CN104352480A - 载紫杉醇的Angiopep-2修饰介孔二氧化硅脂质囊纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及载紫杉醇的Angiopep-2修饰的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒的制备方法，本发明采用改良的经典Stober法制备介孔二氧化硅纳米粒(MSN)，发明了反复饱和溶液吸附法制备载入PTX的MSN(MSN-PTX)，然后运用自组装和薄膜水化法构建Angiopep-2修饰的载紫杉醇的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒(ANG-MSN-LP-PTX)。制得ANG-MSN-LP-PTX体外释药48h内的累积释放率达到75.5％，突释现象降低，具有明显的缓释特性，有望应用于脑胶质瘤的治疗。
Description
(一)技术领域
本发明涉及载紫杉醇的Angiopep-2修饰介孔二氧化硅脂质囊纳米粒的制备方法。
(二)背景技术
脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，为35岁以下成人癌症死亡的第二大原因，占原发性中枢神经系统肿瘤40％以上。由于传统的手术切除不能防止癌细胞扩散入侵周围的正常组织，药物治疗也是必不可少的，然而由于血脑屏障的限制，化疗药物很难有效进入脑内病灶[2]。基于纳米技术研究表明，受体介导的纳米载体能够促进化疗药物递送入脑，特别是低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)受体，LRP在BBB上高度表达，可介导多种配体的跨BBB转运。Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY,分子量2.4kDa)为LRP受体的配体，在体内外BBB模型和原位脑灌注中均有较高的脑渗透性，并且LRP受体也在脑胶质瘤细胞表面大量表达，Angiopep-2也同时发挥对脑胶质瘤细胞的二级脑靶向功能，广泛用于修饰纳米载体使其成为脑靶向递药系统。
介孔二氧化硅纳米粒(Mesoporous silica nanoparticles，MSN)自1992年由Stober发现以来，由于其具备巨大的比表面积和比孔容、可调的孔径和形状、易于修饰的内外表面和良好的生物相容性，使其成为最有前途的药物载体之一。但是，MSN团聚严重，分散性低、靶向能力差、载药易突释，极大阻碍了其应用和发展。脂质包裹后的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒(MSN-LP)不仅可以减少突释现象，还可以在溶液中降低团聚现象，在生理环境中减少与蛋白质的非特异性结合，提高稳定性，并且MSN-LP表面脂质易于修饰可以达到靶向递药的目的。但是，目前还没有相关对MSN-LP用于脑部递药系统及脑胶质瘤治疗的研究报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种构建Angiopep-2修饰的核-壳结构介孔二氧化硅脂质囊纳米粒的制备方法，以抗肿瘤药紫杉醇(Paclitaxel，PTX)为模型药，初步研究此递药系统对脑胶质瘤的治疗作用，为脑胶质瘤的治疗提供实验参考。
本发明采用的技术方案是：
载紫杉醇的Angiopep-2修饰的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒的制备方法，所述方法包括：
(1)称取介孔二氧化硅纳米粒，分散到紫杉醇饱和乙醇溶液中，介孔二氧化硅纳米粒与紫杉醇饱和乙醇溶液用量之比为100mg：5～10mL，搅拌2～3h，期间每隔10～15min超声1～2min，然后15000～20000r·min-1离心20～30min，将离心得到的白色固体35～45℃减压干燥，得到载药粉末；
(2)步骤(1)所得载药粉末重复步骤(1)操作6～7次，得到载紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒；
(3)称取DSPC：DSPE-PEG：DSPE-PEG-ANG：胆固醇的质量比为65：8：2：25的脂质材料适量，置于梨形瓶，于40～45℃下超声溶解于适量三氯甲烷中，加入质量为前述脂质材料质量20～30％的步骤(2)所得载紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒，快速涡旋分散后，40～45℃下旋转蒸发成膜，然后用pH 7.4的PBS溶液水化超声得到混悬液，经葡聚糖凝胶柱纯化分离空白脂质体和载紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒后，得到所述载紫杉醇的Angiopep-2修饰的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒。
本发明采用反复饱和溶液吸附法制备载入PTX的MSN(MSN-PTX)，然后运用自组装和薄膜水化法构建Angiopep-2修饰的载紫杉醇的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒(ANG-MSN-LP-PTX)。ANG-MSN-LP分布均一，无团聚现象，具有明显的核-壳结构，粒径106.37±3.76nm(PDI 0.14±0.02)，并且在0～10ug·mL-1范围内对人脑微毛细血管内皮细胞(HBMEC)和C6细胞具有良好的安全性和生物相容性。制得ANG-MSN-LP-PTX体外释药48h内的累积释放率达到75.5％，突释现象降低，具有明显的缓释特性。
所述介孔二氧化硅纳米粒可按如下方法制备得到：将CTAB和TMP相继溶解于添加有适量2M NaOH溶液的去离子水中，80～85℃剧烈搅拌2～3h，然后快速加入适量TEOS，继续在80～85℃剧烈搅拌2～3h，静置过夜后抽滤得到白色胶状物，将白色胶状物分散于浓度为10mg·mL-1的NH4NO3乙醇溶液中80℃回流4～5h后，冷却至室温，离心得到白色固体，将所得白色固体经过重复上述分散、回流、离心操作6～7次去除CTAB后，再真空干燥，得到白色粉末，即为所述介孔二氧化硅纳米粒。本发明采用改良的经典Stober法制备介孔二氧化硅纳米粒(MSN)，制得MSN粒径为94.61±3.91nm(PDI 0.085±0.01)，比表面积(SBET)为425m2·g-1，孔容积(Vp)为0.37cm3·g-1，孔径MSN在PTX的饱和溶液中反复吸附7次时达到平衡，载药量高达11.1％。
优选的，所述CTAB：TMP：2M NaOH溶液：去离子水(含有NaOH溶液的去离子水体积，即NaOH溶液与去离子水体积之和)：TEOS用量之比为1.0g：5～8mL：2～5mL：400～500mL：4～8mL。
本发明的有益效果主要体现在：本发明采用反复饱和溶液吸附法制备载入PTX的MSN(MSN-PTX)，然后运用自组装和薄膜水化法构建具有核-壳型结构的Angiopep-2修饰的二氧化硅脂质囊纳米粒(ANG-MSN-LP-PTX)，可以有效促进PTX跨过BBB模型而提高对脑胶质瘤的抑制作用，对C6细胞具有较高的抑制效果，有望应用于脑胶质瘤的治疗。
(四)附图说明
图1为纳米粒的TEM图；A.除模板剂之前，B.除模板剂之后，C.MSN-LP，D.ANG-MSN-LP；
图2为纳米粒的粒径分布图；A.除模板剂之前，B.除模板剂之后，C.MSN-LP，D.ANG-MSN-LP；
图3为N2吸-脱附等温线(A)和孔径分布图(B)；
图4.为XRD衍射曲线；
图5为反复饱和吸附次数-重量变化曲线；MSN-PTXi为载体吸附饱和药物溶液的吸附次数-载体重量变化曲线，MSNi为载体吸附空白溶液的吸附次数-载体重量变化曲线，(MSN-PTXi)-(MSNi)为载入载体的药物吸附次数-重量变化曲线，MSNi-MSNi-1为载体吸附次数-重量损失变化曲线(i＝1,2,3,4,5…)；
图6为MSN和MSN-PTX的热重分析曲线；
图7为体外释药曲线；
图8为MSN、MSN-LP和ANG-MSN-LP对HBMEC(A)和C6细胞(B)的细胞毒性，PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX对C6细胞的肿瘤抑制曲线(C)；
图9为PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX跨BBB模型转运率(A)，Angiopep-2和抑肽酶对LRP受体的竞争性实验(B)；*p<0.05，**p<0.01，与PTX对比；
图10为PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX对C6细胞周期的影响(A.直接作用于C6细胞，B.跨BBB模型后作用于C6细胞)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1.材料和方法
1.1材料及仪器
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，99％)，正硅酸乙酯(TEOS，98％)，三甲苯(TMP，98％)(上海阿拉丁试剂有限公司)；
紫杉醇(PTX)(南京泽朗医药科技有限公司)；
Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC)(杭州中肽生化有限公司)；
二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、胆固醇(上海艾韦特医药科技有限公司)；
二硬脂酰磷脂酰聚乙二醇(DSPE-PEG)，二硬脂酰磷脂酰马来酰亚胺聚乙二醇(DSPE-PEG-MAL)(美国Laysan生物科技有限公司)；
细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；
0.25％胰蛋白酶，D-Hanks缓冲液(美国Gibco公司)；
DMEM培养基(含有4.5g·L-1葡萄糖、3.7g·L-1碳酸氢钠、10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素)(杭州吉诺生物医药技术有限公司)；
四甲基偶氧唑盐(MTT)、辣根过氧化物酶(HRP)和二甲亚砜(DMSO)(美国西格玛有限公司)；
其他试剂均为分析纯。
Waters高效液相色谱仪(Waters e2695四元泵，2998PDA检测器，美国Waters公司)；
Nano-ZS 90激光粒度分析仪(英国Malvern仪器有限公司)；
Optima MAX超速低温离心机(美国Beckman Coulter有限公司)；
Mill-Q超纯水仪(美国Millpore公司)；
PH酸度计(瑞士Mettler-Toledo公司)；
HT7700透射电子显微镜(日本日立公司)；
Vector-22傅立叶红外光谱仪(德国BRUKER公司)；
TRISTAR II3020全自动比表面和孔隙分析仪(美国Micromeritics仪器公司)；
Rigaku D-max 2550PC全自动多晶X射线衍射仪(日本理学电机株式会社)；
Thermo Forma超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；
KQ5200DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；
CP225D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；
SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州科创仪器有限公司)；
HZ-9212S恒温振荡器(太仓市科教器材厂)；
VORTEX-5型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；等
1.2细胞
C6细胞和人脑微毛细血管内皮细胞(HBMEC)(浙江中医药大学实验动物中心提供)培养于DMEM培养基(含有4.5g·L-1葡萄糖、3.7g·L-1碳酸氢钠、10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素)。培养条件：37℃、5％的CO2、饱和湿度90％。用于实验的细胞均处于对数生长期。
1.3MSN的合成
1.0g CTAB和7.0mL TMP相继加入含有3.5mL 2M NaOH溶液的480mL去离子水中，80℃剧烈搅拌2h后，快速加入5.0mL TEOS，继续在80℃下剧烈搅拌2h，静置过夜后用砂型漏斗抽滤得到细腻的白色胶状物。将白色胶状物分散到200mL含硝酸铵的乙醇溶液(NH4NO3/C2H5OH,10mg·mL-1)中80℃回流4h，去除模板剂CTAB和TMP，得到的产物冷却到室温后，离心(18000rpm，10min)得到白色固体。将离心得到的白色固体继续分散到200mL的硝酸铵乙醇溶液中80℃回流4h，经过6次反复操作去除模板剂CTAB，将最后一次离心所得的白色固体45℃下真空干燥12h即得到白色粉末状MSN。
1.4反复饱和溶液吸附法制备MSN-PTX
为了提高PTX的载药量，本实验发明了反复饱和溶液吸附法：称取一定量MSN(记为W10)分散到PTX的饱和乙醇溶液中，搅拌2h同时每隔10min短时超声1min，然后18000rpm离心30min，PTX饱和溶液重复利用。将离心得到的白色固体(MSN-PTX)45℃减压干燥12h后称重(记为W11)，然后重复分散、吸附、超声、离心、干燥、称重，每重复一次的称重分别记为W12、W13、W14·····。同样，称取相同重量的MSN分散到不含PTX的乙醇溶液中，同法操作，分散、吸附、超声、离心、干燥、称重，每次称重分别记为W01、W02、W03·····。
1.5ANG-MSN-LP-PTX的制备
ANG-MSN-LP-PTX的制备采用自组装和薄膜水化法：称取DSPC∶DSPE-PEG∶DSPE-PEG-ANG∶胆固醇(65∶8∶2∶25w/w)脂质材料适量，置于梨形瓶，于40℃下超声溶解于少量三氯甲烷中，加入MSN-PTX(脂质材料重量的20％)，快速涡旋分散后，40℃下旋转蒸发成膜(梨形瓶壁上可见透明薄膜和包裹分散在其中的细小颗粒)。然后用PBS(pH 7.4)溶液水化超声得到混悬液，经葡聚糖凝胶柱(G-100)纯化分离空白脂质体后得到ANG-MSN-LP-PTX。MSN-LP-PTX同法制备，除了不加入DSPE-PEG-ANG。
1.6纳米粒的表征
采用透射电镜分别对除模板剂之前和之后的MSN、MSN-LP和ANG-MSN-LP进行观察，粒径仪测定粒径分布和电位，氮气吸附仪绘制氮气吸-脱附曲线，BET法计算比表面积，BJH模型计算孔径分布，X-射线衍射仪分析MSN的X射线衍射行为，热重分析仪测定载药量。
1.7体外释药考察
采用透析袋法测定ANG-MSN-LP-PTX的体外释药特性，释放介质为PBS溶液(pH 7.4，含乙醇20％v/v)。将一定量的ANG-MSN-LP-PTX转移入透析袋中(截留分子量7000KDa)，透析夹封口后放入装有500mLPBS的烧杯中，然后置于37℃、100rpm恒温水浴震荡器中，平行操作三份。于15、30、45、60min、2、4、6、8、12、24、48h时间点吸取0.5mL的透析液，用0.45μm微孔滤膜过滤后，续滤液经HPLC测定PTX浓度，计算累积释放率。每次吸取透析液后，添加等量的空白PBS介质。同法考察PTX溶液、MSN-PTX和MSN-LP-PTX的体外释药特性。
1.8细胞毒性和体外抗肿瘤评价
C6细胞和HBMEC细胞用于评价MSN，MSN-LP和ANG-MSN-LP的细胞毒性，C6细胞还用于PTX溶液、MSN-PTX、MSN-LP-PTX、ANG-MSN-LP-PTX的抗肿瘤研究，采用MTT法检测细胞活性。细胞接种于96孔板(1×105个/孔/100μL)，稳定4h后待用。分别加入不同浓度的纳米粒或载药纳米粒，平行6个复孔，培养48h后，每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μL，微量振荡器上振荡3～5min，继续培养4h，弃上清液，加入DMSO 150μL，在微量振荡器上振荡10min，用酶标仪测定570nm波长处其光密度(OD)值。取6个孔的平均OD值计算细胞的存活率(IC)，IC＝(实验组OD值/空白对照组OD值)×100％。
1.9体外跨BBB转运研究
按照相关文献建立体外BBB模型，HBMEC接种于12孔transwell板(膜嵌套直径12mm，平均孔径3μm，比表面积1.12cm2，美国康宁公司)，细胞密度1×105个/孔。培养3天后，用细胞电阻仪(美国Millipore，Millicell-RES)监控并检测跨细胞电阻(TEER)，只有细胞单层跨细胞电阻超过200Ω/cm2才能用于实验研究。
选用D-Hank’s缓冲液作为转运介质研究跨膜转运率(％)。实验时用预先37℃保温的D-Hanks溶液冲洗供体池3次，在供体池中分别加入含PTX，MSN-PTX，MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX的DMEM培养液(终浓度折PTX为1μg·mL-1)，受体池中加入空白缓冲液，平行6孔，继续孵育，于1、2、4、8、12h在受体池中吸取出100μL样品，并及时补充等量空白介质。样品经HPLC检测PTX浓度。在竞争性实验中，在上述供体池中除了加入各制剂的DMEM培养液外还分别加入了10μg·mL-1的Angiopep-2或抑肽酶，继续孵育4h后，从受体池中吸取100μL样品，其他步骤相同操作。
1.10细胞周期分析
在细胞周期实验中，将C6细胞接种于12孔板中，贴壁稳定4h后，分别加入PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX溶液(终浓度折PTX为1μg·mL-1)，平行6孔，孵育48h后，胰蛋白酶消化，1200rpm离心5min收集细胞，用70％的乙醇溶液4℃固定8h，然后在乙醇混悬液中加入PBS轻轻吹散细胞，1200rpm离心5min弃去残留的乙醇。然后按照细胞周期检测试剂盒操作说明进行细胞样品的处理。通过流式细胞仪检测，运用FCS Express V3.0进行数据分析。
为了分析PTX制剂跨BBB转运后对C6细胞周期的影响，本实验建立了HBMEC和C6双细胞模型：按照“1.9体外跨BBB转运研究”项下操作，建立体外BBB模型后，将transwell供体池嵌套膜转移到另一个在受体池中已接种了C6细胞的transwell中嵌套中。在供体池中分别加入含PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX的DMEM培养液(终浓度折PTX为1μg·mL-1))，受体池中加入DMEM培养液，48h后收集受体池中的C6细胞，同法操作进行细胞周期分析。
2.结果
2.1MSN的表征
通过TEM观察，未除模板剂之前MSN聚集现象严重(图1.A)，除模板剂之后MSN呈圆整球形，形态规整，分散性良好，无聚集现象，由于介孔的存在，MSNs表面粗糙，并且高倍镜下可以清晰观察到高度有序的六角形排列介孔结构(图1.B)。经粒径仪测定后，除模板剂之后MSN粒径为94.61±3.91nm(PDI 0.085)(图2.B，表1)，测定结果比TEM观察到的略大，可能由于在水相环境中MSN表面会形成水化层的而增加粒径。然而，未除模板剂的MSN粒径图出现双峰152nm和1840nm(PDI0.36)，也证明其存在严重的团聚现象。用N2吸-脱附等温线分析MSN的比表面积和平均孔径(图3)，根据IUPAC分型，该BET曲线在相对压力P/Po 0.3～0.7段明显符合IV型分布，说明MSN有均匀的介孔结构，这一点也可以通过XRD衍射证明，如图4所示，有一个峰形良好的衍射峰。通过计算可得出MSN的比表面积(SBET)为425m2·g-1，孔容积(Vp)为0.37cm3·g-1，孔径
表1.纳米粒的主要表征参数(平均值±SD)
2.2ANG-MSN-LP-PTX的制备
以MSN-PTX为核心，由脂质材料构成的脂质层通过自组装包裹于MSN-PTX上，可有效提高其在溶液环境中的稳定性，并可以阻止包载在MSN中的PTX扩散释放，并且DSPE-PEG嵌插在脂质层上，可以形成“隐形”纳米粒，减少被网状内皮系统的截留和吞噬。由图2.D所示，ANG-MSN-LP-PTX圆整球形，粒径均一，无团聚，并且核部分呈现暗色，边缘部分呈现较淡的亮圈，证实核壳结构的构建成功，与文献报道相一致。制备的ANG-MSN-LP-PTX粒径106.37±3.76nm(PDI 0.14)(图2.D，表1)，稍大于MSN的粒径，脂质层厚约5nm。MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX之间并没有明显差异，主要参数相似(图2.C和表1)。2.3反复饱和溶液吸附法制备MSN-PTX
用反复饱和溶液吸附法来制备MSN-PTX，由图5所示：随着吸附次数的增加，MSN的重量不断损失，每次平均损失率为3.13±0.45mg；虽然MSN-PTX的总重量也是呈现下降趋势，但是MSN-PTX减去MSN的重量却不断增加[图中(MSN-PTX)i-MSNi曲线]，表明随着吸附次数的增加，MSN载入PTX的量不断增加，每次吸附平均增加载药量为1.15±0.23mg；由图还可以看出，吸附7次之后，载入药量基本不变，可以推断MSN的介孔内对PTX的载入已经接近平衡状态，因此，本实验确定了反复饱和溶液吸附法来制备MSN-PTX的吸附次数为7次。最后，准确的载药量通过热重分析来计算。由如图6所示，加热到300℃后，MSN和MSN-PTX分别损失3.85wt％和14.93wt％，两者的差异在于一个是空白MSN，另一个则载有PTX，所以最终载药量约为11.1％。
2.4体外释药考察
体外释药曲线如图7所示，MSN-PTX，MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX与PTX相比，均呈现明显的缓释特性。PTX溶液释放迅速，4h内的释药量达98％，而ANG-MSN-LP-PTX在24h内PTX的累积释药量为64.4％，48h的累积释放量达到75.5％，与PTX溶液相比，具有良好的缓释特性。MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX释药特性相似。MSN-PTX在初始4h内突释现象明显，累积释药量达到45.6％，而ANG-MSN-LP-PTX和MSN-LP-PTX的突释现象显著降低，主要得益于MSN表面脂质层的包裹，实验结果证明，脂质层包裹的MSN比未包裹的MSN具有更明显的缓控释特性和防突释特性。
2.5细胞毒性和体外抗肿瘤评价
由如图8.A-B所示，MSN、MSN-LP和ANG-MSN-LP载体对HBMEC和C6均表现出较低的细胞毒性和良好的生物相容性。在纳米载体浓度达到10μg·mL-1的时，细胞存活率仍在85％以上，且3种载体材料的细胞毒性在低浓度时并没有显著的差异。当浓度超过10μg·mL-1时，MSN-LP和ANG-MSN-LP的细胞毒性低于MSN，表明脂质包裹后可以降低细胞毒性，提高生物相容性。
PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX对C6细胞的抗肿瘤结果见图8.C，C6细胞活性随PTX浓度的升高而降低，MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX的IC50分别为4.7μg·mL-1和2.1μg·mL-1。然而，本实验中暂时无法计算PTX和MSN-PTX的IC50，因为PTX主要作用于微管蛋白，使其团聚后阻滞细胞分裂，从而抑制细胞增殖。然而在药物作用的48h内，细胞没有表现出明显凋亡状态，如果延长药物作用时间，由于细胞代谢物的累积和培养基中营养物质的缺乏也会阻止细胞增殖，并将严重影响实验结果。实验结果表明，ANG-MSN-LP-PTX的体外抗肿瘤效果明显高于PTX、MSN-PTX和MSN-LP-PTX。
2.6体外跨BBB转运
建立体外BBB模型，考察PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX的跨膜转运能力。如图9.A所示，跨膜BBB转运12h后，PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX的转运率分别为2.49％、2.72％、4.45％和10.74％，表明了脂质层包裹后可以促进HBMEC对纳米粒的摄取，同时Angiopep-2介导可以显著提高纳米粒的跨BBB转运率。在竞争性实验中，如图9.B所示，Angiopep-2和抑肽酶通过与HBMEC上的LRP受体竞争性结合，显著降低了ANG-MSN-LP-PTX的转运率，证明ANG-MSN-LP-PTX是通过LRP受体介导的细胞内吞作用跨BBB转运。
2.7细胞周期分析
基于PTX的抗肿瘤机制，G2-M期的细胞数比例为最重要的抗肿瘤参数。实验组(不同PTX制剂)和空白对照组的差异十分显著(p<0.001)，证明实验方法学具有可行性。在C6细胞中加入不同PTX制剂(折合PTX1μg·mL-1)，孵育48h后，MSN-PTX和MSN-LP-PTX对细胞周期的影响略低于PTX溶液，PTX和ANG-MSN-LP-PTX结果相似，4种PTX制剂之间并没有显著差异(图10.A和表2)。但是，4种PTX制剂跨BBB模型后对C6细胞周期的影响差异显著(图10.B和表2)，PTX、MSN-PTX和MSN-LP-PTX组的G2-M期的细胞数显著降低，结果分别为12.31±6.28、12.47±3.38、27.07±5.57％，而ANG-MSN-LP-PTX降低不明显，G2-M期的细胞数为40.92±6.20％。ANG-MSN-LP-PTX对C6细胞的抑制率显著高于PTX、MSN-PTX和MSN-LP-PTX，说明其对C6具有良好的抗肿瘤效果。
表2.PTX、MSN-PTX、MSN-LP-PTX和ANG-MSN-LP-PTX对C6细胞作用48h后G2-M期细胞数比率
3.讨论
本发明结合了MSN和Angiopep-2的优势，制备了具有核-壳型结构的Angiopep-2修饰的二氧化硅脂质囊纳米粒，可以有效促进PTX跨过BBB模型而提高对脑胶质瘤的抑制作用。虽然MSN-LP和ANG-MSN-LP的粒径略大于MSN(图1和表1)，但是仍控制在100nm左右，有利于HBMEC的内吞作用。包裹在MSN表面的脂质层可以有效的提高MSN的稳定性、降低突释现象。本发明中，MSN作为药物载体，在浓度低于10μg·mL-1时，表现出良好的生物相容性和较低的细胞毒性，并且MSN-LP和ANG-MSN-LP对HBMEC和C6的细胞毒性更低，表明脂质层可以在一定程度上降低MSN的毒性。而引起MSN毒性的原因，一方面是由于其巨大的比表面积与细胞接触时破坏细胞膜的稳定，另一方面可能由于制备时模板剂CTAB未能除尽而引起细胞毒性，所以改良的Stober法还需要进一步改进。
本发明所介绍的反复饱和溶液吸附法是一种非常有效的载药方法，与其他载药方法如浸渍法、共轭结合法、酸碱吸附法等相比较，反复饱和溶液吸附法操作简单、重现性好，无需贵重设备和仪器，最重要的是随着吸附次数的增加，可以显著的提高药物的载药量，有效解决纳米载体载药量低的问题。但是反复饱和溶液吸附法也只能局限于具有特定刚性结构的纳米载体如MSN、碳纳米管、纳米金属等，同时随着吸附次数的增加，载体重量也不断损失。
本发明建立的HBMEC和C6双细胞模型是考察递药载体跨BBB后抗肿瘤作用的模型，非常适合研究体外递药载体对脑胶质瘤一类肿瘤的抑制作用。与单纯考察递药载体跨BBB模型相比较，本发明建立的HBMEC和C6双细胞模型，不仅考察了递药载体跨BBB的能力，而且还能考察递药载体跨BBB模型后对C6细胞的抗肿瘤活性，逼真模拟递药载体在体内的传递过程，同时，可以间接评价递药载体跨BBB模型过程中，表面修饰的配体或脂质层的脱落情况，具有独特的优势。实验中，ANG-MSN-LP-PTX使C6细胞处于G2-M期的细胞数是MSN-PTX的3.2倍(图10.B和表2)，与跨BBB转运的结果相似(图9)，表明包裹在ANG-MSN-LP-PTX表面的脂质层和修饰的Angiopep-2均没有明显脱落，进而可以发挥Angiopep-2对脑胶质瘤细胞的二级靶向功能。
本发明研究表明Angiopep-2修饰的核-壳结构介孔二氧化硅脂质囊纳米粒是一种优良的递药载体，具有良好的生物相容性和跨血脑屏障的能力，其载入紫杉醇后对C6脑胶质瘤细胞具有较高的抑制效果，有望应用于脑胶质瘤的治疗。
Claims (3)
1.载紫杉醇的Angiopep-2修饰的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒的制备方法，所述方法包括：
(1)称取介孔二氧化硅纳米粒，分散到紫杉醇饱和乙醇溶液中，介孔二氧化硅纳米粒与紫杉醇饱和乙醇溶液用量之比为100mg：5～10mL，搅拌2～3h，期间每隔10～15min超声1～2min，然后15000～20000r·min-1离心20～30min，将离心得到的白色固体35～45℃减压干燥，得到载药粉末；
(2)步骤(1)所得载药粉末重复步骤(1)操作6～7次，得到载紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒；
(3)称取DSPC∶DSPE-PEG∶DSPE-PEG-ANG∶胆固醇的质量比为65∶8∶2∶25的脂质材料适量，置于梨形瓶，于40～45℃下超声溶解于适量三氯甲烷中，加入质量为前述脂质材料质量20～30％的步骤(2)所得载紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒，快速涡旋分散后，40～45℃下旋转蒸发成膜，然后用pH7.4的PBS溶液水化超声得到混悬液，经葡聚糖凝胶柱纯化分离空白脂质体和载紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒后，得到所述载紫杉醇的Angiopep-2修饰的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述介孔二氧化硅纳米粒按如下方法制备得到：将CTAB和TMP相继溶解于添加有适量2M NaOH溶液的去离子水中，80～85℃剧烈搅拌2～3h，然后快速加入适量TEOS，继续在80～85℃剧烈搅拌2～3h，静置过夜后抽滤得到白色胶状物，将白色胶状物分散于浓度为10mg·mL-1的NH4NO3乙醇溶液中80℃回流4～5h后，冷却至室温，离心得到白色固体，将所得白色固体经过重复上述分散、回流、离心操作6～7次去除CTAB后，再真空干燥，得到白色粉末，即为所述介孔二氧化硅纳米粒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述CTAB：TMP：2M NaOH溶液：去离子水：TEOS用量之比为1.0g：5～8mL：2～5mL：400～500mL：4～8mL。
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