CN118085026A - 一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于溶瘤肽的水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用。基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂，包括溶瘤肽‑多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液和免疫治疗剂，其中，将溶瘤肽‑多肽偶联物溶于溶剂中得到溶瘤肽‑多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液，免疫调节剂负载在纳米纤维上。本发明提供的水凝胶疫苗制剂在生理环境中可原位形成水凝胶疫苗，并能够控制疫苗组分缓慢释放，持续释放溶瘤肽和免疫调节剂，从而持续激活体内抗肿瘤免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用。
背景技术
传统的癌症治疗手段主要是手术切除结合放化疗。然而，手术难以做到完全切除，容易出现复发；放化疗毒副作用大，治疗效果不佳。相比于传统疗法，新兴免疫疗法通过激活机体自身的免疫系统来杀伤肿瘤，具有疗效持久、副作用小等优势，是继手术、放疗、化疗之后的第四大癌症治疗方法。目前，免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂、过继细胞疗法、肿瘤疫苗等。尽管免疫检查点阻断疗法、过继细胞疗法如CAR-T细胞疗法在肿瘤治疗领域已经取得了显著的成果，然而，由于免疫抑制微环境的存在，免疫检查点阻断剂仅对20％的患者有效，CAR-T细胞疗法仅对血癌有效。相比于上述两种疗法，肿瘤疫苗利用肿瘤抗原表位活化CD8+T细胞，激活主动免疫，从而杀伤癌细胞，具有其独特的优势：一是可同时识别肿瘤表面抗原和细胞内抗原；二是基于其对于肿瘤微环境的重塑，在“冷肿瘤”中亦可发挥杀伤作用；三是激发长时间免疫记忆，使抗肿瘤作用持久。
根据获取肿瘤抗原方式的不同，肿瘤疫苗分为以下四类：一是通过诱导肿瘤免疫原性死亡，从而释放肿瘤相关抗原，进一步通过抗原呈递细胞摄取抗原并呈递给CD8+T细胞，激活主动免疫；二是将切除的肿瘤组织中的肿瘤细胞或者裂解物抗原装载到自身抗原呈递细胞上，并注射回患者体内；三是获取某一类肿瘤特异性高表达的抗原；四是某一患者的肿瘤特异性表达的抗原。其中，第一类肿瘤疫苗不仅获取抗原的种类多，且操作简单、成本低，临床转化前景大。溶瘤病毒和溶瘤肽就是第一类肿瘤疫苗的代表。溶瘤病毒和溶瘤肽能够溶解肿瘤，进而诱导肿瘤免疫原性死亡，释放肿瘤抗原。但是溶瘤病毒与标准药物不同，它们是活病毒，在临床给药时会增殖，不仅难以确定其有效剂量，而且容易导致生物安全性问题。溶瘤肽不仅具备溶瘤病毒的功能，而且生物安全性好、穿透性强、合成容易成本低，具有独特优势。然而，溶瘤肽免疫原性较低，通过免疫调节剂来提高其免疫应答效力，即使使用较低剂量的溶瘤肽，也能提高疫苗接种所引起的抗肿瘤免疫反应的程度、质量和持久性。但是溶瘤肽和免疫调节剂在系统给药后都因机体快递地清除机制导致半衰期短，进而导致获取抗原效率低，往往不足以引起强大的免疫反应。若能单次接种后实现持续溶解肿瘤和免疫调节剂的可持续递送，诱导CD8+T细胞的持续激活，将极大提升肿瘤疫苗的治疗效果。因此，开发能够提高肿瘤疫苗可控释放的递送平台是当下的迫切需求。
CN116271065A公开了一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用，其包括超分子多肽水凝胶载体和负载在超分子多肽水凝胶载体上的亚单位疫苗组分；所述亚单位疫苗组分包括抗原、佐剂和免疫调节剂。该对比文件1提供的原位亚单位水凝胶疫苗制剂能够控制疫苗组分缓慢释放，持续激活体内免疫应答效应，从而建立免疫屏障，及时切断病毒传播和阻断病毒感染。设计的多肽序列可自组装形成带正电荷的纳米纤维，其可以吸附疫苗组分，进一步在生理环境中原位形成亚单位水凝胶疫苗；通过检测药物释放行为，表明其亚单位水凝胶疫苗能够长效缓慢释放疫苗组分，从而提高抗原暴露时间和持续激活体内免疫应答机制。
CN110269931A公开了一种水凝胶肿瘤疫苗的制备方法以及由其制备的水凝胶肿瘤疫苗和其用途。制备方法包括：1)肿瘤细胞预处理：向作为载体的肿瘤细胞中加入疏水性药物，得到预处理的肿瘤细胞；2)水凝胶载体的制备：将多肽和无机碱溶解于缓冲液中，充分溶解后，30-90℃水浴加热5-50min，即制备得到水凝胶载体；3)水凝胶肿瘤疫苗的制备：取步骤2)中制得的水凝胶载体，在涡旋的状态下，缓慢加入步骤1)中制备的预处理的肿瘤细胞，混合均匀，静置得到水凝胶肿瘤疫苗。该水凝胶肿瘤疫苗将肿瘤细胞疫苗与疏水性药物联合，可以增强特异性抗原呈递的同时抑制免疫逃避机制，高效抑制肿瘤转移和复发。
然而上述两篇专利中的水凝胶肿瘤疫苗都不涉及溶瘤肽相关内容。
发明内容
现有肿瘤疫苗存在依赖冷链、多次接种、毒副作用大等问题，本发明的目的在于提供一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用。
本发明通过构建一种溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液，再负载免疫调节剂，进而制备出一种安全性好、稳定性高、载药量高的基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂，从而可以实现疫苗组分的可控和长效递送，诱导抗原和免疫调节剂的持续释放，诱导CD8+T细胞的持续激活，从而使用时可以有效地抑制肿瘤。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种溶瘤肽-多肽偶联物，通过以下方法制备得到：在溶瘤肽LTX-315的N端通过连接子偶联自组装多肽和/或疏水性分子，得到所述溶瘤肽-多肽偶联物，所述溶瘤肽-多肽偶联物能够在溶剂中自组装形成纳米纤维，所述溶瘤肽LTX-315为KKWWKKW-Dip-K。
在本发明的一些实施方式中，所述连接子选自化学键二硫键、酯键、酰胺键和/或体内酶响应序列中的一种；在本发明的一些实施方式中，所述体内酶响应序列包括基质金属蛋白酶响应序列PLGLAG、PLGVR、PLGIAGQ；组织蛋白酶B响应序列GFLG、ALAL、GLFG；凋亡酶响应序列DEVD。
在本发明的一些实施方式中，所述自组装多肽选自：VVVAAAEGKCC，KKFKFEFEF，AEAEAKAKAEAEAKAK，AGEDQLKHVFS，FFFRGDR，FKFEFKFF，FEFEFKFK，FHFDFHFD，GV2Q2HKD，GGVVVRGDR，GSFSIQYTYHV，IKVAV，KFKFEFKFE，IKVKIKVKVPPTKIKVKIK，KYFIL，K2(QL)6K2，K2(SL)6K2，K(SL)6KGPRKLYDY，VKVKVPPTKVKVKVKVKVKV，KLDLPVGLIGKLDL，K2W(QL)6K2，KNEFKAAFDI，KFDLKKDLKLDL，RGDSRGDS，RADARADARADARADA，Fmoc-FFVPGVGQGK，VLTKVKTKVPLPTKVEVKVLV，Fmoc-FFRGD，Fmoc-FRGDF，Nap-GFFYGRGD，Nap-GFFYGRGDH，VVAA，VVVAAA，Nap-GFFYG或Fmoc-GFFY中的一种或几种的组合。
在本发明的一些实施方式中，所述疏水性分子选自棕榈酸(简写为C16)、月桂酸(简写为C12)、辛酸(简写为C8)或己酸(简写为C6)中的一种；
在本发明的一些实施方式中，溶瘤肽-多肽偶联物选自如下中的一种或几种的组合：C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K，KKFKFEFEFKKWWKKW-Dip-K，AEAEAKAKAEAEAKAKKKWWKKW-Dip-K，AGEDQLKHVFSKKWWKKW-Dip-K，FFFRGDRKKWWKKW-Dip-K，FKFEFKFFKKWWKKW-Dip-K，FEFEFKFKKKWWKKW-Dip-K，FHFDFHFDKKWWKKW-Dip-K，GV2Q2HKDKKWWKKW-Dip-K，GGVVVRGDRKKWWKKW-Dip-K，GSFSIQYTYHVKKWWKKW-Dip-K，IKVAVKKWWKKW-Dip-K，KFKFEFKFEKKWWKKW-Dip-K，IKVKIKVKVPPTKIKVKIKKKWWKKW-Dip-K，KYFILKKWWKKW-Dip-K，K2(QL)6K2KKWWKKW-Dip-K，K2(SL)6K2KKWWKKW-Dip-K，K(SL)6KGPRKLYDYKKWWKKW-Dip-K，VKVKVPPTKVKVKVKVKVKVKKWWKKW-Dip-K，KLDLPVGLIGKLDLKKWWKKW-Dip-K，K2W(QL)6K2KKWWKKW-Dip-K，KNEFKAAFDIKKWWKKW-Dip-K，KFDLKKDLKLDLKKWWKKW-Dip-K，RGDSRGDSKKWWKKW-Dip-K，RADARADARADARADAKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-FFVPGVGQGKKKWWKKW-Dip-K，VLTKVKTKVPLPTKVEVKVLVKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-FFRGDKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-FRGDFKKWWKKW-Dip-K，Nap-GFFYGRGDKKWWKKW-Dip-K，Nap-GFFYGRGDHKKWWKKW-Dip-K，VVAAKKWWKKW-Dip-K，VVVAAAKKWWKKW-Dip-K，Nap-GFFYGKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-GFFYKKWWKKW-Dip-K。
其中，C16＝棕榈酸，S＝丝氨酸，V＝缬氨酸，A＝丙氨酸，E＝谷氨酸，I＝异亮氨酸，L＝亮氨酸，F＝苯丙氨酸，R＝精氨酸，D＝天冬氨酸，Q＝谷氨酰胺，P＝脯氨酸，G＝甘氨酸，K＝赖氨酸，C＝半胱氨酸，W＝色氨酸，Fmoc＝9-芴甲氧羰基，Dip＝L-3,3’-二苯基丙氨酸。
本发明还进一步提供一种溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液，所述溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液是将溶瘤肽-多肽偶联物溶于溶剂中得到的，溶瘤肽-多肽偶联物在溶剂中自组装形成纳米纤维。
在本发明的一些实施方式中，所述溶剂选自水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述溶瘤肽-多肽偶联物在溶剂中的浓度为1-100mM。
本发明提供的溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液在生理环境中可以形成超分子水凝胶。
本发明还进一步提供一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂，包括所述溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液和所述溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液中添加的免疫治疗剂，其中，所述免疫调节剂负载在所述溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液的纳米纤维上。
在本发明的一些实施方式中，所述免疫调节剂选自2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)、c-di-AMP、3',3'-cGAMP、2',3'-cGAMP、CpG ODN、CpG 1018、Poly(I:C)、R837、R848、MF59、AS03、AS01B、MPLA、ADU-S100、MAVU-140、GSK3745417、IMSA-101、MK-1454、E7766、SB11285、BMS-986301、SR-717lithium、MSA-2、c-di-GMP、tautomerism、HG381、明矾、脂多糖、铝盐、GM-CSF、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IFN-β、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11、sotigalimab、cifurtilimab、tecaginlimab、CDX-1140、YH-003、AMG-994、SL-172154、IL-12、IL-21、IL-22、CCL27、CCL28、QS-21中的一种或几种的组合。
本发明还进一步提供一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、合成溶瘤肽-多肽偶联物；
S2、将步骤S1中得到的溶瘤肽-多肽偶联物溶于溶剂中，得到溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液；
S3、将免疫调节剂添加到步骤S2中得到的溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液中孵育，所得含有免疫调节剂的纳米纤维溶液，即为基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，所述孵育温度为4-50℃，所述孵育时间为0-3h。
在本发明的一个实施方式中，更进一步地，所述免疫调节剂在溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液中的浓度为1-10ug/100uL。
本发明还进一步提供一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂在制备杀伤肿瘤细胞并激活机体抗肿瘤免疫的疫苗中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌。
本发明提供的基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂使用时，可以直接加入生理环境中即可原位触发迅速形成凝胶，例如将本发明的基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂皮下接种后可原位触发迅速形成凝胶。
水凝胶是一类能实现可控递送疫苗组分的极具潜力的“智能”药物递送载体，具有可调节的机械性能和良好的生物相容性，本发明中，将溶瘤肽-多肽偶联物溶于溶剂中，自组装得到纳米纤维溶液，该纳米纤维溶液加入生理环境中即可原位触发迅速形成凝胶，因此，本申请方案将溶瘤肽-多肽偶联物制备成可直接形成水凝胶的体系，其具有生物降解性，易制备及功能性，能够作为药物储库，实现免疫治疗剂的可控递送，控制有效载荷的释放并防止不希望的免疫副作用的发生。
本发明涉及一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂，通过局部递送可以增加疫苗组分在接种部位的滞留，并控制和持续释放疫苗组分，在提高药物浓度和生物利用度同时，大大降低疫苗组分在血液中的暴露时间，减少其毒副作用。
本发明基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂可以实现其在生理条件下的即时“溶液-凝胶”转变，以液体状态直接皮下接种，然后原位发生相转变，形成水凝胶疫苗。
本发明提供的基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂不仅能够溶解肿瘤，释放肿瘤抗原，还可以作为载体负载免疫调节剂。本发明提供的基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂能够控制疫苗组分缓慢释放，持续释放溶瘤肽和免疫调节剂，从而持续激活体内抗肿瘤免疫应答。所设计的溶瘤肽-多肽偶联物可自组装形成带正电荷的纳米纤维，其可以吸附免疫调节剂，进一步在生理环境中原位形成水凝胶疫苗；通过检测溶瘤肽水凝胶疫苗释放行为，表明其能够长效缓释释放疫苗组分，从而持续激活体内抗肿瘤免疫应答。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
(1)本发明运用自组装多肽的“溶液-凝胶”转变特性，以溶液态接种后，在注射部位触发形成超分子水凝胶疫苗，构建原位药物储库，控制疫苗组分(溶瘤肽和免疫调节剂)的缓慢和持久释放并防止不希望的免疫反应发生；
(2)本发明制备的基于溶瘤肽的水凝胶疫苗可在肿瘤原位释放疫苗组分，杀伤肿瘤的同时，又能够激活CD8+T细胞，诱导机体长期和持久的抗肿瘤免疫，有效促进肿瘤完全消退并防止肿瘤复发；
(3)本发明制得的基于溶瘤肽的水凝胶疫苗制剂制备简易、给药便捷且易于运输和保存，为疫苗的运输、储存、接种提供了有利条件。
附图说明
图1为本发明实施例1的C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K多肽的质谱图；
图2为本发明实施例1的C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K高效液相色谱表征图；
图3为本发明实施例2的C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K纳米纤维透射电子显微镜表征图；
图4为本发明实施例2的C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K纳米纤维的“溶液-凝胶”转变表征图；
图5为本发明实施例2的“溶液-凝胶”流变测试结果(粘弹性-时间扫描曲线)；
图6为本发明实施例3的C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K(L3-NF)及负载免疫调节剂2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)(CDA)后CDA/L3-NF溶液的Zeta电位图；
图7为本发明实施例4的药物释放特性图；
图8为本发明实施例5的原位溶瘤肽水凝胶疫苗形成示意图；
图9为本发明实施例6的CDA/L3-NF原位水凝胶疫苗诱导CD8+T细胞激活图。
具体实施方式
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
自组装溶瘤肽的合成
通过固相合成法分别合成多肽C16-VVVAAAEGKC和CKKWWKKW-Dip-K，通过制备型高效液相色谱仪对粗产品进行分离纯化；最后通过冷冻干燥机得到干燥的产品(即多肽C16-VVVAAAEGKC和CKKWWKKW-Dip-K)。
C16-VVVAAAEGKC(上)和CKKWWKKW-Dip-K(下)的化学结构式如下：
进一步地，将摩尔比为1:2的CKKWWKKW-Dip-K与2,2’-二硫二吡啶反应，活化半胱氨酸的二硫键，得到Pyr-CKKWWKKW-Dip-K，Pyr-CKKWWKKW-Dip-K的化学结构式如下：
进一步地，将摩尔比为1:1.5的Pyr-CKKWWKKW-Dip-K与C16-VVVAAAEGKC分别溶解于DMSO中，然后混合，常温搅拌36h，得到最终的溶瘤肽-多肽偶联物C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K。
C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K的化学结构式如下：
图1为本发明实施例1的溶瘤肽-多肽偶联物C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K的质谱图谱，通过质谱数据分析，证明成功合成溶瘤肽-多肽偶联物分子C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K；图2为本发明实施例1的溶瘤肽-多肽偶联物C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K的高效液相色谱图，结果证明成功获得纯品。
实施例2
溶瘤肽-多肽偶联物水凝胶的制备
将两亲性溶瘤肽-多肽偶联物C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K(13.725mg)溶解于去离子水(1mL)，然后在室温下静置后得到自组装体纳米纤维L3-NF溶液，然后，将PBS添加到该溶液，即可得到溶瘤肽-多肽偶联物水凝胶。
本实施例通过在体外模拟体内的生理环境，采用倒置法测试“溶液-凝胶”的转变特性，通过流变仪表征“溶液-凝胶”的储能模量(G’)和损耗模量(G”)变化。
图3为本发明实施例2的组装体L3-NF的透射电子显微镜图，显示该溶瘤肽-多肽偶联物在水溶液中自组装为纳米纤维结构。
图4为本发明实施例2的组装体L3-NF的“溶液-凝胶”转变，通过倒置法确定其具有即时“溶液-凝胶”转变特性。
图5为本发明实施例2的“溶液-凝胶”的储能模量(G’)和损耗模量(G”)随时间变化曲线，结果显示：0-1min为溶液状态，G’<G”；在1min加入PBS后，溶液瞬间转变为凝胶状态，此时G’>G”。
实施例3
基于溶瘤肽的水凝胶疫苗体系的制备方法
制备L3-NF溶液(指的是将两亲性溶瘤肽-多肽偶联物C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K溶解于去离子水中，其浓度为3.24mM，体积为180μL)，将CDA(10μg)加入其中，涡旋，37℃孵育30min，制得CDA/L3-NF溶液。通过Zeta电位测定仪检测表面电位变化。
图6为Zeta电位为表征图，L3-NF溶液的Zeta电位为54.93±3.11mV，L3-NF溶液吸附CDA后所得CDA/L3-NF溶液Zeta电位降低到44.55±5.72mV，说明CDA通过静电作用负载到L3-NF纳米纤维表面(每组三个样本)。
实施例4
基于溶瘤肽的水凝胶疫苗体系控制药物释放效果
将180μL CDA/L3-NF溶液(即为实施例3中的CDA/L3-NF溶液)置于0.6mL离心管中，并加入20μL PBS以制备L3-Gel-CDA疫苗制剂。在离心管中加入释放介质(50μL PBS溶液)，并分别在0.25天，0.5天，1天，2天，3天，4天，5天，6天，8天，10天，12天，14天，16天，18天，20天取样50μL，并补充50μL新鲜的PBS溶液。最后通过高效液相色谱检测溶瘤肽和CDA的释放量，计算累积释药量并绘制释药曲线。
图7为体外药物释放表明，该基于溶瘤肽的水凝胶疫苗体系能够缓慢、长效释放疫苗组分。在试验的20天内，溶瘤肽和CDA释放量分别为53.72％±5.17％和73.17％±1.91％(每组三个样本)。因此，该超分子水凝胶可以作为药物储库，有效控制疫苗组分的缓慢和持久释放。
实施例5
基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗的形成
100μL CDA/L3-NF溶液(即为实施例3中的CDA/L3-NF溶液)经皮下接种于小鼠体内，15分钟后解剖小鼠，观察原位水凝胶疫苗的形成并拍照。
从图8可以看出，CDA/L3-NF体系具有“溶液-凝胶”转变特性，以溶液态接种，在生理条件下触发形成原位水凝胶疫苗。
实施例6
基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗能够诱导机体CD8+T细胞的激活在BALB/c小鼠(6-8周)皮下接种B16-OVA黑色素瘤细胞(每只小鼠注射2.5×10^6个细胞)。10天后，将小鼠随机分为三组：CDA/L3-NF组，L3+CDA组和Saline组，每组5只。CDA/L3-NF组每只小鼠瘤内注射100μL CDA/L3-NF溶液，L3+CDA组每只小鼠瘤内注射100μL游离的溶瘤肽和CDA混合溶液(L3物质的量与L3-NF相同，CDA质量与CDA/L3-NF相同)，Saline组每只小鼠瘤内注射100μL的生理盐水。接种一周后，处死小鼠，取肿瘤组织，检测瘤内CD8+T细胞的浸润水平。
从图9可以看出，与对照组(L3+CDA组和Saline组)相比，在肿瘤部位瘤内原位注射CDA/L3-NF体系，在一周后能检测到肿瘤内CD8+T细胞浸润提升，表明CDA/L3-NF水凝胶疫苗体系能够诱导机体CD8+T细胞的激活。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种溶瘤肽-多肽偶联物，其特征在于，通过以下方法制备得到：在溶瘤肽LTX-315的N端通过连接子偶联自组装多肽和/或疏水性分子，得到所述溶瘤肽-多肽偶联物，所述溶瘤肽-多肽偶联物能够在溶剂中自组装形成纳米纤维，所述溶瘤肽LTX-315为KKWWKKW-Dip-K；
所述连接子选自化学键二硫键、酯键、酰胺键和/或体内酶响应，其中，体内酶响应序列包括基质金属蛋白酶响应序列、组织蛋白酶B响应序列和凋亡酶响应序列，其中，基质金属蛋白酶响应序列选自PLGLAG、PLGVR、PLGIAGQ；组织蛋白酶B响应序列选自GFLG、ALAL、GLFG；凋亡酶响应序列选自DEVD；
所述疏水性分子选自棕榈酸、月桂酸、辛酸或己酸中的一种；
所述自组装多肽选自：VVVAAAEGKCC，KKFKFEFEF，AEAEAKAKAEAEAKAK，AGEDQLKHVFS，FFFRGDR，FKFEFKFF，FEFEFKFK，FHFDFHFD，GV2Q2HKD，GGVVVRGDR，GSFSIQYTYHV，IKVAV，KFKFEFKFE，IKVKIKVKVPPTKIKVKIK，KYFIL，K2(QL)6K2，K2(SL)6K2，K(SL)6KGPRKLYDY，VKVKVPPTKVKVKVKVKVKV，KLDLPVGLIGKLDL，K2W(QL)6K2，KNEFKAAFDI，KFDLKKDLKLDL，RGDSRGDS，RADARADARADARADA，Fmoc-FFVPGVGQGK，VLTKVKTKVPLPTKVEVKVLV，Fmoc-FFRGD，Fmoc-FRGDF，Nap-GFFYGRGD，Nap-GFFYGRGDH，VVAA，VVVAAA，Nap-GFFYG或Fmoc-GFFY中的一种或几种的组合。
2.根据权利要求1所述的一种溶瘤肽-多肽偶联物，其特征在于，溶瘤肽-多肽偶联物选自如下中的一种或几种的组合：C16-VVVAAAEGKCCKKWWKKW-Dip-K，KKFKFEFEFKKWWKKW-Dip-K，AEAEAKAKAEAEAKAKKKWWKKW-Dip-K，AGEDQLKHVFSKKWWKKW-Dip-K，FFFRGDRKKWWKKW-Dip-K，FKFEFKFFKKWWKKW-Dip-K，FEFEFKFKKKWWKKW-Dip-K，FHFDFHFDKKWWKKW-Dip-K，GV2Q2HKDKKWWKKW-Dip-K，GGVVVRGDRKKWWKKW-Dip-K，GSFSIQYTYHVKKWWKKW-Dip-K，IKVAVKKWWKKW-Dip-K，KFKFEFKFEKKWWKKW-Dip-K，IKVKIKVKVPPTKIKVKIKKKWWKKW-Dip-K，KYFILKKWWKKW-Dip-K，K2(QL)6K2KKWWKKW-Dip-K，K2(SL)6K2KKWWKKW-Dip-K，K(SL)6KGPRKLYDYKKWWKKW-Dip-K，VKVKVPPTKVKVKVKVKVKVKKWWKKW-Dip-K，KLDLPVGLIGKLDLKKWWKKW-Dip-K，K2W(QL)6K2KKWWKKW-Dip-K，KNEFKAAFDIKKWWKKW-Dip-K，KFDLKKDLKLDLKKWWKKW-Dip-K，RGDSRGDSKKWWKKW-Dip-K，RADARADARADARADAKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-FFVPGVGQGKKKWWKKW-Dip-K，VLTKVKTKVPLPTKVEVKVLVKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-FFRGDKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-FRGDFKKWWKKW-Dip-K，Nap-GFFYGRGDKKWWKKW-Dip-K，Nap-GFFYGRGDHKKWWKKW-Dip-K，VVAAKKWWKKW-Dip-K，VVVAAAKKWWKKW-Dip-K，Nap-GFFYGKKWWKKW-Dip-K，Fmoc-GFFYKKWWKKW-Dip-K。
3.一种溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液，其特征在于，所述溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液是将权利要求1或2所述溶瘤肽-多肽偶联物溶于溶剂中得到的，溶瘤肽-多肽偶联物在溶剂中自组装形成纳米纤维。
4.根据权利要求3所述的一种溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液，其特征在于，所述溶剂选自水、生理盐水或磷酸盐缓冲液；
所述溶瘤肽-多肽偶联物在溶剂中的浓度为1-100mM。
5.一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂，其特征在于，包括权利要求3或4所述的溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液和所述溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液中添加的免疫治疗剂，其中，所述免疫调节剂负载在自组装形成的纳米纤维上。
6.根据权利要求5所述一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂，其特征在于，所述免疫调节剂选自2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)、c-di-AMP、3',3'-cGAMP、2',3'-cGAMP、CpG ODN、CpG 1018、Poly(I:C)、R837、R848、MF59、AS03、AS01B、MPLA、ADU-S100、MAVU-140、GSK3745417、IMSA-101、MK-1454、E7766、SB11285、BMS-986301、SR-717lithium、MSA-2、c-di-GMP、tautomerism、HG381、明矾、脂多糖、铝盐、GM-CSF、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IFN-β、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11、sotigalimab、cifurtilimab、tecaginlimab、CDX-1140、YH-003、AMG-994、SL-172154、IL-12、IL-21、IL-22、CCL27、CCL28、QS-21。
7.一种如权利要求5-6中任一项所述的基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、合成溶瘤肽-多肽偶联物；
S2、将步骤S1中得到的溶瘤肽-多肽偶联物溶于溶剂中，得到溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液；
S3、将免疫调节剂添加到步骤S2中得到的溶瘤肽-多肽偶联物自组装超分子纳米纤维溶液中孵育，所得含有免疫调节剂的纳米纤维溶液，即为基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂。
8.根据权利要求7所述的一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述孵育温度为4-50℃，所述孵育时间为0-3h。
9.权利要求5-6中任一项所述的基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂在制备杀伤肿瘤细胞并激活机体抗肿瘤免疫的疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自黑色素瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌或睾丸癌中的一种或几种。
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