CN114367298A - 一种双酶活性钴单原子纳米酶及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双酶活性钴单原子纳米酶及其制备方法、应用，该双酶活性钴单原子纳米酶包括碳骨架和锚定在碳骨架上的Co单原子；该双酶活性钴单原子纳米酶由包括如下步骤的方法制备得到：(1)Zn(NO3)2·6H2O、Co(NO3)2·6H2O和2‑甲基咪唑反应合成Co‑ZIF‑8；(2)将Co‑ZIF‑8的热解和H2SO4处理后，制得。本发明Co‑N/C SACs催化剂为单原子结构，具有双酶活性，可同时模拟抗坏血酸氧化酶和谷胱甘肽氧化酶的活性。

Description

一种双酶活性钴单原子纳米酶及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于生物催化剂技术领域，具体涉及一种双酶活性钴单原子纳米酶及其制备方法、应用。
背景技术
抗坏血酸(AA，也称为维生素C)从1970年代起也被认为是治疗癌症的有效方法。临床试验表明，AA是一种潜在的佐剂，可以提高包括卵巢癌、脑癌和肺癌等的癌症治疗疗效。大多数研究人员认为，AA抗癌作用的核心药理机制是通过自氧化产生过氧化氢(H2O2)进而抑制肿瘤的生长。以前的研究表明，H2O2选择性地诱导癌细胞氧化应激，因为癌细胞中活性铁代谢的改变使之与正常细胞相比，对抗坏血酸水平的变化更敏感。然而，抗坏血酸的自氧化非常缓慢，治疗效果受到限制，单独使用大剂量抗坏血酸未表现出良好的抗癌活性。抗坏血酸常与化疗药物联合使用以增强其抗癌活性。
谷胱甘肽作为肿瘤微环境中最丰富的抗氧化剂，可以有效清除活性氧，如超氧化物、羟基自由基、H2O2等。高水平的谷胱甘肽可以保护癌细胞免受氧化应激，不利于产生活性氧抑制肿瘤的治疗策略。因此，谷胱甘肽的消耗会增强活性氧的水平，进而抑制癌细胞的功能和增殖。有许多研究报道了一些能催化GSH用于癌症治疗的材料，例如，Dong等开发了一种多功能且类似细菌的PEG/Ce-Bi@DMSN纳米酶，可以通过氧化还原反应有效消耗肿瘤微环境中过表达的GSH。Zhong等报道了PtCu3纳米笼可以模拟谷胱甘肽过氧化物酶，加速GSH消耗，进一步削弱肿瘤细胞通过GSH清除ROS的能力。
在相关技术中，通过增强活性氧水平来抑制肿瘤生长一直是研究的重点。例如，利用抗坏血酸来增强抗肿瘤效果，但是抗坏血酸氧化慢产生的活性氧少，且细胞内的抗氧化剂(谷胱甘肽)会消耗活性氧，这会大大降低抗肿瘤效果。相关技术中也鲜少利用该两条途径(加速AA产生活性氧并消耗细胞内GSH来调节细胞内氧化还原平衡)来提高抗肿瘤治疗效果。因此，相关技术中的生物催化剂材料有待改进。
发明内容
本发明旨在在一定程度上至少解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明一个方面，提供了一种双酶活性钴单原子纳米酶(Co-N/C SACs)。根据本发明的实施例，该双酶活性钴单原子纳米酶包括：碳骨架和锚定在碳骨架上的Co单原子；Co-N/C SACs由包括如下步骤的方法制备得到：(1)Zn(NO3)2·6H2O、Co(NO3)2·6H2O和2-甲基咪唑反应合成Co-ZIF-8；(2)将Co-ZIF-8的热解和H2SO4处理后，制得Co-N/C SACs。
在一些实施例中，Co-N/C SACs为六边形结构，原子Co位点均匀嵌入整个碳六边形中。
在一些实施例中，Co单原子负载量为3-4wt％。
本发明另一方面，提供了Co-N/C SACs的制备方法。根据本发明的实施例，该制备方法包括如下步骤：
(1)Co-ZIF-8的合成:
在室温下，将Zn(NO3)2·6H2O、Co(NO3)2·6H2O混合金属盐和2-甲基咪唑分别溶于甲醇溶液中，室温下混合，搅拌充分反应，离心收集沉淀物，甲醇洗涤，干燥后，得到Co-ZIF-8。
(2)Co-N/C SACs的合成
将Co-ZIF-8在氮气气氛中进行热解。在一些实施例中，热解温度为900-1000℃；热解时间为2-3h；在一些实施例中，热解的升温速度为2-5℃min-1。
在一些实施例中，步骤(1)反应的搅拌速率为800-1000rpm；搅拌时间为0.8-1h。
在一些实施例中，步骤(1)中，Zn(NO3)2·6H2O的浓度为92-95mM，Co(NO3)2·6H2O的浓度为5.5-6.2mM；2-甲基咪唑的浓度为790-800mM。
在一些实施例中，该方法还包括将热解产物浸入H2SO4溶液中，以去除残留的锌。在一些实施例中，H2SO4溶液的浓度为0.5M；温度为80℃；搅拌时间为8h。
在一些实施例中，该方法还包括：离心分离，洗涤，干燥，得Co-N/C SACs。
本发明的另一方面，还提供了上述双酶活性钴单原子纳米酶或上述技术方案制备的双酶活性钴单原子纳米酶作为制备治疗脑肿瘤的药物中的应用。
在一些实施例中，本发明提供了上述双酶活性钴单原子纳米酶作为制备治疗胶质瘤的药物中的应用。
本发明的优点和有益效果有：
(1)、本发明Co-N/C SACs催化剂为单原子结构，具有双酶活性，可同时模拟抗坏血酸氧化酶和谷胱甘肽氧化酶的活性。
(2)、本发明Co-N/C SACs催化剂的Co单原子具有较高的负载量，能够提供充足的催化活性位点。
(3)、本发明Co-N/C SACs催化剂的制备方法，制备工艺简单可控、成本较低，易于实现工业化生产，进一步的，本发明实施例的制备方法采用的金属材料来源广泛、易得，成本较低。
(4)、本发明Co-N/C SACs催化剂可同时催化抗坏血酸氧化与谷胱甘肽氧化。催化抗坏血酸氧化产生活性氧，催化谷胱甘肽氧化以消耗抗氧化剂(谷胱甘肽)，不需借助辅助手段。例如光热、声动力等。两种方法的协同作用增强活性氧水平，可以有效抑制癌细胞的生长，为治疗癌症奠定基础。
附图说明
图1为Co-ZIF-8和ZIF-8的TEM图像，比例尺200nm。其中，图1(A)为Co-ZIF-8的TEM图像，图1(B)为ZIF-8的TEM图像。
图2为Co-N/C SACs的结构表征。其中图2(A)为Co-N/C SACs的SEM图像，比例尺：200nm；图2(B)为Co-N/C SACs的TEM图像，比例尺：200nm；图2(C)为Co-N/C SACs的TEM图像，比例尺：5nm；图2(D)，图2(E)为Co-N/C SACs的AC-STEM图像，Co单原子用红色圆圈表示，比例尺：图3(D)中为2nm；图2(F)为Co-N/C SACs的HAADF-STEM图像和相应的EDX元素映射：C元素(红色)，N元素(绿色)和Co元素(黄色)，比例尺：50nm。
图3为Co-N/C SACs催化剂的X射线衍射图和XPS光谱图，其中图3(A)为Co-N/CSACs催化剂的X射线衍射图。图3(B)为C1s高分辨率XPS光谱。图3(C)为N1s高分辨率XPS光谱。图3(D)为Co 2p高分辨率XPS光谱。
图4为以AA为底物，Co-N/C、N/C、Co-ZIF催化AA的结果图；其中图4(A)为Co-N/C、N/C、Co-ZIF催化AA氧化的紫外-可见吸收光谱。图4(B)AA在不同测定条件下的吸光度随时间的变化。
图5为以GSH为底物，Co-N/C、N/C、Co-ZIF催化谷胱甘肽氧化的结果图，其中图5(A)为Co-N/C、NC、Co-ZIF催化谷胱甘肽氧化的紫外-可见吸收光谱。图5(B)为不同测定条件下GSH-DTNB吸光度随时间的变化。
图6为Co-N/C SACs催化抗坏血酸氧化对PC12细胞存活率的影响。其中图6(A)为0-2mM抗坏血酸或25μg/mL Co-N/C SACs联合0-2mM抗坏血酸处理24h。图6(B)为0-50μg/mLCo-N/C SACs或2mM抗坏血酸联合0-50μg/mL Co-N/C处理24h。
图7为DCFH-DA探针染色的细胞内ROS水平的代表性荧光图像，分别用抗坏血酸、Co-N/C SACs或抗坏血酸+Co-N/C SACs处理PC12细胞，比例尺:100μm。
图8为Co-N/C SACs处理后PC12细胞中还原性谷胱甘肽百分比。
图9为Co-N/C SAC、AA对U87 MG、SVGP12细胞毒性的影响以及Co-N/C SACs催化AA对U87 MG的细胞毒性的影响；其中图9(A)为Co-N/C SAC对SVP12和U87 MG的细胞毒性。图9(B)为AA对SVP12和U87 MG的细胞毒性。图9(C)为Co-N/C SACs催化AA氧化对细胞毒性的影响。误差棒显示三个平行实验计算的平均值的标准偏差(SD)，＊＊＊p<0.001。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明实施例通过热解钴掺杂的沸石咪唑脂骨架-8合成了钴单原子(Co-N/CSACs)催化剂，该催化剂是单原子结构，钴作为催化剂的活性中心。该催化剂可以同时模拟抗坏血酸氧化酶和谷胱甘肽氧化酶的特性。相较于相关技术中的其它催化剂，Co-N/C SACs能够提供强的催化活性位点，具有较高的催化活性。
Co-N/C SACs催化剂可以通过加速抗坏血酸的氧化诱导活性氧产生的同时，Co-N/CSACs催化剂通过消耗主要的抗氧化剂谷胱甘肽来破坏内源性活性氧清除系统。
Co-N/C SACs催化剂通过打破细胞系统的氧化还原平衡来抑制癌细胞的生长，且并不依赖外部环境，是一种温和高效的治疗癌症手段。
在抗坏血酸和Co-N/C SACs与脑肿瘤相关胶质瘤细胞相互作用后，有效抑制脑肿瘤相关胶质瘤细胞的生长，表明Co-N/C SACs的双重酶模拟特性可以通过破坏胞内氧化还原稳态抑制肿瘤的生长。
实施例1
Co-N/C SACs催化剂的制备方法，包括如下步骤：
a、Co-ZIF-8的合成:
在室温下，2.76g的Zn(NO3)2·6H2O、0.1723g的Co(NO3)2·6H2O混合金属盐和6.52g2-甲基咪唑分别溶于100mL甲醇溶液，然后，将两种溶液快速混合并在室温下以1000rpm剧烈搅拌1小时。离心收集沉淀物，并用甲醇洗涤3次，最后在60℃下干燥，得到Co-ZIF-8。
b、Co-N/C SACs的合成
所制备的前体Co-ZIF-8以2℃ min-1的升温速率加热到900℃，并在900℃下氮气气氛下保持2h。获得的产物在80℃的0.5M H2SO4溶液中搅拌8h，以去除残留的锌。离心收集后，用水和乙醇洗涤六次，最后在60℃下真空干燥，最终获得Co-N/C SACs催化剂。
本发明实施例还提供了ZIF-8的合成方法、N/C催化剂的合成方法，具体如下：ZIF-8的合成方法，包括如下步骤：
在室温下，2.76g的Zn(NO3)2·6H2O金属盐和6.52g 2-甲基咪唑分别溶于100mL甲醇溶液，然后，将两种溶液快速混合并在室温下剧烈搅拌1小时。离心收集沉淀物，并用甲醇洗涤3次，最后在60℃下干燥，得到ZIF-8。
N/C催化剂的合成方法，包括如下步骤：
在室温下，2.76g的Zn(NO3)2·6H2O金属盐和6.52g 2-甲基咪唑分别溶于100mL甲醇溶液，然后，将两种溶液快速混合并在室温下剧烈搅拌1小时。离心收集沉淀物，并用甲醇洗涤3次，最后在60℃下干燥，得到ZIF-8。所制备的ZIF-8以2℃ min-1的升温速率加热到900℃，并在900℃下氮气气氛下保持2h。获得的产物在80℃的0.5M H2SO4溶液中搅拌8h，以去除残留的锌。离心收集后，用水和乙醇洗涤六次，最后在60℃下真空干燥，最终获得N/C催化剂。
实验结果
(1)Co-N/C SACs的形貌和结构表征
图1为Co-ZIF-8和ZIF-8的TEM图像，从图1(A)中的透射电子显微镜(TEM)图像可以观察到Co-ZIF-8的多面体结构，其尺寸在100至200nm之间。Co-ZIF-8结构是由Co2+和Zn2+与2-甲基咪唑配位合成的，该结构与ZIF-8相似(图1(B))。
经过Co-ZIF-8的热解和H2SO4处理后，获得了Co-N/C SACs催化剂，该催化剂很好地保留了前驱体Co-ZIF-8的形态。通过扫描电子显微镜(SEM)(图2(A))和TEM图像(图2(B))可见Co-N/C SACs为六边形结构。图2(C)为Co-N/C SACs的TEM图像，在碳六边形中未观察到纳米颗粒，这表明原子Co位点可均匀地嵌入整个碳六边形中。为了获得所合成的Co单原子的更多形貌信息，进行了球差校正扫描透射电子显微镜(AC-STEM)。高原子序数的Co原子显示为亮点(图2(D),2(E))，原子分散的Co原子用红色圆圈突出显示。图2(F)显示了Co-N/CSACs的能量色散X射线光谱(EDX)元素映射，其中元素C，N和Co均匀分布在整个体系结构上。
通过X射线粉末衍射(XRD)谱图进一步研究Co-N/C SACs的结构,没有观察到Co的衍射峰(图3(A))，表明Co以高分散性原子锚定在碳框架上。通过X射线光电子能谱(XPS)对样品表面化学组成以及元素的价态进行了分析。如图3(B)所示，在C1s轨道的高分辨率XPS谱图中，结合能分别为284.8eV、285.5eV、286.5eV、287.8eV、289eV和290eV的峰分别归属于C-C，C＝N，C-OH，C-N，-C＝O，O＝C-O键。图3(C)揭示了吡啶氮(398.4eV)，吡咯氮(400.4eV)和石墨氮(402.8eV)共存。由于强的配位亲和力，吡咯氮是稳定单原子Co的主要锚点。在Co2p(图3(D))的高分辨XPS谱图中，显示出Co(II)(780.7eV)是钴元素的主要存在形式。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)验证，Co-N/C SACs的载Co率高达3.4％，高负载量的Co单原子，有利于Co的活性位点的暴露，提高催化活性。
(2)Co-N/C SACs催化剂的模拟抗坏血酸和谷胱甘肽氧化酶的性质表征
AA和GSH是生物体中重要的抗氧化剂。作为抗氧化剂，AA可以抑制细胞氧化应激。GSH以细胞内游离硫醇的形式存在，其为细胞中占主导地位的还原小分子，并具有保护细胞免受自由基引起的氧化损伤的作用。本部分以AA和GSH为底物，研究了Co-N/C SACs模拟抗坏血酸和谷胱甘肽氧化酶的性质。
根据本发明的实施例，抗坏血酸氧化酶所用检测信号为抗坏血酸在265nm处的吸收，Co-N/C SACs催化AA氧化产生脱氢抗坏血酸(DHA)，随着AA的消耗，其在265nm处的吸收降低，具体实施步骤如下：
在0.1M磷酸缓冲溶液中，AA(100μM)，再加入Co-N/C(50μg/mL)或Co-ZIF(50μg/mL)或N/C(50μg/mL)，反应2min，然后利用紫外分光光度计记录265nm处吸光度。
通过图4(A)可以看出，AA与AA-Co-N/C SACs反应体系相比较，在AA-Co-N/C SACs体系中265nm处吸光度明显降低，这表明Co-N/C SACs催化了AA氧化为脱氢抗坏血酸(DHA)，且与Co-ZIF和N/C相比，Co-N/C SACs显示出更优异的类抗坏血酸氧化酶性质。因此，Co-N/CSACs在模拟抗坏血酸氧化酶方面的催化活性高于Co-ZIF和N/C，这主要归因于Co单原子的催化活性。如图4(B)所示，实时监测底物AA在265nm的吸收变化也证明Co-N/C SACs具有优异的抗坏血酸氧化酶性质。通过图4(A)和4(B)可以看出，Co-N/CSACs与Co-ZIF和N/C相比具有出色的类抗坏血酸氧化酶活性。
根据本发明的实施例，谷胱甘肽氧化酶所用检测试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，谷胱甘肽与发色底物5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)反应生成2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB-)和氧化态谷胱甘肽，TNB-在中性或碱性条件下离子化形成黄色物质TNB2-，其在紫外光谱412nm处有吸收。Co-N/C SACs可以催化GSH和氧气之间的反应，生成GSSG和H2O。随着GSH的消耗，DTNB和GSH反应生成的黄色物质TNB2-减少，其在412nm处的吸光度值减弱。具体实施步骤如下：
在含有100μM GSH和40μM DTNB的0.1M磷酸缓冲溶液中，AA(100μM)，再加入Co-N/C(50μg/mL)或Co-ZIF(50μg/mL)或N/C(50μg/mL)，反应2分钟，检测412nm处的吸光度值。
如图5(A)所示，当在反应体系加入Co-N/C SACs或N/C时，反应产物在412nm处的吸光度值会降低，这是因为GSH与氧气被催化反应生成GSSG，并且使用Co-N/C SACs作为催化剂时，412nm处吸光度降低的速度更快。为了进一步研究Co-N/C SACs模拟谷胱甘肽氧化酶的活性，测定了Co-N/C SACs催化O2与GSH反应体系中GSH的量随时间的变化(图5(B))。GSH与DTNB反应生成的TNB2-在412nm处的吸收值减小，在200s后完全消失，因此表明Co-N/CSACs可以催化GSH快速氧化为GSSG。
(3)Co-N/C SACs催化剂可用于抑制癌细胞的生长
根据本发明的实施例，采用MTT法检测细胞活力。首先，以嗜铬瘤细胞为例，通过MTT法检测AA和Co-N/C SACs对PC12细胞的毒性。具体步骤如下：
将嗜铬瘤细胞细胞以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板上，并在培养基中培养24h.后，加入不同浓度的材料，继续培养24h，加入MTT 5mg/mL，培养4h后，小心吸出孔内培养上清液，避免吸去紫色结晶，继续加入150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
图6为Co-N/C SACs催化抗坏血酸氧化对PC12细胞存活率的影响。其中图6(A)中AA组为0mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM的抗坏血酸处理24h；AA+Co-N/C(25μg/mL)组为25μg/mLCo-N/C SACs联合0mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM的抗坏血酸处理24h；AA组的结果位于左侧，AA+Co-N/C(25μg/mL)组的结果位于右侧。通过图6(A)可以看出，抗坏血酸的浓度小于2mM，几乎没有细胞毒性。当加入25μg/mL Co-N/C SACs时，在较低的抗坏血酸浓度下PC12细胞存活率开始下降。单独的1mM的抗坏血酸下，细胞存活率降低了5％，而加入Co-N/C SACs后可使存活率降低40％。
图6(B)中Co-N/C组为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL Co-N/C SACs处理24h；AA(1mM)+Co-N/C组为1mM抗坏血酸联合0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mLCo-N/C SACs处理24h；Co-N/C组结果位于左侧，AA(1mM)+Co-N/C组结果位于右侧。通过图6(B)可以看出，在24小时和最大Co-N/C SACs物质浓度下，PC12细胞活力下降至最大86.4％，细胞毒性低。当加入1mM固定抗坏血酸后，随着Co-N/C SACs物质浓度的增加，癌细胞的清除效果变好。可以看出，Co-N/C SACs增加了抗坏血酸对癌细胞的细胞毒性作用。
根据本发明的实施例，为评估癌细胞对抗坏血酸诱导的氧化应激的反应。本发明采用DCFH-DA染色法测定细胞内ROS水平。通过显微镜以及活性氧探针(DCFH-DA)验证Co-N/C SACs催化抗坏血酸氧化后胞内活性氧的量。具体步骤如下：
将PC12细胞以2×104个/孔的密度接种96孔板中，培养24h后，分别用1mM AA、25μg/ml Co-N/C SACs、1mM AA+25μg/ml Co-N/C SACs处理2h，PBS清洗。然后用2μMDCFH-DA在黑暗中标记细胞30分钟。PBS洗净后，用显微镜观察细胞内ROS水平。如图7所示，细胞自身的荧光信号非常弱，表明可忽略不计细胞中的活性氧。抗坏血酸处理后，信号略强，导致少量的过氧化物产生。相反，在暴露于Co-N/C SACs和抗坏血酸的细胞中，发现强烈的荧光信号，表明过氧化物水平显着增加。结果表明，抗坏血酸对癌细胞的细胞毒性作用增强，主要是通过加速抗坏血酸氧化引起的毒性应激和代谢应激。
根据本发明的实施例，采用DTNB法检测PC12细胞裂解液内的GSH。通过5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)作为GSH的检测试剂，检测Co-N/C SACs处理后细胞裂解液中的GSH含量。具体步骤如下：
将PC12细胞以2×104个/孔的密度接种96孔板中，培养24h后，25μg/ml Co-N/CSACs处理12h，然后加入细胞裂解液裂解细胞2min，离心，取上清液，加入DTNB，检测细胞裂解液中的GSH。结果如图8所示，GSH的含量略有下降，这可能是因为部分被氧化的GSSG被还原。
根据本发明的实施例，本发明实施例研究了Co-N/C SACs对人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)和人星形胶质细胞(SVGP12)的细胞毒性。
Co-N/C SACs对U87 MG和SVGP12的细胞毒性试验(图9a)
采用MTT法检测细胞活力。将U87 MG和SVGP12细胞以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板上，并在培养基中培养24h后，加入0、5、10、20、30、50μg/mL不同浓度的Co-N/CSACs，继续培养24h，加入MTT 5mg/mL，培养4h后，小心吸出孔内培养上清液，避免吸去紫色结晶，继续加入150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。所有结果平行三次。
AA对U87 MG和SVGP12的细胞毒性试验(图9b)
采用MTT法检测细胞活力。将U87 MG和SVGP12细胞以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板上，并在培养基中培养24h后，加入0、0.5、1、1.5mM不同浓度的AA，继续培养24h，加入MTT 5mg/mL，培养4h后，小心吸出孔内培养上清液，避免吸去紫色结晶，继续加入150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。所有结果平行三次。
Co-N/C SACs对U87 MG的治疗效果(图9c)
采用MTT法检测细胞活力。将U87 MG细胞以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板上，并在培养基中培养24h后，加入0、0.5、1、1.5mM不同浓度的AA，作为对照组；另一组U87MG细胞同样以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板上，并在培养基中培养24h.后，加入50μg/mL Co-N/C SACs、0.5mM AA和50μg/mL Co-N/C SACs、1mM AA和50μg/mL Co-N/C SACs、1.5mM AA和50μg/mL Co-N/C SACs。两组细胞继续培养24h，加入MTT 5mg/mL，培养4h后，小心吸出孔内培养上清液，避免吸去紫色结晶，继续加入150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。所有结果平行三次。
图9(a)中，左侧为SVGP12，右侧为U87 MG。通过图9(a)可以看出，Co-N/C SACs对正常的SVGP12的细胞毒性较低，而对U87 MG表现出相对较高的细胞毒性，这说明Co-N/CSACs对肿瘤细胞表现出一定的选择性的细胞毒性。这将为后续应用于肿瘤细胞的杀死奠定了基础。图9(b)中，左侧为SVGP12，右侧为U87 MG，在没有Co-N/C SACs的情况下，将抗坏血酸引入细胞系统后，癌细胞的存活率没有显着降低。然而，图9(c)中，左侧为U87MG，右侧为Co-N/C(U87 MG)，当50μg/mL Co-N/C SACs存在时，随着AA浓度的增加，细胞存活率降低。当抗坏血酸浓度增加到1.5mM时，抗坏血酸单独存在时的细胞存活率降低约30％。添加Co-N/CSACs后，细胞存活率下降了约70％。相比之下，相同浓度的抗坏血酸和Co-N/C SACs的组合对正常细胞(即U87 MG)的毒性较小。所有结果表明，抗坏血酸和Co-N/C SACs的联合治疗比单独的抗坏血酸更有效地抑制肿瘤生长。
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种双酶活性钴单原子纳米酶，其特征在于：包括碳骨架和锚定在碳骨架上的Co单原子；该双酶活性钴单原子纳米酶由包括如下步骤的方法制备得到：(1)Zn(NO3)2·6H2O、Co(NO3)2·6H2O和2-甲基咪唑反应合成Co-ZIF-8；(2)将Co-ZIF-8的热解和H2SO4处理后，制得。
2.根据权利要求1所述一种双酶活性钴单原子纳米酶，其特征在于：Co单原子负载量为3-4wt％。
3.一种双酶活性钴单原子纳米酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)Co-ZIF-8的合成:
在室温下，将Zn(NO3)2·6H2O、Co(NO3)2·6H2O混合金属盐和2-甲基咪唑分别溶于甲醇溶液中，室温下混合，搅拌充分反应，离心收集沉淀物，洗涤，干燥后，得到Co-ZIF-8；
(2)Co-N/C SACs的合成：
将Co-ZIF-8在氮气气氛中进行热解。
4.根据权利要求3所述一种双酶活性钴单原子纳米酶的制备方法，其特征在于：热解温度为900-1000℃，热解时间为2-3h；优选地，热解的升温速度为2-5℃min-1。
5.根据权利要求3所述一种双酶活性钴单原子纳米酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)反应的搅拌速率为800-1000rpm；搅拌时间为0.8-1h。
6.根据权利要求3所述一种双酶活性钴单原子纳米酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，Zn(NO3)2·6H2O的浓度为92-95mM，Co(NO3)2·6H2O的浓度为5.5-6.2mM；2-甲基咪唑的浓度为790-800mM。
7.根据权利要求3所述一种双酶活性钴单原子纳米酶的制备方法，其特征在于：该方法还包括将热解产物浸入H2SO4溶液中，以去除残留的锌。
8.根据权利要求7所述一种双酶活性钴单原子纳米酶的制备方法，其特征在于：H2SO4溶液的浓度为0.5M；温度为80℃；搅拌时间为8h。
9.一种双酶活性钴单原子纳米酶在制备治疗脑肿瘤的药物中的应用，其特征在于：该双酶活性钴单原子纳米酶为权利要求1或2所述的双酶活性钴单原子纳米酶，或者是权利要求3-8任一项方法制备得到的双酶活性钴单原子纳米酶。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述脑肿瘤为胶质瘤。
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