KR102279913B1 - 이중가교성 화합물을 이용한 동맥류 색전술용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

이중가교성 화합물을 이용한 동맥류 색전술용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 색전술용 충전 물질과 그 용도에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 이온 경화성, 광경화성 또는 이들 모두를 나타내고, 세포 독성이 없으면서도 뛰어난 물성 및 구조적 안정성을 나타내어, 바이오잉크 및 3D 바이오프린팅 시스템에 사용되기에 적합하며, 색전술에서 충전 물질로 사용되기에 적합하다.

Description

이중가교성 화합물을 이용한 동맥류 색전술용 조성물 및 그 제조방법{A composition for endovascular treatment of aneurysms using a double crosslingking compound and preparation method thereof}
본 발명은 이중가교성 화합물을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이중가교성 화합물을 포함하는 색전술용 충전 물질에 관한 것이다.
3D 바이오프린팅은 살아있는 세포를 바이오 잉크와 함께 프린트하여, 인체에 이식 가능한 3차원 인공 구조체를 만드는 기술로써, 상기 바이오프린팅 기술은 원하는 모양 및 구조를 제작할 수 있다는 장점을 통해 이식용 장기 부족 문제에 대한 효과적인 해결책으로 전망되고 있다. 바이오잉크가 실제로 활용되기 위해서 반드시 가져야 하는 특징으로는 구조를 유지하기 위한 충분한 물성을 지녀야 할뿐만 아니라 살아있는 세포가 죽지 않고 지속적으로 기능할 수 있어야 한다.
잉크젯 프린팅 방식은 바이오프린팅의 한 갈래로서 널리 활용되고 있다. Extrusion 혹은 Laser-based 프린팅 방식과 비교할 경우 매우 빠른 출력속도, 높은 해상도 및 낮은 가격 등으로 큰 장점을 지니고 있다. 하지만 사용할 수 있는 물질의 점도 범위가 매우 낮고 좁아 고농도의 세포를 담을 수 없으며 사용할 수 있는 물질이 제한적이라는 단점이 있다. 사용 가능한 물질들이 공통적으로 물성이 매우 약하다는 점 또한 큰 단점으로 지적된다. 게다가 잉크젯 프린팅 방식의 경우 매우 빠른 가교 메커니즘이 필요한데, 이는 고점도의 물질을 사용하는 extrusion 프린팅 방식에서 증착(deposition) 이후에도 높은 점도로 인해 형태가 유지되는 것과는 달리, 잉크젯의 경우 매우 낮은 점도를 사용하기 때문에 가교 결합이 빠르지 않으면 표면 장력에 의해 수 분 내에 그 형태가 변할 수 있기 때문이다.
친수성 고분자의 경우 칼슘 이온을 이용하여 낮은 농도에서도 경화가 가능하기 때문에 잉크젯 바이오프린팅에서 가장 널리 활용된다다. 그 중에서도 알긴산을 이용하여 만들어진 구조체의 경우 생리적(physiological), 수중(aqueous) 환경에서 칼슘 이온의 빠른 소실로 인하여 빠르게 약화되는 단점이 있다. 안정성 문제를 해결하기 위해 바륨 또는 구리 이온을 활용하기도 하나, 이 경우 동시에 세포 독성도 증가한다고 알려져 있다.
뿐만 아니라, 뇌동맥류 치료 방법 중 하나인 색전술에서 기존의 백금 코일을 대체할 물질로 친수성 고분자가 대두되고 있다. 그 중에서도 알긴산은 높은 생체적합성을 지니고, 유기 용매에 녹지 않아도 되며, 점도가 낮고 접착성이 없어 카테터를 통해 쉽게 이동할 수 있다. 또한 경화속도가 매우 빠르며, 포유류에는 분해 효소가 없어 장기간동안 단분자로 분해되는 일 없이 유지될 수 있다. 경화 방식 또한 매우 빠르기 때문에 수술 시간 또한 짧다.
하지만 동물 실험 결과 물성이 충분치 않아 지속적인 혈압을 버티지 못하고 깨지는 경우가 있었으며, 알긴산이 분해되지 않더라도 이온 가교가 풀릴 수 있어 안정성이 떨어지는 문제가 있었다.
이 연구에서는 청색광을 통한 광경화 방식을 추가적으로 활용하여 기계적 물성 및 구조 안정성이 개선된 바이오 잉크 조성물을 개발하였다. 상기 조성물은 세포 독성을 보이지 않아 뛰어난 바이오 잉크로 자리매김할 수 있을 것이다.
Sakai et al., 2008, Journal of Biomedical Materials Research Part A
기존의 잉크젯 프린팅 방식을 이용한 바이오프린팅의 경우, 사용할 수 있는 물질의 점도가 낮아 고농도의 세포를 담을 수 없으며, 물성 또한 매우 약하다는 문제점이 있었다. 또한 종래의 알긴산을 이용한 일반적인 바이오잉크의 경우 그 생리적, 수중 환경에서 칼슘 이온의 빠른 소실로 인해 그 구조체가 빠르게 약화되는 문제점이 있었으며, 칼슘 이온 대신 바륨 또는 구리 이온을 이용한 경우에는 세포 독성이 증가한다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명의 목적은 종래 바이오잉크가 갖는 상기 문제점을 해결한 신규한 바이오잉크 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관 질환을 치료하기 위한 색전술에서 사용될 수 있는 색전술용 충전 물질을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 발명자는 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 하기 단계를 포함하는, 바이오 잉크 조성물의 제조 방법을 제공한다:
a) 친수성 고분자 및 이중 가교성 화합물을 반응시켜 이중 가교 하이드로겔 화합물 용액을 생성시키는 단계;
b) 용액을 완충액으로 투석시키는 단계; 및
c) b) 단계의 결과물을 건조시키는 단계.
또한, 본 발명에서는 상기 방법으로 제조된 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 바이오 잉크 조성물을 (a) 이온경화, (b) 광경화 또는 이들 모두를 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관을 제조하는 방법으로서,
상기 (a) 이온경화는 조성물에 2가 양이온을 혼합하여 이온 경화시키는 단계로서 2가 양이온은 Ca2+, Sr2+, Ba2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Pb2+, Co2+, Ni2+ 또는 이들의 조합인 것이며,
상기 (b) 광경화는 조성물에 [Ru(bpy)3]2+ 및 과황산나트륨을 혼합한 후 청색광을 조사하는 것인 방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물을 포함하는 색전술용 충전 물질을 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 색전술용 충전 물질을 포함하는 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 추가적인 가교 기작을 가지며, 이온경화성 뿐만 아니라 광경화성을 나타내고, 세포 독성이 없으면서도 뛰어난 물성 및 구조적 안정성을 나타낸다. 그러므로 본 발명의 조성물은 신체 결손 부위를 재생시키기 위하여 원하는 세포를 함유하는 조직 유사기관의 제작에 사용되기에 적합하며, 실제 재생 촉진 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 뿐만 아니라, 동일한 화합물을 포함하는 색전술용 충전 물질은 혈관 질환의 치료를 위한 색전술에서 직접 주사되고 경화되어 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 친수성 고분자-이중가교성 화합물의 대표적인 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 농도에 따른 알긴산과 티라민의 결합 확인을 나타낸 것이다. 3300 cm-1 부근의 넓은 밴드 및 1250 cm-1 부근의 새롭게 생성된 피크들은 각각 알긴산에는 존재하지 않는 페놀 및 카르복실산 피크를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 알긴산-티라민과 알긴산의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 도 3에서 ppm 7 부근의 피크를 확대한 것이다.
도 5는 도 4의 피크를 본 발명의 알긴산-티라민에 대응시켜 표시한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 광경화를 위한 [Ru(bpy)3]2+/SPS 다양한 배합 후 1초간의 빛 노출에 의한 경화 능력을 가시화한 것이다.
도 7은 [Ru(bpy)3]2+/SPS 의 다양한 농도 배합 후 30초간의 빛 노출 이후 그 모듈러스를 측정한 것이다. 1.0 mM [Ru(bpy)3]2+, 10 mM SPS 의 농도 이상에서는 포화에 의해 모듈러스가 증가하지 않는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 광경화성 알긴산과 일반 알긴산의 구조적 안정성을 측정하기 위해 PBS 상에서의 분해 정도를 측정한 것으로, 알긴산 하이드로겔 및 알긴산-티라민 하이드로겔의 생리학적 환경에서의 분해 여부를 확인한 결과이다.
도 9는 경화가 가해지지 않은 알긴산 용액의 점도를 측정한 것이다. 그 값이 10 cP 이하로 측정되었으며, 잉크젯 프린팅 방식에 적합함을 확인할 수 있다.
도 10은 잉크젯 프린팅을 위한 형태 디자인(위)과 실제 출력 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 11은 HS68 Cell 및 NIH3T3 Cell-Laden 바이오잉크의 세포 독성 테스트 결과이다.
도 12는 5% 알긴산 하이드로겔 및 알긴산-티라민 하이드로겔의 경화 방법에 따른 저장 모듈러스를 나타낸 것이다.
도 13의 (a)는 광경화한 알긴산-티라민 하이드로겔의 시간에 따른 중량 변화를 표로 나타낸 것이며, (b)는 광경화한 알긴산-티라민 하이드로겔의 시간에 따른 초기 중량 대비 동결 건조 중량비의 변화를 표로 나타낸 것이다.
도 14는 알긴산-티라민 하이드로겔을 주사전자현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 15는 CaCl2 농도에 따른 구조체의 Live/Dead 분석을 진행한 결과이다.
도 16은 CaCl2 농도에 따른 구조체의 Live/Dead 분석을 DAPI/F-Act 염색을 통해 진행한 결과이다.
본 발명은 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물을 포함하는 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.
상기 친수성 고분자는 알긴산, 키토산, 히알루론산, 젤라틴, 셀룰로오스, 펙틴 및 아가로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 친수성 고분자는 알긴산일 수 있다. 상기 알긴산은 알긴산 나트륨이 사용될 수 있으며, 알긴산 칼륨, 폴리에틸렌글리콜알긴산, 알긴산 암모니아 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물의 대표적인 화학적 구조는 도 1과 같다.
일 구체예에서, 상기 친수성 고분자가 알긴산일 때, 본 발명에 따른 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물의 결합구조는 하기 화학식 1로 표시되는 구조일 수 있다 :
[화학식 1]
Figure 112019053036887-pat00001
상기 화학식 1에서 n은 472 내지 967 일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 dityrosine bond를 통하여 이합체로 결합될 수 있으며, 이 경우 구체적인 화학구조를 도 1에 나타내었다.
상기 이중가교성 화합물은 친수성 고분자에 광가교성 성질을 부여하고, 광경화 및 이온경화가 동시에 일어날 수 있도록 하는 역할을 수행한다.
상기 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물은 공유결합으로 결합된 것으로서, 바람직하게는 아미드 결합이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 물성을 확보하기 위해 적절한 공유결합이 활용될 수 있다. 다만, 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물은 공유결합으로 결합되어야 알긴산이 이중가교 성질을 나타내어 안정적인 물성을 확보할 수 있다.
상기 친수성 고분자는 102000 내지 209000 분자량을 가지는 것이 바람직하다. 따라서, 일 실시예에서, 상기 친수성 고분자의 분자량은 2 kDa 내지 1 MDa인 것이 사용된다.
본 발명에서 상기 친수성 고분자가 알긴산인 경우, 베타-D-만뉴로닉산(β-D-mannuronic acid) 및 알파-L-굴루로닉산(α-L-guluronic acid)이 중합된 것으로 이루어져 있으며, 베타-D-만뉴로닉산 대 알파-L-굴루로닉산의 몰 비는 요구되는 하이드로겔의 물성에 따라 원하는 임의의 중량비를 적절하게 사용할 수 있다. 바람직하게는 0.7:0.3 내지 0.15:0.85의 중량비를 가지며, 보다 바람직하게는 0.35:0.65의 중량비를 갖는다. 상기 알긴산의 분자량 및 베타-D-만뉴로닉산 대 알파-L-굴루로닉산의 비는 젤의 형성 및 물성에 영향을 미친다.
본 발명의 이중 가교성 화합물은 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린 및 하이드록시에틸아닐린으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 가교제가 광반응을 통해 광가교할 수 있도록 타이로신 잔기를 제공할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 본 발명에 따른 이중 가교성 화합물은 티라민이다.
본 발명에 있어서, 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물은 1 : 0.5 내지 1 : 10, 바람직하게 1 : 1 내지 1 : 6의 몰비로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물이 하이드로겔로 제작될 경우, 추가적인 가교 기작을 통해 기계적 물성 및 장기적 구조 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 이온경화와 광경화의 이중 가교 반응이 동시에 수 초 내에 일어날 수 있다. 그러므로 기존의 친수성 고분자 기반 3D 프린팅보다 더 높은 활용성을 확보할 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 자외선 사용 없이 추가적 가교 기작을 이용하여 가교가 가능하다. 그러므로 기존의 자외선을 통한 광가교시 발생하는 세포독성 문제를 해결할 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크조성물은 포함되는 친수성 고분자의 분자량을 조절하여 물성을 조절할 수 있다. 상기 물성 조절을 통해 목적하는 장기나 세포에 따라 적합한 환경을 조성할 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 바이오 잉크 조성물의 제조 방법을 제공한다:
a) 친수성 고분자 및 이중 가교성 화합물을 반응시켜 이중 가교 하이드로겔 화합물 용액을 생성시키는 단계;
b) 용액을 완충액으로 투석시키는 단계; 및
c) b) 단계의 결과물을 건조시키는 단계.
본 발명에서, 바이오 잉크 조성물의 제조 방법은 a) 친수성 고분자 및 이중 가교성 화합물을 반응시켜 이중 가교 하이드로겔 화합물 용액을 생성시키는 단계를 포함한다.
친수성 고분자가 포함된 용액에 활성제, 예컨대 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)-N-hydroxysuccinimide(NHS) 또는 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide(DCC)를 처리하고, 이중 가교성 화합물을 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서 반응은 pH 5 내지 7에서 수행되는 것이 바람직하며, 20 내지 40 ℃의 온도에서 수행할 수 있다.
사용되는 친수성 고분자의 농도는 기재된 농도에 한정되지 않으며, 바람직하게는 0.5 %, 0.75 %, 1 %, 1.25 %, 1.5 %, 2 %, 2.5 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % 혹은 그 이상의 농도가 제한없이 사용될 수 있다.
상기 용매는 물, 식염수, 당 용액, 세포 배양 용액, 약물/단백질/핵산/조영제가 포함된 용액, 세포 현탁액, 혈청 또는 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 용액에 사용된 용매는 물, 식염수, 당 용액, 세포 배양 용액, 약물/단백질/핵산/조영제가 포함된 용액, 세포 현탁액, 혹은 혈청이나 혈액을 포함할 수 있다.
상기 용액에 사용된 용매의 양에 대한 친수성 고분자-염 및 가교제의 농도는 겔화 시간, 다공성, 안정성 및 생분해성, 겔 강도 및 탄성에 영향을 미친다. 일반적으로, 친수성 고분자의 농도가 높을수록 강도 및 탄성이 증가하며 생분해에 필요한 시간이 길어진다.
본 발명에서, 바이오 잉크 조성물의 제조 방법은 b) 용액을 완충액으로 투석시키는 단계를 포함한다. 상기 완충액은 일반적으로 사용되는 인산완충식염수(Phosphate buffer saline, PBS)가 사용될 수 있으나, 투석에 필요한 임의의 적절한 완충액이 사용될 수 있다.
본 발명에서, 바이오 잉크 조성물의 제조 방법은 c) b) 단계의 결과물을 건조시키는 단계를 포함한다. 건조는 공지의 건조 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 회전 건조법, 밴드 건조법 또는 선반 건조법과 같은 열풍 건조, 진공 동결 건조, 진공 건조 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 바이오 잉크 조성물의 제조 방법은 d) c)단계의 결과물을 용매에 용해하여 바이오 잉크 액상 조성물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 용매는 물, 식염수, 당 용액, 세포 배양 용액, 약물/단백질/핵산/조영제가 포함된 용액, 세포 현탁액, 혈청 또는 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 바이오 잉크 용액 조성물은 3D 프린트 등에서 잉크 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 제조방법으로 제조된 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 바이오 잉크 조성물을 (a) 이온경화, (b) 광경화 또는 이들 모두를 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관을 제조하는 방법으로서,
상기 (a) 이온경화는 조성물에 Ca2+, Sr2+, Ba2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Pb2+, Co2+, Ni2+ 또는 이들의 조합으로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 2가 양이온을 혼합하여 이온 경화시키는 단계를 포함하며,
상기 (b) 광경화는 조성물에 [Ru(bpy)3]2+ 및 과황산나트륨을 혼합한 후 청색광을 조사하는 것인, 방법을 제공한다.
상기 바이오 잉크 조성물을 (a) 이온경화, (b) 광경화 또는 이들 모두를 시키는 단계에서 바이오 잉크 조성물과 약물, 단백질, 방사성 물질 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 함께 경화시킬 수 있다. 상기 약물, 방사성 물질, 세포의 경우 경화 이전 단계에서 바이오 잉크 조성물과 혼합하고 함께 경화시켜 최종 결화된 젤 내부에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 상기 단백질의 경우 일반적으로 바이오 잉크 조성물과 혼합하고 함께 경화시켜 최종 결화된 젤 내부에 존재하도록 하는 것이 바람직하나, 크기가 짧은 기능성 펩타이드, 예를 들어 RDG 펩타이드의 경우 바이오 잉크 조성물과 화학적으로 결합시키는 것이 바람직하다.
상기 약물은 택솔, 시스플라틴, 히알루론산, 키토산, 헤파린 또는 콘드로틴 설페이트일 수 있다.
상기 단백질은 RDG 펩타이드 (Arg-Asp-Gly), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질 전환 성장인자 (TGF) 또는 골 형성 단백질 (BMP)일 수 있다.
상기 방사성 물질은 예를 들어 131I 방사성 잔기, 방사성 비투광성 물질, 즉 Ta, Gd, Dy 또는 이들의 산화물, 수용체 결합 리간드 또는 기타 검출 가능한 표지일 수 있다.
상기 살아있는 세포는 MC3T3, NIH3T3, HS68 세포, 재조합 세포, 비-재조합 세포, 간세포, 신경세포, 신장 피질 세포 또는 혈관 내피세포 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 경화는 바이오잉크 조성물을 2가 양이온 물질과 함께 혼합하여 경화시키는 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물은 추가의 구성 성분으로 2가 양이온을 가지는 화합물을 더 포함할 수 있다. 이러한 화합물의 바람직한 예시로는 CaCl2, SrCl2, BaCl2, ZnSO4, FeSO4, MnSO4, CuCl2, PbCO3, CoCl2 또는 NiCO3다.
상기 2가 양이온은 바람직하게, Ca2+일 수 있으나, 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
상기 (a) 이온경화 및 (b) 광경화는 순서에 상관없이 수행하여도 무방하며, 어느 한 단계만을 수행하여도 무방하다. 예를 들어, 일 실시예에서 광경화를 먼저 수행한 후, 칼슘 2가 양이온을 포함하는 용액에 하이드로겔을 침지하고 혼합하여 이온경화를 수행하여 이중 경화를 수행할 수 있다.
상기 광경화를 위한 청색광은 파장 400 nm 내지 500 nm의 광으로, 약 30초 내지 0.5 시간 조사하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 3D 프린팅에 사용될 수 있다.
상기 3D 프린팅은 잉크젯 프린팅을 비롯하여, 통상의 3D 프린팅을 모두 포함한다.
본 발명의 바이오잉크는 세포를 함유하여 조직 유사기관 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물을 포함하는 색전술용 충전 물질을 제공한다.
상기 색전술은 혈관 질환의 예방 또는 치료를 위해 의도적으로 혈관을 차단하여 종양으로 통하는 혈류를 의도적으로 막거나, 파열 위험이 있는 혈관을 막는 것을 목적으로 하는 시술을 의미한다.
상기 색전술은 바람직하게는 코일 색전술이다.
상기 색전술용 충전 물질은 색전술 도중에 투여되어 파열 위험이 있는 혈관을 충전하여 혈류를 변경시킬 수 있는 물질을 의미힌다. 기존 색전술의 경우 불완전한 폐색으로 인하여 시술 후 재발 가능성이 20% 이상으로 매우 높다는 단점을 가지고 있다. 상기 색전술용 충전 물질은 종래 기술과는 달리 파열 위험이 있는 혈관을 완전하게 막아 재발 가능성을 현저하게 감소시킬 수 있다는 점에서 종래 기술과 구별되는 기술적 특징이 존재한다.
상기 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물은 아미드 결합으로 결합된 것일 수 있다.
상기 친수성 고분자, 이중 가교성 화합물 및 이들의 몰비는 앞서 정의한 것과 동일하게 정의된다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 색전술용 충전 물질의 제조 방법을 제공한다:
a) 친수성 고분자 및 이중 가교성 화합물을 반응시켜 이중 가교 하이드로겔 화합물 용액을 생성시키는 단계;
b) 용액을 완충액으로 투석시키는 단계; 및
c) b) 단계의 결과물을 건조시키는 단계.
상기 각 제조단계에 대한 구체적인 정의는 앞서 정의한 것과 동일하게 정의된다. 본 발명에서, 상기 색전술용 충전 물질의 제조 방법은 d) c)단계의 결과물을 용매에 용해하여 색전술용 충전용 액상 조성물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 용매는 물, 식염수, 당 용액, 세포 배양 용액, 약물/단백질/핵산/조영제가 포함된 용액, 세포 현탁액, 혈청 또는 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 색전술용 충전 물질을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 색전술용 충전 물질을 포함하는 혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 (a) 이온경화, (b) 광경화 또는 이들 모두로 경화될 수 있다. 상기 (a) 이온경화는 조성물에 2가 양이온을 혼합하여 이온 경화시키는 것으로, 2가 양이온은 Ca2+, Sr2+, Ba2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Pb2+, Co2+, Ni2+ 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 이러한 경화는 색전술용 충전 물질을 환부에 2가 양이온 물질과 함께 투여하여 경화시키는 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 색전술용 충전 물질을 포함하는 혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 추가의 구성 성분으로 2가 양이온을 가지는 화합물을 더 포함할 수 있다. 이러한 화합물의 바람직한 예시로는 CaCl2, SrCl2, BaCl2, ZnSO4, FeSO4, MnSO4, CuCl2, PbCO3, CoCl2 또는 NiCO3다.
또한, 상기 (b) 광경화는 조성물에 [Ru(bpy)3]2+ 및 과황산나트륨을 혼합한 후 청색광을 조사하는 것일 수 있다. 색전술용 충전 물질를 환부에 [Ru(bpy)3]2+ 및 과황산나트륨을 함께 투여한 후, 청색광 등을 조사함으로써 경화 작용을 통해, 질환의 치료제로 이용할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 색전술용 충전 물질을 포함하는 혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 추가의 구성 성분으로 [Ru(bpy)3]2+ 및 과황산나트륨을 더 포함할 수 있다. 위와 같은 색전술용 충전 물질과 상기 언급된 경화에 이용되는 물질은 각각 별도로 패키징되어 키트로 제공될 수 있다.
상기 혈관 질환은 바람직하게는 뇌동맥류의 색전 또는 간동맥류의 색전일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 색전술이 필요한 임의의 혈관 질환에 사용될 수 있다.
상기 혈관 질환 외에도 색전술을 이용하여 치료할 수 있는 임의의 질환, 예를 들어 간암환자에 대한 색전술에도 본 발명의 조성물이 사용될 수 있다.
상기 친수성 고분자는 높은 생체적합성을 지니고, 유기 용매에 녹지 않아도 되며, 점도가 낮고 접착성이 없어 카테터를 통해 쉽게 이동할 수 있다. 또한 경화속도가 매우 빠르며, 포유류에는 분해 효소가 없어 장기간동안 단분자로 분해되는 일 없이 유지될 수 있다. 경화 방식 또한 매우 빠르기 때문에 색전술에 요구되는 시간이 적다는 장점이 존재한다.
본 발명에 있어서, 용어 “예방”은 상기 조성물의 투여에 의해 혈관 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 “치료”는 색전술에 있어 상기 조성물을 투여하여 혈관 질환을 낫게 하는 행위를 모두 의미하는 것으로, 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 치료, 경감, 완화, 요법(remedy), 또는 향상하기 위한 목적과 함께 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인을 갖는 피험자(인간 또는 동물)에게 상기 조성물의 적용 또는 투여로 정의된다.
상기 색전술용 충전 물질을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 현탁액, 에멀젼, 용액 또는 하이드로겔 등의 형태로 제공될 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 비경구 투여 방식으로 환부에 직접 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
종래의 친수성 고분자의 경우 이온으로 경화되기 위해서는 고농도의 칼슘 이온 농도를 유지해 주어야만 한다. 하지만 이러한 높은 농도 조건은 고삼투압 환경을 만들게 되고, 주변 세포가 정상적으로 생존하지 못하게 만든다. 이와는 달리, 본 발명의 약학적 조성물은 이중 가교성 화합물과 친수성 고분자를 공유 결합으로 결합시켜 칼슘 이온이 빠져나감에 따라 겔화되는 현상을 방지할 수 있으며, 충전 물질의 물성이 뛰어나다는 점에 있어 기술적 특징이 존재한다.
상기 (b) 광경화에 있어서, 청색광을 조사하는 것은 앞서 정의한 것과 동일하게 정의된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예. 티라민을 포함하는 이중 가교성 알긴산-티라민(Alginate-Tyramine)의 제조
다음 과정을 통하여 티라민을 포함하는 이중 가교성 알긴산을 제조하였으며, 이를 알긴산-티라민으로 명명하였다.
1. 1 g (4.63 mmol) 의 알긴산 나트륨을 100 ml 탈이온수에 용해시켰다.
2. EDC, NHS, 티라민을 1X 농도를 기준으로 0.88g, 0.80g, 0.63g 준비하였다. 목적으로 하는 치환 정도에 따라 이 세 물질의 농도를 2, 3, 6배까지 높여 사용하며 이 때의 농도를 각각 2X, 3X, 6X 라고 지칭하였다.
3. 1 에서 만들어진 알긴산 나트륨 용액에 EDC와 NHS를 우선적으로 넣어 주고, RT에서 15분간 교반하여 활성화시켰다.
4. 이후 티라민 분말을 넣어준 뒤 HCl를 사용하여 pH를 5~7 사이로 적정하였다.
5. 반응이 진행되도록 상온에서 24시간동안 교반하였다.
6. 3.5 kDa MWCO 투석백(dialysis bag)에 용액을 전부 넣었다.
7. 0.1M NaH2PO4(pH 7) 완충액에서 투석을 진행하였다. 4℃에서 교반과 함께 진행하며, 4 시간 간격으로 위 완충액 상에서 5회 투석한 후 염 제거를 위해 DW에서 4 시간 동안 1회 투석하였다.
8. 동결건조 과정을 통해 알긴산-티라민 분말을 수득하였다.
상기 알긴산-티라민이 제조되는 반응식은 하기와 같다.
[반응식]
Figure 112019053036887-pat00002
실험예 1. 제조된 알긴산-티라민의 IR 측정
제조된 알긴산-티라민에 대하여 IR을 측정하였으며, 그 결과를 도 2로 나타내었다. 도 2는 다양한 농도에 따른 알긴산과 티라민의 결합 확인을 나타낸 것이다. 3300 cm-1부근의 넓은 밴드 및 1250 cm-1 부근의 새롭게 생성된 피크들은 각각 기존 알긴산에는 존재하지 않는 페놀 및 카르복실산 피크를 나타낸다.
실험예 2. 제조된 알긴산-티라민의 1 H NMR 스펙트럼 측정
500MHz 핵자기 공명 분광분석기를 이용하여 알지네이트와 제조된 알긴산-티라민의 1H NMR 스펙트럼을 측정하였으며, 이를 도 3으로 나타내었다. 도 3 중 알긴산-티라민의 ppm 7 부근의 피크를 확대하여 도 4로 나타내었으며, 알긴산-티라민의 구조 중 도 4의 A 및 B에 해당하는 부분을 표시하여 도 5로 나타내었다. 이로부터 제조된 알긴산-티라민이 도 5의 화학 구조를 갖는다는 점을 명확하게 확인하였다.
실험예 3. 제조된 알긴산-티라민의 광경화 능력 확인
본 발명의 알긴산-티라민의 광경화를 위한 [Ru(bpy)3]2+/SPS와 다양한 배합 후 1초간 빛에 노출 시켜 광경화 능력을 가시화하여 확인하였으며, 이를 도 6으로 나타내었다.
실험예 4. 제조된 알긴산-티라민의 광경화 이후 모듈러스 측정
본 발명의 알긴산-티라민과 [Ru(bpy)3]2+/SPS을 다양한 농도로 배합한 후 30초간의 빛에 노출시켜 광경화하였다. 그 후 모듈러스를 측정하였으며, 이를 도 7로 나타내었다. 1.0 mM [Ru(bpy)3]2+, 10 mM SPS의 농도 이상에서는 포화에 의해 모듈러스가 증가하지 않는 것을 확인하였다.
실험예 5. 광경화성 알긴산과 일반 알긴산의 구조적 안정성 비교
PBS(phosphate-buffered saline) 상에서의 분해 정도를 측정하여 본 발명의 알긴산-티라민과 일반 알긴산의 구조적 안정성을 비교하였으며, 이를 도 8로 나타내었다. 1.0% 알긴산, 알긴산-티라민 용액에 [Ru(bpy)3]2+ 0.5 mM, 과황산나트륨 2.5 mM, 100 mM CaCl2에 청색광을 조사하여 충분히 경화시켜 주었다. 경화가 완전히 진행된 이후 하이드로겔의 초기 무게를 측정한 뒤 DPBS(Dulbeco phophate buffered saline) 용액에 넣어주었다. 이후 하이드로겔의 분해 양상을 하이드로겔의 질량 측정을 통해 확인하여 도 8에 나타내었다.
일반적인 알긴산 하이드로겔의 경우에는 칼슘이 없는 조건이 되면서 급격하게 형태가 와해되어 구조를 잃어버리는 반면, 알긴산-티라민 하이드로겔의 경우에는 10일이 지나도 겔을 충분히 잘 유지하는 것을 확인하였다.
실험예 6. 제조된 알긴산-티라민의 점도 측정
본 발명의 알긴산-티라민 경화되기 전 용액의 점도를 측정하였으며, 이를 도 9로 나타내었다. 그 값이 10 cP 이하로 측정되었으며, 잉크젯 프린팅 방식에 적합함을 확인하였다.
실험예 7. 제조된 알긴산-티라민을 이용한 잉크젯 프린팅
제조된 알긴산-티라민을 실제로 잉크젯 프린터에 사용하여 프린팅을 수행하였다. 그 결과를 도 10으로 나타내었으며, 도 10의 위는 잉크젯 프린팅을 위한 형태 디자인이고 도 10의 아래는 실제 출력 결과를 나타낸 것이다. 형태 디자인대로 프린팅이 잘 이루어졌음을 확인하였다.
실험예 8. 제조된 알긴산-티라민의 세포 독성 확인
제조된 알긴산-티라민으로 HS68 Cell 및 NIH3T3-Laden 바이오잉크의 세포 독성 테스트를 수행하였으며, 그 결과를 도 11로 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 알긴산-티라민은 세포 독성이 적어 바이오잉크로 사용되기에 적합하다는 점을 확인하였다.
실험예 9. 알긴산 하이드로겔 및 알긴산-티라민 하이드로겔의 경화 방법에 따른 저장 모듈러스 측정
5% 알긴산, 알긴산-티라민 용액을 준비하였다. 이후, 광경화를 위해 용액에 [Ru(bpy)3]2+ 0.5 mM, 과황산나트륨(Sodium persulfate, SPS) 2.5 mM을 추가로 넣고 청색광으로 충분히 경화시켜 주었다. 이온 경화를 위해 100 mM CaCl2 를 첨가해 주었다. 이후 하이드로겔의 유동학을 DHR-1 Rheometer를 이용해 측정하였다.
도 12는 경화 방식에 따른 저장 모듈러스 차이를 분석한 것이다. 이중 경화된 알긴산-티라민(녹색)의 경우 단일 방식으로 경화된 알긴산 또는 알긴산-티라민에 비해 모듈러스가 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 10. 알긴산 하이드로겔 및 알긴산-티라민 하이드로겔의 경화 방법에 따른 저장 모듈러스 측정
5% 알긴산-티라민 용액에 광경화만을 위한 [Ru(bpy)3]2+ 0.5 mM, SPS 2.5 mM 을 추가로 넣고 청색광으로 충분히 경화시켜 혈액 내에서의 구조체 형태 유지 능력을 확인하였다. 이 때, 칼슘 이온이 포함되는 경우 항응고제(CPDA) 효과가 없어지고 혈액 응고가 일어나기 때문에, 이온 경화는 진행하지 않았다.
이후 시간 경과에 따른 하이드로겔의 질량, 동결 건조 하이드로겔의 질량 및 형태를 확인하여 도 13에 나타내었다.
그 결과, 3주 가량이 지나더라도 원기둥 형태를 유지하는 것을 확인할 수 있으며(우측 하단), 분해되는 일 없이 잘 유지되는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과로 인해, 혈관 내에서도 안정적으로 그 구조를 유지할 수 있을 것으로 기대되었다. 또한 하이드로겔 내부로 혈액 성분들이 잘 스며들어와 색이 붉게 변하면서 습윤 질량/ 건조 질량 모두 증가하는 모습을 확인할 수 있었다.
실험예 11. 상이한 2가 양이온 농도에 따른 바이오잉크 구조체 유지 및 세포 생존 효과 확인
일반적인 알긴산 바이오잉크를 만들기 위한 CaCl2 농도(100 mM) 보다 더 낮은 농도에서의 구조체 유지 및 세포 생존 효과를 알아보기 위해 Live/Dead 분석을 진행하였다. 각 세포 배지에 2% 알긴산-티라민, 세포(1M cells per ml), 0.5 mM [Ru(bpy)3]2+, 2.5 mM 과황산나트륨을 섞어주었다. 이렇게 만들어진 바이오잉크를 24-웰 플레이트에 각 웰당 300 ul씩 넣어주었다. 이후 452 nm 청색광으로 광경화를 발생시키면서 CaCl2가 첨가된 배지에서 하이드로겔을 배양하였다. 48 시간 간격으로 media를 교체하였다. 총 14일간의 배양 이후 Live/Dead 분석을 진행하였다.
상기 Live/Dead 분석은 하기의 단계를 거쳐 수행하였다:
1. 14일간 배양한 하이드로겔을 DPBS 1ml로 세척하였다.
2. DPBS 10ml; EtHD1 20 ul: Calcein-AM 5 ul의 비율로 혼합한 용액에서 하이드로겔을 교반하고 15분간 방치한 후 광학 현미경을 통해 이를 관찰하여 도 15에 나타내었다.
그 결과 칼슘을 포함하지 않은 구조체의 경우, 구조체가 유지되지 못하고 와해되는 현상을 보여주었으나, 그 이외의 경우, 칼슘의 농도가 낮아지더라도 충분히 안정적으로 구조를 유지할 수 있음을 확인하였다.
실험예 12. DAPI/F-Act 염색을 통한 상이한 2가 양이온 농도에 따른 구조체 유지 및 세포 생존 효과 확인
실험예 11에서 수행한 Live Dead 분석을 수행하기 전에 DAPI/F-Act 염색을 수행하고 그 결과를 도 16에 나타내었다.
DAPI/F-Act 염색은 하기 단계를 거쳐 수행하였다:
1. PBS로 세척하여 하이드로겔에 부착되지 않은 세포를 제거하였다.
2. 혈청-유리(serum-free) 배지 500ul를 넣고 24시간 동안 배양하였다.
3. 하기 단계를 거쳐 Fluorescein isothiocyanate(FITC)-결합 phalloidin으로 액틴 필라멘트를 표지하고, 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)으로 핵을 염색하였다:
1) DPBS 500ul으로 세척하였다.
2) 4 % (v/v) 포름 알데히드 500ul, 30 분간 교반하여 고정시켰다.
3) PBS 500ul로 5분간 세척하였다.
4) 0.5 % 트리톤 X-100/PBS 100ul으로 교반하여 30분간 침투시켰다.
5) 0.02 % 트윈20/PBS 500ul으로 세척하였다.
6) 0.02 % 트윈20 & 1% BSA / PBS 500ul으로 30분간 차단시켰다.
7) 1차 항체 1ul + 3 % BSA / PBS 30ul으로 37 ℃에서 45분간 교반하여 1차 항체로 처리하였다.
8) 0.02 % 트윈20/PBS 500ul으로 세척하였다.
9) PBS 500ul으로 세척하였다.
10) DAPI 용액 500ul으로 10 분간 어두운 곳에서 염색한 후 PBS로 2번 세척하였다.
11) 30분간 건조하였다.
이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (26)

  1. 삭제
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  3. 삭제
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  5. 삭제
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  7. 삭제
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  10. 삭제
  11. a) 친수성 고분자 및 이중 가교성 화합물을 반응시켜 이중 가교 하이드로겔 화합물 용액을 생성시키는 단계;
    b) 용액을 완충액으로 투석시키는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계의 결과물을 건조시켜 바이오 잉크 조성물을 제조하는 단계;
    d) 상기 c) 단계의 바이오 잉크 조성물을 이온경화 및 광경화를 모두 시키는 단계;를 포함하는 조직 유사기관을 제조하는 방법으로서,
    상기 친수성 고분자는 알긴산, 키토산, 히알루론산, 젤라틴, 셀룰로오스, 펙틴 및 아가로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 이중가교성 화합물은 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린 및 하이드록시에틸아닐린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    친수성 고분자 및 이중가교성 화합물의 몰 비는 1:0.5 내지 1:10이 되도록 사용되는 것이며,
    상기 이온경화는 바이오 잉크 조성물에 2가 양이온을 혼합하여 이온 경화시키는 단계로서 2가 양이온은 Ca2+, Sr2+, Ba2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Pb2+, Co2+, Ni2+ 또는 이들의 조합인 것이며,
    상기 광경화는 조성물에 [Ru(bpy)3]2+ 및 과황산나트륨을 혼합한 후 청색광을 조사하는 것인, 조직 유사기관을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 청색광은 400 nm 내지 500 nm 의 파장을 갖는 것인 조직 유사기관을 제조하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 청색광은 30초 내지 0.5시간 조사되는 것인 조직 유사기관을 제조하는 방법.
  14. 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물을 포함하는 색전술용 충전 물질로서,
    상기 친수성 고분자는 알긴산, 키토산, 히알루론산, 젤라틴, 셀룰로오스, 펙틴 및 아가로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 이중가교성 화합물은 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린 및 하이드록시에틸아닐린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    친수성 고분자 및 이중가교성 화합물의 몰 비는 1:0.5 내지 1:10이 되도록 포함되는 것인 색전술용 충전 물질.
  15. 제14항에 있어서, 친수성 고분자 및 이중가교성 화합물은 아미드 결합으로 결합된 것인 색전술용 충전 물질.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. a) 친수성 고분자 및 이중 가교성 화합물을 반응시켜 이중 가교 하이드로겔 화합물 용액을 생성시키는 단계;
    b) 용액을 완충액으로 투석시키는 단계; 및
    c) b) 단계의 결과물을 건조시키는 단계;를 포함하고,
    상기 친수성 고분자는 알긴산, 키토산, 히알루론산, 젤라틴, 셀룰로오스, 펙틴 및 아가로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 이중가교성 화합물은 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린 및 하이드록시에틸아닐린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    친수성 고분자 및 이중가교성 화합물의 몰 비는 1:0.5 내지 1:10이 되도록 사용되는 것인 색전술용 충전 물질의 제조 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제19항의 방법으로 제조된 색전술용 충전 물질.
  24. 제14항, 제15항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 색전술용 충전 물질을 포함하는 색전술이 필요한 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    친수성 고분자는 알긴산이고, 이중가교성 화합물은 티라민이며,
    상기 조성물은 이온경화 및 광경화를 모두 시키는 단계로 경화되며,
    상기 이온경화는 조성물에 2가 양이온을 혼합하여 이온 경화시키는 단계로서 2가 양이온은 Ca2+, Sr2+, Ba2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Pb2+, Co2+, Ni2+ 또는 이들의 조합이고,
    상기 광경화는 조성물에 [Ru(bpy)3]2+ 및 과황산나트륨을 혼합한 후 청색광을 조사하는 것인 색전술이 필요한 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 청색광은 400 nm 내지 500 nm 의 파장을 갖는 것인 색전술이 필요한 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 청색광은 30초 내지 0.5시간 조사되는 것인 색전술이 필요한 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020190060682A 2018-05-23 2019-05-23 이중가교성 화합물을 이용한 동맥류 색전술용 조성물 및 그 제조방법 KR102279913B1 (ko)

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