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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung
für die
parenterale und insbesondere intravenöse Verabreichung, die Liposomen
umfasst, die aus ungeladenen vesikelbildenden Lipiden bestehen und
bis zu 20 Molprozent eines amphipathischen vesikelbildenden Lipids
enthalten, das mit Polyethylenglycol (PEG) derivatisiert ist, und
gegebenenfalls nicht mehr als 10 Molprozent negativ geladener vesikelbildender
Lipide enthalten, wobei die Liposomen einen ausgewählten mittleren
Teilchendurchmesser im Größenbereich zwischen
etwa 40 und 200 nm haben und ein Corticosteroid für die ortsspezifische
Behandlung von entzündlichen
Erkrankungen enthalten.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
intravenöse
Verabreichung von Zusammensetzungen auf der Basis von PEG-haltigen Liposomen
für die
ortsspezifische Behandlung von entzündeten Geweben und Bereichen
ist bereits in
EP 0 662 820 offenbart.
Es ist wohlbekannt, dass kleine Liposomen mit langer Zirkulationszeit,
die ungeladene oder leicht negativ geladene vesikelbildende Lipide enthalten,
wie PEG-Liposomen, nach der intravenösen Verabreichung viele Stunden
in einem Volumen, das nicht größer ist
als die allgemeine Zirkulation, zirkulieren können und daher theoretisch
in der Lage sind, relativ große
Mengen an entzündungshemmenden
Mitteln durch Extravasation an Stellen mit verstärkter Gefäßdurchlässigkeit, wie sie für entzündete Bereiche
typisch sind, abzugeben. Solche Liposomen sind für die Behandlung von entzündlichen
Erkrankungen, z.B. rheumatoider Arthritis, bei der es sich um eine
chronische Autoimmunerkrankung handelt, die Gelenkentzündung und
fortschreitende Knorpelzerstörung
verursacht, von besonderem Interesse. Obwohl mehrere Typen von Antirheumawirkstoffen
für die
Verwendung verfügbar
sind, kann die Behandlung von schwerer persistierender Synovi tis und
akuten Exazerbationen die Verwendung von mehreren intravenösen Injektionen
erfordern, die hohe Dosen von Glucocorticoiden enthalten. Systemische
Corticosteroide können
zwar die Symptome der Krankheit unterdrücken, doch schränken nachteilige
Wirkungen ihre Verwendung ein. Außerdem zeigen Glucocorticoide
ein ungünstiges
pharmakokinetisches Verhalten: kurze Plasmahalbwertszeiten und ein
großes
Verteilungsvolumen erfordern eine hohe und wiederholte Verabreichung,
um eine therapeutisch wirksame Konzentration des Wirkstoffs an der gewünschten
Wirkungsstelle zu erreichen. Die intraartikuläre Injektion von Steroiden
in die betroffenen Gelenke wird häufig verwendet, um die (lokale)
Wirksamkeit der Glucocorticoide zu erhöhen und die systemischen Nebenwirkungen
zu reduzieren, doch diese Art der Verabreichung ist für die Patienten
weniger bequem und nicht praktikabel, wenn viele kleine Gelenke
betroffen sind. Außerdem
kann mit wiederholten intraartikulären Injektionen von Glucocorticoiden ein
erhebliches Auftreten von schmerzloser Zerstörung des Gelenks verbunden
sein. Gemäß
EP 0 662 820 B sind
bevorzugte Verbindungen zum Einschluss in PEG-haltigen Liposomen
die steroidalen entzündungshemmenden
Verbindungen, wie Prednison, Methylprednisolon, Paramethazon, 11-Fludrocortisol, Triamcinolon,
Betamethason und Dexamethason. Die aufgeführten Steroide gehören zur
Gruppe von Steroiden, die systemisch verabreicht werden. Beispiel
Nr. 12 ist das einzige Beispiel für ein Glucocorticoid-haltiges
PEG-Liposom in diesem Patent und bezieht sich auf die Herstellung
von Beclomethasondipropionat enthaltenden PEG-Liposomen. Es werden
jedoch keine in-vivo-Daten angegeben. Bei der Herstellung von Dexamethason
enthaltenden PEG-Liposomen gemäß der Offenbarung
in
EP 0 662 820 und
bei der intravenösen
Verabreichung derselben in einem experimentellen in-vivo-Arthritis-Modell stellten
die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, dass die günstigen
Wirkungen, wie sie in
EP 0 662 820 gelehrt
werden, überhaupt
nicht beobachtet werden konnten. Es gab keinen Unterschied im pharmakokinetischen
Profil zwischen einer Suspension, die das Glucocorticoid enthielt,
und den PEG-Liposomen, bei denen dasselbe Glucocorticoid eingekapselt
wurde.
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Da
Glucocorticoide häufig
die wirksamsten Wirkstoffe bei der Behandlung von entzündlichen
Erkrankungen sind, besteht ein Bedürfnis danach, liposomale Zusammensetzungen
bereitzustellen, die nach der parenteralen Verabreichung effizienter
wirksame Mengen an Glucocorticoid im entzündeten Bereich oder Gewebe
für eine
verstärkte
und verlängerte
lokale Aktivität
abgeben können.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung
für die
parenterale Verabreichung bereitzustellen, die Liposomen umfasst,
die aus ungeladenen vesikelbildenden Lipiden bestehen und bis zu
20 Molprozent eines amphipathischen vesikelbildenden Lipids enthalten,
das mit Polyethylenglycol derivatisiert ist, und gegebenenfalls
nicht mehr als 10 Molprozent negativ geladener vesikelbildender
Lipide enthalten, wobei die Liposomen einen ausgewählten mittleren
Teilchendurchmesser im Größenbereich
zwischen etwa 40 und 200 nm haben und ein wasserlösliches
Corticosteroid für die
ortsspezifische Behandlung von entzündlichen Erkrankungen enthalten.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposomen umfasst, die
aus ungeladenen vesikelbildenden Lipiden bestehen und bis zu 20
Molprozent eines amphipathischen vesikelbildenden Lipids enthalten,
das mit Polyethylenglycol derivatisiert ist, und gegebenenfalls
nicht mehr als 10 Molprozent negativ geladener vesikelbildender
Lipide enthalten, wobei die Liposomen einen ausgewählten mittleren
Teilchendurchmesser im Größenbereich
zwischen etwa 40 und 200 nm haben und ein Corticosteroid enthalten,
zur Herstellung eines Medikaments anzugeben, das nach der parenteralen
Verabreichung bei der ortsspezifischen Behandlung von entzündeten Geweben
oder Bereichen wirksam ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Corticosteroid
in dem Medikament in einer wasserlöslichen Form verwendet wird.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Es
hat sich jetzt gezeigt, dass man durch Einarbeiten einer wasserlöslichen
Form eines Corticosteroids in Liposomen mit langer Zirkulationszeit, die
aus ungelade nen vesikelbildenden Lipiden bestehen und bis zu 20
Molprozent eines amphipathischen vesikelbildenden Lipids enthalten,
das mit Polyethylenglycol (PEG) derivatisiert ist, und gegebenenfalls nicht
mehr als 10 Molprozent negativ geladener vesikelbildender Lipide
enthalten, wobei die Liposomen einen ausgewählten mittleren Teilchendurchmesser im
Größenbereich
zwischen etwa 40 und 200 nm haben, nach einer einzigen intravenösen Injektion
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die Liposomen umfasst,
eine erhöhte
Lokalisierung und verbesserte Retention des Corticosteroids im entzündeten Gewebe
erreichen kann im Vergleich mit einer einzigen intravenösen Injektion
einer wässrigen
Lösung,
die dieselbe Corticosteroidverbindung enthält.
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Die
Liposomen mit langer Zirkulationszeit gemäß der vorliegenden Erfindung
haben eine Zirkulationshalbwertszeit von wenigstens 6 Stunden, wobei
die Zirkulationshalbwertszeit als die Zeit definiert ist, bei der
die zweite lineare Phase des logarithmischen liposomalen Clearance-Profils
50% seiner Anfangskonzentration, die die auf t = 0 extrapolierte Plasmakonzentration
ist, erreicht.
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Die
Teilchengröße der Liposomen
ist ein wichtiges Merkmal, was dadurch bewiesen wurde, dass die
Verabreichung eines wasserlöslichen
Corticosteroids, wie Prednisolon-Dinatriumphosphat, in PEG-Liposomen
mit einem mittleren Teilchendurchmesser > 500 nm nicht zu einer signifikanten Abnahme
der Pfotenentzündung
im Ratten-Adjuvans-Arthritis-Modell führte.
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Ein
wasserlösliches
Corticosteroid gemäß der vorliegenden
Erfindung ist eine Verbindung, die in einer Konzentration von 1
in ≤ 10 (w/v)
löslich
ist, bewertet in Wasser oder auf physiologische Werte gepuffertem
Wasser, z.B. bei pH > 6,0,
bei einer Temperatur zwischen 15 und 25 °C.
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Wasserlösliche Corticosteroide,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung vorteilhaft verwendet werden können, sind Alkalimetall- und
Ammoniumsalze, die aus Corticosteroiden mit einer freien Hydroxygruppe
und organischen Säuren,
wie aliphatischen gesättigten
und ungesättigten
(C2-C12)-Dicarbonsäuren, und
anorganischen Säuren,
wie Phosphorsäure
und Schwefelsäure,
hergestellt werden.
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Außerdem können Säureadditionssalze
von Corticosteroiden vorteilhafterweise in den PEG-Liposomen mit
der langen Zirkulationszeit eingekapselt werden. Wenn mehr als eine
Gruppe in dem Corticosteroidmolekül für die Salzbildung zur Verfügung steht,
können
Mono- sowie Disalze nützlich
sein. Als Alkalimetallsalze sind die Kalium- und Natriumsalze bevorzugt.
Auch andere, positiv oder negativ geladene, Derivate von Corticosteroiden
können
verwendet werden. Spezielle Beispiele für wasserlösliche Corticosteroide sind
Betamethason-Natriumphosphat, Desonid-Natriumphosphat, Dexamethason-Natriumphosphat,
Hydrocortison-Natriumphosphat, Hydrocortison-Natriumsuccinat, Methylprednisolon-Dinatriumphosphat,
Methylprednisolon-Natriumsuccinat, Prednisolon-Natriumphosphat,
Prednisolon-Natriumsuccinat, Prednisolanat-Hydrochlorid, Prednisonphosphat,
Triamcinolonacetonid-Dinatriumphosphat und Triamcinolonacetonid-Dikaliumphosphat.
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Die
oben genannten Corticosteroide werden normalerweise bei der systemischen
Behandlung von Entzündungskrankheiten
und entzündlichen
Erkrankungen verwendet. Da die Erfinder bewiesen haben, dass durch
Verwendung einer wasserlöslichen Form
eines Corticosteroids in PEG-Liposomen mit einem bestimmten kleinen
mittleren Teilchendurchmesser eine effektive Zielsteuerung des Wirkstoffs hin
zu arthritischen Stellen durch systemische Verabreichung erfolgt,
kann die vorliegende Erfindung vorteilhaft auf Corticosteroide angewendet
werden, die aus einer Vielzahl von Gründen normalerweise für die topische
Anwendung verwendet werden. Zu diesen Corticosteroiden gehören zum
Beispiel Alclomethasondipropionat, Amcinonid, Beclomethasonmonopropionat,
Betamethason-17-valerat,
Ciclomethason, Clobetasolpropionat, Clobetasonbutyrat, Deprodonpropionat,
Desonid, Desoxymethason, Dexamethasonacetat, Diflucortolonvalerat,
Diflurasondiacetat, Diflucortolon, Difluprednat, Flumetasonpivalat, Flunisolid,
Fluocinolonacetonidacetat, Fluocinonid, Fluocortolonpivalat, Fluormetholonacetat,
Fluprednidenacetat, Halcinonid, Halometason, Hydrocortisonacetat,
Medryson, Methylprednisolonacetat, Mometasonfuroat, Parametasonacetat,
Prednicarbat, Prednisolonacetat, Prednyliden, Rimexolon, Tixocortolpivalat
und Triamcinolonhexacetonid. Topische Corticosteroide, die einer
schnellen und effizienten Clearance unterliegen, sobald diese Wirkstoffe
in der allgemeinen Zirkulation verfügbar werden, sind von besonderem
Interesse. Beispiele dafür
sind Budesonid, Flunisolid und Fluticasonpropionat. Durch Herstellen einer
wasserlöslichen
Form der oben genannten topischen Steroide und Einkapseln derselben
in PEG-Liposomen
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es jetzt möglich,
solche Corticosteroide systemisch zu verabreichen, um eine ortsspezifische
Wirkstoffabgabe zu erreichen und dadurch Nebenwirkungen, die mit
einer systemischen Behandlung verbunden sind, zu vermeiden und Probleme,
die dem Corticosteroid inhärent
sind, wie eine schnelle Clearance, zu überwinden. In dieser Hinsicht
schien Budenosidphosphat ein Salz von großem Interesse zu sein.
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Die
Liposomen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
nach Verfahren hergestellt werden, die man bei der Herstellung von
herkömmlichen
Liposomen und PEG-Liposomen verwendet, wie sie z.B. in
EP 0 662 820 offenbart sind. Eine
passive Beladung der Liposomen mit den Wirkstoffen durch Auflösen des
Corticosteroids in der wässrigen
Phase ist ausreichend, um eine möglichst
hohe Einkapselung zu erreichen, aber es können auch andere Verfahren verwendet
werden. Die zur Bildung der Liposomen verwendeten Lipidkomponenten
können
aus einer Vielzahl von vesikelbildenden Lipiden, wie Phospholipiden,
Sphingolipiden und Sterinen, ausgewählt werden. Eine Substitution
(vollständig
oder teilweise) dieser Grundkomponenten z.B. durch Sphingomyeline
und Ergosterol erschien möglich.
Für eine
effektive Einkapselung der wasserlöslichen Corticosteroide in
den Liposomen unter Vermeidung eines Austretens des Wirkstoffs aus
den Liposomen schienen insbesondere Phospholipidkomponenten mit
gesättigten,
versteifenden Acylketten geeignet.
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Die
günstigen
Wirkungen, die man nach einer einzigen Injektion der ein wasserlösliches
Corticosteroid enthaltenden PEG-Liposomen gemäß der Erfindung beobachtet,
sind sehr günstig
im Vergleich zu den Ergebnissen, die man nach einer einzigen, aber
auch nach wiederholten Injektionen des nicht eingekapselten wasserlöslichen
Corticosteroids in verschiedenen Konzentrationen erhält. Die
Verabreichung des nicht eingekapselten wasserlöslichen Corticosteroids war
viel weniger effektiv als die des eingekapselten Corticosteroids,
was leicht zu verstehen ist, wenn die Gesamtmenge des freien im
Vergleich zu dem eingekap selten Corticosteroid in Betracht gezogen
wird: Das freie Corticosteroid war stets um einen Faktor von wenigstens
5–10 weniger
effektiv, auch wenn es an 7 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert
wurde. Diese Wirkungen wurden in zwei verschiedenen Tiermodellen
beobachtet, nämlich
einem Ratten-Adjuvans-Arthritis-Modell
und einem Mausmodell der collageninduzierten Arthritis. Die günstigen
Wirkungen können
in Abhängigkeit
von der Dosis eine vollständige
und langfristige Remission aller mit Arthritis verbundenen Symptome
sein. Außerdem wurde
im Mausmodell eine Woche nach der Behandlung zu dem Zeitpunkt, als
die Entzündung
zurückgekehrt
war, eine reduzierte Knorpelerosion beobachtet.
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Da
sich gezeigt hat, dass ultrahohe Dosen von Methylprednisolon bei
der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis effizienter in
Bezug auf die Induktion von T-Zell-Apoptose sind als die "Standarddosis" von 10 mg/kg, die
bei der Therapie von multipler Sklerose verwendet wird, wurde untersucht,
ob eine Zubereitung von Liposomen mit langer Zirkulationszeit, die
Prednisolon enthalten, einer Methylprednisolon-Pulstherapie bei
der Induktion der T-Zell-Apoptose
in situ überlegen
ist. Es wurde beobachtet, dass liposomales Prednisolonphosphat,
das in einer Menge von 10 mg/kg gegeben wurde, die T-Zell-Apoptose in situ
schnell erhöht,
und die reduzierte Infiltration von T-Zellen und Makrophagen führt zu einer
verbesserten Krankheitsaktivität
der durch Zelltransfer induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
(AT-EAE). Da die Liposomen die Gefäße verlassen und sich in entzündetem Gewebe
mit einer zerstörten
Blut-Hirn-Barriere ansammeln können,
könnte
liposomales Prednisolonphosphat eine therapeutische Alternative
zu Methylprednisolon sein, das eine höhere Dosis benötigt und
daher mehr systemische Nebenwirkungen verursachen würde. Diese
Ergebnisse können
Implikationen für die
Behandlung von entzündlichen
Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), wie multipler
Sklerose, haben.
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Überraschenderweise
setzen kleine starre PEG-haltige Liposomen zwar bekanntlich ihren
Inhalt kaum frei, doch waren die PEG-Liposomen gemäß der vorliegenden
Erfindung in der Lage, das wasserlösliche Corticosteroid effektiv
an der gewünschten Wirkungsstätte abzugeben,
was zu einer vollständigen
Remission der Entzündung
führt.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Herstellung
von Prednisolonphosphat enthaltenden PEG-Liposomen
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750
mg Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) (Lipoid Ludwigshafen), 250,8
mg Cholesterin (Sigma Aldrich) und 267,6 mg PEG-Distearoylphosphatidylethanolamin
(PEG-DSPE) (Avanti Polar Lipids) wurden abgewogen und in einem 100-ml-Rundkolben miteinander
gemischt. Die Lipide wurden in etwa 30 ml Ethanol gelöst. Danach
erfolgte ein Eindampfen zur Trockne in einem Rotavapor während 1 Stunde
im Vakuum bei 40 °C
und anschließend
ein Spülen
mit Stickstoffgas während
1 Stunde.
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1200
mg Prednisolon-Dinatriumphosphat (OPG Nieuwegein) wurden abgewogen
und in 12 ml sterilisiertem PBS gelöst. Die Lösung wurde zu dem trockenen
Lipidfilm gegeben und eine Stunde lang in Gegenwart von Glaskügelchen
geschüttelt,
um eine vollständige
Hydratation des Lipidfilms zu ermöglichen.
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Die
liposomale Suspension wurde in einen Extruder (Avestin, maximales
Volumen 15 ml) übergeführt und
unter Druck sowie unter Verwendung von Stickstoffgas sechsmal durch
2 übereinandergelegte Porenfilter
mit einer Porengröße von 200
bzw. 100 nm, 100 bzw. 50 nm und 50 bzw. 50 nm extrudiert. Anschließend wurde
die liposomale Suspension zweimal 24 Stunden lang in einer Dialysekammer (Slide-A-Lyzer,
10.000 MWCO) gegen 1 Liter sterilisiertes PBS dialysiert.
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Die
mittlere Teilchengröße der Liposomen wurde
mittels Lichtstreuung (Malvern Zeta-sizer) zu 93,1 ± 1,2 nm
bestimmt, wobei der Polydispersitätsindex 0,095 ± 0,024
betrug. Die Einkapselungseffizienz des Prednisolonphosphats wurde
mittels eines HPLC-Verfahrens zu 3 bis 4% bestimmt. Die Suspension
der Liposomen wurde in einer Stickstoffatmosphäre bei 4 °C gelagert und erwies sich als
etwa 2 Monate lang stabil.
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Beispiel 2
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Herstellung von anderen,
ein wasserlösliches
Corticosteroid enthaltenden PEG-Liposomen
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Beispiel
1 wurde wiederholt, aber anstelle von Prednisolon-Dinatriumphosphat
wurden Dexamethason-Dinatriumphosphat (OPG Nieuwegein), Betamethason-Dinatriumphosphat
(Sigma-Aldrich) bzw. Budesonid-21-phosphat (hergestellt von Syncom,
Groningen, Niederlande) verwendet.
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Beispiel 3
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Bewertung der therapeutischen
Wirksamkeit im Ratten-Adjuvans-Arthritis-Modell
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Lewis-Ratten
wurden subkutan am Schwanzansatz mit hitzeinaktiviertem Mycobacterium
tuberculosis in Freunds unvollständigem
Adjuvans immunisiert. Eine Pfotenentzündung begann zwischen 9 und
12 Tagen nach der Immunisierung, erreichte nach ungefähr 20 Tagen
ihr maximales Ausmaß und ging
dann allmählich
wieder zurück.
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Die
Bewertung der Krankheit erfolgte durch visuelle Beurteilung der
Schwere der Pfotenentzündung
mit einer maximalen Bewertung von 4 pro Pfote und Messung des krankheitsinduzierten
Verlusts an Körpergewicht.
Die therapeutische Wirksamkeit von liposomalem Prednisolonphosphat,
das nach Beispiel 1 hergestellt wurde, auf diese Variablen wurde mit
der von gleichen Dosen des nicht eingekapselten Wirkstoffs verglichen.
Die Ratten wurden behandelt, wenn die mittlere Bewertung > 6 betrug (am Tag 14 oder
15 nach der Induktion der Krankheit).
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Eine
vollständige
Remission des Entzündungsprozesses
bei 4 von 5 Ratten wurde innerhalb von 3 Tagen nach der Behandlung
mit einer einzigen Dosis 10 mg/kg liposomalen Prednisolonphosphat beobachtet
(mittlere Bewertung 0,1 ± 0,1,
im Vergleich zu 11,8 ± 1,9
bei den PBS-behandelten Ratten). Nicht eingekapseltes Prednisolonphosphat
veränderte
den Verlauf der Krankheit nicht signifikant (p > 0,05, Kruskall-Wallis-Test, nicht-parametrisch).
Dagegen war auch 1 mg/kg liposomales Prednisolonphosphat wirksam
(p < 0,05, Kruskall-Wallis, nicht-parametrisch). In
Bezug auf den Gewichtsverlust hatte nur 10 mg/kg liposomales Prednisolonphosphat
eine signifikante Wirkung (p < 0,05,
Einweg-ANOVA). Innerhalb von 8 Tagen erreichten diese Ratten wieder
ihr ursprüngliches
Gewicht. Andere Behandlungsgruppen litten weiterhin unter fortschreitendem
Gewichtsverlust.
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Bei
einer einzigen Injektion von nicht eingekapseltem Prednisolonphosphat
wurde keine Wirkung beobachtet. Daher wurde beschlossen, 7 Tage lang
täglich
10 mg/kg bzw. 20 mg/kg zu injizieren. Beide Behandlungsweisen reduzierten
die Entzündungsbewertungen
von durchschnittlich 6,5 ± 0,56 (Tag
14) auf Durchschnittswerte um 5,0 von Tag 15 bis Tag 21 (die Kontrollbehandlung
mit täglicher Kochsalzlösung erreichte
maximal 10,6 ± 1,3
am Tag 20). Einzelne Injektionen von 10 mg/kg bzw. 20 mg/kg liposomalem
Prednisolonphosphat am Tag 14 führten
jedoch zum Verschwinden der Adjuvans-Arthritis(AA)-Symptome bis
zum Tag 20. Die Kontrollbehandlung mit leeren Liposomen führte nicht
zu einem geänderten
Fortschreiten der Krankheit (p > 0,05).
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Die
liposomalen Zusammensetzungen von Beispiel 2 wurden ebenfalls im
Adjuvans-Arthritis-Modell getestet. Liposomales Dexamethasonphosphat
erwies sich als wirksamer als entweder liposomales Prednisolonphosphat
oder liposomales Betamethasonphosphat. Eine Dosis von 2 mg/kg war genauso
wirksam wie 10 mg/kg liposomales Prednisolonphosphat. 2 mg/kg liposomales
Betamethasonphosphat erwies sich als wirksamer als 2 mg/kg liposomales
Prednisolonphosphat, doch im Gegensatz zu 2 mg/kg liposomalem Dexamethasonphosphat wurde
keine vollständige
Remission beobachtet. Liposomales Budenosid-21- phosphat (1 mg/kg) bewirkte im Vergleich
zu liposomalem Dexamethasonphosphat eine wenigstens gleich wirksame
Unterdrückung
der Krankheit.
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Beispiel 4
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Bewertung
der therapeutischen Wirksamkeit bei AT-EAE
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Durch
Zelltransfer induzierte experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
(AT-EAE) wurde bei weiblichen
Lewis-Ratten durch intravenöse
Injektion von 107 MBP-spezifischen T-Zellen
induziert. 10 mg/kg Prednisolonphosphat enthaltende Liposomen, die
gemäß Beispiel
1 hergestellt wurden, wurden 42 Stunden und 18 Stunden vor der Tötung intravenös verabreicht.
Eine andere Gruppe erhielt 50 mg/kg Methylprednisolon intravenös 18 Stunden
und 6 Stunden vor der Perfusion. Kontrollratten erhielten zu äquivalenten
Zeitpunkten leere Liposomen und/oder Kochsalzlösung. Die T-Zellen oder Makrophagen
im Rückenmark
wurden immunhistochemisch in Gewebe, das in Paraffin eingebettet
war, nachgewiesen, und die Apoptose wurde durch den TUNEL-Assay und
anhand von morphologischen Kriterien bewertet. Ein Student-t-Test
für gruppierte
Daten wurde für
die statistische Analyse verwendet. Der Grad der T-Zell-Apoptose
in Rückenmarkgewebe
wurde durch liposomales Prednisolonphosphat signifikant erhöht (39,4 ± 6,8%,
p < 0,0001 gegenüber 16,1 ± 4,3%
in der Kontrollgruppe, alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung
angegeben). Methylprednisolon als interne Kontrolle führt zu einem
Grad von 30,8 ± 8,0%
T-Zell-Apoptose (p < 0,01
gegenüber
Kontrollen). Als Ergebnis der Erhöhung der Apoptose wurde die
T-Zell-Infiltration durch liposomales Prednisolonphosphat eindeutig
reduziert (45 ± 12
T-Zellen/mm2), was im Vergleich zu den Kontrollen
(115 ± 51
T-Zellen/mm2, p < 0,05)
sowie im Vergleich zu Methylprednisolon (96 ± 19 T-Zellen/mm2,
p < 0,05) statistisch
signifikant war. Als weiterer Aspekt der Entzündung wurde die Makrophageninfiltration
durch liposomales Prednisolonphosphat (31 ± 13 Makrophagen/mm2) im Vergleich zu den Kontrollen (78 ± 37 Makrophagen/mm2, p < 0,05)
und im Vergleich zu Methylprednisolon (66 ± 25 Makrophagen/mm2, p < 0,05)
signifikant reduziert. Obwohl das Modell der Induktion durch Zelltransfer
gewählt
wurde, um schnelle Mechanismen zu untersuchen, konnte ein therapeutischer
Nutzen des liposomalen Prednisolonphosphats innerhalb von 42 Stunden
beobachtet werden, was einem klinischen Score von 2,8 ± 0,2 im
Vergleich zu den Kontrollen (3,2 ± 0,3, p < 0,01) entspricht und damit Methylprednisolon
(3,2 ± 0,3,
p < 0,05 gegenüber liposomalem
Prednisolonphosphat) überlegen
war.