CN103257115A

CN103257115A - 邻苯二甲酸二丁酯残留检测试剂盒

Info

Publication number: CN103257115A
Application number: CN2013101861107A
Authority: CN
Inventors: 赵静云; 魏晨曦
Original assignee: Huazhong Normal University
Current assignee: Huazhong Normal University
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明提供了一种检测邻苯二甲酸二丁酯残留量的试剂盒。该试剂盒包括：DBP标准品，包被抗原，包被缓冲液，封闭液，洗涤缓冲液，竞争反应液，DBP单抗，抗体稀释液，亲和素标记的羊抗小鼠IgG，过氧化物酶标记的亲和素，OPD底物显色液，终止液。该试剂盒成本低，检测速度快，本灵敏度高，检测限可达6.25ng/mL，可用于大批样品的现场快速筛选。

Description

邻苯二甲酸二丁酯残留检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种邻苯二甲酸二丁酯残留检测试剂盒和检测邻苯二甲酸二丁酯残留量的方法，属于生物检测领域。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯（DBP），又名酞酸二丁酯，属于邻苯二甲酸酯类（Phthalate,PAEs）化合物的一员。英文名Dibutyl phthalate，分子式C₁₆H₂₂O₄，分子量278.35。邻苯二甲酸二丁酯是一种无色无气味的油状液体。蒸汽压2.7×10^-5mmHg(25℃)，溶点-35℃，沸点340℃，闪点188℃，密度1.042g/cm³(20℃)。难溶于水，在水中溶解度为11.2mg/L(20℃)。

DBP是硝基纤维素漆的优良增塑剂，凝胶化能力强，有良好的软化作用，其稳定性、耐挠曲性、黏结性和防水性均优于其他增塑剂。也可作为聚氯乙烯（PVC）、聚醋酸乙烯、醇酸树脂、乙基纤维素及氯丁橡胶、丁腈橡胶的增塑剂。同时还是防沫剂、乳胶粘合剂以及纺织纤维润滑剂的工业原料,另外还可用作染料和杀虫剂的溶剂。这些材料广泛用于制造我们的日常生活用品，例如：塑料制品、油漆、胶水、驱虫剂、香水、发胶、指甲油等。

DBP可在其生产或掺入到塑料、粘合剂和染料的过程中释放到环境。另外由于DBP不与终产品共价结合，随着使用时间的推移，可不断地释出进入到空气。释放到环境中的DBP能够被庄稼等作物吸收和积累，从而进入食物链。除了常规暴露外，工人在生产DBP时可通过皮肤和吸入暴露，高剂量DBP的暴露源于频繁使用香水、发胶、洗发液和指甲油等个人护理用品。

DBP对啮齿动物急性毒性较低，口服给药其LD₅₀在g/kg范围内。但现有足够的实验数据说明大于350mg/kg bw/day DBP的口服摄入对成年大鼠和小鼠是有毒的。DBP会增加肝脏系数与肾脏系数，更高剂量DBP的饮食摄入会影响造血系统并造成肝和睾丸的损伤。

基于动物实验和调查研究的数据库，专家已确认DBP具有生殖和发育毒性。DBP能通过口服给药扰乱雄激素引起雄性大鼠生殖道畸形，这种抗雄激素机制的产生是通过影响睾酮的合成而不是对雄激素受体的拮抗作用。

美国环境保护署规定的DBP安全上限值为每天每公斤体重0.1毫克；欧盟认定DBP安全上限值是每天每公斤体重0.01毫克。2011年6月卫生部签发的551号文件《卫生部办公厅官员通报食品及食品添加剂中邻苯二甲酸酯类物质最大残留量的函》，这份文件规定DBP的最大残留量为0.3mg/kg。

我国国家标准规定的食品、食品塑料包装材料和玩具及儿童用品聚氯乙烯塑料PAEs含量检测方法是通过GC-MS，采用特征选择离子监测扫描模式检测，最低可检出0.05mg/kg DBP。

Jen和Liu利用20cm聚砜中空透析纤维柱对PAEs样品进行微透析浓缩，以40%-90%水合乙腈（pH6.0）作为洗脱剂，通过C₁₈柱HPLC分离，紫外检测仪于225nm收集检测信号，最低可检出0.4μg/L DBP。

Toyoda等人采用单克隆抗体首次将人工抗原包被间接竞争ELISA用于检测DBP等环境内分泌干扰物，但检测的灵敏度不够高，对DBP的最低检测限>100μg/L。

目前国内外对DBP的监测方法主要是色谱法，但色谱法对仪器条件要求高，前处理操作相对复杂、耗时。现已有基于多克隆抗体的DBP免疫检测研究，但多克隆抗体的制备受动物免疫时间、免疫批次限制而不能无限量生产。为了更好测定DBP在环境中的污染水平以及评价暴露于DBP产生的潜在不利影响，必须建立一种快速、简便、灵敏、费用低廉的方法检测DBP在环境及生活用品中的残留量。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种快速、简便检测邻苯二甲酸二丁酯在环境中残留量的方法。

本发明中，所述试剂盒包括：

DBP标准品:1mg/mL；包被抗原DBAP-BSA：1μg/mL；包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，称取Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，用1000mL蒸馏水定容；封闭液：5%的SMP，称5g脱脂奶粉用，100mL PBS定容；洗涤缓冲液：含0.05%Tween-20的PBS，1000mLPBS中加0.5mL Tween-20；竞争反应液:含10%DMF，1.6%NaCl，0.02%KCl的0.01mol/L pH6.8的PBS；DBP单抗：1.4mg/mL；抗体稀释液：含0.1%BSA的PBS，100mLPBS中加0.1gBSA；亲和素标记的羊抗小鼠IgG；过氧化物酶标记的亲和素；OPD底物显色液：邻苯二胺（OPD）4mg,0.2mol/L Na₂HPO₄2.57mL，0.1mol/L柠檬酸2.43mL，dH₂O4mL，30%H₂O₂4μL；终止液：2mol/L H₂SO₄。

所述DBAP为4-氨基邻苯二甲酸二丁酯。

使用上述试剂盒检测邻苯二甲酸二丁酯残留量的方法，如下：

标准曲线的制作：

1、酶标板包被DBAP-BSA,用包被缓冲液稀释为0.5μg/mL，100μL/孔（空白孔A₀加100μL包被缓冲液)，4℃过夜。

2、酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，每孔加入250μL封闭液，37℃封闭1小时。

3、酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加入不同浓度的DBP标准品（用竞争反应液稀释为2000ng/mL到3.9ng/mL共11个梯度）50μL，再加入50μL邻苯二甲酸二丁酯单抗（用抗体稀释液稀释4000倍），另设阳性对照孔A（50μL抗体稀释液+50μLDBP抗体），25℃孵育1.5小时。

4、酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加入亲和素标记的羊抗小鼠IgG（用抗体稀释液稀释10000倍）100μL，37℃孵育1小时。

5、酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加入过氧化物酶标记的亲和素（用抗体稀释液稀释1000倍）50μL，37℃孵育30分钟。

6、酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加OPD显色液100μL室温避光20分钟。

7、每孔加入50μL终止液，用酶标仪测定492nm处吸光度。

以邻苯二甲酸二丁酯浓度的自然对数ln[c]为横坐标（X），对应的抑制率I为纵坐标（Y），可得一条Y=a+bX直线，根据测得样品吸光值计算出抑制率，代入直线中，可得X，取反对数，即可知样品中邻苯二甲酸二丁酯的浓度。

抑制率I按公式

计算。其中A为阳性对照孔吸光值，A_i为含有浓度i的DBP孔的吸光值，A₀为空白孔的吸光值。

样品的测定：

样品测定步骤与标准曲线制作步骤相同，将DBP标准品用待测样品替代即可，测得吸光值与样品中的邻苯二甲酸二丁酯的浓度成反比，对照标准曲线即可确定待测样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量。

由于采用上述技术方案，本发明的有益效果在于：

1、建立了环境样品中邻苯二甲酸二丁酯的检测方法，比色谱法简便、快速，利于推广。

2、本方法具有简单、快速、准确、高效等优点，邻苯二甲酸二丁酯的检出限为6.25ng/mL，满足国内外相关法规的要求。

3、本发明可以用于环境样品中邻苯二甲酸二丁酯残留量的检测，对保障环境安全，人类健康都具有十分重要的意义。

附图说明

图1DBP检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1日常消费品中DBP含量测定

1、样品前处理：将食品保鲜袋和一次性塑料杯剪成0.5cm²的碎片，称取0.5gX牌指甲油称取0.5g，分别加5mL乙腈于带塞玻璃试管中抽提过夜。取3mL抽提液减压蒸馏除去乙腈，残余物用1～2mL竞争反应液溶解，分装后-20℃保存。

2、将包被抗原DBAP-BSA用包被缓冲液稀释至0.5μg/mL，100μL/孔包被酶标板（空白对照孔A₀加100μL包被缓冲液），4℃过夜。

3、酶标板用洗涤液洗涤3次，每孔加入250μL封闭液，37℃孵育1小时。

4、酶标板用洗涤液洗涤3次，加入不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯（用抗体稀释液从2000μg/mL梯度稀释到3.9μg/mL）和检测样品50μL，再加入最佳工作浓度抗体邻苯二甲酸二丁酯抗体50μL，另设阳性对照孔A（50μL抗体稀释液+50μL最佳工作浓度抗体），25℃孵育1.5小时。

5、酶标板用洗涤液洗涤3次，加入亲和素标记的羊抗小鼠IgG（抗体稀释液1:10000稀释）100μL，37℃孵育1小时。

6、酶标板用洗涤液洗涤3次，用抗体稀释液将过氧化物酶标记的亲和素1:1000稀释后，100μL/孔加入酶标板，37℃孵育30分钟。

7、酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加OPD显色液100μL室温避光20分钟。

8、每孔加50μL终止液，终止反应，用酶标仪测定492nm处的吸光值。

以邻苯二甲酸二丁酯浓度的自然对数ln[c]为横坐标（X），对应的抑制率I为纵坐标（Y），可得一条Y=a+bX直线，如图1所示。根据测得样品吸光值计算出抑制率Y，代入直线中，可得X，取反对数，即可知样品中邻苯二甲酸二丁酯的浓度。

抑制率I按公式

上述三中生活用品的检出值分别为：食品保鲜袋1.6±0.22，一次性塑料杯1.91±0.21，X牌指甲油0.43±0.03mg/kg。

Claims

1.一种邻苯二甲酸二丁酯残留检测试剂盒，其特征在于包括如下试剂： DBP标准品:1mg/mL；包被抗原DBAP-BSA：1μg/mL；包被缓冲液：0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液；封闭液：5%的SMP；洗涤缓冲液：含0.05% Tween-20的PBS；竞争反应液:含10%DMF，1.6%NaCl，0.02%KCl的0.01mol/L pH6.8的PBS；DBP单抗：1.4mg/mL；抗体稀释液：含0.1% BSA的PBS；亲和素标记的羊抗小鼠IgG；过氧化物酶标记的亲和素；OPD底物显色液；终止液。

2.使用权利要求1所述试剂盒检测邻苯二甲酸二丁酯残留量的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）酶标板包被DBAP-BSA,用包被缓冲液稀释为0.5 μg/mL，100 μL/孔，4℃过夜；

2）酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，每孔加入250 μL封闭液，37℃封闭1小时；

3）酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加入不同浓度的DBP标准品50μL，再加入50 μL邻苯二甲酸二丁酯单抗，另设阳性对照孔A，25℃孵育1.5小时；

4）酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加入亲和素标记的羊抗小鼠IgG100 μL，37℃孵育1小时；

5）酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加入过氧化物酶标记的亲和素50μL，37℃孵育30分钟；

6）酶标板用洗涤缓冲液洗涤3次，加OPD显色液100μL室温避光20分钟；

7）每孔加入50μL终止液，用酶标仪测定492nm处标准品的吸光度，根据测得标准品吸光度计算出抑制率，以邻苯二甲酸二丁酯浓度的自然对数为横坐标，对应的抑制率I为纵坐标，制作标准曲线；

8）测得待测样品吸光度，对照标准曲线即可确定待测样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量。