CN101245315B - 实验室贴壁细胞薄膜培养装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物工程技术领域的实验室贴壁细胞薄膜培养装置及方法，所述装置包括平皿、有机聚合物薄膜层、粘附液层。有机聚合物薄膜层通过粘附液层贴在平皿内底面。利用高分子聚合材料薄膜，加以粘附液润湿后贴在培养皿底面作为贴壁细胞附着面，便于传代时快速分离细胞，并快速投入定容培养液中用摇荡的方法脱落细胞，直接以此计数和传代，准确分量保证了下一代平行的初始接种条件，较原始传代方法操作更加简易，染菌机会更少。配合不同需要贴附不同高分子薄膜，能起到更高效的消化效率或贴壁培养的存活率。

Description

实验室贴壁细胞薄膜培养装置及方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的装置及方法，具体是一种实验室贴壁细胞薄膜培养装置及方法。

背景技术

实验室常规贴壁细胞培养传代方法，大致如下，以65mm平皿接种Vero细胞系为例，将接种的少量细胞悬液加入约2ml的培养液，轻轻摇匀后置于37℃的CO2培养箱中培养，当细胞生长达到一定密度时进行细胞传代。细胞传代时首先吸弃培养基，用1-2ml的PBS冲洗2遍，加入胰酶或胶原酶1ml，置于培养箱中温孵5-10min后加入含血清的培养基终止消化，轻轻反复吹打，直至平板上的细胞完全脱落，平板底部变得光滑透亮，用移液管吸取细胞悬液按比例分置在下一代平皿中，加入一定量的培养基轻轻平摇混匀，重复以上操作。

从以上步骤可以看出，对于严格要求染菌几率低、下一代平行培养以及批量传代的实验来说，仍然存在诸多弊端：(1)对细胞消化过程中吹打操作有一定技术要求，容易造成后期的实验误差不易预计。(2)对平皿不同位置的吹打效率不一样，造成的传代结果与细胞当初接种时未均匀平铺开造成的差异相关，并可能因随机吹打的重点不一，使得细胞不能均匀脱落。(3)由于贴壁不良的细胞最先被吹打下来，而越先吹打下来的细胞被用来撞击其他细胞的频率越高，受到的损伤和后期死亡率也越高，相应通过枪口更加容易，被保留传代的几率也越高，通过时间积累效应，选择下来的是非均一，损伤率高、贴壁不良的细胞。(4)当存在较大浓度差时，细胞扩散更容易进行，而反复吹打一般是采用高浓度的细胞悬液，对细胞的伤害较大，如果每吹打一次后就转移悬液，然后吸取新鲜培养基，则成本增加了许多倍，要耗费多倍的无菌移液管，并且染菌的机会和污染纯净培养基的机会倍增。(5)操作虽然在无菌超净台中进行，但传统吹打传代的方式造成细胞暴露的时间较长，尤其是贴壁良好的细胞，有时每平方厘米需要十次左右的吹打才能冲洗到平皿平滑洁净、细胞完全脱落的效果，因此需要有效的方法减少细胞的暴露，增加培养传代过程的安全性。(6)后代细胞如要准确定量，需获得平行一代的最真实准确细胞密度。目前缺少环节最少且最直接的计量方法。(7)如是玻璃平皿，清洗工作稍有难度。因此，利用薄膜代替平板作为细胞接触面，将可能克服目前细胞培养及传代过程的上述弊端。

经对现有技术文献的检索发现，张宇等人在《中国组织工程研究与临床康复》杂志2007-05-06发表的《壳聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜的制备及其与肌成纤维细胞的相容性》有相关提及，但并没有系统地将薄膜培养提出作为实验室一种新的适合常用的细胞培养装置或方法，另外如《湖南医科大学学报》中赵迪诚等人的《Separation of adhering cell colonies with a direct digestion method》一文中，将细胞接种在血纤维蛋白膜上，这种思想及其益处(便于直接消化有效获得单细胞克隆)与本发明十分吻合，但材料不利于普及和生产，不能作为一种常规的新型装置被应用于实验室。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种实验室贴壁细胞薄膜培养装置及方法，使细胞传代分取过程不但难度减少、操作安全方便、染菌机会降低，并使得平板培养的可变性、适应性大大提高。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所涉及的实验室贴壁细胞薄膜培养装置，包括平皿、有机聚合物薄膜层、粘附液层。有机聚合物薄膜层通过粘附液层贴在平皿内底面。

所述有机聚合物薄膜层可根据需要选用聚酯类、聚氨基酸类(如聚天冬氨酸、聚氨酯)、壳聚糖与纤维素聚合物、离子聚合物等材料。

所述粘附液层，可根据薄膜材料选用甘油、丙二醇、含明胶的PBS缓冲液等。

本发明所涉及的实验室贴壁细胞薄膜培养方法，本发明利用多种可适应性的有机聚合物薄膜，在粘附液的作用下贴在平皿内底面，在培养时供细胞附着并在需要的条件下整合适应生长环境变化的抑制因素；在消化传代时直接投入到准确定量的培养液中，在封闭条件下利用人手或者高速摇床的力量洗脱细胞，然后直接从大瓶细胞悬液中取样计数并直接分装接种，所计数目即是所有下代平皿接种细胞密度，无需稀释。

本发明包括以下步骤：

第一步，按照指定平皿规格，制备并剪取或购买已生产的有机聚合物薄膜，用一滴粘附液滴在平皿底面，轻晃均匀，贴上有机聚合物薄膜，并可用无菌三角玻棒轻轻涂匀，保证紧密贴合无气泡。

第二步，按照传统方法接种培养。

第三步，传代时用胰酶或胶原酶消化，消化完毕后加少量血清中止并吸去(或直接省略加入血清步骤)，将有机聚合物薄膜用无菌镊子撕起，快速投入到已准确定容的培养液瓶中，盖上瓶盖，充分摇荡或移至摇床高速摇荡10分钟左右，至细胞基本完全脱落形成悬液，用移液管定量分取至下一代平皿，按照第一步循环进行。

本发明充分利用薄膜的一次性，改进了传统平皿培养支持物结构不可变动的缺点，使得培养更具动态性，同时降低了成本。本发明用于准确定容且获得密度均一的细胞悬液，便于平行比较同一代传代产物的差异，而不是单纯的不计量传代。本发明通过物理方法使得消化后细胞脱落时完全在无菌密封环境中，染菌机会大大降低，而贴壁表面受力均匀，所脱落下来的细胞相对完整，代表性强。

附图说明

图1为本发明装置的结构示意图

图中1为平皿、2为有机聚合物薄膜层、3为粘附液层。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1所示，本实施例所涉及的实验室贴壁细胞薄膜培养装置，包括平皿1、有机聚合物薄膜层2、粘附液层3。有机聚合物薄膜层2在粘附液层3的作用下贴在平皿1内底面。

所述平皿1为普通规格培养皿，可以是玻璃或塑料的。

所述有机聚合物薄膜层2可根据需要选用聚酯类、聚氨基酸类PGAc、PU、壳聚糖与纤维素聚合物、离子聚合物等材料。

所述粘附液层3，可根据薄膜材料选用甘油、丙二醇、PBS明胶等。

基于传统贴壁细胞传代时消化吹打困难、定容不便、染菌率高的缺点，本实施例的装置利用高分子聚合材料薄膜，加以粘附液润湿后贴在培养皿底面作为贴壁细胞附着面，便于传代时快速分离细胞，并快速投入定容培养液中用摇荡的方法脱落细胞，直接以此计数和传代，准确分量保证了下一代平行的初始接种条件，较原始传代方法操作更加简易，染菌机会更少。配合不同需要贴附不同高分子薄膜，能起到更高效的消化效率或贴壁培养的存活率。

本实施例所涉及的实验室贴壁细胞薄膜培养方法以培养Vero细胞为例：

(1)将符合平皿规格的相应透明薄膜置于无菌环境中备用，如果是自行剪取，则在无菌操作台上浸泡75％乙醇1分钟，取出于热源附近等待酒精自然挥发干燥，注意有机材料不可升温，避免产生毒性。

(2)滴加粘附液1-2滴。粘附液的作用一方面是保持薄膜与底面的紧密贴合，排除气泡；另一方面是消化末期方便分离，可快速轻易的撕脱。粘附液要求相对培养基为惰性，或者是培养集中固有的非限制性成分；最好是油性。

(3)用无菌镊子夹置透明薄膜帖附在平皿内底面，由一侧慢慢放下，注意赶走气泡，也可用无菌三角玻棒轻轻推平赶走气泡。

(4)加样接种，按照传统方法吸取接种悬液滴加在透明薄膜上，加入适量的培养液，轻轻晃匀，盖上平皿上盖，置于37℃的CO2培养箱中培养。

(5)传代时，将已备好的准确体积的培养基(如500ml)置于无菌广口瓶中。吸弃细胞培养平皿中的上清液，加入含EDTA的0.25％胰酶或胶原酶，置于培养箱中消化5-10分钟。

(6)镜下观察，细胞变圆、少量脱离薄膜底面，可停止消化，(可加入少量含血清培养基，也可不加)，直接用无菌镊子将薄膜夹起，投入到培养基广口瓶中，盖上瓶盖，快速振摇，或放置在高速摇床上，可选择旋转往复式300-500rpm或直线往复式500-600rpm，或者复合使用，大约10min-15min，细胞可脱离薄膜。由于本方法培养基体积较多，而直接撕起的薄膜附着的细胞培养液体积≤0.5ml，因此培养基体积和浓度没有发生变化。此外，由于培养基中已含有大量的血清，可以足够终止薄膜表面附着的少量胰酶并认为新的细胞悬液中已不含胰酶。

(7)按常规方法，从广口瓶中取5μl细胞悬液并滴加5μl台盼蓝染液利用血球计数器计数。

(8)第(7)步所计数即为初始细胞接种浓度，用移液管准确吸取3-5ml细胞悬液，分置于下一代各个平皿中进行培养.下一代平皿的薄膜帖附具体方法同(1)(2)(3)步。

本实施例的方法克服了传统方法的诸多不利，使操作更加简便，易产生误差的环节减少，系统误差降低，后代初始条件相对平行，量取准确，最关键是贴壁细胞的脱离均匀，损伤减少，并由于暴露时间缩短，降低为原来的十分之一左右，故而染菌机会大大减少。另外，在该系统方法上，密不可分的一部分是针对不同的实验要求，充分利用有机薄膜的一次性和可变性，设计或使用不同的薄膜垫片。

Claims (9)

1.一种实验室贴壁细胞薄膜培养装置，其特征在于，包括平皿、有机聚合物薄膜层、粘附液层，有机聚合物薄膜层通过粘附液层贴在平皿内底面，所述有机聚合物薄膜层，其材料选用聚酯类、聚氨基酸类、壳聚糖与纤维素聚合物、离子聚合物中的一种。

2.根据权利要求1所述的实验室贴壁细胞薄膜培养装置，其特征是，所述粘附液层，其材料选用甘油、丙二醇、含明胶的PBS缓冲液中的一种。

3.根据权利要求1所述的实验室贴壁细胞薄膜培养装置，其特征是，所述聚氨基酸类为聚天冬氨酸，或聚氨酯。

4.一种实验室贴壁细胞薄膜培养方法，其特征在于，利用有机聚合物薄膜，在粘附液的作用下贴在平皿内底面，以便在培养时供细胞附着并整合适应生长环境变化的抑制因素，在消化传代时直接投入到培养液中，在封闭条件下洗脱细胞，然后直接从大瓶细胞悬液中取样计数并直接分装接种，所计数目即是所有下代平皿接种细胞密度。

5.根据权利要求4所述的实验室贴壁细胞薄膜培养方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步，按照指定平皿规格，制备并剪取或购买已生产的有机聚合物薄膜，用一滴粘附液滴在平皿底面，轻晃均匀，贴上有机聚合物薄膜；

第二步，接种培养；

第三步，传代时用胰酶或胶原酶消化，消化完毕后，将有机聚合物薄膜用无菌镊子撕起，快速投入到已准确定容的培养液瓶中，盖上瓶盖，充分摇荡或移至摇床高速摇荡10分钟，至细胞基本完全脱落形成悬液，用移液管定量分取至下一代平皿，按照第一步循环进行。

6.根据权利要求5所述的实验室贴壁细胞薄膜培养方法，其特征是，第一步中，贴上有机聚合物薄膜之后，用无菌三角玻棒轻轻涂匀，保证紧密贴合无气泡。

7.根据权利要求4或5或6所述的实验室贴壁细胞薄膜培养方法，其特征是，所述有机聚合物薄膜，其材料选用聚酯类、聚氨基酸类、壳聚糖与纤维素聚合物、离子聚合物中的一种。

8.根据权利要求4或5所述的实验室贴壁细胞薄膜培养方法，其特征是，所述粘附液，选用甘油、丙二醇、含明胶的PBS缓冲液中的一种。

9.根据权利要求5所述的实验室贴壁细胞薄膜培养方法，其特征是，第三步后，消化完毕后加少量血清中止并吸去，然后将有机聚合物薄膜用无菌镊子撕起。

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