CN107741498A - 一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：将玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，清洗干净；取氮掺杂碳量子点N‑CQDs溶液滴到电极表面；待电极近干时，滴加1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)‑碳化二亚胺EDC和N‑羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，晾干；滴加牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点；滴加一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，冲洗电极表面，干燥；滴涂银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面。本发明根据上述步骤制的用于检测肿瘤标志物免疫传感器，检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强。
Description
技术领域
本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法。
背景技术
肿瘤是人类健康的杀手。恶性肿瘤也称为癌症，是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，它是机体受各种内在或外在致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失掉了对其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。据WHO研究，2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居世界第一位。WHO也指出，及早诊断和治疗是对抗肿瘤疾病的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中产生的、反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、基因等，是肿瘤早期诊断的重要指标。一般而言，肿瘤细胞越多，恶性程度越高，越晚期，肿瘤标志物的浓度越高。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，越来越多的高特异性、低丰度肿瘤标志物被发现，这就对建立快速、高灵敏度、高特异性肿瘤标志物检测技术提出了更高的要求。
免疫分析法是利用抗体与抗原之间的特异性识别与结合而建立的高选择性生物化学方法。目前，检测肿瘤标志物的免疫分析方法主要有：放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、电化学免疫分析法(ECIA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)和免疫电镜法等，这些方法都有一定的灵敏度和准确度，但也各有一定的不足之处：有的仪器昂贵、操作复杂、技术要求高，有的步骤繁多、易出现假阳性和假阴性，有的使用放射性试剂，有的特异性不强、灵敏度不高、选择性差，有的响应时间长、无法重复测量。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的肿瘤标志物检测方法仍是迫切需求。
电化学发光免疫传感器是电化学发光和免疫传感器相结合的产物，由于其灵敏度高、特异性好、重现性好、操作简便等优点，具有广阔的应用前景，并被广泛应用于临床分析和环境检测领域。
氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，是一种性能优异的新型碳材料，具有较高的比表面积和丰富的官能团，而基于氧化石墨烯制备的功能化氧化石墨烯稳定性高、制备简单，是构建电化学发光传感器的理想材料。氮化碳材料(g-C3N4)是一种类似石墨的纳米薄膜，具有比表面积大、稳定性强、硬度大、导电性好、生物相容性良好等特点，并且氮化碳材料本身具有极强的电化学发光的能力，非常适合用于开发电化学发光免疫传感器。目前国内外还没有公开任何关于基于氧化石墨烯和氮化碳两种纳米复合材料的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强的用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种乳腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μL、15～20μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
(3)待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.4～0.6mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.2～0.25mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；
(4)滴加6μL、质量分数为0.5～2.0％的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
滴加6μL、1～50ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
(5)滴涂6μL、1～3mg/mL的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器。
作为优选方案：所述氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备步骤如下：
将0.2～0.3g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于25～35mL的超纯水中，超声分散，继续加热至250℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点N-CQDs的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，9000rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点N-CQDs固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点N-CQDs。
作为优选方案：所述银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：
①磺化碳纳米管的制备
称取1.0～1.5g的多壁碳纳米管置于350mL三口烧瓶中，依次加入77mL浓硫酸和33mL 浓硝酸，150℃油浴下反应50～55min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入1000mL烧杯，加 300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于85～90℃真空干燥箱内干燥15～18h，得到磺化碳纳米管；
②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备
在250mL圆底烧瓶中依次加入12～16mg磺化碳纳米管，80mL、1.5mol/L的盐酸溶液，超声分散2h，加入2.0g4,4’-二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0℃，在搅拌下缓慢加入20mL亚硝酸钠水溶液，反应1.5h，升温至35℃，继续搅拌下反应2.5～3.5h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤4次，无水乙醇洗涤4次，得到的固体超声分散到80mL乙醇中，依次加入80mL乙腈和620mg三苯基磷，搅拌2h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤4次，所得固体90℃真空干燥箱内干燥15h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
所述的亚硝酸钠水溶液是将300mg固体亚硝酸钠溶于15mL超纯水制得；
③银纳米粒子溶液的制备
将2mL、50mmol/L的硝酸银和2mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到50mL超纯水中，然后加入50～55mg硼氢化钠，在搅拌下反应20min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速6000rpm下离心10min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；
④银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备
取10～15mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到35～45mL银纳米粒子溶液中，130rpm 转速下振荡12～15h，离心，90℃真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
将4～8mg的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到2mL超纯水中，加入200μL、100～110μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和1000μL、100mmol/L的pH7.4 磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化15h；在4℃下，8000rpm转速下离心 20min，得到下层沉淀，加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4℃下保存备用。
本发明还提供用于肿瘤标志物免疫传感器的检测，步骤如下：
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20mL、60mmol/L的pH5.10～7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.8V，取样间隔0.05s，运行时间400s；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔10s向20mL、60mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法,以氮掺杂碳量子点为发光材料，利用其良好的光学性能，构建的传感器具有更高的灵敏度；
(2)采用银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管作为检测抗体标记物，碳纳米管有极高的强度和良好的导电性，且对过氧化氢有催化作用，对苯硫酚功能化磺化的碳纳米管有更好的分散性及生物相容性，且功能化的基团可以更好的抗体结合，银纳米粒子对过氧化氢也有催化作用，因此，银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管对过氧化氢的催化作用呈多重的放大作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
实施例1：
一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μL、15μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
(3)待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.4mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.2mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；
(4)滴加6μL、质量分数为0.5％的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
滴加6μL、10ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
(5)滴涂6μL、1mg/mL的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器。
其中：所述氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备步骤如下：
将0.2g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于25mL的超纯水中，超声分散，继续加热至250℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点N-CQDs的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，9000rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点N-CQDs固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点N-CQDs。
其中：所述银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：
①磺化碳纳米管的制备
称取1.0g的多壁碳纳米管置于350mL三口烧瓶中，依次加入77mL浓硫酸和33mL浓硝酸，150℃油浴下反应50min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入1000mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于85℃真空干燥箱内干燥18h，得到磺化碳纳米管；
②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备
在250mL圆底烧瓶中依次加入12mg磺化碳纳米管，80mL、1.5mol/L的盐酸溶液，超声分散2h，加入2.0g4,4’-二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0℃，在搅拌下缓慢加入20mL亚硝酸钠水溶液，反应1.5h，升温至35℃，继续搅拌下反应2.5h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤4次，无水乙醇洗涤4次，得到的固体超声分散到80mL乙醇中，依次加入80mL乙腈和620mg三苯基磷，搅拌2h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤4次，所得固体90℃真空干燥箱内干燥15h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
所述的亚硝酸钠水溶液是将300mg固体亚硝酸钠溶于15mL超纯水制得；
③银纳米粒子溶液的制备
将2mL、50mmol/L的硝酸银和2mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到50mL超纯水中，然后加入50mg硼氢化钠，在搅拌下反应20min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速6000rpm下离心10min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；
④银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备
取10mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到35mL银纳米粒子溶液中，130rpm转速下振荡12h，离心，90℃真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
将4mg的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到2mL超纯水中，加入 200μL、100μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和1000μL、100mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化15h；在4℃下，8000rpm转速下离心20min，得到下层沉淀，加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4℃下保存备用。
本发明实施例还提供用于肿瘤标志物免疫传感器的检测，步骤如下：
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20mL、60mmol/L的pH6.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.8V，取样间隔0.05s，运行时间400s；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔10s向20mL、60mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
实施例2：
一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μL、20μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
(3)待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.6mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.25mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；
(4)滴加6μL、质量分数为2.0％的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
滴加6μL、50ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
(5)滴涂6μL、3mg/mL的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器。
作为优选方案：所述氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备步骤如下：
将0.3g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于35mL的超纯水中，超声分散，继续加热至250℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点N-CQDs的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，9000rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点N-CQDs固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点N-CQDs。
作为优选方案：所述银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：
①磺化碳纳米管的制备
称取1.5g的多壁碳纳米管置于350mL三口烧瓶中，依次加入77mL浓硫酸和33mL浓硝酸，150℃油浴下反应55min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入1000mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于90℃真空干燥箱内干燥18h，得到磺化碳纳米管；
②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备
在250mL圆底烧瓶中依次加入16mg磺化碳纳米管，80mL、1.5mol/L的盐酸溶液，超声分散2h，加入2.0g4,4’-二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0℃，在搅拌下缓慢加入20mL亚硝酸钠水溶液，反应1.5h，升温至35℃，继续搅拌下反应3.5h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤4次，无水乙醇洗涤4次，得到的固体超声分散到80mL乙醇中，依次加入80mL乙腈和620mg三苯基磷，搅拌2h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤4次，所得固体90℃真空干燥箱内干燥15h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
所述的亚硝酸钠水溶液是将300mg固体亚硝酸钠溶于15mL超纯水制得；
③银纳米粒子溶液的制备
将2mL、50mmol/L的硝酸银和2mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到50mL超纯水中，然后加入55mg硼氢化钠，在搅拌下反应20min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速6000rpm下离心10min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；
④银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备
取15mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到45mL银纳米粒子溶液中，130rpm转速下振荡15h，离心，90℃真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
将8mg的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到2mL超纯水中，加入 200μL、110μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和1000μL、100mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化15h；在4℃下，8000rpm转速下离心20min，得到下层沉淀，加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4℃下保存备用。
本发明还提供用于肿瘤标志物免疫传感器的检测，步骤如下：
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20mL、60mmol/L的pH7.9磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.8V，取样间隔0.05s，运行时间400s；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔10s向20mL、60mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
实施例3：
一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μL、18μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
(3)待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.5mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.22mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；
(4)滴加6μL、质量分数为1.0％的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
滴加6μL、30ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
(5)滴涂6μL、2mg/mL的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器。
作为优选方案：所述氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备步骤如下：
将0.25g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于30mL的超纯水中，超声分散，继续加热至250℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点N-CQDs的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，9000rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点N-CQDs固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点N-CQDs。
作为优选方案：所述银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：
①磺化碳纳米管的制备
称取1.2g的多壁碳纳米管置于350mL三口烧瓶中，依次加入77mL浓硫酸和33mL浓硝酸，150℃油浴下反应55min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入1000mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于88℃真空干燥箱内干燥16h，得到磺化碳纳米管；
②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备
在250mL圆底烧瓶中依次加入14mg磺化碳纳米管，80mL、1.5mol/L的盐酸溶液，超声分散2h，加入2.0g4,4’-二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0℃，在搅拌下缓慢加入20mL亚硝酸钠水溶液，反应1.5h，升温至35℃，继续搅拌下反应3.0h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤4次，无水乙醇洗涤4次，得到的固体超声分散到80mL乙醇中，依次加入80mL乙腈和620mg三苯基磷，搅拌2h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤4次，所得固体90℃真空干燥箱内干燥15h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
所述的亚硝酸钠水溶液是将300mg固体亚硝酸钠溶于15mL超纯水制得；
③银纳米粒子溶液的制备
将2mL、50mmol/L的硝酸银和2mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到50mL超纯水中，然后加入55mg硼氢化钠，在搅拌下反应20min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速6000rpm下离心10min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；
④银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备
取12mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到40mL银纳米粒子溶液中，130rpm转速下振荡14h，离心，90℃真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
将6mg的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到2mL超纯水中，加入 200μL、105μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和1000μL、100mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化15h；在4℃下，8000rpm转速下离心20min，得到下层沉淀，加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4℃下保存备用。
本发明还提供用于肿瘤标志物免疫传感器的检测，步骤如下：
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20mL、60mmol/L的pH6.5磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.8V，取样间隔0.05s，运行时间400s；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔10s向20mL、60mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (3)
1.一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μL、15～20μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
(3)待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.4～0.6mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.2～0.25mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；
(4)滴加6μL、质量分数为0.5～2.0％的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
滴加6μL、1～50ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
(5)滴涂6μL、1～3mg/mL的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备步骤如下：
将0.2～0.3g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于25～35mL的超纯水中，超声分散，继续加热至250℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点N-CQDs的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，9000rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点N-CQDs固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点N-CQDs。
3.如权利要求1所述的一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：
①磺化碳纳米管的制备
称取1.0～1.5g的多壁碳纳米管置于350mL三口烧瓶中，依次加入77mL浓硫酸和33mL浓硝酸，150℃油浴下反应50～55min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入1000mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于85～90℃真空干燥箱内干燥15～18h，得到磺化碳纳米管；
②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备
在250mL圆底烧瓶中依次加入12～16mg磺化碳纳米管，80mL、1.5mol/L的盐酸溶液，超声分散2h，加入2.0g4,4’-二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0℃，在搅拌下缓慢加入20mL亚硝酸钠水溶液，反应1.5h，升温至35℃，继续搅拌下反应2.5～3.5h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤4次，无水乙醇洗涤4次，得到的固体超声分散到80mL乙醇中，依次加入80mL乙腈和620mg三苯基磷，搅拌2h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤4次，所得固体90℃真空干燥箱内干燥15h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
所述的亚硝酸钠水溶液是将300mg固体亚硝酸钠溶于15mL超纯水制得；
③银纳米粒子溶液的制备
将2mL、50mmol/L的硝酸银和2mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到50mL超纯水中，然后加入50～55mg硼氢化钠，在搅拌下反应20min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速6000rpm下离心10min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；
④银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备
取10～15mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到35～45mL银纳米粒子溶液中，130rpm转速下振荡12～15h，离心，90℃真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；
将4～8mg的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到2mL超纯水中，加入200μL、100～110μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和1000μL、100mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化15h；在4℃下，8000rpm转速下离心20min，得到下层沉淀，加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4℃下保存备用。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109541211A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-03-29 | 广东工业大学 | 一种肿瘤标志物在纳米孔中的快速检测方法 |
| CN109633151A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-16 | 西北农林科技大学 | 一种肠炎沙门氏菌检测方法、试纸条及应用 |
| CN112684182A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-20 | 上海大学 | 一种非疾病诊断的检测pd-l1的免疫传感器系统 |
Citations (2)
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| CN104833806A (zh) * | 2015-05-13 | 2015-08-12 | 济南大学 | 一种恶性肿瘤特异性生长因子tsgf抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用 |
| CN105572356A (zh) * | 2016-02-25 | 2016-05-11 | 山东理工大学 | 一种乳腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用 |
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2017
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