CN102914520A

CN102914520A - 检测结核的表面等离子共振生物传感器，制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102914520A
Application number: CN2012104076458A
Authority: CN
Inventors: 李根喜; 陈红霞; 刘峰; 李鹏飞; 侯亚菲
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-10-24
Also published as: CN102914520B

Abstract

本发明涉及一种用于检测结核的光学传感器的制备方法及其应用。该传感器为双通道表面等离子共振体系，利用蛋白连接剂将CFP-10的抗体固定到芯片的表面，制得所需的免疫芯片，加入待测物后，CFP-10通过抗原与抗体间的特异性结合固定到芯片的表面，为了能够降低传感器的检测限，本发明首次利用氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体的复合物，起到了良好的信号放大效果，检出限为0.01ng/mL，能满足临床痕量样品检测需求。因此，该传感器可用于结核等疾病标志蛋白的检测，操作方便，灵敏度高，应用前景广泛。

Description

检测结核的表面等离子共振生物传感器,制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型表面等离子共振生物传感器，制备方法及其应用，特别是一种检测结核的表面等离子共振生物传感器，制备方法及其应用。

背景技术

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的常见的传染性疾病，因其具有较高的发病率和死亡率进而严重威胁人类的健康。据目前的估计，世界上有三分之一的人口（约20亿）为隐性结核病感染者，它是发展中国家一种最主要的疾病。我国现有结核病人450万例，每年因结核病死亡人数近13万。由此可见，廉价、快速的诊断技术在临床上具有重要意义。现有很多种结核病的诊断方法，主要有鉴定结核杆菌、影像学检查及免疫分析等，直接对结核杆菌的分析，如果操作不当，会有再次传播的风险，而且由于结核菌的遗传特性决定了其生长周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂、费时、影响因素较多而不易标准化等缺点；影像学检查对于仪器设备以及操作者具有很高的要求。近年来，人们发现在结核病抗原中，CFP-10是一种结核杆菌早期分泌的抗原，在病人的组织液中存在，这种蛋白在结核杆菌卡介苗或者大部分的非结核杆菌中是不存在的，因此，CFP-10作为结核杆菌的标志物能增强诊断的灵敏度，并减少临床假阳性反应，针对这种抗原的临床分析，对结核病的早期预警和诊断也有重要意义。

近些年来，纳米科技迅速发展并被广泛应用于药物输送，疾病诊断等领域，纳米材料本身具有表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等特性，这也为发展新型高灵敏度、高稳定性、低成本生物传感器提供了新的途径。基于金纳米粒子，碳纳米管，量子点等纳米材料的生物传感器已成功构建。氧化镍纳米颗粒因其能与组氨酸的咪唑基团螯合而进入了研究者的视线，这一性质使得它在生物传感器领域有极大的应用前景，目前研究者主要利用这一性质用于合成蛋白的分离纯化，但氧化镍纳米颗粒在生物传感器中的应用还亟待开发。

表面等离子共振仪（Surface Plasmon Resonance）作为一种新型的技术广泛应用于生物治疗、医学诊断、抗体选择、细胞信号传导等领域的研究。表面等离子共振是一种光学现象，是表面增强拉曼的重要增强机理之一，由于贵金属纳米粒子的尺寸效应及量子效应通过激发光照射能引起表面等离子共振，从而大大增强拉曼散射信号，该体系借助于激光实现信号的输入和输出，从而原位检测天然状态下生物分子间的相互作用，是一种不需要标记且能进行实时分析的工具。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测结核的表面等离子共振生物传感器。

本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：根据研究发现，结核患者的尿液中会含有一种蛋白—CFP-10(Culture Filtrate Protein)，CFP-10是结合分支杆菌早起分泌的抗原物质，这种蛋白在没有感染结核或者接种了卡介苗的人中不存在，因此被用作检测结核的标志蛋白，这为结核的检测提供了新的途径，也大大降低了假阳性的概率。首先通过蛋白连接剂将CFP-10的抗体固定在芯片的表面，然后加入CFP-10，CFP-10会通过抗原和抗体的特异性反应结合到芯片的表面，从而引起SPR角的变化，得到相应的信号。本发明为了提高检测的灵敏度，引入了氧化镍纳米颗粒作为信号放大的原件，实验中用到的抗体是带有多组氨酸标记的，组氨酸上的咪唑基团可以与氧化镍纳米颗粒表面的镍离子螯合，从而抗体可以吸附到氧化镍纳米颗粒的表面，本发明利用氧化镍与CFP-10抗体形成的复合物来进行信号放大，具体来说，当加入氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体的复合物时，复合物会通过抗原抗体的反应结合到芯片的表面，由于纳米颗粒具有较好的光学性质，所以在SPR上起到良好的放大效果，进而实现CFP-10的放大检测。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种检测结核的表面等离子共振生物传感器，为双通道表面等离子共振仪。免疫芯片的表面修饰有CFP-10的抗体。

一种制备上述检测结核的生物传感器的方法，该方法的具体步骤为：

a. 免疫芯片的处理：将芯片浸没在水虎鱼溶液中，即浓硫酸：过氧化氢的体积比为3:1，反应45s，然后用超纯水冲洗干净，氮气吹干；

b. 将处理过的芯片浸没在0.1mM 的蛋白连接剂中10小时，蛋白连接剂通过金硫键反应自组装到芯片的表面，然后先后用氯仿、甲醇、超纯水冲洗，氮气吹干；

c. 将芯片安装到表面等离子共振仪上，向反应池中注入100μL 2.5μg/mL的CFP-10的抗体，它通过与蛋白连接剂的反应固定到芯片表面，然后加入100 μL 0.1mg/mL牛血清白蛋白进行封板半小时，这就得到了检测结核的表面等离子共振生物传感器。

上述的CFP-10的抗体以及牛血清白蛋白都是用含有0.15 M NaCl，10mM，pH为7.4的PBS缓冲液配制；所述的蛋白连接剂为Prolinker^TM，用于固定CFP-10的抗体。

一种检测CFP-10的方法，采用上述的检测结核的表面等离子共振生物传感器，其特征在于，该方法的具体步骤为：

a. 向修饰好的芯片上加入待测溶液：待测液为内含0.15 M NaCl以及待测CFP-10的PBS缓冲液，pH 7.4，室温下反应半小时，然后PBS缓冲液冲洗；

b. 向步骤a所得的芯片表面加入氧化镍纳米颗粒与CFP-10的抗体的复合物，用表面等离子共振仪，实时的检测反应的过程。

上述氧化镍纳米颗粒与CFP-10的抗体复合物制备的具体步骤为：将0.1mg/mL的氧化镍纳米颗粒与2.5μg/mL的CFP-10的抗体等体积混合，摇床上孵育1小时，然后离心机离心3次，1200 rpm，20min，每次去除上清，然后加入等量的PBS缓冲液，最终除去上清，加入缓冲液将沉淀溶解，得氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体的复合物。

与现有技术相比，本发明具有如下的突出的优点：

本发明构建了一种新型的检测结核的生物传感器，利用CFP-10与其对应抗体的反应，首次将氧化镍纳米颗粒用于结核的检测，快速简单，容易操作，灵敏度高，取得了满意的结果。同样的原理可以推广到其他物质的检测，应用前景广泛。

附图说明

图1为将处理后的芯片安装到机器上后，先后加入2.5μg/mL CFP-10的抗体和0.1 mg/mL的牛血清白蛋白后SPR角的变化图。

图2为同体积的0.1 mg/mL氧化镍纳米颗粒与2.5 μg/mL CFP-10的抗体混合前后的紫外分光光度计测量的吸收峰值图。

图3为加入不同浓度的CFP-10（0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL）后所得到的SPR角的变化图。

图4为氧化镍纳米颗粒与CFP-10的抗体所形成的复合物与不同浓度的CFP-10（0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL）反应后所得到的SPR角的变化图。

具体实施方式

实施例一：传感器的制备

将芯片浸没在4mL的水虎鱼溶液（浓硫酸：过氧化氢体积比为3:1）中45s，然后用超纯水冲洗，氮气吹干。将洗净的芯片浸没在氯仿中1-2小时，然后将芯片转移到0.1mM的Prolinker^TM浸泡10小时，使其在芯片表面自组装一层单分子膜，再将芯片转移到氯仿中浸泡1-2小时，最后分别用甲醇、超纯水冲洗干净，氮气吹干。

将芯片安装到表面等离子共振仪上（Autolab ESPRIT），加入100μL含有2.5μg/mL CFP-10抗体的PBS缓冲液（0.15M NaCl pH 7.4）反应半小时，然后用PBS缓冲液冲洗，接着注入100μL 0.1mg/mL的牛血清白蛋白进行封板半小时，然后用PBS缓冲液进行冲洗。实验结果如图1所示，当加入抗体后，引起了较大的SPR角的变化，说明抗体通过与Prolinker^TM反应被固定到芯片表面，当加入BSA进行封板时，SPR角也发生了较大的偏移，说明BSA起到了良好的封板作用。

实施例二：免疫芯片检测CFP-10

氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体复合物的制备：

先将直径30 nm的氧化镍纳米颗粒加入到PBS缓冲液中，超声溶解，浓度调整为0.1 mg/mL，将同体积的氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体（2.5 μg/mL）在振荡器上孵育一小时，因为抗体上是有多组氨酸标记的，所以通过组氨酸上咪唑基团与氧化镍纳米颗粒上镍离子的反应，抗体可以被固定到纳米颗粒的表面，最后用高速离心机对混合物进行离心（1200 rpm 20 min），离心3次，每次离心后除去上清，然后加入等体积的PBS缓冲液，第三次离心后加入缓冲液将沉淀溶解。用紫外可见分光光度计分别检测氧化镍纳米颗粒溶液、抗体溶液以及混合离心后复合物溶液的吸收峰，结果参见图2，从图中可以看出，三种溶液分别在303纳米、278纳米、314纳米有较强的吸收峰，这表明抗体通过与氧化镍纳米颗粒共孵育结合到了纳米颗粒的表面，形成了一种复合物。

向修饰好的芯片分别注入5个不同浓度（0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL）的CFP-10溶液，CFP-10通过与芯片表面其对应抗体的反应结合到芯片表面，观察SPR角的变化，结果如图3，即使CFP-10在较高浓度时（100ng/mL）也没有引起明显的SPR角的变化，为了能够检测较低浓度的CFP-10，氧化镍纳米颗粒用来放大信号。

实施例三：氧化镍纳米颗粒来放大信号

由于直接检测低浓度的CFP-10的没有得到理想的效果，本发明利用氧化镍纳米颗粒来放大信号，将上面制得的氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体的复合物加入到芯片上，分别与5个不同浓度（0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL）的CFP-10反应，氧化镍纳米颗粒表面的抗体与芯片表面的抗原结合，进而被固定到芯片表面，由于纳米颗粒能够引起较大的折射率的变化，进而起到了信号放大的效果。结果参见图4，在加入氧化铌纳米颗粒与抗体的复合物后，SPR角有了明显的变化，这说明功能化的氧化镍纳米颗粒起到了很好的信号放大的作用，这有利于实现对CFP-10的低浓度的检测，检测限达到0.01ng/mL。

以上结果表明，本生物传感器可以应用于结核的检测，实验操作方便，检测结果灵敏，可以检测到最低浓度0.01ng/mL的目标蛋白。本发明中首次将氧化镍纳米颗粒应用于生物传感器的制作中，同样的原理可以用于其他生物传感器的设计，应用前景广泛。

Claims

1.一种检测结核的表面等离子共振生物传感器，为双通道表面等离子共振仪，其特征在于，免疫芯片的表面修饰有CFP-10的抗体。

2.一种制备根据权利要求1所述检测结核的表面等离子共振生物传感器的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：

a.免疫芯片的处理：将芯片浸没在水虎鱼溶液中，即浓硫酸：过氧化氢的体积比为3:1，反应45s，然后用超纯水冲洗干净，氮气吹干；

b.将处理过的芯片浸没在0.1mM 的蛋白连接剂中10小时，蛋白连接剂通过金硫键反应自组装到芯片的表面，然后先后用氯仿、甲醇、超纯水冲洗，氮气吹干；

c.将芯片安装到表面等离子共振仪上，向反应池中注入100μL 2.5μg/mL的CFP-10的抗体，它通过与蛋白连接剂的反应固定到芯片表面，然后加入100 μL 0.1mg/mL牛血清白蛋白进行封板半小时，这就得到了检测结核的表面等离子共振生物传感器。

3.根据权利要求2所示的一种制备检测结核的表面等离子共振生物传感器的方法，其特征在于，所述的CFP-10的抗体以及牛血清白蛋白都是用含有0.15 M NaCl，10mM，pH为7.4的PBS缓冲液配制。

4.根据权利要求2所示的一种制备检测结核的表面等离子共振生物传感器的方法，其特征在于，所述蛋白连接剂为Prolinker^TM，用于固定CFP-10的抗体。

5.一种检测CFP-10的方法，采用根据权利要求1所述的检测结核的表面等离子共振生物传感器，其特征在于，该方法的具体步骤为：

a.向修饰好的芯片上加入待测溶液：待测液为内含0.15 M NaCl以及待测CFP-10的PBS缓冲液，pH 7.4，室温下反应半小时，然后PBS缓冲液冲洗；

b.向步骤a所得的芯片表面加入氧化镍纳米颗粒与CFP-10的抗体的复合物，用表面等离子共振仪，实时的检测反应的过程。

6.根据权利要求5所述的一种检测CFP-10的方法，其特征在于，所述氧化镍纳米颗粒与CFP-10的抗体复合物制备的具体步骤为：将0.1mg/mL的氧化镍纳米颗粒与2.5μg/mL的CFP-10的抗体等体积混合，摇床上孵育1小时，然后离心机离心3次，1200 rpm，20min，每次去除上清，然后加入等量的PBS缓冲液，最终除去上清，加入缓冲液将沉淀溶解，得氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体的复合物。