BR102013005601A2 - Composição farmacêutica contendo lipossomas convencionais e lipossomas de circulação prolongada para o tratamento da lieishmaniose visceral - Google Patents

Abstract

Composição farmacêutica contendo lipossomas convencionais e lipossomas de circulação prolongada para o tratamento da lieishmaniose visceral. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento da leishmaniose visceral caracterizada por compreender a associação de lipossomas convencionais e de lipossomas de circulação prolongada como sistema entregador de fármacos leishmanicidas. Essa composição pode ser utilizada no preparo de um medicamento para o tratamento das leishmanioses, podendo ser administrada por via intramuscular, subcutânea, intraperitoral ou intravenosa. O uso desse sistema permite que a droga atinja com eficiência todos os ssítios de infecção pelo parasito, sendo que os lipossomas peguilados promovem o direcionamento mais efetivo de fármacos leishmanicidas para a medula óssea e o baço, enquanto lipossomas convencionais atuam no direcionamento do fármaco para o fígado.

Description

“COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO LIPOSSOMAS

CONVENCIONAIS E LIPOSSOMAS DE CIRCULAÇÃO PROLONGADA PARA O TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE VISCERAL” A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento da leishmaniose visceral caracterizada por compreender a associação de lipossomas convencionais e de lipossomas de circulação prolongada como sistema entregador de fármacos leishmanicidas. Essa composição pode ser utilizada no preparo de um medicamento para o tratamento das leishmanioses, podendo ser administrada por via intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa. O uso desse sistema permite que a droga atinja com eficiência todos os sítios de infecção pelo parasito, sendo que os lipossomas peguilados promovem o direcionamento mais efetivo de fármacos leishmanicidas para a medula óssea e o baço, enquanto lipossomas convencionais atuam no direcionamento do fármaco para o fígado.

As leishmanioses são doenças parasitárias que atingem cerca de 12 milhões de pessoas no mundo, sendo causadas por protozoários flagelados pertencentes à Ordem Kinetoplastida, Família Trypanosomatidae e ao Gênero Leishmania [UNDP/World Bank/WHO Special Programme For Research &

Training In Tropical Diseases (TDR). Em Tropical Disease Research Programme Report, 13; progress 1995-96; World Health Organization: Geneva, 1997, cap. 8]. No Brasil, dados recentes relatam a ocorrência de cerca de 30.000 novos casos anuais da doença.

As leishmanioses são transmitidas aos hospedeiros vertebrados pela picada de um inseto que regurgita o parasito na forma promastigota. Esses parasitos são fagocitados por macrófagos, onde se transformam em amastigotas. Os amastigotas se multiplicam livremente no compartimento ácido dos fagolisossomos e escapam dos sistemas de defesa do hospedeiro. A

Leishmania corresponde a um complexo de várias espécies diferentes que causam vários tipos de manifestações clínicas, que incluem formas cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, a espécie causadora da leishmaniose visceral é a Leishmania chagasi. O cão aparece como hospedeiro vertebrado das formas cutânea e visceral e, particularmente no caso da leishmaniose visceral, tem papel importante como reservatório e fonte de infecção da doença em área endêmica. A leishmaniose visceral apresenta índice de letalidade de 100% nos casos não tratados clinicamente. A partir da década de 1940, complexos de antimônio pentavalente (Sb(V)) começaram a ser utilizados na terapêutica das leishmanioses [Marsden, P. D.; Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 1985, 78,187; Berman, J. D.; Clin.

Infect. Dis. 1997, 24, 684; Rath, S.; Trivelin, L. A.; Imbrunito, T. R.; Tomazela, D. M.; de Jesús, Μ. N.; Marzal, P. C.; Junior H. F. A.; Tempone, A. G.; Quim.

Nova 2003, 26, 550], Os principais antimoniais atualmente em uso são complexos de Sb(V) com o N-metil-glucamina (antimoniato de meglumina) e com o gluconato de sódio (estibogluconato de sódio). Foi sugerido que o Sb(V) seria uma pró-droga, sendo reduzido no organismo hospedeiro a Sb(lll) que seria a forma ativa e tóxica. Embora os antimoniais pentavalentes continuem sendo os medicamentos de primeira escolha no tratamento de todas as formas de leishmanioses, o seu uso clínico apresenta várias limitações. Esses compostos devem ser administrados por via parenteral (injeção intravenosa ou intramuscular), diariamente, num período de 20-40 dias. Nesse contexto, efeitos colaterais são freqüentes. O aparecimento de casos de resistência ao tratamento representa também um problema sério na terapêutica das leishmanioses. Outra dificuldade encontrada no controle da leishmaniose visceral é que não existe até hoje tratamento eficaz para os cães naturalmente infectados.

Entre os novos medicamentos que poderíam vir a substituir os antimoniais pentavalentes, destacam-se: (1) o AmBisome®, uma formulação da anfotericina B a base de lipossomas que foi recentemente aprovada pela U.S.

Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da leishmaniose visceral [Meyerhoff A. 1999 U.S. Food and Drug Administration approval of AmBisome (liposomal amphotericin) for treatment of visceral leishmaniasis. Clin Infect Dis 28, 42-48]; (2) o L'lmpavido®, que é o hexadecilfosfocolina ou miltefosine, inicialmente desenvolvido sob o nome de Miltex® para o tratamento do câncer, que mostrou uma elevada eficácia por via oral no tratamento da leishmaniose visceral em ensaios clínicos na índia [Sundar S, Jha TK, Thakur CP, Engel J, Sendermann H, Fischer C, Junke K, Bryceson A, Berman J. 2002 Oral miltefosine for Indian Visceral leishmaniasis. N Engl J Med 347, 1739- 1746]; e (3) uma formulação tópica da paromomicina (ou aminosidina), que mostrou-se efetiva no tratamento experimental da leishmaniose cutânea [Gamier T, Croft SL. 2002 Topical treatment for cutaneous leishmaniasis. Curr Opin Investig Drugs 3, 538-544], Entretanto, a perspectiva de uso desses medicamentos é remota, devido ao elevado custo do AmBisome®, aos efeitos colaterais da Miltefosina e à baixa eficácia da formulação de paromomicina.

Em face dessas limitações, a Organização Mundial da Saúde recomenda, com incentivo inclusive a outras entidades afins como a TDR (“Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases”), a pesquisa de novos medicamentos [Remme, J. H. F.; Blas, E.; Chitsulo, L.;

Desjeux, P. Μ. P.; Engers, H. D.; Kanyok, T. R.; Kayondo, J. F. K.; Kioy, D. W.;

Kumaraswami, V.; Lasdins, J. K.; Nunn, P. P.; Oduola, A.; Ridley, R. G.; Toure, Y. T.; Zicker, F.; Morei, C. M.; Trends Parasitol. 2002,18, 421; Ridley, R. G. Em Drug against Parasitic Diseases; Failamb, A. H. ; Ridley, R. G. ; Vial, H. J., eds.; UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (TDR): Geneva, 2003, p. 13].

Essencialmente, três estratégias diferentes estão sendo atualmente estudadas para a melhoria da terapêutica da leishmaniose visceral. Uma primeira estratégia consiste na combinação de diferentes agentes leishmanicidas com ação sinérgica. Por exemplo, a associação da gentamicina à paromomicina aumentou a eficácia da paromomicina em aplicação tópica [WO9406439-A1]. A combinação de aminosidina com estibogluconato de sódio, por sua vez, mostrou ser uma medida efetiva no tratamento da forma visceral não responsiva ao tratamento convencional. De forma semelhante, a associação desse antimonial com outra droga em avaliação clínica, o alopurinol, se mostrou eficaz até em casos de resistência aos antimoniais [Martinez, S.; Gonzalez, M.; Vernaza, Μ. E.; Clin Infect Dis 1997, 24, 165], A imuno-quimioterapia, que associa substâncias imunomoduladoras aos antimoniais pentavalentes, revelou ser uma forma de reduzir a dose aplicada de antimonial, mantendo a eficácia do tratamento [Murray, H. W.; Berman, J. D.; Wright, S. D.; J Infect Dis 1988, 157, 973; Machado-Pinto, J.; Pinto, J.; da Costa, C. A.; Genaro, O.; Marques, M. J.; Modabber, F.; Mayrink, W.; Int. J.

Dermatol. 2002, 41, 73], Uma segunda estratégia envolve o planejamento/síntese de novas substâncias ativas ou de fármacos já conhecidos, com modificações químicas.

Entretanto, o tempo longo e o custo elevado do desenvolvimento de um novo fármaco limitam consideravelmente o sucesso dessa estratégia. A terceira estratégia envolve a associação reversível de fármacos já em uso a um sistema transportador, visando direcionar melhor o fármaco para a célula alvo e evitar os locais indesejáveis onde o fármaco exerce toxicidade.

Esta estratégia, também conhecida como “rejuvenescimento de fármacos”, oferece um ganho de tempo na fase de desenvolvimento do produto, porque usa um fármaco já caracterizado do ponto de vista farmacológico. Entre os sistemas transportadores de medicamentos atualmente disponíveis, os lipossomas ocupam uma posição de destaque para a terapia das leishmanioses. O uso de lipossomas como veículos de fármacos tem sido uma tendência na indústria farmacêutica e vem abrindo perspectivas para o desenvolvimento de novos medicamentos leishmanicidas. Essas vesículas esféricas, constituídas por uma ou várias bicamadas concêntricas de lipídeos, podem armazenar em seu compartimento aquoso interno princípios ativos hidrossolúveis ou terem princípios ativos lipofílicos ou anfifílicos incorporados em suas membranas. Assim, o medicamento é liberado lentamente, evitando, por consequência, sua rápida eliminação pelo organismo. O resultado é um aumento da biodisponibilidade do medicamento, com potencialização da ação e redução da toxicidade.

Lipossomas convencionais foram amplamente estudados para a veiculação de fármaco leishmanicida, visando o tratamento da leishmaniose visceral [Frézard, F., Demicheli, F. 2010. New delivery strategies for the old pentavalent antimonial drugs. Expert Opin. Drug Deliv. 7(12), 1343-58], Lipossomas convencionais são tipicamente formados de um fosfolipídeo, tal como a fosfatidilcolina, ou de um surfactante não iônico. Podem também incluir na sua composição o colesterol, um fosfolípideo com carga negativa, como por exemplo, fosfatidilglicerol, ácido fosfatidico, dicetilfosfato, e/ou um fosfolípideo com carga positiva, tal como esterarilamina. Por serem rapidamente clareados da circulação sanguínea pelos macrófagos do sistema fagocítico mononuclear, principalmente o fígado, o baço e a medula óssea, os lipossomas convencionais carregam a droga para os sítios de infecção da leishmaniose visceral, o que disponibiliza uma maior quantidade do fármaco para interagir com o parasito.

Nesse contexto, foi desenvolvida uma formulação de anfotericina B em lipossomas convencionais (AmBisome®) [W09640060-A1] que foi usada com sucesso no tratamento de pacientes não responsivos às drogas antimoniais, o mesmo ocorrendo no tratamento de pacientes com a forma PKDL, sem relato de efeitos colaterais. A eficácia na faixa de 100% em pacientes imunocompetentes rendeu-lhe a aprovação pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) como a primeira apresentação à base de lipossomas a ser reconhecida para tratamento do Calazar (Leishmaniose visceral) [Meyerhoff A. 1999 U.S. Food and Drug Administration approval of AmBisome (liposomal amphotericin) for treatment of visceral leishmaniasis. Clin Infect Dis 28, 42-48].

No caso dos compostos antimoniais, formas encapsuladas em lipossomas convencionais foram também desenvolvidas [US4186183A; EP72234A; W09604890-A1; US4594241]. Em modelo experimental de leishmaniose visceral, essas preparações se revelaram pelo menos 200 vezes mais eficazes que o antimonial não encapsulado na eliminação do parasito no fígado [New, R. R.; Chance, M. L.; Thomas, S. C.; Peters, W.; Nature 1978, 272(5648), 55; Alving, C. R.; Steck, E. A.; Chapman, W. L.; Waits, V. B.;

Hendricks, L. D.; Swartz, G. M.; Hanson W. L.; Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1978, 75, 2959; Black, C. D. V.; Watson, G. J.; Ward, R. J.; Trans. Roy. Soc.

Trop. Med. Hyg. 1977, 71, 550]. Estudos de biodistribuição/farmacocinética do antimônio em camundongos e cães mostraram que a forma lipossomal convencional promove níveis de antimônio muito mais elevados e prolongados no fígado e no baço dos animais, quando comparada à forma livre [Collins, M., Carter, K. C., Baillie, A. J., OGrady, J.; J. Drug Targeting 1993, 1, 133; Frézard e Demicheli. 2010 New delivery strategies for the old pentavalent antimonial drugs. Expert Opin Drug Deliv 7, 1343-58]. Entretanto, a baixa estabilidade dessas primeiras formulações explica, pelo menos em parte, que nenhuma delas chegou a ser comercializada.

Mais recentemente, esforços foram dedicados no sentido de se obter novas formulações do antimoniato de meglumina em lipossomas convencionais com características tecnológicas mais favoráveis. Assim, foi desenvolvido um novo processo de preparo que consiste na re-hidratação de lipossomas vazios liofilizados formados por fosfatidilcolina, colesterol e dicetilfosfato com uma solução do antimonial [Frézard F, Michalick MSM, Soares CF, Demicheli C. 2000. Novel methods for the encapsulation of meglumine antimoniate in liposomes. Braz J Med Biol Res 33, 841-6]. Uma vantagem tecnológica significativa do método de preparo dessa formulação, quando comparado aos métodos convencionais, é que a formulação resultante pode ser armazenada na forma de lipossomas vazios liofilizados, e a re-hidratação é realizada pouco antes da administração, facilitando sua conservação e seu transporte.

Uma única injeção endovenosa da formulação lipossomal em cães sadios resultou em níveis elevados de antimônio no fígado e no baço, correspondendo a cerca de 40% da dose injetada, por um período de 4 dias [Schettini DA, Costa Vai AP, Souza LF, Demicheli C, Rocha OGF, Melo MN, Michalick MSM, Frézard F. 2003. Distribution of liposome-encapsulated antimony in dogs. Braz J Med Biol Res 36, 269-72], Por outro lado, os níveis de antimônio na medula óssea foram muito inferiores, cerca de 10 vezes menores.

Além disso, após tratamento de cães naturalmente infectados com doses múltiplas dessa formulação, uma redução significativa do número de parasitos na medula óssea foi observada, mas não houve eliminação completa dos parasitos naquele tecido [Schettini DA, Costa Vai AP, Souza LF, Demicheli C, Rocha OGF, Melo MN, Michalick MSM, Frézard F. 2005. Pharmacokinetic and parasitological evaluation of the bone marrow of dogs with visceral leishmaniasis submitted to multiple dose treatment with liposome-encapsulated meglumine antimoniate. Braz J Med Biol Res 38, 1879-83], Estes dados sugeriram que o aumento da concentração de antimônio na medula óssea é provavelmente crítico para obter a cura com essa formulação. Baseando-se no estado da técnica [Carter, K. C.; Dolan, T. F.; Alexander, J.; Baillie, A. J.;

McColgan, C.; J. Pharm. Pharmacol. 1989, 41, 87], foi levantada a hipótese de que o tamanho elevado desses lipossomas convencionais (diâmetro hidrodinâmico médio superior a 1000 nm) poderia ser responsável pelo baixo direcionamento das vesículas para a medula óssea.

Desta forma, em estudo posterior, o processo de preparo dos lipossomas mencionado acima foi modificado, pela introdução de um açúcar crioprotetor, de forma a obter lipossomas de tamanho reduzido [Frézard F, Demicheli C, Schettini DA, Ribeiro RR, Melo MN, Michalick MSM. Processo para a preparação de formulações farmacêuticas do antimoniato de meglumina em lipossomas e uso das formulações farmacêuticas em animais acometidos com leishmaniose visceral. Depósito de patente no INPI PI0405489-0, 11 de novembro de 2004], O uso da sacarose na relação açúcar/lipídeo 3:1 (p/p), permitiu que o diâmetro médio das vesículas fosse reduzido de 1200 nm para 400 nm. As duas formulações de tamanhos diferentes foram administradas em cães naturalmente infectados nas mesmas doses de lipídeo e de antimônio e foram comparadas por sua capacidade de direcionar o antimônio para a medula óssea. Os lipossomas “médios” (diâmetro médio 400 nm) promoveram, neste tecido, níveis de antimônio 3 a 4 vezes maiores do que aqueles alcançados com os lipossomas “grandes” (diâmetro médio 1200 nm) [Schettini DA, Ribeiro RR, Demicheli C, Rocha OGF, Melo MN, Michalick MSM, Frézard F. 2006. Improved targeting of antimony to the bone marrow of dogs using liposomes of reduced size. Int J Pharm 315, 140-7], Este resultado é de grande interesse, pois sugere uma maior eficácia da formulação de lipossomas de tamanho reduzido, para a eliminação do parasito na medula óssea dos animais.

Em estudo mais recente [Ribeiro RR, Moura P, Pimentel VM, Sampaio WM, Silva SM, Schettini DA, Alves CF, Melo FA, Demicheli C, Tafuri WL, Melo MN, Frézard F, Michalick MSM. 2008 Reduced tissue parasitic load and infectivity to sand flies in dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi following treatment with a liposome formulation of meglumine antimoniate. Antimicrob Agents Chemother 52, 2564-72], foram avaliadas a eficácia terapêutica e a toxicidade da formulação do antimoniato de meglumina em lipossomas de tamanho médio em cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi. Grupos de 12 animais receberam por via endovenosa 4 doses (com intervalos de 4 dias), seja do antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas (Gl, 6,5 mg Sb/kg/dose), de lipossomas vazios (Gll) ou de solução salina (GIN). Parâmetros marcadores das funções renal, hepática e hematopoiética, quando avaliados antes e logo depois do tratamento, não mostraram alterações significativas indicando ausência de toxicidade da formulação. A carga parasitária na medula óssea do Gl mostrou uma redução significativa 4 dias depois do tratamento, quando comparada àquela dos grupos controle. Avaliações imunocitoquímicas da carga parasitária na pele, nos linfonodos, no fígado, no baço e na medula óssea, 5 meses depois do tratamento, mostraram uma redução significativa nos linfonodos, no fígado e no baço dos animais do Gl, quando comparados aos animais do Gll e GUI.

Quando flebotomíneos Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis foram alimentadas nos animais dos diferentes grupos 5 meses após o tratamento, uma taxa de infecção significativamente menor foi encontrada no Gl, quando comparado aos grupos Gll e GUI. Vale ressaltar que essa elevada eficácia terapêutica foi alcançada usando uma dose cumulada de antimônio 25 vezes menor do que aquela usada no tratamento convencional.

Entretanto, quando culturas de medula óssea dos animais de Gl foram realizadas 5 meses após o tratamento, a presença do parasito foi evidenciada em todos os animais.

Vale ressaltar que o tratamento com AmBisome também não foi capaz de curar cães naturalmente infectados com Leishmania infantum [Oliva G, Gradoni L, Ciaramella P, et al. Activity of liposomal amphotericin B (AmBisome) in dogs naturally infected with Leishmania infantum. J Antimicrob Chemother 1995;36:1013-19], Portanto, o estado da técnica mostra que as tecnologias baseadas em lipossomas convencionais, atualmente disponíveis para propiciar o direcionamento do fármaco para os sítios de infecção de animais acometidos, principalmente cães com leishmaniose visceral, não permitem alcançar níveis suficientes do fármaco para a eliminação do parasito em determinados sítios de infecção. Mais especificamente, a medula óssea parece ser um tecido crítico no qual é necessário aumentar a concentração do fármaco.

Nos anos 90, diferentes investigadores relataram simultaneamente que lipossomas de circulação prolongada podem ser obtidos pela incorporação, na membrana das vesículas, de lipídeo com cabeça polar constituída de polímero de etileno glicol (PEG). Neste caso, esta nova classe de lipossomas foi chamada de lipossomas peguilados, furtivos ou estabilizados estericamente [Klibanov e Col. 1990. FEBS Letter 268:235-237; Allen e Col. 1991. Biochim Biophys Acta 1066, 29-36; Woodle MC, Lasic DD. 1992 Sterically stabilized liposomes. Biochim Biophys Acta 1113, 171-99], Um exemplo não limitante desses lipídeos é o diestearoilfosfatidiletanolamina-PEG(2000) (DSPE- PEG2000) incorporado tipicamente em proporção de 5 a 10 mol% dos lipídeos totais.

Essa modificação química da superfície das vesículas tem os seguintes impactos em sua farmacocinética [Frézard F, Schettini DA, Rocha OGF, Demicheli C. 2005 Liposomes: physicochemical and pharmacological properties, applications in antimony-based chemotherapy. Quím Nova 28, 511- 518]: redução do nível de opsonização dos lipossomas; redução da velocidade de captação pelos macrófagos dos órgãos do sistema fagocítico mononuclear (fígado, baço, medula óssea); circulação prolongada no plasma sanguíneo; acúmulo preferencial em sítios de inflamação/infecção pelo fato destes sítios apresentarem uma permeabilidade vascular aumentada. Essa propriedade está sendo explorada no desenvolvimento de lipossomas radiomarcados para o diagnóstico de sítios de inflamação/infecção [Boerman e Col. 1997.

Optimization of technetium-99m-labeled PEG liposomes to image focal infection: effects of particle size and circulation time. J Nucl Med 38, 489-493], Estudos nessa área estabeleceram que a meia-vida plasmática dos lipossomas contendo lipídeo-PEG depende de vários fatores. As características ideais dos lipossomas peguilados são: i) um diâmetro médio das vesículas na faixa de 150 a 200 nm; ii) o uso de um PEG de peso molecular aproximado de 2000 Da; iii) a incorporação do lipídeo-PEG na relação de 5 mol% com relação aos outros lipídeos [Woodle MC, Lasic DD. 1992 Sterically stabilized liposomes.

Biochim Biophys Acta 1113, 171-99], Outras entidades químicas que podem substituir o PEG e conferir propriedades de circulação prolongada aos lipossomas são polivinilpirolidina, polimetiloxazolina, polietil-oxazolina, polihidroxipropil-metacrilamida, ácido polilactico, ácido poliglicolico e celuloses derivatizadas, como hidroximetilceiulose ou hidroxietiicelulose [Patente US7,666,674], O uso de lipídeos de cadeias hidrofóbicas parcialmente fluoradas ou perfluoroalquiladas é outra estratégia que permite aumentar a meia-vida plasmática dos lipossomas [Santaella C, Frézard F, Vierling P, Riess JG. 1993 Extended in vivo blood circulation time of fluorinated liposomes. FEBS Lett. 336:481-4], Considerando que o fígado, o baço e a medula óssea são os principais sítios de infecção na leishmaniose visceral e que esses mesmos tecidos têm papel fundamental na remoção dos lipossomas da circulação sanguínea, a meia-vida plasmática e a distribuição dos lipossomas peguilados após administração em animais acometidos não podem ser previstas a priori, já que o estado patológico pode afetar o processo de opsonização dos lipossomas e o seu reconhecimento pelos macrófagos teciduais. Neste sentido, a eficácia da camptotecina encapsulada em lipossomas peguilados em comparação com sua forma livre não mostrou uma melhora significativa em relação à redução de carga parasitária no fígado, em modelo murino de leishmaniose visceral [Proulx, M.-E., Désormeaux, A., Marquis, J.-F., Olivier, M., Bergeron M.G. 2001 Treatment of Visceral Leishmaniasis with Sterically Stabilized Liposomes Containing Camptothecin. Antimicrob Agents Chemother45, 2623-7], sugerindo que os lipossomas peguilados não se acumulam no fígado e são pouco promissores, sozinhos, para tratar a leishmaniose visceral. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento da leishmaniose visceral caracterizada por compreender a associação de lipossomas convencionais e de lipossomas de circulação prolongada como sistema entregador de fármacos leishmanicidas. Essa composição pode ser utilizada no preparo de um medicamento para o tratamento das leishmanioses, podendo ser administrada por via intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa. O uso desse sistema permite que os lipossomas peguilados promovam o direcionamento mais efetivo de fármacos leishmanicidas para a medula óssea e o baço, enquanto lipossomas convencionais atuam no direcionamento do fármaco para o fígado.

De acordo com a presente invenção, após administração em cães naturalmente acometidos com leishmaniose visceral, lipossomas peguilados contendo antimoniato de meglumina encapsulado promoveram uma meia-vida de antimônio no sangue mais elevada que os lipossomas convencionais de tamanho médio (diâmetro médio de 410 nm) e reduzido (diâmetro médio de 175 nm) (Tabela 2), o que estabelece a propriedade de circulação prolongada dos lipossomas peguilados em cães infectados e seu potencial para distribuir o fármaco para tecidos outros que o fígado. Após avaliação da distribuição de antimônio no fígado, no baço e na medula óssea 24 horas depois da administração endovenosa de cada formulação, os lipossomas peguilados promoveram o direcionamento mais efetivo de antimônio para a medula óssea, enquanto lipossomas convencionais de tamanho médio (diâmetro médio de 410 nm) resultaram em níveis mais elevados de antimônio no fígado dos animais (Tabela 3). O conjunto desses resultados validou em cães naturalmente infectados o modelo em que os lipossomas peguilados permitem alcançar uma maior concentração de antimônio em sítios de infecção outros que o fígado e que os lipossomas convencionais de tamanho médio permitem alcançar uma concentração muito elevada de antimônio no fígado.

De acordo com a presente invenção, a composição caracterizada pela mistura dos dois tipos de lipossomas convencionais e lipossomas peguiladas encapsulando antimoniato de meglumina foi mais eficaz na eliminação dos parasitos no baço de camundongos experimentalmente infectados com Leishmania infantum chagasi, quando comparada às composições de cada tipo de lipossomas administradas separadamente (Tabela 4 e Figura 2). Por outro lado, todas as composições apresentaram a mesma eficácia na redução da carga parasitária no fígado. Portanto, esses resultados comprovam, pela primeira vez, a superioridade da mistura dos dois tipos de lipossomas quando comparada a cada tipo de lipossomas, na redução da carga parasitária num sítio de infecção outro que o fígado.

Além disso, o presente estudo relata pela primeira vez a eficácia dos lipossomas peguilados e da sua mistura com lipossomas convencionais na redução da carga parasitária na medula óssea de camundongos (Figura 3).

Esses resultados diferenciam-se daqueles obtidos na literatura com lipossomas e niossomas contendo antimonial, que não se mostraram capazes de reduzir a carga parasitária nesse tecido (Carter KC, Baillie AJ, Alexander J, Dolan TF. 1988 The therapeutic effect of sodium stibogluconate in BALB/c mice infected with Leishmania donovani is organ-dependent. J Pharm Pharmacol 40, 370- 373). A inovação proposta diferencia-se das tecnologias existentes que consistem de lipossomas convencionais [US4186183A; EP72234A; W09604890-A1; US4594241 BR0405489] ou de lipossomas de circulação prolongada [Proulx e Col. 2001 Antimicrob. Agents Chemother 45, 2623-7], A nova tecnologia é mais efetiva que aquelas baseadas em lipossomas convencionais, pois aumenta a distribuição do fármaco para outros sítios de infecção além do fígado. É também mais efetiva que aquelas baseadas em lipossomas de circulação prolongada, pois permite alcançar elevada concentração e ação do fármaco no fígado. A tecnologia proposta poderá ser aplicada no tratamento das leishmanioses visceral canina e humana, resultando em tratamento mais eficaz e seguro. Uma maior adesão dos pacientes ao tratamento é também esperada em função da menor incidência de efeitos colaterais (por causa da menor dose total de fármaco administrada), do menor número de doses e do maior intervalo entre as doses. Abre também novas perspectivas para a terapêutica da leishmaniose visceral, com a possibilidade de alcançar cura parasitológica em cães naturalmente infectados.

Breve descrição das figuras Figura 1: Carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados com a cepa C43 de Leishmania (Leishmania) infantum determinada pela técnica de diluição limitante 8 semanas após a infecção dos animais e 2 semanas após o tratamento com as diferentes formulações em dose única por via endovenosa (n=8). * p<0,05 (teste de Kruskal-Wallis) para comparação entre os grupos que receberam lipossomas contendo antimoniato de meglumina (AM) encapsulado e os grupos controle (salina e lipossomas vazios) (n=8).

Figura 2: Carga parasitária no baço de camundongos BALB/c infectados com a cepa C43 deLeishmania (Leishmania) infantum determinada pela técnica de diluição limitante 8 semanas após a infecção dos animais e 2 semanas após o tratamento com as diferentes formulações em dose única por via endovenosa (n=8). * p<0,05 (teste de Kruskal-Wallis) para comparação entre os grupos que receberam AM encapsulado e o grupo controle (salina). # p<0,05 (teste de Kruskal-Wallis) para comparação do grupo MIX 200 + 4,7com os grupos Lconv 200 e Lpeg 4,7 (n=8).

Figura 3: Carga parasitária na medula óssea de camundongos BALB/c infectados com a cepa C43 deLeishmania (Leishmania) infantumdeterminada pela técnica de diluição limitante 8 semanas após a infecção dos animais e 2 semanas após o tratamento com as diferentes formulações em dose única por via endovenosa (n=8). * p<0,05 (teste de Kruskal-Wallis) para comparação entre os grupos Lpeg 4,7 e MIX 200 + 4,7 e os grupos controle (salina e lipossomas vazios). # p<0,05 (teste de Kruskal-Wallis) para comparação do grupo MIX 200 + 4,7 com o grupo Lconv 200 (n=8).

Descrição Detalhada da Tecnologia A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento da leishmaniose visceral caracterizada por compreender a associação de lipossomas convencionais e de lipossomas de circulação prolongada como sistema entregador de fármacos leishmanicidas. Essa composição pode ser utilizada no preparo de um medicamento para o tratamento das leishmanioses, podendo ser administrada por via intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa. Nesta composição, os lipossomas convencionais podem compreender fosfolipídeos naturais ou sintéticos e/ou surfactante e/ou colesterol e apresentar diâmetro hidrodinâmico médio na faixa de 20 a 1000 nm.

Nesta composição, os lipossomas de circulação prolongada podem ser obtidos pela inclusão na composição lipídica dos lipossomas de um lipídeo ou surfactante que resulta no aumento do tempo de circulação dos lipossomas na corrente sanguínea. Exemplo não limitante são lipídeos ou surfactantes com cabeça polar constituída de polímero de etilenoglicol (PEG), preferencialmente o diestearoilfosfatidiletanolamina-PEG(2000) ou o diestearoilfosfatidiletanolamina-PEG (5000). O(s) fármaco(s) leishmanicida(s) pode(m) ser selecionado(s) do grupo de fármacos atualmente em uso clínico, incluindo complexos de antimônio, anfotericina B, pentamidina, miltefosina, alopurinol e paromomicina, mas também do grupo de fármacos com atividade leishmanicida estabelecida experimentalmente, incluindo sitamaquina, iminoquimod, fluconazol, cetoconazol, itraconazol, posaconazol, tucaresol, azitromicina, buparvaquona, tamoxifeno, terbinafina, furazolidona, fluoroquinolona, domperidona, interleucina 12, interleucina 10, lipídeo A, derivados de alquil-lisofosfolipídeo e de alquil-fosfolipídeo, aza-esteróis, licocalcona A, maesabalid III, tricotecenos, n-acetil-cisteina, quinolina 3-substituída [Monzote L. 2009 The Open Antimicrobial Agents Journal 1, 9-19], A invenção, aqui descrita, pode ser melhor entendida pelos seguintes exemplos que não são limitantes.

Exemplo 1 - Preparo e caracterização de suspensões de lipossomas convencionais e lipossomas peguilados contendo do antimoniato de meglumina encapsulado.

Um filme lipídico foi formado a partir dos lipídeos diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), colesterol (COL) e dicetilfosfato (DCP), na relação molar 5:4:1 (lipossomas convencionais) ou a partir do DSPC/COL/DCP/diestearoil-fosfatidiletanolamina-PEG(2000) na relação molar 4,53:1:4:0,47 (lipossomas peguilados). O filme foi hidratado com água destilada em temperatura de 60°C e submetido à agitação mecânica, o que levou a obtenção de lipossomas de tipo multilamelar.

Em seguida, a suspensão de lipossomas multilamelares resultante foi submetida à ultrassonicação (Ultrasonic Processor, 500 Watts de tipo sonda) em temperatura de 60°C, de forma a obter lipossomas pequenos uni- e oligo- lamelares. A suspensão resultante foi então filtrada, usando filtros estéreis de poros de diâmetro de 0,2 pm. A essa suspensão foi acrescentada uma solução aquosa de açúcar crioprotetor na relação sacarose/lipídeo 1:1 (m/m) (lipossomas peguilados e lipossomas convencionais calibrados) ou 3:1 (m/m) (lipossomas convencionais não calibrados). Logo em seguida, essa mistura foi congelada por imersão em nitrogênio líquido e submetida à liofilização (freeze- dryer, Labconco). Neste estágio, a formulação liofilizada pode ser armazenada a -20°C por pelo menos 6 meses sem comprometer as características finais de tamanho e taxa de encapsulação da formulação.

Um dia antes da administração, o liofilizado foi então hidratado com uma solução aquosa do antimoniato de meglumina na concentração de antimônio de 80 g/L e usando uma relação mássica Sb/lipídeo de aproximadamente 0,6.

Nessa fase de hidratação, a suspensão foi incubada por 30 min a 60°C e submetida a agitação mecânica (uso de um vortex) no tempo 0 e a cada 10 min.

No caso dos lipossomas peguilados e dos lipossomas convencionais calibrados, a suspensão de lipossomas foi submetida ao processo de extrusão, por filtrações repetidas a 65°C através de membranas de policarbonato de poro de diâmetro de 200 nm (Extruder, Lipex biomembrane, Canada). Depois dessa etapa, a suspensão de lipossomas foi diluída com uma solução salina estéril (NaCI 0,9% (m/v)) e submetida a centrifugação em 20.000 x g por 40 min a 4°C. O sobrenadante da centrifugação foi eliminado e o precipitado de lipossomas foi lavado duas vezes em solução salina estéril (resuspensão em solução salina estéril e centrifugação em 20.000 x g por 40 min a 4°C). O precipitado de lipossomas foi finalmente ressuspendido no volume desejado de solução salina estéril, tipicamente na concentração de 10 g/L de antimônio.

Para a determinação da taxa de antimônio encapsulada, a amostra foi submetida à digestão com ácido nítrico e o antimônio foi dosado por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (ETAAS). O tamanho dos lipossomas foi determinado por espectrometria de correlação de fótons, usando um analisador de tamanho de partícula (Malvern Instrument, UK).

Os resultados obtidos, com as taxas de encapsulação de antimônio e os diâmetros médios de lipossomas, são mostrados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 - Características dos lipossomas convencionais e peguilados em relação à taxa de encapsulação do antimoniato de meglumina e ao tamanho das vesículas.

Portanto, o presente exemplo mostra processos simples para a obtenção de suspensões de lipossomas convencionais e de lipossomas peguilados contendo antimoniato de meglumina encapsulado.

Exemplo 2 - Meia-vida plasmática e concentrações de antimônio no fígado, no baço e na medula óssea de cães com leishmaniose visceral, após administração endovenosa das formulações de antimoniato de meglumina em lipossomas convencionais e peguilados.

Visando determinar e comparar as meia-vidas plasmáticas dos lipossomas convencionais e de circulação prolongada, bem como sua capacidade de direcionar um fármaco encapsulado para o baço, fígado e medula óssea de animais com leishmaniose visceral, as suspensões de lipossomas contendo o antimoniato de meglumina encapsulado foram preparadas como descrito no Exemplo 1 e administradas em dose única por via endovenosa em cães naturalmente infectados com L. chagasi.

Três grupos de cães sem raça definida, pesando de 5 a 15 kg, com infecção comprovada com L. chagasi, foram utilizados nesse experimento. O primeiro grupo (3 animais) recebeu por via endovenosa a formulação de lipossomas convencionais não calibrados na dose de 4,2 mg de Sb/kg de peso corporal. O segundo grupo (5 animais) recebeu por via endovenosa a formulação de lipossomas convencionais calibrados na dose de 6,5 mg de Sb por kg de peso corporal. O terceiro grupo (4 animais) recebeu por via endovenosa a formulação de lipossomas peguilada na dose de 3,7 mg de Sb por kg de peso corporal.

No período de 24 h após administração, amostras de sangue foram retiradas em diferentes intervalos de tempo para a dosagem de antimônio por espectroscopia de absorção atômica com forno de grafite. No tempo de 24 horas, os cães foram sacrificados e o fígado, o baço e amostras de medula óssea foram retirados. O fígado e o baço foram pesados e homogeneizados.

As amostras de tecidos foram então submetidas à digestão com ácido nítrico e levadas para posterior dosagem de antimônio por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite. Os resultados de meia-vida de antimônio no sangue são mostrados na Tabela 2. Os resultados de percentual da dose de antimônio recuperada nos órgãos são mostrados na Tabela 3.

Tabela 2 - Meia-vida de antimônio no sangue de cães acometidos com leishmaniose visceral, após administração endovenosa das formulações de lipossomas convencionais e peguiladas.

Tabela 3 - Percentual da dose administrada de antimônio encontrada no fígado, no baço e na medula óssea de cães acometidos com leishmaniose visceral, 24 horas após administração endovenosa das formulações de lipossomas convencionais e peguilados (dados mostrados como média ± DP).

Esses dados mostram que os lipossomas convencionais apresentam meia-vida curta, quando comparados aos lipossomas peguilados (Tabela 2).

Portanto, os resultados obtidos confirmam as propriedades de circulação prolongada dos lipossomas peguilados em cães naturalmente infectados, quando comparados aos lipossomas convencionais. Além disto, os lipossomas convencionais de tamanho médio promovem um maior direcionamento de antimônio para o fígado dos animais, enquanto que os lipossomas peguilados apresentam um maior direcionamento para a medula óssea com a manutenção de um elevado direcionamento para o baço (Tabela 3). O conjunto desses resultados valida, em cães naturalmente infectados, o modelo de que os lipossomas peguilados permitem alcançar uma maior concentração de antimônio em outros sítios de infecção além do fígado devido a sua característica de circulação prolongada e que os lipossomas convencionais de tamanho médio permitem alcançar uma concentração muito elevada de antimônio no fígado.

Os dados obtidos sugerem que a mistura de lipossomas convencionais com lipossomas peguilados permitiría elevar o direcionamento de antimônio para a medula óssea e garantir o direcionamento do antimônio para o fígado e o baço dos animais acometidos com leishmaniose visceral. Portanto, com o uso dessa combinação espera-se um combate mais eficaz da leishmaniose visceral.

Vale ressaltar ainda que a injeção endovenosa dessas formulações farmacêuticas, mesmo com a elevada dose de antimônio administrada, foi bem tolerada nos animais.

Exemplo 3. Atividade anti-leishmania de formulações de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina e da associação dos dois tipos de lipossomas em modelo murino de leishmaniose visceral.

Camundongos BALB/c fêmeas foram infectados com L. infantum chagasi (cepa M2682 - MHOM/BR/74/PP75). 14 dias após a inoculação dos parasitos através da veia caudal, os animais receberam as diferentes composições de lipossomas convencionais e lipossomas peguilados e suas misturas em dose única de 10 mg Sb/kg por via endovenosa. A mistura consistiu em lipossomas convencionais na dose de 5 mg Sb/kg e lipossomas peguilados na dose 5 mg Sb/kg. 14 dias após o tratamento, os animais foram sacrificados e o fígado e o baço foram colhidos para avaliação de carga parasitária pela técnica de diluição limitante. A Tabela 4 mostra as proporções de animais negativados (sem parasito detectado) no fígado e no baço.

Tabela 4 - Atividade anti-leishmania de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina em camundongos BALB/c infectados com Leishmania infantum chagasi. Os dados mostrados são as proporções de animais negativados (sem parasito detectado) no fígado e no baço após tratamento por via endovenosa com dose única de 10 mg Sb/kg (n = 8 por grupo). ‘Diferença significativa com relação aos grupos tratados com formulações sem antimônio; “Diferença significativa com relação aos outros grupos (P<0.05, Teste exato de Fisher).

Os resultados da Tabela 4 mostram que todas as formulações apresentaram eficácias equivalentes na redução da carga parasitária no fígado dos camundongos com relação aos grupos controles (tratados com lipossomas vazios ou salina). Entretanto, no baço, apenas a formulação associando os lipossomas convencionais e peguilados mostrou-se capaz de reduzir de forma significativa a carga parasitária.

Esse dado demonstra claramente e, de forma surpreendente, o sinergismo dos dois tipos de lipossomas (convencionais e peguilados) para a redução da carga parasitária no baço dos animais.

Portanto, esses resultados comprovam, pela primeira vez, a superioridade da mistura dos dois tipos de lipossomas quando comparada a cada tipo de lipossoma isolado, na redução da carga parasitária num sítio de infecção diferente do fígado.

Exemplo 4. Eficácia das formulações de lipossomas peguilados e convencionais e da sua mistura na redução de carga parasitária no fígado, no baço e na medula óssea, em modelo murino de leishmaniose visceral. A cepa C43 de Leishmania (Leishmania) infantum, obtida a partir de um isolado de cão sintomático e caracterizada por RFLP, foi utilizada pela sua elevada capacidade infectante da medula óssea de camundongos.

Os camundongos BALB/c (8 animais por grupo) foram inoculados na veia da cauda com 1 x 107 formas promastigotas de Leishmania infantum chagasi. Após seis semanas, os animais receberam uma das seguintes formulações em dose única por via endovenosa: 1) Formulação do antimoniato de meglumina (AM) em lipossomas peguilados de 200 nm (Lpeg 4,7, na dose de 10 mg Sb/kg); 2) Formulação do AM em lipossomas convencionais de 200 nm (Lconv 200, na dose de 10 mg Sb/kg); 3) Formulação do AM constituída pela mistura de Lpeg 4,7 (5 mg Sb/kg) com Lconv 200 (5 mg Sb/kg) (MIX 200 + 4,7); 4) Formulação de lipossomas convencionais Lconv 200 vazios; 5) Formulação de lipossomas peguilados Lpeg 4,7 vazios; 6) Tampão fosfato 10 mM contendo NaCI 0,15 M pH 7,4 (PBS).

As formulações do AM em lipossomas foram preparadas e caracterizadas como descrito no Exemplo 1. As concentrações de Sb e de lipídeos foram ajustadas para 3,77 g/L e 49,8 g/L, respectivamente, com adição de PBS ou de suspensão de lipossomas vazios de mesma composição lipídica e tamanho idênticos. A Tabela 5 apresenta as características de tamanho e de taxa de encapsulação das formulações administradas, assim como os ajustes de concentração realizados.

Para o preparo da mistura de lipossomas, foram misturadas volumes iguais das formulações Lconv 200 e Lpeg 4,7 no momento imediatamente anterior à administração da formulação nos animais.

Duas semanas após o tratamento (8 semanas após a inoculação dos parasitos), os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical e o fígado, baço e medula óssea foram coletados para a determinação da carga parasitária através da técnica de diluição limitante. A Tabela 6 descreve as características das formulações de lipossomas administradas em dose única nos camundongos BALB/c infectados com a cepa C43 de L. infantum chagasi. Todas as formulações apresentaram populações de vesículas monodispersas (índice de polidispersão < 0,3) com diâmetro hidrodinâmico médio próximo a 200 nm. A determinação da carga parasitária no fígado, baço e medula óssea dos camundongos foi realizada 8 semanas após a inoculação dos parasitos e 2 semanas após a administração do tratamento e, de forma a coincidir com o pico da carga parasitária na medula óssea.

As Figuras 1, 2 e 3 apresentam as cargas parasitárias no fígado, no baço e na medula óssea, respectivamente.

Os resultados mostram que as formulações do AM em lipossomas peguilados e na mistura de lipossomas peguilados e convencionais (MIX 200 + 4,7) promoveram reduções significativas da carga parasitária em todos os órgãos avaliados, quando comparadas aos tratamentos controle (salina ou lipossomas vazios) (Figuras 1, 2 e 3). Por outro lado, a formulação do AM em lipossomas convencionais promoveu uma redução significativa da carga parasitária no fígado (Figura 1) e no baço (Figura 2) dos animais, mas nao na medula óssea (Figura 3).

Quando as formulações foram comparadas com relação à capacidade de redução de carga parasitária, a formulação do AM em mistura de lipossomas peguilados e convencionais mostrou-se significativamente mais eficaz no baço, em relação às formulações de lipossomas peguilados ou convencionais (Figura 2), e na medula óssea, em relação à formulação de lipossomas convencionais (Figura 3). Por outro lado, não houve diferença de eficácia entre as formulações do AM para a redução da carga parasitária no fígado (Figura 1).

Esse estudo estabelece a superioridade da mistura de lipossomas peguilados e convencionais, com relação às formulações individuais, na redução da carga parasitária no baço e na medula óssea em modelo de leishmaniose visceral.

Claims (7)

1 COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE VISCERAL caracterizada por compreender a associação de lipossomas convencionais e lipossomas de circulação prolongada incorporando um ou vários fármacos leishmanicidas.

2. A COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato dos lipossomas convencionais compreenderem fosfolipídeo(s) natural(is) e/ou sintético(s) e/ou surfactante(s) e/ou colesterol e apresentarem diâmetro médio na faixa de 50 a 1000 nm.

3. A COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato dos lipossomas de circulação prolongada incluírem na sua composição um lipídeo ou surfactante que resulta no aumento do tempo de circulação dos lipossomas na corrente sanguínea.

4. A COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato do lipídeo ou surfactante ter sua cabeça polar formada de polímero de etilenoglicol.

5. A COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do(s) fármaco(s) leishmanicida(s) ser(em) selecionado(s) do grupo de fármacos compreendendo um composto antimonial, anfotericina B, pentamidina, miltefosina, alopurinol, paromomicina, sitamaquina, iminoquimod, fluconazol, cetoconazol, itraconazol, posaconazol, tucaresol, azitromicina, buparvaquona, tamoxifeno, terbinafina, furazolidona, fluoroquinolona, domperidona, interleucina 12, interleucina 10, lipídeo A, derivado de alquil-lisofosfolipídeo ou de alquil- fosfolipídeo, aza-esterol, licocalcona A, maesabalid III, tricotecenos, n-acetil- cisteina, quinolina 3-substituída e/ou outro fármaco usualmente utilizado para tratamento de leishmanioses.

6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizada por poder ser administrada pelas vias intramuscular, subcutânea, intraperitoneal e/ou intravenosa.

7 USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para a produção de um medicamento para o tratamento das leishmanioses em mamíferos.