CN103755796A - 海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及属于生物医学领域，具体的说是一种海南湍蛙（Amolops hainanensis）抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用。抗癌肽Hainanenin-1序列为SEQ ID No.1中氨基酸所示。Hainanenin-1分子量小、结构简单，仅含有一个二硫键，方便化学合成及基因工程制备。Hainanenin-1作为制备抗肿瘤药物被应用，具有广谱的抗肿瘤活性，对MCF-7细胞有明显的杀伤作用，对其他多种肿瘤细胞也有明显的生长抑制作用。外还具有溶血性低、对正常细胞几无毒性等有益特点。最重要的是，由于Hainanenin-1特殊的癌细胞杀伤机制，不易产生传统化学药物应用时产生的肿瘤多药耐药性。

Description

海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用

技术领域

本发明涉及属于生物医学领域，具体的说是一种海南湍蛙（Amolo_pshainanensis）抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用。

背景技术

肿瘤是全世界死亡率最高的重大恶性疾病之一，随着工业发展、环境污染以及人们生活节奏的改变，肿瘤的发病率及死亡率呈逐年上升趋势。近年来，尽管随着治疗手段的翻新进步，肿瘤早期诊断的高灵敏化，及抗癌新药和单克隆抗体药物的不断问世，给许多癌症患者带来了福音，但是人类想要攻克癌症，目前仍面临有几大难点：1.癌症治疗过程中常常伴随着肿瘤的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)产生，且癌细胞对于抗癌药物的抗性呈越演越烈的趋势，最终造成化疗的失败;2.由于常规小分子抗癌药物不仅针对癌细胞.而是所有快速增殖的细胞起作用，因此现有的抗癌治疗常常存在严重的副作用；3.近年来发展迅速的单克隆抗体药物，尽管具有高度特异性，可以进行靶向治疗，但是作为大分子糖蛋白，结构复杂，不利储存和口服，进入体内5-7天才能到达靶位置，药物的质量标准高但生产技术却复杂，成本高昂，导致价格昂贵，以致被喻为“经济负作用”。因此，寻找到一类新型抗肿瘤药物以克服化疗中的肿瘤细胞MDR，同时降低其对正常细胞的杀伤作用，使更多的癌症患者得到有效治疗，成为国际上现阶段肿瘤药物的研究热点。

抗菌肽是一种普遍存在生物体内由生物基因组编码的具有抵抗外源性微生物侵害、清除体内病变细胞活性的一类小分子多肽，早期抗菌肽的研究集中在其广谱的杀菌性包括对革兰氏阴性、阳性菌，真菌，原虫奶汁部分病毒的的抑制作用，随着研究的不断深入，人们发现一些抗菌肽还具有明显的抗肿瘤活性，并且在作用细胞时有很强的选择性。由于它们特殊的抗肿瘤机制，不易产生耐药性，

以及对正常细胞毒性较低等特点.已经成为具有逆转活性强、低毒的抗MDR抗肿瘤药物研发的热点，因此又被称为抗癌肽(anticancer peptides,ACPs)。

抗癌肽从结构上来看，可分为α螺旋结构抗癌肽、β折叠结构抗癌肽、线性抗癌肽。从两栖动物中分离得到的抗癌肽绝大多数是α螺旋的结构类型,这也是抗癌肽最普遍存在的一种形式；β折叠结构抗癌肽多数来源于哺乳动物，并且折叠程度在不同肽之间差别较大，一般β折叠结构抗癌肽中会含有较多的半胱氨酸（Cys），使分子内形成二硫键结构。许多抗癌肽都是同时含有α螺旋和β折叠结构。而线性结构抗癌肽，没有二级结构但却具有抗肿瘤活性，典型的代表是PR-39，一类富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽，现已被证明除了有很强的抗菌作用外，还对肝癌细胞HLF有明显抑制生长的作用。将已知的抗癌肽分子，对某些氨基酸残基做替换、删减或者用本身的一些氨基酸残基或与另外一种抗癌肽的片段融合，可以得到活性更高，结构更稳定的杂合肽。

对于抗癌肽的抗癌机制，目前并没有一个明确的阐述，但是不可否认的是抗癌肽分子通常都是富含碱性氨基酸和疏水性氨基酸，因此分子会表面带有大量的正电荷，而癌变细胞的细胞膜表面会高表达一系列带负电荷的分子，比如磷脂酰丝氨酸、O-糖基化的黏蛋白、唾液酸化的神经节苷酯、硫酸乙酰肝素等,但正常细胞的细胞膜主要是由磷脂类和甾醇类等中性电荷分子构成，因此在解释为何抗癌肽会对癌细胞有很强的靶向性时，我们通常会认为大部分带正电荷的抗癌肽会通过静电相互作用与表面带负电的肿瘤细胞结合而发挥具有靶向性的抗肿瘤活性，除此之外肿瘤细胞和正常细胞的另外一个区别源于肿瘤细胞相对于正常细胞所含的微绒毛数目。这些微绒毛促使肿瘤细胞与更多数目的抗癌肽接触。除了溶膜的作用方式，抗癌肽还可以通过下调癌细胞相关抗原、细胞分化相关酶的表达来抑制癌细胞的增殖。此外,有些抗癌肽对肿瘤部位的血管生成也有一定的抑制作用。

我国是一个物产资源丰富的国家，两栖类动物作为一个复杂且具有多样性的生态类型，广泛分布在全国各地，尤其在南方气候潮湿、物种丰富的山间雨林里。自古以来，各种医学药典中就有关于两栖类物种，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)等背皮入药的记载，因此等很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而被广泛应用，如，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。

两栖类动物体内，除了具有生物碱等一系列有机药用小分子外，两栖类皮肤还含有大量的活性肽类物质，这是新药发现的一个重要来源。生活在海南省山岭间的海南湍蛙，其潮湿、温热的气候环境促使其体内进化形成较为强化的防御机制，体内含有丰富的活性肽。

发明内容

本发明目的在于提供一种海南湍蛙（Amolops hainanensis）抗癌肽Hainanenin-1及其基因和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1，抗癌肽Hainanenin-1序列为SEQID No.1中氨基酸所示。所述抗癌肽Hainanenin-1的C端含有一个由二硫键形成的七元Rana Box的环分子量为2278.9Da，等电点为9.5。

所述海南湍蛙Hainanenins的基因序列为SEQ ID No.2中核苷酸所示。

一种海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1的应用，所述海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1有广谱抗肿瘤活性，用于制备抗肿瘤药物。

进一步的说，所述海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1用于制备A-549人肺癌细胞、SGC-7901人胃癌细胞、MDA-MB-453人乳腺癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞或MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。

更进一步的说，所述海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1用于制备MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。

所述合成的Hainanenin-1抗癌肽具有很强的体外杀伤癌细胞作用，溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。

本发明所具有的优点：

本发明采用基因克隆得到编码海南湍蛙Hainanenin-1抗癌肽的基因，通过化学合成方法得到成熟肽Hainanenin-1，结构简单，仅含有一个二硫键，方便化学合成及基因工程制备。Hainanenin-1具有广谱抗肿瘤活性，在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗肿瘤活性，体外对肿瘤细胞A-549，SGC-7901，MDA-MB-453，PC-3均有较强的抑制生长作用，24h用药时间内，IC₅₀值在10-13μM/L之间。尤其对乳腺癌细胞MCF-7有明显体外抑制生长作用，24h用药时间内，IC₅₀仅为6.9μM/L，相比传统化疗药物阿霉素（IC₅₀为15.6μM/L），效应更强。且Hainanenin-1作为阳离子小肽家族一员，杀伤癌细胞机制在于破坏胞体结构，细胞膜的完整性，使其内容物溶出，细胞死亡。相比作用于肿瘤DNA，抑制癌细胞有丝分裂的化疗药物如阿霉素、紫杉醇等，Hainanenin-1不易引起肿瘤细胞多药耐药性，且几无细胞毒性和溶血性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的Hainanenin-1三级空间结构图。

图2为本发明实施例提供的Hainanenin-1对不同肿瘤细胞的生长抑制作用图。

图3为本发明实施例提供的不同浓度Hainanenin-1引起MCF-7细胞形态变化图，其中，A：DMSO对照组；B：2.15μM/L；C：4.3μΜm/L；D：8.6μΜm/L；E：13μΜm/L。

图4为本发明实施例提供的Hocheset33258染色观察Hainanenin-1对MCF-7细胞形态变化的影响图，其中A：DMSO对照组；B：2.15μM/L；C：4.3μΜm/L；D：8.6μΜm/L；E：13μΜm/L。

图5为本发明实施例提供的SEM观察Hainanenin-1对MCF-7细胞超显微结构的影响图，其中A、B：对照组；C：药物作用6h；D：药物作用12h；E：药物作用18h；F：药物作用24h

图6为本发明实施例提供的AV/PI双染检测Hainanenin-1对MCF-7细胞凋亡的量效关系图；其中，A：DMSO对照组；B：3.5μM/L（1/2IC₅₀）；C：6.9μΜm/L(IC₅₀)。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

海南湍蛙Hainanenin-1的基因的克隆包括:

海南湍蛙背皮总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选海南湍蛙Hainanenin基因。5’端引物为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司CreatorTMSMART TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5’CGGGGTACGATGAGACACCAT3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码海南湍蛙Hainanenins的基因开放阅读框由204个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:

1   ATGTTCCCCT TGAAGAAATC CATGTTACTC CTTTTCTTCC TTGGGACCAT

51  CAACTTATCT CTCTGTGAGC AAGAGAGAGA GCCGAAGAAG AAAGAAGAGG

101 TAAAAGGGAT GTTGAAGTGG AAAAACGATT TGCATTAGGT GCGGTTACTA

151 AGCTTTTGCC ATCACTGTTA TGTATGATTA CCAGAAAATG TTGA

编码海南湍蛙成熟肽Hainanenin-1为第88-181位核苷酸，其氨基酸序列为:

Phe-Ala-Leu-Gly-Ala-Val-Thr-Lys-Leu-Leu-Pro-Ser-Leu-Leu-Cys-Met-Ile-Thr-Arg-Lys-Cys（FALGAVTKLLPSLLCMITRKC）。Hainanenin-1为C端含有七元Rana Box的环状多肽，含有21个氨基酸残基，理论等电点（pI）为9.5，理论分子量为2279.8，含有3个碱性氨基酸残基（1个精氨酸和2个赖氨酸），不含有酸性氨基酸，静电荷为+3，说明它是一种碱性多肽。Hainanenin-1含有2个半胱氨酸，因此分子内形成一个二硫键，结构简单。

根据成熟肽序列化学合成的抗癌肽Hainanenin-1可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。

实施例1

海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1基因克隆

1）海南湍蛙皮肤总RNA提取：

①取300mg海南湍蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75%（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为海南湍蛙皮肤总RNA。

2）海南湍蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit。

I.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①经DEPC处理（DEPC处理是在含0.1%（V/V）DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干）的离心管中加入1μl海南湍蛙皮肤总RNA、1μl3’端一链合成引物（3’In-Fusion SMARTer CDS Primer）和2.5μl DEPC处理的水（DEPC处理的水是含0.1%DEPC(V/V)的水，放置过夜，高压灭菌）使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心（2000rpm，30s），离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂（均为CLONTECH公司In-FusionSMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备），2.0μl5×第一链缓冲液、0.25μl100mM DTT、1.0μl10mM dNTPMix、1.0μl SMARTer V Oligonucleotide、0.25μl RNase Inhibitor和1.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心（2000rpm，30s），在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

II.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链（所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA LibraryConstruction Kit建库试剂盒中配备）

①将2μl cDNA第一链（mRNA反转录）、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲液、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl50×Advantage2Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。

3）海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1基因克隆筛选：

根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：94℃4min，94℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进CaCl₂-MgCl₂法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABIPRISM377进行核苷酸测序，并翻译成氨基酸序列。

4）同源建模模拟Hainanenin-1三级结构

利用同源建模的方法模拟了Hainanenin-1的3D结构，如图1所示，显示主要由α螺旋结构构成，两端带有random coil,该类型结构与已知的阳离子抗菌肽的基本结构相符。

实施例2

海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1的细胞增殖抑制实验，

MTT法检测Hainanenin-1对不同肿瘤细胞株的细胞毒作用

实验用细胞株MCF-7,SGC-7901,MDA-MB-453,A-549,PC-3,HUVEC均由中科院昆明动物研究所友情提供，且都为贴壁生长细胞。均用含有20%胎牛血清（Gibico，Life Tech，USA）以及100U/ml青链双抗（Gibico，Life Tech，USA）的DMEM（Gibico，Life Tech，USA）培养基悬浮细胞沉淀，转入25ml培养瓶中，于37℃，5%CO₂培养箱内培养至对数期。胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，通过血细胞计数板的计数调整其浓度至5-10×10⁴个/ml。于96孔板内，每孔加入100ul,使得待测细胞密度为5000-10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层贴壁长满孔底即可加药。

浓度药物（Hainanenin-1）浓度分别是0.005mg/ml,0.010mg/ml,0.015mg/ml,0.020mg/ml,0.025mg/ml.0.030ml/m,和0.040mg/ml。阴性照为0.1%DMSO，阳性对照为阿霉素（0.005mg/ml）。每个梯度5个复孔，每孔加药100ul，终体积为200ul。5%CO₂，37℃培养箱内孵育48h后，每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml），继续避光培养4h。

终止培养，吸去孔内液体，加入200ul DMSO（此处要向空白孔内加入一组DMSO做为调零组），放在摇床上慢摇10min，溶解紫色结晶，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。每种细胞检测重复三次。根据公式：细胞死亡率=1—(对照组OD—实验组OD)/对照组OD×100%计算细胞存活率，并利用软件SPSS计算药物的IC₅₀值，进行显著性分析（参见图2）。

IC₅₀是对50%细胞产生细胞毒作用时的药物浓度。Hainanenins-2对不同细胞的IC₅₀值如下表1所示。

表1

肿瘤细胞	Hainanenin-1IC50（μM/L）	阿霉素IC50（μM/L）
			MCF-7	6.9±1.52	15.6±0.35μM/L
A-549	13±1.73	12.0±0.26
			SGC-6901	11.7±2.72	6.9±0.17
PC-3	11.3±1.15	6.2±0.23
			MDA-MB-453	10.4±1.41	13.2±0.19
HUVEC	43±1.91	33±0.22

实验结果显示Hainanenin-1对多种癌细胞都有抑制生长的作用，具有广谱抗癌活性，且均呈现明显的浓度依赖性,对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用最为明显，IC₅₀值仅为6.9μM/L，而阿霉素为15.6μM/L。在对正常细胞HUVEC细胞毒性检测中，Hainanenin-1IC₅₀高达43μM/L，4-7倍于癌细胞，且低于阿霉素的细胞毒性，显示了良好的用药前景。

实施例3

Hainanenin-1杀伤肿瘤细胞的机制研究

1）倒置显微镜观察MCF-7细胞形态

细胞在凋亡过程中会出现一些形态上的变化，光学显微镜加可观察到细胞形态变圆、体积缩小、细胞皱缩核凝集等现象。现在处于对数期生长的MCF-7细胞以2×10⁵个/ml的密度接种到6孔板内，每孔2ml。带细胞贴壁后，弃掉就培养基，加入含有不同浓度的Hainanenin-1的培养基，对照组加入相同体积的0.1%DMSO。Hainanenin-1作用浓度为2.15μM/L，4.3μΜm/L，8.6μΜm/L，13μΜm/L。在37℃、5%CO₂的条件下培养24h，倒置显微镜下观察细胞形态。

由图3可知，对照组细胞贴壁量好，呈梭行或多边形，紧密相间长满瓶底（图3A）；2.15μM/L Hainanenin-1作用12h后，可见细胞间隙变大，细胞轮廓逐渐模糊（图3B）；当浓度升到4.3μΜm/L时，细胞多数变圆，胞质起泡，且有部分细胞从壁上脱落，细胞间出现较大空隙（图3C）；Hainanenin-1浓度为8.6μΜm/L时，细胞个数大量减少，可观察到胞质皱缩，内部粗糙，出现颗粒堆积物，细胞大量脱落，间隙显著增大（图3D）；当Hainanenin-1浓度达到13μΜm/L时，明显可见细胞核凝集或断裂成碎片，贴壁细胞几乎完全脱落，细胞呈圆形(图3E)。

2）Hochest33258染色荧光显微镜观察细胞形态变化

Hochest33258是双苯咪唑类的染料,可渗透细胞膜进入细胞内，与DNA结合使之染色，荧光显微镜下细胞核成蓝色。取普通洁净盖玻片于置于六孔板内，种入处于对数生长期的MCF-7细胞培养过夜，种植密度大约铺满60%-80%孔底。加入含有不同浓度的Hainanenin-1的DMEM培养基，对照组为于培养基中加入相同体积的0.1%DMSO。培养基中Hainanenin-1作用浓度为0.005mg/ml,0.010mg/ml,0.020mg/ml,0.030mg/ml。在37℃、5%CO₂的条件下培养24h，去掉培养基，用PBS洗涤2-3次，加入1ml固定液（2.5-3.0%（v/v）戊二醛），4℃中固定30min。去固定液，用PBS洗涤两遍，尽量摇晃洗涤，每次3分钟。吸尽液体后加入1ml Hoechst33258染色液，染色20-30分钟。加少许抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，避免气泡，置于荧光显微镜下检测（参见图4）。

由图4可以观察到对照组A中个别细胞正处在有丝分裂时期，其他细胞细胞核膜完整，染色均匀。随着Hainanenin-1浓度的增加，细胞核逐渐凝集，并且边缘化，染色较深（图中箭头所指处既为核凝集皱缩，着色较深）。可见其Hainanenin-1引起MCF-7细胞不同程度的凋亡。

3）SEM扫描电镜观察细胞超显微结构

取普通洁净盖玻片于置于六孔板内，接种处于对数生长期的MCF-7细胞培养过夜，种植密度大约铺满60%-80%孔底。加入含有不同浓度的Hainanenin-1的DMEM培养基对照组为于培养基中加入相同体积的0.1%DMSO。Hainanenin-1作用浓度为0.005mg/ml,0.010mg/ml,0.020mg/ml,0.030mg/ml。37℃、5%CO₂的条件下培养24h，去培养基，用PBS洗涤2-3次，向孔内加入固定液2.5-3.0%（v/v）戊二醛，4℃固定3h。吸弃戊二醛,用30%,50%,75%,90%,100%梯度乙醇脱水，每个梯度洗涤两遍，每遍5min，最后脱水的100%乙醇洗涤时间为10min。弃掉乙醇，加入乙酸乙酯置换15min，取出盖玻片，放在冷冻干燥机里干燥6h以上。将盖玻片黏在上样环上，喷金，上样观察（参见图5）。

由图5可见正常状态下的乳腺癌细胞MCF-7细胞外部布满绒毛，细胞一侧紧紧的贴在底壁上（图5A），细胞与细胞之间通过绒毛相互交织，连在一起（图5B）；当细胞用Hainanenin-1(6.9μM/L,IC₅₀)处理6h后，绒毛开始断裂（图5C），随着作用时间延长，细胞表面绒毛断裂增多，表面逐渐变得光滑，且与底壁贴合极具减少，细胞逐步变成圆球形（图5D）；当作用时间到18h后，细胞凋亡越来越严重，可见细胞膜开始发泡，处于瓦解边缘（图5E）；最终，24小时后小泡破裂，胞内容物外溢，细胞皱缩，变形，死亡（图5F）。由此证明,Hainanenin-1具备阳离子小肽家族的特点，作用靶点主要位于细胞膜上。由于其自身结构及理化性质特点，可以通过诱导细胞膜去极化,使细胞破裂，形成孔洞，内容物溶出而发挥作用,因此,相比传统化疗药物，抗癌肽不易引起肿瘤细胞多药耐药性。

4）AnnexinV-FITC和PI双染分析Hainanenin-1对细胞凋亡率的影响

将状态良好的MCF-7细胞以每孔2ml（4×10⁵个/孔）接种于6孔板中，待细胞贴壁后，弃旧液，加入含有不同浓度的Hainanenin-1的DMEM培养基，对照组为于培养基中加入相同体积的0.1%DMSO。Hainanenin-1作用浓度为0.005mg/ml,0.010mg/ml,0.020mg/ml,0.030mg/ml。在37℃、5%CO₂的条件下培养24h，结束培养后，收集细胞，1000rpm离心5min，PBS清洗2次，按照Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒（invitrogen，USA）的说明进行双染操作，先后加入5ul的Annexin-FITC和5ul的PI到binding buffer重悬液中，室温避光10min，流式细胞仪检测（参见图6）。

由图6可见结果显示Hainanenin-1会引起细胞的早起凋亡，且随着浓度的增加，早期凋亡率增大，而晚期凋亡率也具备浓度依赖性。

Claims (7)

1.一种海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1，其特征在于：抗癌肽Hainanenin-1序列为SEQ ID No.1中氨基酸所示。

2.按权利要求1所述的海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1，其特征在于：所述抗癌肽Hainanenin-1的C端含有一个由二硫键形成的七元Rana Box的环分子量为2278.9Da，等电点为9.5。

3.按权利要求1所述的海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1，其特征在于：所述海南湍蛙Hainanenins的基因序列为SEQ ID No.2中核苷酸所示。

4.一种权利要求1所述的海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1的应用，其特征在于：所述海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1有广谱抗肿瘤活性，用于制备抗肿瘤药物。

5.按权利要求4所述的海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1的应用，其特征在于：所述海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1用于制备A-549人肺癌细胞、SGC-7901人胃癌细胞、MDA-MB-453人乳腺癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞或MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。

6.按权利要求4所述的海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1的应用，其特征在于：所述海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1用于制备MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤药物。

7.按权利要求3所述的海南湍蛙抗癌肽Hainanenin-1基因的应用，其特征在于，所述合成的Hainanenin-1抗癌肽具有很强的体外杀伤癌细胞作用，溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。

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