CN105911289A - 一种基于动态三明治结构的电化学传感器及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物电化学技术领域，具体涉及一种基于动态三明治结构的电化学传感器及其制备和应用。本发明所述电化学生物传感器，由电极、信号链和反应体系组成，电极采用金电极，信号链为一段单链DNA，DNA链的5’端修饰有巯基，DNA链的3’端修饰有亚甲基蓝，通过巯基与金电极表面自组装形成金‑巯键立于金电极表面，反应体系中含有DNAzyme与必须的反应缓冲体系，DNAzyme可以与信号链互补配对并将其切割成两段DNA短链，DNAzyme上标记有靶蛋白识别元件，可用于定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用，本发明操作简单，操作者无需特别训练，适合于偏远地区及资源贫乏地区使用。
Description
一、技术领域
本发明属于生物电化学技术领域，具体涉及一种基于动态三明治结构的电化学传感器及其制备和应用。
二、背景技术
在人蛋白质组中大约存在65万种蛋白质相互作用对，这些蛋白质分子彼此间的相互作用控制着细胞绝大多数的活动，破译这些蛋白质分子的相互作用网络不仅可以更加深入的理解这些蛋白质是如何发挥功能并最终影响细胞活动，而且有助于人们设计更加特异性的药物分子来治疗特定的疾病。因此，在生物基础研究领域对于发展灵敏、操作友好的分析方法来检测这些蛋白质间的相互作用事件有着内在的迫切要求。
目前，已有多种研究蛋白质间相互作用的方法被开发出来。比如，免疫共沉淀法作为测定蛋白质相互作用的金标准，被广泛使用多年(Barrios.R.M.,Brown,K.R.,Ozdamar,B.,Bose,R.,Liu,Z.,Donovan,R.S.,Shinjo,F.,Liu,Y.,Dembowy,J.&Taylor,I.W.High-Throughput Mapping of a Dynamic Signaling Network inMammalian Cells.Science 2005,307,1621)。但是免疫共沉淀法往往需要结合蛋白印迹法或者质谱法才能获得最后的结果，过多的实验步骤使得整个方法耗时耗力，大大降低了分析效率。蛋白片段互补检测法是细胞内蛋白质相互作用原位成像一个强有力的工具(Kerppola,T.K.Bimolecular Fluorescence Complementation(Bifc)Analysis as a Probe of Protein Interactions in Living Cells.Ann.Rev.Biophys.2008,37,465)。然而，靶蛋白上需要融合被切断的报告酶(绿色荧光蛋白或荧光素酶等)，这些报告酶片段很可能会干扰两种蛋白质之间的相互作用，得到假阳性结果。至于表面等离子共振法，核磁共振法和等温滴定量热法等(Kerppola,T.K.Bimolecular Fluorescence Complementation(Bifc)Analysis as a Probe of ProteinInteractions in Living Cells.Ann.Rev.Biophys 2008,37,465；Vaynberg,J.&Qin,J.Weak Protein-Protein Interactions as Probed by NMR Spectroscopy.TrendsBiotechnol.2006,24,22；Ronkainen,N.J.,Halsall,H.B.&Heineman,W.R.Electrochemical Biosensors.Chem.Soc.Rev.2010,39,1747)，由于需要昂贵的大型仪器设备，极大的限制了它们在许多领域的应用，特别是在资源匮乏的地区。因此，如何开发更加灵敏、简单、高效的方法来分析复杂生物环境下的蛋白质分子间的相互作用就变得十分重要。
电化学技术由于其固有的简单，灵敏，便携和经济等性质被广泛用于各种生物分子的检测中。尽管存在这些优点，利用电化学技术研究蛋白质相互作用仍处于探索阶段，而且经常面临灵敏度和精确度不足的问题。近年来，随着DNA纳米技术的发展，将生物电化学技术和DNA纳米技术相结合，开发各项性能更加优异的生物传感器成为了新的热点(Li,C.,Li,X.,Wei,L.,Liu,M.,Chen,Y.&Li,G.Simple Electrochemical Sensing of Attomolar Proteins Using FabricatedComplexes with Enhanced Surface Binding Avidity.Chem.Sci.2015,6,4311)。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种可以定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用的生物传感器及其制备方法和应用。本发明充分利用DNA纳米技术，提出了使用电化学技术为表征手段的蛋白质定量和蛋白质间相互作用研究方案，以求达到成本更低、快速简单的检测复杂生物环境下的蛋白质分子和蛋白质分子间相互作用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于动态三明治结构的电化学生物传感器，包括：电极、信号链和反应体系，电极采用金电极，信号链为一段单链DNA，DNA链的5’端修饰有巯基，DNA链的3’端修饰有亚甲基蓝，通过巯基与金电极表面自组装形成金-巯键立于金电极表面，反应体系中含有DNA核酶(DNAzyme)与必须的反应缓冲体系，DNAzyme可以与信号链互补配对并将其切割成两段DNA短链，DNAzyme上标记有靶蛋白识别元件。
所述DNA信号链含有17个碱基，序列为5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-methylene blue-3’。
所述反应体系中包括：10mM Tris-HCl，10nM DNAzyme，200mM NaCl，1mM ZnCl2，pH 7.2。
所述DNAzyme序列为5’-Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3’。
本发明所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)金电极的预处理：将金电极在水虎鱼溶液(70％浓硫酸，30％过氧化氢)中处理10分钟，随后将电极依次用1.0μm，0.3μm的氧化铝粉末抛光，并在乙醇和纯水中超声清洗5分钟，最后将电极置于水虎鱼溶液中处理10分钟，取出冲洗，并在0.5M的硫酸中循环伏安扫描至稳定。
(2)功能电极的组装：将信号链分散在DNA固定液中，滴加到处理好的金电极上，室温固定后取出电极用超纯水冲洗，MCH封闭后即可得到组装好的电极。
所述步骤一中金电极为直径3mm的圆盘金电极。
所述步骤二中信号链DNA浓度为0.4～2μM。
所述步骤二中DNA固定液为10mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，10mM TCEP，pH 7.4。
所述步骤二中DNA固定时间为1～12小时。
所述步骤二中MCH封闭时间为1～4小时。
所述步骤二中MCH浓度为1～5mM。
本发明所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器用于定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用的方法，包括以下步骤：
(1)信号链修饰的金电极在-0.05～-0.5V范围内，对其进行电化学方波伏安法检测。
(2)靶蛋白先与反应体系作用10分钟后滴加到信号链修饰的金电极表面，37℃孵育40分钟后，同样条件进行电化学检测。
本发明利用了分子在界面上不同的扩散速率来实现对蛋白质分子的检测。传统的免疫传感器中广泛使用的“一抗—靶标—二抗”三明治结构一旦形成就无法改变，由于靶蛋白无法释放出来进行有效的循环，检测灵敏度受到了一定的限制。本发明提供了一种新的思路，利用DNAzyme的循环切割能力使得靶标蛋白可以完成多次信号转导过程，有效实现信号的增益效果。
DNAzyme由于尺寸较小(直径小于2nm)，可以很容易的扩散到电极表面并与修饰在电极上面的信号链形成互补配对，然后DNAzyme发挥作用将信号链切为两半，这时双链结构变得不稳定，标记有亚甲基蓝的DNA短链会脱落下来扩散到溶液中，同时DNAzyme则恢复单链状态，又可以结合下一条信号链，继续将其切断，最终大大减弱亚甲基蓝的电信号；当溶液中存在靶蛋白时，靶蛋白与DNAzyme上的识别位点结合，由于靶蛋白较大的体积(直径大于10nm)，会显著拖慢DNAzyme的扩散和切割速率，在相同的作用时间内，电极上的信号链不会被大量切割，从而产生信号差异，实现该传感器对靶蛋白的检测。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
1、本发明依靠于靶标—配体特异性识别和高保真度的DNA杂交保证了实验在复杂生物样本下仍具有高度的选择性，通过替换DNAzyme上的识别元件(抗体、适体、多肽、小分子等)理论上可以检测任何目标蛋白，并研究其与其他蛋白的相互作用。
2、本发明可以直接检测到亚纳摩尔级别的靶标蛋白并可以分析其与类似浓度的其他蛋白质的相互作用；在金纳米颗粒的帮助下，检测灵敏度可大幅提升至飞摩尔级别的目标物，十分方便分析珍贵样本。
3、本发明仅需要短时间的一步孵育，操作简单，避免了复杂的实验步骤，操作者无需特别训练。
4、本发明利用便宜且便携的电化学工作站，适合于偏远地区及资源贫乏的地区使用。
四、附图说明
图1为动态三明治结构电化学传感器进行免疫球蛋白质定量检测的原理图。
图2为加入或不加入羊抗地高辛抗体的电化学方波伏安信号变化图。
图3为动态三明治结构电化学传感器进行抗体—抗体相互作用分析的原理图。
图4为加入或不加入羊抗地高辛抗体—兔抗羊抗体复合物的电化学方波伏安信号随时间变化图。
图5为兔抗羊抗体的滴定曲线。
图6为金纳米颗粒辅助下的羊抗地高辛抗体滴定曲线。
五、具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
图1是动态三明治结构电化学传感器进行免疫球蛋白质定量检测的原理图。DNAzyme由于尺寸较小(直径小于2nm)，可以很容易的扩散到电极表面并与修饰在电极上面的信号链形成互补配对，然后DNAzyme发挥作用将信号链切为两半，这时双链结构变得不稳定，标记有亚甲基蓝的DNA短链会脱落下来扩散到溶液中，同时DNAzyme则恢复单链状态，又可以结合下一条信号链，继续将其切断，最终大大减弱亚甲基蓝的电信号；当溶液中存在靶蛋白时，靶蛋白与DNAzyme上的识别位点结合，由于靶蛋白较大的体积(直径大于10nm)，会显著拖慢DNAzyme的扩散和切割速率，在相同的作用时间内，电极上的信号链不会被大量切割，从而产生信号差异，实现该传感器对靶蛋白的检测。
实施例一：动态三明治结构电化学传感器检测羊抗地高辛免疫球蛋白反应流程
步骤一，将直径为3mm的金电极倒置固定好，取98％浓硫酸与过氧化氢按照3:1的比例混合配置成水虎鱼溶液，滴加10μL水虎鱼溶液完全覆盖金表面，10min后用大量超纯水冲洗；金电极分别用1.0μm氧化铝粉末于绢布和0.3μm氧化铝粉末在麂皮上轻柔打磨各5min，使电极表面光滑至镜面；用大量超纯水冲洗打磨好的金电极表面，将金电极先后浸入乙醇和超纯水中，超声清洗5min；用氮气将电极表面吹干，再次滴加10μL水虎鱼溶液于电极表面10min后，超纯水冲洗。
步骤二，将处理过的金电极置于0.5M H2SO4中，在0～1.6V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速为100mV/s，直至峰电流稳定；配制5μL的反应体系，其中含有终浓度为0.4～2μM信号链(序列：5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-methylene blue-3’)和10mM TCEP(缓冲液体系：10mM Tris-HCl，100mMNaCl，pH 7.4)，滴加到处理好的电极上，盖上电极帽，防止水分的蒸发，室温下修饰1h，信号链通过巯基共价固定到金电极表面；用超纯水冲洗电极，用1mM的MCH溶液对电极进行封闭1h，占据电极上未反应的活性位点，再用超纯水冲洗，吹干，记得到信号链修饰的金电极。
步骤三，取不同浓度的羊抗地高辛抗体加入到10mM Tris-HCl，10nM标记有地高辛分子的DNAzyme(序列：5’-Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3’)，200mM NaCl，1mM ZnCl2，pH 7.2中形成100μL的反应体系。将信号链修饰的金电极插入到含有抗地高辛抗体的反应体系中，在37℃金属浴中反应40min；将反应后的电极放置于4mL的电化学检测液(10mMTris-HCl，100mM NaCl，pH 7.4)中，利用三电极体系(信号链修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极)，以方波伏安法(SWV)检测修饰在信号链上的亚甲基蓝信号(图2)。
实施例二：动态三明治结构电化学传感器检测抗体—抗体相互作用反应流程
图3是动态三明治结构电化学传感器进行抗体—抗体相互作用分析的原理图。在实施例一的基础上，如果在检测体系中进一步引入可以与羊抗地高辛免疫球蛋白(Ab1)发生相互作用的兔抗羊免疫球蛋白(Ab2)，浓度定为0.01nM、0.5nM、1.5nM、5nM、8nM、20nM、200nM、2000nM，由于形成的“DNAzyme—羊抗体—兔抗羊抗体”复合结构体积进一步增大，使得DNAzyme对信号链的切割更加缓慢(图4)，在相同的作用时间内，电化学信号进一步提升，通过比较单独羊抗体的电化学信号，即可分析得知溶液中兔抗羊抗体的存在(图5)。
实施例三：联合动态三明治结构和金纳米颗粒的电化学传感器灵敏检测羊抗地高辛免疫球蛋白反应流程
由于DNAzyme上的吸附物体积越大，切割金电极上信号链的能力就越低，如果将DNAzyme与金纳米颗粒连接起来形成超大体积的“DNAzyme—靶标物—金纳米颗粒”复合结构，将会极大的提高传感器的分析能力。
步骤一，将20nm柠檬酸覆盖的金纳米颗粒溶液(3nM)用100mMK2CO3溶液调至pH 9.0；取10μL 1mg/mL的兔抗羊抗体加入到990μL上述金纳米颗粒溶液中，室温孵育2h；13000rpm离心15min，弃去上清液，用990μL PBS(pH 8.0)重悬，重复一次，去除溶液中未与金纳米颗粒结合的抗体；加入10μL10％的BSA溶液封闭未被抗体吸附的金纳米颗粒表面，室温震荡反应30min；13000rpm离心15min，弃去上清液，用990μL PBS(pH 8.0)重悬，重复三次，即可得到1mL兔抗羊抗体修饰的金纳米颗粒。
步骤二，在得到实施例一中的信号链修饰电极后，取1μL不同浓度的羊抗地高辛抗体与2μL兔抗羊抗体修饰的金纳米颗粒37℃孵育30min；上述复合物加入10mM Tris-HCl，10nM标记有地高辛分子的DNAzyme，200mM NaCl，1mM ZnCl2，pH 7.2中形成100μL的反应体系；进行与实施例一类似的电化学检测(图6)。
Claims (5)
1.一种基于动态三明治结构的电化学传感器，其特征是由电极、信号链、反应体系和电极检测液组成，电极采用金电极，信号链为一段单链DNA，DNA链的5’端修饰有巯基，DNA链的3’端修饰有亚甲基蓝，通过巯基与金电极表面自组装形成金-巯键立于金电极表面，反应体系中含有DNA核酶DNAzyme与必须的反应缓冲体系，DNAzyme可以与信号链互补配对并将其切割成两段DNA短链，DNAzyme上标记有靶蛋白识别元件。
2.根据权利要求1所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器，其特征在于：DNA信号链含有16个碱基，序列为5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-Methylene blue-3’，所述DNAzyme序列为5’-Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3’，所述反应体系为10mM Tris-HCl，10nM DNAzyme，200mM NaCl，1mM ZnCl2，pH 7.2，所述电极检测液为10mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.4。
3.根据权利要求1所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器的制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)金电极的预处理：将直径3mm的圆盘金电极在水虎鱼溶液即70％浓硫酸和30％过氧化氢的混合液中处理10分钟，随后将电极依次用1.0μm，0.3μm的氧化铝粉末抛光，并在乙醇和纯水中超声清洗5分钟，最后将电极置于水虎鱼溶液中处理10分钟，取出冲洗，并在0.5M的硫酸中循环伏安扫描至稳定；
(2)功能电极的组装：将信号链分散在浓度为0.4～2μM的DNA固定液中，滴加到处理好的金电极上，固定液为10mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mMEDTA，10mM TCEP，pH 7.4，室温固定1～12小时后取出电极，用超纯水冲洗，浓度为1～5mM的MCH封闭1～4小时后，即得到组装好的电极。
4.权利要求1所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器在定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用中的应用。
5.根据权利要求4所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器在定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用中的应用，其特征是电化学传感器用于定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用的方法，由以下步骤构成：
(1)信号链修饰的金电极在-0.05～-0.5V范围内，对其进行电化学方波伏安法检测；
(2)靶蛋白先与反应体系作用10分钟后，将信号链修饰的金电极插入到加入靶蛋白的反应体系中，37℃孵育40分钟后，同样条件进行电化学检测。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106706748A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-05-24 | 北京化工大学 | 检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法 |
| CN108896639A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-11-27 | 南京工业大学 | lncRNA MEG3双重检测电化学基因传感器，其制备方法与应用 |
| CN110514629A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 南京大学 | 一种基于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的新方法 |
| CN110514504A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 南京大学 | 一种新型细胞印迹模型的构建及性质与应用的研究 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102262118A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-11-30 | 上海大学 | 检测肿瘤标志物的生物电化学传感器及其制备方法 |
| CN102608180A (zh) * | 2012-03-21 | 2012-07-25 | 上海大学 | 检测银离子的生物电化学传感器及其制备方法 |
| CN104328192A (zh) * | 2014-11-05 | 2015-02-04 | 南京大学 | 核酸酶放大的高灵敏电化学免疫分析方法 |
-
2016
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102262118A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-11-30 | 上海大学 | 检测肿瘤标志物的生物电化学传感器及其制备方法 |
| CN102608180A (zh) * | 2012-03-21 | 2012-07-25 | 上海大学 | 检测银离子的生物电化学传感器及其制备方法 |
| CN104328192A (zh) * | 2014-11-05 | 2015-02-04 | 南京大学 | 核酸酶放大的高灵敏电化学免疫分析方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LI SHEN ET AL: "Electrochemical DNAzyme Sensor for Lead Based on Amplification of DNA Au Bio-Bar Codes", 《ANAL.CHEM.》 * |
| SHANA O.KELLEY: "Electrochemistry of Methylene Blue Bound to a DNA-Modified Electrode", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 * |
| 陈桂芳 等: "纳米材料用于构建新型电化学生物传感器的研究进展", 《生物物理学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106706748A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-05-24 | 北京化工大学 | 检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法 |
| CN106706748B (zh) * | 2016-12-16 | 2018-10-23 | 北京化工大学 | 检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法 |
| CN108896639A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-11-27 | 南京工业大学 | lncRNA MEG3双重检测电化学基因传感器，其制备方法与应用 |
| CN110514629A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 南京大学 | 一种基于细胞印迹的肿瘤细胞识别与检测的新方法 |
| CN110514504A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 南京大学 | 一种新型细胞印迹模型的构建及性质与应用的研究 |
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