CN104198557A - 一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法，属于环境分析领域。本发明利用胸腺嘧啶与汞离子特异性作用和核苷酸外切酶Ⅲ循环放大功能实现对痕量汞离子检测。探针DNA与目标DNA通过捕获汞离子杂交形成特殊结构的双链DNA，结果pDNA被ExoⅢ消化，而tDNA游离出继续与其他的pDNA杂交并重复上述过程。消化后残留pDNA与[Ru(NH3)6]3+电信号强度成正比，故可实现对汞离子检测。本发明的酶基电化学生物传感方法具有灵敏度高、选择性高、成本低等特点，对汞离子检测线性范围为0.01-500nM，检测限为1pM。

Description

一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法
技术领域
本发明属于环境分析领域，涉及一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法。
背景技术
作为一种非必需元素，汞离子能对人体组织和内脏器官产生永久性的伤害[Bontidean I,Mortari A,Leth S,Brown N L,Karlson U,Larsen M M,VangronsveldJ,Corbisier P,Csoregi E.Environ.Pollut.,2004,131(2),255-262]。污水中的汞离子一旦通过食物链间进入人体后，人体自身的新陈代谢系统很难将其排出体外[YuC J,Cheng T L,Tseng W L.Biosens.Bioelectron.2009,25(1):204-210]。就汞离子的毒性而言，即使人体长期暴露在较低浓度汞源中，也能产生可遗传的毒性。因此开发新型简单的检测方法以便高效地检测痕量的汞离子是一件非常有意义的工作。
传统的汞离子检测方法主要为原子吸收或发射光谱、荧光分析、诱导耦合等离子体质谱、X射线吸收光谱等。然而每种方法至少有如下缺点之一：设备昂贵、方法复杂、稳定性差、耗时、灵敏度不高、选择性一般。最近报道的一些传感方法对汞离子检测具有较好的灵敏度，但是这些方法主要集中在光传感技术上，而光传感技术严重依赖于复杂的设备和严格的操作技能。
作为最具潜力的检测技术之一，电化学生物传感器在汞离子检测方面具有独特的优势。因为这种技术所需设备简单、耗时少、成本低，而且可实现实时原位分析。特别是，汞离子能特异性与两个胸腺嘧啶碱基作用形成T-Hg2+-T络合物，为开发高选择性高灵敏度的检测汞离子的电化学生物传感器奠定了基础。为了达到此目标，当前主要有三种信号放大方法来提高电化学生物传感器对汞离子检测的灵敏度，即纳米材料[Zhang Y,Zhao H,Wu Z,Xue Y,Zhang X,He Y,LiX,Yuan Z.Biosens.Bioelectron.,2013,48,180-187.]、酶[Dominguez-Renedo O,Alonso-Lomillo M A,Ferreira-Goncalves L,Arcos-Martinez M J,Talanta,2009,79(5),1306-1310.]、DNA结构转变[Wu D,Zhang Q,Chu X,Wang H,Shen G,Yu R,Biosens.Bioelectron.,2010,25(5),1025-1031.]。其中酶作为一种特异性和高效性的催化剂，被广泛应用于电化学生物传感器的构建，去监测食品和环境安全[A.Amine,H.Mohammadi,I.Bourais,G.Palleschi,Biosens.Bioelectron.,2006,21(8),1405-1423.]。但是目前酶基电化学生物传感器对汞离子检测的研究很少，并且用于构建电化学生物传感器的酶主要集中在链霉亲和素-过氧化氢酶(HRP)和脲酶，而这两种酶基电化学生物传感器对汞离子的最低检出限远高于另外两种(基于纳米材料或DNA结构转变)电化学生物传感器的最低检出限。因此筛选新的高效酶和设计新的检测方法是构建用于汞离子检测的高选择性高灵敏度的酶基电化学生物传感器的关键。
发明内容
发明的目的：本发明的目的通过筛选新的酶体系和设计新的检测路线，利用T-Hg2+-T特异性作用和核苷酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)循环放大效应的协同作用，在保证对汞离子的高选择性的前提下，极大地提高酶基电化学生物传感器的灵敏度。
本发明的技术方案是：
本发明提供了一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法，包括如下步骤：
(1)将10-20μL的含有1μM的探针DNA(pDNA)的孵化缓冲液滴加到清洁后的金电极表面，在4℃下孵化24小时，即得到pDNA修饰后的金电极(pDNA/Au)；其中，pDNA的孵化缓冲液的成分为：0.1M NaCl、10μM三(2-羧乙基)膦(TCEP)和pH＝7.4的10mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)。
(2)将步骤(1)得到的pDNA/Au浸入到6-巯基己-1-醇(MCH)缓冲溶液中，保持1-2小时，用于减少pDNA在金电极表面的非特异性地吸附，即得到处理后的pDNA/Au。其中，MCH缓冲溶液的成分为1-5mM MCH和pH＝7.4的10mM Tris-HCl。
(3)将经过步骤(2)处理后的pDNA/Au用pH＝7.4的Tris-HCl淋洗，再浸入含有浓度不大于10μM汞离子的核苷酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)消化缓冲液中，在37-40℃恒温水浴中反应10-30分钟，即得到消化后的pDNA/Au电极。其中，Exo Ⅲ消化缓冲液的成分为pH＝8的50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1-1μM tDNA、1.8units/μL Exo III和0.2-0.6M NaCl。
(4)将步骤(3)得到的消化后的pDNA/Au电极浸入含有pH＝7.0的10mMTris-HCl和50μM氯化六氨合钌(Ru(NH3)6 3+或RuHex)电解质溶液中，利用方波伏安(SWV)进行测试并分析结果。测试参数为：初始电压-0.6V，终止电压0V，频率25Hz。由于静电作用，带正电的Ru(NH3)6 3+会强烈的吸附到带负电pDNA的磷酸骨架上，并被还原为Ru(NH3)6 2+，因此产生电信号。由于电信号的强度与被Exo Ⅲ消化后残余的pDNA量成正比，所以能实现对溶液中汞离子的检测。
所述的探针DNA为5’端巯基修饰的单链核苷酸。
与pDNA杂交的互补链tDNA是具有4个胸腺嘧啶失配的单链核苷酸，其碱基数比pDNA的碱基数至少多5个。
步骤(1)中金电极在使用前需要清洁，具体方法如下：
将金电极分别在1μm、0.3μm和0.05μm粒径的氧化铝抛光粉的悬浮液中依次研磨5-10分钟，每次研磨后分别用乙醇和高纯水超声清洗5分钟，待电极干燥后，浸入体积比为3:1的浓硫酸和双氧水的混合溶液中保持30分钟，然后用高纯水清洗，作为工作电极浸入0.5M的H2SO4溶液中，进行循环伏安扫描，直到扫描曲线稳定，最后用高纯水清洗并用N2吹干。
本发明具有如下效果：
(1)灵敏度高，检测限可达1pM(S/N＝3)。
(2)选择性高，噪声值低。
(3)成本低和操作简单，利用普通的恒电位仪扫描和分析即可，不需要复杂昂贵的大型设备，而且避免纳米材料基电化学生物传感器的繁琐的材料制备过程。
附图说明
图1是本发明所述的一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法的检测过程示意图。
图2是本发明所构建的酶基电化学生物传感方法对不同浓度的汞离子的SWV响应图。
图3A为不同浓度的汞离子与其SWV峰电流的关系图。
图3B为不同浓度的汞离子与其SWV峰电流的线性范围图(0.01-500nM范围内R2＝0.9987)。
图4为所构建的酶基电化学生物传感方法对汞离子的选择性测试图(图中金属离子浓度均为10μM，其电流值是通过SWV测定所得)。
图中：a为0nM汞离子的SWV响应图；b为0.002nM汞离子的SWV响应图；c为0.01nM汞离子的SWV响应图；d为0.05nM汞离子的SWV响应图；e为0.5nM汞离子的SWV响应图；f为5nM汞离子的SWV响应图；g为50nM汞离子的SWV响应图；h为500nM汞离子的SWV响应图；i为10000nM汞离子的SWV响应图。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
本发明涉及一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法，本方法通过pDNA与具有4个胸腺嘧啶(T)失配的tDNA杂交，形成T-Hg2+-T络合物，来保证该传感器对汞离子检测的高选择性。由于这种杂交形成的双链DNA具有pDNA的3’端为平端而tDNA的3’端多出一定量碱基的特殊结构，导致双链DNA中pDNA被Exo Ⅲ消化，而tDNA完整地游离出来继续与其他的pDNA杂交，并重复上述过程，在这过程中pDNA被循环利用，产生了累积放大的效应，这样实现该传感器对汞离子检测的高灵敏度。
下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)将直径为2mm金电极分别在1μm、0.3μm和0.05μm粒径的氧化铝抛光粉的悬浮液中依次研磨5-10分钟，每次研磨后需用乙醇和高纯水超声清洗5分钟，待电极干燥后，浸入新制备的浓硫酸和30％双氧水(体积比3:1)的混合溶液中保持30分钟，然后用高纯水清洗，作为工作电极浸入0.5M的H2SO4溶液中，进行循环伏安扫描，直到扫描曲线稳定，最后用高纯水清洗并用N2吹干。
(2)将10μL的含有1μM的探针DNA(pDNA)孵化缓冲液加到清洁后的金电极表面，将其在4℃下孵化24小时，通过自组装形成pDNA修饰的金电极(pDNA/Au)。其中，pDNA孵化缓冲溶液的成分为：0.1M NaCl、10μM三(2-羧乙基)膦(TCEP)、pH＝7.4的10mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)。pDNA为19个碱基的5’端有巯基修饰的单链DNA，其序列为：
5’-SH-(CH2)6-GATTCCGTGCATGACTCAG-3′。
(3)进一步地，将pDNA/Au浸入到6-巯基己-1-醇(MCH)的缓冲溶液中，保持2小时，用于减少pDNA在金电极表面的非特异性地吸附。其中，MCH缓冲溶液的成分为5mM MCH和10mM Tris-HCl(pH＝7.4)。
(4)进一步地，将电极用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)淋洗后，浸入到加有不同浓度汞离子的核苷酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的消化缓冲液中，在37℃恒温水浴中反应10-30分钟。最后将电极取出用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)淋洗后，浸入含有10mM Tris-HCl(pH＝7.0)和50μM氯化六氨合钌电解质溶液中，利用方波伏安进行测试并分析结果。其中，核苷酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)的消化缓冲液的成分为50mM Tris-HCl(pH＝8),5mM MgCl2,1mM二硫苏糖醇(DTT),1μM目标DNA(tDNA),1.8units/μL Exo III和0.4M NaCl；tDNA为24个碱基的单链DNA，且与pDNA具有4个碱基T失配，其碱基序列为：
5’-CTGTGTCTTGCTCGGTATCAAGCG-3'。
实施例2：一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)将直径为2mm金电极分别在1μm、0.3μm和0.05μm粒径的氧化铝抛光粉的悬浮液中依次研磨5-10分钟，每次研磨后需用乙醇和高纯水超声清洗5分钟，待电极干燥后，浸入新制备的浓硫酸和30％双氧水(体积比3:1)的混合溶液中保持30分钟，然后用高纯水清洗，作为工作电极浸入0.5M的H2SO4溶液中，进行循环伏安扫描，直到扫描曲线稳定，最后用高纯水清洗并用N2吹干。
(2)将10μL的含有1μM的探针DNA(pDNA)孵化缓冲液滴加到清洁后的金电极表面，将其在4℃下孵化24小时，通过自组装形成pDNA修饰的金电极(pDNA/Au)。其中，pDNA孵化缓冲溶液的成分为：0.1M NaCl、10μM三(2-羧乙基)膦(TCEP)、pH＝7.4的10mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)。pDNA为19个碱基的5’有巯基修饰的单链DNA，其序列为：
5’-SH-(CH2)6-GATTCCGTGCATGACTCAG-3′。
(3)进一步地，将步骤(2)中的pDNA/Au浸入到6-巯基己-1-醇(MCH)的缓冲溶液中，保持2小时，用于减少pDNA在金电极表面的非特异性地吸附。其中，MCH缓冲溶液的成分为5mM MCH和10mM Tris-HCl(pH＝7.4)。
(4)进一步地，将电极取出用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)淋洗后，浸入到加有不同浓度汞离子的核苷酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)的消化缓冲液中，在37℃恒温水浴中反应10-30分钟。最后将电极用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)淋洗后，浸入含有10mM Tris-HCl(pH＝7.0)和50μM氯化六氨合钌电解质溶液中，利用方波伏安进行测试并分析结果。其中，核苷酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)的消化缓冲液的成分为50mM Tris-HCl(pH＝8),5mM MgCl2,1mM二硫苏糖醇(DTT),1μM目标DNA(tDNA),1.8units/μL Exo III和0.4M NaCl。tDNA为27碱基单链DNA，且与pDNA具有4个碱基T失配，其碱基序列为：
5’-CTGTGTCTTGCTCGGTATCAAGCGAAA-3'。

Claims (5)

1.一种用于痕量汞离子检测的酶基电化学生物传感方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将10-20μL的含有1μM的探针DNA的孵化缓冲液滴加到清洁后的金电极表面，在4℃下孵化24小时，即得到pDNA修饰后的金电极；其中，pDNA的孵化缓冲液的成分为：0.1M NaCl、10μM三(2-羧乙基)膦和pH＝7.4的10mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液；
(2)将步骤(1)得到的pDNA/Au浸入到6-巯基己-1-醇缓冲溶液中，保持1-2小时，即得到处理后的pDNA/Au；其中，MCH缓冲溶液的成分为1-5mMMCH和pH＝7.4的10mM Tris-HCl；
(3)将经过步骤(2)处理后的pDNA/Au用pH＝7.4的Tris-HCl淋洗，再浸入含有浓度不大于10μM汞离子的核苷酸外切酶Ⅲ消化缓冲液中，在37-40℃恒温水浴中反应10-30分钟，即得到消化后的pDNA/Au电极；其中，Exo Ⅲ消化缓冲液的成分为pH＝8的50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、0.1-1μM tDNA、1.8units/μL Exo III和0.2-0.6M NaCl；
(4)将步骤(3)得到的消化后的pDNA/Au电极浸入含有pH＝7.0的10mMTris-HCl和50μM氯化六氨合钌的电解质溶液中，利用方波伏安进行测试并分析结果；测试参数为：初始电压-0.6V，终止电压0V，频率25Hz。
2.根据权利要求1所述的酶基电化学生物传感方法，其特征在于，探针DNA为5’端巯基修饰的单链核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的酶基电化学生物传感方法，其特征在于，与pDNA杂交的互补链tDNA是具有4个胸腺嘧啶失配的单链核苷酸，其碱基数比pDNA的碱基数至少多5个。
4.根据权利要求1或2所述的酶基电化学生物传感方法，其特征在于，步骤(1)中金电极在使用前需要清洁，具体方法如下：
将金电极分别在1μm、0.3μm和0.05μm粒径的氧化铝抛光粉的悬浮液中依次研磨5-10分钟，每次研磨后分别用乙醇和高纯水超声清洗5分钟，待电极干燥后，浸入体积比为3:1的浓硫酸和双氧水的混合溶液中保持30分钟，然后用高纯水清洗，作为工作电极浸入0.5M的H2SO4溶液中，进行循环伏安扫描，直到扫描曲线稳定，最后用高纯水清洗并用N2吹干。
5.根据权利要求3所述的酶基电化学生物传感方法，其特征在于，步骤(1)中金电极在使用前需要清洁，具体方法如下：
将金电极分别在1μm、0.3μm和0.05μm粒径的氧化铝抛光粉的悬浮液中依次研磨5-10分钟，每次研磨后分别用乙醇和高纯水超声清洗5分钟，待电极干燥后，浸入体积比为3:1的浓硫酸和双氧水的混合溶液中保持30分钟，然后用高纯水清洗，作为工作电极浸入0.5M的H2SO4溶液中，进行循环伏安扫描，直到扫描曲线稳定，最后用高纯水清洗并用N2吹干。
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