CN112684182A - 一种非疾病诊断的检测pd-l1的免疫传感器系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非疾病诊断的检测PD‑L1的免疫传感器系统，包括二胺类客体分子、pSC4‑AuNPs、附着有pSC4的芯片、PD‑L1抗体和Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒，其中，二胺类客体分子与pSC4‑AuNPs连接后在附着有pSC4的芯片表面自组装构筑作为增敏层的3D‑AuNPs，PD‑L1抗体吸附在增敏层上，Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒经过与分析物反应后添加到附着有pSC4的芯片表面从而与PD‑L1抗体进行特异性识别。本发明3D‑AuNPs作为抗体固定基底，超分子层可定向固定抗体，基于细胞内肽的机理作用，可代替抗体构建免疫传感器，且成本较低。

Description

一种非疾病诊断的检测PD-L1的免疫传感器系统
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种非疾病诊断的检测PD-L1的免疫传感器系统。
背景技术
健康机体的免疫细胞能发现和杀灭癌细胞，但在各种先天和后天因素的诱导下，免疫系统会失去杀伤能力，导致癌症的发生和发展。“癌症免疫治疗”，即借助人体自身的免疫系统，去攻击癌细胞的治疗方法。
程序性死亡配体1(PD-L1)是调节T细胞免疫应答的主要分子之一。PD-L1(B7-H1)与CD80和CD86属于同一CD28/B7/CTLA-4家族成员，编码基因位于第9染色体p24。其是Ⅰ型膜蛋白，由单一的疏水跨膜结构域，短胞内结构域，以及胞外区内的两个类Ig结构域，即N端IgV结构域和C端IgC结构域通过短接头连接。PD-1的主要配体是PD-L1，PD-L1为组成性的表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞，肿瘤细胞，间充质干细胞同时也表达于其他多种组织细胞，如血管上表皮细胞、肌细胞、胰岛细胞等。通常在炎症反应中，促炎细胞因子如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的作用使它的表达上调。PD-L1在许多恶性肿瘤中呈高水平表达，如黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌等，提示PD-L1参与肿瘤的发生发展，在减弱抗肿瘤免疫反应中起重要作用。许多恶性肿瘤细胞表面表达的PD-L1与活化T细胞的PD-1结合，促进PD-1ITSM区酪氨酸的磷酸化，抑制下游Akt、ERK等途径的活化，最终抑制T细胞活化所需的基因和细胞因子的转录和翻译，导致肿瘤免疫逃逸。因此，PD-L1的检测成为多种肿瘤免疫治疗的重要指标。对于PD-L1的临床检测对肿瘤的早期诊断、诊疗方案的确定、治疗剂量的优化以及药物疗效的评价具有重要意义。
目前，免疫组化作为一种可预测的生物标志物检测方法,也是目前在临床实验中应用最多的检测PD-L1的方法之一，具有应用广泛、成本效益、快速和成熟的优点。然而，由于操作过程中的不确定因素过多，对实验结果可能造成一定影响。比如制备、处理标本时会影响蛋白质稳定性、固定类型、固定时间、抗原修复技术、存储条件和标本存储时间等因素，使检测所用到的标本的可靠性和可用性不能完全保证。并且该方法对个别患者的预测效果也不理想。例如，一些PD-L1阴性患者对免疫治疗有反应，而一些PD-L1阳性患者对免疫治疗却完全没有反应。并且免疫组化的结果判定主要是人为定性或半定量，存在一定程度的主观性，使得对结果判定的人员和场地有一定要求。国际上对此达成的共识是免疫组化的结果判读需要设立专门的实验室和具备足够经验、熟悉各种PD-L1截断值参考图像的病理学家。故免疫组化检测方法不具备很高的直观分析能力，且专业知识，设备场地等要求过高，不具备通用简便性。实验室常规的聚合酶链反应(PCR)技术可直接在核酸水平特异性检测sPD-L1基因。蛋白质是生物功能的执行者，而基因表达水平与蛋白质表达水平之间没有绝对对应关系，所以通过基因检测很难准确反映病理状态，并且由于其成本较高，一直受到很大的限制。而且现有方法依旧不能将PD-L1低表达的患者与健康人区分开，也不能预测部分患者(约15％的患者)的临床结果，灵敏度还有待提高。重复性较差、易受自身抗体干扰出现假阳性、检测过程中干扰因素过多等缺点也制约着ELISA在PD-L1检测中的应用。流式细胞术相比其他的检测方法拥有强大的分选能力，可在分析的同时分选特定群体(如：设定含量参数值，实现分选)。并且可对多种类型的样本进行检测(培养上清液、细胞裂解液、血清，血浆等)。但流式细胞检测分析的主要对象为细胞或细胞样颗粒物，故其检测前样品制备较为繁琐。并且在将组织解离为单细胞过程中，可能会造成细胞破裂，导致检测结果准确性有待考究。SERS用于分析的优点有，其可以直接以分子特异性的方式检测实验中的待检分子，从而无需分离即可进行原位鉴定。并且检测灵敏度高,分析速度快,是一种颇具潜力的痕量分析技术。然而，SERS检测很容易受到反应混合物中其他成分的干扰，表面分析物的取向变化也会引起光谱的变化。特别是如果表面覆盖率高于约1/10单层，或PH等参数发生变化就可观察到光谱的变化。以及SERS活性基底的材料、纳米颗粒的形状及尺寸、探测物在活性基底上的吸附量和距离等因素都会影响SERS的增强效果。
因此，开发一种快速、准确、灵敏、价廉的PD-L1检测方法成为研究人员迫切需要解决的问题。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种快速、准确、灵敏、价廉并且能够定量PD-L1的检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种非疾病诊断的检测PD-L1的免疫传感器系统，其特征在于，包括二胺类客体分子、pSC4-AuNPs、附着有pSC4的芯片、PD-L1抗体和HomingPeptide功能化的磁包银纳米颗粒，
其中，二胺类客体分子与pSC4-AuNPs连接后在附着有pSC4的芯片表面自组装构筑作为增敏层的3D-AuNPs，PD-L1抗体吸附在增敏层上，Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒被设置为经过与分析物反应后添加到附着有pSC4的芯片表面从而与PD-L1抗体进行特异性识别。
进一步的，磁包银纳米颗粒被替换为磁包金纳米颗粒或者磁包纳米量子点。
进一步的，Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒的制备方法如下：
(1)将1mL磁包银纳米颗粒溶液用PBS洗三次后，加入特异性的10μL 1mg/mLHomingPeptide，磁包银纳米颗粒与特异性的Homing Peptide的体积比为2:1，反应时间4小时，
(2)磁分离，弃上清，重悬于PBS中，即得到Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒。
进一步的，3D-AuNPs的制备方法为将100μL的2mM二胺类客体分子与400μL的pSC4-AuNPs反应10分钟。
本发明还提供一种制备上述免疫传感系统的方法，包括如下步骤：
(a)将3D-AuNPs添加到附着有pSC4的芯片表面上，
(b)在多参数表面等离子体共振仪上采用2μL/min的流速添加500μL的1μg/mLPD-L1抗体与3D-AuNPs反应，后用缓冲液洗涤芯片表面以洗脱未连接的抗体，
(c)将芯片与1mg/mL的BSA溶液反应半小时，以避免芯片表面上的非特异性吸附，同时，Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒在25℃与不同浓度的分析物反应30min，然后用外磁分离，
(d)将步骤(c)反应后的Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒添加到芯片表面，从而被表面修饰PD-L1抗体特异性识别，信号可以通过Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒进一步放大。
本发明提供一种利用上述的免疫传感系统检测PD-L1的方法，包括如下步骤：
(i)Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒在25℃与不同浓度的分析物反应30min，然后用外磁分离，
(ii)将步骤(i)反应后的Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒添加到芯片表面，从而被表面修饰PD-L1抗体特异性识别，
(iii)通过SPR或者电化学定量监测PD-L1浓度。
本发明还提供一种简便监测PD-L1的方法，首先在96孔板内分别加入0.1mL的Homingpeptide溶液，室温孵育2h；随后加入0.1mg/mL BSA封板；同时，加入不同浓度的分析物反应1h，随后加入HPR标记抗体0.05mL，并随后加入显色剂及终止液，30min内至酶标仪上进行相应读数，波长450nm。本方法通过天然胞内多肽，PD-L1和HRP标记的二抗构建ELISA检测试剂盒，实现高通量的PD-L1检测。
技术效果
本发明利用超分子介导3D-AuNPs纳米结构作为抗体固定基底，能提高抗体的表面密度，增强SPR及电化学信号，提高PD-L1检测的灵敏度，并通过等离子体磁性材料实现对信号的极大放大效果。
本发明利用Homing Peptide和PD-L1的相互作用，实现代替抗体，适体构建免疫传感器，且成本较低。
本发明利用Homing Peptide和PD-L1胞内区特定结合作用，实现PD-L1蛋白的定向结合，降低空间位阻干扰，并提高了靶标捕获量。
3D-AuNPs对SPR信号及电化学信号均有增强作用；基于该免疫传感器的构建，可实现SPR和电化学信号超灵敏双输出；这种传感模式为开发更直接有效的生物传感器提供了实际的临床应用价值。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是现有技术中胞内PD-L1与Homing Peptide作用原理图；
图2是本发明的免疫传感系统的作用原理图；
图3是本发明的ELISA传感器的作用原理图；
图4是本发明的实施例2的3D-AuNPs的透射电子显微镜图像；
图5是本发明实施例2的3D-AuNPs对SPR信号及电化学信号增敏效图；
图6A是本发明实施例3的SPR监测PD-L1的结果图，图6B是本发明实施例4的电化学监测PD-L1的结果图；
图7是本发明实施例5的基于ELISA方法检测PD-L1的结果图；
图8是本发明的通过不同浓度二胺类客体调控3D-AuNPs中AuNPs间距的透射电子显微镜图像；
图9是本发明实施例1的磁包银纳米颗粒在多肽功能化前后的粒径、电位、紫外吸收变化图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本文述及的“Homing Peptide”可作为PD-L1溶酶体降解的天然调节因子，其功能依赖于两个序列延伸，分别涉及与PD-L1的相互作用和溶酶体的分选。如图1所示，基于该多肽作用的“结合-分选”模型，可实现PD-L1的胞内转运并在溶酶体内降解，显著减弱了IFN-γ诱导的PD-L1蛋白表达，减少肿瘤细胞膜与免疫细胞膜表面PD-L1/PD-1的结合，从而消除免疫细胞的活性抑制，通过免疫活性恢复，实现免疫治疗。该方法可以保证T细胞在机体中的免疫效应。
“3D-AuNPs”具有三维有序纳米结构，其中，金属纳米颗粒(AuNPs)不仅因其本身的高折射率能引起SPR信号增强，而且其自有的局域SPR(Localized Surface PlasmonResonance,LSPR)能够与金膜表面的表面等离子波(SPW)耦合亦可增强SPR信号。而且金纳米颗粒(AuNPs)具有生物相容性好、化学性质稳定以及表面易于功能化等优点尤为受到关注。通过AuNPs在金膜表面构筑增敏层，利用纳米材料作为放大标签进一步结合其它高折射率物质，从而提高SPR的传感灵敏性。在超分子介导构建有序三维纳米网状结构的基础上，如图8所示，通过改变二胺类客体间的浓度调控AuNPs间距，进而能构筑精准自组装金属纳米结构。其中图8A、8B和8C分别对应的二胺类客体浓度为0.5mM、1mM及10mM。图8A和图8B中AuNPs间距分别为5±1.2nm，2±0.4nm，由于图C中二胺类客体浓度过高，导致AuNPs形成了极其紧密的聚集物，可近似为0nm。如图5所示，基于超分子介导能构建有序三维纳米网状结构，从而提高SPR芯片的灵敏度。
本发明的原理为：如图2所示，首先，用二胺类客体分子(PQ)介导的主客识别作用，在芯片表面自组装构筑作为增敏层的三维有序纳米结构(3D-AuNPs)，之后通过PD-L1抗体在增敏层上定向活性吸附，增强SPR光谱信号。在此过程中，使用Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒与复杂溶液中的分析物结合，之后通过外部磁铁进行高效分离。最后，将反应后的磁纳米颗粒置于电极或金片表面。若溶液中含有一定浓度的PD-L1，则反应后的PD-L1将被特异性捕获，从而借助捕获的PD-L1的胞外区与界面抗体特异性结合，相应的SPR响应信号增强。或引起电极表面电化学信号增加，通过该模式，使得抗原被更多的捕获于界面，信号输出进一步增强，使得检测灵敏度更一步增加。
并在此基础上，同时设计了一种简单的ELISA传感器通过光学信号输出来定量PD-L1的水平，如图3所示。该方法利用胞内肽“Homing Peptide”与PD-L1胞内区特异性的识别能力将PD-L1捕获于96孔板，随后HPR标记的PD-L1抗体与PD-L1特异性结合，显色剂的加入使得不同浓度PD-L1显示出明显颜色变化。通过该方法有效的实现了PD-L1的定向，使得后续信号分子的结合不受到空间位阻的影响，实现更多的靶标被检出，并且明显降低了成本。
实施例1制备Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒，即Ag@MNPs-HomingPeptide：
Homing Peptide功能化的磁包银颗粒的合成步骤为：将约1mL磁包银纳米颗粒溶液(Ag@MNPs)用PBS洗三次后，加入特异性的10μL 1mg/mL Homing Peptide，所述的磁包银纳米颗粒与特异性的Homing Peptide的体积比约为2:1，反应时间约为4小时，之后磁分离，弃上清，重悬于PBS中，即得到Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒(Ag@MNPs-HomingPeptide)。
通过紫外可见光谱(Uv-vis)，傅里叶红外光谱仪(FTIR)，动态光散射(DLS)，Zeta电位和透射电子显微镜(TEM)表征所得到的Ag@MNPs-Homing Peptide，可简写为Ag@MNPs-HP。可以发现，图9中，磁包银纳米颗粒在多肽功能化前后的粒径、电位、紫外吸收都发生了改变，证明多肽的成功修饰。
实施例2制备检测PD-L1的免疫传感器系统
首先，将100μL的2mM二胺类客体与400μL的pSC4-AuNPs反应10分钟形成相应3D-AuNPs如图4所示，并且添加到附着有pSC4的芯片表面上如图5所示3D-AuNPs对SPR信号及电化学信号增敏效果。在多参数表面等离子体共振仪(MP-SPRModelNaviTM210A)上采用2μL/min的流速添加500μL的1μg/mLPD-L1抗体与3D-AuNPs反应，后用缓冲液洗涤金片表面以洗脱未连接的抗体。而后，将芯片与1mg/mL的BSA溶液反应半小时，以避免芯片表面上的非特异性吸附。同时，Ag@MNPs-Homing Peptide在25℃与不同浓度的分析物反应30min，然后用外磁分离。最后，将反应后Ag@MNPs-Homing Peptide添加到芯片表面，从而被表面修饰PD-L1抗体特异性识别。信号可以通过Ag@MNPs-Homing Peptide进一步放大。
实施例3利用该免疫传感系统SPR监测PD-L1
采用PD-L1浓度分别为：1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，300ng/ml。
测试条件：使用SPR仪，以相同流速运行，在室温条件下进行不同浓度的PD-L1下的SPR测定。
如图6A所示，随着PD-L1浓度的增大，造成的SPR角的变化也越大。
实施例4利用该免疫传感系统电化学监测PD-L1
使用SPR相同的方式修饰电极表面，并通过电化学阻抗检测不同浓度PD-L1引起电化学信号变化。
采用PD-L1浓度分别为：1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，300ng/ml。
测试条件：使用电化学工作站(Autolab PGSTAT128N system)，以10min作为孵育时间，在室温条件下进行不同浓度PD-L1作用下的电化学阻抗测定。
图6B的两条线分别对应增敏前后对PD-L1的定量分析，随着PD-L1浓度的增大，导致的电化学信号也越大。因此可以对其进行灵敏的定量分析。
实施例5利用ELISA方法测定PD-L1
首先在96孔板内分别加入0.1mL的Homing peptide溶液，室温孵育2h；随后加入0.1mg/mL BSA封板，以消除后续可能出现的非特异性吸附。同时，加入不同浓度的分析物反应1h，随后加入HPR标记抗体0.05mL，并随后加入显色剂及终止液，30min内至酶标仪上进行相应读数(450nm)。在每步操作后需多次洗板，防止对后续读数造成干扰。
采用PD-L1浓度分别为：1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，300ng/ml。
测试条件：使用酶标仪，在室温条件下进行不同浓度PD-L1作用下的吸光度测定。
如图7所示，随着PD-L1浓度的增大，导致的吸光度也越大。因此可以对其进行灵敏的定量分析。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种非疾病诊断的检测PD-L1的免疫传感器系统，其特征在于，包括二胺类客体分子、pSC4-AuNPs、附着有pSC4的芯片、PD-L1抗体和Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒，
其中，所述二胺类客体分子与pSC4-AuNPs结合后在所述附着有pSC4的芯片表面自组装构筑作为增敏层的3D-AuNPs，所述PD-L1抗体吸附在所述增敏层上，所述Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒被设置为经过与分析物反应后添加到所述附着有pSC4的芯片表面从而与所述PD-L1抗体进行特异性识别。
2.如权利要求1所述的免疫传感器系统，其中，所述磁包银纳米颗粒被替换为磁包金纳米颗粒或者磁包纳米量子点。
3.如权利要求1所述的免疫传感器系统，其中，所述Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒的制备方法如下：
(1)将1mL磁包银纳米颗粒溶液用PBS洗三次后，加入特异性的10μL 1mg/mL HomingPeptide，所述磁包银纳米颗粒与特异性的Homing Peptide的体积比为2:1，反应时间4小时，
(2)磁分离，弃上清，重悬于PBS中，即得到Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的免疫传感器系统，其中，所述3D-AuNPs的制备方法为将100μL的2mM二胺类客体分子与400μL的pSC4-AuNPs反应10分钟。
5.一种制备如权利要求1所述的免疫传感系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将3D-AuNPs添加到附着有pSC4的芯片表面上，
(b)在多参数表面等离子体共振仪上采用2μL/min的流速添加500μL的1μg/mLPD-L1抗体与3D-AuNPs反应，后用缓冲液洗涤芯片表面以洗脱未连接的抗体，
(c)将芯片与1mg/mL的BSA溶液反应半小时，以避免芯片表面上的非特异性吸附，同时，所述Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒在25℃与不同浓度的分析物反应30min，然后用外磁分离，
(d)将步骤(c)反应后的Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒添加到芯片表面，从而被表面修饰PD-L1抗体特异性识别，信号可以通过Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒进一步放大。
6.一种利用如权利要求1所述的免疫传感系统检测PD-L1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(i)Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒在25℃与不同浓度的分析物反应30min，然后用外磁分离，
(ii)将步骤(i)反应后的Homing Peptide功能化的磁包银纳米颗粒添加到芯片表面，从而被表面修饰PD-L1抗体特异性识别，
(iii)通过SPR或者电化学定量监测PD-L1浓度。
7.一种简便监测PD-L1的方法，其特征在于，首先在96孔板内分别加入0.1mL的Homingpeptide溶液，室温孵育2h；随后加入0.1mg/mL BSA封板；同时，加入不同浓度的分析物反应1h，随后加入HPR标记抗体0.05mL，并随后加入显色剂及终止液，30min内至酶标仪上进行相应读数，波长450nm。
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