CN103675052B - 一种检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电化学免疫传感器检测邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于：制备检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器，以K₃[Fe(CN)₆]为探针，采用差分脉冲伏安法（DPV）监测免疫反应，通过计算DPV峰电流与邻苯二甲酸二丁酯浓度的变化关系检测样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量。本发明充分结合免疫分析技术和电化学分析技术优势和特点，不仅为邻苯二甲酸二丁酯的定量提供了一种新的简单而高效的检测方法，而且该方法特异性好且制作简单、响应快、灵敏度高、成本低、能满足实际测定的要求。

Description

一种检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及邻苯二甲酸二丁酯的定量检测方法，具体涉及采用电化学免疫传感器方法对邻苯二甲酸二丁酯的定量检测。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）属于邻苯二甲酸酯类化合物的一员，主要用作硝基纤维素漆的增塑剂，也可作为聚氯乙烯和聚醋酸乙烯等塑料的增塑剂。同时是防沫剂、乳胶粘合剂以及纺织纤维润滑剂的工业原料，还可用作染料和杀虫剂的溶剂。DBP可在其生产或掺入到塑料、粘合剂和染料的过程中释放到环境，另外由于DBP不与终产品共价结合，随着使用时间的推移，可不断地释出进入环境，环境中的DBP可通过呼吸、饮食以及皮肤接触等多种途径进入人体。近年来，DBP被认为是一种环境内分泌干扰物，具有生殖毒性、发育毒性以及潜在的致癌性等。

为了更好测定DBP在环境中的污染水平以及评价暴露于环境中的DBP产生的潜在不利影响，必须建立一种快速、简便、灵敏、费用低廉的方法检测DBP在环境和生活用品中的残留量。目前国内外对DBP的监测方法主要有气相色谱（GC），气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱法（HPLC）等色谱技术，这些分析方法对仪器条件要求高，色谱柱等耗材价格也昂贵，前处理的操作过程相对复杂、耗时。

免疫分析技术由于其特异性好，灵敏度也较高，不需要昂贵的设备和耗材，因此免疫分析技术应用于DBP检测具有简便、快速、成本低等优点。目前，主要用于DBP免疫分析技术有酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫层析法。但是这两种方法也有不足之处，酶联免疫吸附法（ELISA）在检测DBP实际样品时，有时要对样品进行特殊处理，如果处理不当或不完全，检测DBP样品本身的颜色和浊度可能会对实验结果造成偏差或误判。胶体金免疫层析法优势在于检测时间更短，成本低廉，但其灵敏度通常与上述任何一种方法相比都要低一些。而且该方法只能定性不能定量，不能给出准确的检测结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器的定量检测方法，可以实现在体检测，不受样品自身颜色、浊度的影响，所需仪器设备相对简单，为邻苯二甲酸二丁酯建立一种简单快速、灵敏度高、特异性好、低成本的检测方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案为：一种检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器，其特征在于：包括基底电极，所述基底电极表面吸附纳米金，并以邻苯二甲酸二丁酯抗体进行修饰，最后以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。

优选地，所述基底电极为玻碳电极，所述基底电极表面吸附的纳米金的粒径大小为20nm。

具体地，邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器采用如下制备步骤：

1）纳米金溶液配制：100mL0.01%氯金酸，加热至沸腾，加入4mL1%柠檬酸，不停搅拌并反应15分钟，得到酒红色且径粒大小为20nm的纳米金溶液；

2）玻碳电极处理：玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al₂O₃粉乳液分别打磨抛光后，在乙醇和超纯水中分别超声清洗3min；

3）纳米金的吸附：清洗后的玻碳电极浸泡在步骤1配制的径粒为20nm的纳米金溶液中，在1.5V电势下恒电位扫描800s，扫描完成后继续在纳米金溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水冲洗掉表面吸附不牢固的纳米金粒子；

4）电极表面修饰：将5μL浓度为0.2mg/mL的邻苯二甲酸二丁酯抗体滴涂于步骤3）制得的玻碳电极表面；

5）非特异性的活性位点封闭：表面修饰后的玻碳电极于37℃下浸泡在1%的牛血清蛋白溶液中30min，以封闭剩余的活性位点制得所述邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器。

纳米金具有比表面积大、导电性能和生物相容性高的优点。本发明先制备好20nm的纳米金粒子且纳米金大小均一，来获得更加稳定和高效的修饰电极。由于制备好的纳金粒子带负电，在正电势的作用下，纳米金粒子直接吸附在电极上。电极表面吸附纳米金后，将邻苯二甲酸二丁酯抗体滴涂在电极上，利用纳米金对抗体进行物理吸附并固定于电极表面，并将电极浸泡在BSA溶液中，以封闭非特异性的活性位点。电极表面修饰见图1。

基于上述电化学免疫传感器检测邻苯二甲酸二丁酯的方法为：制备检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器，以K₃[Fe(CN)₆]为探针，采用差分脉冲伏安法（DPV）监测免疫反应，通过计算DPV峰电流与邻苯二甲酸二丁酯浓度的变化关系检测样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量。

基于上述检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器，本发明涉及的邻苯二甲酸二丁酯的定量检测方法包括如下步骤：

1）标准溶液配制：配制含不同浓度邻苯二甲酸二丁酯的磷酸缓冲溶液为标准溶液，其中含有20%二甲基甲酰胺；

2）建立标准曲线：将邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器分别浸入标准溶液中孵育进行免疫反应，免疫反应完成后用磷酸缓冲溶液冲洗所述免疫传感器，以K₃[Fe(CN)₆]为探针，采用差分脉冲伏安法（DPV）监测免疫反应，记录响应电流；空白标准样的响应电流为I₀，含有邻苯二甲酸二丁酯的标准样的响应电流为I_x，响应电流的增加ΔI（ΔI=I_x-I₀）与标准溶液中邻苯二甲酸二丁酯浓度C成正比，绘制ΔI-C标准曲线；

3）邻苯二甲酸二丁酯测定：将待测样品滴涂于修饰好的电极上进行免疫反应，按照与步骤2）相同的方法对所述免疫反应进行差分脉冲伏安扫描，记录响应电流，根据响应电流的增加ΔI和ΔI-C标准曲线得到邻苯二甲酸二丁酯含量。

优选地，所述的K₃[Fe(CN)₆]溶液的浓度为5mM且含有0.1M的磷酸缓冲液。免疫反应条件为30℃下孵育8min，且反应溶液pH为7.0。

本发明所涉及的一种邻苯二甲酸二丁酯检测方法基于以下原理，如图2示。

修饰电极在含有邻苯二甲酸二丁酯溶液中孵育时，基于邻苯二甲酸二丁酯抗体和抗原之间特定反应模式，邻苯二甲酸二丁酯抗体与邻苯二甲酸二丁酯的特异免疫反应使邻苯二甲酸二丁酯吸附在电极上。邻苯二甲酸二丁酯浓度越高，在电极上的免疫反应形成抗原-抗体复合物就越多。在进行差分脉冲伏安（DPV）扫描时，抗体-抗原复合物在电极表面的形成导致电极产生位阻，减少了电极活动区域，阻碍了K₃[Fe(CN)₆]探针离子到达电极，使[Fe(CN)₆]^3-/4-氧化还原峰电流值降低。因此利用免疫反应机制，不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯孵育后的电极，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中差分脉冲伏安法(DPV)得到的曲线峰电流不同。实验结果显示，随着邻苯二甲酸二丁酯浓度在孵育液中的增加，DPV峰电流减小，且峰电流减小值与邻苯二甲酸二丁酯浓度呈线性，从而实现对邻苯二甲酸二丁酯的定量检测。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过粒径20nm纳米金固定邻苯二甲酸二丁酯抗体于玻碳电极上，以K₃[Fe(CN)₆]为探针，采用差分脉冲伏安法监测免疫反应，实现对邻苯二甲酸二丁酯进行定量检测。本发明具有高度的灵敏度和专一性，不受样品自身颜色、浊度的影响。检测方法简单、高效，检测限可达到3ng/mL，线性范围5~80ng/mL。总之，本发明充分结合免疫分析技术和电化学分析技术优势和特点，不仅为邻苯二甲酸二丁酯的定量提供了一种新的简单而高效的检测方法，而且该方法特异性好且制作简单、响应快、灵敏度高、成本低、能满足实际测定的要求。

附图说明

图1为本发明玻碳电极表面修饰示意图；

图2为本发明检测邻苯二甲酸二丁酯的原理，（a）将修饰好的电极浸入含有邻苯二甲酸二丁酯的溶液中进行孵育，（b）以[Fe(CN)₆]^3-/4-为探针进行电化学检测，通过监测电信号的变化检测邻苯二甲酸二丁酯浓度；

图3为纳米金的透射电镜图TEM；

图4为纳米金吸附时间优化：（a）400s，（b）600s，（c）800s，（d）1000s；

图5为邻苯二甲酸二丁酯抗体吸附时间优化：（a）1h，（b）2h，（c）3h，（d）4h，（e）5h；

图6为电极修饰的循环伏安图，（a）裸电极，（b）纳米金修饰电极，（c）纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极，（d）修饰电极上的邻苯二甲酸二丁酯抗体与邻苯二甲酸二丁酯结合形成复合物；

图7为电极修饰的交流阻抗图，（a）裸电极，（b）纳米金修饰电极，（c）纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极，（d）修饰电极上的邻苯二甲酸二丁酯抗体与邻苯二甲酸二丁酯结合形成复合物；

图8为修饰电极在孵育液中的孵育时间与DPV峰电流的影响关系；

图9为修饰电极在孵育液中的孵育温度与DPV峰电流的影响关系；

图10为修饰电极在孵育液的pH与DPV峰电流的影响关系；

图11为修饰电极的特异性；

图12为修饰电极的DPV曲线图，（a）0ng/mL，（b）5ng/mL，（c）10ng/mL，（d）20ng/mL，（e）40ng/mL，（f）80ng/mL的孵育液中孵育后，在5mM的K₃[Fe(CN)₆]的PBS溶液中的DPV曲线图；

图13为响应电流的变化ΔI与邻苯二甲酸二丁酯浓度的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

以下实施例中使用上海晨华公司的电化学工作站（CHI440a），以修饰的玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极进行电化学测量。所使用的邻苯二甲酸二丁酯抗体是本实验室自制的，其效价浓度为1:32000。

一、工作电极的修饰

其具体修饰方法如下：

1）纳米金溶液制备：100mL0.01%氯金酸，加热至沸腾，加入4mL1%柠檬酸，不停搅拌并反应15分钟，得到酒红色且径粒大小为20nm的纳米金溶液。如图3所示为制得的纳米金的透射电镜照片，由图中可以看出，纳米金径粒大小为20nm左右，纳米金在生物学和电学方面具有独特性质,可对蛋白质产生强的吸附作用,维持其生物活性,并可增强固定的生物分子的电子传递能力。

2）纳米金吸附时间优化：玻碳电极处理：直径为3mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al₂O₃粉乳液分别打磨抛光后，在乙醇和超纯水中分别超声清洗3min；清洗后的玻碳电极浸于纳米金溶液中，在1.5V电势下恒电位分别扫描400s，600s，800s，1000s；扫描完成后继续在纳米金溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水冲洗掉表面吸附不牢固的纳米金粒子。接着在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，结果如图4，由图可知，峰电流随着纳米金吸附量的增加而逐渐降低，在800s以后变化很小，说明此时在玻碳电极上的纳米金吸附量基本达到最大，所以选择800s作为最佳吸附时间。

3）抗体吸附时间优化：将5μL浓度为0.2mg/mL的邻苯二甲酸二丁酯抗体滴涂于修饰过纳米金的玻碳电极上于4℃下分别孵育1h，2h，3h，4h，5h。在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲液溶液中进行循环伏安扫描，结果如图5，由图可知，峰电流随着抗体吸附时间的增加而逐渐降低，在4h以后变化很小，说明此时在玻碳电极上的抗体吸附量基本达到最大，所以选择4h作为最佳抗体吸附时间。

4）电极修饰：直径为3mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al₂O₃粉乳液分别打磨抛光后，在乙醇和超纯水中分别超声清洗3min；清洗后的玻碳电极浸于纳米金溶液中，在1.5V电势下恒电位扫描800s；将5μL浓度为0.2mg/mL的邻苯二甲酸二丁酯抗体滴涂于修饰了纳米金的玻碳电极上于4℃下孵育4h制得的玻碳电极表面。表面修饰后的电极于37℃下浸泡在1%的牛血清蛋白溶液中30min，以封闭剩余的活性位点。

二、电极修饰过程表征

对不同修饰电极进行循环伏安研究，其结果见图6。曲线a，裸电极在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲液溶液中的循环伏安曲线表现出一对明显的[Fe(CN)₆]^3-/4-氧化还原峰；曲线b，当电极上修饰了纳米金后，峰电流明显降低，表明纳米金已经修饰在电极表面并与同样带负电[Fe(CN)₆]^3-/4-相排斥；曲线c是吸附纳米金的电极在吸附邻苯二甲酸二丁酯抗体后，由于抗体是非导电性物质，电流值响应仍然是降低；曲线d，邻苯二甲酸二丁酯与邻苯二甲酸二丁酯抗体结合成复合物，进一步的阻碍了电子的传输。图7交流阻抗图进一步表征了电极的修饰过程，曲线a为裸电极的阻抗图，近似一条直线，表面电子的传递到电极表面只受扩散控制；曲线b，当电极表面吸附了纳米金，出现高的膜本体阻抗；曲线c，当电极修饰了抗体和纳米金，抗体的覆盖使阻抗值增加；曲线d，当电极表面抗体与抗原反应结合成复合物后，其阻抗值进一步增大。由以上结果表明，修饰电极的循环伏安图和交流阻抗图结果一致，说明邻苯二甲酸二丁酯抗体成功修饰在了电极上。

三、检测条件的优化

不同检测条件的影响，由DPV法进行确定。

1、免疫反应时间

将修饰电极在含有40ng/mL邻苯二甲酸二丁酯的标准溶液中分别孵育2，4，6，8，10和12分钟后用PBS清洗，在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲溶液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，结果如图8。纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极的DPV峰电流随孵育时间增加在8分钟内快速下降，8分钟后电流值趋于平稳且基本不再变化。因此，选择8分钟作为免疫反应的最佳孵育时间。

2、免疫反应温度

将修饰电极在含有40ng/mL邻苯二甲酸二丁酯的标准溶液中分别在20，25，30，35，40℃下分别孵育8分钟后用PBS清洗，在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲溶液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，结果如图9。纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极的DPV峰电流在30℃孵育温度下电流值最低，表明此时抗原抗体反应最完全。因此，选择30℃作为免疫反应的最适孵育温度。

3、免疫反应pH

将修饰电极分别在pH值为5，6，7，8，9的含有40ng/mL邻苯二甲酸二丁酯的标准溶液中30℃下孵育8分钟后用PBS清洗，在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲溶液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，结果如图10。纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极的DPV峰电流在pH值为7的条件下电流值最低，表明此时抗原抗体反应最完全。因此，选择pH=7作为免疫反应的最适pH。

四、标准曲线的建立

以K₃[Fe(CN)₆]为探针，通过DPV扫描，利用邻苯二甲酸二丁酯抗体特异结合邻苯二甲酸二丁酯的能力，可以实现对邻苯二甲酸二丁酯的检测。

配制标准溶液（孵育液），标准溶液为含有浓度：0，5，10，20，40，80ng/mL的邻苯二甲酸二丁酯并含20%二甲基甲酰胺的PBS溶液（pH=7.0）。

将纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极浸入孵育溶液，经过30℃下8min孵育后用PBS冲洗。冲洗后的电极作为工作电极在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲溶液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，记录响应电流，如图11所示。

结果表明，随着邻苯二甲酸二丁酯浓度在孵育液中的增加DPV峰电流减小。以纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极在不含邻苯二甲酸二丁酯孵育液中孵育后的响应电流为I₀，在含有邻苯二甲酸二丁酯孵育液孵育后的响应电流为I_x，响应电流的增加ΔI（ΔI=I_x-I₀）与邻苯二甲酸二丁酯浓度在5到80ng/mL范围内成正比。

绘制ΔI-C标准曲线如图12所示。线性回归方程为：Y=-0.06611+0.04341X。

以大于噪音信号3倍的电流信号对应的浓度为最低检出限，重复5次以上实验得出，上述方法的最低检测限为3ng/mL。

五、特异性检测

将修饰电极分别在40ng/mL邻苯二甲酸二丁酯和各含400ng/mL的4种邻苯二甲酸二丁酯结构类似物：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)混合溶液中，以及只含400ng/mL的4种邻苯二甲酸二丁酯结构类似物的混合溶液中，30℃下孵育8分钟后用PBS清洗，在在5mM的K₃[Fe(CN)₆]+0.1M磷酸缓冲溶液中分别进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，结果如图13。在检测不含邻苯二甲酸二丁酯的混合物时，纳米金/邻苯二甲酸二丁酯抗体修饰电极的DPV峰电流基本无变化，电流仅下降0.02μA，而在检测含有苯二甲酸二丁酯的混合物时，电流下降了1.89μA，表明此方法特异性良好。

六、水样中邻苯二甲酸二丁酯检测

根据步骤四所建立的邻苯二甲酸二丁酯检测的标准曲线，采用本发明的方法测定水样中邻苯二甲酸二丁酯的含量。

在自来水和磨山东湖水样中添加邻苯二甲酸二丁酯标准溶液，邻苯二甲酸二丁酯的终浓度为0ng/mL，10ng/mL，30ng/mL和60ng/mL，并按照与步骤四相同的方法对修饰电极进行孵育及检测，根据工作曲线得到样品中邻苯二甲酸二丁酯的实际浓度，所得数据结果及回收率见表1。

表

七、塑料制品以及化妆品中邻苯二甲酸二丁酯检测

检测方法同步骤四，样品按下述方法预处理：

将某品牌食品保鲜袋和一次性塑料杯剪成0.5cm²的碎片，称取0.5g；某品牌指甲油称取0.5g。分别加5mL正己烷于带塞玻璃试管中抽提过夜，取3mL抽提液减压蒸馏除去正己烷，残余物用2mL不含邻苯二甲酸二丁酯的标准溶液溶解，并按照与步骤四相同的方法进行电化学检测。

所得数据结果见表2。

表2

样品	检出浓度（mg/kg）
		食品保鲜袋	1.26±0.05
一次性塑料杯	2.20±0.08
		指甲油	0.33±0.01

Claims (6)

1.一种检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：包括基底电极，所述基底电极为玻碳电极，所述基底电极表面吸附有纳米金，并以邻苯二甲酸二丁酯抗体进行修饰，最后以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点；

该检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器的制备方法包括如下步骤：

1)纳米金溶液配制：100mL0.01％氯金酸，加热至沸腾，加入4mL1％柠檬酸，不停搅拌并反应15分钟，得到酒红色且径粒大小为20nm的纳米金溶液；

2)玻碳电极处理：玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al₂O₃粉乳液分别打磨抛光后，在乙醇和超纯水中分别超声清洗3min；

3)纳米金的吸附：清洗后的玻碳电极浸泡在步骤1配制的径粒为20nm的纳米金溶液中，在1.5V电势下恒电位扫描800s，扫描完成后继续在纳米金溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水冲洗掉表面吸附不牢固的纳米金粒子；

4)电极表面修饰：将5μL浓度为0.2mg/mL的邻苯二甲酸二丁酯抗体滴涂于步骤3)制得的玻碳电极表面；

5)非特异性的活性位点封闭：表面修饰后的玻碳电极于37℃下浸泡在1％的牛血清蛋白溶液中30min，以封闭剩余的活性位点制得所述邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：所述基底电极表面吸附的纳米金的粒径大小为20nm。

3.一种基于权利要求1所述的电化学免疫传感器检测邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于：制备检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器，以K₃[Fe(CN)₆]为探针，采用差分脉冲伏安法(DPV)监测免疫反应，通过计算DPV峰电流与邻苯二甲酸二丁酯浓度的变化关系检测样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量。

4.根据权利要求3所述的电化学免疫传感器检测邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)标准溶液配制：配制含不同浓度邻苯二甲酸二丁酯的磷酸缓冲溶液为标准溶液，其中含有20％二甲基甲酰胺；

2)建立标准曲线：将邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器分别浸入标准溶液中孵育进行免疫反应，免疫反应完成后用磷酸缓冲溶液冲洗所述免疫传感器，以K₃[Fe(CN)₆]为探针，采用差分脉冲伏安法(DPV)监测免疫反应，记录响应电流；空白标准样的响应电流为I₀，含有邻苯二甲酸二丁酯的标准样的响应电流为Ix，响应电流的增加ΔI(ΔI＝Ix-I₀)与标准溶液中邻苯二甲酸二丁酯浓度C成正比，绘制ΔI-C标准曲线；

3)邻苯二甲酸二丁酯测定：将待测样品滴涂于修饰好的电极上进行免疫反应，按照与步骤2)相同的方法对所述免疫反应进行差分脉冲伏安扫描，记录响应电流，根据响应电流的增加ΔI和ΔI-C标准曲线得到邻苯二甲酸二丁酯含量。

5.根据权利要求4所述的电化学免疫传感器检测邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于，所述的K₃[Fe(CN)₆]溶液的浓度为5mM且含有0.1M的磷酸缓冲液。

6.根据权利要求4所述的电化学免疫传感器检测邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于，免疫反应条件为30℃下孵育8min，且反应溶液pH为7.0。