CN108350501A - 环状rna作生物标记诊断内皮功能紊乱的系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环状RNA作生物标记诊断内皮功能紊乱的系统及方法，所述系统及方法确定来自肥胖(OB)或阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)儿童的血浆外泌体可导致内皮功能障碍(ED)。这种ED外泌体能导致内皮细胞中粘附分子的上调。外泌体miRNA运载物的差异是构成ED存在机制的基础。特别地，在患有ED的肥胖和OSA儿童的环状外泌体中，miRNA‑630的表达降低，而经过对内皮功能的恢复治疗后，其在ED的OSA患儿身上的表达又恢复正常。这些发现阐明了外泌体miRNA‑630作为儿童血管功能的假定关键调节因子和心血管疾病风险的生物标志物的新作用。

Description

环状RNA作生物标记诊断内皮功能紊乱的系统及方法
技术领域
本发明涉及诊断内皮功能紊乱的系统及方法，尤其涉及一种用环状RNA作生物标记诊断内皮功能紊乱的系统及方法。
背景技术
肥胖儿童罹患阻塞性睡眠呼吸暂停症的风险日益增高。这两种病情与内皮功能紊乱(endothelial dysfunction,ED)均有着紧密的联系，内皮功能紊乱是儿童心血管疾病的早期危险因素。尽管减肥和对OSA的治疗能改善内皮功能，但并非每个患有肥胖或OSA的儿童都会产生ED。血浆中常见有纳米大小的膜囊泡外泌体，其含有可以转运到内皮细胞及其他细胞中的功能性mRNA及miRNA。现有技术方法表明，环状外泌体中的差异miRNA可能是患有肥胖和OSA的儿童的二分血管表型的基础。
本发明的方法专注于血浆外泌体，所述血浆外泌体来自肥胖儿童或非肥胖的OSA儿童，主要来自内皮细胞源，即有无ED的人内皮细胞以及注射入小鼠后的体内实验。且在ED儿童的环状外泌体内，miRNA-630的表达下降，而经过对内皮功能的恢复治疗后其表达变为正常。相反，使用miRNA-630抑制剂转染无ED受试者的外泌体可诱导ED功能表型。基因靶标发现实验进一步表明，miRNA-630可调控内皮细胞中的416个基因靶标，其中包括Nrf2、激酶和紧密连接通路。本发明揭示了外泌体miRNA-630是儿童血管功能与CVD风险的关键中间物，并确定治疗靶向。
发明内容
本领域技术人员根据本揭露的说明书、权利要求书以及说明书附图的指引，能够理解本发明的其他方面。肥胖症作为儿童中常见的病症，诱发心血管疾病(CVD)的风险很高。相似地，阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)也是一种流行的小儿疾病，与心血管疾病的发病率具有典型相关性，主要表现为全身血压失调导致心室重塑，以及动脉粥样硬化的前兆——改变内皮功能。此外，肥胖儿童患上OSA的概率极高。然而，通过闭塞后充血反应测量，不是每个患有严重的OSA或肥胖的儿童都会表现出内皮功能失常，并且CVD易感性的决定因素的发生机制也尚未明确。因此，已经有研究致力于确定病变心脏和脉管系统的分子学及病理学特征，以开发新的诊疗策略。
细胞间通讯是多细胞生物体的基本标志，可以通过直接的细胞-细胞接触、转移或分泌的分子介导。为了响应生理和病理信号，所有的细胞通过分泌大小、成分不同的囊泡组成的多相混合物进行相互沟通。外泌体作为被研究最多的囊泡，具有30-100nm的囊状结构，其中包含了蛋白质、脂质、RNAs、未转录的RNAs、miRNAs和小RNAs等多种物质。在检测诸如尿液和血浆的生物体液时，这些不同的运载物使得外泌体为生物标记物的发现和无创诊断的发展提供了独特的作用。外泌体内容物的交换表现出一种潜在且值得探索的细胞间交流通路，即miRNAs的转运，而miRNAs是心血管疾病发病几率的可靠指标，同样也构成了潜在的治疗靶向。
本发明表明，与具有正常内皮功能(normal endothelial function,NEF)的OB或OSA儿童的外泌体相比，内皮功能紊乱(ED)——正如异常迟发性闭塞后再灌注动力学表现的——的OB或OSA儿童的血浆外泌体对内皮细胞单层阻抗和紧密连接功能具有不同的影响。这种ED外泌体可引导内皮细胞的黏附分子上调。有研究也表明，外科腺样体切除术治疗非肥胖ED患儿的OSA可以逆转外泌体诱导的变化。此外，已经确定外泌体miRNA运载物的差异是构成ED存在机制的基础。特别地，在患有ED的肥胖或OSA儿童的环状外泌体中，miRNA-630的表达降低，而经过对内皮功能的恢复治疗后，其在ED的OSA患儿身上的表达又恢复正常。此外，用miRNA-630抑制剂转染来自NEF受试者的外泌体，诱导出了ED功能表型，而用miRNA-630拟似物转染ED患儿的外泌体则消除了异常的内皮功能。这些实验方法进一步揭示了miRNA-630与培养物中幼稚内皮细胞中的转录组靶标签相关。综上所述，这些发现阐明了外来体miRNA-630作为儿童血管功能和心血管疾病风险的假定关键调节因子的新作用，并推断出了治疗靶点。
附图说明
图1描绘了使用Bionalyzer、蛋白质印迹和电镜分析法，得到的具有和不具有内皮功能障碍的儿童体内血浆外泌体的表征。对总RNA进行质量控制评估用于基因芯片分析。从血浆中分离出总RNA，包括miRNA。图(A)显示了血浆中总RNA的生物分析概况，图(B)显示了包括血浆外泌体miRNA的总RNA。与细胞RNA相比，RNA含量显著不同，大多数外泌体RNA低于200个碱基，并且具有很少或不具有28S和18S核糖体RNA的条带。以Y轴表示荧光，X轴表示时间(s)。图(C)是蛋白质印迹，其显示血浆蛋白中不存在CD63蛋白，但CD63蛋白通常在外泌体中富集(图C)。图D显示了具有典型形态和大小(30-120nm)的外泌体的电镜照片。使用流失细胞术表明，与相应的肥胖或OSA患儿的正常内皮功能相比，来自ED受试者(肥胖或OSA)的外泌体主要源自内皮细胞(EC)或内皮细胞祖细胞(ECP)(图E)。
图2描述了外泌体介导对内皮细胞单层阻抗的体外作用，以及对血管功能的体内作用。图A：对原代人内皮细胞进行免疫荧光处理后，得到的有免疫荧光标记的血浆外泌体的典型图像，显示出外泌体已进入细胞中。下面的Tmax(肥胖或OSA患儿中内皮功能的量度)散点图，是在24小时，血浆外泌体对内皮细胞单层阻抗(ECIS)的作用图(R2＝0.85,p<0.0001；n＝41)。图B：经过对内皮功能紊乱(OBed)和非内皮功能紊乱(OBnef)的肥胖症儿童和对照组儿童(Control Children,CO)的外泌体处理过后，ECIS随时间变化的示例性集合平均曲线(n＝12/tracing)。图C：闭塞后再灌注动力学的典型实例(闭塞时间为5min)，从内皮功能正常的OSA患儿(OSAnef)身上获得i.v.外泌体，对小鼠进行注射，每日一次，注射三天；从年龄性别和体重指数(BMI)相同的内皮功能紊乱的OSA患儿(OSAed)获得外泌体，以同样的方法对小鼠进行注射。结果表明，注射ED外泌体的小鼠中，再灌注峰值(Tmax)的出现时间延迟；图D：从年龄、性别、BMI相同的OSAed和OSAnef儿童中获取外泌体对小鼠进行注射后，代表性地对小鼠的Tmax进行测量；图E：分别用对照组(CO)、OSAed、OSAnef、OBed和OBnef儿童的外泌体注射小鼠后，小鼠的Tmax值(n＝8/group；line indicate p<0.001)；图F：分别用OBed，OBnef，年龄、性别、AHI和BMI均相同的OSAed和OSAnef儿童的外泌体处理原代人内皮细胞，得到至少6个独立实验的典型图像，显示了原代人内皮细胞中，外泌体诱导V-钙粘蛋白、ZO-1、ICAM-1和VCAM1的表达的变化。所有代表性图像的比例尺均为25μm。
图3描述了miRNA-630的拟似物和抑制剂对ED和NEF外泌体在内皮细胞单层阻抗和ZOI功能变化方面的影响。图A：左图是用参比荧光标记的miRNA-630拟似物转染原代人内皮细胞后，血浆外泌体的免疫荧光图像；下方的图为对6个OSAed儿童的外泌体经过miRNA-630拟似物或其错义模拟序列处理后，ECIS随时间变化的示例性集合平均曲线，，对照组不含外泌体；中间的图：分别用不含外泌体，经miRNA-630拟似物或错义模拟序列转染过的OSAed外泌体，和经miRNA-630抑制剂或错义序列(n＝8-12/实验组)转染过的OSAnef外泌体处理24小时后，得到的单层阻抗标准测量值的变化情况；右图：分别用不含外泌体，经miRNA-630拟物或错义模拟序列转染过的OBed外泌体，和经miRNA-630抑制剂或错义序列(n＝8-12/实验组)转染过的OBnef外泌体处理24小时后，得到的单层阻抗标准测量值的变化情况。图B：分别用OBed，OBnef，年龄、性别、AHI和BMI均相同的OSAed和OSAnef儿童的外泌体处理原代人内皮细胞，得到至少6个独立实验的典型图像，显示了原代人内皮细胞中，外泌体诱导ZO-1的表达的变化。ED受试者的外泌体经过miRNA-630拟似物或错义模拟序列转染，而作为对照组的NEF受试者的外泌体经过miRNA-630抑制剂或错义序列转染。
图4描述了人内皮细胞中miRNA-630的基因靶标。左侧热图显示的差异表达的基因，是将miRNA-630拟似物或对照处理7个ED儿童的外泌体的效果比较实验后确定的。右侧热图显示的差异表达的基因，是经过miRNA-630抑制剂处理8个NEF儿童的外泌体，以及对照处理7个NEF儿童的外泌体的效果比较实验后确定的。这些实验表明，内皮细胞中共有416个基因，对应于10条主要的功能通路，其中的Nrf2和紧密连接通路用于阐明本文论点。使用qRT-PCR方法，此前假定的mRNA序列中的miRNA-630基因靶标也得到证实。
具体实施方式
本发明具有不同形式的具体实施方式，将结合附图详细说明。任何基于本发明公开的技术方案及其发明构思的特定实施方式都应属于本发明原理的示例。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，而不用于限定本发明。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明优选实施例的说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
受试者
本发明的创造性方法学的研究得到每个参与中心的人类学科委员会(芝加哥大学IRB协议##09-115-B，以及布尔戈斯和索里亚健康领域临床研究委员会协议#603)的支持，并从每位参与者的法定监护人获得了知情同意书。我们邀请来自社区的健康的肥胖或非肥胖青春期前儿童(年龄4-12岁)以及被多导睡眠系统诊断为OSA的打鼾的儿童参加实验。所有参与者都接受了基线人体测量和血压评估，以及夜间多导睡眠监测，这些都是用标准方法实施的。早晨进行内皮功能测定，随后进行空腹抽血。闭塞释放后达到最大局部血流量时间(Tmax)代表闭塞后充血反应，所述Tmax是一氧化氮(NO)-依赖性内皮功能指数。Tmax>45秒即为内皮功能异常。除了闭塞时间设定为5分钟以外，在8-12周龄C57b16小鼠中也进行了几乎相同的测试。
按照本发明的方法对参与研究的儿童进行分组。对照组：健康的、不打鼾的多导睡眠图测试为正常的儿童，BMI总分<1.34，且Tmax正常；肥胖的(OB)、多导睡眠图测试为正常的儿童，例如，BMI总分为1.65，具有正常的Tmax(OBnef)或非正常Tmax(OBed)；打鼾的、多导睡眠图测试为非正常并确诊为OSA的儿童，其BMI总分为1.65，具有正常的Tmax(OSAnef)或非正常Tmax(OSAed)。
排除标准
患有高血压或使用降压药的儿童被排除(n＝14)。此外，患有糖尿病(空腹血糖120mg/dL；n＝17)，颅面、神经肌肉或确定有遗传综合征的和接受慢性抗炎治疗的儿童(n＝11)，或任何已知的急性或慢性疾病的儿童也被排除在外。另外，使用精神兴奋剂等拟交感神经药物的儿童(n＝22)没有进行测试。
血液测试
在早晨进行内皮功能测试后，立即通过静脉穿刺抽取空腹血样，并使用标准实验室技术检测血脂浓度。
外泌体分离，标记和表征
使用标准方法从血浆中分离外泌体，使用Exo-Glow kit进行荧光标记(cat#EXORIOOA-1；System Biosciences,Inc.,Mountain View,CA)，并递送给内皮细胞，对小鼠进行体外或体内实验。类似地，使用如图1所示的FACS和电镜方法测定外泌体的细胞来源和大小。
原代内皮细胞培养环境
人微血管内皮细胞购自Lonza(型号：CC-2543；Allendale，NJ)，并在Dulbecco改良伊格尔培养基中培养，培养基中含有4.5g/L葡萄糖，3,7g/L碳酸氢钠，4mmol/L谷氨酰胺，10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素，pH值7.4，并放置在37℃和5％CO2的细胞培养箱中。为了持续的温水培养，将细胞用胰蛋白酶消化并以150xg离心7分钟，稀释后以合适的密度重新铺在培养基上。使用的细胞全部是传代前的细胞。
细胞电阻抗传感器(ECIS)和免疫荧光
内皮细胞生长至融合到ECIS阵列中作为单一融合单层，ECIS监测用作细胞生长基底的小型250微米直径电极的阻抗，并且随着细胞在所述电极上生长，它们能收缩电流改变阻抗。将外泌体添加到复孔中，并置于ECIS仪器(Applied Biophysics Inc,Troy,NY)中连续监测至24小时。使用培养基(300μL/孔)单独建立基线，并与使用500μL培养基中的单层细胞覆盖的电极获得的值进行比较。对于免疫荧光染色，融合的内皮细胞单层在12个盖玻片上生长，然后在盖玻片上单独添加从受试者分离的外泌体处理24小时。将细胞固定，透化处理，然后分别用1:400的ZO-1、1：400的VE-钙粘蛋白(Life Technologies，Grand island，NY，USA)、1：250的ICAM-1和1：100的VCAM1(圣克鲁斯生物技术公司，达拉斯，TX)处理，在4℃通宵孵育。使用Alexa488或Alexa-594作为二级抗体(1：400，2mg/ml；Life technologies，Grand Island，NY)，用1：1 000的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)(LifeTechnologies，Grand Island，NY)进行核染色。用带有63x油浸透镜的Leica SPS TandemScanner Spectra 2-photon共焦显微镜(Leica Microsystems,Inc.，Buffalo Grove，II)捕获图像。
外泌体细胞的摄取
为了评估一部分试验(n＝6-8)中摄取细胞的外泌体的情况，用ExoGreen染色剂对外泌体染色，所述ExoGreen染色剂基于carboxy fluorescein Succinimidyl diacetateester chemistry(SBI，Mountain View，CA)，并且用带有63x油浸透镜的Leica SPS TandemScanner Spectral 2-photon共聚焦显微镜(Leica Microsystems，Lie，Buffalo Grove，IL)获取图像。
miRNA的分离与微排列
依据制造商的说明书(Qiagen，Tumberry Lane，Valencia，CA，USA)，使用安捷伦人类miRNA微阵列(安捷伦科技公司)进行分析，使用基于miRNeasy Mini试剂盒的系统分离包括rniRNA的总RNA。所述安捷伦人类miRNA微阵列由代表2006年人类miRNA的原位合成的60-mer DNA探针组成。经过杂交和洗涤后，用安捷伦microanay扫描仪进行高动态范围设置对结果进行扫描，并使用安捷伦特征提取软件(v11.0)对结果进行提取。如果两组中至少有一组的信号>50％超过检测限(“远高于背景”标记＝1)，则认为特征是可探测的，并且如果>50％的复制特征可检测到，则认为探针是可探测的。
基因本体论(GO)和功能注释
GO注释的分析通过应用DAVID(注释数据库，可视化和集成发现(DAVID6.7)功能注释工具来执行。该DAVID软件(http://david.abcc.nciferf.gov/)能够识别与给定基因列表相关联的最相关的(过度表示的)生物学术语。DAVID功能注释群集工具基于其相关的GO注释对基因进行分组，并且将相关术语根据富集分数进行聚类，所述富集分数由其EASE分数(修饰后的Fisher Exact P值)计算得来。此外，网络服务器支持KEGG数据库的更新版本，提供基于KEGG路径描述的一相关搜索模块。
miRNA拟似物和抑制剂的体外和体内实验
如制造商在协议中(cat#EXFT20A-1；System Biosciences,Inc.SBI,MountainView,CA,USA)所描述的，使用Exo-FectTM外泌体转染试剂对外泌体进行转染。简单地说，在每个反应中加入50μl的纯净外泌体(100μg)，并加入如下试剂：10μl的Exo-Fect溶液，20μl(20pmol)的miRNA拟似物或抑制剂，70μl无菌1x PBS。将混合物在37℃下的混合器中孵化10分钟，然后加入300μl Exoquick-TC以停止反应。样品以13,000rpm离心3分钟。将转染的外泌体重新悬浮于300μl 1x PBS中，并用于miRNA拟似物和目标抑制剂的ECIS系统中(75μl加入到外泌体消耗的约5×105个细胞/孔的PBS12孔培养基中，并且在整个条件下达到相同的外泌体浓度。miRNAs拟似物和抑制剂购自Life Technologies(美国纽约，格兰德岛)。使用Acridine Orange chemistry的ExoRed进行标记(SBI，Mountain View，CA)。使用qRT-PCR通过miRNA-630拟似物或抑制剂分别对miRNA-630外泌体含量特别预期的增加或减少进行验证。
数据分析
除非另有说明，结果均用平均值±SD表示。对所有的数值数据都进行统计分析，使用独立的斯图登检验或方差分析，然后酌情进行事后检验(Tukey)。对各组人口统计特征的确切数据进行卡方分析。进行皮尔逊相关检验以建立几个研究参数之间的关联，包括ECIS派生的归一化电阻变化和内皮功能试验中的Tmax。最后，进行典型相关分析以探索各组变量之间的关系。使用SPSS软件(版本21.0；SPPS Inc.，Chicago，Hi.)进行统计分析。对于所有比较，我们认为双侧p<0.05可定义为有统计显著性。
结果
受试者特征
此项研究共由128名儿童参与。表1为他们的人口统计学与多导睡眠图特征。2个OSA副组中不存在年龄、性别和种族差异，但OSAed儿童的BMI总分要比OSAnef或CO儿童的略低(表1)。OBed与OBnef儿童表现出的BMI总分并无差异。正如障碍性AHI或最低的SpO2水平，收缩压和舒张压，或OSAed和OSAnef儿童之间的血脂谱所显示的，OSA严重程度无显著差异，但这些测量值与CO儿童的显著不同(表1)。正如ED定义所预计的那样，与OBnef(33.2±7.3秒；p<0.01)、OSAnef(31.6±6.2秒；p<0.01)和CO(29.9±5.1秒；p<0.01)相比，OBed和OSAed组的Tmax都显著延长(56.8±8.6秒和54.7±8.5秒)。手术切除16例OSAed患儿的扁桃体和腺样体，并在术后4～8个月内按照方案进行第二次评估。这些儿童在睡眠期间的呼吸障碍恢复正常(AHI从15.7±4.7/小时的睡眠时间减少到0.7±0.4小时，p<0.001)，而除一名儿童以外，所有儿童的内皮功能均正常化(Tmax从57.7±8.5秒下降到37.8±7.3秒，p<0.001)。
表1：具有和不具有内皮功能障碍的OSA儿童、肥胖儿童与健康的对照组儿童的一般特征。
*p<0.05；**p<0.01
外泌体的细胞来源
图1示出了外泌体的表征程序。ED与NEF儿童的血浆外泌体的总浓度相似。然而，与单核细胞、T细胞淋巴细胞或嗜中性粒细胞没有显着差异的NEF儿童相比，ED儿童的外泌体越来越多地源于内皮细胞或内皮祖细胞。来自血小板的外泌体浓度仅在患有OSA和ED的儿童中增加，在无OSA的ED患儿中不增加。事实上，OSA儿童的血小板外泌体增加了很多(在OSAed中增加了852±122/10000，在OSAnef中增加了367±89/10000，在OBed或OBnef中增加了228±78/10000；且在对照组中增加了217±81/10000，与所有其他组相比，OSAed组的p<0.01)。
外泌体对内皮细胞单层的效应
将可商业获取的人原代内皮细胞进行单层培养，并根据OB和OSA组使其接触来自NEF和ED患儿的外泌体。持续监测ECIS归一化电阻值，ED儿童的外泌体单层电阻显著减少，这在NEF儿童中不存在或显著减弱(图2)。值得注意的是，在6小时(数据未显示)或24小时处的ECIS值与相应的Tmax值强相关(图2)。此外，V-钙粘蛋白的不连续性，紧密连接蛋白ZG-1的形状分布改变，且粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达增加，这些表明ED来源的外泌体诱导破坏了内皮细胞膜(图2)。类似地，与来自健康的受试者的外泌体相比，OSA或OB儿童的ED外泌体，但不是NEF外泌体(来自OB，OSA或对照组儿童)，诱导内皮一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达的显着降低(ED：57.6±8.9％，NEF：2.9±5.2％；p<0.001)。将从ED(OB或OSA)或NEF(OB，OSA和对照组)的儿童分离的血浆外泌体静脉注射到小鼠中，并在注射后24和48小时评估血管功能。在施用ED外泌体(肥胖和OSA)之后的Tmax显著延长，但与对照相比，在用NEF外泌体处理后的Tmax缺失(图2)。对患有ED的儿童的OSA进行腺样体切除术(Tx)治疗不仅使他们的Tmax正常化，而且导致血浆外泌体诱导的内皮细胞单层电阻变化也变得正常(处理前Tx：-37.8±7.4％，处理后Tx：-4.7±4.6％；n＝15；p<0.001)。
外泌体miRNA运载物
最初使用miRNA阵列探索NEF与ED儿童的miRNA外泌体内容物间的差异，并且发现，在肥胖或OSA状态独立的两组中，有5个miRNAs的限制性簇发生了一致的改变，其中ED中有4个miRNAs的丰度减少(miRNA-16-5减少了3.18倍，p<0.0001；miRNA-451a减少了3.74倍，p<0.0001；miRNA-5100减少了1.65倍，p<0.01；miRNA-630减少了4.11倍，p<0.0001)，且1个miRNA的丰度增加(miRNA-4665-3p增加了2.35倍，p<0.01)。随后在所有组(n＝20/组)中使用的qPCR验证并确认了这些发现。此外，对OSA和ED患儿进行治疗后发现，他们的外泌体miRNA-630显著降低，且miRNA-16-5p恢复到健康对照组儿童的水平(miRNA-630：处理前Tx：4.76±0.97与处理后Tx0.19±0.32，n＝15，p<0.001；miRNA-16-5p：处理前Tx：-2.87±0.45，处理后Tx：-0.87±1.65，p<0.01)。
miRNA-630与内皮功能
为了探索小儿ED的miRNA运载物的预期功能，基于ED和NEF的肥胖与OSA儿童之间表达的最大倍数差异以及OSA患儿在Tx之后的最大反应，我们选择miRNA-630作为初始候选物。为此，分别将特定的miRNA-630拟似物和抑制剂转染到ED和NEF的血浆外泌体中(使用了对照处理、拟似物的错义序列和抑制剂)。拟似物诱导的ED外泌体中miRNA-630含量的恢复显著改善了不利的ED外泌体诱导的对内皮细胞单层阻抗的ECIS测量和对肥胖或OSA儿童的内皮细胞中ZO-1紧密连接免疫荧光的影响(图3)，并且在以对照组外泌体为参照时，还恢复了eNOS mRNA的表达(miRNA错义序列处理的内皮细胞中为0.56±0.17，miRNA拟似物处理的内皮细胞中为0.94±0.29；n＝4；p<0.05)。相反，用miRNA-630抑制剂转染NEF外泌体则与单层阻抗的破坏和ZO-1在内皮细胞中的分布改变有关(图3)，也与内皮细胞中eNOS表达的降低相关(miRNA-630抑制剂处理后为0.47±0.22，miRNA错义序列处理后为1.04±0.33；n＝5；p<0.02)。
内皮细胞中的miRNA-630基因靶标
图4为基于差集的用于描绘人内皮细胞中miRNA-630基因靶标的试验示意图。使用全基因组转录组学分析，在内皮细胞的miRNA-630中共识别出416个基因靶标(图3)，并对应于10个主要规范通路(表2)。这些通路中值得关注的是如NRF2介导的氧化应激反应，AMP激酶和紧密连接信号传导通路(图4)。
表2：内皮细胞中416个基因靶标中的前10个典型miRNA-630基因靶标通路。
讨论与结论
该研究显示，有肥胖症或OSA的ED患儿的血浆外泌体可诱导内皮细胞中明显的体外与体内功能和结构的改变，主要由源自内皮细胞和内皮祖细胞的各种外泌体miRNA运载物所调节。在差异表达的外泌体miRNAs中，miRNA-630表达的减少是ED的显著效应器，并且miRNA-630外泌体水平的恢复似乎可纠正内皮细胞中ED外泌体的干扰，而抑制NEF外泌体中的miRNA-630则重现了由内皮细胞中ED外泌体反应所引起的干扰。综上所述，我们确定了一种基于微泡的miRNA介导机制，该机制在CVD风险增加的儿童中选择性地改变。
闭塞后充血试验为评估内皮功能提供了稳健可靠的无创方法，同时能够准确报告eNOS来源的一氧化氮在循环中的生物利用度。此外，越来越多的证据表明，血管重塑从有ED背景的儿童早期开始逐渐发生，直到晚年CVD风险的增加。在目前的研究中，我们确定了两种先验的不同的病症，这两种病症都与血管功能障碍风险增加有关，即肥胖和OSA。在用ED或NEF受试者的外泌体处理幼稚培养的内皮细胞后，eNOS表达的变化程度显著不同，这与外泌体是否来自肥胖儿童或OSA非肥胖儿童无关。此外，ECIS实验中单层电阻的变化与Tmax密切相关，这表明eNOS的表达和外泌体处理后单层电阻的变化提供了体内内皮功能的准确生物相关性。此外，将不同受试组的外泌体以相同剂量静脉注射到其他健康小鼠体内后，这些动物产生明显不同的闭塞后充血反应，这与对儿童的初始研究结果相吻合。这些试验提供了确凿的证据，证明循环外泌体在儿童中的生物学特性足以诱导血管表型，并因此推进对所述外泌体运载物的探索，以鉴定可能介导血管缺陷的潜在候选物，所述血管缺陷可在患有肥胖、OSA或二者皆有的儿童中观察到。然而，由于对任何给定儿童可用的血浆数量有限，我们无法从目前的研究中推断出不同细胞中的外泌体对体外或体内内皮功能异常的具体作用。
一些报道已经显示，miRNAs在来自不同细胞类型的外泌体中主动分泌，突出了其作为旁分泌细胞间信号传导分子的可能性。选择这些外泌体miRNA作为主要的研究方向并非是随机的，而是因为此前的工作暗示外泌体miRNA不仅在血管生成和其他血管现象中起作用，而且可能提供治疗的可能性。此外，我们最近提出了血浆miRNA作为血管功能障碍的候选生物标志物的潜在作用，并且其初步的发现将支持驱动假设，即一组循环miRNAs可以可靠地区分出ED和NEF儿童。
在通过微阵列方法鉴定的5种差异miRNAs中，对文献的搜索揭示了这些miRNA在可能关于血管靶标和组织表达方面的大多数的稀缺信息。在这种情况下，基于miRNA-630在ED儿童中的表达显著减少与在OSA儿童治疗后外泌体中的显著增加，以及其在癌症背景下与血管生成和凋亡过程的早期关联，选择miRNA-630用于进一步检查。值得注意的是，在心脏衰竭的情况下，miRNA 16-5p与心脏细胞功能有关，并且存在于心包液中。根据目前miRNA与其mRNA靶标结合并诱导其下调的共识，miRNA水平的降低可能与特定靶基因和蛋白质表达的增加相关。将miRNA-630拟似物和抑制剂并入外泌体的试验能够对内皮细胞中miRNA-630的功能作用进行具体评估，并证实了该外泌体miRNA在血管系统中的机制作用。此外，转录组学策略确定了内皮细胞中这种miRNA的416个基因靶标，明确涵盖了血管稳态中的良好途径，如Nrf2，AMP激酶途径和细胞间紧密连接42-44的调节。
综上所述，我们已经表明，二分支血管结果——例如通过闭塞后充血反应发现OSA患儿或无OSA的肥胖儿童中内皮功能障碍的存在与否——可以通过血浆外泌体的体外或体内作用进行重现。这种外泌体诱导非幼稚内皮细胞的orurine血管反应的变化可以至少部分地通过miRNA-630表达的变化及其对约416个基因靶标的下调作用来实现。对造成OSA或肥胖患儿的个体血管易感性差异机制的更深入的理解，应该能够改善疾病表型，以及为将来有CVD患病风险的儿童制定更个性化的治疗策略。

Claims (2)

1.一种环状RNA作生物标记诊断内皮功能紊乱的系统及方法，其特征在于，所述系统及方法为说明书中的任意实施例和任意配置。
2.一种诊断和鉴定处于心血管疾病发生风险中的儿科患者的系统和方法，其特征在于，包括使用来自血浆或来自血浆外泌体的miRNA的选择性标记来诊断内皮功能障碍。
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