KR101722827B1 - 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자 항암제 및 그의 제조방법 - Google Patents

하이드록시 라디칼 생성유도 고분자 항암제 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자에 관한 것으로, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체로 치환된 폴리(β-아미노 에스터), 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체로 치환된 폴리(아미도 아민) 또는 이들의 공중합체와, 친수성을 갖는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을 공중합시킴으로써 마이셀 형성을 가능하게 하였다. 마이셀의 구조는 pH 변화에 민감하게 반응하여 약산성의 암 조직 주변 환경 하에서 아세탈 결합이 끊어지면서 붕괴되고, 마이셀 내부에 포접되어 고분자 주사슬에 결합되어 있던 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 방출된다. 산성조건 하에서 신남알데하이드 유도체는 과산화수소를 생성하고 아미노 메탈로센 유도체가 과산화수소와 반응하여 독성이 높은 하이드록실 라디칼을 생성하여 암세포를 자멸화시킨다. 이로써 기존의 생분해성 고분자를 이용한 약물전달체와 달리 본 연구에서는 고분자 자체가 치료약물로 사용이 가능하고, 마이셀 구조를 통하여 다른 약물을 포접할 수 있으며 암 부위에만 특이적으로 축적되는 능력을 지니고 있다. 그렇기 때문에 정상세포에 미치는 독성을 최소화하는 효과를 가지는 한편, 과산화수소 생성을 유도하는 신남알데하이드 유도체와 하이드록실 라디칼을 생성하는 아미노 메탈로센 유도체의 시너지 작용을 통해 향상된 항암산화 치료효과를 누릴 수 있다. 이와 같은 기전을 통하여 polyCAFE는 고분자 자체의 우수한 생체적 활성을 가지고 생리적 조건에서 분해되면서 높은 항암효과를 발휘할 뿐만 아니라 기존의 항암제를 포접할 경우, 암조직 감응성 약물전달체로 사용될 수 있다는 이점이 있다.

Description

하이드록시 라디칼 생성유도 고분자 항암제 및 그의 제조방법{Anticancer polymer for inducing formation of hydroxy radical and method for preparing the same}
본 발명은 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체를 함유한 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자의 제조방법과 이를 이용한 항암 산화치료에 관한 것이다. 보다 상세하게는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체를 고분자의 합성단계에서 단량체로 사용하여 주사슬에 결합한 뒤, 이를 마이셀로 형성하여 항암치료를 위한 약물 및 약물 전달체로 제조한 자극 감응형 고분자에 관한 것이다.
세계적으로 암은 전체 사망원인 중 약 13%를 차지하고 있으며 성별, 나이에 구분없이 발병이 가능하다. 또한 전 세계 질병 중 2위의 사망원인, 국내 사망원인 1위를 차지하는 무서운 질병으로 세계적으로 암 발생인구가 매 년마다 약 3천만 명씩 증가할 것으로 예상된다. 미국 국립 암 연구소(NCI, National Cancer Institute)에서 2015년까지 암 정복을 목표로 하고 있으며 활발한 연구가 진행되고 있다. 국내 암 환자 수는 매 년마다 약 10만 명이 증가하고 있으며 5만 명이 사망하고 있어 연평균 암환자 증가율이 약 10%를 웃돌고 있다. 항암제는 의약품 중에서도 가장 빠르게 발전하는 분야로 다른 제품과는 달리 임상시험과의 연계성이 매우 높으며 이미 허가된 항암제라 할지라도 타 종류의 항암제로 적용범위가 추가되거나, 다른 투약방법이 제시되거나, 혹은 병용 가능한 항암제가 개발되는 등의 새로운 연구결과가 꾸준히 발표되고 있다. 이에 따라 국내 항암제 시장규모 역시 원외처방까지 포함할 경우 2000년 1300억 원, 2003년 1730억 원으로 연평균 8~10%정도의 성장률을 보이고 있다. 또한 암은 질병의 특성 상 발병률이 높고 완치가 어려울 뿐만 아니라 발병하는 암 역시 발병기전의 다양화로 인하여 위암, 폐암과 같은 과거부터 존재했던 암의 종류부터 혈액암과 같은 희귀 암까지 그 종류가 다양해짐에 따라, 보다 치료효과가 높은 약물, 그리고 약물에 대한 부작용과 내성이 적은 항암제의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
현재까지 약 70%의 항암치료인자들은 천연원료에 기인해있으며, 상기 천연화합물 중에서 관심을 끌고 있는 한가지 원료가 시나몬의 주요원료인 신남알데히드(cinnamaldehyde, 이하 CA)이다. CA는 한의학에서 건위, 구충, 발한, 해열 및 대장균, 포도상구균, 카디나 알비칸스 균등의 발육을 억제하는 향균 재료로 사용되어 온 계피나무의 주성분으로 세포의 사멸을 유도하는 물질로 뛰어난 항암효과를 지니고 있는 페놀계 화합물이다. CA는 불포화 alpha, beta-카르보닐기를 포함하고 있으며, ROS로 매개되어 미토콘드리아 막에서의 투과성이 최하 1500 Da이상으로 증가함으로 인해 Pore가 생기는 Mitochondrial Permeability Transition (MPT)현상을 유발하는 한편, 카스파제의 활성 증대을 통해 반증식 활성을 증가시켜 세포의 사멸을 촉진하는 것으로 알려져 있다. CA는 그 자체뿐 아니라, 최근 벤조일옥시신남알데하이드 (bezoyloxycinnamaldehyde, 이하 BCA)와 같은 CA유도체의 경우도 뛰어난 항암효과를 가지고 있다고 알려지면서 천연에서 얻어지는 CA와 CA유도체의 효능을 규명하는 많은 연구가 진행되고 있어 그 응용성이 점차 넓어질 것으로 기대된다. 하지만 CA는 생체 내 반감기가 매우 짧기 때문에 이를 직접적으로 섭취하였을 경우에는 체내에 오래 머물지 못하고 약 10분 내외에 분해되거나 외부로 배출되는 문제점이 있는 등, 생물학적으로 가용하기가 어렵다. 따라서 CA와 CA유도체를 다른 치료인자와 혼합하여 사용하는 방법에 대한 연구를 통해 이의 항암효과를 활용할 수 있는 방안을 찾는 것이 필요하다.
페로센(Ferrocene)은 싸이클로펜타디에닐 고리 (cyclopentadienyl(Cp) ring) 2개가 금속원소인 Fe를 사이에 두고 샌드위치 구조를 하고 있는 아미노 메탈로센계열의 화합물로, 2가 철로 이루어져 있다. 이의 2가 철이 활성산소 중의 하나인 과산화수소와 펜톤반응을 하여 반응성이 매우 높은 하이드록실 라디칼을 생성한다. 이 하이드록실 라디칼은 반응성이 매우 높고 DNA에 산화적 손상을 입혀 세포자멸사(apoptosis)를 유도하며, 이를 통해 작용하는 항암효과를 규명하는 많은 연구가 진행되고 있다. 하지만 페로센은 강한 소수성으로 유기용제에 용해되고 생리학적 조건에서 용해도가 낮아, 항암치료제로 응용하는데에 문제점으로 지적되고 있으며, 따라서 생분해성 고분자와의 컨주게이션 (conjugation)을 이용한 가용화 기술이 필요하다.
마이셀 (micelle)은 일반적으로 양친성 (amphiphilic), 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하는 것이다. 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 마이셀 내부에 존재하게 되며, 이러한 마이셀은 체내에서 온도나 pH 변화에 반응하여 표적 지향적 약물방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 담체(carrier)로서의 응용 가능성이 대단히 높다고 볼 수 있다. 대한민국 특허출원 제 10-2001-0035265호에서는 폴리에틸렌글리콜과 생분해성 고분자를 이용한 마이셀의 제조에 관하여 기재하고 있다. 이들 물질은 모두 생분해성을 갖고 있기 때문에 생체친화성을 갖고 있다는 장점은 있으나, 체내 변화, 예컨대 pH와 같은 특정 변화에 민감한 것이 아니기 때문에 원하는 부위에서의 약물 전달이 어렵다는 단점이 있다. 한편, 체내의 pH 환경은 일반적으로 pH 7.2 내지 7.4를 나타내나, 암세포와 같은 비정상 세포의 주변 환경은 pH 6.0 내지 7.2로 약산성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는 암세포에 특정적으로 약물을 전달하기 위해서 pH 7.2 이하에서 약물을 방출하도록 하는 연구가 이루어지고 있다.
현재 국내외에서 약물방출제어기술과 난용성 약물가용화기술, 나노입자를 이용한 약물전달체 제조기술에 대한 연구를 통하여 표적지향성을 가지는 펩타이드 및 단백질 약물전달체와 치료용 유전자전달체 등 수송체의 개발이 활발히 진행되고 있다. 또한 생분해성 고분자 나노입자 블록 공중합 고분자를 이용한 마이셀 및 입자, 캡슐을 만들어 사용하고 있으며 생분해성 고분자는 체내에 들어간 후 조작이 필요하지 않고 회수가 필요하지 않아 관심의 대상이 되고 있다. 가장 높은 관심을 끈 고분자는 폴리에스테르 형으로서 polylactic acid(PLA), polyglyolic acid(PGA) 그리고 이들의 공중합체 polylactic-glycolic acid(PLGA) 등이 가장 많이 사용되고 있다. 특히 PLA와 PLGA의 마이크로 입자는 캡슐화되어 분해를 막고 생체적합성을 향상시키며 약물방출의 지속성을 유지할 수 있으나 높은 가격, 염증을 유발하는 분해산물의 생성, 느린 가수분해 속도로 인해 약물의 방출속도가 지연되는 등의 문제점과 함께 특정부위를 표적하거나 질병부위의 환경에 감응하는 능력이 없다. 따라서 표적성이 없어 주변의 세포까지 독성을 미치거나, 항암효과를 높이기 위해 투약량을 증가시키거나 이로 인한 부작용 등, 기존의 항암제가 가지고 있는 문제점을 개선할 수 있는 새로운 형태의 표적형 항암치료제에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 신남알데하이드 유도체가 쉽게 산화되거나 단백질과 반응하기 때문에 체내에서 머무를 수 있는 시간이 짧다는 점을 개선하는 한편, 메탈로센 유도체, 예를 들어 페로센의 용해도를 개선시키며, 약물의 부작용, 정상세포에 미치는 독성 증가 등의 기존의 항암제들이 가지고 있는 문제점을 해결고자 한다.
전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자를 포함하는 고분자 마이셀을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고분자 마이셀을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고분자 마이셀을 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자는 마이셀을 형성하여 신남알데하이드 유도체가 체내에서 오래 잔재하도록 하고 아미노 메탈로센의 용해성을 높이며, 낮은 pH 환경에서 마이셀이 붕괴되어 CA와 메탈로센이 방출되어 항암효과를 나타내므로 암조직에 선택적으로 반응하는 항암제이고 정상조직에 대한 독성이 매우 적다. 또한, 상기 마이셀이 붕괴되면 고분자가 양이온성을 띄게 되면서 세포흡수율이 증가한다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자는, 항암효과가 기존 항암제에 비해 낮은 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체의 각각을 하나의 고분자에 결합하여, 항암효과가 상승하도록 한다. 또한, 세포내 엔도좀의 낮은 pH에 의해서 고분자가 분해되면서 신남알데히드 유도체가 방출되어 과산화수소를 생성하고, 메탈로센 유도체가 과산화수소를 더욱 활성이 강한 하이드록시 라디칼로 전환시켜 암세포의 자멸사(apoptosis)를 유도하므로, 상기 신남알데히드 유도체와 메탈로센 유도체의 시너지적인 항암효과를 유도하는 매우 강력한 항암효과를 갖는다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자는 고분자 자체로서 항암제로 사용 가능할 뿐만 아니라 마이셀 구조를 통하여 다른 약물을 포접할 수 있으므로, 예를 들어 기존 항암제와 함께 이용할 경우 상승작용에 의해 더욱 강력한 항암작용을 나타낼 수 있고 또한 약물의 복용량을 감소시키는 등의 용량 조절로 부작용을 현저히 완화 시킬 수 있는 새로운 항암제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자는 입자의 크기에 의한 EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과를 가지므로 암 부위에만 특이적으로 축적되어 정상세포에 미치는 독성을 최소화할 수 있다.
본 발명에 따른 블록 공중합체는 고분자 마이셀로서 약물 전달체로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 조영물질을 블록 공중합 반응에 참여시켜 암조직 선택적 항암작용을 갖는 조영제로 사용할 수 있다.
도 1은 polyCAFE의 1H NMR의 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 polyBCAFE의 1H NMR의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3는 polyCAFE 및 polyBCAFE의 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 4은 polyBCAFE 마이셀의 pH 의존성 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 DLS(Dynamic light scattering)를 이용한 polyBCAFE 마이셀의 크기 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 polyBCAFE 마이셀의 pH 변화에 따른 안정도 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 polyBCAFE 마이셀 크기 분석을 위한 투시전자현미경(TEM)의 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 polyBCAFE 마이셀로부터 벤조일신남알데하이드의 방출속도 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 polyBCAFE 마이셀의 pH 에 대한 민감성 방출을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10는 polyBCAFE의 H2O2 및 하이드록시 라디칼 생성에 의한 아폽토시스 측정 결과를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 11은 polyBCAFE의 H2O2 생성 및 하이드록시 라디칼 생성을 H2O2 소거 카탈라제(CAT) 또는 하이드록시 라디칼 소거 티오우레아(Urea) 처리에 의해 확인한 것이다.
도 12a는 정상세포에서 polyBCAFE 마이셀의 MTT assay에 의한 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 12b는 DU14 세포에서 polyBCAFE 마이셀의 MTT assay에 의한 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 12c는 SW620 세포에서 polyBCAFE 마이셀의 MTT assay에 의한 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 세포 사멸을 조절하는 단백질의 발현정도를 측정한 도면이다.
도 14은 종양을 가진 마우스에서 polyBCAFE 마이셀의 항 종양 효과를 H&E 염색으로 확인한 도면이다.
도 15은 종양을 가진 마우스에서 polyBCAFE 마이셀의 항 종양 효과를 DAPI 및 TUNEL 염색으로 확인한 도면이다.
도 16a는 종양을 가진 마우스와 그 종양의 크기를 나타낸 것으로서 polyBCAFE 마이셀의 항 종양 효과를 나타낸 도면이다(a : 대조군, b : 페로센 5㎍, c : BCA 20㎍, d : BCA와 페로센, e : polyBCAFE 100㎍).
도 16b는 각 약물을 처리한 군에서 종양의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 16c는 종양을 가진 마우스에서 프로토포피린이 적재된 polyBCAFE 마이셀의 생체 분포를 나타낸 도면이다.
도 16d는 IR820-labeled polyBCAFE 마이셀로 처치된 마우스의 형광 이미지를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명은 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 동시에 주 사슬 내에 화학적으로 결합된 생분해성 공중합 고분자인 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자를 제공한다. 또한, 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자를 포함하는 항암제를 제공한다. 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자는, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체를, 폴리에틸렌글리콜 계열의 화합물과 공중합 시킨, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체의 형태를 포함한다.
상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체는 pH가 6.7 내지 7.4범위에서 마이셀을 형성하며 pH 6.6 이하에서는 마이셀이 붕괴되는 것을 특징으로 한다. 이를 통해 결합되어 있던 신남알데하이드 유도체가 방출되면서 암세포 주변의 산성환경에서 과산화수소를 생성하고 이와 아미노 메탈로센 유도체가 반응하여 하이드록실 라디칼을 생성하면서 암세포 특이적인 항암작용 효과를 갖는다.
또한 본 발명은 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체(polyCAFE)의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀과 이에 포접가능한 생리활성물질을 포함하는 약물전달체와 이의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 신남알데하이드 유도체, 아미노 메탈로센 유도체 및 조영물질 함유 블록 공중합체를 포함하는 암 치료용 조영제를 제공한다.
본 발명은
폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A); 및
하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 화학식 2로 표시되는 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B);를 공중합시킨, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015010121320-pat00001
상기 화학식 1에 있어서, R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, OCO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
바람직하게는, 상기 화학식 1에 있어서, R은 H, F, OH, CH3, OCH3 또는 OCOPh이다.
[화학식 2]
(C5H5)2MNH2
여기서, M은 금속원자이다. 바람직하게, 상기 화학식 2에 있어서, M은 Fe, Pt, Ni, Zn 또는 Cu 이다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자는, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체로 치환된 폴리(β-아미노 에스터), 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체로 치환된 폴리(아미도 아민) 또는 이들의 공중합체와, 친수성을 갖는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을 공중합 시킴으로써 신남알데하이드 및 아미노 메탈로센 유도체가 치환되었으며, 마이셀 형성이 가능하고, 상기 마이셀은 약물을 포접할 수 있다. 본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자는 pH 변화에 민감하기 때문에 약산성의 암조직에서 마이셀 형태가 붕괴되는데, 마이셀 내부에 포접되어 있던 약물, 예를 들어 항암제 등이 방출되고, 또한 아세탈 결합이 끊어지면서 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 방출되어 항암효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 산성조건 하에서 신남알데하이드 유도체는 과산화수소를 생성하고 아미노 메탈로센 유도체가 과산화수소와 반응하여 반응성과 독성이 높은 하이드록실 라디칼을 생성하여 암세포를 자멸화시킴으로써 항암효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자는 양친성과 pH 민감성으로 인해 pH 변화에 따라 마이셀(micelle)을 형성하거나 붕괴할 수 있으며, 바람직하게는 pH가 6.7 내지 7.4 범위인 경우 마이셀을 형성하고, pH가 6.6 이하의 범위인 경우 마이셀이 붕괴하게 된다. 특히, 본 발명의 블록 공중합체는 pH ㅁ0.2 범위 이내의 우수한 민감성을 나타낸다는 장점을 가지므로, 체내 pH 변화에 따른 민감성이 요구되는 용도, 예컨대 약물방출용 담체 또는 진단 용도 등에서 사용될 수 있고, 만족스런 결과를 도출해낼 수 있다.
본 발명의 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자는 pH 민감성 유지 및 마이셀을 형성하는 물성을 유지하는 한, 전술한 친수성 폴리에틸렌글리콜계열 화합물과 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 화합물 이외에, 다른 당업계의 통상적인 단위체를 더 포함할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범주에 속한다.
상기 블록 공중합체의 분자량 범위는 특별한 제한은 없으나, 2000 내지 20000 범위가 바람직하다. 분자량이 2000 미만인 경우 특정 pH에서 블록 공중합체 마이셀이 형성되기 어려울 뿐만 아니라 형성되더라도 물에 용해되어 붕괴되기 쉽다. 또한, 분자량이 20000을 초과하는 경우 친수성/소수성의 밸런스가 깨져 특정 pH에서 마이셀이 형성하지 못하고 침전될 수 있다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자의 구성 성분 중 하나인, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)은 당업계에 알려진 통상적인 친수성을 갖는 생분해성 화합물을 제한없이 사용 가능하나, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물 말단에 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 등의 단일 관능기(monofunctional)를 가지거나, 또는 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 것이 특히 바람직하다. 상기 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물의 분자량 (Mn) 은 특별한 제한이 없으나, 500 내지 5000 범위가 바람직하다. 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물의 분자량(Mn)이 상기 범위를 벗어나는 경우, 예컨대 500 미만인 경우와 5000을 초과하는 경우 최종 블록 공중합체의 분자량 조절이 어려울 뿐만 아니라 상기 블록 공중합체를 이용하여 마이셀을 형성하는 것이 용이하지 않다. 즉, 분자량이 500 미만인 경우 특정 pH에서 친수성 블록의 길이가 너무 짧아 친수성/소수성에 의한 자기 조합(self assembly)이 일어나지 못하여 마이셀 형성이 어려울 뿐만 아니라 형성되더라도 물에 용해되어 붕괴되기 쉽다. 또한, 분자량이 5000을 초과하는 경우 소수성인 신남알데하이드 유도체 및 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터) 또는 폴리(아미도 아민)의 분자량에 비해 블록 길이가 너무 커져서 친수성/소수성의 밸런스가 깨져 특정 pH에서 마이셀이 형성하지 못하고 침전될 수 있다.
본 발명에 따른 최종 생성물인 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자 내에, 폴리에틸렌글리콜(A) 계열 블록의 함량은 특별한 제한이 없으나, 5 내지 95 중량부가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5 내지 40 중량부이다. 폴리에틸렌글리콜은 모노아크릴레이트로 중합과정에서 한쪽 말단만 반응하는 종결자로 작용할 수 있다. 따라서 폴리에틸렌글리콜 계열 블록의 함량이 5 중량부 미만인 경우에는 상기 블록 공중합체의 고분자의 분자량은 높아지지만 폴리에틸렌글리콜 계열 블록이 연결된 공중합체의 수율이 낮아지고 마이셀 형성이 어려울 수 있으며, 95 중량부를 초과하는 경우에는 종결반응이 너무 많이 일어나서 폴리에틸렌글리콜 계열 블록이 많이 연결될 수 있지만 중합반응이 많이 일어나지 않아서 분자량이 낮아진다. 또한 상기 블록 공중합체는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)과, 신남알데하이드 유도체 및 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 또는 폴리(아미도 아민)(B)의 반응 몰비를 조절함으로써 AB형의 이중 블록 공중합체; ABA 또는 BAB 형의 삼중 블록 공중합체 또는 그 이상의 다양한 블록 형태를 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자의 구성 성분 중 다른 하나인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터), 및 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B)는, 소수성과 pH 민감성을 동시에 갖는, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 화합물로서, 이의 비제한적인 예로는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터), 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민) 또는 이들의 혼합 공중합물 등이 있다. 이들은 자체 내 존재하는 3차 아민기로 인해 pH에 따라 물에 대한 용해도가 달라지는 이온화 특성을 가짐으로써, 체내 pH 변화에 따라 마이셀 구조를 형성 및/또는 붕괴할 수 있다. 구체적으로, 이들은 pH 6.6 이하에서 이온화되는 3차 아민기를 포함할 수 있다.
상기 화합물들은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이의 바람직한 일 실시예를 들어 설명한다. 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
먼저, 신남알데하이드 유도체가 연결된 비스아크릴레이트 또는 비스아크릴아마이드를 합성한 후, 마이클 반응을 통하여 아미노 메탈로센과 아민 계열의 화합물을 중합시켜서, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 화합물을 얻을 수 있다.
여기서 상기 신남알데하이드 유도체가 결합된 비스아크릴레이트 합성에 사용 가능한 아크릴레이트 계열 화합물의 비제한적인 예로는 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시프로필 아크릴레이트, 2-하이드록시부필 아크릴레이트, 2-하이드록시펜틸 아크릴레이트 등이 있다.
또한, 상기 신남알데하이드 유도체가 결합된 비스아크릴아마이드 합성에 사용 가능한 아크릴아마이드 계열 화합물의 비제한적인 예로는 2-(2-하이드록시에틸)아이소인도린-1,3-다이온, 2-(3-하이드록시프로필)아이소인도린-1,3-다이온, 2-(4-하이드록시부틸)아이소인도린-1,3-다이온 등이 있다.
또한, 아민 계열 화합물은 아민기를 갖는 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용 가능하며, 1차 아민, 2차 아민 함유 디아민 화합물 또는 이들의 혼합물 등이 바람직하다.
상기 1차 아민 화합물의 비제한적인 예로는 3-메틸-4-(3-메틸페닐)피페라진, 3-메틸피페라진, 4-(비스-(플루오로페닐)메틸)피페라진, 4-(에톡시카르보닐메틸)피페라진, 4-(페닐메틸)피페라진, 4-(1-페닐에틸)피페라진, 4-(1,1-디메톡시카르보닐)피페라진, 4-(2-(비스-(2-프로페닐)아미노)에틸)피페라진, 메틸아민, 에틸아민, 부틸아민, 헥실아민, 2-에틸 헥실 아민, 2-피페리딘-1-에틸아민, C-아지리딘-1-일-메틸아민, 1-(2-아미노에틸) 피페라진( 1-(2-aminoethyl)piperazine), 4-(아미노메틸) 피페라진 (4-(aminomethyl)piperazine), N-메틸에틸렌디아민 (N-methylethylenediamine), N-에틸에틸렌디아민 (N-ethylethylenediamine), N-헥실에틸렌디아민 (Nhexylethylenediamine), 피콜리아민 (pycoliamine), 아데닌 (adenine), 티라민 (tyramine), 도파민 (dopamine), 2-페닐에탄아민 (2-phenylethanamine) 등이 있으며,
상기 2차 아민 함유 디아민 화합물의 비제한적인 예로는 피페라진, 4,4'-트리메틸렌 디피페리딘, 이미다졸리딘 등이 있다.
상기 pH 민감성을 나타내는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 제조시 반응 몰비는, 신남알데하이드 유도체가 연결된 비스아크릴레이트 또는 비스아크릴아마이드 화합물과, 아미노 메탈로센 및 아민 계열 화합물을 합한 물질의 반응 몰비로서 1: 1.0~1.3 이 바람직하고, 1:1.11 이 가장 바람직하다. 상기 아미노 메탈로센 및 아민 계열 화합물의 몰비가 1.0 미만이거나 1.3 초과이면 고분자량이 낮아지게 된다.
또한, 아미노 메탈로센과 아민 계열 화합물의 반응 몰비는 1:3~10 가 바람직하고, 1:4가 가장 바람직하다. 상기 아민 계열 화합물의 몰비가 3미만이면 고분자의 소수성 커서 마이셀 제조가 어렵고, 10을 초과이면 펜톤반응의 효율이 낮아지게 된다.
또한, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물과 신남알데하이드 유도체가 연결된 비스아크릴레이트 또는 비스아크릴아미이드의 몰비는 1: 3~10 이 바람직하고, 1: 8~10 이 가장 바람직하다. 상기 신남알데하이드 유도체가 연결된 비스아크릴레이트 또는 비스아크릴아미이드가 3 미만이면 친수성이 너무 커서 마이셀 제조가 불가능하고 10 초과이면 친수성이 낮아 마이셀 제조가 불가능하다.
바람직하게는 본 발명의 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 하이드록시 라디칼 생성유도 고분자는 하기 화학식 3 내지 6으로 표시될 수 있다.
[화학식3]
Figure 112015010121320-pat00002
[화학식4]
Figure 112015010121320-pat00003
[화학식5]
Figure 112015010121320-pat00004
[화학식6]
Figure 112015010121320-pat00005
[화학식7]
Figure 112015010121320-pat00006
[화학식8]
Figure 112015010121320-pat00007
[화학식9]
Figure 112015010121320-pat00008
[화학식10]
Figure 112015010121320-pat00009
[화학식11]
Figure 112015010121320-pat00010
[화학식12]
Figure 112015010121320-pat00011

상기 화학식 3 내지 12에서, R1 내지 R8은 C1-C30의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기이며, R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이며, M은 금속원자이며, x, y, z 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이며, p는 0 내지 10의 정수이다.
화학식 11 내지 12와 같이 폴리에틸렌글리콜이 가지에 포함되어 있어 신남알데하이드 및 아미노 메탈로센과 함께 빗형(come-like) 블록 공중합체를 형성하게 하므로서 마이셀이 더욱 안정한 나노입자를 형성할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센을 함유한 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자는 하기 화학식 13 내지 16으로 표시될 수 있다.
[화학식13]
Figure 112015010121320-pat00012
[화학식14]
Figure 112015010121320-pat00013
[화학식15]
Figure 112015010121320-pat00014
[화학식16]
Figure 112015010121320-pat00015

상기 화학식 13 내지 16에서, x, y 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이다.
본 명세서에서, polyCAFE는 폴리[(3-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트] -co-4,4’-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-페로세닐 아미노-co-폴리(에틸렌 글리콜)을 지칭하며, polyBCAFE는 폴리[(3-(2-벤조일옥시)페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트]-co-4,4’-(트리메틸렌 디피페리딘)-co- 페로세닐 아미노-co-폴리(에틸렌 글리콜)을 지칭한다.
또한, 본 발명은
1) 아크릴레이트 계열 화합물 또는 아크릴아마이드 계열 화합물을 상기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 반응시켜 신남알데하이드 유도체-비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴아마이드 계열 화합물을 얻는 단계; 및 2) 상기 1)단계에서 제조된 신남알데하이드 유도체-비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴아마이드 계열 화합물을, 아미노 메탈로센, 아민 계열 화합물 및 에틸렌 글리콜 계열 화합물과 반응시켜, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 블록 공중합체를 얻는 단계; 를 포함하는, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자의 제조방법을 제공한다.
이하, 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자의 제조방법에 대해 일 실시예를 들어 상세히 설명한다.
상기 1) 단계는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴아마이드 계열 화합물을 제조하는 단계로, 먼저 아크릴레이트 계열 화합물 또는 아크릴아마이드 계열 화합물을 히드로퀴닌과 함께 유기용매에 용해시키고, 온도를 36 내지 90℃로 가열한다. 여기에 신남알데하이드 유도체 및 p-톨루엔술폰산을 가해준 후, 10 내지 24시간 동안 80 내지 99℃에서 가열한다. 이후, 온도를 상온으로 내리고 트리에틸아민을 넣어 반응을 종결시킨 뒤, 정제하여 생성물을 수득한다.
상기 2)단계는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 블록 공중합체를 제조하는 단계로, 상기 1)단계에서 제조한 신남알데하이드 유도체-비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴아마이드 계열 화합물, 아미노 메탈로센 및 아민 계열 화합물을 유기용매에 용해하여 혼합한다. 상기 혼합물에 폴리에틸렌 글리콜 계열 화합물을 가하고 온도를 35 내지 50℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합개시를 수행한다. 36 내지 96시간의 고분자 중합 이후에, 반응 혼합물을 차가운 유기용매로 침전시켜 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 블록 공중합체를 제조한다.
여기서 상기 신남알데하이드 유도체가 결합된 비스아크릴레이트 합성에 사용 가능한 아크릴레이트 계열 화합물의 비제한적인 예로는 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시프로필 아크릴레이트, 2-하이드록시부필 아크릴레이트, 2-하이드록시펜틸 아크릴레이트 등이 있다.
상기 신남알데하이드 유도체가 결합된 비스아크릴아마이드 합성에 사용 가능한 아크릴아마이드 계열 화합물의 비제한적인 예로는 2-(2-하이드록시에틸)아이소인도린-1,3-다이온, 2-(3-하이드록시프로필)아이소인도린-1,3-다이온, 2-(4-하이드록부틸)아이소인도린-1,3-다이온 등이 있다.
상기 아민 계열 화합물은 4,4'-트리메틸렌-디피페리딘이 바람직하며, 에틸렌 글리콜 계열 화합물은 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트인 것이 바람직하다. 상기 각 단계에서 사용된 유기용매로는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 디메틸 설폭사이드, 디메틸 포름아마이드, 메틸렌 클로라이드, 벤젠, 헥산 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 아민 계열 화합물로 아민기가 포함된 신남알데하이드 유도체를 사용하는 경우 블록 공중합체의 주사슬에 신남알데하이드 유도체의 양이 두배로 증가하여 그 효과 또한 증가하므로 더욱 강한 항암 효과를 볼 수 있어 바람직하다.
화학식 11 내지 12와 같이 폴리에틸렌글리콜이 가지에 포함되어 있는 빗형(come-like) 블록 공중합체를 제조할 수 있다. 이 때, 상기 1)단계에서 제조한 신남알데하이드 유도체-비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴아마이드 계열 화합물, 아미노 메탈로센 및 아민 계열 화합물과 함께 아미노 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 온도 30 내지 50℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합개시를 수행한다. 48 내지 96시간의 고분자 중합 이후에, 반응 혼합물을 차가운 유기용매로 침전시켜 신남알데하이드 유도체 및 아미노 메탈로센 함유 하이드록시 라디칼 생성 유도 빗형 블록 공중합체를 제조한다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자 화합물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자 화합물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁용제로는 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 일반적으로 의약품에 있어서, 본 발명에 의한 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자로 표시되는 화합물의 유효 용량은 0.1 ∼ 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직 하기로는 0.1 ∼ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 ~ 3회 투여될 수 있다.(임의로 넣은 것입니다. 확인하여 주십시오) 그러나, 상기 투여량은 변화시킬 필요가 있으며, 특히 치료할 객체의 체질 및 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질 및 투여기간 또는 간격을 고려하여 변화시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자를 포함하는 고분자 마이셀 및 이를 포함 하는 약물전달체를 제공한다.
상기 고분자 마이셀은 두 가지 형태로 제작이 가능한데,
첫 번째로, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자를 포함하는 고분자 마이셀이 가능하며,
두 번째로, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자, 및 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 하이드록시 라디칼 생성 유도 고분자에 봉입될 수 있는 물질, 예를 들면 생리 활성 물질 및 항암제 등의 기타 약물을 포함하는 고분자 마이셀이 가능하다.
상기 첫 번째 형태의 고분자 마이셀은 고분자 자체에 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체를 포함하고 있는 바, pH가 낮은 곳에 도달하게 되면 마이셀이 붕괴되어 신남알데하이드 유도체와 메탈로센 유도체를 방출시킨다. 낮은 pH에서 신남알데하이드 유도체가 과산화수소를 생성하고 이 과산화수소와 아미노 메탈로센 유도체가 반응하여 펜톤반응을 통해 반응성과 독성이 높은 하이드록실 라디칼을 형성함으로써 암세포의 자멸화(apoptosis)를 유도할 수 있다.
또한, 상기 두 번째 형태의 고분자 마이셀로서 항암제가 봉입된 마이셀인 경우, pH가 낮은 곳에 도달하게 되면 마이셀이 붕괴되면서 내부에 포접되어 있던 항암제가 방출되어 1차적 항암작용을 하고 신남알데하이드 유도체 및 아미노 메탈로센 유도체가 방출되어 2차 항암작용을 한다. 상기 고분자 마이셀은 체내에 주입되었을 때 마이셀을 형성하고 있다가 암세포와 같이 국소적으로 pH가 낮은 곳에 도달하게 되면 마이셀이 붕괴됨으로써, 봉입된 담지 약물의 방출을 통해 표적 지향적 약물 전달이 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 고분자 마이셀은 입자의 크기에 의한 EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과에 의하여 생체 내에서 암세포에 축적되는 효율이 증가될 수 있으므로 표적 지향적 약물 전달이 이루어질 수 있다.
본 발명의 고분자 마이셀 형태의 블록 공중합체에 봉입될 수 있는 생리 활성 물질은 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역 억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제 또는 항히스타민제 등이 있다. 또한, 전술한 성분 이외에 당업계에 알려진 통상적인 첨가제, 예컨대 부형제, 안정화제, pH 조정제, 항산화제, 보존제, 결합제 또는 붕해제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 고분자 마이셀의 제조방법은 교반, 가열, 초음파 주사, 유화법을 이용한 용매증발법, 매트릭스형성 또는 유기용매를 이용한 투석법 등의 방법을 단독 또는 병행하여 사용할 수 있다. 제조된 고분자 마이셀의 직경은 특별한 제한이 없으나, 10 내지 1000nm 범위가 바람직하다. 또한, 상기 고분자 마이셀 약물 조성물은 경구제 또는 비경구제의 형태로 제제화하여 사용할 수 있으며, 정맥, 근육 또는 피하 주사제로 제조할 수 있다.
본 발명의 고분자 마이셀은 특정 pH, 예컨대 체내 정상 세포의 pH 범위인 pH 6.7~7.4에서는 안정한 마이셀을 형성하고, 암 세포와 같은 비정상 세포가 나타내는 pH 범위 6.6 이하인 경우 상기 마이셀 구조가 붕괴됨으로써, 암 세포에 표적 지향적인 약물 방출용 담체로서 사용될 수 있다. 즉, 낮은 pH(pH 6.6 이하)에서는, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터), 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민), 또는 이들의 혼합 공중합물에 존재하는 3차 아민의 이온화도 증가로 인해 공중합체 전체가 수용성으로 변하게 되어 마이셀을 형성할 수 없게 되며, pH 6.7~7.4 에서는 이의 이온화도가 저하되어 소수성 특징을 나타냄으로써 자기 조립에 의한 마이셀을 형성하는 것이다.
추가적으로, 본 발명에서는 정상 체내 조건과 동일한 pH 6.7 ~ 7.4 범위에서는 마이셀을 형성하고 암세포와 같은 비정상 조건인 pH 6.6 이하에서는 마이셀이 붕괴되는 암세포 표적 지향적인 마이셀을 디자인하여 적용하였으나, 상기 블록 공중합체의 구성 성분, 이들의 몰비, 분자량 및/또는 블록 내 관능기를 적절히 변경함으로써 암세포 뿐만 아니라 유전자 변이 또는 다른 응용 분야에 표적 지향적인 마이셀을 디자인하여 이를 유용하게 응용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이셀을 형성할 수 있는 블록 공중합체는 유전자 전달, 약물 전달 분야 뿐만 아니라 병의 진단을 위한 물질을 비정상 세포에 전달함으로써, 진단 이미징(diagnostic imaging) 등의 조영제 용도에 응용될 수 있다. 본 발명의 조영제 조성물에 있어서, 상기 고분자 마이셀은 조영물질로서 무기 또는 유기 염료(dye), 형광체, 동위원소로 표지된 것일 수 있다. 여기에서 조영물질이란 조영제로 사용될 수 있는 모든 물질을 말하는 것으로 영상 대조도를 크게 해 주는 물질을 말한다.
상기 무기 또는 유기 염료는 기존의 염료를 포함하여 형광 또는 광학 영상, 컴퓨터 단층(CT) 촬영과 같은 방사선 영상화, 초음파 또는 MRI와 같은 비방사선 영상화에 있어서 영상의 대조도를 증가시키기 위하여 사용되는 것으로서, 예컨대 디아트리조에이트 (Diatrizoate), 메트리조에이트 (Metrizoate), 이옥사글레이트 (Ioxaglate), 이오파미돌 (Iopamidol), 이오헥솔 (Iohexol), 이옥실란 (Ioxilan), 이오프로미드 (Iopromide), 이오딕산올 (Iodixanol), 바륨 설페이트와 같은 바륨계 염료, 가스트로그라핀 (Gastrografin)　등을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 형광 표지자로는, 예컨대 IR820, 인도시아닌, NIR(근적외선) 염료, 플루오레신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), Cy3, Cy5 (Pharmacia), 발색단, 화학발광단, 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제) 등을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 고분자 마이셀은 방사성 동위 원소로 표지될 수도 있는데, 사용 가능한 방사성 동위 원소의 예는 123I, 125I, 55Co, 56Co, 58Co, 61Cu, 62Cu, 62Zn, 63Zn, 64Cu, 65Zn, 66Ga, 66Ge, 67Ge, 68Ga, 69Ge, 69As, 99mTc 또는 이들의 유도체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 고분자 마이셀은 자성체, 상자성 나노입자 또는 초상자성 나노입자를 포접할 수도 있는데, 이 경우 특히 MRI를 이용한 영상화에 있어 유용하게 활용될 수 있다.
상자성 나노입자란 스핀-격자 이완을 일으킬 수 있는 물질로서, 예컨대 Magnevist (Schering, Germany), Gd-DTPA (Gd-diethylene triamine pentaaceticacid)와 같은 Gd 킬레이트 화합물, Gd2O3 (C. Riviere et al. J. Am. Chem. Soc.2007, 129, 5076.), MnO (T. Hyeon et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5397.) 등의 물질을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 초상자성 나노입자란 외부에서 자기장을 주었을 때 자화되고, 유도 자기장을 발생시켜 주변 물분자의 수소 핵스핀의 스핀-스핀 과정에 영향을 주며, 자기공명영상 신호를 증폭시키어, 통상 물과 비교하여 어두운 조영효과 (darkor negative contrast effect)를 나타내는 물질로서, 예컨대 산화철 성분을 포함하는 Feridex, Resovist, Combidex, MEIO (magnetism engineered iron oxide) 등을 사용할 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 조영제 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 조영제 조성물은 화학적으로 본 발명에 따른 블록 공중합체의 주사슬에 결합될 수도 있고, 본 발명에 따른 마이셀에 포접된 형태일 수도 있다.
본 발명은 상기 블록 공중합체의 주사슬에 조영물질이 결합되는 고분자 조영제을 제공한다.
또한, 1) 아크릴레이트 계열 화합물 및 아크릴아마이드 계열 화합물을 상기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체를 반응시켜 신남알데하이드 유도체-비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴아마이드 계열 화합물을 얻는 단계;
2) 상기 1)단계에서 제조된 신남알데하이드 유도체-비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-비스아크릴아마이드 계열 화합물을, 아미노 메탈로센, 아민 계열 화합물 및 에틸렌 글리콜 계열 화합물과 반응시켜, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 함유된 블록 공중합체를 얻는 단계; 및
3) 상기 2)에서 얻은 블록 공중합체를 용매에 용해한 후 조영물질을 혼합하여 고분자 조영제를 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 블록 공중합체의 주사슬에 결합되는 IR820을 포함하는 조영제 조성물을 일 실시예로 하여 본 발명에 따른 조영제 조성물의 제조방법을 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 조영제 조성물과 그 제조방법은 이에 한정되지 않는다. IR820를 포함하는 본 발명의 블록 공중합체는 예를 들면 다음과 같이 화학식 17로 나타낼 수 있다.
[화학식 17]
Figure 112015010121320-pat00016
상기 화학식 17에 있어서, R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, OCO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다. 바람직하게는, 상기 화학식 17에 있어서, R은 H, F, OH, CH3, OCH3 또는 OCOPh이다.
본 발명에 따른 IR820을 포함하는 조영제 조성물은 본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체 및 아미노 메탈로센 유도체를 함유하는 블록 공중합체를 THF용매에 용해한 후 IR820을 혼합하고 이 혼합물을 상온에서 24시간 동안 반응하여 생성물을 수득한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
폴리[(3-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트] -co-4,4’-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-페로세닐 아미노-co-폴리(에틸렌 글리콜) (polyCAFE)의 제조
Figure 112015010121320-pat00017

1-1. 3-(페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트의 제조
유기용매를 제외한 모든 시약은 sigma aldrich 에서 구입하였다. 2-하이드록실 에틸 아크릴레이트(2-Hydroxyl ethyl acrylate) (11.13g, 96 mmol)와 히드로퀴닌(hydroquinone) (1g, 9.0 mmol)를 드라이벤젠(dry benzene)을 가하여 용해시키고, 온도를 50ㅀC로 가열하였다. 여기에 신남알데하이드 (32 mmol)와 p-톨루엔술폰산(p-toluenesulfonic acid) (28mg, 0.015 mmol)를 가해준 후, 92ㅀC에서 12시간동안 가열하였다. 혼합물을 상온으로 냉각시킨 뒤, 트리에틸아민(triethylamine)을 넣어 반응을 종결시켰다. 그 다음, 벤젠은 회전증발기에서 증발시키고, 헥산:에틸 아세테이트(8:2)의 용제를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 수득하였다. 1H NMR in CDCl3 on a 400MHz spectrometer :δ 3.77 (m, 4H), 3.89 (m, 4H), 5.23 (d, 2H), 5.84 (d, 2H), 6.16 (m, 4H), 6.43 (t, 1H), 7.24-7.44 (m, 5H).
1-2. 폴리[(3-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-4,4’-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-페로세닐 아미노-co-폴리(에틸렌 글리콜) 의 제조
4.4'-트리메틸렌-디피페리딘 (1.51g, 7.2 mmol), 아미노페로센 (160 mg, 0.8 mmol) 및 상기 실시예 1-1에서 제조한 3-(페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트 (2.49g, 7.2mmol)를 디클로로메탄 10ml를 가하여 혼합시켰다. 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트 (MW 2,000 Da, 1.6 g, 0.8 mmol)를 상기 혼합물에 가하고 온도를 40℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합을 개시하였다. 72시간의 고분자 중합과정을 거치고 반응 혼합물을 차가운 헥산으로 침전시켜 고형화시킨다. 진공건조과정을 거쳐 매우 점성이 높은 갈색 고분자를 얻어서, 이의 화학적 구조를 1H NMR로 측정하여 도1에 나타내었다.
<실시예 2>
폴리[(3-(2-벤조일옥시)페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트]-co-4,4’-(트리메틸렌 디피페리딘)-co- 페로세닐 아미노-co-폴리(에틸렌 글리콜) (polyBCAFE) 의 제조
Figure 112015010121320-pat00018
1-1. (3-(2-벤조일옥시)페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트의 제조
유기용매를 제외한 모든 시약은 sigma aldrich 에서 구입하였다. 2-하이드록실 에틸 아크릴레이트 (2-Hydroxyl ethyl acrylate) (9.20g, 79.28 mmol)와 히드로퀴닌 (hydroquinone) (873mg, 7.93 mmol)를 드라이벤젠 (dry benzene)을 가하여 용해시키고, 온도를 50℃로 가열하였다. 여기에 벤조일옥시신남알데하이드 (5g, 19 mmol)와 p-톨루엔술폰산 (p-toluenesulfonic acid) (28mg, 0.015 mmol)를 가해준 후, 92ㅀC에서 12시간 동안 가열하였다. 혼합물을 상온으로 냉각시킨 뒤, 트리에틸아민 (triethylamine)을 넣어 반응을 종결시켰다. 그 다음, 벤젠은 회전증발기에서 증발시키고, 헥산:에틸 아세테이트(8:2)의 용제를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 수득하였다. 화학구조를 1H NMR로 확인하였다.
1H NMR in CDCl3 on a 400MHz spectrometer : δ 3.77 (m, 4H), 3.89 (m, 4H), 5.23 (d, 2H), 5.84 (d, 2H), 6.16 (m, 4H), 6.43 (t, 1H), 7.24-7.7 (m, 8H), 8.2 (m, 2H)
1-2. 폴리[(3-(2-벤조일옥시)페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트]-co-4,4’-(트리메틸렌 디피페리딘)-co- 페로세닐 아미노-co-폴리(에틸렌 글리콜)의 제조
4.4'-트리메틸렌-디피페리딘(1.51g, 7.2 mmol), 아미노페로센(0.16g, 0.8mmol) 및 상기 실시예 1-1에서 제조한 (3-(2-벤조일옥시)페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트 (3.355g, 7.2mmol)를 디클로로메탄 10ml를 가하여 혼합시켰다. 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트 (MW 2,000 Da, 1.6 g, 0.8 mmol)를 상기 혼합물에 가하고 온도를 40℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합을 개시하였다. 72시간의 고분자 중합과정을 거치고 반응 혼합물을 차가운 헥산으로 침전시켜 고형화시킨다. 진공건조과정을 거쳐 매우 점성이 높은 갈색 고분자를 얻어서, 이의 화학적 구조를 1H NMR로 측정하여 도2에 나타내었다.
<실시예 3> 마이셀의 제조
3-1. polyCAFE 마이셀의 제조
실시예 1에서 제조된 polyCAFE (5 mg)을 메탄올 100 ㎕에 용해한 후, PBS(pH 7.4) 5 ml에 가하였다. 이후, 회전 증발기로 메탄올을 모두 증발시켜 1mg/mL의 polyCAFE 마이셀을 수득하였다.
3-2. polyBCAFE 마이셀의 제조
상기 3-1에서 polyCAFE 대신 실시예 2에서 제조된 polyBCAFE를 사용한 것을 제외하고는, 상기 3-1과 동일한 방법으로 제조하여 polyBCAFE 마이셀을 수득하였다.
<실시예 4> IR820를 포함하는 본 발명의 고분자 조영제의 제조
4.4'-트리메틸렌-디피페리딘(1.34g, 6.4 mmol), 아미노페로센(0.16g, 0.8mmol), 3-(2-벤조일옥시)페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트 (3.355g, 7.2mmol), 티라민(0.138g, 0.8mmol) 및 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트 (MW 2,000 Da, 1.6 g, 0.8 mmol)를 디클로로메탄 10ml를 가하여 혼합시켰다. 상기 혼합물을 40℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합을 개시하였다. 72시간의 고분자 중합과정을 거치고 반응 혼합물을 차가운 헥산으로 침전시켜 고형화 시켰다. 진공건조과정을 거쳐 매우 점성이 높은 갈색 고분자를 수득하였다. 상기 고분자 100mg을 THF 2ml에 용해한 후 IR820 20mg을 혼합하고 이 혼합물을 상온에서 24시간 동안 반응하였다.
<실험예 1> 본 발명의 polyCAFE 및 polyBCAFE의 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 측정
pH 7.4의 PBS 내의 polyCAFE 및 polyBCAFE의 임계 마이셀 농도(CMC)를 형광 탐침으로써 파이렌(pyrene)을 사용하여 측정하였다. 구체적으로는, polyCAFE 또는 polyBCAFE마이셀은 PBS 내에서 여러가지 농도로 제조되었으며(5×10-4 내지 1×10-1mg/ml), 여기에 상기와 같은 농도로 메탄올 내에 용해된 파이렌을 각각 가하였다. 파이렌이 포접된 polyCAFE 또는 polyBCAFE 마이셀의 형광 발광 스펙트럼을 여기(excitation) 파장을 334 nm로 하고, 형광 분광광도계(FP-6500, JASCO Corp., Japan)를 이용하여 CMC를 측정하였다. 373 nm 및 384 nm의 파장에서 형광세기의 비율을 마이셀의 질량 농도에 대하여 플롯팅하였다. 본 발명의 polyCAFE 또는 polyBCAFE의 임계 마이셀 농도의 측정 결과를 각각 도3 에 나타내었다. 도3에 나타난 바와 같이, polyBCAFE과 polyCAFE마이셀은 각각 12 ㎍/mL 및 8 ㎍/mL 이상에서 마이셀의 소수성 내부에 형광 탐침을 캡슐화하는 열역학적으로 안정적인 마이셀을 형성하는 것을 알 수 있다.
<실험예 2> 본 발명의 polyBCAFE 의 마이셀의 pH 의존성 측정
파이렌 5 mg을 메탄올 10 mL에 용해시킨 후, 20배 희석하였다. 큐벳에 준비한 상기 용액 0.5 ㎕를 가하고, 인산염 완충액 (pH 7.4)으로 제조한 다른 pH 조건에 있는 100 ㎍/mL의 polyBCAFE 마이셀 용액을 가하였다. 발광 (photoluminescence) (FP-6500, Japan)을 이용하여 여기 파장을 337nm로 하고, 373 nm 및 384 nm의 파장에서 형광세기를 측정하였다. 373 nm 및 384 nm에서 형광세기의 비율을 pH에 대하여 플롯팅 하였다.
본 발명의 polyBCAFE 마이셀의 pH 의존성의 측정 결과를 각각 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, polyBCAFE마이셀은 pH 7.4에서는 안정적으로 마이셀을 형성하다가, pH가 감소함에 따라 인덱스 값이 감소하였으며, pH 5.5 이하에서는 마이셀이 존재하지 않게 되었다. 이는 소수성 블록 내의 3차아민기 (pKb=6.5)가 양성자화 되고, polyBCAFE 전체가 수용성으로 변하게 되어 마이셀을 형성할 수 없음을 알 수 있다.
<실험예 3> DLS(Dynamic light scattering)를 이용한 polyBCAFE 마이셀의 크기 분석 및 투과전자현미경(TEM) 관찰
3-1. polyBCAFE 마이셀의 크기 분석
1mg/mL의 농도의 polyBCAFE 마이셀을 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 PBS에 10배 희석하여 100 ㎍/mL의 최종농도로 제조한 뒤 쿼츠셀(quartz cell)에 가하였다. DLS(ELS-6000, Germany)를 이용하여 polyBCAFE 마이셀의 크기를 측정하였다. 본 발명의 polyBCAFE 마이셀의 크기의 측정 결과를 각각 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, polyBCAFE 공중합체는 160 nm 이상의 단분산 구형 마이셀을 형성하는 것을 확인하였다.
또한, FBS의 존재 유무에 따른 polyBCAFE 마이셀의 안정도를 확인하기 위하여, 마이셀의 크기를 측정하였으나 24시간동안 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 도 6에 나타난 바와 같이, polyBCAFE 마이셀은 PBS에서 약 24시간 정도의 분석에서 크기의 변화를 나타내지 않았고, HCl 용액(0.1 N)을 가하여 pH가 감소하게 되면 마이셀의 크기가 급격히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이는 산성의 조건에서 아민 기가 소수성에서 친수성으로 변하면서 마이셀이 분해되는 것을 의미한다.
3-2. polyBCAFE 마이셀의 투과전자현미경 관찰
polyBCAFE 마이셀 용액 (100 ㎍/mL)을 탄소코팅 그리드(grid)에 올려 24시간 동안 건조 후, 1%의 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid)으로 염색하여 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)(Bio-TEM)(HITACHI H-7650, Japan)으로 관찰하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, polyBCAFE 공중합체는 160 nm 이상의 단분산 구형 마이셀을 형성하는 것을 확인하였다.
<실험예 4> polyBCAFE 마이셀로부터 신남알데하이드의 방출속도
pH 7.4 및 5.4 Sorensen 인산염 완충액으로 제조한 100 ㎍/mL의 polyBCAFE 마이셀 용액 2 mL를 투석 튜브 (dialysis tube) (aldrich, cutoff : 1000)에 가한 뒤, 외부용액(50mL)으로 방출되어 나오는 벤조일신남알데하이드의 양을 시간별로 샘플링 하였다. 기준 곡선은 pH 7.4 및 5.4의 인산염 완충액에 벤조일신남알데하이드를 농도별로 녹여 각각 작성하였다. 샘플을 UV-Vis 분광광도계(S-3100, Scinco, Korea)를 이용하여 290 nm 파장에서 벤조일신남알데하이드의 농도를 측정하였다. 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, pH 7.4의 경우에는 72시간이 경과하였음에도, 약 30%의 벤조일신남알데하이드가 방출되는 반면에, pH 5.4의 경우에는 약 24시간에 약 50%의 벤조일신남알데하이드가 방출되었으며, 약 72시간 후에는 약 90% 이상의 벤조일신남알데하이드가 방출되었다. 따라서, 더 낮은 pH에서 벤조일신남알데하이드가 더 빠르게 방출됨을 알 수 있다.
<실험예 5> polyBCAFE 마이셀의 pH 민감성 방출 측정
polyBCAFE를 pH 5.5 용액에서 48시간 처리 후 아세탈 결합이 분해되어 BCA가 방출되는지 확인하였다. 화학적 구조를 NMR로 분석하였다. 도9에 나타낸 바와 같이, 산성의 조건에서 아세탈 결합이 끊어져 5.2 ppm에서 나타나던 아세탈 중성자의 피크가 사라졌고, 벤조일옥시신남알데하이드가 생성되어 9.6 ppm에서 알데하이드 중성자 피크가 새롭게 나타남으로 polyBCAFE에서 BCA가 생성되어 방출됨을 확인하였다.
<실험예 6> polyBCAFE 마이셀의 H2O2 및 하이드록시 라디칼 생성에 의한 아폽토시스 측정
SW620 세포(5×105)를 12-웰 플레이트에 24시간 동안 배양하고, 단독 페로센(25μM), 단독 벤조일신남알데하이드(BCA, 80 μM), 페로센 (25μM)과 BCA (80μM), 또는 polyBCAFE 100 ㎍을 각각 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 세포를 신선한 배지로 2회 세척한 후, 1×105 cells/mL에서 1× 결합 완충액에 재현탁 하였다. 세포 현탁액 100μL를 5mL의 배양 튜브로 옮기고 DCFH-DA 5μL 및 PI 10μL를 가한 뒤, 부드럽게 혼합하였다. 이후 세포를 암실에서 실온으로 15분 동안 배양하고 1× 결합 완충액 400μL을 가하였다. ROS 생성은 DCFH-DA (2 ', 7'-dichlorofluorescein -diacetate)를 프로브로 사용하여 평가 하였는데, DCFH-DA는 H2O2 또는 하이드록시 라디칼과 같은 ROS에 의해 형광 DCF로 변환된다. 다양한 ROS의 존재하에 DCFH의 산화에 기인한 2',7'-디클로로플루오레신(DCF)의 형성을 485 nm의 여기 파장(Ex) 및 535 nm의 방출 파장(Em)에서 유세포분석기(flow cytometry) (FACS caliber, Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다.
도10에서 보듯이, 페로센 단독 처리(25μM)시에는 대조군보다 ROS 생성이 조금 증가했다. 이것은 암세포에서 높은 수준의 내인성 H2O2와 페로센이 펜톤반응(Fenton reactions)을 하기 때문이다. BCA (80μM) 역시 ROS 생성이 조금 증가했다. 또한, 페로센과 BCA를 함께 처리한 군은 더 많은 펜톤 반응으로 ROS 생성이 더욱 증가했다. 본 발명에 따른 polyBCAFE 100μg을 처리한 군은 ROS가 현저히 증가했다. 이것은 H2O2 및 하이드록시 라디칼 때문이라는 것을 말한다.
상기 polyBCAFE 마이셀이 세포에서 H2O2를 생성하고 후속적으로 펜톤 반응을 통해 하이드록시 라디칼 생산을 유도하는지 여부를 입증하기 위해, polyBCAFE 100 μg을 처리하여 48시간 동안 배양한 후, H2O2 소거 카탈라아제 또는 하이드록시 라디칼 소거 티오우레아(thiourea)를 처리하여 반응시키고, DCFH-DA를 상기 방법과 같이 추가하였다. 그 결과, 도 11에서 보듯이, 카탈라아제의 전처리는 DCF 형광을 현저히 감소시켰다. 이것은 polyBCAFE 에서 방출된 BCA가 H2O2를 생성하는 것을 나타낸다. 티오우레아의 전처리도 효과적으로 하이드록시 라디칼을 소거하여 DCF 형광을 감소시켰다. 이것은 polyBCAFE 마이셀이 펜톤 반응을 통하여 하이드록시 라디칼을 생성하는 것을 암시한다.
<실험예 7> polyCAFE 의 마이셀의 세포독성 실험
polyCAFE 마이셀의 세포 독성은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) 감소 분석을 이용하여 조사하였다. SW620(전립선암), DU14(대장암) 및 NIH3T3(정상) 세포를 24-웰 플레이트에 1×105cells/well의 농도로 접종하고 ~90%의 confluency (세포가 자란 정도)에 도달하기까지 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 벤조일옥시신남알데하이드 (BCA), 페로센, 벤조일옥시신남알데하이드 (BCA)와 페로센, 또는 polyBCAFE 마이셀 (50 및 100 ㎍)과, H2O2 및 하이드록시 라디칼 소거 효소 전처리 후 polyBCAFE를 세포에 각각 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 각각의 웰에 100μL의 MTT 용액을 붓고 다시 2시간 동안 배양하였다. 생성된 포르마잔 결정은 200μL의 DMSO용액으로 용해시켰다. 배양 10분후 흡광도를 570 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Biotek Instruments, Winooski, VT)를 사용하여 측정하였다. 세포 생존은 마이셀 처리 세포의 흡광도와 대조 세포의 흡광도를 비교하여 결정하였으며, 이의 결과를 도14a 내지 도14c에 나타내었다.
도 12a 내지 도12c에 나타낸 바와 같이 정상세포(도 12a)에서는 독성이 거의 나타나지 않았으며, DU14 (도 12b) 및 SW620(도 12c) 세포에서는 polyBCAFE 마이셀이 용량 의존성 세포독성을 나타내었고, 100 ㎍에서는 50%이상의 세포가 죽었다. 또한, H2O2 및 하이드록시 라디칼 소거 효소인 카탈라아제 및 티오우레아는 polyBCAFE 마이셀의 세포 사멸 효과를 억제하였다. 이것은 polyBCAFE 마이셀이 H2O2와 하이드록시 라디칼을 생성하여 암세포를 죽인다는 것을 가리킨다.
<실험예 8> 세포의 사멸을 조절하는 단백질의 발현여부를 측정
polyBCAFE 마이셀이 상승적인 ROS-매개 세포 자멸사가 유도되었는지 조사하기 위해 세포 자멸사-조절 단백질의 발현을 western blot assay를 통하여 측정하였다.
세포는 6-웰 플레이트에 1.5×106 cells/well의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후 다양한 혼합물(a : 대조군, b : 페로센 5μg/mL, c : BCA 20μg/mL, d : BCA와 페로센, e : polyBCAFE 100μg/mL)로 처리하고 36시간동안 배양한 뒤, PBS용액으로 두 번 세척하였다. Lysis buffer로 셀에서의 단백질을 추출하고, 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 20μg의 세포 용해물을 사용하여 전기영동을 시켰다. 그리고 난 후, 단백질이 PVDF 막으로 전이되도록 하였다. Blot 은 PARP 단일클론항체 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), caspase-3 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) 그리고 2차 항체로 쓰이는 HRP-conjugated goat anti-mouse (Millipore, Billerica, MA)로 배양하였다. Immunoblot signal은 Super Signal Ultra chemiluminescent reagent (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 현상하였고 이의 결과를 도13에 나타내었다. 도 13에 나타난 바와 같이, 대조군(a)에 비해 polyBCAFE 마이셀을 처리한 군의 단백질 발현정도가 농도 의존적으로 현저히 감소한 것을 알 수 있다.
<실험예 9> 종양을 가진 마우스에서 polyBCAFE 마이셀의 항 종양 효과 확인
polyBCAFE 마이셀의 치료 효과를 평가하기 위해, 누드 마우스(4주령, Orient Bio,서울, 한국)의 등에 SW620 인간의 대장암 세포 (2.5ㅧ106 세포)를 접종하여 피하 종양을 생성시켰다. 종양의 크기가 약 ~0.5 mm3에 도달했을 때, 마우스에 다음 중 하나를 정맥 주사하였다 :BCA (2 mg/kg), 페로센 (2㎎/㎏), BCA와 페로센(2㎎/㎏), polyBCAFE 마이셀 (2㎎/㎏) 처리군. 각 샘플은 21일 동안 3일에 한번씩 정맥 주사하였다. 체중과 종양의 부피는 22일 동안 3일에 한번씩 기록하였다. 종양의 길이와 폭은 디지털 캘리퍼스(digital calipers)로 측정하였으며, 종양의 부피는 다음과 같은 공식을 사용하여 계산하였다: (너비2×길이)/2. 끝으로, 마우스를 개복하여 종양의 질량을 측정하였다. 약물 분포 연구를 위하여, 마우스에게 실시예 4에서 제조된 본 발명에 따른 고분자 조영제인 IR820-labeled polyBCAFE micelles 을 주사하고 장기를 적출하여 이의 형광 이미지를 fluorescence imaging system (FOBI, Neoscience, Korea)을 사용하여 확인 하였다.
종양 조직은 H&E 염색(도14)과, DAPI 및 TUNEL 염색(도15)으로 확인하였으며, 이의 결과를 도14 및 도15에 나타내었다. 도14 및 도15에서 보듯이 polyBCAFE 마이셀을 처리한 군에서 세포 사멸이 현저히 일어남을 알 수 있었다.
도16a은 종양을 가진 마우스와 그 종양 크기 변화를 나타내며, 도16b는 종양의 크기 변화를 그래프로 나타낸 것이고, 도16c는 종양을 가진 마우스에서 IR820-labeled polyBCAFE 마이셀의 생체 분포를 나타낸 것이고, 도 16d는 IR820-labeled polyBCAFE 마이셀로 처치된 마우스의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 도 16a 내지 도16b에 나타낸 바와 같이, polyBCAFE 마이셀 처리군에서 종양 크기가 대조군 또는 BCA, 페로센, BCA와 페로센을 처리한 경우의 종양 크기보다 현저히 줄어드는 것을 확인하였고, 형광 이미지를 통해 polyBCAFE의 분포는 암조직에 선택적으로 분포되는 것을 확인하였다.
이상에서 살펴본 본 발명은 도면에 도시된 실시예들을 참고로 하여 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 실시예의 변형이 가능하다는 점을 이해할 것이다. 그러나, 이와 같은 변형은 본 발명의 기술적 보호범위 내에 있다고 보아야 한다. 따라서, 본 발명의 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해서 정해져야 할 것이다.

Claims (20)

  1. 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A); 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 화학식 2로 표시되는 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터), 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 화학식 2로 표기되는 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물, 또는 이의 공중합체(B);를 공중합시킨,
    신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112016082376816-pat00019

    상기 R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, OCO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
    [화학식 2]
    (C5H5)2MNH2
    M은 금속원자이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R은 H, F, OH, CH3, OCH3 또는 OCOPh 인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 2에서 M은 Fe, Pt, Ni, Zn 또는 Cu 인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)은 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물의 말단에 아크릴레이트 및 메타크릴레이트로 구성된 군으로부터 선택된 관능기를 포함하는 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)은 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 신남알데하이드 유도체 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터), 및 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B)는 pH 6.6 이하에서 이온화되는 3차 아민기를 포함하는, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터), 및 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물, 또는 이의 공중합체(B)는, 신남알데하이드 유도체를 아크릴레이트 또는 아크릴아미드 계열 화합물과 반응시켜 생성된 신남알데하이드 유도체가 연결된 비스아크릴레이트 또는 비스아크릴아마이드를 아미노 메탈로센 유도체 및 아민 계열 화합물을 중합시켜 형성되고, 상기 아크릴레이트 계열 화합물은 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시프로필 아크릴레이트, 2-하이드록시부필 아크릴레이트, 2-하이드록시펜틸 아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이며, 상기 아크릴아마이드 계열 화합물은 2-(2-하이드록시에틸) 아이소인도린-1,3-다이온, 2-(3-하이드록시프로필) 아이소인도린-1,3-다이온, 2-(4-하이드록부틸)아이소인도린-1,3-다이온로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 아민 계열 화합물은 1차 아민 또는 2차 아민 함유 디아민 화합물인 것을 특징으로 하고, 상기 1차 아민 화합물은 3-메틸-4-(3-메틸페닐)피페라진, 3-메틸피페라진, 4-(비스-(플루오로페닐)메틸)피페라진, 4-(에톡시카르보닐메틸)피페라진, 4-(페닐메틸)피페라진, 4-(1-페닐에틸)피페라진, 4-(1,1-디메톡시카르보닐)피페라진, 4-(2-(비스-(2-프로페닐)아미노)에틸)피페라진, 메틸아민, 에틸아민, 부틸아민, 헥실아민, 2-에틸 헥실 아민, 2-피페리딘-1-에틸아민, C-아지리딘-1-일-메틸아민, 1-(2-아미노에틸)피페라진 (1-(2-aminoethyl)piperazine), 4-(아미노메틸)피페라진(4-(aminomethyl)piperazine), N-메틸에틸렌디아민 (N-methylethylene diamine), N-에틸에틸렌디아민 (N-ethylethylenediamine), N-헥실에틸렌디아민 (Nhexylethylenediamine), 피콜리아민 (pycoliamine) 및 아데닌 (adenine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이며, 상기 2차 아민 함유 디아민 화합물은 피페라진, 피페리딘(piperidine), 피롤리딘(pirrolidine), 3,3-디메틸피페리딘 (3,3-dimethylpiperidine), 4,4'-트리메틸렌 디피페리딘, N,N'-디메틸에틸렌 디아민, N,N'-디에틸 에틸렌 디아민, 이미다졸리딘 및 디아제판으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체는 하기 화학식 3 내지 12로 표시되는 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 블록 공중합체인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
    [화학식3]
    Figure 112016082376816-pat00020

    [화학식4]
    Figure 112016082376816-pat00021

    [화학식5]
    Figure 112016082376816-pat00022

    [화학식6]
    Figure 112016082376816-pat00023

    [화학식7]
    Figure 112016082376816-pat00024

    [화학식8]
    Figure 112016082376816-pat00025

    [화학식9]
    Figure 112016082376816-pat00026

    [화학식10]
    Figure 112016082376816-pat00027

    [화학식11]
    Figure 112016082376816-pat00028

    [화학식12]
    Figure 112016082376816-pat00029


    상기 화학식 3 내지 12에서, R1 내지 R8은 C1-C30의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기이며, R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이며, M은 금속원자이며, x, y, z 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이며, p는 0 내지 10의 정수이다.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체는 하기 화학식 13 내지 16으로 표시되는 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 블록 공중합체인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
    [화학식13]
    Figure 112016082376816-pat00030

    [화학식14]
    Figure 112016082376816-pat00031

    [화학식15]
    Figure 112016082376816-pat00032

    [화학식16]
    Figure 112016082376816-pat00033

    상기 화학식 13 내지 16에서, x, y 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이다.
  11. 1) 아크릴레이트 계열 화합물 또는 아크릴아마이드 계열 화합물을 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 반응시켜, 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-아크릴아마이드 계열 화합물을 얻는 단계; 및
    2) 상기 1)단계에서 제조된 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체-아크릴아마이드 계열 화합물을 하기 화학식 2로 표시되는 아미노 메탈로센 유도체, 아민 계열 화합물 및 에틸렌 글리콜 계열 화합물과 반응시켜, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 얻는 단계; 를 포함하는,
    신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체의 제조방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112016082376816-pat00034

    상기 R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, OCO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
    [화학식 2]
    (C5H5)2MNH2
    M은 금속원자이다.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 1)단계의 아크릴레이트 계열 화합물은 2-히드록실 에틸 아크릴레이트이고, 상기 2)단계의 아민 계열 화합물은 4,4'-트리메틸렌-디피페리딘이고, 에틸렌 글리콜 계열 화합물은 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체의 제조방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물의 제조방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체 함유 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 블록 공중합체에 항암제를 봉입하여 포함하는 고분자 마이셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 블록 공중합체에 조영물질을 봉입하여 포함하는 고분자 마이셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  16. 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A); 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 화학식 2로 표시되는 아미노 메탈로센 유도체와 조영물질이 치환된 폴리(β-아미노에스터), 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체와 화학식 2로 표기되는 아미노 메탈로센 유도체와 조영물질이 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물, 또는 이의 공중합체(B);
    를 공중합시킨, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체와 조영물질 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방치료 및 진단용 약학조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112016082376816-pat00035

    상기 R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, OCO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
    [화학식 2]
    (C5H5)2MNH2
    M은 금속원자이다.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 조영물질은 근적외선의 형광을 나타내는 조영물질인 것으로서, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체와 조영물질 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방치료 및 진단용 약학조성물.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R은 H, F, OH, CH3, OCH3 또는 OCOPh 인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체와 조영물질 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방치료 및 진단용 약학조성물.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 화학식 2에서 M은 Fe, Pt, Ni, Zn 또는 Cu 인, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체와 조영물질 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방치료 및 진단용 약학조성물.
  20. 제 16항에 있어서, 상기 블록 공중합체는 화학식 17로 표시되는, 신남알데하이드 유도체와 아미노 메탈로센 유도체와 조영물질 함유 블록 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 예방치료 및 진단용 약학조성물.

    [화학식 17]
    Figure 112016082376816-pat00036

    상기 R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, OCO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
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