CN114563456A - 以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法 - Google Patents

Abstract

一种以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，包括一条胆固醇修饰的DNA探针T，T链可以通过胆固醇插入外泌体磷脂双分子层，且T链与包封MOFs的P链碱基序列部分互补，T链3'末端突出；检测体系中存在间充质干细胞外泌体时，外泌体能够与金电极表面修饰的磷脂酰丝氨酸多肽配体发生特异性识别结合，固定在电极表面，产生电化学信号。与外泌体检测的常规定量方法相比，如：酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术，本发明的方法使用的电化学技术更方便、更灵敏，且不需要复杂样品处理以及精密仪器的分析。

Description

以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞来源物质的检测方法方法，特别涉及一种电化学方法，对来自于如：干细胞的生物物质实施定性和定量的检测。

背景技术

外泌体是一类直径为30nm-150nm的膜性囊泡样小体。间充质干细胞是分泌外泌体能力最强的细胞，其可通过特定的信号轴来调控外泌体的释放，同时细胞外环境的改变也能影响间充质干细胞分泌外泌体的能力和活性。利用无外泌体的血清培养间充质干细胞最终分离得到的间充质干细胞源性外泌体，不仅共性表达外泌体标志蛋白如:CD63和CD81等，还表达间充质干细胞的相关分子如：CD29、CD44、CD90和CD73等。随着干细胞研究的进展，不断有研究证实间充质干细胞源性外泌体能够借助所携带的蛋白、非编码RNA和微小RNA等生物活性物质在多种疾病的中发挥作用，可作为一种潜在生物标志物，用于疾病的早期筛查和预后监测等。

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine)在质膜中具有不均匀的分布状态，并且优先位于正常细胞的内部小叶。磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，其可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。近年来的研究表明，磷脂酰丝氨酸不仅外化在凋亡细胞上，还外化在囊泡化过程中的微泡和外泌体上。外泌体膜含有较高水平的磷脂酰丝氨酸，其不同于一般的外泌体的标志物如：CD63会因细胞类型而改变，具有更高的识别稳定性。

金属-有机框架(MOFs)由于其高表面积、弹性孔隙度、化学耐受性和持久传感特性，已成为一种新型材料，并被广泛应用于传感器设计。MOFs的高孔隙率提供了容纳大量电活性分子的能力，并提高了它们的电导率和分析敏感性。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，借助于MOFs，以检测磷脂酰丝氨酸在细胞或囊泡表面的表达。

本发明的另一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，借助于MOFs，对磷脂酰丝氨酸在细胞或囊泡表面的表达实施定量检测。

在本发明中，使用了一种以锆(Zr)为金属中心的MOFs，可以负载具有电化学信号的分子亚甲基蓝，并且Zr-MOF对磷酸基团有很高的亲和性，DNA可以通过形成Zr-O-P键包封MOFs。

一种以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，包括一条胆固醇修饰的DNA探针T，T链可以通过胆固醇插入外泌体磷脂双分子层，且T链与包封MOFs的P链碱基序列部分互补，T链3'末端突出；

检测体系中存在间充质干细胞外泌体时，外泌体能够与金电极表面修饰的磷脂酰丝氨酸多肽配体发生特异性识别结合，固定在电极表面，产生电化学信号。

另一种电化学检测外泌体的方法，包括两条DNA链，即P链和T链，

P链的核酸序列为：5'-GCGATTCAGATGGATGGGACGCGTGAAGG-3'；

T链的核酸序列为：5'-CCTTCACGCGTCCCATCCATCTGAATCGCACTACACTTCA-3'，在其3’末端进行胆固醇修饰。

另一种电化学检测间充质干细胞的方法，以MB@DNA/MOFs为电化学探针，包括Zr⁴⁺和2-氨基1,4-苯二甲酸通过配位作用合成金属-有机框架MOFs，将电信号分子亚甲基蓝包裹到MOFs的内部空间，P链通过与金属离子形成Zr-O-P键包封MOFs，最终形成DNA门控的MOFs。

为了实施本发明电化学检测外泌体的方法，采用CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极为工作电极，铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极进行电化学检测，电位扫描范围为0～-0.6V，势阶跃4mV，振幅25mV，频率15赫兹。

经验证，本发明的方法在外泌体浓度范围为4×10³个/毫升至4×10⁸个/毫升与得到的电化学信号呈线性相关，能在此浓度范围内实现定量化的电化学检测。检测外泌体的检测限为550颗粒/mL，显著优于现有的绝大多数外泌体检测方法。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的方法基于DNA门控金属有机框架结合靶标驱动信号级联放大实现电活性分子的负载释放，设计了一种超灵敏的电化学生物传感平台。该MOFs(UiO-66-NH2)被用作可编程DNA组装和电化学信号分子亚甲基蓝加载形成MB@DNA/MOFs，实现了信号放大输出。目标物的存在启动了MOFs上的链置换以及核酸外切酶III触发的循环，使孔洞解锁，从而释放其中的信号分子。该生物传感器以间充质干细胞外泌体为模型靶点，为外泌体的检测提供了一种灵敏有效的检测策略。

与外泌体检测的常规定量方法相比，如：酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术，需要复杂的样品预处理和专用的分析仪器。流式细胞术的方法检测需要高精度的仪器，且对仪器本身的电子噪音、电压的设定、鞘液的纯净程度和机器对不同群体的识别分离度要求高。流式细胞术检测外泌体需要手动调整硬件、严苛的仪器校准、数小时的鞘液净化和复杂的数据分析。酶联免疫吸附试验(ELISA)重复性不好；会受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性；不论仪器和手工操作，干扰因素较多。本发明中使用的电化学技术更方便、更灵敏，且不需要复杂样品处理以及精密仪器的分析。

外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡，它广泛存在并分布于血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等种体液中。间充质干细胞外泌体携带和传递重要的信号分子，包含细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白质，参与细胞活动的重要调控，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，其影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。间充质干细胞外泌体表面脂质双分子层中含有丰富的磷脂酰丝氨酸，但其CD63、CD81等外泌体表面标志物缺乏特异性，在一些检测中漏检率高。而本发明中使用的磷脂酰丝氨酸作为外泌体检测标志物有更好的通用性。

附图说明

图1为检测外泌体技术方案的路线图；

图2为捕获外泌体结果图；

图3为亚甲基蓝电化学信号对比图；

图4为浓度4×10⁸个/毫升外泌体的电化学响应对比图；

图5为不同浓度外泌体的电化学信号响应结果线性拟合图；

图6为MB@DNA/MOFs的透射电镜图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

图1为检测外泌体技术方案的路线图。具体方法包括：

(1)首先，锆离子(Zr⁴⁺)和2-氨基1,4-苯二甲酸(NH₂-BDC)通过配位作用合成金属-有机框架(UiO-66-NH₂)，并将电信号分子亚甲基蓝(MB)包裹到金属-有机框架(MOFs)的内部空间。随后，加入DNA探针P链后，P链通过与金属离子形成Zr-O-P键包封金属-有机框架，最终形成DNA门控的金属-有机框架(MB@DNA/MOFs)，作为电化学探针。如图6所示，所获得的MB@DNA/MOFs相对均匀，直径为70nm～100nm。

(2)磷脂酰丝氨酸多肽配体通过金巯键功能化金电极用于捕获磷脂酰丝氨酸外翻的间充质干细胞外泌体。当检测体系中存在间充质干细胞外泌体时，外泌体能够与金电极表面修饰的磷脂酰丝氨酸多肽配体发生特异性识别结合，固定在电极表面。设计一条修饰胆固醇的DNA探针T，T链可以通过胆固醇插入外泌体磷脂双分子层，且T链的与包封MOFs的P链碱基序列部分互补。胆固醇修饰的DNA探针T可以插入外泌体的磷脂双分子层。

(3)当溶液加入DNA门控MOF(MB@DNA/MOFs)时，MOF表面的P链因为与T链杂交形成P/T双链，脱离MOF表面。因T链3'端凸出而抵抗该酶的切割，外切酶III只切割P/T双链中P链，自由的T链可以启动下一轮DNA链置换反应，从而不断置换并消化包封MOFs的P链，产生大量游离的亚甲基蓝分子。

(4)释放出的亚甲基蓝分子与葫芦[7]脲(CB[7])、金纳米颗粒(AuNPs)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)共同功能化的石墨电极孵育，能够被CB[7]的疏水空腔捕获，形成具有的稳定的主-客体配合物。同时，AuNPs可以促进吸附的MB与电极表面之间的电子转移，产生电化学信号。

(5)当检测体系中不存在外泌体时，加入的T链游离在溶液中，不能在电极表面固定。冲洗电极后，T链随缓冲溶液去除，包封MOF的P链因为不能与T链杂交被置换下来，DNA探针P包封的MOF不能释放出电化学信号分子亚甲基蓝，抑制电化学信号。

(6)通过测定石墨电极表面富集的亚甲基蓝电化学信号，可以实现间充质干细胞外泌体的定量检测。

本发明如下实施例采用的方案主要包括以下步骤：

(a)MOFs(UiO-66-NH₂)和MB@DNA/MOFs制备，具体过程为：将230-250mg的四氯化锆，210-230mg的氨基对苯二甲酸，3.7-3.9g苯甲酸溶解在10-30mL DMF溶剂中并超声大约3-5分钟。然后，将混合物转移到聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，静置于120℃烘箱中。20小时后，从烘箱中取出待母液冷却到室温再进行离心分离沉淀(10500转，10分钟)。用二甲亚砜(DMF)和乙醇依次清洗10分钟移除未参加反应的前体物质，并重复操作3次。最后，将固体在100℃下真空干燥过夜备用。合成的MOFs被用来制备MB@DNA/MOFs。首先，5-15μL MB(10mM)与1-2mLUiO-66-NH₂(1mg/mL)混合，在室温下超纯水中搅拌24小时。生成的MB@UiO-66沉淀经离心收集，用去离子水洗涤，再分散于1-2mL PBS(10mM,pH 7.4)供进一步使用。取40-60μL MOF@MB(1mg/mL)与10-15μL DNA探针P(10μM)在25℃、500rpm条件下反应1小时。得到DNA门控的MOF(MB@DNA/MOFs)。

(b)磷脂酰丝氨酸多肽配体功能化电极，具体过程为：首先将未修饰的金电极依次在3000目和5000目的砂纸上打磨至电极表面划痕均匀一致且表面平整；再依次使用1μm和0.03μm的铝粉给电极表面进行抛光处理；然后将金电极依次在无水乙醇和超纯水中分别超声波清洗5分钟。使用氮气吹干后，滴加30-50μL新鲜配制的水虎鱼溶液98％H₂SO₄:30％H₂O₂＝3:1在电极表面，静置5分钟后用超纯水冲洗干净。最后，对金电极进行活化，在0～1.6V电势范围内通过循环伏安法扫描20圈，电解液为0.5MH₂SO₄溶液。然后用双蒸馏水冲洗，氮气干燥。制备的金电极与5μM含5mM TCEP的磷脂酰丝氨酸多肽配体在4℃条件下孵育16小时，TCEP作为还原剂防止半胱氨酸末端二硫键的形成。

(c)CB[7]/AuNPs/PDDA功能化电极的制备，具体过程为：首先将石墨电极在细砂纸上进行打磨，再用氧化铝(粒径约为0.05μm)抛光处理；然后分别在双蒸馏水和乙醇中超声清洗电极3-5min。然后，将电极浸入PDDA溶液(3.5mg/mL，含0.05M NaCl)中20分钟，在电极表面形成带正电荷的PDDA(厚度约6nm)。用双蒸馏水洗涤后，将柠檬酸还原的HAuCl(0.01％)制备的13nm AuNPs在电极上室温孵育1小时，其能够与PDDA通过静电作用固定在电极表面。最后，将电极与1mM CB[7]在室温下孵育1小时。使CB[7]能够通过羰基与金的相互作用牢牢地附着在AuNPs上。用双蒸馏水彻底洗涤，氮气干燥后，最终制备出CB[7]/AuNPs/PDDA功能化电极，供后续使用。

(d)将(b)多肽功能化的电极用1mM MCH溶液中处理1-2小时以阻断非特异性位点，用超纯水冲洗电极，氮气干燥后。在Tris-HCL(50mM Tris和150mM NaCl)中与不同浓度(10μL)的外泌体，在37℃、2小时条件下相互作用。然后，将电极漂洗，在5％Tween-20中浸泡20分钟，以排除非特异性吸附。然后，加入5-10uL胆固醇修饰的DNA探针T(100μM)室温孵育45分钟，再将40-50μL制备的MB@DNA/MOFs溶液孵育在电极表面，同时加入0.3-0.5uL核酸外切酶III(5000U)在37℃孵育2小时。

(e)将(d)中的MOFs离心收集，重悬在90-110uL缓冲溶液中，在25℃、500rpm条件下震荡30分钟，充分释放MOFs中的亚甲基蓝后离心取上清，在CB[7]/AuNP/PDDA功能化石墨电极上室温孵育1小时。最后，将修饰过的电极彻底清洗以进行电化学测量。

其中：

步骤(a)中所使用的P链的序列为：5'-GCGATTCAGATGGATGGGACGCGTGAAGG-3'，该序列并非已知序列，而是根据本发明的原理随机设计而成，其基本原则是：首先，P链能够与T链部分碱基序列形成双链结构，P/T杂交互补后，P链能够从MOFs上被置换下来；其次，因核酸外切酶III具有从双链DNA的3'-OH末端降解生成5'单核苷酸的3'-5'外切酶活性，其最适底物是平末端或3'凹陷末端DNA，因此核酸外切酶III能够从3'端切割P/T双链中的P链。

步骤(b)中所使用的T链的序列为：5'-CCTTCACGCGTCCCATCCATCTGAATCGCACTACACTTCA-胆固醇-3'。其基本原则是：首先，T链通过胆固醇修饰可以插入到外泌体的磷脂双分子层中；其次，T链部分碱基序列与P链互补，可以置换包封MOFs的P链；再次，T链3'末端突出，在引入核酸外切酶III后T链能够抵抗核酸外切酶III切割，实现T链在体系中的循环，为了保证核酸外切酶III切割效率，T链较P链3'突出末端凸出序列长度为4～10bp。

步骤(c)中所使用的磷脂酰丝氨酸多肽配体的序列为：N'-FNFRLKAGAKIRFGRGC-C'，该碱基序列是已知的识别间充质干细胞外泌体的序列；能够特异性识别外泌体膜外的磷脂酰丝氨酸。

步骤(e)中测定方波伏安法(SWV)时所采用的实验条件是：电位扫描范围0～-0.6V；势阶跃4mV；振幅25mV；频率15赫兹。

实施例1磷脂酰丝氨酸多肽配体与间充质干细胞外泌体特异性识别结合的验证

(a)首先活化羧基功能化磁珠，取50μL～70μL商品化的功能化磁性颗粒置于微量管中，加入100μL PBS(10mM,pH7.5)，充分混合洗涤后进行磁性分离，弃去溶液；重复上述洗涤过程三次。磁吸弃去上清后，重悬于500μL含有77.6mg/mL EDC和11.5mg/mL NHS的缓冲液中，在25℃反应30分钟条件下反应后进行磁性分离，弃去溶液。加入100μL PBS(10mM、pH7.5)，再次充分混合洗涤后进行磁性分离，磁分离得到活化后的羧基功能化磁珠再重悬1mL PBS中备用。

(b)接下来制备捕获探针，分别取8μL～10μL磷脂酰丝氨酸多肽配体和100μL活化后的羧基功能化磁珠混合，25℃条件下反应2小时后进行磁性分离，弃去溶液。加入90μL～100μL 10mM PBS(pH7.5)，再次充分混合洗涤后进行磁性分离，磁分离得到磷脂酰丝氨酸多肽配体功能化磁珠再重悬1mL PBS(10mM,pH7.5)中备用。

(c)将15-25μL含4.10×10⁸particles/mL间充质干细胞外泌体加入步骤(b)所得溶液，充分混合后在25℃条件下反应2小时；反应完成后，使用1mL PBS(10mM,pH7.5)洗涤磁性颗粒，重复三次，弃去溶液，将得到的磁性颗粒重悬于100μL PBS(10mM,pH 7.5)。

(d)将1mL～2mL亲脂染料DIO(30μM)加入步骤(c)所得溶液中，充分混合后在37℃条件下反应30分钟，对外泌体膜进行染色；反应完成后，使用100μL PBS(10mM,pH7.5)洗涤磁性颗粒，重复三次，弃去溶液，将得到的磁性颗粒重悬于350μL～400μL PBS(10mM,pH7.5)中并进行流式细胞术分析，具体参数为：所用仪器是CytoFLEX S流式细胞仪，分析通道是FAM/FITC通道(488nm激发波长)。

结果如图2所示，实验体系b中加入外泌体。此时，DIO进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染被激发出很强的荧光，磁性颗粒有较强的荧光发射，这证明磷脂酰丝氨酸多肽配体可以捕获外泌体。而当未加入外泌体时(实验体系a)，荧光发射较弱。这说明当体系中无外泌体时荧光染料DIO被磁吸洗涤后已经脱离磁性颗粒表面。以上结果表明修饰在磁性颗粒表面的磷脂酰丝氨酸多肽配体可以特异性识别外泌体。

实施例2MOFs酶切循环信号放大体系验证

(a)1mg～2mg MOFs@MB在1mL缓冲溶液中超声处理并保存备用。

(b)取40μL～50μLMOF@MB(1mg/mL)置于微量管中，加入5μL～15μL修饰的DNA探针P(10μM)，混合均匀后在25℃500rpm条件下反应1个小时。

(c)将10μL与DNA探针P互补的T链(100μM)加入步骤(b)所得溶液中在37℃下反应2小时。

(d)再将5μL～10μL Buffer、0.3μL～0.5μL核酸外切酶III(5000U)、15-20μL H₂O加入到步骤(c)所得溶液中在37℃下反应2小时。

(e)制备CB[7]/AuNPs/PDDA功能化电极，首先将石墨电极在细砂纸上进行打磨，再用氧化铝(粒径约为0.05μm)抛光处理；然后分别在双蒸馏水和乙醇中超声清洗电极5min。然后，将电极浸入PDDA溶液(3.5mg/mL，含0.05M NaCl)中20分钟，在电极表面形成带正电荷的PDDA(厚度约6nm)。用双蒸馏水洗涤后，将柠檬酸还原的HAuCl4(0.01％)制备的13nmAuNPs在电极上室温孵育1小时，其能够与PDDA通过静电作用固定在电极表面。最后，将电极与1mM CB[7]在室温下孵育1小时。使CB[7]能够通过羰基与金的相互作用牢牢地附着在AuNPs上。用双蒸馏水彻底洗涤，氮气干燥后，最终制备出CB[7]/AuNPs/PDDA功能化电极，供后续使用。

(f)将(d)中的MOFs离心收集，重悬在100uL缓冲溶液中，在25℃、500rpm条件下震荡30分钟，充分释放MOFs中的亚甲基蓝后离心取上清，在CB[7]/AuNP/PDDA功能化石墨电极上室温孵育1小时。最后，将修饰过的电极彻底清洗以进行电化学测量。

结果如图3所示，MB@DNA/MOFs中P链可以通过π-π堆积或氢键相互作用包封信号分子亚甲基蓝，因此电极表面富集不到亚甲基蓝，电流变弱(曲线a)。当引入核酸外切酶III和信号探针T链时，核酸外切酶III能够从3'端切割P/T双链中的P链，而T链因3'端凸出而抵抗该酶的切割，实现了T链在体系中的不断循环，置换吸附在MOFs上的P链，最终释放大量的亚甲基蓝电化学信号(曲线b)。

实施例3外泌体的定量检测

(a)金电极与5μM设的含有5mM TCEP的多肽在4℃条件下孵育16小时

(b)将不同浓度的外泌体孵育在步骤(a)得到的磷脂酰丝氨酸多肽配体功能化的金电极上，37℃条件下反应两个小时。

(c)将5μL～10μL胆固醇修饰的DNA探针T(10μM)与步骤(b)所修饰的金电极，在25℃条件下反应45分钟。

(d)取50μL MOF@MB(1mg/mL)与10μL DNA探针P链(10μM)在25℃、500rpm条件下反应1小时。得到DNA门控的MOFs(MB@DNA/MOFs)。

(e)将(d)制备好的DNA门控MOFs孵育在电极上，同时加入10μL Buffer、0.3μL核酸外切酶III(5000U)，在37℃条件反应2小时。

(d)将(e)中的MOFs离心收集，重悬在100uL缓冲溶液中，在25℃、500rpm条件下震荡30分钟，充分释放MOFs中的亚甲基蓝后离心收集上清。

(e)将石墨电极分别在细砂纸上和氧化铝(粒径约为0.05μm)/水泥浆上抛光，获得光滑的表面；然后分别在双蒸馏水和乙醇中超声清洗电极5分钟。然后，将电极浸入PDDA溶液(3.5mg/mL，含0.05M NaCl)中20分钟，将柠檬酸还原的HAuCl₄(0.01％)制备的13nmAuNPs与PDDA静电作用固定在电极表面1小时。最后，将电极与1mM CB[7]在室温下孵育1小时。使CB[7]能够通过羰基与金的相互作用牢牢地附着在AuNPs上。

(f)将(d)中的离心后的上清与在(e)制备好的CB[7]/AuNPs/PDDA功能化石墨电极，在25℃条件下反应1小时。

(g)将(f)反应好的石墨电极在Tris-HCl溶液中，从-0.4V到-0.1V扫描方波伏安(swv)。

相关寡核苷酸DNA链序列如下：

P链：5'-GCGATTCAGATGGATGGGACGCGTGAAGG-3'。

T链：5'-CCTTCACGCGTCCCATCCATCTGAATCGCACTACACTTCA-胆固醇-3'。

图4显示了本方法用于检测4×10⁸个/毫升外泌体时所得到的电化学。如图4a所示，当体系中存在外泌体时，溶液在-0.35V电压附近有一个明显的电流峰。在空白对照组，溶液在-0.35V电压附近仅有一个很小的背景发射峰(图4b)。

图5显示了溶液最终的峰电流随外泌体浓度的变化情况，从图中可以看出，在4×10³个/毫升至4×10⁸个/毫升范围内，溶液最终的电流随间充质干细胞外泌体浓度的增加而增大。溶液最终的电流与间充质干细胞外泌体浓度的对数值(lgC)在4×10³个/毫升至4×10⁸个/毫升范围呈线性相关，线性方程是C＝0.22113lgC—0.40123(R²＝0.998)。根据线性方程，我们计算得到本方法用于检测间充质干细胞外泌体的检测限为550个/毫升，优于现有的绝大多数电化学检测方法。

序列表

<110> 章毅

中国干细胞集团上海生物科技有限公司

中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司

重庆市干细胞技术有限公司

上海市干细胞技术有限公司

陕西省干细胞技术有限公司

苏州市干细胞技术有限公司

三亚市干细胞技术有限公司

<120> 以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Phe Asn Phe Arg Leu Lys Ala Gly Ala Lys Ile Arg Phe Gly Arg Gly

1 5 10 15

Cys

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttcacgcg tcccatccat ctgaatcgca ctacacttca 40

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgattcaga tggatgggac gcgtgaagg 29

Claims (10)

1.一种以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于包括一条胆固醇修饰的DNA探针T，T链可以通过胆固醇插入外泌体磷脂双分子层，且T链与包封MOFs的P链碱基序列部分互补，T链3'末端突出；

检测体系中存在间充质干细胞外泌体时，外泌体能够与金电极表面修饰的磷脂酰丝氨酸多肽配体发生特异性识别结合，固定在电极表面，产生电化学信号。

2.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于T链的核酸序列包括：

5'-CCTTCACGCGTCCCATCCATCTGAATCGCACTACACTTCA-3'，在其3’末端以胆固醇修饰。

3.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于所述P链的核酸序列包括：5'-GCGATTCAGATGGATGGGACGCGTGAAGG-3'。

4.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于相较于P链，T链3'末端突出长度为4～10bp。

5.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于Zr⁴⁺和2-氨基1,4-苯二甲酸通过配位作用合成金属-有机框架MOFs，将电信号分子亚甲基蓝包裹到MOFs的内部空间，P链通过与金属离子形成Zr-O-P键包封MOFs，最终形成DNA门控的MOFs，作为电化学探针。

6.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于采用CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极为工作电极。

7.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于磷脂酰丝氨酸多肽配体功能化电极。

8.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于电位扫描范围为0～-0.6V，势阶跃4mV，振幅25mV，频率15赫兹。

9.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于对所述的外泌体实施定量检测。

10.根据权利要求1所述的以MOFs探针对外泌体实施电化学检测的方法，其特征在于所述的外泌体浓度范围为4×10³个/毫升至4×10⁸个/毫升与得到的电化学信号呈线性相关。

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