CN112057467A

CN112057467A - 一种磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物的制备方法及其在腺苷代谢调控中的应用

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Publication number: CN112057467A
Application number: CN202010938892.5A
Authority: CN
Inventors: 袁荃; 梁玲; 谈洁
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2040-09-09
Also published as: CN112057467B

Abstract

本发明公开了一种磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物的制备方法及其在腺苷代谢调控中的应用，由氯化铁、间‑四(4‑羧基苯基)卟啉、苯甲酸分散在二甲基亚砜溶液中，于油浴锅中加热回流后得到MOF纳米材料；将合成的MOF溶液加入CaCl₂溶液，摇床300rpm平衡2h；加入Na₂HPO₄溶液，摇床300rpm矿化过夜，得到CaP@MOF纳米颗粒。本发明提供的CaP@MOF是具有纳米级大小的梭形颗粒，可以有效减缓体内快速清除的问题；可以通过腺苷的产生及腺苷的转换两种途径降低腺苷的浓度，在肿瘤组织内通过多途径调控腺苷代谢具有巨大的实用前景。

Description

一种磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物的制备方法及其在腺苷代谢调控中的应用

技术领域

本发明属于医用纳米材料领域，具体涉及一种磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物的制备方法，及其在腺苷代谢调控中的应用。

背景技术

腺苷是一种信号分子，其浓度的变化被认为是用于调节一些重要的生理病理过程，如缺氧、缺血、炎症或创伤。在生理条件下，细胞外腺苷的积累具有保护作用，可以使细胞和组织免受过度的炎症反应和免疫介导的损害。然而，在肿瘤微环境中，腺苷浓度比在正常组织中含量高得多。一方面，肿瘤微环境的乏氧条件诱导核苷三磷酸二磷酸化酶(CD39)和胞外5-核苷酸酶(CD73)高表达并增加其分解代谢产生腺苷。另一方面，已产生的高浓度腺苷降低了腺苷激酶(ADK) 催化腺苷磷酸化的能力。过量的腺苷在免疫抑制肿瘤微环境的建立和肿瘤的进展中起着重要的作用，可通过激活腺苷受体调节巨噬细胞、树突状细胞、骨髓源性抑制细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫或炎性细胞的功能，构建免疫耐受肿瘤微环境。肿瘤细胞利用腺苷介导的这种免疫抑制反应，保护肿瘤组织免受免疫系统损害，从而逃避免疫监测促进肿瘤的发生发展。因此，调控肿瘤微环境腺苷的浓度对于腺苷介导的免疫抑制作用是尤为重要的。

在肿瘤免疫治疗中，为了抑制腺苷介导的免疫抑制作用，目前已有文献报道利用小分子抑制剂来降低腺苷浓度，通过小分子抑制剂抑制CD39或CD73的蛋白表达，从而激活T淋巴细胞的免疫应答作用，同时增加T淋巴细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性，最终杀伤肿瘤细胞。这样的方法存在很多缺陷，第一，小分子抑制剂血液循环时间短且易于被肝肾等器官代谢，难以维持长期的治疗作用。第二，腺苷的代谢涉及多种途径包括腺苷产生、转化及降解等，小分子抑制剂只能对一种途径进行抑制，并不能从根本上改善腺苷介导的免疫抑制。第三，小分子抑制剂主要解决细胞外腺苷的腺苷代谢，没有考虑细胞内腺苷代谢；第四，腺苷代谢与酶的表达高度相关，而酶的高度表达与所处的乏氧肿瘤微环境导致，并没有解决肿瘤乏氧等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种纳米级磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物的制备方法，利用磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物解决了肿瘤微环境腺苷大量积累和固有肿瘤乏氧的问题。本发明的另一目的是提供前述化合物在腺苷代谢调控中的应用，其中包覆在CaP@MOF表面的CaP在酸性肿瘤微环境中可降解为无机磷酸盐，该磷酸盐将恢复腺苷腺苷激酶的活性并随后减少腺苷的积累。CaP@MOF中金属铁部分会通过类芬顿反应产生氧气(O₂)改善肿瘤乏氧问题，从而阻碍腺苷相关的CD39和CD73高表达，进一步降低腺苷浓度。

为实现上述目的，本发明主要提供了下述技术方案：

一种磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物CaP@MOF的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)由10mg氯化铁(FeCl₃.6H₂O)、1mg间-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、 0.1124g苯甲酸分散在2.5ml二甲基亚砜(DMF)溶液中，于油浴锅中加热到 120-150℃回流反应持续10h，得到MOF纳米材料；

(2)将合成的MOF溶液加入0.5mL 3mM CaCl₂溶液，37℃摇床300rpm 平衡2h；加入0.5mL 1.5mM Na₂HPO₄溶液，37℃摇床300rpm矿化过夜，得到CaP@MOF纳米颗粒。

本发明的纳米级磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物应用于腺苷代谢的调控。

本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明提供的CaP@MOF是具有纳米级大小的梭形颗粒，可以有效减缓体内快速清除的问题。

(2)本发明提供的CaP@MOF可以通过腺苷的产生及腺苷的转换两种途径降低腺苷的浓度，在肿瘤组织内通过多途径调控腺苷代谢具有巨大的实用前景。

(3)本发明提供的CaP@MOF能够通过类芬顿反应产生O₂，改善了肿瘤微环境的乏氧状态，降低了腺苷相关酶的表达。

(4)本发明提供的CaP@MOF能够降低肿瘤组织内的腺苷浓度，因此它非常适于肿瘤组织内腺苷代谢的调控，并在腺苷介导的免疫抑制作用中起到抑制作用。

附图说明

图1 CaP@MOF制备过程的示意图。TCPP：间-四(4-羧基苯基)卟啉， Fe-TCPP：铁络合间-四(4-羧基苯基)卟啉，MOF：铁基金属有机框架化合物， CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。

图2 CaP@MOF通过抑制腺苷产生及增强腺苷转化两种途径降低腺苷在肿瘤微环境中积累的示意图。ATP：三磷酸腺苷，Ado：腺苷，AMP：一磷酸腺苷， CD39：核苷三磷酸二磷酸化酶，CD73：胞外5-核苷酸酶，CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。

图3 MOF的表征：

其中，(a)MOF的TEM图像；(b)MOF的TEM图像；(c)TCPP及MOF 的紫外可见光谱；(d)TCPP和MOF的傅里叶红外光谱仪光谱。TCPP：间-四(4- 羧基苯基)卟啉：MOF：铁基金属有机框架化合物。

图4 CaP@MOF的表征：

其中，(a)CaP@MOF的TEM图像；(b)在不同pH中，CaP@MOF降解产生磷酸盐浓度；(c)由溶氧仪检测CaP@MOF随时间改变产生的O₂浓度。 CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物；H₂O₂：过氧化氢。

图5 CaP@MOF不同pH下促进腺苷转换的HPLC图

其中，(a)在pH 5.5时，ATP,ADP,AMP,Ado等底物及产物的HPLC色谱图；(b)在pH7.4时，ATP,ADP,AMP,Ado等底物及产物的HPLC色谱图。ATP：三磷酸腺苷；ADP：二磷酸腺苷；AMP：一磷酸腺苷；Ado：腺苷；ADK：腺苷激酶。CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。

图6 CaP@MOF在不同条件下对CD39及CD73蛋白表达的影响

其中，常氧、缺氧及不同浓度CaP@MOF孵育后4T1细胞中CD39(a)和 CD73(b)表达的蛋白质印迹结果。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。CD39：核苷三磷酸二磷酸化酶；CD73：胞外5-核苷酸酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。

图7 CaP@MOF处理4T1细胞后胞内腺苷检测的HPLC图

其中，通过HPLC对暴露于常氧(a)、低氧(b)、低氧+MOF(c)及低氧+ CaP@MOF(d)条件下4T1细胞内腺苷定量。MOF：铁基金属有机框架化合物；CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。

图8 CaP@MOF处理荷瘤小鼠后，肿瘤组织后腺苷检测的HPLC图。Ado：腺苷；CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

图1是CaP@MOF制备过程的示意图，TCPP：间-四(4-羧基苯基)卟啉， Fe-TCPP：铁络合间-四(4-羧基苯基)卟啉，MOF：铁基金属有机框架化合物， CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。所述CaP@MOF是由通过溶剂热法一锅合成的铁基金属有机框架化合物(MOF)及通过种子生长法在其表面包覆磷化钙(CaP)矿化层制备而成。

图2是CaP@MOF通过抑制腺苷产生及增强腺苷转化两种途径降低腺苷在肿瘤微环境中积累的示意图。ATP：三磷酸腺苷，Ado：腺苷，AMP：一磷酸腺苷，CD39：核苷三磷酸二磷酸化酶，CD73：胞外5-核苷酸酶，CaP@MOF：磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物。CaP@MOF通过抑制腺苷产生及增强腺苷转化两种途径降低腺苷在肿瘤微环境的积累。CaP@MOF在酸性条件下促进 ADK催化腺苷磷酸化降低腺苷的积累；此外，CaP@MOF通过类芬顿反应产生氧气降低低氧环境中高表达的CD39及CD73，进一步促进细胞内腺苷减少。所述CaP@MOF在肿瘤组织中也能够显着降低腺苷水平，可以有效抑制肿瘤组织中腺苷的积累。

实施例1：MOF的制备及表征

MOF通过以下方法制备：将FeCl₃.6H₂O、TCPP及苯甲酸按照摩尔比28：1： 634溶于2.5mL DMF溶液中，磁子搅拌，油浴锅加热到120-150℃回流10h。反应完成后，自然冷却到室温，将产物转移到5mL离心管中，15000rpm离心 15min，得红棕色MOF纳米材料。去离子水洗涤三次，并放入60℃烘箱中干燥。

将得到的MOF溶液滴到铜网上进行透射电子显微镜表征。表征结果如图3 (a)所示，MOF具有大小均匀且分散良好的纳米梭形态，其长约为70-80nm，宽约为40-50nm。进一步将浓度为5μM的MOF溶液在紫外分光光度计上进行光学吸收性质的检测，紫外可见光谱(UV-vis)表明TCPP和MOF同时含有400 nm较强吸收峰及500-680nm范围内及吸收带(图3(b))。相比于TCPP， MOF500-680 nm范围内少两个吸收峰，说明TCPP金属化后导致分子对称性增加。傅里叶红外光谱仪进一步表征了MOF的结构。如图3(c)所示，与TCPP 相比，MOF的C＝O伸缩振动从1687下降到1661cm^-1，Fe-N在1001cm^-1伸缩振动较强，而N-H在963cm^-1的面内弯曲振动消失，反映了卟啉环与铁的金属化。同时，与TCPP相似，MOF在1602、1550和1404cm^-1处表现出大环骨架吸收的特征峰，表明合成的MOF保持了TCPP的吡咯环结构。

实施例2：CaP@MOF的制备及表征

(1)MOF表面包覆CaP矿化层，通过以下方法：移液枪取500μL 300μM MOF溶液，15000rpm离心15min。向所得到的MOF沉淀中加入0.5mL 3mM CaCl₂溶液，在37℃、300rpm摇床中震荡2h后，加入0.5mL 1.5mM的Na₂HPO₄溶液，在37℃、300rpm摇床中矿化过夜，反应完成后，利用7-10kD透析袋透析去除未矿化的离子。

(2)CaP@MOF在酸性条件下降解为磷酸盐，通过以下方法检测：将两份 MOF沉淀分别溶于50mL Tris-HCl缓冲盐(pH 7.4)和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES) 缓冲盐(pH 5.5)，并同时置于7-14kD的透析袋中，在不同的时间点从缓冲溶液中取100μL，用磷酸盐检测试剂盒检测不同时间间隔的磷酸盐浓度。

(3)CaP@MOF通过类芬顿反应产生O₂，通过以下方法检测：将1000μM H₂O₂分别与5μMCaP@MOF、10μM CaP@MOF和10μM TCPP溶液在无氧PBS (pH 7.4)中，用溶氧仪以5min间隔测量溶解的O₂浓度。

将得到的CaP@MOF滴到铜网上进行透射电子显微镜表征。表征结果如图4 (a)所示，MOF表面的成功包覆上了一层CaP。利用磷酸盐检测试剂盒检测 CaP@MOF降解产生的磷酸盐浓度，结果显示在MES(pH 5.5)处理的上清液中磷酸盐浓度随时间的快速升高，24h后，在MES(pH 5.5)处理的上清液中的磷酸盐浓度(27.59μM)约为在Tris-HCl缓冲盐(pH7.4)中浓度(12.23μM)的两倍(图4(b))。该结果表明在酸性环境中CaP@MOF溶解度更高，并且更容易产生游离磷酸根离子。此外，进一步将CaP@MOF与H₂O₂放置于无氧的PBS 缓冲液中，TCPP与H₂O₂作为对照，通过溶氧仪测量释放的O₂浓度随时间的变化。O₂浓度呈现随时间依赖的上升趋势(图4(c))，表明CaP@MOF能够产生了大量的O₂。

实施例3：CaP@MOF体外调控腺苷代谢中的应用。

(1)将CaP@MOF溶液分别重悬于MES溶液(pH 5.5)和的Tris溶液(pH 7.4)中，放置24h后用0.22μm滤膜过滤，加入终浓度1mM ATP、1mM MgCl₂、 0.5mM腺苷，10μg/mL ADK，在37℃的恒温水浴中反应10min后取出置于 -20℃冰箱中停止反应，HPLC检测ADK酶催化的腺苷转化浓度。

(2)以每孔1×10⁷细胞的密度将4T1细胞接种在培养皿中，细胞培养箱中培养48h后，分别用常氧、低氧、低氧+MOF及低氧+CaP@MOF处理4h，去除旧培养基后用150μL HClO4(70～72％)收集细胞。细胞粉碎仪超声(50W，工作时间0.5s，间隔时间1s)5min后，4℃12000rpm离心5min，取上清液进行蛋白浓度定量，用超纯水稀释至各样品中蛋白浓度相等。取350μL各样品溶液，加入150μL 0.4M NaOH中和，15000rpm离心15min，用0.22μm水系滤膜过滤该上清液，HPLC检测细胞内腺苷浓度。

通过HPLC测定ATP，ADP，AMP和腺苷的水平。如图5(a)所示，在含 ATP和腺苷的MES(pH 5.5)溶液中，加入ADK后出现了两个新的色谱峰，分别是ADP(3.58min)和AMP(5.54min)。同时，ATP(3.58min)和腺苷(16.12 min)的色谱峰强度出现明显的降低趋势，表明在MES(pH 5.5)的缓冲溶液中， ADK可以催化腺苷磷酸化，生成ADP及AMP。其次，将CaP@MOF加入到上述ADK催化的腺苷磷酸化反应体系后，ATP和腺苷浓度继续降低，分别降至608.06±19.57μM和158.76±5.55μM，ADP和AMP的峰强度继续上升至342.61 ±15.96μM和317.45±11.30μM。当将ADK加入到Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液后，HPLC色谱图中同样显示出ADP和AMP的色谱峰，但峰强度都小于MES (pH 5.5)缓冲液中的结果。当在Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液加入含ADK的 CaP@MOF时，ADP和AMP的色谱峰强度基本不变(图5(b))。上述结果都表明，ADK酶的催化活性在pH 5.5时比在pH 7.4时强，且CaP@MOF在酸性条件下促进ADK催化的腺苷磷酸化。

肿瘤微环境中CD39和CD73表达量通过蛋白免疫印迹进行了表征。如图6 (a)，(b)所示，在低氧条件下CD39和CD73蛋白均上调，CaP@MOF处理后CD39和CD73蛋白表达量均以剂量依赖性呈下调趋势。这些结果充分证实了 CaP@MOF介导的CD39和CD73蛋白表达下调，同时该下调的两个腺苷产生相关的蛋白也能够抑制肿瘤细胞腺苷的积累。

4T1细胞内腺苷浓度通过HPLC进行了检测。检测结果如图7(a)～(d) 所示，在常氧条件下，腺苷保留时间为15.45min，浓度为0.71±0.03μM。在低氧环境中，腺苷浓度增加至1.57±0.08μM，约为常氧条件下腺苷浓度的2倍，表明在低氧条件下细胞积累了大量腺苷。经CaP@MOF处理后，在低氧环境中腺苷浓度显著降低至0.54±0.02μM。总之，这些结果都表明CaP@MOF能够减少细胞内腺苷的含量。

实施例4：CaP@MOF体内调控腺苷代谢中的应用。

(1)将100μL RPMI 1640培养基中悬浮的1×10⁶ 4T1细胞皮下注射到4周龄雌性Balb/c小鼠(18-20g)进行肿瘤接种。当肿瘤大小达到约120mm³后，用50μL 10mg kg^-1剂量的PBS或CaP@MOF对荷瘤小鼠进行瘤内注射。24h 后，从每组小鼠中取出肿瘤组织，切碎肿瘤组织，并将肿瘤组织转移至1.5ml 管中超声处理5min(30W，工作3s，间隔3s)。将组织液以5000rpm离心10 min，取上清液，HPLC检测样品中的腺苷含量。

在将CaP@MOF注射到荷瘤小鼠后，进一步通过HPLC检测肿瘤组织中的腺苷水平。如图8所示，PBS组中腺苷的峰强度远低于CaP@MOF处理组中的腺苷峰强度。PBS组中腺苷的浓度为76.18±8.91μM，与报道的肿瘤微环境中的高浓度非常吻合，表明在肿瘤组织中大量腺苷积累。相比之下，用CaP@MOF 处理的肿瘤组织中腺苷浓度显着降低至17.92±0.90μM，表明CaP@MOF可以有效抑制肿瘤组织中腺苷的积累。总之，无论是源自于CaP壳降解导致磷酸盐促进的腺苷磷酸化，还是通过类芬顿反应补充了O₂，我们制备的CaP@MOF都可以有效抑制肿瘤组织中腺苷的积累。

上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims

1.一种磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)由10mg氯化铁(FeCl₃.6H₂O)、1mg间-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、0.1124g苯甲酸分散在2.5ml二甲基亚砜溶液中，于油浴锅中加热到120-150℃回流反应持续10h，得到MOF纳米材料；

(2)将合成的MOF溶液加入0.5mL 3mM CaCl₂溶液，37℃摇床300rpm平衡2h；加入0.5mL1.5mM Na₂HPO₄溶液，37℃摇床300rpm矿化过夜，得到CaP@MOF纳米颗粒。

2.权利要求1所述的纳米级磷化钙矿化的铁基金属有机框架化合物应用于腺苷代谢的调控。