CN110514504A - 一种新型细胞印迹模型的构建及性质与应用的研究 - Google Patents
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Abstract
一种新型细胞印迹模型的构建与应用。原理如下：本发明工作中，我们利用聚二甲基硅氧烷本体和固化剂，研制出高度保真性的细胞印迹聚合物，细胞印迹产生了“人造受体”，可通过特异性的凹陷结构形状捕获靶细胞。本研究在研制高度保真细胞印迹聚合物时，创新使用通过双醛固定组合处理使细胞失活，其优点有(1)利用醛基交联而使细胞表面硬化；(2)消除活细胞分泌的化学物质，防止干扰细胞印迹形成过程的保真度。同时本研究提供了一个简单廉价的单细胞分离模型，不依靠专业或昂贵的设备，不需要亲和试剂或蛋白抗体，对靶细胞的捕获效率为89％，且高度抗干扰，可为单细胞分析、细胞组织分化及以细胞为基础的临床诊断提供广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞印迹领域，尤其涉及一种新型细胞印迹模型的构建、性质及其应用的研究。
发明背景
聚二甲基硅氧烷Polydimethylsiloxane(PDMS)，由于其优秀的生物相容性和稳定的物理性质而近来广泛应用于生物医学装置，如医学植入物，导管和隐形眼镜。PDMS弹性体可以很容易的制成(亚)微米特征材料，并且由于其光学透明和相对化学惰性，正是软光刻技术所需要的理想特性，在许多软光刻应用中，PDMS的低能量表面有利地用于例如非极性物质的微接触印刷。未修饰的PDMS表面是疏水性的，需要表面修饰以印刷极性油墨或蛋白质，促进细胞生长，改善相容性，罗杰斯和同事开创转移印刷技术，并用于微流体。在应用细胞生物学，诊断，生物医学和组织工程应用的背景下，聚二甲基硅氧烷是细胞生长的理想基质，聚二甲基硅氧烷便宜且易于制备，不具有细胞毒性，具有可调的机械性能，并且可以制成几乎任何可能的形状。
细胞印迹技术是最近发展起来的技术，将细胞在聚合物表面的结构和化学信息通过模板辅助功能组装配，再经过聚合物固化，随后移除模板细胞，留下互补空腔，不仅在空间上适合，而且可以化学识别靶细胞。细胞印迹材料具有特定的化学亲和力的原始模板细胞，从而可以作为人工受体，这种受体是廉价的和更耐用的，因此这些细胞的分子印迹聚合物膜可广泛用于细胞分选方法。
我们利用聚二甲基硅氧烷本体和固化剂，研制出高度保真性的细胞印迹聚合物，细胞印迹产生了“人造受体”，可通过特异性的凹陷结构形状捕获靶细胞。本发明在研制高度保真细胞印迹聚合物时，创新使用通过双醛固定组合处理使细胞失活，其优点有(1)利用醛基交联而使细胞表面硬化；(2)消除活细胞分泌的化学物质，防止干扰细胞印迹形成过程的保真度。同时本研究提供了一个简单廉价的单细胞分离模型，不依靠专业或昂贵的设备，不需要亲和试剂或蛋白抗体，对靶细胞的捕获效率为89％，且高度抗干扰，可为单细胞分析、细胞组织分化及以细胞为基础的临床诊断提供广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型细胞印迹模型的构建其制备方法及性质与应用。
技术方案：
本实验设计原理如附图1和附图2所示。玻片经过王水浸泡和超声清洗后，对玻片进行硅烷化修饰，增加细胞对玻片的亲和度，使细胞更牢固的吸附在玻片上，防止印模过程中细胞脱落。培养生长良好状态的的细胞稀释合适浓度后，滴加在硅烷化处理的玻片上，使其呈单细胞分散平铺培养，固定细胞。
配制好的PDMS固化混合物先经过预固化，保持表面平整且内部无气泡，随后将制作好的单细胞吸附的玻片放置在PDMS固化混合物上，使细胞压印在 PDMS固化混合物上，经过固化后，取出压印的细胞玻片，清洗留下的印迹聚合物。
本研究使用的是MCF-7细胞作为印迹模板细胞，制作完成印迹聚合物后，分别对培养的MCF-7细胞进行DiO(细胞膜绿色荧光探针)染色，MDA-MB- 231细胞进行DiI(细胞膜红色色荧光探针)染色，然后将细胞稀释到106个 /mL，分别取0.5mL的染色后MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞混合均匀。取混合后的细胞1mL滴加在制作的印迹聚合物上，静置10min，随后用PBS溶液冲洗印迹聚合物表面，离心计数并荧光观察所洗脱下的细胞；再用胰蛋白酶酶解印迹聚合物表面，用PBS溶液冲洗酶解底物，荧光观察所洗脱下的细胞并离心计数。
本发明利用聚二甲基硅氧烷在固化时会保留特定的形状结构的性质，当以完整的细胞为模板制作印迹聚合物时，细胞的外形结构就印迹在聚二甲基硅氧烷上，通过原子力显微镜观察该印迹聚合物的结构外貌，结果与原始细胞的表面结构基本一样，且具有模板细胞的性质；同时，本发明优化了细胞固定时候的固定液配方和孵育时间，使细胞在固定的时候更能保持原有的结构，从而制作的印迹聚合物具有更高的保真性和选择性；另外，本发明还设计了单细胞微流通道，在捕获单个靶细胞的同时也可以作为单细胞研究平台，为单细胞分析、细胞组织分化及以细胞为基础的临床诊断提供了广阔的应用前景。
附图说明
图1：细胞印迹模型用于细胞筛选原理图。
图2：细胞印迹模型构建步骤图。
图3：细胞固定方式的优化(a：多聚甲醛溶液固定；b：戊二醛溶液固定；c：多聚甲醛溶液与戊二醛体积比1∶1固定)原子力成像图。
图4：细胞与印迹底物结合时间的优化图。
图5：模板细胞的制备图。
图6：印迹聚合物的原子力表征。
图7：单细胞通道的原理图
图8：制作的毛细管和单细胞通道实验结果
具体实施方式
本发明的制备过程如下所述：
1.玻片处理
烷基化修饰：取若干玻片高温灭菌后，分别在丙酮、乙醇和水中超声 10min，然后在配制的王水溶液(浓盐酸HCl和浓硝酸HNO3按体积比3∶1组成) 浸泡0.5h后，再经过水和乙醇各超声10min，用含3％3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)乙醇溶液浸泡处理1h，蒸馏水冲洗干净，110℃烘干30min(注意玻片分散开来，防止凝聚成块)，自然冷却至室温备用。
2.细胞处理
Hela，MCF-7，MDA-MB-231细胞在具有10％胎牛血清(FBS)的高糖 Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，在37℃培养箱中含5％CO2 环境中生长。
取处于对数期，生长状态良好的细胞，用1mL胰蛋白酶处理2min，再用新配置的1×PBS(pH 7.4)溶液洗脱胰蛋白酶酶解下来的细胞，经过800rpm 离心5min，然后重悬细胞，吹打细胞使其单个均匀分散，另取10微升计数，稀释浓度至106个/mL。
把硅烷化的玻片放在培养皿中间，取0.5mL 106个/mL上述细胞悬液缓慢滴加在玻片上，左右轻轻摇晃，使细胞分散平铺均匀，静置0.5h后(注意细胞悬液不要从玻片上流淌下来，防止细胞吸附在其他部位)，重新放到培养箱内，培养4h。
3.细胞灭活
用镊子缓缓取出上述培养4h后表面吸附细胞的玻片，用PBS溶液冲洗3～4 次，保持湿润，在显微镜下观察细胞的状况。
双醛固定：为减少细胞分泌影响印迹形成的物质，且保持细胞的原有形态和结构，本研究采取结合醛类固定的方法处理细胞，渗透力强的固定液既可以迅速进入细胞中，又不使细胞过度收缩或膨胀，发现同时使用双醛固定的方法比单独使用多聚甲醛或戊二醛的固定方法效果好。取体积比为1∶1的4％多聚甲醛和2.5％戊二醛混合PBS溶液固定玻片上细胞0.5h，随后取出并用PBS溶液冲洗3～4次，氮气缓慢吹干。
4.印迹聚合物的成型
PDMS固化混合物(单体∶交联剂＝10∶1)配制后，若发现有气泡，可超声10min脱气，使液体粘稠均匀透彻且无气泡。然后将该固化混合物旋涂到细胞培养皿上(100mm×20mm)上约1cm厚度适宜，左右轻微晃动(若发现有气泡可超声3～5min脱气)，静止2min，使PDMS表面平整无凸起和凹陷，随后将培养皿放到恒温箱中，PDMS固化混合物在80℃下预固化3分钟后立即取出，再将制作的灭活后的细胞玻片水平轻轻压入PDMS固化混合物中，并在80℃下保持4小时，然后放在25℃下固化24小时。
随后取出固化细胞后的PDMS培养皿，用镊子将玻片缓慢剥离，并将留下印迹的聚合物膜浸没在装满蒸馏水的培养皿中超声处理5分钟，然后将培养皿倒扣在吸水纸上，待印迹聚合物膜表面无水分后，用原子力显微镜观察表面形态。
5.分离通道制作
取若干毛细管(φ＝0.3mm)在酒精灯外焰附近逐渐加热，不要距离灯焰太近以防烧断，待毛细管加热软化后，立即双缓慢手平稳拉伸毛细管直至粗细均匀延长，待毛细管外径拉伸至约原来粗细的1/6时，灭掉酒精灯，把拉伸后的毛细管轻轻放在超净台上，冷却后用显微镜观察直径，取合适备用。
毛细管硅烷化处理：取上述制备拉伸后的毛细管，在配制的王水溶液(浓盐酸HCI和浓硝酸HNO3按体积比3∶1组成)浸泡10min后，乙醇反复冲洗3～5 次，用含3％3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液浸泡处理0.5h，蒸馏水冲洗干净，室温分散晾干。
毛细管粘附细胞：取处于对数期，生长状态良好的细胞，用胰蛋白酶酶解后，经过800rpm离心5min，用含10％胎牛血清的DMEM重悬细胞，吹打细胞使其单个均匀分散。将制作好约为0.05mm的毛细管平整铺在培养皿上，间距均匀，分散对齐，然后缓慢滴加重悬后的细胞溶液，直至细胞液浸没过毛细管，滴加过程中保持毛细管静止在原位，毋使移动错位，滴加后静止10min，再移至培养箱内，培养4h。
制作单细胞通道印迹：配制PDMS固化混合物5mL，单体：交联剂体积比为10∶1，若发现有气泡，可在超声波清洗仪中进行超声10min脱气，最终使液体粘稠均匀透彻且无气泡。然后将该固化混合物旋涂到细胞培养皿上 (100mm×20mm)上约1cm厚度适宜，左右轻微晃动(若发现有气泡可超声3～5min震荡脱气)，静止2min，使PDMS表面平整无凸起和凹陷，随后将培养皿放到恒温箱中，PDMS固化混合物在80℃下预固化3分钟后立即取出。用镊子取出上述培养后粘附细胞的毛细管，在PBS溶液里面浸泡一下，除去残留的培养基溶液，随后放置在预固化后的PDMS混合物上，在80℃下保持4小时，然后放25℃下固化24小时。
取出固化毛细管粘附细胞后的PDMS培养皿，用镊子将毛细管轻轻缓慢剥离，并将留下印迹的聚合物膜浸没在装满蒸馏水的培养皿中超声处理3～5分钟，然后将培养皿倒扣在吸水纸上，待印迹聚合物膜表面无水分后，用原子力显微镜观察表面形态。
发明条件优化
本发明为制作完整准确的印迹聚合物，分别从细胞固定方式及细胞与印迹底物结合时间两个方面进行实验条件的优化。
细胞固定方式的优化
为获得良好保真的细胞结构模型，本实验分别采用4％多聚甲醛溶液，2.5％戊二醛溶液以及两者混合体积比为1∶1的溶液分别对细胞进行固定化处理，结果如附图3所示，a和b显示单独的使用多聚甲醛和戊二醛对细胞膜的结构固化有一定的影响，c证明多聚甲醛和戊二醛的混合溶液则较好的保持了细胞膜的完整性保真性，本实验最终选择多聚甲醛溶液与戊二醛体积比1∶1固定方式。
细胞与印迹底物结合时间的优化
在获得以原始细胞为模型制作的印迹聚合物的基础上，为增加印迹聚合物的捕获效率，本研究同时优化了细胞与印迹聚合物的共同孵育时间如附图4。
本发明以MCF-7细胞为印迹模板，制作出完整的印迹聚合物后，分别取 0.5mL浓度为106个/mL绿色荧光探针染色的MCF-7细胞和0.5mL浓度为106个/mL红色荧光探针染色的MDA-MB-231细胞混合后，滴加印迹聚合物上，静置不同的时间，分别计算洗脱和酶解下的细胞数量，结果如上图所示。MDA- MB-231细胞滴加在印迹聚合物上时，由于底物对该细胞无明显的亲和力，在很短的时间内就被洗脱掉，随时间的推移数量几乎没有什么变化；当MCF-7细胞遇到本身制作的印迹聚合物底物时，会发生特异性吸附结合，随时间的推移吸附数量变得更加的牢固，在孵育10min的时候达到饱和，因此本实验选择加入混合细胞，孵育10min后作为最适时间。
模板细胞与印迹的制备
对细胞进行前面的处理后，显微镜观察如附图5和附图6所示。
附图5图表示经过体积比为1∶1的4％多聚甲醛和2.5％戊二醛混合PBS溶液固定和蒸馏水清洗后，吸附在玻片上的MCF-7细胞，该细胞经过双醛固化后，外貌形态保持固定不变，保持原有正常的形态结构；图b表示玻片上的MCF-7 细胞印在聚二甲基硅氧烷表面，经过在80℃下保持4小时，然后放在25℃下固化24小时，剥离附着细胞的玻片后，留下印迹聚合物的图形；图c为从图b中选取的一块区域，在原子力显微镜下的扫描图，可以清晰的观察到细胞印迹在聚二甲基硅氧烷的形状结构。
附图6：图a表示对模板细胞留下的印迹的原始图像；图b是对图a进行Flatten后的图像，显示该印迹呈圆形，直径约为25um，与细胞形状基本符合；图c是3D效果展示图，可以观察到在竖直方向Z轴，其深度约为13um，符合细胞印迹留在PDMS的尺寸；图d是在图b的中心区域划出一条线段显示其位置的深度，其长度和宽度均与细胞的形状相符。
5单细胞通道构建
为了更快速的捕获到单个靶细胞，并使其固定在某个位置，方便后续的筛选及单细胞点位研究，本实验同时构建了一种单细胞通道结构，其原理图如附图7。
本发明制作了外径为50um的毛细管，通过对毛细管的进一步加工修饰，用含3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液浸泡处理1h，蒸馏水冲洗干净，使其表面同样硅烷化，增加对细胞的亲和力。取浓度约为10-6个/mL 生长状态良好的细胞重悬后滴加在毛细管周围，培养4h后，使细胞均匀附着在毛细管周围，随后取出毛细管经PBS溶液缓缓清洗后，即制作出吸附细胞的毛细管。把该吸附细胞的毛细管放置在培养皿上，摆放成如图所示的结构，然后将配置好除去气泡的聚二甲基硅氧烷从培养皿的一边逐渐加入，使其慢慢浸没过毛细管(添加PDMS的过程中，务必保持毛细管静止不动)，最终添加聚二甲基硅氧的厚度约为0.5cm，静止0.5h后，经过在80℃下保持4小时，然后放 25℃下固化24小时后，倒置用镊子取出压印的毛细管，蒸馏水清洗留下的印迹聚合物。
本实验制作的吸附细胞的外径为50um毛细管和最终单细胞捕获装置如图8 所示。图a为在显微镜下观察所制作的吸附细胞外径为50um的毛细管，由于细胞浓度合宜，且毛细管经过3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰，增加了对细胞的亲和力，可观测到毛细管外壁所吸附的单个细胞。图b为吸附毛细管留下的单细胞印迹通道，可做为微流体通道用以捕获分离分析单细胞，每个通道宽度约为 50um，而癌细胞的直径约为25～30um，因此该通道只能同时容纳单个细胞通过，通道的高度为40μm，其体积容量约为1μL，将移液器尖端作为储液器插入通道的入口并充满细胞悬液，以0.2mm/s的流速，每分钟每个通道可检测10μL 细胞溶液，通过增加毛细管通道的个数，可使检测容量提升。
基于印迹聚合物的细胞分选
在以MCF-7细胞制作完整的细胞印迹后，取0.5mL浓度为10-6个/mL绿色荧光探针染色DiO(细胞膜绿色荧光探针)的MCF-7细胞和0.5mL浓度为 10-6个/mL红色荧光探针染色DiI(细胞膜红色荧光探针)的MDA-MB-231细胞混合后，滴加印迹聚合物上，在同一片区域的荧光显微镜观察结果如下。
如附图9所示：图a为等量的绿色荧光MCF-7细胞和红色荧光MDA-MB- 231细胞刚滴加到印迹聚合物时，细胞分部均匀；图b和图c为静止10min后，用PBS缓冲液清洗后的残留情况单色分析图，颜色多少代表细胞的数目，未吸附的MDA-MB-231多数被冲洗掉，而与印迹聚合物结合的MCF-7细胞则保留在界面上；图d为图b和图c的组合图。上图表格为经多次捕获数目测定， MCF-7细胞的捕获效率为89％，干扰率为1.2％。
以上详细描述了本发明关于细胞印迹模型的构建、制备及相关性质研究过程，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (3)
1.请求保护本发明设计原理思想：即对玻片进行硅烷化修饰，增加细胞对玻片的亲和度，使细胞更牢固的吸附在玻片上，防止印模过程中细胞脱落。培养生长良好状态的的细胞稀释合适浓度后，滴加在硅烷化处理的玻片上，使其呈单细胞分散平铺培养，固定细胞。配制好的PDMS固化混合物先经过预固化，保持表面平整且内部无气泡，随后将制作好的单细胞吸附的玻片放置在PDMS固化混合物上，使细胞压印在PDMS固化混合物上，经过固化后，取出压印的细胞玻片，清洗留下的印迹聚合物，达到细胞印迹的制备。
2.请求保护一种细胞印迹的制备方法包括如下步骤：1、玻片处理2、细胞处理细胞灭活3、印迹聚合物的成型4、分离通道制作。
3.请求保护本专利中关于细胞印迹条件的优化：具体包括多聚甲醛溶液与戊二醛体积比1∶1固定方式，细胞与印迹聚合物的共同孵育时间为12h为最优条件。
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