CN103405783A - OX26/CTX-PL/pC27复合物及其在治疗神经胶质瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OX26/CTX-PL/pC27复合物及其在治疗神经胶质瘤中的应用。本发明所述OX26/CTX-PL/pC27复合物全称为OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物，是以转铁蛋白蛋白受体抗体OX26和CTX作为靶向修饰的配体，以hTERTC27作为神经胶质瘤的治疗基因，以PEG化脂质体作为载体骨架得到的纳米基因载体。该载体可以用于制备治疗神经胶质瘤的药物，既可以透过血脑屏障，同时对神经胶质瘤具有靶向性作用，安全有效的治疗神经胶质瘤。
Description
技术领域
本发明涉及纳米基因载体领域，具体涉及一种既可以通过血脑屏障，又能靶向作用于神经胶质瘤的纳米基因载体OX26/CTX-PL/pC27复合物及其构建方法和应用。
背景技术
神经胶质瘤（glioma）是最常见的原发性颅内肿瘤，其年发病率为十万分之六。尽管近30年来在胶质瘤手术、化疗与放疗方面取得很大的进步，但恶性胶质瘤患者的中位生存期只有14.6个月。因此，神经胶质瘤的临床治疗仍是一个需要研究和探索的难题。
神经胶质瘤治疗失败的一个重要原因是抗肿瘤药物难以通过血脑屏障到达脑实质。而传统的基因载体，包括纳米载体，不具有透过血脑屏障的能力，这严重限制了基因治疗在胶质瘤中的应用。为实现基因治疗神经胶质瘤，有人采用脑内局部注射法，但局部注射为有创性，治疗往往需要反复给药，且药物作用也局限于注射部位附近，所以该方法在临床应用中有一定困难。因此，研究者们一直在寻找可以通过静脉给药途径进入脑的基因载体。
现有的研究中，虽然已经有靶向纳米载体的开发应用研究，比如免疫脂质体，靶向修饰的PEG化的PAMAM树状高分子等，但脑胶质瘤靶向作用也仅限于通过血脑屏障，从而实现目的基因在脑内肿瘤细胞和非肿瘤细胞中广泛表达。再者，更多的纳米载体倾向于对化疗药物，如阿霉素，紫杉醇等传统药物的脑靶向递送，靶向纳米基因载体的研究少见。
脂质体作为有效的基因递送载体，经静脉注射后很快被循环中的单核巨噬细胞系统清除；而PEG外壳能降低血清蛋白调理作用，增加脂质体在循环中的稳定性，延长循环时间。血脑屏障内皮细胞表达丰富的特异性受体，其中转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）特异性的单克隆抗体OX26可通过受体介导的跨细胞转运通过血脑屏障。氯毒素（chlorotoxin，CTX）是具有36个氨基酸分子量为4k Da的小分子肽，对非脊椎动物有剧毒，但对哺乳动物是无毒的。能与一系列来源于神经外胚层的癌细胞结合，而这种结合依赖于细胞膜表面的基质金属蛋白酶2（MMP-2）。以上PEG化脂质体、OX26和CTX的特性已经在其他体外和体内研究中得到证实。
hTERTC27是人端粒酶逆转录酶（hTERT）的C端的27kD的多肽，85％以上的人肿瘤组织中都有端粒酶活性的表达，而与肿瘤相邻的正常组织或良性病变很少表达。hTERTC27可造成端粒功能紊乱和分裂后期的染色体末端融合，已经证实hTERTC27具有良好的抑瘤作用。
发明内容
本发明的目的在于根据目前用于治疗神经胶质瘤的药物难以通过血脑屏障、脑内局部注射法在临床应用中存在困难等诸多缺陷，提供一种可以通过静脉给药的、既可以透过血脑屏障，又对神经胶质瘤具有靶向性作用的OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物，该复合物可以安全有效的治疗神经胶质瘤。
本发明另一目的在于提供上述OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物的构建方法。
本发明还有一个目的在于提供上述OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/ pC27复合物在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物（又称OX26/CTX-PL/pC27），是以转铁蛋白蛋白受体抗体OX26和CTX作为靶向修饰的配体，以hTERTC27作为神经胶质瘤的治疗基因，以PEG化脂质体作为载体骨架得到的纳米基因载体。
上述OX26/CTX-PL/pC27复合物的构建是本发明的关键。要将OX26和CTX以适当的比例成功地连接于PEG末端形成稳定的复合载体，并要控制其粒径在合适范围，所以需要对反应条件进行摸索，还要对脂质体的处方工艺进行优化筛选，找出最适合的反应配比、浓度、温度和时间等。最终通过反向蒸发法合成了平均粒径约120nm，PDI为0.2和平均zeta电势为12.8mv的双靶向基因载体复合物。该复合物有较高的包封率，适宜的配体蛋白偶联率，表明所制备的复合物具备了较理想的体外指标，为其后续的体内外研究奠定了基础。
要实现成功的靶向基因递送，载体本身的物理特性尤为关键。脾血窦内皮细胞之间有200～500nm宽的间隙，纳米载体要么足够小，要么变形性强，才能避免被脾脏巨噬细胞清除。还有报道指出，平均粒径100nm的纳米粒具有延长的血循环时间和相对低的单核巨噬细胞摄取率。本发明中所述纳米载体复合物的平均粒径约为120nm，这种粒径大小符合体内循环和相关报道的要求。延长的血循环时间使得更多的纳米粒到达脑，从而使更多的治疗基因有机会通过血脑屏障，靶向作用于神经胶质瘤。
综上所述，本发明OX26/CTX-PL/pC27复合物的构建方法包括如下步骤：
（1）称取25.1mg大豆卵磷脂S100、19.9mg DC-chol、10.5mg聚乙二醇- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、8.8mg马来酰亚胺-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，用三氯甲烷溶解后，于室温下旋转蒸发使形成均匀的薄膜；
（2）用20ml三氯甲烷复溶，加入1ml含有质粒pEGFP0.5mg或pC270.5mg的pH7.4磷酸缓冲液，涡旋5min，于10℃下超声5min，再于30℃旋转蒸发至形成凝胶，继续旋转蒸发，至转相完全，形成透明的、有乳光的水相；
（3）依次过0.45μm、0.22μm的聚碳酸酯膜各4次，分别制得载有pEGFP和pC27的脂质体，分别标记为PL/pEGFP和PL/pC27；
（4）OX26和CTX分别用硼酸缓冲液溶解，再分别与2-亚氨基硫烷盐酸盐混合均匀，OX26/CTX与2-亚氨基硫烷盐酸盐的摩尔比为1:100，室温条件下反应1h；将反应体系转移至离心超滤管，采用14000rpm进行离心浓缩，再加pH8.0磷酸缓冲液离心，除去多余的2-亚氨基硫烷盐酸盐，将浓缩的巯基化的OX26-SH、CTX-SH与脂质体进行偶联反应；
（5）在弱碱性条件下，将巯基化合物OX26-SH、CTX-SH以及这两种巯基化物的物理混合物分别与脂质体PL/pEGFP和PL/pC27孵育过夜，肽与磷脂质量比为1:20，将脂质体与巯基化蛋白混合液采用琼脂糖凝胶填料sepharoseCL-4B进行分离，除去未反应的巯基化蛋白，洗脱液为0.001M磷酸缓冲液，洗脱顺序为脂质体组分、游离的巯基化蛋白；先洗脱下来的带有乳光的体系，即为OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物（OX26/CTX-PL/pC27复合物）。
本发明OX26/CTX-PL/pC27复合物能够成功跨过血脑屏障，并通过CTX与MMP-2相互作用实现肿瘤靶向效应，从而发挥双靶向的神经胶质瘤治疗效应，因此所述OX26/CTX-PL/pC27复合物可以用于制备治疗神经胶质瘤的药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供了一种新型的具有双靶向功能的纳米基因载体OX26/CTX-PL/pC27复合物，低毒的载体复合物表现出良好的神经胶质瘤治疗效果，给神经胶质瘤患者带来了希望；
（2）本发明使用脂质体作为载体骨架，脂质体与细胞膜的相似性决定了载体复合物具有良好的生物相容性；
（3）本发明OX26/CTX-PL/pC27复合物与现有的神经胶质瘤靶向研究相比，双靶向递送为其突出特征，既可通过主动靶向作用跨过血脑屏障，又可靶向作用于脑胶质瘤，减少了目的基因在其他细胞中非特异性表达，提高了药物利用率；
（4）本发明采用静脉注射给药途径符合纳米载体的发展方向，避免了脑内局部注射的创伤，方便临床推广应用；
（5）本发明首次将PEG化的脂质体、双靶向效应、基因治疗和静脉给药有机结合，实现了神经胶质瘤非侵入靶向治疗新的突破。
附图说明
图1为旋转蒸发温度对脂质体复合物粒径的影响；
图2为超声温度及超声时间对脂质体复合物粒径的影响；
图3为靶向PL/pDNA复合物（包括PL/pC27和PL/pEGFP两种复合物）合成示意图，其中，(A)OX26或CTX与Traut’s试剂室温孵育1小时合成巯基化的OX26或CTX；(B)PL/pDNA外部的马来酰亚胺基团与巯基化的OX26和CTX反应生成靶向PL/pDNA复合物；
图4为DC-chol与pEGFP(A)或pC27(B)质量比对PL/pDNA复合物粒径大小及 zeta电势的影响；
图5为OX26/CTX-PL/pC27的透射电镜成像，标尺为100nm;
图6为不同处理组大鼠脑的横断面照片，其中，(A)假手术组(未建模和给药)；(B)PBS对照组；(C)OX26/CTX-PL/pEGFP对照组；(D)PL/pC27组；(E)OX26-PL/pC27组；(F)OX26/CTX-PL/pC27组；箭头所指为肿瘤；
图7为同处理组荷C6胶质瘤大鼠肿瘤体积，数值以均数±标准差(n=6)，*和**分别表示与OX26/CTX-PL/pEGFP组相比p>0.05和p<0.01；
图8为用PBS，OX26/CTX-PL/pEGFP，PL/pC27，OX26-PL/pC27和OX26/CTX-PL/pC27复合物处理后的C6胶质瘤荷瘤大鼠的K-M生存曲线；
图9为C6胶质瘤荷瘤大鼠脑组织HE染色(A1～F1)和免疫组化分析(A2～F2)(×400)，其中，A(A1,A2)：正常脑组织；B(B1,B2)：PBS对照组；C(C1,C2)：OX26/CTX-PL/pEGFP组；D(D1,D2)：PL/pC27组；E(E1,E2)：OX26-PL/pC27组；F(F1,F2)：OX26/CTX-PL/pC27组。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
以下实施例中所提到的药物、设备或器材，如无特别说明，均为本领域技术人员常用的药物、设备或器材。
各实施例中所用到的实验动物为成年Wistar雄性大鼠，体重250～280g，购自中山大学实验动物中心。动物在SPF（specific pathogen free）级、每12小时明暗交替的环境饲养，室温25℃，水和饲料均充足。
实施例1双靶向基因载体复合物的构建
1)脂质体复合物制备工艺的研究
采用反相蒸发法制备包载pC27的脂质体复合物，分别考察旋转蒸发时温度（20℃、30℃和40℃）、超声温度（4℃、10℃和20℃）、超声时间（2min、5min和10min）、溶剂种类（乙醚、乙酸乙酯及三氯甲烷）等处方工艺因素对阳离子脂质体粒径的影响。结果（见图1，2）表明，旋转蒸发时的温度对脂质体粒径影响不大，但是温度太高易导致旋转蒸发过程中溶液起泡，影响铺膜质量，因此选择旋转蒸发的温度为30℃；超声温度为4℃时油水两相不能充分混匀，10℃和20℃均能制得较好的脂质体，但由于温度较高对于磷脂稳定性有不良影响，因此选择10℃的超声条件；超声时间在5min以上时，所得脂质体粒径差异不大，因此选择超声时间为5min。溶剂为乙醚和乙酸乙酯时，不能跟水形成均一的乳状液，因此选择三氯甲烷为溶剂。根据上述结果，确定最佳工艺条件为：旋转蒸发的溶剂为三氯甲烷；旋转蒸发时温度为30℃；超声温度为10℃；超声时间为5min。
2）脂质体复合物的处方筛选
主要考察了脂质膜材DC-chol〔胆甾烯基-3β-N-(二甲氨基乙基)氨基甲酸酯盐酸盐〕与质粒DNA的比例对脂质体粒径和电位的影响。方法为固定磷脂和质粒DNA的用量，分别制备含有不同质量比的DC-chol脂质体，分别测定其粒径和电位。结果（见图4）表明，与空白脂质体粒径相比较，包载质粒的脂质体粒径随DC-chol与DNA比例的增加而出现波动，当比例提高至6:1以上时，粒径变化趋于不明显。非靶向脂质体的zeta电位由于带正电荷的DC-chol的存在，一般均为正值，随DC-chol/DNA比值增加，脂质体的zeta电位增大，当二者比例超过4:1时，zeta电位的增加趋于平缓。结合粒径与zeta电位的变 化关系，当DC-chol与质粒质量比超过6:1时，对粒径和zeta电位的影响相对较小，因此确定DC-chol与质粒的质量比不低于6:1。
3）OX26/CTX-PL/pC27的合成及特征
我们采用反相蒸发法制备脂质体复合物：精密称取25.1mg S100-PC(大豆卵磷脂S100)，19.9mg DC-chol，10.5mg DSPE-PEG(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，8.8mg Mal-PEG2000-DSPE(马来酰亚胺-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，用适量的三氯甲烷溶解后，于室温下旋转蒸发使形成均匀的薄膜；然后用20ml三氯甲烷复溶，加入1ml含有质粒pEGFP0.5mg或pC270.5mg的PBS（磷酸缓冲液,pH7.4），涡旋5min，再于10℃下超声5min。于30℃旋转蒸发至形成凝胶，继续旋转蒸发，至转相完全，形成透明的、有乳光的水相。依次过0.45μm、0.22μm的聚碳酸酯膜各4次，分别制得载有pEGFP和pC27的脂质体，分别标记为PL/pEGFP和PL/pC27。
OX26和CTX分别用硼酸缓冲液[0.15M硼酸钠+0.1mM EDTA﹙乙二胺四乙酸﹚，pH8.5]溶解，再分别与2-IT（2-Iminothiolane hydrochloride,2-亚氨基硫烷盐酸盐）混合均匀（OX26/CTX与2-IT的摩尔比为1:100），室温条件下反应1h；将反应体系转移至离心超滤管，采用14000rpm进行离心浓缩，再加少量的PBS（pH8.0）离心，除去多余的2-IT，将浓缩的巯基化的蛋白（OX26-SH、CTX-SH）与脂质体进行偶联反应。
在弱碱性条件下，将上述所制备的巯基化合物OX26-SH、CTX-SH以及这两种巯基化物的物理混合物（即OX26-SH和CTX-SH），分别与上述脂质体PL/pEGFP和PL/pC27孵育过夜（肽与磷脂质量比为1:20），将脂质体与巯基化蛋白混合液采用琼脂糖凝胶填料（sepharose CL-4B）进行分离，除去未反应的 巯基化蛋白，洗脱液为0.001M PBS，洗脱顺序为脂质体组分、游离的巯基化蛋白，将先洗脱下来的带有乳光的体系，即为偶联OX26的单靶向脂质体复合物（OX26-PL/pEGFP和OX26-PL/pC27）或偶联了OX26+CTX的双靶向脂质体复合物（OX26/CTX-PL/pEGFP和OX26/CTX-PL/pC27）。
脂质体复合物的粒径和zeta电位均采用激光散射粒度分析仪进行测定。测定条件为：测定温度设置为25℃，散射角为90°，取脂质体样品，测定前用0.45μm微孔滤膜过滤除去大颗粒，用去离子水稀释至适宜浓度后，分别加入样品池，每个样品重复测定3次。
测定脂质体中质粒DNA的包封率，需先将包封入脂质体中的质粒DNA和未包封的游离质粒DNA进行分离，通过测定游离的质粒DNA量以及加入的总量，计算出质粒DNA的包封率。具体方法为：采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱分离脂质体和未包封的游离质粒DNA。以pH7.4的PBS为洗脱剂进行洗脱，每管收集洗脱液0.5ml。除有浑浊的洗脱液外，其余洗脱液逐管进行测定，采用分光光度法于260nm波长处测定其吸收度值。另分别精密称取两种质粒DNA适量，以PBS（pH7.4）为溶剂，溶解并定量稀释成系列浓度的标准溶液，分别测定其260nm波长处吸收度值，以吸收度值对质粒浓度进行线性拟合，得两种质粒DNA的标准曲线方程，分别为：A=0.0215C+0.021，（γ2=0.9976）（质粒pEGFP）和A=0.0204C+0.0089（γ2=0.9987）（质粒pC27）。依据标准曲线方程，计算出每管洗脱液中质粒DNA浓度；根据测定结果，将含有游离质粒的洗脱液样品合并，稀释至适宜浓度后，测定其吸收度值，依据标准曲线方程计算出游离质粒DNA的量，并采用以下公式计算包封率（encapsulation efficiency，EE）：EE=(1-游离量/加入量)×100%。
采用柱色谱分离法，以琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B为填料，以PBS为洗脱剂，将脂质体与未偶联到脂质体上的游离蛋白分开；采用分光光度法测定洗脱液中蛋白OX26以及CTX浓度。其中OX26浓度采用蛋白定量试剂盒测定。根据使用说明书制定的操作，精密称取BSA（牛血清白蛋白）标准品（
蛋白定量试剂盒中指定的试剂），用试剂盒指定的稀释剂进行稀释，得系列浓度（0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml）的标准溶液，激发波长和发射波长分别设定为470nm和570nm，测定荧光强度，以荧光强度对浓度进行线性拟合，得标准曲线方程为A=289.15C-13.611（γ2=0.9972），可见BSA浓度在0.1μg/ml～1μg/ml范围内线性关系良好。依据上述标准曲线方程计算出蛋白OX26和CTX浓度，并进一步计算出偶联率：偶联率=（蛋白分子总加入量-游离蛋白量）/蛋白分子总加入量×100%。
实验结果：
1.粒径和zeta电位是脂质体和其他纳米体系的重要体外评价指标。一般来说，粒子的粒径越小，其聚集沉降的速度越慢，物理稳定性越好；粒子表面的zeta电位为零时，粒子容易发生聚集沉降，而当粒子表面带有一定量的正电荷或负电荷时，粒子间产生较大的静电排斥力，可使粒子保持较高的稳定性。本实施例中所制备的免疫脂质体粒径和zeta电位测定结果见表1。
表1脂质体复合物粒径和zeta电位检测
*与含相同质粒DNA的PEG化脂质体复合物相比，均数差异无统计学意义（p>0.05）。
由上述测定结果可知，采用反相蒸发法制得的各种脂质体粒径在120nm左右，PDI（polydispersity index，多分散指数）约为0.2，说明其粒径较小，分布较窄；所有样品粒子表面均带正电荷，通过相反电荷的静电吸引作用，保证了对荷负电的质粒有较高的包封率，通过粒子间相同电荷的静电排斥力，使体系有良好的物理稳定性。与未偶联配体的脂质体复合物相比，单独偶联了OX26，以及偶联了OX26和CTX的脂质体复合物的粒径、PDI和zeta电位均无显著变化。该结果也说明偶联配体后的脂质体粒径及分布、zeta电位的变化在可控范围内。
此外，本研究中还采用透射电镜法观察了脂质体复合物的粒子大小及形态。由结果（图5）可知，脂质体粒子近似球形，未见粒子聚集，粒径与动态光散射法测定结果基本一致。
采用柱分离法测定脂质体的包封率，其质粒洗脱峰与脂质体洗脱峰可以完全分离。未偶联配体的脂质体复合物及偶联配体的脂质体复合物包封率测定结果（表2）显示，由于脂质体膜材中有荷正电的材料DC-chol，与荷负电的质粒之间发生静电吸引作用，使各脂质体复合物均具有较高的包封率。OX26在OX26-PL/pC27和OX26/CTX-PL/pC27中的偶联率分别为40.4±5.1%和35.4±3.8%，CTX在CTX-PL/pC27和OX26/CTX-PL/pC27中的偶联率分别为44.9±6.1%和42.5±5.5%。在OX26和CTX的偶联反应中无明显的相互作用。
表2不同组成的PEG化脂质体复合物包封率检测
结论：实施例1中，首先制备了包载质粒的脂质体复合物，对其进行了处方筛选及工艺条件考察；在此基础上，以抗体蛋白为配体，对上述脂质体进行表面修饰，从而得到靶向脂质体复合物。分别检测了不同组成的脂质体复合物粒径及分布、zeta电位、包封率和蛋白偶联率，结果表明所有脂质体粒径分布较窄，平均粒径为120nm左右，zeta电位在10mV左右，包封率较高，有适宜的配体蛋白偶联率，表明所制备的免疫脂质体具备了较理想的体外指标，为其后续的体内外研究奠定了基础。
实施例2OX26/CTX-PL/pC27对荷胶质瘤大鼠的治疗效果评价
实验动物的分组：动物随机分为5组，每组15只：（1）PBS对照组；(2)OX26/CTX-PL/pEGFP处理组；(3)PL/pC27处理组；（4）OX26-PL/pC27处理组和（5）OX26/CTX-PL/pC27处理组。
大鼠原位脑胶质瘤模型建立：用10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉Wistar大鼠后，将大鼠头部固定在脑立体定位仪上。根据大鼠头部立体定向解剖图谱确定右尾状核为靶点，于冠状缝后1mm，中线右旁开3mm，用牙科钻先钻一小孔，然后再立体定位仪引导下，50μl微量注射器抽取C6细胞悬液10μl（1×106个细胞），沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下6mm，再退回1mm。缓慢注射10分钟，注射完毕后留针5min，缓慢拔针，之后用骨蜡封闭骨孔，4号缝线缝合切口。
移植后第3天，分别用PBS，OX26/CTX-PL/pEGFP，PL/pC27，OX26-PL/pC27和OX26/CTX-PL/pC27复合物溶液处理各组大鼠。采用尾静脉注射的给药方式，每3天给药一次，每次剂量为含40μg质粒DNA的复合物，共给予5次，分别为移植后第3天，第6天，第9天，第12天和第15天。移植后第18天，从每组中取6只大鼠，灌注固定，取脑后沿大鼠脑表面的接种穿刺点做冠状切开，观察各组肿瘤生长情况，并按公式：肿瘤体积=a2×b×π/6(a为肿瘤短径，b为肿瘤长径)测量肿瘤大小。剩余动物用来观察其生存期并做K-M生存曲线分析。
取脑并统计出肿瘤大小后，脑组织用石蜡包埋做成蜡块，连续冠状切片，厚3～5mm，每隔四张切片取一张，每个标本取切片12张，10张行免疫组化检测，两张做HE(苏木素-伊红)染色。按照HE染色试剂盒说明书：切片脱蜡至水，苏木素染色液浸染10min，自来水洗10min，蒸馏水洗涤3s，95%乙醇5s，伊红染色液浸染30s～2min，脱水，透明，中性树胶封片。免疫组化检测时，切片常规脱蜡至水；高压锅抗原修复：先将Tris/EDTA（氨基丁三醇-乙二胺四乙酸）缓冲液加热至沸腾，将切片浸入缓冲液后，沸腾状态4分钟高压修复，然后自然冷却至室温；PBS清洗5min×3次；切片入3%H2O2（过氧化氢）溶液浸泡15min，消除内源性过氧化物酶；PBS清洗5min×3次；用10%正常山羊血清室温封闭10min；滴加抗端粒酶逆转录酶抗体（1:100），4℃孵育过夜；PBS清洗5min×3次；滴加HRP(辣根过氧化物酶)标记二抗，37℃孵育30min；PBS清洗5min×4次；新鲜配制DAB(二氨基联苯胺)，滴加显色；浸水终止显色，苏木素复染50s；流水冲洗，晾干，中性树胶封片。用染色强度和染色阳性细胞数评价hTERTC27免疫组化染色：染色强度分为弱（1+），中（2+），强（3+）；染色阳性细胞数分为5个等级：0%（0），<10%(1),10～50%(2),51～80%(3),>80%(4)。染色强度得 分×染色阳性细胞数得分为最终的免疫组化总分。
实验结果：
1.各处理组平均肿瘤体积变化
在C6胶质瘤移植后第3天开始，不同处理组分别静脉给予PBS，OX26/CTX-PL/pEGFP，PL/pC27，OX26-PL/pC27和OX26/CTX-PL/pC27。其中每次量中含质粒DNA40μg，PBS对照组给予相同体积的PBS。在移植后第18天平均肿瘤体积分别为:PBS对照组53.61±3.71mm3,OX26/CTX-PL/pEGFP处理组47.1±3.02mm3,PL/C27处理组44.87±3.12mm3,OX26-PL/pC27处理组33.49±2.83mm3及OX26/CTX-PL/pC27处理组18.81±6.15mm3。与PBS组，OX26/CTX-PL/pEGFP组，PL/pC27组及OX26-PL/pC27组相比，OX26/CTX-PL/pC27能显著缩小肿瘤体积；相反，OX26/CTX-PL/pEGFP与PBS组相比，P>0.05,没有显示出对肿瘤的抑制效应。由此说明，对肿瘤的抑制是通过hTERTC27来发挥作用的，且双靶向修饰的载体系统表现出了更好的肿瘤治疗效果。
2.各处理组生存曲线变化
对荷瘤大鼠的疗效观察也能从大鼠的K-M生存曲线中得以反应。OX26/CTX-PL/pC27处理组46天的中位生存期较PBS组（13天，p=0.000），OX26/CTX-PL/pEGFP处理组（14天，p=0.000），PL/pC27处理组（21天，p=0.002）和OX26-PL/pC27处理组（29天，p=0.038）明显延长。
3.HE染色和IHC(免疫组织化学)分析
瘤细胞胞浆丰富，核大，形状不规则，核深染，部分可见大核仁。在OX26-PL/pC27处理组，大部分胞浆内可见空泡形成，有时可见小的散在坏死灶； 而在OX26/CTX-PL/pC27处理组，在空泡形成的基础上，可见明显的凋亡小体、核碎片及大片坏死灶。IHC研究进一步证实了hTERTC27蛋白在肿瘤细胞中的表达：在PL/pC27，OX26-PL/pC27和OX26/CTX-PL/pC27处理组，hTERTC27分布于整个细胞，但主要分布于细胞核，得分分别为1.33±0.58,7.33±1.16和11.00±1.73。OX26/CTX-PL/pC27处理组得分明显高于PL/pC27（p<0.01）和OX26-PL/pC27（p=0.034）。
结论：OX26/CTX-PL/pC27对荷胶质瘤大鼠疗效实验证实了其体内的双靶向效应。结果显示，OX26-PL/pC27能够改善对荷瘤大鼠的治疗效果，而具有双靶向作用的OX26/CTX-PL/pC27能产生最显著的肿瘤抑制和最明显的中位生存期延长。组织病理和免疫组化分析进一步揭示了治疗效应来自于双靶向效应导致的hTERTC27蛋白在肿瘤细胞中的高表达。
Claims (3)
1.OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物，其特征在于是以转铁蛋白蛋白受体抗体OX26穿透血脑屏障和CTX作为胶质瘤靶向修饰的双配体修饰，以hTERTC27作为神经胶质瘤的治疗基因，以PEG化脂质体作为载体骨架得到的纳米基因载体。
2.权利要求1所述的OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）称取25.1mg大豆卵磷脂S100、19.9mg DC-chol、10.5mg聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、8.8mg马来酰亚胺-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，用三氯甲烷溶解后，于室温下旋转蒸发使形成均匀的薄膜；
（2）用20ml三氯甲烷复溶，加入1ml含有质粒pEGFP0.5mg或pC270.5mg的pH7.4磷酸缓冲液，涡旋5min，于10℃下超声5min，再于30℃旋转蒸发至形成凝胶，继续旋转蒸发，至转相完全，形成透明的、有乳光的水相；
（3）依次过0.45μm、0.22μm的聚碳酸酯膜各4次，分别制得载有pEGFP和pC27的脂质体，分别标记为PL/pEGFP和PL/pC27；
（4）OX26和CTX分别用硼酸缓冲液溶解，再分别与2-亚氨基硫烷盐酸盐混合均匀，OX26/CTX与2-亚氨基硫烷盐酸盐的摩尔比为1:100，室温条件下反应1h；将反应体系转移至离心超滤管，采用14000rpm进行离心浓缩，再加pH8.0磷酸缓冲液离心，除去多余的2-亚氨基硫烷盐酸盐，将浓缩的巯基化的OX26-SH、CTX-SH与脂质体进行偶联反应；
（5）在弱碱性条件下，将巯基化合物OX26-SH、CTX-SH以及这两种巯基化物的物理混合物分别与脂质体PL/pEGFP和PL/pC27孵育过夜，肽与磷脂质量比为1:20，将脂质体与巯基化蛋白混合液采用琼脂糖凝胶填料sepharoseCL-4B进行分离，除去未反应的巯基化蛋白，洗脱液为0.001M磷酸缓冲液，洗脱顺序为脂质体组分、游离的巯基化蛋白；先洗脱下来的带有乳光的体系，即为OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物。
3.权利要求1所述OX26/CTX偶联的PEG化的脂质体/pC27复合物在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。
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