CN101509924A - 基于微间隙阵列电极的电化学侧流免疫定量试纸传感器及其用于检测生物毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于微间隙阵列电极的电化学侧流免疫定量试纸传感器及其用于检测生物毒素如赭曲霉毒素A、伏马菌素B1的方法。传感器包括免疫色谱分析试纸条和电化学检测部分等两部分。该快速检测试纸传感器特异性强，能够实现定量检测，4－40℃都可使用，10min以后便可观察结果，适合于单位或个人对动物源性食品样品中的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1进行快速检测，可望成为食品、饲料样品中的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1现场筛查提供有效的技术手段。

Description

基于微间隙阵列电极的电化学侧流免疫定量试纸传感器及其用于检测生物毒素的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于微间隙阵列电极的电化学侧流免疫定量试纸传感器及其利用该传感器检测赭曲霉毒素A或伏马菌素B1的方法。

背景技术

赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的次级代谢产物。它极可能通过食物链进入人体，从而对人体健康构成潜在威胁。其中，以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，简称OTA)的毒性最强，对免疫系统有毒性，并有致畸、致癌和致突变作用。OTA在不同农产品中的污染水平差异很大，约有1.4％和0.6％的农产品中OTA的污染水平分别超过5和20μg/kg，其中粮食及其制品中分别有1.2％和0.3％的样品OTA含量超过5μg/kg，0.3％和0.05％的样品OTA污染水平高于20μg/kg在目前条件下，要完全避免OTA对食品及饲料的污染非常困难。除了在粮食收获、储存、加工各个环节科学作业、注意防霉去毒外，唯一有效的办法是加强对食品及饲料等的监控检测，及时发现污染的食品和饲料，并立即剔除，防止OTA超标污染的食品进入人类的食物链。到目前为止，全世界已有11个国家制订了食品(1～50μg/kg)和动物饲料(100～1000μg/kg)中OTA的限量标准。我国尚无粮食中OTA的限量标准，OTA的检测方法也仅限于薄层色谱法和ELISA法，前者为半定量，后者未经仪器法验证，对OTA毒性的研究也极少。因此，必须尽快建立快速、准确、灵敏并与国际接轨的检测OTA的方法，开展对农产品和食品中OTA的污染检测。

TLC是OTA早期研究中最常见的检测方法，因其操作简便曾被广泛应用。但这种方法较费时(48h左右)，灵敏度和特异性较差，在OTA的提取过程中所需的有机溶剂品种多且量大。HPLC法具有更高的灵敏度，可以精确地对样品中的OTA进行定性和定量分析，世界各地已有不少文献报道用高压液相色谱法检测真菌毒素，但此法不适合于大批量样品的检测。ELISA法由于其快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测，但由于需要多种仪器设备，不适合于现场快速抽检。

伏马菌素是是一组由串珠镰孢，轮状镰孢、多育镰孢和其它一些镰孢菌种产生的真菌毒素。迄今为止，已经发现伏马菌素的相关组分包括：FB1、FB2、FB3、FB4，FA1和FA2。串珠镰孢是玉米的一种致病菌，是全世界玉米中分布最广泛的一类真菌。是2B类致癌物，是一种毒性极强的真菌毒素，它可引起马脑白质软化症(EL EM)，猪肺水肿症候群(PPE)、并具有致癌活性，同时许多动物实验证明它可引起实验动物的肝、肾损伤。另外，由于伏马菌素可引起灵长类动物血浆中致动脉粥样硬化的脂肪改变，因此使人类患动脉粥样硬化的危险性增高。其在食品卫生领域中越来越受到人们的重视，对串珠镰刀菌及其产毒物的深入研究，将有利于减轻它们对人类健康的威胁，保障人类的健康。

各国都对农副产品中伏马菌素的最高允许浓度作出了严格的规定，建立伏马菌素的高灵敏分析手段对农副产品监督与检测具有重大意义。目前国内尚没有成形的方法检测伏马菌素B₁，在伏马菌素B1的众多检测方法中，多采用薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、液/质联用法(LC/MS)、液体二次离子探针质谱法(liquid-S IMS)等检测方法，这些检测方法具有较高的灵敏度和特异性，但均需复杂的提取净化步骤，单位时间内检测样品数量有限，且需要较贵重的仪器设备，耗时长，不适宜现场快速筛查，而我国大部分基层实验室根本不具备这些条件，使这些方法的推广应用受到限制。而免疫传感器便携、制作简便、分析速度快、灵敏度高，可望成为伏马菌素B1现场快速筛查的有效工具，适于我国具体国情。

发明内容

为实现对赭曲霉毒素A或伏马菌素B1的快速、高效的检测，本发明提供的技术方案为：一种基于微间隙电极阵列的电化学侧流免疫定量试纸传感器，该传感器包括免疫色谱分析试纸条和电化学检测部分；免疫色谱分析试纸条包括覆盖有一层硝化纤维膜的基片，以及基片上从一侧向另一侧依次排列粘贴的样液吸收垫、碱性磷酸酯酶标记抗体垫、检测反应区和吸水垫；电化学检测部分包括工作电极，印刷在检测反应区的正下面；

所述碱性磷酸酯酶标记抗体为碱性磷酸酯酶标记的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1单克隆抗体。

如附图1所示从右向左依次排列粘贴，其中，样液吸收垫和碱性磷酸酯酶(ALP)标记抗体垫可以部分重叠。

上述所述基片为PVC板；所述样液吸收垫为玻璃纤维或者滤纸；所述碱性磷酸酯酶标记抗体垫为玻璃纤维或者滤纸浸入碱性磷酸酯酶标记抗体溶液，经室温干燥；所述检测反应区宽度为15mm—20mm，距离试纸的始端350mm—400mm；所述吸水垫为聚酰胺纤维、聚酯、滤纸、硝化纤维或吸水网孔，经室温干燥处理。

所述碱性磷酸酯酶标记抗体溶液的制备包括以下步骤：取2.5mg/mL的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1抗体1mL，加入碱性磷酸酯酶5mg，再加入质量分数为2.5％戊二醛20μL，室温放置2h，不时振荡，然后用0.01mol/LPBS4℃透析过夜，换液3次；再移入0.05mol/LTris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次；取出，用含质量分数为1.0％BSA和质量分数为0.02％NaN₃的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记抗体溶液原液；最后加入1mL—2mL纯甘油，4℃保存。

所述工作电极为常规光刻印刷法制作的微间隙阵列金电极做基片，正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉组成微间隙阵列金电极，梳形齿宽为1μm—100μm，间隙为1μm—100μm；再对基片进行硅烷化处理，步骤包括：1)将上述金电极基片用无水乙醇清洗三次，每次1min—2min；2)将金电极浸入1M的NaOH溶液中25min—35min，然后用超纯水清洗该电极三次，每次1min—2min，吹干；3)将经步骤2)处理后的金电极浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(V/V)的乙醇溶液中，室温下静置23小时—25小时；再用超纯水清洗三次后吹干，即得工作电极。

本发明还提供了一种基于微间隙电极阵列的电化学侧流免疫定量试纸传感器的制备方法，包括以下步骤：1)按照上述方法制备的工作电极浸入质量分数为2.5％的戊二醛水溶液中，室温下静置1小时；2)取出，用超纯水清洗三次；在上述电极上滴加30μL待测赭曲霉毒素A或伏马菌素B1与牛血清白蛋白或酪蛋白交联物溶液，室温下静置反应1小时；所述交联物浓度为100μg/mL，是溶于0.01mol/L、pH7.4磷酸缓冲溶液而得；3)用超纯水清洗三次，吹干，所得的工作电极保存于4℃备用；4)试纸组装：将试纸固定在基片上，并依次粘贴样液吸收垫、碱性磷酸酯酶标记的抗体垫、检测反应区和吸水垫；5)将上述工作电极印刷在试纸的检测反应区的正下面，并浸泡在银沉积溶液中1min-2min，再经室温干燥，即得试纸传感器，所述的银沉积溶液为将1mM抗坏血酸磷酸酯，2mM AgNO₃的0.1M甘氨酸—NaOH缓冲溶液而得，溶液pH＝9.0。

本发明还提供了一种基于微间隙电极阵列的电化学侧流免疫定量试纸传感器的生物毒素的检测方法，包括如下步骤：分别取一系列浓度0.10ng/mL，1.0ng/mL，1.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，100.0ng/mL，200.0ng/mL的生物毒素标准样品溶液100μL，滴入上述试纸传感器的样液吸收垫，样液被吸收并通过毛细作用向试纸另一侧移动，样品中游离的生物毒素与碱性磷酸酯酶标记抗体结合，形成抗原-碱性磷酸酯酶标记抗体结合物，未反应的碱性磷酸酯酶标记抗体和结合物继续移动到检测反应区，未反应的碱性磷酸酯酶标记抗体则与工作电极表面的已经固定了的生物毒素的牛血清白蛋白或酪蛋白交联物反应形成偶联物—单抗复合物；偶联物—单抗复合物中的碱性磷酸酶催化工作电极表面的抗坏血酸磷酸酯水解产生抗坏血酸，银离子在抗坏血酸的作用下被还原成银单质并沉积在工作电极上，从而增大了微间隙阵列电极的电导；室温下静置反应5min-8min，将传感器工作电极的正极与CHI 760A型电化学工作站的工作电极连接，工作站对电极与参比电极复合，再与传感器工作电极的负极连接，采用线性扫描伏安法在0～50mV电位范围检测，记录传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；根据不同浓度的生物毒素标准样品溶液的电导值，获得工作曲线；再根据样品的电导值与工作曲线，求得对应的样品的生物毒素的浓度；

所述生物毒素为赭曲霉毒素A或伏马菌素B1。

本发明的有益效果为：

1)、电化学侧流免疫定量试纸制备简单，成本低廉，可大批量低成本生产；

2)、操作步骤简单，检测时间在30分钟内，检测所需要的仪器可用自行研制的电阻量测装置；

3)、本免疫传感器灵敏度高，可实现浓度为10pg/mL的农副产品中伏马菌素B1的检测，达到我国农副产品中赭曲霉毒素A或伏马菌素B1的限量标准。且背景干扰小，可以对农副产品中赭曲霉毒素A或伏马菌素B1的进行快速筛查和检测。

4)、解决了快速检测卡只能定性或者半定量的问题，克服了光学定性检测卡、薄层层析检测卡重现性差的难题，实现真正意义上的定量检测，数据真实可靠，整个仪器可便携，低成本。在国内外首次将该技术与侧流层析技术相结合应用于食品、环境等领域的检测。特别适用于食品安全检测机构和监管部门的现场检测。

5)检测温度适宜范围宽，在4-40℃都可使用，结果正常。

本发明适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性食品样品中的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1进行快速检测，可望成为食品样品中的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1现场筛查提供有效的技术手段。

附图说明

图1是电化学侧流免疫定量试纸示意图；

1—PVC板，2—样液吸收垫，3—碱性磷酸酯酶(ALP)标记抗体垫，4—硝化纤维膜，5—电化学检测反应部分，6—检测反应区，7—吸水垫；

图2是微间隙阵列电极图样(黑色区域为金膜，白色区域为裸露的基片)，掩膜图样与此相反(黑色区域为透明区，白色区域为不透明区)，它为叉指式双电极，正负电极均为两个梳形金电极，彼此通过微米级绝缘间隙交叉组成阵列式金电极，正负电极的梳形齿数5至20个，宽为1μm—100μm。电极间隙为1μm—100μm。

具体实施方式：

实施例1：

利用本传感器对玉米中的伏马菌素B1回收率的检测：取测定碎过的120目筛的过玉米(未检出的伏马菌素B1)，置于250mL具塞锥形瓶中，加入10.0ng/mL的伏马菌素B1，混匀。用甲醇:水(3:1，V/V)混合溶液100mL振荡20min，静置提取10min，用20mL水稀释，盖严防漏。离心混合液(2500-3000r/min，10-15min)，取上层清液100μL滴到制备好的伏马菌素B1的电化学侧流免疫定量试纸表面的样液吸收垫。当样液到达检测反应区时，室温下静置反应8-12min，再从该电极获取与伏马菌素B1抗原浓度相关的电导信号。记录变化值。根据工作曲线计算得到伏马菌素B1浓度。五次测定伏马菌素B1浓度得到其结果平均值为9.83±0.11ng/mL。与五次薄层色谱法结果9.64±0.15ng/mL吻合。结果表明，本传感器的回收率88.1％～105.5％.结果表明，本传感器可以对玉米中伏马菌素B1进行快速检测。

实施例2：

利用本传感器对发霉花生样品中的赭曲霉毒素A的检测：取250.0g碎过的120目筛的发霉花生样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液200mL，均质成匀浆，混匀。过滤取上层清液50mL，用甲醇:水(3:1，V/V)溶液100mL振荡20min，静置提取10min，盖严防漏。离心混合液(2500-3000r/min，10-15min)，取上层清液100μL滴到制备好的赭曲霉毒素A的电化学侧流免疫定量试纸表面的样液吸收垫。当样液到达检测反应区时，室温下静置反应8-12min，再从该电极获取与赭曲霉毒素A抗原浓度相关的电导信号。记录变化值。根据工作曲线计算得到赭曲霉毒素A浓度。五次测定得到对应的试液中赭曲霉毒素A浓度平均值为41.4±1.5ng/mL。与五次薄层色谱法结果40.5±2.1ng/mL吻合。结果表明，本传感器可以对花生中赭曲霉毒素A进行快速检测。

实施例3：

利用本传感器对发霉玉米样品中的伏马菌素B1的检测：取200.0g碎过的120目筛的发霉玉米样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液200mL，均质成匀浆，混匀。过滤取上层清液50mL，用甲醇:水(3:1，V/V)溶液100mL振荡20min，静置提取10min，用20mL水稀释。离心混合液(2500-3000r/min，10-15min)，取上层清液100μL滴到制备好的伏马菌素B1的电化学侧流免疫定量试纸表面的样液吸收垫。当样液到达检测反应区时，室温下静置反应8-12min，再从该电极获取与伏马菌素B1抗原浓度相关的电导信号。记录变化值。五次测定并根据工作曲线计算得到对应的试液中伏马菌素B1浓度平均值为24.2±1.2ng/mL。与五次薄层色谱法结果22.3±2.0ng/mL吻合。结果表明，本传感器可以对玉米中伏马菌素B1进行快速检测。

Claims (6)

1、一种基于微间隙电极阵列的电化学侧流免疫定量试纸传感器，其特征在于，该传感器包括免疫色谱分析试纸条和电化学检测部分；其中，免疫色谱分析试纸条包括覆盖有一层硝化纤维膜的基片，以及基片上从一侧向另一侧依次排列粘贴的样液吸收垫、碱性磷酸酯酶标记抗体垫、检测反应区和吸水垫；电化学检测部分包括工作电极，印刷在检测反应区的正下面；

所述碱性磷酸酯酶标记抗体为碱性磷酸酯酶标记的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1单克隆抗体。

2、根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述基片为PVC板；所述样液吸收垫为玻璃纤维或者滤纸；所述碱性磷酸酯酶标记抗体垫为玻璃纤维或者滤纸浸入碱性磷酸酯酶标记抗体溶液，经室温干燥；所述检测反应区宽度为15mm—20mm，距离试纸的始端350mm—400mm；所述吸水垫为聚酰胺纤维、聚酯、滤纸、硝化纤维或吸水网孔，经室温干燥处理。

3、根据权利要求2所述的传感器，其特征在于，所述碱性磷酸酯酶标记抗体溶液的制备包括以下步骤：取2.5mg/mL的赭曲霉毒素A或伏马菌素B1抗体1mL，加入碱性磷酸酯酶5mg，再加入质量分数为2.5％戊二醛20μL，室温放置2h，不时振荡，然后用0.01mol/LPBS4℃透析过夜，换液3次；再移入0.05mol/LTris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次；取出，用含质量分数为1.0％BSA和质量分数为0.02％NaN₃的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记抗体溶液原液；最后加入1mL—2mL纯甘油，4℃保存。

4、根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述工作电极为常规光刻印刷法制作的微间隙阵列金电极做基片，正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉组成微间隙阵列金电极，梳形齿宽为1μm—100μm，间隙为1μm—100μm；再对基片进行硅烷化处理，步骤包括：1)将上述金电极基片用无水乙醇清洗三次，每次1min—2min；2)将金电极浸入1M的NaOH溶液中25min—35min，然后用超纯水清洗该电极三次，每次1min—2min，吹干；3)将经步骤2)处理后的金电极浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(V/V)的乙醇溶液中，室温下静置23小时—25小时；再用超纯水清洗三次后吹干，即得工作电极。

5、基于微间隙电极阵列的电化学侧流免疫定量试纸传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)按照权利要求4制备的工作电极浸入质量分数为2.5％的戊二醛水溶液中，室温下静置1小时；2)取出，用超纯水清洗三次；在上述电极上滴加30μL待测赭曲霉毒素A或伏马菌素B1与牛血清白蛋白或酪蛋白交联物溶液，室温下静置反应1小时；所述交联物浓度为100μg/mL，是溶于0.01mol/L、pH7.4磷酸缓冲溶液而得；3)用超纯水清洗三次，吹干，所得的工作电极保存于4℃备用；4)试纸组装：将试纸固定在基片上，并依次粘贴样液吸收垫、碱性磷酸酯酶标记的抗体垫、检测反应区和吸水垫；5)将上述工作电极印刷在试纸的检测反应区的正下面，并浸泡在银沉积溶液中1min-2min，再经室温干燥，即得试纸传感器，所述的银沉积溶液为将1mM抗坏血酸磷酸酯，2mMAgNO₃的0.1M甘氨酸—NaOH缓冲溶液而得，溶液pH＝9.0。

6、基于微间隙电极阵列的电化学侧流免疫定量试纸传感器的生物毒素的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：分别取一系列浓度0.10ng/mL，1.0ng/mL，1.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，100.0ng/mL，200.0ng/mL的生物毒素标准样品溶液100μL，滴入权利要求1所述试纸传感器的样液吸收垫，样液被吸收并通过毛细作用向试纸另一侧移动，样品中游离的生物毒素与碱性磷酸酯酶标记抗体结合，形成抗原-碱性磷酸酯酶标记抗体结合物，未反应的碱性磷酸酯酶标记抗体和结合物继续移动到检测反应区，未反应的碱性磷酸酯酶标记抗体则与工作电极表面的已经固定了的生物毒素的牛血清白蛋白或酪蛋白交联物反应形成偶联物—单抗复合物；偶联物—单抗复合物中的碱性磷酸酶催化工作电极表面的抗坏血酸磷酸酯水解产生抗坏血酸，银离子在抗坏血酸的作用下被还原成银单质并沉积在工作电极上，从而增大了微间隙阵列电极的电导；室温下静置反应5min-8min，将传感器工作电极的正极与CHI760A型电化学工作站的工作电极连接，工作站对电极与参比电极复合，再与传感器工作电极的负极连接，采用线性扫描伏安法在0～50mV电位范围检测，记录传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；根据不同浓度的生物毒素标准样品溶液的电导值，获得工作曲线；再根据样品的电导值与工作曲线，求得对应的样品的生物毒素的浓度；

所述生物毒素为赭曲霉毒素A或伏马菌素B1。

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