CN104367552B - 载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，所述方法包括：称取氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒，分散到白藜芦醇饱和乙醇溶液中，常温下避光搅拌，每隔20～30min超声处理3～5min，搅拌2～3h使H2N‑MSN充分吸附RES饱和乙醇溶液，然后15000～20000r·min‑1离心20～30min，将离心得到的白色固体35～45℃减压干燥，得到载药粉末；重复上述分散、吸附、离心、干燥操作7～8次，即得所述载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒。本发明改良的经典Stober法成功合成了NH2‑MSN，通过反复饱和溶液吸附法能够有效提高载药量，制备得到NH2‑MSN‑RES提高了RES的生物利用度，具有较好市场前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的制备方法。
(二)背景技术
白藜芦醇(Resveratrol，RES)为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.etZucc.干燥根茎及根中提取出来的一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物[1]。研究证明，RES不仅有抗炎、抗血栓等功效[2]，而且RES通过抗氧化、抗突变、抑制环加氧酶和氢过氧化物酶的活性，抑制癌细胞的生长和增殖、诱导癌细胞的分化和凋亡，被喻为继“紫杉醇”之后又一新的绿色抗癌物质。但是，由于其理化性质不稳定、极难溶于水、半衰期短等特性，致口服制剂的生物利用度较低、血药浓度不稳定，严重限制其临床应用。
纳米粒载体作为一种新型药物传递系统，将药物包载于纳米粒中，一方面可以提高药物稳定性，具有缓控释特性，另一方面可以增加生物膜透过性、改变药物体内分布、提高生物利用度等。其中，介孔二氧化硅(Mesoporous Silica Nanoparticles，MSN)作为一种新型的介孔材料，其巨大的比表面积和比孔容可有效的提高载药量，介孔结构和孔径调节药物释放特性，丰富的表面硅羟基极易修饰或改性，并且MSN具有良好的生物相容性，使其在药物载体领域具有优良的研究前景。
(三)发明内容
本发明提供一种氨基改性的介孔二氧化硅(Amino-modified Mesoporous SilicaParticles，NH2-MSN)为载体材料，制备新型口服氨基改性介孔二氧化硅载白藜芦醇纳米粒(NH2-MSN-RES)的方法，为RES纳米制剂的研究提供参考。
本发明采用的技术方案是：
载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，所述方法包括：(1)称取氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒(H2N-MSN)，分散到白藜芦醇(RES)的饱和乙醇溶液中，氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒与白藜芦醇饱和乙醇溶液用量之比为100mg：20～25mL，常温下避光搅拌，每隔20～30min超声处理3～5min，搅拌2～3h使H2N-MSN充分吸附RES饱和乙醇溶液，然后15000～20000r·min-1离心20～30min，将离心得到的白色固体35～45℃减压干燥，得到载药粉末；(2)重复步骤(1)操作8～9次，即得所述载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒。本发明采用反复饱和溶液吸附法来制备H2N-MSN-RES，经实验发现，随着吸附次数的增加，H2N-MSN载入RES的量不断增加，吸附8次之后，载入药量基本不变，因此，本发明确定了反复饱和溶液吸附法来制备H2N-MSN-RES的吸附次数为8～9次。
优选的，所述氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒按如下方法制备得到：将CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解于超纯水中，加入适量2M NaOH溶液，80～85℃恒温搅拌2～3h，然后快速加入适量TEOS(正硅酸乙酯)，30min后缓慢恒速滴入适量APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，控制5min内滴毕，恒温继续反应2～3h，反应结束后静置熟化24h，15000～20000r·min-1离心20～30min得到白色固体，将离心得到的白色固体分散于浓度为10mg·mL-1的NH4NO3乙醇溶液中80℃回流4～5h，经过6次反复操作去除CTAB后，再经离心、真空干燥，得到白色粉末，即为所述氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒。本发明在经典Stober法制备MSN基础上，改良了经典Stober法，进行一步合成H2N-MSN，制得H2N-MSN氨基成功修饰，呈圆整球形，分布均一，粒径为98.4±2.8nm，Zeta电位13.2±1.8mv，在0～20ug·mL-1范围内，对Caco-2细胞无明显的毒性。
具体的，所述CTAB：水：2M NaOH溶液：TEOS：APTES用量之比为1.0g：400～500mL：3～5mL：2～4mL：1～3mL。
本发明的有益效果主要体现在：本发明改良的经典Stober法成功合成了NH2-MSN，通过反复饱和溶液吸附法能够有效提高载药量，制备得到的NH2-MSN-RES提高了RES的生物利用度，具有较好市场前景。
(四)附图说明
图1为H2N-MSN的TEM图；A为除模板剂之前，B为除模板剂之后；正常观察为放大12k倍，观察介孔结构为放大40k倍；
图2为粒径分布图；A：MSN，B：H2N-MSN；
图3为Zeta电位分布图；A：MSN，B：H2N-MSN；
图4为红外光谱图；
图5为反复饱和吸附次数-重量变化曲线；(H2N-MSN-RES)i为载体吸附药物饱和溶液的吸附次数-载体重量变化曲线，(H2N-MSN)i为载体吸附空白溶液的吸附次数-载体重量变化曲线，(H2N-MSN-RES)i—(H2N-MSN)i为载入载体的药物吸附次数-重量变化曲线，(H2N-MSN)i—(H2N-MSN)i-1为载体吸附次数-重量损失变化曲线(i＝1,2,3,4,5…)；
图6为MSN和H2N-MSN对Caco-2细胞的毒性；
图7为体外释药曲线；
图8为跨Caco-2单层细胞转运的药物浓度-时间曲线；A为AP→BL，B为BL→AP)；
图9为大鼠灌胃后的血药浓度-时间曲线(n＝6)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1仪器与材料
1.1 仪器
Waters高效液相色谱仪(Waters e2695四元泵，2998 PDA检测器，美国Waters公司)；
Nano-ZS 90激光粒度分析仪(英国Malvern仪器有限公司)；
Optima MAX超速低温离心机(美国Beckman Coulter有限公司)；
Mill-Q超纯水仪(美国Millpore公司)；
PH酸度计(瑞士Mettler-Toledo公司)；
JEM-1200EX透射电子显微镜(日本JEOL公司)；
Vector 22傅立叶红外光谱仪(德国BRUKER公司)；
TRISTAR II3020全自动比表面和孔隙分析仪(美国Micromeritics仪器公司)；
Rigaku D/max 2550PC全自动多晶X射线衍射仪(日本理学电机株式会社)；
Thermo Forma超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；
KQ5200DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；
CP225D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；
SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州科创仪器有限公司)；
HZ-9212S恒温振荡器(太仓市科教器材厂)；
VORTEX-5型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；等。
1.2 药品与试剂
白藜芦醇(南京泽朗医药科技有限公司，纯度>98％)；
白藜芦醇对照品(中国食品药品检定研究院，11535-200502)；
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)(阿拉丁试剂@上海晶纯生化科技股份有限公司)；
0.25％胰蛋白酶，D-Hanks缓冲液(美国Gibco公司)；
DMEM(含有4.5g·L-1葡萄糖、3.7g·L-1碳酸氢钠、10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素)(杭州吉诺生物医药技术有限公司)；
甲醇(美国Honeywell Burdick&Jackson公司)，其他试剂均为分析纯。
1.3 实验动物与细胞
清洁级SD大鼠18只，雌雄兼用，体重(280±20)g(浙江中医药大学实验动物中心提供，SCXK沪2012-0002)；Caco-2细胞(浙江中医药大学实验动物中心冻存，原购于中国科学院上海细胞研究所)；
2方法
2.1 H2N-MSN的制备
依据经典Stober法制备MSN，在此基础上，本实验改良了经典Stober法，并一步合成H2N-MSN：1.0g CTAB溶解于480mL超纯水中，加入3.5mL 2M NaOH溶液，80℃恒温搅拌2h，然后快速加入3mL TEOS，30min后缓慢恒速滴入2mL APTES，控制5min滴毕，恒温继续反应2h，反应结束后静置熟化24h，15000r·min-1离心30min得到的白色固体。将离心得到的白色固体分散于200mL NH4NO3(10mg·mL-1)的乙醇溶液中80℃回流4h，经过6次反复操作去除模板剂CTAB，最后一次离心后真空干燥，得到白色粉末H2N-MSN。采用透射电镜(TEM)分别对MSN、H2N-MSN进行观察，粒径仪测定粒径及Zeta电位，傅立叶红外光谱仪(FTIR)表征H2N-MSN上的修饰氨基。
2.2 H2N-MSN-RES的制备
本发明采用反复饱和溶液吸附法来制备H2N-MSN-RES：称取100mgH2N-MSN(记为W10)分散到RES饱和乙醇溶液20mL中，常温25℃避光搅拌，每隔30min短时超声3min，搅拌2h使H2N-MSN充分吸附RES饱和乙醇溶液，然后15000r·min-1离心30min，将离心得到的白色固体35℃减压干燥后称重(记为W11)，然后重复分散、吸附、离心、干燥、称重，每重复一次的称重分别记为W12、W13、W14……。同样，称取100mg H2N-MSN分散到乙醇溶液20mL中，除了不加入RES外，其他同法操作，每次称重分别记为W01、W02、W03、W04……，按照相同的方法制备对照组MSN-RES。
2.3 H2N-MSN-RES体外释放度的测定
分别称取RES、MSN-RES、H2N-MSN-RES适量(折合RES量10mg)分散于10mL的PBS(pH7.4)缓冲液，置于透析袋(截留分子量3500KDa)中，透析夹密封后置于1000mL释放介质PBS中，在37℃下以50r·min-1恒温水浴振荡，平行操作3份。分别于15、30、45、60min、2、4、6、8、12、24、48h取1mL透析介质，并补充相应的PBS。取出的透析介质用0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液经HPLC测定RES浓度，计算累积释放率。
2.4 HPLC色谱条件
色谱柱：SunFire C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(50:50)；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1；检测波长：306nm；进样量：20μL。以白藜芦醇的峰面积为纵坐标(Y)，其浓度为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程为：Y＝132917X+776.27，r＝0.9999，表明RES在0.25～10μg·mL-1内线性关系良好。考察其高中低3种浓度溶液的日内精密度RSD小于2％，日间精密度RSD小于3％。
2.5 H2N-MSN细胞毒性
Caco-2细胞置培养瓶中，加入DMEM培养基，置37℃恒温培养箱(5％ CO2，相对湿度90％)连续培养。每2～3d用含0.02％EDTA的胰蛋白酶消化，以1﹕3比例传代培养。
取对数生长期Caco-2细胞接种于96孔平底细胞培养板中，密度为1×105个·mL-1，每孔加入190μL培养液培养12h。然后实验组分别加入不同浓度的MSN和H2N-MSN的混悬液10μL，最终浓度分别为0.01、0.1、0.5、1、5、20、50、100μg·mL-1，空白对照组加入无菌生理盐水，每组每浓度设6个平行孔。培养24h后，每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μL，微量振荡器上振荡3～5min，继续培养4h，弃上清液，加入DMSO 150μL，在微量振荡器上振荡10min，用酶标仪测定570nm波长处的光密度(OD)值。取6个孔平均OD值计算细胞的存活率(IC)，IC＝(实验组OD值/空白对照组OD值)×100％。
2.6 H2N-MSN-RES跨膜转运
Caco-2细胞单层模型的建立参考文献(Hilgers A R,Conradi R A,Burton PS.Caco-2Cell Monolayers as a Model for Drug Transport Across the IntestinalMucosa[J].Pharm Res.1990；7(9):902-910；Rieux A,Ragnarsson EG,Gullberg E,PréatV,Schneider YJ,Artursson P.Transport of nanoparticles across an in vitromodel of the human intestinal follicle associated epithelium[J].Eur J PharmSci.2005；25(4):455-65.)。将对数生长期细胞用完全培养液制成浓度为1×106个·mL-1的细胞悬液，按每1mL接种于Transwell 12孔板(美国Corning公司3402型，膜面积1.12cm2，膜孔径3μm)中，培养三周后，跨膜电阻仪测得跨膜电阻均大于500Ω·cm2，用普萘洛尔对所建的Caco-2细胞单层模型经行验证，与文献对比后确认建模成功。
将造模成功的Transwell小室置于12孔嵌套板中，每板分为3组(RES、MSN-RES、H2N-MSN-RES)，平行6孔，每组考察含RES为2μg·mL-13种制剂的转运情况。用预先37℃保温的D-Hanks溶液冲洗3次，跨膜转运AP侧→BL侧时，在BL室加入1.5mL空白D-Hanks溶液，使AP室外表面完全浸透；然后在AP室加入1.5mL含药培养基；跨膜转运BL侧→AP侧时，在BL室中加入1.5mL含药培养基，AP室加入1.5mL空白D-Hanks溶液。加入药液后分别于0.5、1、2、4、8、12h时从BL或AP室小心取样0.15mL，并补充0.15mL的空白D-Hanks。样品经HPLC测定药物浓度，绘制药物吸收曲线并计算表观渗透系数Papp，Papp＝ΔQ/(Δt·A·C0)，ΔQ为药物的累积转运量(μg)；ΔQ/Δt为药物转运速率(μg·min-1)；C0为药物初始浓度(μg·mL-1)；A为细胞单层的表面积(cm2)。
2.7 药动学研究
2.7.1血浆样品的处理 精密吸取血浆上清100μL，加入400μL甲醇涡旋振荡30s，8000r·min-1离心10min，取上清液300μL于35℃氮气挥干，150μL甲醇复溶残余物，涡旋震荡30s，超声2min后，过0.22μm微孔滤膜后，取20μL进样分析。
2.7.2给药方案与血样采集 18只SD大鼠，随机分为3组，给药前禁食12h，自由饮水。分别灌胃给药RES溶液、MSN-RES和H2N-MSN-RES(折合RES药量200mg·kg-1)。于给药后15、30、45min、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12h经股动脉插管采血0.5mL，置于经肝素钠处理过的离心管中，迅速3500r·min-1离心5min后取上清100μL按照“2.7.1”项下方法处理，剩余血浆中加入100μL生理盐水轻轻震荡摇匀后经颈静脉缓慢注回大鼠体内。样品经HPLC测定并计算血药浓度，绘制药-时曲线和计算药动学参数。
3结果
3.1 H2N-MSN的制备和表征
本实验采用改良的经典Stober法，一步合成了H2N-MSN。通过TEM观察，H2N-MSN未除模板剂CTAB之前，大量团聚粘连，分散性差，也没有介孔结构(图1.A)；H2N-MSN经过除模板剂后，呈现圆整球形，形态规整，分散性良好，无聚集现象，放大到40k倍可清晰观察到介孔结构(图1.B)。H2N-MSN经粒径仪测定后，粒径为98.4±2.8nm，Zeta电位为13.2±1.8mv；用经典Stober法合成的MSN的粒径为77.8±3.4nm，Zeta电位为-24.6±0.9mv(图2.和图3)。H2N-MSN粒径明显大于MSN主要由于APTES中的3-氨丙基三乙氧基增大了H2N-MSN的粒径，并且3-氨丙基三乙氧基使得MSN由荷负电变为荷正电的H2N-MSN。H2N-MSN经红外光谱表征，与MSN的峰形对比，在3000cm-1处出现双峰(图4)，可以推断为N-H的伸缩振动峰，表明成功合成了H2N-MSN。
3.2 H2N-MSN-RES的制备
用反复饱和溶液吸附法来制备H2N-MSN-RES，由图5所示：随着吸附次数的增加，H2N-MSN的重量不断损失，每次平均损失率为3.21±0.50mg；虽然H2N-MSN-RES的总重量也是呈现下降趋势，但是H2N-MSN-RES减去H2N-MSN的重量却不断增加[图中(H2N-MSN-RES)i-(H2N-MSN)i曲线]，表明随着吸附次数的增加，H2N-MSN载入RES的量不断增加，每次吸附平均增加载药量为1.69±0.22mg；由图还可以看出，吸附8次之后，载入药量基本不变，可以推断H2N-MSN的介孔内已经接近满载状态，因此，本实验确定了反复饱和溶液吸附法来制备H2N-MSN-RES的吸附次数为8次，最终的载药量为19.26±2.51％。
3.3 药物载体细胞毒性的评价
采用MTT法测定了MSN和H2N-MSN对Caco-2的细胞毒性。如图6所示，孵育24h后，在纳米粒浓度达到20ug·mL-1时，细胞的存活率仍然保持在90％以上。此外，H2N-MSN的毒性略高于MSN，可能是由于3-氨丙基三乙氧基对细胞有一定的毒性，其毒性机制还需进一步的研究。实验结果表明，在0～20ug·mL-1范围内，MSN和H2N-MSN纳米载体对Caco-2细胞无明显的毒性作用。
3.4 体外释药评价
考察了MSN-RES和H2N-MSN-RES在模拟生理环境(PBS，pH7.4)中的释药行为。由体外释药曲线看出，RES溶液释药迅速，3h内的释药量达到90％，4h已基本完全释药；MSN-RES和H2N-MSN-RES在12h内的累积释药量分别为70.1％和62.5％，并且12h后平稳释药，48h内释药量分别为81.4％和73.3％。MSN-RES和H2N-MSN-RES均呈现明显的缓释特性。
3.5 跨膜转运评价
在跨膜转运实验中，RES溶液、MSN-RES和H2N-MSN-RES随时间的增加，跨膜转运的药量不断增加(图8)。RES溶液、MSN-RES和H2N-MSN-RES在AP→BL和BL→AP两个方向的转运非常相似，ER值分别为0.99、1.07、1.06，表明3种制剂都为被动跨膜转运，并且没有明显的外排现象(表1)。RES溶液在2h后基本达到平稳状态，而MSN-RES在4h后达到平稳状态，但是MSN-RES表观透过吸收率非常低，两个方向的Papp值仅为10.58±0.76和9.89±0.40明显小于RES溶液。H2N-MSN-RES在4h后达到平稳状态，但是其Papp值远远高于RES溶液和MSN-RES，两个方向的Papp分别为17.86±0.59和16.85±0.38，表明氨基修饰之后的MSN具有较强的跨膜能力。
表1：载体在Caco-2单层细胞转运中Papp的测定
3.5 药动学研究
大鼠经一次性灌胃给药RES溶液、MSN-RES和H2N-MSN-RES后血药浓度-时间线如图9所示，经PKSolver软件进行数据分析，AIC最小法选择最适房室模型。RES溶液为单室模型，而MSN-RES和H2N-MSN-RES为二室模型，主要的药动学参数见表2。
由图9和表2可以看出，MSN-RES和H2N-MSN-RES半衰期(T1/2)和达峰时间(Tmax)显著大于RES溶液，表明RES经MSN和H2N-MSN包载后不仅药物代谢速度降低，而且载体的的缓释特性使得RES的Tmax显著延迟、平均滞留时间(MRT)延长数倍，并且药物浓度的波动性趋于平稳。H2N-MSN-RES的达峰浓度(Cmax)明显大于RES溶液和MSN-RES，表明氨基修饰后可以促进MSN的胃肠道吸收，同时与跨膜转运的结果一致。H2N-MSN-RES的药时曲线下面积(AUC0-t)是RES溶液的2.37倍，而H2N-MSN-RES的清除率(CL)只有RES溶液的29.2％，表明H2N-MSN-RES可以有效的增加RES在机体内的效应时间和提高RES的生物利用度。
表2：主要药动学参数(n＝6)
4讨论
大多数难溶性药物因水溶性差而导致口服生物利用度低及临床效果不佳，其主要原因是药物在胃肠道分泌液中的溶解度较小，难以分散在其中，不能与胃肠道黏膜充分接触，因而不能被充分吸收。口服纳米给药系统的优势在于增加药物的生物膜透过率：纳米载体由于粒径小，表面积非常大，药物可高密度地负载在纳米载体内部和表面，形成局部的高浓度，有利于增加药物与肠壁的接触时间和接触面积，从而提高药物口服吸收的生物利用度等。而纳米载体表面的荷电性质也同样影响药物的生物膜透过率，表面荷正电的纳米载体可以与胃肠道粘膜表面荷负电的黏蛋白相互静电作用，因而导致强烈的粘膜粘附，延长载体的滞留时间，促进药物吸收和载体的跨膜转运。
MSN凭借其巨大的比表面积可以有效提高药物的口服生物利用度，而经过氨基修饰的MSN通过与胃肠道表面黏蛋白的相互粘附，更加有效促进了药物的吸收。同样，实验结果表明MSN和NH2-MSN在较高浓度时具有一定的细胞毒性，一方面是由于其巨大的比表面积与细胞接触时破坏细胞膜的稳定，另一方面可能由于制备时模板剂CTAB未能除尽而引起细胞毒性，前者在口服给药中难以避免，因为降低了比表面积也会降低与胃肠道的接触面积而降低吸收，后者可以在后续的研究中改进合成工艺来解决。
本发明采用的反复饱和溶液吸附法是一种非常有效的载药方法，与其他载药方法如浸渍法、共轭结合法、酸碱吸附法等相比较，反复饱和溶液吸附法操作简单、重现性好，无需贵重设备和仪器，最重要的是随着吸附次数的增加，可以显著的提高药物的载药量，有效解决纳米载体载药量低的问题。但是反复饱和溶液吸附法也只能局限于具有特定刚性结构的纳米载体如MSN、碳纳米管、纳米金属等。
纳米给药系统能够改变药物的药动学特征，而药动学研究也是评价纳米给药系统是否成功构建的标准之一，为最终确定用药剂量提供参考。RES载入纳米载体后，由单室模型改变为二室模型，同时T1/2、Tmax和MRT显著的延长，Cmax和AUC0-t明显增加，而CL则成倍减少，主要由于NH2-MSN的缓控释特性和对胃肠道的粘附作用导致。因此，氨基修饰的介孔二氧化硅是一种优良的口服纳米载体材料，能够有效的提高难溶性药物的生物利用度，具有广泛的研究和应用前景。
Claims (1)
1.载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，所述方法包括：(1)称取氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒，分散到白藜芦醇饱和乙醇溶液中，氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒与白藜芦醇饱和乙醇溶液用量之比为100mg：20～25mL，常温下避光搅拌，每隔20～30min超声处理3～5min，搅拌2～3h使氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒充分吸附白藜芦醇饱和乙醇溶液，然后15000～20000r·min-1离心20～30min，将离心得到的白色固体35～45℃减压干燥，得到载药粉末；(2)重复步骤(1)操作7～8次，即得所述载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒；所述氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒按如下方法制备得到：将CTAB溶解于超纯水中，加入2M NaOH溶液，80～85℃恒温搅拌2～3h，然后快速加入TEOS，30min后缓慢恒速滴入APTES，控制5min内滴毕，恒温继续反应2～3h，反应结束后静置熟化24h，15000～20000r·min-1离心20～30min得到白色固体，将离心得到的白色固体分散于浓度为10mg·mL-1的NH4NO3乙醇溶液中80℃回流4～5h，经过6次反复操作去除CTAB后，再经离心、真空干燥，得到白色粉末，即为所述氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒；所述CTAB：水：2M NaOH溶液：TEOS：APTES用量之比为1.0g：400～500mL：3～5mL：2～4mL：1～3mL。
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