KR20140046389A - 신남알데하이드 유도체 함유 ｐＨ 민감성 블록 공중합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

신남알데하이드 유도체 함유 ｐＨ 민감성 블록 공중합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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박상아
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Abstract

본 발명은 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 마이셀을 형성하여 신남알데하이드 유도체가 체내에서 보다 오래 지속되도록 하고, 암조직의 약산성 pH에서 마이셀이 붕괴되고 신남알데하이드 유도체가 연결된 아세탈 결합이 끊어져 신남알데하이드 유도체가 생성 및 방출되어 암세포에 특이적으로 작용하여 정상세포에 미치는 독성이 적어 그 자체만으로도 항암효과가 있으며, 약물전달체로서 항암제를 포접시켜 암세포까지 전달할 수 있는 효과가 있다.

Description

신남알데하이드 유도체 함유 ｐＨ 민감성 블록 공중합체 및 이의 제조방법{ｐＨ sensitive block copolymer comprising cinnamaldehyde derivative and method for preparing the same}
본 발명은 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
신남알데하이드는 한약재, 음료 및 음식에 사용되는 계피유의 주성분이며 특유의 향과 항균작용을 가지고 있다. 특히 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 항암효과를 발휘하는 것으로 알려지면서 최근 국내외에서 관심이 증가되고 그 약효에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만 신남알데하이드는 생체 내 반감기가 매우 짧기 때문에, 이를 직접적으로 섭취하였을 경우에는 체내에 오래 머물지 못하고 약 10분 내외에 분해되거나 외부로 배출되는 문제점을 안고 있다.
마이셀(micelle)은 일반적으로 양친성(amphiphilic), 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하는 것이다. 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 마이셀 내부에 존재하게 되며, 이러한 마이셀은 체내에서 온도나 pH 변화에 반응하여 표적 지향적 약물방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 담체(carrier)로서의 응용 가능성이 대단히 높다고 볼 수 있다.
대한민국 특허출원 제 10-2001-0035265호에서는 폴리에틸렌글리콜과 생분해성 고분자를 이용한 마이셀의 제조에 관하여 기재하고 있다. 이들 물질은 모두 생분해성을 갖고 있기 때문에 생체친화성을 갖고 있다는 장점은 있으나, 체내 변화, 예컨대 pH와 같은 특정 변화에 민감한 것이 아니기 때문에 원하는 부위에서의 약물 전달이 어렵다는 단점이 있다.
한편, 체내의 pH 환경은 일반적으로 pH 7.2 내지 7.4를 나타내나, 암세포와 같은 비정상 세포의 주변 환경은 pH 6.0 내지 7.2로 약산성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는 암세포에 특정적으로 약물을 전달하기 위해서 pH 7.2 이하에서 약물을 방출하도록 하는 연구가 이루어지고 있다.
따라서, 신남알데하이드를 마이셀의 형태로 제조하여 생체 내에 머무르는 시간을 연장시켜 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있는 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 신남 알데하이드 유도체를 생체 내에 오래 머물게 하고, 암세포에 특이적으로 전달하는 방법에 대해 탐색하던 중, 신남알데하이드 유도체를 포함하는 블록 공중합체가 마이셀로 형성되면 생체 내에 머무르는 시간이 증가하고, 암세포에 특이적으로 작용한다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 고분자 마이셀을 포함하는 약물 전달체를 제공하고자 한다.
본 발명은 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체의 제조방법을 제공한다.
*또한, 본 발명은 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고분자 마이셀을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 마이셀을 형성하여 신남알데하이드 유도체가 체내에서 보다 오래 지속되도록 하고, 암조직의 약산성 pH에서 마이셀이 붕괴되고 신남알데하이드 유도체가 연결된 아세탈 결합이 끊어져 신남알데하이드 유도체가 생성 및 방출되어 암세포에 특이적으로 작용하여 정상세포에 미치는 독성이 적어 그 자체만으로도 항암효과가 있으며, 약물전달체로서 항암제를 포접시켜 암세포까지 전달할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 PCAE-PEG의 1H NMR의 결과를 나타낸 도이다(a-CDCl3, b-D2O).
도 2는 BPCAE-PEG의 1H NMR의 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 PCAE-PEG의 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 BPCAE-PEG의 임계 마이셀 농도측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 PCAE-PEG 마이셀의 pH 의존성 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 BPCAE-PEG 마이셀의 pH 의존성 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 DLS(Dynamic light scattering)를 이용한 PCAE-PEG 마이셀의 크기 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 DLS를 이용한 BPCAE-PEG 마이셀의 크기 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 PCAE-PEG 마이셀의 FBS의 존재 유무에 따른 안정도를 나타낸 도이다.
도 10은 PCAE-PEG 마이셀 크기 분석을 위한 투시전자현미경(TEM)의 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 PCAE-PEG 마이셀로부터의 pH 변화에 따른 신남알데하이드의 방출속도 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 12은 활성 산소종 발생 확인을 위한 공초점 주사레이저현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다(a - 신남알데하이드 100 uM, b - PAE 마이셀 100 ug, c - PCAE 마이셀 50 ug, d - PCAE 마이셀 100 ug, e - CPT 10 ug, f - CPT 포접된 PAE 100 ug, g - CPT 포접된 PCAE 100 ug, h - 항산화물질 NAC + PCAE 마이셀 100 ug).
도 13는 활성 산소종 발생 결과의 비교를 나타낸 도이다.
도 14은 아폽토시스 확인을 위한 유세포분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15은 아폽토시스 확인을 위한 공초점 주사레이저현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다(a - 미처리 세포, b - 신남알데하이드 100 uM, c - PAE 마이셀 100 ug, d - CPT 포접된 PAE 100 ug, e - PCAE 마이셀 100 ug, f - CPT 포접된 PCAE 100 ug).
도 16은 BPCAE-PEG 마이셀의 pH 및 H2O2에 대한 민감성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 PCAE-PEG 마이셀 또는 BPCAE-PEG 마이셀의 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 종양을 가진 마우스에서 PCAE-PEG 마이셀의 항 종양 효과를 H&E 염색(a), 및 DAPI 및 TUNEL 염색(b)으로 확인한 도이다.
도 19는 종양을 가진 마우스에서 PCAE 마이셀의 항 종양 효과를 나타낸 도이다[(a) 종양을 가진 마우스, (b) 종양을 가진 마우스의 종양 크기 변화, (c) 종양을 가진 마우스에서 프로토포피린이 적재된 PCAE 마이셀의 생체 분포].
본 발명은
폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A); 및
하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B);
를 공중합시킨, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에 있어서, R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, COO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
바람직하게는, 상기 화학식 1에 있어서, R은 H, OH, CH3, OCH3 또는 COOPh이다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 pH에 민감한 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터), 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민) 또는 이들의 공중합체와, 친수성을 갖는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을 공중합시킴으로써 신남알데하이드 유도체가 치환되어 있으며, 마이셀 형성이 가능하고 pH 변화에 민감하기 때문에 약산성의 암조직에서 마이셀이 붕괴될 경우에는 마이셀 내부에 포접되어 있던 항암제 등의 약물이 방출되고, 또한 아세탈 결합이 끊어지면서 신남알데하이드 유도체가 방출되어 항암효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 양친성과 pH 민감성으로 인해 pH 변화에 따라 마이셀(micelle)을 형성하거나 붕괴할 수 있으며, 바람직하게는 pH가 6.7 내지 7.4 범위인 경우 마이셀을 형성하고, pH가 6.6 이하의 범위인 경우 마이셀이 붕괴하게 된다. 특히, 본 발명의 블록 공중합체는 pH ±0.2 범위 이내의 우수한 민감성을 나타낸다는 장점을 가지므로, 체내 pH 변화에 따른 민감성이 요구되는 용도, 예컨대 약물방출용 담체 또는 진단 용도 등에서 만족스런 결과를 도출해낼 수 있다.
*본 발명의 블록 공중합체는 pH 민감성 유지 및 마이셀을 형성하는 물성을 유지하는 한, 전술한 친수성 폴리에틸렌글리콜계열 화합물과 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 화합물 이외에, 다른 당 업계의 통상적인 단위체를 더 포함할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범주에 속한다.
상기 블록 공중합체의 분자량 범위는 특별한 제한은 없으나, 1000 내지 20000 범위가 바람직하다. 분자량이 1000 미만인 경우 특정 pH에서 블록 공중합체 마이셀이 형성되기 어려울 뿐만 아니라 형성되더라도 물에 용해되어 붕괴되기 쉽다. 또한, 분자량이 20000을 초과하는 경우 친수성/소수성의 밸런스가 깨져 특정 pH에서 마이셀이 형성하지 못하고 침전될수 있다.
본 발명에 따른 블록 공중합체의 구성 성분 중 하나인, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)은 당 업계에 알려진 통상적인 친수성을 갖는 생분해성 화합물을 제한 없이 사용 가능하나, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물 말단에 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 등의 단일 관능기(monofunctional)를 가지거나, 또는 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 것이 특히 바람직하다. 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)의 경우 폴리에틸렌글리콜이 말단이 아닌 주사슬에 포함되어 있어 빗형(come-like) 블록 공중합체를 형성하게 하며, 이로 인해 마이셀보다 더욱 안정한 나노입자를 형성할 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물의 분자량(Mn)은 특별한 제한이 없으나, 500 내지 5000 범위가 바람직하다. 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물의 분자량(Mn)이 상기 범위를 벗어나는 경우, 예컨대 500 미만인 경우와 5000을 초과하는 경우 최종 블록 공중합체의 분자량 조절이 어려울 뿐만 아니라 상기 블록 공중합체를 이용하여 마이셀을 형성하는 것이 용이하지 않다. 즉, 분자량이 500 미만인 경우 특정 pH에서 친수성 블록의 길이가 너무 짧아 친수성/소수성에 의한 자기 조합(self-assembly)이 일어나지 못하여 마이셀 형성이 어려울 뿐만 아니라 형성되더라도 물에 용해되어 붕괴되기 쉽다. 또한, 분자량이 5000을 초과하는 경우 소수성인 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터) 또는 폴리(아미도 아민)의 분자량에 비해 블록 길이가 너무 커져서 친수성/소수성의 밸런스가 깨져 특정 pH에서 마이셀이 형성하지 못하고 침전될 수 있다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체 중 폴리에틸렌글리콜(A) 계열 블록의 함량은 특별한 제한이 없으나, 5 내지 95 중량부가 적절하며, 바람직하게는 5 내지 40 중량부이다. 폴리에틸렌글리콜은 모노아크릴레이트로 중합과정에서 한쪽 말단만 반응하는 종결자로 작용할 수 있다. 따라서 폴리에틸렌글리콜 계열 블록의 함량이 5 중량부 미만인 경우에는 상기 블록 공중합체의 고분자의 분자량은 높아지지만 폴리에틸렌글리콜 계열 블록이 연결된 공중합체의 수율이 낮아지고, 95 중량부를 초과하는 경우에는 종결반응이 너무 많이 일어나서 폴리에틸렌글리콜 계열 블록이 많이 연결될 수 있지만 중합반응이 많이 일어나지 않아서 분자량이 낮아진다. 또한 상기 블록 공중합체는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물과 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 또는 폴리(아미도 아민)의 반응 몰비를 조절함으로써 AB형의 이중 블록 공중합체; ABA 또는 BAB 형의 삼중 블록 공중합체 또는 그 이상의 다양한 블록 형태를 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 블록 공중합체의 구성 성분 중 다른 하나인, 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B)는 소수성과 pH 민감성을 동시에 갖는, 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 화합물로서 이의 비제한적인 예로는 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터), 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민) 또는 이들의 혼합 공중합물 등이 있다. 이들은 자체 내 존재하는 3차 아민기로 인해 pH에 따라 물에 대한 용해도가 달라지는 이온화 특성을 가짐으로써, 체내 pH 변화에 따라 마이셀 구조를 형성 및/또는 붕괴할 수 있다. 구체적으로, 이들은 pH 6.6 이하에서 이온화되는 3차 아민기를 포함할 수 있다. 상기 화합물들은 당 업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이의 일 실시예를 들면, 먼저 비스아크릴레이트 화합물 또는 비스아크릴아마이드 화합물에 신남알데하이드 유도체를 치환시킨 후, 마이클 반응을 통하여 신남알데하이드 유도체가 치환된 비스아크릴레이트 화합물 또는 신남알데하이드 유도체가 치환된 비스아크릴아마이드 화합물에 아민 계열 화합물을 중합시켜서 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 화합물을 얻을 수 있다.
여기서 사용된 비스아크릴레이트 화합물의 비제한적인 예로는 3-(페닐프로프-2-엔-1,1-디일) 비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 1,4-부탄디올 디아크릴레이트, 1,3-부탄디올 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 에톡실레이트 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 프로폭실레이트 디아크릴레이트, 3-하이드록시-2,2-디메틸프로필 3-하이드록시-2,2-디메틸프로피오네이트 디아크릴레이트, 1,7-헵탄디올 디아크릴레이트, 1,8-옥탄디올 디아크릴레이트, 1,9-노나디올 디아크릴레이트, 1,10-데칸디올 디아크릴레이트 또는 이들의 혼합물 등이 있다.
또한, 비스아크릴아마이드 계열 화합물의 비제한적인 예로는 N,N'-메틸렌 비스아크릴아마이드(MDA), N,N'-에틸렌 비스아크릴아마이드 또는 이들의 혼합물 등이 있다. 상기 디아크릴아마이드 화합물과 아민계 화합물로는 4-아미노메틸피페리딘(AMPD), N-메틸 에텔렌디아민(MEDA)을, 그리고 1-(2-아미노에틸)피페리딘(AEPZ)를 사용하여 당 업계에 알려진 통상적인 방법, 예컨대 마이클 반응에 따라 제조될 수 있다.
또한, 아민 계열 화합물은 아민기를 갖는 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용 가능하며, 1차 아민, 2차 아민 함유 디아민 화합물 또는 이들의 혼합물 등이 바람직하다.
상기 1차 아민 화합물의 비제한적인 예로는 3-메틸-4-(3-메틸페닐)피페라진, 3-메틸피페라진, 4-(비스-(플루오로페닐)메틸)피페라진, 4-(에톡시카르보닐메틸)피페라진, 4-(페닐메틸)피페라진, 4-(1-페닐에틸)피페라진, 4-(1,1-디메톡시카르보닐)피페라진, 4-(2-(비스-(2-프로페닐)아미노)에틸)피페라진, 메틸아민, 에틸아민, 부틸아민, 헥실아민, 2-에틸 헥실 아민, 2-피페리딘-1-에틸아민, C-아지리딘-1-일-메틸아민, 1-(2-아미노에틸)피페라진(1-(2-aminoethyl)piperazine), 4-(아미노메틸)피페라진(4-(aminomethyl)piperazine), N-메틸에틸렌디아민(N-methylethylenediamine), N-에틸에틸렌디아민(N-ethylethylenediamine), N-헥실에틸렌디아민(N-hexylethylenediamine), 피콜리아민(pycoliamine), 아데닌(adenine) 등이 있으며,
상기 2차 아민 함유 디아민 화합물의 비제한적인 예로는 피페라진, 피페리딘(piperidine), 피롤리딘(pirrolidine), 3,3-디메틸피페리딘(3,3-dimethylpiperidine), 4,4'-트리메틸렌 디피페리딘, N,N'-디메틸에틸렌 디아민, N,N'-디에틸 에틸렌 디아민, 이미다졸리딘 또는 디아제판 등이 있다.
상기 pH 민감성을 나타내는 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 또는 폴리(아미도 아민) 제조시, 상기 비스아크릴레이트 화합물 또는 비스아크릴아마이드 화합물과 아민 계열 화합물의 반응 몰비는 1 : 0.5 ~ 2.0 범위가 바람직하다. 상기 아민 계열 화합물의 몰비가 0.5 미만 또는 2.0을 초과하는 경우 중합되는 고분자의 분자량이 1000 이하가 되므로 마이셀을 형성하기가 어렵게 된다.
바람직하게는 상기 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A); 및 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B);의 공중합을 통해 형성되는 본 발명의 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 하기 화학식 2 내지 6로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 4]
Figure pat00004
[화학식 5]
Figure pat00005
[화학식 6]
Figure pat00006
상기 화학식 2 내지 6에서, R1 내지 R7은 C1-C30의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기이며,
R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이며,
m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이며,
p는 0 내지 10의 정수이다.
바람직하게는, 본 발명의 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 하기 화학식 7 내지 8로 표시될 수 있다.
[화학식 7]
Figure pat00007
[화학식 8]
Figure pat00008
상기 화학식 7 내지 8에서, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이다.
본 명세서에서, PCAE-PEG 또는 PCAE는 폴리[(3-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-4,4'-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-폴리(에틸렌 글리콜)을 지칭하며, PAE-PEG 또는 PAE는 폴리(β-아미노 에스터)-co-폴리(에틸렌 글리콜)을 지칭한다. 또한, BPCAE-PEG 또는 BPCAE는 폴리[(3-벤조일옥시-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-4,4'-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-폴리(에틸렌 글리콜)을 지칭한다.
또한, 본 발명은
1) 아크릴레이트 계열 화합물 및 상기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체를 반응시켜, 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 계열 화합물을 얻는 단계; 및
2) 상기 1)단계에서 제조된 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 계열 화합물을 아민 계열 화합물 및 에틸렌 글리콜 계열 화합물과 반응시켜, 신남알데하이드 유도체 함유 블록 공중합체를 얻는 단계;
를 포함하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체의 제조방법을 제공한다.
이하, 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체의 제조방법에 대해 상세히 설명한다.
상기 1) 단계는 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 계열 화합물을 제조하는 단계로, 먼저 아크릴레이트 계열 화합물 및 히드로퀴닌을 유기용매에 용해시키고, 온도를 36 내지 96℃로 가열한다. 여기에 신남알데하이드 유도체 및 p-톨루엔술폰산을 가해준 후, 10 내지 24시간 동안 80 내지 99℃에서 가열한다. 이후, 온도를 상온으로 내리고 트리에틸아민을 넣어 반응을 종결시킨 뒤, 정제하여 생성물을 수득한다.
상기 2)단계는 신남알데하이드 유도체 함유 블록 공중합체를 제조하는 단계로, 상기 1)단계에서 제조한 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 계열 화합물 및 아민 계열 화합물을 유기용매에 용해하여 혼합한다. 상기 혼합물에 에틸렌 글리콜 계열 화합물을 가하고 온도를 35 내지 50℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합개시를 수행한다. 36 내지 96시간의 고분자 중합 이후에, 반응 혼합물을 차가운 유기용매으로 침전시켜 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 제조한다.
상기 아민 계열 화합물은 4.4'-트리메틸렌-디피페리딘이 바람직하며, 에틸렌 글리콜 계열 화합물은 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트인 것이 바람직하다.
상기 각 단계에서 사용된 유기용매로는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 디메틸 설폭사이드, 디메틸 포름아마이드, 메틸렌 클로라이드, 벤젠, 헥산 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
1') 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물 및 상기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체를 반응시켜, 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을 얻는 단계; 및
2') 상기 1')단계에서 제조된 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을, 아민 계열 화합물과 반응시켜, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형(come-like) 블록 공중합체를 얻는 단계;
를 포함하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형 블록 공중합체의 제조방법을 제공한다.
이하, 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형 블록 공중합체의 제조방법에 대해 상세히 설명한다.
상기 1') 단계는 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을 얻는 단계로, 신남알데하이드 유도체와 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물은 85-95:5-15의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다.
상기 2')단계는 신남알데하이드 유도체 함유 빗형 블록 공중합체를 제조하는 단계로, 상기 1')단계에서 제조한 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물 및 아민 화합물을 유기용매에 용해하여 혼합하며, 이때 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물과 아민 화합물은 0.8~1.2:1.2~0.8의 중량비로 반응하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:1의 중량비로 반응한다. 상기 혼합물에 에틸렌 글리콜 계열 화합물을 가하고 온도를 30 내지 50℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합개시를 수행한다. 48 내지 96시간의 고분자 중합 이후에, 반응 혼합물을 차가운 유기용매으로 침전시켜 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형 블록 공중합체를 제조한다.
상기 아민 계열 화합물로 아민기가 포함된 신남알데하이드 유도체를 사용하는 경우 블록 공중합체의 주사슬에 신남알데하이드의 양이 두배로 증가하여 그 효과 또한 증가하므로 더욱 강한 항암 효과를 볼 수 있어 바람직하다.
상기 에틸렌 글리콜 계열 화합물은 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트인 것이 바람직하다.
상기 각 단계에서 사용된 유기용매로는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 디메틸 설폭사이드, 디메틸 포름아마이드, 메틸렌 클로라이드, 벤젠, 헥산 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀 및 이를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
상기 고분자 마이셀은 두 가지 형태로 제작이 가능한데,
첫 번째로, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀이 가능하며,
두 번째로, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체, 및 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체에 봉입될 수 있는 생리 활성 물질을 포함하는 고분자 마이셀이 가능하다.
상기 첫 번째 형태의 고분자 마이셀은 고분자 자체에 신남알데하이드 유도체를 포함하고 있는 바, pH가 낮은 곳에 도달하게 되면 마이셀이 붕괴되어 신남알데하이드 유도체를 방출하여 암세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다.
또한, 상기 두 번째 형태의 고분자 마이셀은 pH가 낮은 곳에 도달하게 되면 마이셀이 붕괴되면서 1차적으로 신남알데하이드 유도체가 방출됨은 물론, 마이셀 내부에 포접되어 있던 생리 활성 물질 등이 방출되어 2차적인 작용을 할 수 있다.
상기 고분자 마이셀은 체내에 주입되었을 때 마이셀을 형성하고 있다가 암세포와 같이 국소적으로 pH가 낮은 곳에 도달하게 되면 마이셀이 붕괴됨으로써, 봉입된 담지 약물의 방출을 통해 표적 지향적 약물 전달이 이루어질 수 있다.
본 발명의 고분자 마이셀 형태의 블록 공중합체에 봉입될 수 있는 생리 활성 물질은 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역 억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제 또는 항히스타민제 등이 있다. 또한, 전술한 성분 이외에 당 업계에 알려진 통상적인 첨가제, 예컨대 부형제, 안정화제, pH 조정제, 항산화제, 보존제, 결합제 또는 붕해제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 생리 활성 물질로 함암제인 캠토테신(camptothecin, CPT)을 사용하였으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 고분자 마이셀의 제조방법은 교반, 가열, 초음파 주사, 유화법을 이용한 용매증발법, 매트릭스 형성 또는 유기용매를 이용한 투석법 등의 방법을 단독 또는 병행하여 사용할 수 있다.
제조된 고분자 마이셀의 직경은 특별한 제한이 없으나, 10 내지 1000nm 범위가 바람직하다. 또한, 상기 고분자 마이셀 약물 조성물은 경구제 또는 비경구제의 형태로 제제화하여 사용할 수 있으며, 정맥, 근육 또는 피하 주사제로 제조할 수 있다.
본 발명의 pH 민감성 마이셀은 특정 pH, 예컨대 체내 정상 세포의 pH 범위인 pH 6.7 ~ 7.4에서는 안정한 마이셀을 형성하고, 암 세포와 같은 비정상 세포가 나타내는 pH 범위 6.6 이하인 경우 상기 마이셀 구조가 붕괴됨으로써, 암 세포에 표적 지향적인 약물 방출용 담체로서 사용될 수 있다. 즉, 낮은 pH(pH 6.6 이하)에서는 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노 에스터), 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민) 또는 이들의 혼합 공중합물에 존재하는 3차 아민의 이온화도 증가로 인해 공중합체 전체가 수용성으로 변하게 되어 마이셀을 형성할 수 없게 되며, pH 7.4에서는 이의 이온화도가 저하되어 소수성 특징을 나타냄으로써 자기 조립에 의한 마이셀을 형성하는 것이다.
상기 pH 민감성 마이셀을 형성할 수 있는 블록 공중합체는 유전자 전달, 약물 전달 분야 뿐만 아니라 병의 진단을 위한 물질을 비정상 세포에 전달함으로써, 진단 이미징(diagnostic imaging) 등의 진단 용도에 응용될 수 있다.
추가적으로, 본 발명에서는 정상 체내 조건과 동일한 pH 6.7 ~ 7.4 범위에서는 마이셀을 형성하고 암세포와 같은 비정상 조건인 pH 6.6 이하에서는 마이셀이 붕괴되는 암세포 표적 지향적인 마이셀을 디자인하여 적용하였으나, 상기 블록 공중합체의 구성 성분, 이들의 몰비, 분자량 및/또는 블록 내 관능기를 적절히 변경함으로써 암세포 뿐만 아니라 유전자 변이 또는 다른 응용 분야에 표적 지향적인 마이셀을 디자인하여 이를 유용하게 응용할 수 있다.
본 발명에 따른 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 마이셀을 형성하여 신남알데하이드 유도체가 체내에서 보다 오래 지속되도록 한다. 또한, 암조직의 약산성 pH에서 마이셀이 붕괴되고 신남알데하이드 유도체가 연결된 아세탈 결합이 끊어져, 신남알데하이드 유도체가 생성 및 방출되어 암세포에 특이적으로 작용하여 정상세포에 미치는 독성이 적어 그 자체만으로도 항암효과가 있다. 또한, 약물전달체로서 항암제를 포접시켜 암세포까지 전달할 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 폴리[(3-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-4,4'-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-폴리(에틸렌 글리콜) (PCAE-PEG)의 제조
Figure pat00009

1-1. 3-(페닐프로프-2-엔-1,1-디일) 비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크 릴레이트의 제조
유기용매를 제외한 모든 시약은 sigma aldrich에서 구입하였다. 250 ml 용량의 이구 플라스크에 2-히드록실 에틸 아크릴레이트(10 mL, 96 mmol) 및 히드로퀴닌 (1 g)을 넣고 벤젠 80 ml을 가하여 용해시키고, 온도를 50℃로 가열하였다. 여기에 신남알데하이드 (4 mL, 32 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 (30 mg, 0.16 mmol)을 가해준 후, 12시간 동안 92℃에서 가열하였다. 이후, 온도를 상온으로 내리고 트리에틸아민을 넣어 반응을 종결시켰다. 그 다음, 회전증발기로 벤젠을 증발시키고 헥산 : 에틸 아세테이트(8:2)의 용리제를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 수득하였다.
1-2. 폴리[(3-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-4,4'-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-폴리(에틸렌 글리콜) (PCAE-PEG)의 제조
4.4'-트리메틸렌-디피페리딘(1.68 g, 8 mmol) 및 상기 실시예 1-1에서 제조한 3-(페닐프로프-2-엔-1,1-디일) 비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트 (2.49 g, 7.2 mmol)를 디클로로메탄 10 ml을 가하여 혼합하였다. 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트(MW:2000, 1.6 g, 0.8 mmol)를 상기 혼합물에 가하고 온도를 40℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합개시를 하였다. 48시간의 고분자 중합 이후에, 반응 혼합물을 차가운 헥산으로 침전시켜 점성이 있는 노란색 고분자 형태의 PCAE-PEG를 제조하였다. 제조한 PCAE-PEG에 대한 1H NMR 데이터를 도 1에 나타내었다(a-CDCl3, b-D2O).
실시예 2. 폴리[(3-벤조일옥시-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-4,4'-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-폴리(에틸렌 글리콜) (BPCAE-PEG)의 제조
2-1. 3-(벤조일옥시-페닐프로프-2-엔-1,1-디일) 비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트의 제조
250 ml 용량의 이구 플라스크에 2-히드록실 에틸 아크릴레이트(10 mL, 96 mmol) 및 히드로퀴닌(1 g)을 넣고 벤젠 80 ml를 가하여 용해시키고, 온도를 50℃로 가열하였다. 여기에 벤조일옥시 신남알데하이드(benzoyloxycinnamaldehyde) (4 mL, 32 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 (30 mg, 0.16 mmol)을 가해준 후, 12시간 동안 92℃에서 가열하였다. 이후, 온도를 상온으로 내리고 트리에틸아민을 넣어 반응을 종결시켰다. 그 다음, 회전증발기로 벤젠을 증발시키고 헥산 : 에틸 아세테이트(8:2)의 용리제를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 수득하였다.
2-2. 폴리[(3-벤조일옥시-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-4,4'-(트리메틸렌 디피페리딘)-co-폴리(에틸렌 글리콜) (BPCAE-PEG)의 제조
4.4'-트리메틸렌-디피페리딘(1.68 g, 8 mmol) 및 상기 실시예 2-1에서 제조한 3-(벤조일옥시-페닐프로프-2-엔-1,1-디일) 비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트(2.49 g, 7.2 mmol)를 디클로로메탄 10 ml에 가하여 혼합하였다. 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트(MW:2000, 1.6 g, 0.8 mmol)를 상기 혼합물에 가하고 온도를 40℃로 가열하고 교반하여 고분자 중합개시를 하였다. 48시간의 고분자 중합 이후에, 반응 혼합물을 차가운 헥산으로 침전시켜 점성이 있는 노란색 고분자 형태의 BPCAE-PEG를 제조하였다. 제조한 BPCAE-PEG에 대한 1H NMR 데이터를 도 2에 나타내었다.
실시예 3. 폴리[(3-페닐프로프-2-엔-1,1-디일)비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트]-co-5-메틸-2-스티릴-1,3-디옥산-5-아민 신남알데하이드-co-폴리(에틸렌 글리콜)의 제조 : 빗형 블록 공중합체
Figure pat00010
Figure pat00011

3-1. 3-(페닐프로프-2-엔-1,1-디일) 비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트의 제조
250 ml 용량의 이구 플라스크에 2-히드록실 에틸 아크릴레이트(10 mL, 96 mmol) 및 히드로퀴닌(1 g)을 넣고 벤젠 80 ml를 가하여 용해시키고, 온도를 50℃로 가열하였다. 여기에 신남알데하이드 (4 mL, 32 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 (30 mg, 0.16 mmol)을 가해준 후, 12시간 동안 92℃에서 가열하였다. 이후, 온도를 상온으로 내리고 트리에틸아민을 넣어 반응을 종결시켰다. 그 다음, 회전증발기로 벤젠을 증발시키고 헥산 : 에틸 아세테이트(8:2)의 용리제를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 수득하였다.
3-2. 5-메틸-2-스티릴-1,3-디옥산-5-아민 신남알데하이드(5-methyl-2-styryl-1,3,dioxan-5-amime cinnamaldehyde)의 제조
2-아미노-2-메틸-1,3-프로판올(2-Amino-2-methyl-1,3-propanediol)과 트리플루오로에틸아세테이트(trifluoroethylacetate)를 1:1의 중량비로 용해시키고, 12시간 반응시켜 N-(1,3-디히드록시프로판-2-일)-2,2,2-트리플루오로아세트아마이드(N-(1,3-dihydroxypropan-2-yl)-2,2,2-trifluoroacetamide)를 제조하였다. 상기 제조된 N-(1,3-디히드록시프로판-2-일)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드와 신남알데하이드를 1.5:1의 중량비로 1% 파라-톨루엔설폰산 (1%) 촉매 존재 하에서 7시간 반응시켜 2,2,2-트리플루오로-N-(5-메틸-2-스티릴-1,3-디옥산-5-일)아세트아미드(2,2,2-trifluoro-N-(5-methyl-2-styryl-1,3-dioxan-5-yl)acetamide)를 제조하였다. 이를 메탄올에 용해시키고 K2CO3를 이용하여 CO-CF3그룹을 제거하여 아민기가 첨가된 5-메틸-2-스티릴-1,3-디옥산-5-아민 신남알데하이드를 제조하였다.
3-3. 빗형(comb-like) 블록 공중합체의 제조
상기 실시예 3-1에서 제조한 디아크릴레이트에 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트와 신남알데하이드를 각각 가하여 결합시켜, PEG-디아크릴레이트 및 CA-디아크릴레이트를 제조하였다. 제조된 PEG-디아크릴레이트와 CA-디아크릴레이트를 5-15:85-95의 중량비로 혼합하였다. 여기에 상기 실시예 3-2에서 제조한 5-메틸-2-스티릴-1,3-디옥산-5-아민 신남알데하이드를 1:1의 중량비로 디클로로메탄 10 ml에 가하여 혼합하고 온도를 35℃로 가열하고 고분자 중합개시를 하였다. 72시간의 고분자 중합 이후에, 반응 혼합물을 차가운 헥산으로 침전시켜 미반응물을 제거하고, 진공건조하여 빗형 블록 공중합체를 제조하였다.
실시예 4. 마이셀의 제조
4-1. PCAE-PEG 마이셀의 제조
마이셀은 직접 용해(direct dissolution)방법을 이용하여 제조하였다. 구체적으로는, 실시예 1에서 제조된 PCAE-PEG 5 mg을 메탄올 100 ul에 용해한 후, PBS(pH 7.4) 50 ml에 가하였다. 이후, 회전증발기로 메탄올을 모두 증발시켜 100 ug/mL의 PCAE-PEG 마이셀을 수득하였다.
4-2. BPCAE-PEG 마이셀의 제조
상기 4-1에서 PCAE-PEG 대신 실시예 2에서 제조된 BPCAE-PEG를 사용한 것을 제외하고는, 상기 4-1과 동일한 방법으로 제조하여 BPCAE-PEG 마이셀을 수득하였다.
실시예 5. 캠토테신(camptothecin, CPT)이 포접된 마이셀의 제조
5-1. 캠토테신(camptothecin, CPT)이 포접된 PCAE-PEG 마이셀의 제조
캠토테신(camptothecin, CPT) 0.5mg을 에탄올 10 ul에 녹이고 실시예 1에서 제조된 PCAE-PEG 5 mg을 에탄올 100 ul과 혼합하였다. 상기 혼합물을 PBS 50 ml에 교반하면서 천천히 가하였다. 회전증발기로 메탄올을 모두 증발시켜 100 ug/mL의 CPT가 포접된 PCAE-PEG 마이셀을 수득하였다.
5-2. 캠토테신(camptothecin, CPT)가 포접된 BPCAE-PEG 마이셀의 제조
상기 5-1에서 PCAE-PEG 대신 실시예 2에서 제조된 BPCAE-PEG를 사용한 것을 제외하고는, 상기 5-1과 동일한 방법으로 제조하여 BPCAE-PEG 마이셀을 수득하였다.
실험예 1. 본 발명의 PCAE-PEG 또는 BPCAE-PEG의 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 측정
pH 7.4의 PBS 내의 PCAE-PEG의 임계 마이셀 농도(CMC) 또는 BPCAE-PEG의 임계 마이셀 농도를 형광 탐침으로써 파이렌(pyrene)을 사용하여 측정하였다.
구체적으로는, PCAE-PEG 마이셀 또는 BPCAE-PEG 마이셀은 PBS 내에서 여러가지 농도로 제조되었으며(2×10-4 내지 1×10-2 mg/ml), 여기에 상기와 같은 농도로 메탄올 내에 용해된 파이렌을 각각 가하였다. 파이렌이 포접된 PCAE-PEG 마이셀 또는 BPCAE-PEG 마이셀의 형광 발광 스펙트럼을 여기(excitation) 파장을 337 nm로 하고, 형광 분광광도계(FP-6500, JASCO Corp., Japan)를 이용하여 CMC를 측정하였다. 373 nm 및 384 nm에서 방출세기(emission intensity)의 비율을 PCAE-PEG의 질량 농도에 대하여 플롯팅하였다.
본 발명의 PCAE-PEG 또는 BPCAE-PEG의 임계 마이셀 농도의 측정 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, PCAE-PEG 마이셀은 5 ug/mL 이상에서 또는 BPCAE-PEG 마이셀은 8 ug/mL 이상에서 마이셀의 소수성 중심 내에 형광 탐침을 캡슐화하는 열역학적으로 안정적인 마이셀을 형성하는 것을 알 수 있다.
실험예 2. 본 발명의 PCAE-PEG 또는 BPCAE-PEG의 마이셀의 pH 의존성 측정
파이렌 5 mg을 메탄올 10 mL에 용해시킨 후, 20배 희석하였다. 큐벳에 준비한 상기 용액 0.5 uL를 가하고, 인산염 완충액(pH 5.4)으로 제조한 다른 pH 조건에 있는 100 ug/mL의 PCAE-PEG 마이셀 용액 또는 100 ug/mL의 BPCAE-PEG 마이셀 용액을 가하였다. 발광(photoluminescence) (FP-6500, Japan)을 이용하여 여기 파장을 337 nm로 하고, 373 nm 및 384 nm의 방출세기를 측정하였다. 373 nm 및 384 nm에서 방출세기의 비율을 pH에 대하여 플롯팅하였다.
본 발명의 PCAE-PEG 마이셀 또는 BPCAE-PEG 마이셀의 pH 의존성의 측정 결과를 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, PCAE-PEG 마이셀 및 BPCAE-PEG 마이셀 모두 pH 7.4에서는 안정적으로 마이셀을 형성하다가, pH가 감소함에 따라 인덱스 값이 감소하였으며, pH 6.6 이하에서는 마이셀이 존재하지 않게 되었다. 이는 소수성 블록 내의 3차 아민기(pKb=6.5)가 양성자화 되고, PCAE-PEG 전체가 수용성으로 변하게 되어 마이셀을 형성할 수 없음을 알 수 있다.
실험예 3. DLS(Dynamic light scattering)를 이용한 PCAE-PEG 또는 BPCAE-PEG의 마이셀의 크기 분석 및 투과전자현미경(TEM) 관찰
3-1. PCAE-PEG 또는 BPCAE-PEG의 마이셀의 크기 분석
10 %의 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 PBS로 제조한 PCAE-PEG 마이셀 용액 또는 BPCAE-PEG 마이셀 용액(100 ug/mL)을 3분간 원심분리 한 뒤, 상층액 3 mL를 얻어 쿼츠셀(quartz cell)에 가하였다. DLS(ELS-6000, Germany)를 이용하여 PCAE-PEG 또는 BPCAE-PEG의 마이셀의 크기를 측정하였다.
본 발명의 PCAE-PEG 또는 BPCAE-PEG의 마이셀의 크기의 측정 결과를 각각 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, PCAE-PEG 공중합체는 90 nm 이상의 단분산 구형 마이셀을 형성하고, BPCAE-PEG 공중합체는 115.8 nm 이상의 단분산 구형 마이셀을 형성하는 것을 확인하였다.
또한, FBS의 존재 유무에 따른 PCAE-PEG 마이셀의 안정도를 확인하기 위하여, 마이셀의 크기를 측정하였으며 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, PCAE-PEG 마이셀은 PBS에서 약 10시간 정도의 분석에서 크기의 변화를 나타내지 않았고, FBS가 존재하는 경우에는 크기가 조금 증가하였지만 통계적으로 유의할 정도는 아니며, HCl 용액을 가하여 pH가 감소하게 되면 마이셀의 크기가 급격히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이는 산성의 조건에서 아민 기가 소수성에서 친수성으로 변하면서 마이셀이 분해되는 것을 의미한다.
3-2. PCAE-PEG 마이셀의 투과전자현미경 관찰
PCAE-PEG 마이셀 용액 (100 ug/mL)을 탄소코팅 그리드(grid)에 올려 24시간 동안 건조 후, 1%의 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid)으로 염색하여 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)(Bio-TEM)(HITACHI H-7650, Japan)으로 관찰하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, PCAE-PEG 공중합체는 90 nm 이상의 단분산 구형 마이셀을 형성하는 것을 확인하였다.
실험예 4. PCAE-PEG 마이셀로부터 신남알데하이드의 방출속도 측정
pH 7.4 및 5.4 Sorensen 인산염 완충액으로 제조한 100 ug/mL의 PCAE-PEG 마이셀 용액 2 mL를 투석 튜브(dialysis tube) (aldrich, cutoff : 1000)에 가한 뒤, 외부용액(50mL)으로 방출되어 나오는 신남알데하이드의 양을 0 내지 80시간별로 샘플링하였다. 기준 곡선은 pH 7.4 및 5.4의 Sorensen 인산염 완충액에 신남알데하이드를 농도별로 녹여 각각 작성하였다. 샘플을 UV-Vis 분광광도계(OPTIZEN 2012 UV, Korea)를 이용하여 290 nm 파장에서 신남알데하이드의 농도를 측정하였다. 결과를 도 11에 나타내었다.
*도 11에 나타난 바와 같이, pH 5.4의 경우에는 80분이 경과하였음에도, 약 30%의 신남알데하이드가 방출되는 반면에, pH 7.4의 경우에는 약 25분만에 약 50%의 신남알데하이드가 방출되었으며, 약 50분 후에는 약 95% 이상의 신남알데하이드가 방출되었다. 따라서, 더 낮은 pH에서 신남알데하이드가 더 빠르게 방출됨을 알 수 있다.
실험예 5. 활성 산소종 발생 확인을 위한 공초점 주사레이저현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM) 관찰
SW620 세포(5×105)를 유리 바닥 디쉬(glass bottom dish)(MatTek Corp., Ashland, MA)에 배양하고, 신남알데하이드, PCAE-PEG 마이셀 또는 CPT가 포접된 마이셀로 각각 48시간 동안 처리하였다. 세포 내부 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)을 측정하기 위하여, 세포를 2',7'-디클로로플루오레세인디아세테이트(DCFH-DA)로 15분간 처리하였다. 아폽토틱 세포의 이미지화를 위하여 세포를 annexin V-FITC 및 PI(propidium iodide)로 염색하였다. 이후 세포를 신선한 배지로 2회 세척한 후, 공초점 주사레이저현미경(LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Inc. Germany)을 이용하여 분석하였다. 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 암 세포의 아폽토시스에 영향을 주는 ROS가 많이 생성됨에 따라 형광 강도가 강하게 나타나는데, 고분자 백본(backbone)에 신남알데하이드를 포함하지 않는 폴리(β-아미노 에스터)-co-폴리(에틸렌 글리콜)(PAE)의 경우에는 ROS를 거의 생성하지 못하였으며(도 12-b 참조), 신남알데하이드(도 12-a 참조) 및 PCAE-PEG(도 12-c, 도 12-d 참조)의 경우에는 ROS를 많이 생성하는 것을 확인하였다. 또한, CPT를 포접한 PCAE-PEG(도 12-g 참조)는 CPT를 포접한 PAE(도 12-f 참조)보다 ROS를 더 많이 생성하는 것을 확인하였다. 따라서, PCAE-PEG가 PAE에 비하여 암세포 사멸에 더 효과적이라는 것을 확인하였다.
실험예 6. 아폽토시스 확인을 위한 유세포분석 및 공초점 주사레이저현미경 관찰
SW620 세포(4×105)를 24-웰 플레이트에 24시간 동안 배양하고, 신남알데하이드, PCAE-PEG 마이셀 또는 CPT가 포접된 PCAE-PEG 마이셀로 각각 48시간 동안 처리하였다. 세포를 신선한 배지로 2회 세척한 후, 4×105 cells/mL에서 1× 결합 완충액에 재현탁하였다. 세포 배지 100 uL을 5mL의 배양 튜브로 옮기고 annexin V-FITC 5 uL 및 PI 10 uL를 가한 뒤, 부드럽게 혼합하였다. 이후 세포를 암실에서 실온으로 15분 동안 배양하고 1× 결합 완충액 400 uL을 가하였다. 염색된 세포는 유세포분석기(flow cytometry) (FACS caliber, Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다. 24시간, 48시간에 대하여, 1) 미처리 세포, 2) 폴리(β-아미노 에스터)-co-폴리(에틸렌 글리콜)(PAE), 3) CPT가 포접된 폴리(β-아미노 에스터)-co-폴리(에틸렌 글리콜)(CPT-PAE), 4) PCAE-PEG, 5) CPT가 포접된 PCAE-PEG(CPT-PCAE-PEG)의 아폽토시스 확인을 위한 유세포분석 결과 및 공초점 주사레이저현미경 관찰 결과를 각각 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, PCAE-PEG 및 CPT-PCAE-PEG의 경우에 오른쪽 상단 사분면에 세포의 수가 많으며, 시간이 지날수록 더 증가하는 바, 아폽토시스에 대한 효과가 가장 큰 것을 확인하였다.
또한 도 15에 나타난 바와 같이, PAE가 처리된 세포는 아폽토시스의 흔적을 알아보기 힘들었던 반면, CPT가 포접된 PCAE-PEG가 처리된 세포는 녹색 및 적색 형광이 뚜렷하게 나타나 아폽토시스가 일어났음을 확인하였다.
실험예 7. BPCAE-PEG 마이셀의 pH 및 H 2 O 2 에 대한 민감성 측정
BPCAE-PEG 마이셀의 pH와 H2O2에 대한 민감성을 분석하였으며, 이의 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 산성의 조건에서 아세탈 결합이 끊어지고 벤조일옥시 신남알데하이드가 생성되며(9.4ppm의 알데하이드 양이온), H2O2 존재 하에서 보로네이트 결합이 끊어지고 새로운 양이온 피크가 나타남을 확인하였다.
실험예 8. PCAE-PEG 및 BPCAE-PEG의 마이셀의 세포독성 실험
PCAE-PEG 마이셀의 세포 독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 감소 분석을 이용하여 조사하였다. SW620 세포를 24-웰 플레이트에 1×105 cells/well의 농도로 접종하고 ~90%의 confluency(세포가 자란 정도)에 도달하기까지 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 PCAE-PEG 마이셀 또는 BPCAE-PEG 마이셀의 다양한 양으로 세포를 각각 처리하고 24 시간 동안 배양하였으며, 각각의 웰에 100 μL의 MTT 용액을 붓고 다시 4시간 동안 배양하였다. 생성된 포르마잔 결정은 200μL의 디메틸설폭시화물(dimethylsulfoxide)로 용해시켰다. 배양 10 분 후 흡광도를 570 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Biotek Instruments, Winooski, VT)를 사용하여 측정하였다. 세포 생존은 마이셀 처리 세포의 흡광도와 대조 세포의 흡광도를 비교하여 결정하였으며, 이의 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, PCAE-PEG 마이셀 및 BPCAE-PEG 마이셀은 BCA와 같이 농도 의존적으로 세포독성을 가지며, BPCAE-PEG 마이셀은 PCAE-PEG 마이셀보다 높은 암세포 독성이 나타남을 확인하였다.
실험예 9. 종양을 가진 마우스에서 PCAE-PEG 마이셀의 항 종양 효과 확인
PCAE 마이셀의 치료 효과를 평가하기 위해, 누드 마우스(6주령, Orient Bio, 서울, 한국)의 등에 SW620 인간의 대장암 세포 (5.0×106 세포)를 접종하여 피하 종양을 생성시켰다. 종양의 크기가 약 ~50mm3 에 도달했을 때, 마우스에 다음 중 하나를 정맥 주사하였다 : (a) 식염수 (B) 신남알데하이드 (2㎎/㎏) (C) CPT (1㎎/㎏), (D) 빈 PCAE 마이셀(10㎎/㎏) 및 (E) 1㎎/kg의 CPT가 포접된 PCAE 마이셀 (10 ㎎/㎏). 각 샘플은 21일 동안 3일에 한번씩 정맥 주사하였다. 체중과 종양의 부피는 22일 동안 3일에 한번씩 기록하였다. 종양의 길이와 폭은 디지털 캘리퍼스(digital calipers)로 측정하였으며, 종양의 부피는 다음과 같은 공식을 사용하여 계산하였다: (너비2×길이)/2. 끝으로, 마우스를 개복하여 종양의 질량을 측정하였다. 간 종양 조직은 H&E 염색과 DAPI 및 TUNEL 염색으로 확인하였으며, 이의 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다. 도 18a는 H&E 염색, 도 18b는 DAPI 염색 및 TUNEL 염색(위: DAPI 염색, 아래: TUNEL 염색)을 나타낸다. 또한, 도 19a는 종양을 가진 마우스, 도 19b는 종양을 가진 마우스의 종양 크기 변화를 나타내며, 도 19c는 종양을 가진 마우스에서 프로토포피린이 적재된 PCAE 마이셀의 생체 분포를 나타낸다.
도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 CPT가 포접된 PCAE 마이셀로 처리한 경우 종양 크기가 비처리군 또는 신남알데하이드, CPT, 빈 PCAE 마이셀을 처리한 경우의 종양 크기보다 현저히 줄어드는 것을 확인하였다.

Claims (24)

  1. 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A); 및
    하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B);
    를 공중합시킨, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체:
    [화학식 1]
    Figure pat00012

    상기 R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, COO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R은 H, OH,CH3, OCH3 또는 COOPh인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 pH가 6.7 내지 7.4 범위에서 마이셀(micell)을 형성하며, pH가 6.6 이하 범위에서는 형성된 마이셀이 붕괴되는 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)은 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물의 말단에 아크릴레이트 및 메타크릴레이트로 구성된 군으로부터 선택된 관능기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물(A)은 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B)는 pH 6.6 이하에서 이온화되는 3차 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(β-아미노에스터) 및 신남알데하이드 유도체가 치환된 폴리(아미도 아민)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 공중합체(B)는,
    신남알데하이드 유도체가 치환된 비스아크릴레이트 또는 신남알데하이드 유도체가 치환된 비스아크릴아마이드 화합물; 및 아민 계열 화합물을 중합시켜 형성되는 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 비스아크릴레이트 화합물은 3-(페닐프로프-2-엔-1,1-디일) 비스(옥시)비스(에탄-2,1-디일) 디아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 1,4-부탄디올 디아크릴레이트, 1,3-부탄디올 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 에톡실레이트 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 프로폭실레이트 디아크릴레이트, 3-하이드록시-2,2-디메틸프로필 3-하이드록시-2,2-디메틸프로피오네이트 디아크릴레이트, 1,7-헵탄디올 디아크릴레이트, 1,8-옥탄디올 디아크릴레이트, 1,9-노나디올 디아크릴레이트, 1,10-데칸디올 디아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  9. 제 7항에 있어서 상기 비스아크릴아마이드 계열 화합물은 N,N'-메틸렌 비스아크릴아마이드 및 N,N'-에틸렌 비스아크릴아마이드로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 아민 계열 화합물은 1차 아민 또는 2차 아민 함유 디아민 화합물인 것을 특징으로 하는 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 1차 아민 화합물은 3-메틸-4-(3-메틸페닐)피페라진, 3-메틸피페라진, 4-(비스-(플루오로페닐)메틸)피페라진, 4-(에톡시카르보닐메틸)피페라진, 4-(페닐메틸)피페라진, 4-(1-페닐에틸)피페라진, 4-(1,1-디메톡시카르보닐)피페라진, 4-(2-(비스-(2-프로페닐)아미노)에틸)피페라진, 메틸아민, 에틸아민, 부틸아민, 헥실아민, 2-에틸 헥실 아민, 2-피페리딘-1-에틸아민, C-아지리딘-1-일-메틸아민, 1-(2-아미노에틸)피페라진(1-(2-aminoethyl)piperazine), 4-(아미노메틸)피페라진(4-(aminomethyl)piperazine), N-메틸에틸렌디아민(N-methylethylenediamine), N-에틸에틸렌디아민(N-ethylethylenediamine), N-헥실에틸렌디아민(N-hexylethylenediamine), 피콜리아민(pycoliamine) 및 아데닌(adenine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 2차 아민 함유 디아민 화합물은 피페라진, 피페리딘(piperidine), 피롤리딘(pirrolidine), 3,3-디메틸피페리딘(3,3-dimethylpiperidine), 4,4'-트리메틸렌 디피페리딘, N,N'-디메틸에틸렌 디아민, N,N'-디에틸 에틸렌 디아민, 이미다졸리딘 및 디아제판으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 하기 화학식 2 내지 6으로 표시되는 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 블록 공중합체인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체:
    [화학식 2]
    Figure pat00013

    [화학식 3]
    Figure pat00014

    [화학식 4]
    Figure pat00015

    [화학식 5]
    Figure pat00016

    [화학식 6]
    Figure pat00017

    상기 화학식 2 내지 6에서, R1 내지 R7은 C1-C30의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기이며,
    R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이며,
    m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이며,
    p는 0 내지 10의 정수이다.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체는 하기 화학식 7 내지 8로 표시되는 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 블록 공중합체인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체:
    [화학식 7]
    Figure pat00018

    [화학식 8]
    Figure pat00019

    상기 화학식 7 내지 8에서, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수이다.
  15. 1) 아크릴레이트 계열 화합물 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체를 반응시켜, 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 계열 화합물을 얻는 단계; 및
    2) 상기 1)단계에서 제조된 신남알데하이드 유도체-아크릴레이트 계열 화합물을 아민 계열 화합물 및 에틸렌 글리콜 계열 화합물과 반응시켜, 신남알데하이드 유도체 함유 블록 공중합체를 얻는 단계;
    를 포함하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00020

    상기 R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, COO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 1)단계의 아크릴레이트 계열 화합물은 2-히드록실 에틸 아크릴레이트이고, 상기 2)단계의 아민 계열 화합물은 4.4'-트리메틸렌-디피페리딘이고, 에틸렌 글리콜 계열 화합물은 메톡시 폴리에틸렌글리콜 모노아크릴레이트인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체의 제조방법.
  17. 1') 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물 및 하기 화학식 1로 표시되는 신남알데하이드 유도체를 반응시켜, 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을 얻는 단계; 및
    2') 상기 1')단계에서 제조된 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을, 아민 계열 화합물과 반응시켜, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형(come-like) 블록 공중합체를 얻는 단계;
    를 포함하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형 블록 공중합체의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00021

    상기 R은 H, OH, 할로겐 원자, C1-C10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, C1-C4의 알콕시, COO-(C5-C20의 아릴), C5-C20의 아릴 또는 C5-C20의 헤테로 아릴이다.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 1') 단계에서 신남알데하이드 유도체와 폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물은 85-95:5-15의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형 블록 공중합체의 제조방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 2') 단계에서 신남알데하이드 유도체-폴리에틸렌글리콜을 주사슬에 포함하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물과 아민 화합물은 0.8~1.2:1.2~0.8의 중량비로 반응하는 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형 블록 공중합체의 제조방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 2') 단계에서 아민 계열 화합물은 아민기가 포함된 신남알데하이드 유도체인 것을 특징으로 하는, 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 빗형 블록 공중합체의 제조방법.
  21. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀.
  22. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체 및 상기 신남알데하이드 유도체 함유 pH 민감성 블록 공중합체에 봉입될 수 있는 생리 활성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자 마이셀.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 생리 활성 물질은 항암제인 것을 특징으로 하는 고분자 마이셀.
  24. 제 22항의 고분자 마이셀을 포함하는 약물 전달체.
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