CN109142739A - 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征血清外泌体蛋白标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征血清外泌体蛋白标志物及其应用。具体来说，本发明提供了蛋白标志物的检测试剂在制备用于检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的试剂盒中的应用，其中所述蛋白标志物选自C‑反应蛋白、结合珠蛋白和纤连蛋白，所述试剂盒检测的是受试者血清外泌体中所述蛋白标志物的浓度，其中与正常对照相比，所述受试者血清外泌体中C‑反应蛋白浓度上升、结合珠蛋白浓度上升和/或纤连蛋白浓度下降指示阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的概率上升。本发明还提供了相关的试剂盒和检测系统。血清外泌体来源的上述三种蛋白标志物的浓度变化水平可以用于检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征。

Description

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征血清外泌体蛋白标志物及 其应用

技术领域

本发明涉及阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征领域，具体涉及一种与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征相关的血清外泌体蛋白标志物及其应用。

背景技术

在睡眠障碍中，最常见的是阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(ObstructiveSleep Apnea-Hypopnea Syndrome，OSAHS)。OSAHS是心脑血管疾病的独立危险因素，也与日间过度嗜睡导致智力衰退、心情变化和机动车事故的增加相关。最新的《睡眠白皮书》显示我国20.4％的成人患有OSAHS。在美国，未经控制的中-重度OSAHS每年会增加个人健康消费2700-3000美元，每年总经济成本达650-1650亿美元。目前我国尚缺乏OSAHS对健康消费影响的研究，但可以肯定的是改善OSAHS症状会极大的减少我国的健康消费和相关疾病的致残致死率。

目前用于诊断OSAHS的方法中一般以多导睡眠图(PSG)作为“金标准”。但是PSG的诊断有如下问题：A.OSAHS的PSG诊断数据需要经过一定技术培训的专业人员来分析解读并由委员会认证的睡眠专家审核，同时睡眠中心的有限性加上扩容需要大量资金投入，并且检测过程复杂，耗时并昂贵，无法满足OSAHS患者大规模临床筛查的需求；B.对于患者来说，该诊断技术不够方便，在医院或者临床设施中过夜床旁检测和大量传感器的佩戴也会影响患者的情绪，进而影响监测结果的准确性。

目前，尚未见到OSAHS的分子标志物用于OSAHS临床诊断的报道。因此，急需寻找简单廉价的，并且能够快速测试OSAHS的分子标志物作为临床诊断或干预指标来指导临床治疗。已报道的OSAHS分子标志物主要来源于OSAHS患者液态活检样品(包括尿液、血液、唾液等)的蛋白、代谢性小分子、miRNA等标志物，其中以蛋白和代谢性小分子两者报道居多^1,2。血液是最常用的临床液体活检样本来源，监测血清或血浆的蛋白组分也成为现在评价疾病易感性、是否患病以及疾病进程的重要手段。目前已经有很多血清/血浆蛋白作为疾病的标志物用于临床诊断。

蛋白质组学等系统生物学技术的飞速发展，极大地推动了组学特征谱在疾病早期诊断中的应用。同样地，通过组学的方式进行筛查是目前最常用的寻找OSAHS疾病生物标志物的策略。然而，目前利用比较蛋白组学的手段进行全血清/血浆的差异蛋白检测和鉴定还有一定难度，其中最困难的就是高丰度血清/血浆蛋白对痕量的差异蛋白信息的掩盖，这些高丰度蛋白包括血清白蛋白(Albumin，35-45mg/ml)、纤维蛋白原(Fibrinogen，2-6mg/ml)、IgG(12-18mg/ml)、转铁蛋白(Transferrin，2-3mg/ml)等。有效地去掉这些高丰度蛋白可以提高检测蛋白的数量和精确度，也能更多地检测出痕量蛋白差异。提取血清/血浆中的亚组分进行蛋白组学分析将有助于降低血清/血浆高丰度蛋白的污染和复杂性。目前，通过血清进行OSAHS和对照人群的比较蛋白组学研究及生物标志物鉴定已经有一些报道。例如，通过比较蛋白组学分析，发现儿童OSAHS患者血清中骨钙蛋白(Osteocalcin)增加³；成人OSAHS患者中C4结合蛋白α-链、玻连蛋白(Vitronectin)等蛋白表达降低，而纤连蛋白(Fibronectin)、ApoB-100、血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)、结合珠蛋白(Haptoglobin)和载脂蛋白(Apolipoprotein)M表达增高^4,5。

近年来，外泌体(Exosome)研究受到心血管领域研究者的极大关注。存在于体液中的外泌体是机体绝大部分细胞都能分泌的纳米级双层膜微囊泡(直径范围：30-100nm)，携带来自分泌细胞的多种RNA、蛋白和脂成分⁶。分泌细胞对外泌体的内容物具有靶向精密调节和高度选择性，在不同病理生理状态下，细胞分泌出包含有特定内容物的外泌体至细胞外环境(血液、尿液、唾液、前列腺液、羊水和胸腔积液等)中⁷，这些物质不仅能反映分泌细胞类型(如转铁蛋白多见于网织红细胞来源外泌体)，还与分泌细胞的生理功能或病理改变密切相关(如肿瘤细胞来源外泌体既含有肿瘤抗原又含有肿瘤特异性蛋白)。外泌体释放入细胞外环境后，距离较近的可直接被受体细胞摄取，距离稍远的可由旁分泌途径被摄取，还有部分外泌体随循环到达全身多种器官组织由内分泌途径被其他受体细胞摄取⁶。受体细胞对外泌体摄取也具有高度的靶向性(如黑色素瘤来源外泌体倾向于到达前哨淋巴结以促进肿瘤转移⁸)。外泌体在分泌细胞和受体细胞间的穿梭介导了细胞间的生物分子传递，是不同组织细胞间信息沟通的重要媒介，通过这种方式外泌体参与了一系列重要的生理病理过程⁶。

外泌体的蛋白表达特征谱与特定的病理生理状态密切相关并且被外泌体包裹的蛋白具有高度的生物学稳定性。通过特异性分泌和靶向摄取使外泌体中某些特定组织来源的蛋白或蛋白能够远距离调节另一些组织或细胞的功能。这些特点使得循环中外泌体蛋白不仅有望成为疾病诊断和预后的一类新型生物学标志物⁹，而且也决定了它在外泌体介导的细胞间相互作用中扮演重要角色。

截止2017年，在不同来源的外泌体中已经鉴定到了9769种蛋白(http://www.exocarta.org/)，随着质谱技术的发展和精度的提高，近几年外泌体中已经检测到更多的蛋白。如此复杂的成分也使外泌体的功能呈现出动态性、多样性和复杂性的特点，目前的研究还远未能完全揭示。除此之外，外泌体是人体自身存在的天然脂质体，与人工合成的脂质体相比，外泌体半衰期更长且无毒性，能逃避宿主免疫系统，还可以改造成携带药物和核酸小分子的有靶向特异性的药物载体，这些生物学特性决定了外泌体在转化医学和分子治疗领域的可能性，外泌体携带蛋白靶分子的类似物或者抑制物也成为外泌体作为治疗载体的主要策略。

由于血清外泌体来源于机体的不同细胞，其中的蛋白组分不仅能够反应机体生理病理状态的变化，而且血清外泌体提取纯化过程中反复离心洗涤有效地降低血清高丰度蛋白的含量以及血清蛋白的复杂性。因此，OSAHS状态下血清外泌体中的差异蛋白有望成为诊断OSAHS的重要分子标志物来源。

发明内容

发明人利用TMT标记的比较蛋白组学的策略，通过比较OSAHS患者和非OSAHS患者的血清外泌体蛋白差异，鉴定到了32个血清外泌体蛋白在OSAHS患者的血清来源的外泌体表达发生变化，通过进一步ELISA验证发现OSAHS患者的血清外泌体中的C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)含量增加而纤连蛋白(Fibronectin，FN)含量降低，并且与非OSAHS对照相比，含量变化有显著差异，由此完成了本发明。

在第一方面，本发明提供了蛋白标志物的检测试剂在制备用于检测OSAHS的试剂盒中的应用，其中所述蛋白标志物选自CRP、HP和FN，所述试剂盒检测的是受试者血清外泌体中所述蛋白标志物的浓度，其中与正常对照相比，所述受试者血清外泌体中CRP浓度上升、HP浓度上升和/或FN浓度下降指示OSAHS的概率上升。

优选地，所述检测试剂为所述蛋白标志物的特异性抗体。

优选地，所述受试者血清外泌体中CRP的浓度高于12.04ng/mL血清外泌体、HP的浓度高于9.15μg/mL血清外泌体和/或FN的浓度低于114.12μg/mL血清外泌体时指示OSAHS的概率上升。

优选地，所述受试者血清外泌体中CRP浓度上升、HP浓度上升和FN浓度下降的组合指示OSAHS的概率上升。

优选地，受试者血清外泌体中所述蛋白标志物浓度的变化与选自下列诊断方法的结果组合以检测所述受试者是否患有OSAHS：受试者鼻咽腔及头颈部的解剖结构检查、多导睡眠图、睡眠指数；进一步优选地，所述睡眠指数选自呼吸暂停低通气指数、呼吸干扰指数、多睡眠潜伏期测试、ASDA微觉醒指数、以及慢波与REM睡眠的时间百分比。

在第二方面，本发明提供了一种用于检测OSAHS的试剂盒，其包括用于一种或多种测定的试剂，所述测定设定成检测受试者血清外泌体中选自CRP、HP和FN的一种或多种蛋白标志物的浓度，其中与正常对照相比，所述受试者血清外泌体中CRP的浓度上升、HP的浓度上升和/或FN的浓度下降指示OSAHS的概率上升。

优选地，所述试剂选自CRP、HP和FN的特异性抗体。

优选地，所述试剂盒包括用于检测受试者血清外泌体中CRP、HP和FN三者的试剂。

在第三方面，本发明提供了一种用于检测OSAHS的系统，其包括：

一种或多种试剂，其用于检测受试者血清外泌体中的一种或多种蛋白标志物的浓度，所述蛋白标志物选自CRP、HP和FN；

测定仪器，其用于执行所述蛋白标志物浓度的检测。

优选地，所述测定仪器选自ELISA检测仪器、Luminex液相芯片蛋白分析平台和流式细胞仪。

优选地，所述系统还包括执行选自鼻咽腔及头颈部的解剖结构检查、多导睡眠图和睡眠指数的仪器；进一步优选地，所述睡眠指数选自呼吸暂停低通气指数、呼吸干扰指数、多睡眠潜伏期测试、ASDA微觉醒指数、以及慢波与REM睡眠的时间百分比。

除了作为在OSAHS临床诊断方面的检测蛋白标志物外，血清外泌体CRP、HP和FN三种蛋白中的任何一种也有可能适用于诊断OSAHS相关疾病，包括肥胖、代谢综合征、神经功能障碍、心血管疾病、呼吸功能障碍等。另外，CRP、HP和FN三种蛋白中任一种的mRNA也有可能是一种有意义的疾病诊断核酸标志物。

本发明的有益效果

本发明提供的血清外泌体来源的三种蛋白标志物可以用来提高诊断OSAHS的准确性和及时性，优化个体OSAHS筛选策略；可以用来检测疾病治疗的有效性，例如可以协助检测治疗方案例如经鼻持续气道正压通气(nasal continuous positive airway pressure，nCPAP)或者悬雍垂软腭咽成形术(uvulopalatopharyngoplasty，UPPP)等手术在治疗OSAHS以及OSAHS相关疾病中的有效性；也可以用来检测OSAHS及OSAHS相关疾病的疾病进程。

本发明提供的血清外泌体来源的蛋白标志物CRP、HP和FN可以与PSG结果组合，为患有或疑似患有OSAHS的个体提供疾病分析、分级、筛选、监测或为治疗处方方案提供依据。

本发明提供了用血清外泌体中CRP、HP和FN的含量来鉴定患者是否有罹患OSAHS疾病及其相关疾病和损伤事件的风险或者高风险。例如，拥有较高水平的CRP(例如1mL血清提取的血清外泌体中CRP高于12.04ng)，HP(例如1mL血清提取的血清外泌体中HP高于9.15μg)和低水平血清外泌体FN(例如1mL血清提取的血清外泌体中FN低于114.12μg)的受试者，将需要更加频繁地接收临床OSAHS筛查。这个程序的具体实施将依据受试个体的年龄、性别、健康程度、体重、尤其是CRP、HP和FN这三个蛋白指标的不同而有所变化。在一些实施方案中，推荐的CRP、HP和FN的检测程序不是必须基于此发明所涉及的高低值，这些检测值可以根据生物样本的来源以及其他检测方式的不同分成不同的水平。

对于OSAHS临床诊断，血清外泌体CRP、HP和FN三种蛋白含量联合鼻咽腔及头颈部的解剖结构检查、PSG检测能够更加准确地确定OSAHS的患病风险及程度。另一方面，血清外泌体CRP、HP和FN三种蛋白含量和OSAHS的呼吸暂停低通气指数(apnea hypopnea index，AHI)指数、血氧饱和度(blood oxygen saturation,SaO₂)水平和以呼吸干扰指数(respiratory disturbance index,RDI)作为睡眠指数的相关性研究能够更加有助于评价血清外泌体CRP、HP和FN三种蛋白在诊断和评价OSAHS及其相关疾病患病风险中的应用。合适的睡眠指数包括AHI、RDI、多睡眠潜伏期测试、ASDA微觉醒指数(ASDA microarousalindex,ARI)、以及慢波(slow waves,SWS)与REM睡眠的时间百分比。AHI通过将患者在特定时间段中经历的呼吸暂停和呼吸浅慢总数求和，再除以该段时间中时间数所得，其是目前判断OSAHS的关键指标。AHI值为0-4.9的呼吸暂停得分是正常的，5至14.9是轻度OSAHS，15至29.9是中度OSAHS，而等于或大于30是严重OSAHS。另一种睡眠指数是RDI，该指数表示每小时睡眠的异常呼吸事件数。RDI得分大于或等于20是严重OSAHS。

血清外泌体CRP、HP和FN三种蛋白变化符合度越高，OSAHS的风险越大。测试的灵敏度和特异性可进一步通过结合身体体征(例如颈围、BMI和打鼾)、睡眠相关问卷(Epworth嗜睡评价量表)、血压和相关临床状况(例如中风、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、血脂指标和II型糖尿病)的结果与基于血清外泌体测试的一个或多个测试结果来改进。当这些信息暗示出典型OSAHS的特征时，只需要较少量的基于血液的标志物变化来表明OSAHS风险。

将结果加以组合，增加了OSAHS测试的灵敏度和特异性。也就是说，结果组合便于从其他病理状态中区分出OSAHS。例如血清外泌体FN的降低指示血管通透性增加和OSAHS等状态，但如果同时合并CRP增加和HP的增高就可以增大OSAHS诊断的特异性；血清外泌体HP的增高指示贫血等状态，如果同时合并血清外泌体FN的降低及血清外泌体CRP增加就可以增大OSAHS诊断的特异性。

附图说明

图1为本发明的总体实验流程图。

图2为血清外泌体提取方法流程图。

图3为血清外泌体的鉴定。A.电镜负染观察人血清外泌体的大小和完整性。B.纳米颗粒分析仪Nano analyzer显示人血清外泌体的分布，直径均值为86.9nm。C.Westernblotting检测血清外泌体的标志蛋白CD63和CD81的表达量，结果显示在人血清外泌体样品中有CD63和CD81蛋白富集。银染胶显示上样量。H-serum，人全血清；H-SExo，人血清外泌体；H-supernatant，去掉外泌体沉淀后的人血清。D.OSAHS患者血清外泌体数量增加。n＝4，*P<0.05vs非-OSAHS。

图4为比较蛋白组学的流程图及鉴定结果。A.TMT标记的比较蛋白组学的流程示意图。B.火山图显示比较蛋白组学在OSAHS患者的血清来源的外泌体中鉴定到32个蛋白有特异性表达，其中17个蛋白含量增高(△)；15个蛋白含量降低(□)。

图5.ELISA结果显示OSAHS患者和对照人群血清外泌体中HP、CRP、PF4和FN的表达水平。A.质谱鉴定到的HP、CRP、PF4和FN的表达变化。B。Western blotting检测OSA患者和非OSA患者的血清外泌体中CRP的表达变化(银染表明蛋白上样量)。C.ELISA检测血清外泌体CRP的表达水平。D.ELISA检测血清外泌体FN的表达水平。E.ELISA检测血清外泌体HP的表达水平。F.ELISA检测血清外泌体PF4的表达水平。n＝20,*P<0.05vs.非-OSAHS。

图6.血清外泌体CRP和HP诊断OSAHS的ROC曲线分析。

图7.血清外泌体FN诊断OSAHS的ROC曲线分析。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明进行详细描述，但本发明的范围将不限于此。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的意义。在本文中具体提到的所有出版物，为包括描述和公开在出版物中报道的可能与本发明相结合使用的化学物质、仪器、统计分析和方法在内的所有目的，以其全部内容通过参考并入本文。在本说明书中引用的所有参考文献应该被视为指示了本领域的技术水平。本文中的任何内容不应被解释为承认本发明没有权利早于通过在先发明的这些公开。

当在本文中使用时，术语“包括”和“包含”是开放性术语，并且应该被解释为意味着“包括但不限于”。这些术语涵盖了更加限制性的术语“基本上由……构成”和“由……构成”。还应该指出，术语“包含”与“包括”、“特征在于”与“具有”可以互换使用。

当在本文中使用时，没有具体数量的指称包括其单数或复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。此外，无具体数量的指称、术语“一个或多个”和“至少一个”可以互换使用。

当提供值的范围时，应该理解，在所述范围的上下限之间的每个居间值和居间值的任何组合或子组合，以及所述陈述的范围内的任何其他陈述的或居间的值，都被涵盖在所叙述的值的范围之内。

当在本文中使用时，“受试者”包括哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，包括但不限于人类、非人类灵长动物例如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农场动物例如牛、马、绵羊、山羊和猪，家畜例如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿动物例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟类等。术语“受试者”不指示特定年龄或性别。本发明所针对的主要受试者是接受OSAHS筛查的人类。术语“受试者”在本文中可以与术语“患者”或“个体”互换使用。

实验步骤

1.血清来源及收集

本发明实施方式所述的患者诊断及入组标准：本研究符合首都医科大学附属北京安贞医院的医学伦理学及道德委员会的要求，并获得患者的知情同意，中国临床实验注册号ChiCTR-ROC-17011027。所有实验参与者均来源于北京安贞医院，并在北京安贞医院睡眠中心进行过PSG检测。为了减少样品的混杂性和减少其他疾病对实验数据的干扰，本研究严格排除糖尿病、高血压、血脂异常、肿瘤、精神神经异常等疾病，并进行组间严格的性别和年龄配对，具体要求如下：

1)OSAHS患者入组要求男性无肿瘤，无血脂异常，无高血糖，无高血压患者，并且AHI>15，SaO₂<82％，每组样本进行质谱检测人数3人，严格年龄配对，进行ELISA验证人数20人。

2)对照组要求男性无肿瘤，肥胖、冠心病、血脂异常、高血糖、高血压，并且AHI<5，SaO₂>90％，每组样本进行质谱检测人数3人，严格年龄配对，进行ELISA验证人数20人。

血液优选晨血，可在PSG监测及OSAHS治疗方案之前、中和/或之后采集。受试者晨血采集之前禁食。血样收集在试管中，尽快离心收集血清。外泌体在血清中可以较稳定保存于4℃，-20℃，-40℃或者-80℃。以上所有实验入选参与者年龄在27-75岁之间。各组样品需要取晨血5ml(无抗凝剂血清管收集)，2000g常温离心10分钟后分离血清到1.5mL离心管，再一次2000g常温离心10分钟进一步去除其中的血细胞沉淀，得到血清。

表1.患者基础临床信息

注：以上数值以平均值±标准差表示。

2.血清外泌体提取

参见图2，取晨血血清2mL，用PBS等量稀释，4℃2,000×g离心30分钟，弃去细胞沉淀并留取上清，将上清在12,000×g，4℃离心45分钟进一步弃掉细胞碎片等杂质沉淀，上清在Backman(USA)超速离心机110,000×g，4℃离心2小时，沉淀即血清外泌体初提物。为了进一步纯化外泌体，血清外泌体初提物用1mL PBS重悬，用0.22μm过滤器过滤后110,000×g，4℃离心70分钟，沉淀用1mL PBS重悬洗涤，110,000×g，4℃离心70分钟，沉淀就是纯化的血清外泌体。通过以上多次离心、过滤和PBS的两次清洗，可以去除外泌体以外的细胞碎片、其他细胞外囊泡以及黏附在外泌体上面的其他血清蛋白。

3.外泌体验证

3.1 电镜负染照片

血清超速离心及过滤获取血清外泌体之后，进行血清外泌体的纯度和浓度测定。首先通过电镜负染观察血清外泌体的大小和形状。PBS重悬血清外泌体后，将外泌体转移到碳支持膜覆盖的铜网上，利用等量体积的2％醋酸双氧铀染色60秒。之后，铜网在FEITecnai 20电子显微镜下观察人血清外泌体的大小和完整性。

3.2 Western blotting检测

血清外泌体、全血清和除去外泌的血清溶于RIPA缓冲液中(25mM Tris–HCl pH7.6,150mM NaCl,1％NP-40,1％脱氧胆酸钠,以及0.1％SDS)，并加入5xSDS上样缓冲液，95℃变性5分钟，进行SDS-PAGE电泳和转膜，5％脱脂牛奶封闭之后分别用抗CD63和CD81(以上一抗均购自SBI)一抗经一抗稀释液1:1000稀释后4℃过夜杂交，辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育2小时，进行ECL显色反应。以蛋白SDS-PAGE胶银染作为蛋白上样量内参。以此检测血清外泌体的标志蛋白CD63和CD81在人血清外泌体样品的富集。

3.3 血清外泌体浓度测定

通过纳米颗粒分析仪Delsa Nano C particle analyzer(Beckman-Coulter)检测提取的人的血清外泌体的分布；NanoSight NS300(Malvern Instruments,UK)检测血清外泌体浓度。

4.比较蛋白组学分析

鉴定了血清外泌体纯度之后，通过8mol/L尿素溶解蛋白，BCA测定蛋白浓度，收集200μg血清外泌体蛋白用5mmol/L dithiothreitol(DTT)还原处理后和用12.5mmol/Liodoacetamide(IAM)烷基化后，通过1：50的比例进行37℃过夜胰酶降解，进行TMT标记。之后样品进行C18柱脱盐和样品冻干浓缩复溶，并利用UPLC 3000(Thermo-FisherScientific,Waltham,MA)系统进行质谱分析，利用SEQUEST软件进行数据检索分析。

5.ELISA验证

血清外泌体利用100μL RIPA裂解液裂解外泌体中的蛋白，通过ELIAS进行蛋白样本浓度测试。ELISA试剂盒购自R&D公司，分别为如下试剂盒：Human HaptoglobinQuantikine ELISA Kit(Cat No.DHAP0)；Human C-Reactive Protein/CRP QuantikineELISA kit(Cat No.DCRP00)；Human CXCL4/PF4 Quantikine ELISA Kit(Cat No.DPF40)；Human Fibronectin Quantikine ELISA Kit(Cat No.DFBN10)。ELISA实验按照试剂盒的提示进行操作。样品(抗原)被置于微滴定板翻开的孔中，并使之吸附到孔壁上。然后用封闭试剂(如牛血清白蛋白或脱脂乳蛋白)处理孔，以覆盖孔中未结合抗原的区域。然后向孔中加入含标志物抗体的合适缓冲液，孵育微滴定板，使抗体结合吸附在每个孔壁上的抗原。然后用能结合标志物抗体(一抗)的酶偶联抗体(二抗)结合孔中标志物抗体。最后加入二抗的显色底物，并通过酶标仪(EnSpire,Mulimode Plate Reader,PerkinElmer,USA)在560nm的读数检测颜色变化来反映抗原标志物的含量。利用标志物标准样作浓度曲线即可得到以上四种血清外泌体标志物的浓度。

实验结果：

1.血清外泌体的分离纯化

通过超速离心结合过滤的方式成功纯化了对照组和OSAHS组血清外泌体。首先利用电镜负染观察人血清外泌体的大小，形状，发现纯化的外泌体呈圆形，边界清楚，大部分小于100nm(图3.A)。通过纳米颗粒分析仪Delsa Nano C particle analyzer(Beckman-Coulter，USA)显示提取的人的血清外泌体的分布，直径均值86.9nm(图3.B)，符合公认的外泌体大小。Western blot结果提示外泌体的标志蛋白CD63和CD81在外泌体组分中有富集(图3.C)。通过以上实验确认外泌体纯度较高，可以进行蛋白质组学分析。利用NanoSightNS300(Malvern Instruments,UK)检测血清外泌体浓度，结果显示OSAHS患者(12.72±1.45e+11粒子/ml)与非OSAHS患者(9.04±2.48e+11粒子/ml)相比显著增加(图3.D)。

2.血清外泌体比较蛋白组学检测

通过TMT标记的比较蛋白组学的方法(图4.A)，通过比较蛋白组学的策略，在OSAHS患者血清来源的外泌体中一共鉴定到32个蛋白有特异性表达，其中17个蛋白含量增高(△)；15个蛋白含量降低(□)(图4.B)(表2，表3)。

表2.OSAHS患者与对照组相比血清外泌体中表达增加的蛋白

表3.OSAHS患者与对照组相比血清外泌体中表达降低的蛋白

3.血清外泌体蛋白ELISA验证。

通过比较蛋白差异比例、蛋白鉴定的分值、蛋白肽段的覆盖程度，以及蛋白的功能，我们进一步筛选出四种目标标志蛋白HP、CRP、FN和血小板因子4(Platelet factor 4，PF4)进行进一步ELISA验证。这四个血清外泌体蛋白功能如下：

1)PF4：PF4属于CXC细胞因子家族，也叫做CXCL4(chemokine(C-X-C-motif)ligand4)。这种因子从激活的血小板alpha-granules中释放出来，在血小板聚集、促进血液凝固中发挥作用。因此其在损伤修复和炎症中发挥重要作用。

2)CRP：CRP是肝脏产生的急性期反应蛋白，CRP的增高反映了机体的炎症状态。生理状态下，CRP结合表达于死亡细胞或者某些细菌表面的溶血磷脂胆碱(lysophosphatidylcholine)上，通过C1Q复合体激活补体系统，促进巨噬细胞的吞噬作用已清除坏死凋亡的细胞和细菌。CRP在临床上主要作为炎症标志物。临床研究表明，血液中CRP水平增高也和OSAHS疾病有正相关。

3)HP：HP在血液中与血红蛋白(hemoglobin,Hb)有很高的亲和力，结合血红蛋白形成HP-Hb复合物能够抑制血红蛋白的氧化活性，这个HP-Hb被转移到网状内皮系统使Hb降解。临床上HP的监测常用来筛查血管内的溶血性贫血。血管内的溶血性贫血时，Hb释放，导致大量HP结合Hb，使血液中的HP降低。通常HP的血清浓度为30-200mg/dL,在一些急性反应期，HP血清水平增加，例如烧伤、肾病综合征时，HP水平的增加通常伴随着其他急性期反应蛋白如CRP和α-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin)的增加。临床研究表明，OSAHS患者血液中HP水平增高，但并没有进行验证和疾病相关性分析⁵。

4)FN：FN在伤口的修复和愈合中起着十分重要的作用，是促进伤口愈合的关键物质，动脉粥样硬化是普遍危害中老年人身体健康的疾病，现已证明FN参与了这一过程。随着血管硬化程度的增加FN含量呈下降趋势。血浆FN缺乏会引起微血管完整性的破坏和通透性升高，导致血浆大量外渗，血液浓缩，粘度增高，有效循环血量减少，血浆与组织液内平衡失调，引起机体休克等危险情况。研究表明，体内FN的分布和含量与肿瘤的发生、发展是密切相关的。糖尿病人的成纤维细胞外基质蛋白的合成发生改变，FN与胶原的比例降低，即胶原相对含量升高。临床研究表明，OSAHS患者血液中FN水平增高，但并没有进行验证和疾病相关性分析⁴。

通过ELISA验证，发现血清外泌体中CRP含量增加(从10.82±6.47ng/mL血清外泌体增加到23.78±10.56ng/mL血清外泌体)；HP含量增加(从8.51±3.36μg/mL血清外泌体增加到11.51±4.15μg/mL血清外泌体)，而FN含量降低(从138.90±47.23μg/mL血清外泌体降低到87.47±28.51μg/mL血清外泌体)，并且与非OSAHS相比，有显著差异(图5)。提示血清外泌体中CRP和HP的增加和FN的降低很可能用来指示OSAHS疾病及其严重程度。在OSAHS患者中，现有文献中显示血清中FN表达增高(未作验证)⁴，而本研究中显示OSAHS患者外泌体FN含量显著下降，考虑到外泌体成分具有选择性的特征，以上结果很可能是由于表达FN的组织在OSAHS状态下直接将FN释放入血清，而没有选择性包裹到外泌体中，可能和FN的功能发挥相关。同时也提示，血清FN增高，血清外泌体FN降低可能也是OSAHS状态的一种特殊现象，或可组合用于临床诊断。而比较蛋白组学有差异的血清外泌体中的CXCL4/PF4蛋白经ELISA结果显示在对照组和OSAHS组现有样品量并未体现出显著差异，需要增加样本量进一步确认。

血清外泌体蛋白相对血清蛋白来说，检测的准确性和精度更高；通过检测血清外泌体CRP、HP和FN的蛋白差异，将会为临床OSAHS筛选、预警、检测提供更加便捷的方式，大大降低OSAHS检测的人力、物力和财力的消耗。

4.统计分析。

血清外泌体中HP、CRP、PF4和FN的浓度值通过SPSS软件分析，发现均为偏态分布。

利用Spearman's rho(斯皮尔曼秩相关系数)非参数相关性分析发现CRP、FN和HP均与AHI相关。其中CRP与AHI的相关系数为0.567，它的实际显著性小于理论显著性水平0.05，说明相关系数的值不是由偶然因素造成的，即CRP与AHI存在中度正相关；FN与AHI的相关系数为-0.393，它的实际显著性是0.01小于理论显著性水平0.05，说明相关系数的值不是由偶然因素造成的，即FN与AHI存在低度负相关；HP与AHI的相关系数为0.478，它的实际显著性是0.002，小于理论显著性水平0.05，说明相关系数的值不是由偶然因素造成的，即HP与AHI存在中度正相关(表4)。

表4.OSAHS和非OSAHS患者的血清外泌体中CRP、HP和FN与AHI的相关性分析

Speaman’s rho相关分析

将OSAHS患者和非OSAHS患者分为两组，分别赋值1和0，通过非参数检验-两个独立样本检验(Mann-Whitney U检验),从检验统计量中可以看出，血清外泌体中HP的渐进显著性为0.009，单侧显著性为0.008；CRP的渐进显著性为0.000，单侧显著性为0.000；PF4的渐进显著性为0.552，单侧显著性为0.565；FN的渐进显著性为0.001，单侧显著性为0.000；其中，CRP、HP和FN的渐进显著性和单侧显著性均小于0.05，所以得出结论：OSAHS和非OSAHS患者的血清外泌体中CRP、HP和FN的含量不同(表5)。

表5.OSAHS和非OSAHS患者的血清外泌体中CRP、HP和FN含量的非参数检验

Mann-Whitney u检验统计量^a

a.分组变量：OSAHS

将OSAHS患者和非OSAHS患者分为两组，分别赋值1和0，利用二元回归分析(BinaryLogistic)发现年龄、血清外泌体中HP、PF4和FN的浓度值这些变量其P值均大于0.05，没有统计学意义。BMI即身体质量指数(Body Mass Index)和CRP浓度的P值小于0.05，有统计学意义。其中CRP和BMI的置信区间大于1，说明在本项目被检人群中中这两个因素对于OSAHS的患病有意义。OR值说明在其他条件不变的情况下，CRP每增加1ng/mL血清外泌体，OSAHS的发生率提高0.266倍，而BMI每增加1，OSAHS的发生率提高1.088倍(表6)。

表6.自变量年龄、BMI、CRP和因变量是否OSAHS的二元回归分析

方程中的变量

输入的变量：年龄，BMI，CRP

将血清外泌体CRP、HP和FN的含量对OSAHS诊断的ROC曲线分析见图6-图7，各指标的ROC曲线面积及95％的可信区间见表7-表8。各指标的ROC曲线下面积分别为：CRP：ROC曲线下面积0.853(95％置信区间：0.738-0.967，p<0.000)；HP：ROC曲线下面积0.743(95％置信区间：0.584-0.901，p<0.009)；FN：ROC曲线下面积0.815(95％置信区间：0.680-0.950，p<0.001)。找到约登指数最大的点作为临界值(约登指数＝灵敏度与特异度之和减去1)。血清外泌体CRP浓度高于12.04ng/mL时诊断OSAHS的敏感性和特异性分别为80％和75％，血清外泌体HP浓度高于9.15μg/mL时诊断OSAHS的敏感性和特异性分别为75％和75％，血清外泌体FN浓度低于114.12μg/mL时诊断OSAHS的敏感性和特异性分别为65％和90％。以上血清外泌体中的生物标志物CRP、HP和FN在OSAHS辅助诊断中是潜在的生物标志物，其临床应用价值有待进一步评估。

表7.CRP和HP预测OSAHS的ROC曲线下面积及95％的可信区间

曲线下面积

表8.FN预测OSAHS的ROC曲线下面积及95％的可信区间

曲线下面积

参考文献

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9.Hu G,Drescher KM,Chen XM.Exosomal miRNAs:Biological Properties andTherapeutic Potential.Front Genet 3,56(2012).

Claims (10)

1.蛋白标志物的检测试剂在制备用于检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的试剂盒中的应用，其中所述蛋白标志物选自C-反应蛋白、结合珠蛋白和纤连蛋白，所述试剂盒检测的是受试者血清外泌体中所述蛋白标志物的浓度，其中与正常对照相比，所述受试者血清外泌体中C-反应蛋白浓度上升、结合珠蛋白浓度上升和/或纤连蛋白浓度下降指示阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的概率上升。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述检测试剂为所述蛋白标志物的特异性抗体。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者血清外泌体中C-反应蛋白的浓度高于12.04ng/mL血清外泌体、结合珠蛋白的浓度高于9.15μg/mL血清外泌体和/或纤连蛋白的浓度低于114.12μg/mL血清外泌体时指示阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的概率上升。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中所述受试者血清外泌体中C-反应蛋白浓度上升、结合珠蛋白浓度上升和纤连蛋白浓度下降的组合指示阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的概率上升。

5.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中受试者血清外泌体中所述蛋白标志物浓度的变化与选自下列诊断方法的结果组合以检测所述受试者是否患有阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征：受试者鼻咽腔及头颈部的解剖结构检查、多导睡眠图、睡眠指数；

优选地，所述睡眠指数选自呼吸暂停低通气指数、呼吸干扰指数、多睡眠潜伏期测试、ASDA微觉醒指数、以及慢波与REM睡眠的时间百分比。

6.一种用于检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的试剂盒，其包括用于一种或多种测定的试剂，所述测定设定成检测受试者血清外泌体中选自C-反应蛋白、结合珠蛋白和纤连蛋白的一种或多种蛋白标志物的浓度，其中与正常对照相比，所述受试者血清外泌体中C-反应蛋白的浓度上升、结合珠蛋白的浓度上升和/或纤连蛋白的浓度下降指示阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的概率上升。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述试剂选自C-反应蛋白、结合珠蛋白和纤连蛋白的特异性抗体。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其包括用于检测受试者血清外泌体中C-反应蛋白、结合珠蛋白和纤连蛋白三者的试剂。

9.一种用于检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的系统，其包括：

一种或多种试剂，其用于检测受试者血清外泌体中的一种或多种蛋白标志物的浓度，所述蛋白标志物选自C-反应蛋白、结合珠蛋白和纤连蛋白；

测定仪器，其用于执行所述蛋白标志物浓度的检测；

优选地，所述测定仪器选自ELISA检测仪器、Luminex液相芯片蛋白分析平台和流式细胞仪。

10.根据权利要求9所述的系统，其还包括执行选自鼻咽腔及头颈部的解剖结构检查、多导睡眠图和睡眠指数的仪器；

优选地，所述睡眠指数选自呼吸暂停低通气指数、呼吸干扰指数、多睡眠潜伏期测试、ASDA微觉醒指数、以及慢波与REM睡眠的时间百分比。