CN107384987A - 利用Glycosylasparaginase酶释放及纯化制备还原性N‑糖链的方法 - Google Patents

利用Glycosylasparaginase酶释放及纯化制备还原性N‑糖链的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于糖生物技术领域，具体涉及一种利用Glycosylasparaginase酶释放及纯化制备还原性N‑糖链的方法。本发明的N‑糖链的酶解释放方法包括以下步骤：向变性的糖蛋白进中加入Tris‑HCl缓冲液，溶解样品，加入适量的胰蛋白酶，得到含有N‑糖肽的酶解液；加入适量的Glycosylasparaginase酶，进行酶解反应，得到还原性N‑糖链。经过实验验证本方法可以适用于所有类型的N‑糖链的释放，包括α‑1,3‑Fuc修饰的N‑糖链的释放，并且操作简便，成本低廉，适于大规模应用，在生命科学和医药领域均具有重要的研究和应用价值。

Description

利用Glycosylasparaginase酶释放及纯化制备还原性N-糖链 的方法
技术领域
本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及一种利用Glycosylasparaginase酶释放及纯 化制备还原性N-糖链的方法及该方法的用途。
背景技术
生物体中50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，糖蛋白在动物、植物、细菌、真菌中广泛存在。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、 蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用。
在真核生物中，糖蛋白分类是基于糖链与蛋白质的连接类型的，可分为：N-糖链和O-糖链两大类。其中，糖蛋白的O-糖链是通过N-乙酰葡萄糖胺连接在蛋白质丝氨酸或丝 氨酸的羟基氧上，也有通过O-甘露醇等其他方式的连接。糖蛋白的N-糖链与蛋白质中的 天冬酰胺残基(Asn)的氨基侧链共价相连，在动物细胞中，几乎都是N-乙酰葡萄糖胺 与Asn残基以β-苷键构型相连。N-糖链不仅介导细胞之间的识别以及信号转导过程，还 在蛋白质的稳定性、定位以及受体之间的相互作用中具有重要的生物学功能和意义 Weixuan Chen；etal.Journal of Proteome Research,(2014),13(3):1466-1473。
在植物和昆虫中N-糖链普遍存在α-1,3-岩藻糖(Fucose，简称Fuc)修饰。研究表明，由于植物中糖链的这种特殊结构修饰，将植物糖蛋白注入到人体会产生免疫交叉反应，即引起过敏反应，Wei Song；et al.Journal of Proteomics,(2011),74(8):1463-1474。树 木花粉、蜂毒等都是主要的过敏原，而且通常与食物引起的过敏反应息息相关，但是有 关这些物质寡糖结构的分析报道较少，Wei Song；et al.Journal of Proteomics,(2011),74(8): 1463-1474。主要是由于缺乏对这类N-糖链的特异性、高效的分析方法和手段。
由于完整的糖蛋白分子量较大，很难直接对其中的N-糖链进行分析。因此，一般需要将N-糖链从蛋白上释放下来，才能进行下一步的分析检测，因此，糖链的释放在糖链 分析中是一个非常关键的环节，对糖蛋白糖链结构和功能的分析研究有重要意义。由于 生物体内N-糖链表达的微量性和复杂性，同时又具有多羟基，一般需对糖链进行化学衍 生以改变其疏水性，便于后续多重分析模式和方法，如高效液相色谱(HPLC)，质谱 (MS)和毛细管电泳(CE)等进行高效的分析。因而高效获取还原性N-糖链对糖类物 质进行后续的结构和功能研究尤为重要。
目前，糖蛋白N-糖链的释放主要采用特异性酶解法和化学法。常见的化学法有肼解 法，即糖蛋白在无水肼中于90℃反应4h可以非还原性的释放糖链，此方法虽通用性好，但是无水肼有剧毒，容易爆炸，且反应过程中，N-乙酰氨基中的酰基易脱落。糖蛋白还 可以在氢氧化钠(NaOH)和硼氢化钠(NaBH4)体系中进行解离，糖蛋白在氢氧化钠 碱性介质中能解离出还原性N-糖链，由于脱乙酰化副反应十分严重，并且还原性糖链在 强碱性的水性介质中会发生降解，在反应体系中加入硼氢化钠等还原剂，使得解离下来 的糖链主要生成还原端为醇羟基的糖醇产物，该产物不可进行荧光标记，不利于后续的 分离分析。糖蛋白在浓氨水和饱和的碳酸钠中释放还原性N-糖链的方法，水解后一部分 核心α-1,3-岩藻糖(α-1,3-Fuc)糖基化还原性N-糖链在碱性环境下会发生peeling降解，不 利于后续的分析。
相比而言，特异性糖苷酶酶解法如N-糖苷酶F(PNGase F)与N-糖苷酶A(PNGase A)副反应少，糖链不会在释放过程中降解。PNGase F能够水解糖蛋白或糖肽N-糖链 的还原性末端N-乙酰葡糖胺与天冬酰胺残基侧链之间的酰胺键，天冬酰胺变为天门冬氨 酸，并得到完整的糖链，PNGase F可以有效释放哺乳动物，尤其是人体中的多种N-糖 链，但该酶不能释放α-1,3-Fuc修饰的还原性N-糖链，阻碍了N-糖基化研究的深入开展， Tretter V.,Altmann F.,Marz L.Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase Fcannot release glycans with fucose attachedα-1→3to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue[J].European Journal of Biochemistry,(1991),199(3):647-652。PNGase A酶可以解离核心α-1,3-岩藻糖糖基化还原性N-糖链，但由于酶活性 较低，不能作用于完整的糖蛋白，仅适用于短的糖肽，所以在酶解释放之前，必须先用 胰蛋白酶或胃蛋白酶将糖蛋白降解为糖肽，然后才能用PNGase A释放还原性N-糖链； 并且该酶对唾液酸化糖链的释放效率低，Hanneman A.J.,Rosa J.C.,Ashline D.,et al. Isomer andglycomer complexities of core GlcNAcs in Caenorhabditis elegans[J].Glycobiology,2006,16(9):874-890。此外，PNGase A只能从杏仁酵素中分离纯化，不易 获得，因而价格昂贵，这些因素影响了PNGase A在还原性N-糖链释放领域中的进一步 应用。
可以看出，N-糖苷酶F(PNGase F)与N-糖苷酶A(PNGase A)两种酶解法都有 各自的局限性，因而难以用于大规模的糖组学分析。
综上，由于还原性N-糖链，尤其是α-1,3-Fuc修饰的还原性N-糖链的释放方法的相对缺乏，因而极大地制约了植物和昆虫中N-糖组的结构和功能研究的深入开展， XuezhengSong；et al.Bioconjugate Chemistry,(2014),25(10):1881-1887。
因此，发展通用性强，可适用于含α-1,3-Fuc修饰的还原性N-糖链的释放，酶活性高，成本低，适于大规模的糖组学分析的还原性N-糖链释放新方法，对糖蛋白的N-糖 链分析鉴定、结构和功能研究，以及具有药用价值还原性N-糖链的规模制备有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中缺乏应用于含有核心α-1,3-岩藻糖修饰的还原性N-糖链的、通 用性强、酶活性高、成本低、便于规模化应用的释放还原性N-糖链的酶解法的问题，本发明一方面提供了一种利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，另一方面，本发明还提供了酶解法释放的还原性N-糖链的纯化方法。本发明要解决的技术问题 通过以下技术方案实现：
一种利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，其包括以下步骤：
(a)向变性处理后的糖蛋白样品中加入Tris-HCl缓冲液，溶解样品，然后加入适量的胰蛋白酶，在适宜条件下进行酶解反应，得到含有N-糖肽的酶解液；终止胰蛋白酶的 反应，冷却至室温；
(b)向步骤(a)所得到的含有N-糖肽的酶解液中加入适量的Glycosylasparaginase 酶，合适条件下进行酶解反应，得到还原性N-糖链。
进一步地，本发明所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法中， 所述步骤(a)具体过程为：向变性处理后的糖蛋白样品中加入pH为8，含有1.0mM氯 化钙的Tris-HCl缓冲液，至完全溶解样品；
然后向其中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的用量为：胰蛋白酶与蛋白样品的质量比为1： 40～200；
将所得混合物置于37℃恒温水浴中，反应12小时，得到含有N-糖肽的酶解液；
将酶解液置于100℃条件下，反应3分钟，终止胰蛋白酶的反应，并冷却至室温。
进一步地，本发明所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法中， 所述步骤(b)具体过程为：向步骤(a)所得到的酶解液中加入Glycosylasparaginase酶， 所述Glycosylasparaginase酶的含量为750unit/100μL，Glycosylasparaginase酶的用量 为：每1μL酶液作用于2mg～10mg蛋白样品；
然后所得混合物体系置于37℃恒温条件下，反应12小时～24小时，得到还原性N-糖 链粗品。
进一步地，本发明所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法中， 步骤(b)中所述的Tris-HCl缓冲液为pH＝8，含有1mM氯化钙的0.1M Tris-HCl缓冲液，其配制方法为：称取605mg Tris用Mill-Q溶至50mL，称取CaCl2 5mg加入溶液中，以 0.5MHCl调pH至8.0。
进一步地，本发明所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法中， 所述步骤(a)中所述变性处理的具体过程为：取糖蛋白样品，溶于5mM的二硫苏糖醇 溶液中，50℃下反应30分钟，待冷却至室温后，向其中加入10mM的碘乙酰胺溶液， 避光振荡反应30分钟，氮气吹干仪中吹干，得到变性的糖蛋白样品。
另一方面，本发明还提供了利用Glycosylasparaginase酶解法释放的还原性N-糖链 的纯化方法，过程为：将酶解法释放得到还原性N-糖链粗品，依次经微晶纤维素柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化，以除去杂质和盐，得到纯化后的N-糖链样品。
进一步地，本发明所述的还原性N-糖链的纯化方法中，所述微晶纤维素柱纯化过程 为：微晶纤维素柱预先用水洗柱，然后用正丁醇/甲醇/水溶液(V/V/V)＝4：1：1的混 合溶剂平衡；将N-糖链粗品重溶于正丁醇/甲醇/水(V/V/V)＝4：1：1的混合溶剂中， 上样，再用相同比例的混合溶剂冲柱，以除去肽杂质，然后用水将N-糖链洗脱出柱， 收集洗脱液，除去溶剂，得初步纯化的N-糖链样品。
进一步地，本发明所述的还原性N-糖链的纯化方法中，所述石墨碳固相萃取柱纯化 过程为：石墨碳固相萃取柱先用乙腈活化，再用水洗柱，然后将经微晶纤维素柱纯化 后的样品上样，上样后先用水洗脱除杂质，然后，用合适浓度的乙腈水溶液进行洗 脱，收集洗脱液，除去溶剂得纯化后的N-糖链样品。
还在另一方面，本发明还提供了利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的 方法用于释放所有类型还原性N-糖链的用途，所述所有类型还原性N-糖链包括核心 α-1,3-Fuc修饰的N-糖链。
进一步地，使用本发明所述的Glycosylasparaginase酶释放后得到的所述还原性N- 糖链为末端带有半缩醛羟基的N-糖链。
进一步地，使用本发明所述的Glycosylasparaginase酶释放得到的还原性N-糖链的 类型有以下三种：高甘露糖型、复杂性和杂合型，N-糖链模式如下所示：
(1)高甘露糖型N-糖链模式：
(2)复杂型N-糖链模式：
(3)杂合型N-糖链模式：
进一步地，使用本发明所述的Glycosylasparaginase酶释放所有类型还原性N-糖链时， 可对一般类型还原性N-糖链和核心α-1,3-Fuc修饰还原性N-糖链同时进行释放。
进一步地，使用本发明所述的Glycosylasparaginase酶释放的所有类型还原性N-糖链 的结构类型如下所示：(1)一般类型还原性N-糖链
(2)植物或昆虫中α-1,3-Fuc和β-1,2木糖(Xylose，Xyl)修饰的还原性N-糖链
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明所公开的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，提出了胰 蛋白酶结合Glycosylasparaginase酶法释放还原性N-糖链的方法，释放所得N-糖链具有末 端半缩醛结构，可通过微晶纤维素和石墨碳柱进行富集纯化和制备，保留了完整的糖链 结构，糖链末端具有半缩醛结构，易于化学标记和便于后续的结构分析，在生命科学和 医药领域均具有重要的研究和应用价值。
2、本发明所公开的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，经过实验 验证可以用于所有类型的还原性N-糖链的释放，例如，动物源、植物来源的番茄叶、烟草叶、油菜花粉和植物辣根过氧化物酶，还有昆虫来源的蚕卵样品中的所有类型还原性 N-糖链，其中，包括α-1,3-Fuc修饰的还原性N-糖链，本发明为所有类型还原性N-糖链的 酶法释放提供了一种新途径和方法体系。
3、本发明所公开的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，成本低， 酶活性高，反应条件温和，对于含有α-1,3-Fuc修饰的还原性N-糖链，也不会造成糖链降 解，释放效率可达到接近100％。
4、本发明所公开的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，与N-糖肽酶A(PNGase A)酶释放法或现有化学方法相比，所选用的胰蛋白酶和Glycosylasparaginase酶价格低廉，操作过程简单，直接在溶液中就可进行高效地糖链 解离和释放，不需要进行酶固定化，避免了在在固定化酶的过程中，酶活力有所损 失，固定化的成本高等缺点；也克服了固定化酶与底物之间接触不充分，规模化运用， 成本高，难度大的问题；利于还原性N-糖链的大规模释放和制备研究。
5、本发明所公开的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法中，糖蛋白 先使用特异性强的胰蛋白酶，切断糖蛋白肽链中的赖氨酸和精氨酸残基中的羧基，从而 切断该肽键，将糖蛋白酶解为糖肽，然后再经Glycosylasparaginase酶在特异位点切断N-GlcNAc与Asn之间的N-糖苷键，就可以特异性地、高效地释放出各种类型的还原性N- 糖链；因此，使用Glycosylasparaginase酶可释放植物、动物包括昆虫中糖蛋白上的所有 类型还原性N-糖链，包括α-1,3-Fuc修饰N-糖链。
附图说明
图1为本发明方法释放得到的还原性N-糖链的模式结构和类型示意图。
图2为本发明实施例1中所释放得到的植物来源还原性N-糖链的质谱分析图谱。
图3为本发明实施例2中所释放得到的昆虫来源还原性N-糖链的质谱分析图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面所描述的实施例，除非其他方面表明所有的温度定为摄氏度，如无特殊说明温 度的误差范围为实施例中无特殊说明，反应温度为室温，室温指25℃±5℃，所有的温度误差为±5℃。
微晶纤维素均购于Sigma-Aldrich公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、 NP-40均购于Aladdin Industrial Inc公司；Glycosylasparaginase酶、胰蛋白酶、辣根过氧化 物酶、胎牛血清(FBS)购于Thermo Scientific公司；荞麦花粉由温室培养获得。微晶纤 维素和石墨碳填料购自郑州市国达仪器设备有限公司。固相萃取小柱多孔石墨碳柱(150 mg/4mL)和微晶纤维素柱购于Alltech Associates公司。MD34透析袋(截留分子量为8～14 KDa)购买于Union Carbide公司；色谱纯乙腈购于Fisher Scientific公司，其它试剂均为 分析纯。去离子水是实验室用Milli-Q Advantage超纯水系统进行制备。
本发明实施例中所使用的“水”如无特别说明，均为去离子水。
本发明中质谱鉴定(ESI-MS)使用电喷雾电离线性离子阱质谱(LTQ XL，ThermoScientific，USA)进行检测，如无特别说明，质谱分析检测条件如下：
ESI-MS参数设置如下：
质谱为电喷雾离子源(ESI)，质谱模式为正离子模式；
喷雾电压为4.2Kv；
流动相为甲醇：水＝1：1(V/V)，流速为200μL/min；
离子传输毛细管温度(Capillary Temp)是370℃，毛细管电压(CapillaryVoltage) 为47Kv；
鞘气(Sheath gas，N2)流速为30arb，辅助气(Aux gas，N2)流速为4arb；
离子透镜电压(tube lens)为250；
离子吹扫气(Ion sweep gas，N2)流速为0arb；
扫描范围：900～2000；
样品进样量为2μL；
ESI-MS数据采集使用LTQ Tune软件。
下面简写词的使用贯穿本发明：
ACN 乙腈
arb arbitrary unit任意单位，属于压力单位
CaCl2 氯化钙
DMSO 二甲基亚砜
DTT 二硫苏糖醇
IAM 2-Iodoacetamide，碘乙酰胺
MeOH 甲醇
mL 毫升
min 分钟
ms 毫秒
M mol/L
mM mmol/L
h 小时
NaOAc 乙酸铵
PMSF 苯甲基磺酰氟
Retention time 保留时间
Relative Abundance 相对丰度
RIPA Buffer RIPA裂解液
Relative abundance 相对丰度
SDS 十二烷基硫酸钠
Tris-HCl 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液
TCA 三氯乙酸
V 伏
实施例：
本发明中的实施例是关于酶解法释放糖蛋白中还原性N-糖链及N-糖链的纯化制备 方法和质谱分析过程的。本发明实施例中所公开的利用Glycosylasparaginase酶释放还原 性N-糖链的方法中，糖蛋白先使用特异性强的胰蛋白酶，切断糖蛋白肽链中的赖氨酸和 精氨酸残基中的羧基，从而切断该肽键，将糖蛋白酶解为糖肽，然后再经Glycosylasparaginase酶在特异位点切断N-GlcNAc与Asn之间的N-糖苷键，就可以特异性地、高效地释放出各种类型的还原性N-糖链；本发明方法可释放得到的还原性N-糖链的 模式结构和类型如图1所示。
具体实验过程以下详述。
实施例1：辣根过氧化物酶中N-糖链的酶解法释放、纯化及质谱分析方法
1、酶解法释放
取辣根过氧化物酶0.01mg，溶于100μL 5mM的二硫苏糖醇(DTT)溶液中，50℃ 反应30min，待冷却至室温后，加入10μL 10mM碘乙酰胺，避光振荡反应30min，氮 气吹干仪中吹干，得到变性的糖蛋白样品。糖蛋白的变性，即破坏分子中的次级结构， 不涉及肽键和二硫键的断裂，一级结构仍保持完整。
向变性处理后的糖蛋白样品中加入1mL pH为8的、含有1.0mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液，充分溶解样品，然后向其中加入0.05μg胰蛋白酶，所得混合物置于37℃恒温水浴 中，反应12小时，可以向体系中，滴加少量甲苯，抑制细菌生长，得到含有N-糖肽的酶 解液。胰蛋白酶是肽链内切酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，从 而将糖蛋白酶解为糖肽。
所用的pH为8的、含有1.0mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液，配制方式：称取605mg Tris用Mill-Q去离子水定容至50mL，称取CaCl2 0.005g加入溶液中，以1M HCl调pH 至8.0。
将含有N-糖肽的酶解液，置于100℃沸水浴中反应3分钟，终止胰蛋白酶的反应，然后冷却至室温。把以上溶液均分为2等份。
(1)一份向冷却后的酶解液中加入0.5μL Glycosylasparaginase酶(750Unit，100μL)，所得混合物体系震荡3分钟；然后置于37℃恒温水浴中，反应12小时后，终止 反应，氮气吹干仪中40℃吹干得到还原性N-糖链粗品。
(2)另一份冷却后的酶解液，氮气吹干，后加入酶解缓冲液(磷酸缓冲液，1.9g 磷酸钠溶于10mL Mill-Q中，用磷酸调pH至7.5)，后加入0.5μL PNGase A酶(750Unit， 100μL)，所得混合物体系震荡3分钟；然后置于37℃恒温水浴中，反应12小时后， 终止反应，氮气吹干仪中40℃吹干得到还原性N-糖链粗品。
2、柱层析纯化
使用微晶纤维素柱结合石墨碳柱纯化酶解法释放后的N-糖链粗品。首先用微晶纤维素除去反应样品中的大量蛋白质杂质和少量的盐，然后使用石墨碳柱进一步除去大量的盐和色素等杂质。
微晶纤维素柱纯化过程：
(1)活化柱子：用大量的Mill-Q去离子水(大约为柱体积的10倍)洗脱微晶纤维 素柱(1cm×3cm柱子)，除去填料本身含有的一些寡糖等杂质；然后用约2倍柱体积 蛋白洗脱液(正丁醇：甲醇：水＝4：1：1，V/V/V)平衡柱子。
(2)上样：将吹干后的N-糖链粗品以适量蛋白洗脱液(恰能溶解即可)溶解上样，待样品在柱子上吸附5min。
(3)冲洗杂质：用约50倍柱体积的蛋白洗脱液洗脱杂多肽和无机盐等杂质；
(4)回收样品：用2mL Mill-Q去离子水缓慢洗脱目标N-糖链，收集洗脱液，氮气 吹干仪中40℃吹干，除去机溶剂，得初步纯化的N-糖链样品。
石墨碳柱纯化过程：
(1)活化柱子：用5倍柱体积100％乙腈活化石墨碳柱(1cm×1cm)，再用5倍柱 体积去离子水冲洗柱子。
(2)上样：将初步纯化的N-糖链样品溶于去离子水中，上样，待样品在柱子上吸 附5min。
(3)冲洗杂质：用5倍柱体积的去离子水洗脱，除盐、色素等可溶性杂质。
(4)回收样品：用1倍柱体积的25％的乙腈水溶液，洗脱目标糖链，收集洗脱液， 氮气吹干仪中40℃吹干样品，得到纯化的N-糖链。
3、质谱分析
将纯化得到的N-糖链进行质谱分析，以确定目标糖链结构。
内标定量：用超纯水做溶剂配制浓度为11.3mg/mL的环糊精溶液，环糊精作为内标试剂，以N-糖链与环糊精的丰度比作为指标参数，计算相对丰度比，并以其为指标评估 释放效率。本内标定量法属于本领域常规评估方法。
质谱分析条件：质谱为电喷雾离子源(ESI)，质谱模式为正离子模式；喷雾电压 为4.2Kv；流动相为甲醇：水＝1:1(V/V)，流速为200μL/min；离子传输毛细管温度 (CapillaryTemp)是370℃，毛细管电压(Capillary Voltage)为47Kv；鞘气(Sheath gas， N2)流速为30arb，辅助气(Aux gas，N2)流速为4arb；离子透镜电压(tube lens)为250，离子吹扫气(Ion sweep gas，N2)流速为0arb；扫描范围：900～2000；样品进样量 为2μL。
辣根过氧化物酶为一种标准植物糖蛋白，其糖基化修饰N-糖链有一般类型的N-糖链，还有核心α-1,3-岩藻糖修饰的N-糖链，其中7条N-糖链结构已得到验证和精确解 析，因此，本实施例中，以其为标准糖蛋白样品。按照本发明实施例1所记载的方法进 行酶解释放其中所有类型N-糖链，再结合内标法质谱相对定量分析结果进行验证，以对 方法的可行性和释放效率进行确定和评估。
本实施例质谱相对定量结果显示，标准植物糖蛋白HRP中的7条N-糖链均可被两种酶(Glycosylasparaginase酶和PNGase A酶)释放，在两组实验中均检测到5个分子 离子峰([M+Na]+)，分子离子峰m/z为1065.17，1079.25，1211.25，1227.25，1373.33， 1430.42和1576.42，其中m/z为1065.25和1227.25的分子离子峰经鉴定为一般类型还 原性N-糖链，糖链组成为[Hex]3[HexNAc]2[Xyl]，[Hex]4[HexNAc]2[Xyl]，而m/z为 1079.25，1211.25，1373.33，1430.42和1576.42等5个分子离子峰，经解析糖链组成为， [Hex]3[HexNAc]2[Fuc]，[Hex]3[HexNAc]2[Fuc][Xyl]，[Hex]4[HexNAc]2[Fuc][Xyl]， [Hex]3[HexNAc]3[Fuc][Xyl]和[Hex]4[HexNAc]3[Fuc][Xyl]，经鉴定为含有α-1,3-岩藻糖修 饰的还原性N-糖链(注，Hex是hexanose；HexNAc是acetylaminohexose；Xyl是Xylose； Fuc是Fucose)，质谱结果如图2所示。
结合环糊精内标法相对定量，结果显示，Glycosylasparaginase酶与PNGaseA酶的释放效率相同，对糖链的释放效率接近100％。
以上实验结果说明，本专利实施方法可高效释放五糖核心未发生α-1,3-岩藻糖修饰， 以及五糖核心发生α-1,3-岩藻糖修饰或/和β-1,2-木糖修饰的还原性N-糖链。本实验中我 们不仅得到了所有类型的还原性N-糖链，而且同时扩充了Glycosylasparaginase酶的作 用底物。
本实施例利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，采用胰蛋白酶结 合Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链，释放所得N-糖链具有末端半缩醛结构，可通过微晶纤维素和石墨碳柱进行富集纯化和制备，保留了完整的糖链结构，糖链末端 具有半缩醛结构，易于化学标记和便于后续的结构分析，具有重要的研究和应用价值。
本实施例中酶解释放糖链的过程：糖蛋白先使用特异性强的胰蛋白酶，切断糖蛋白 肽链中的赖氨酸和精氨酸残基中的羧基，从而切断该肽键，将糖蛋白酶解为糖肽，然后再经Glycosylasparaginase酶在特异位点切断N-GlcNAc与Asn之间的N-糖苷键，就可 以特异性地、高效地释放出所有类型还原性N-糖链包括α-1,3-岩藻糖修饰的N-糖链。
本实施例的酶解法与N-糖肽酶A释放法或现有化学方法相比，所选用的胰蛋白酶和Glycosylasparaginase酶价格低廉，操作过程简单，直接在溶液中就可进行高效地糖链解离和释放，不需要进行酶固定化，避免了在在固定化酶的过程中，酶活力有所损失， 固定化的成本高等缺点；也克服了固定化酶与底物之间接触不充分，规模化运用，成本 高，难度大的问题；利于所有类型还原性N-糖链的大规模释放和制备研究。
以下将实施例1的还原性N-糖链的释放方法应用在其他类型的糖蛋白中，验证该方 法的适用范围。
实施例2：昆虫中N-糖链的酶解法释放、纯化及质谱分析方法
1、酶解法释放N-糖链
家蚕卵100粒，用Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液反复冲洗3～5次，洗去杂质；后移至组织匀浆器中，按体积比10：1的比例，加入蛋白提取液(RIPA Buffer)1mL，后加入1/10 倍体积的蛋白酶抑制剂(PMSF，2.0mg/mL，水溶液)，在研磨器中冰上研磨数分钟， 离心取上清，置于透析袋于4℃冰箱中透析3天(每天换水三次)，将透析袋内样品回收， 然后置于真空冷冻干燥仪进行冷冻干燥，备用。
将蚕卵蛋白、蚕丝蛋白分别称取200mg，溶于500μL 5.0mM的DTT溶液中，置于 50℃水浴中反应30min，待反应液冷却至室温，加入10μL 10.0mM的IAM，避光振荡 反应30min，氮气吹干后，得到变性的糖蛋白样品。将该蛋白样品溶解在1mL Tris-HCl 缓冲液(与实施例1中相同，pH 8.0，内含1.0mM CaCl2)中，向其中加入5.0mg胰蛋白 酶，置于37℃恒温水浴中，酶解反应12小时，滴加少量甲苯抑制细菌生长；得到含有 N-糖肽的酶解液。将含有N-糖肽的酶解液，置于100℃水浴中，反应3min，终止胰蛋白 酶反应，然后冷却至室温；再向其中加入20μL Glycosylasparaginase酶(750Unit，100μL)， 所得混合物体系震荡3分钟，然后置于37℃恒温水浴中，反应24h，氮气吹干仪吹干， 得到还原性N-糖链粗品。
2、柱层析纯化
使用微晶纤维素柱结合石墨碳柱纯化酶解法释放后的N-糖链粗品。首先用微晶纤维素除去反应样品中的大量蛋白质杂质和少量的盐，然后使用石墨碳柱进一步除去大量的盐和色素等杂质。
微晶纤维素柱纯化过程：
(1)活化柱子：用Mill-Q去离子水(大约为柱体积的100倍)洗脱微晶纤维素柱(3cm×10cm柱子)，除去填料本身含有的一些寡糖等，然后用约2倍柱体积蛋白洗脱液(正 丁醇：甲醇：水＝4：1：1，V/V/V)平衡柱子。
(2)上样：将吹干后的N-糖链粗品用蛋白洗脱液(恰能溶解即可)溶解后上样， 上样后，样品在微晶纤维素柱上吸附3min。
(3)冲洗杂质：用约50倍柱体积的蛋白洗脱液洗脱杂质。
(4)回收样品：用2mL Mill-Q去离子水缓慢洗脱，收集洗脱液，氮气吹干仪中40℃吹干，除去机溶剂，得初步纯化的N-糖链样品。
石墨碳柱纯化过程：
(1)活化柱子：用5倍柱体积的100％乙腈活化石墨碳柱(1cm×6cm柱子)，再 用5倍柱体积的Mill-Q去离子水冲洗平衡柱子。
(2)上样：待纯化样品溶于50μL去离子水，上样，待样品在柱子上吸附5min。
(3)冲洗杂质：用去离子水(约50倍柱体积)洗脱，除盐和其它杂质。
(4)回收样品：用500μL 25％的乙腈水溶液洗脱目标糖链，收集洗脱液，氮气吹 干仪中40℃吹干样品，得到纯化的N-糖链。
使用完后，以不同浓度的乙腈水溶液梯度洗脱冲净石墨碳柱，最后保存在100％的乙腈中，柱子可再次用于糖链的纯化。
3、质谱分析
将纯化得到的N-糖链进行质谱分析，以确定目标糖链结构。
质谱分析条件：质谱为电喷雾离子源(ESI)，质谱模式为正离子模式；喷雾电压 为4.2Kv；流动相为甲醇：水＝1：1(V/V)，流速为200μL/min；离子传输毛细管温度 (CapillaryTemp)是370℃，毛细管电压(Capillary Voltage)为47Kv；鞘气(Sheath gas， N2)流速为30arb；辅助气(Aux gas，N2)流速为4arb；离子透镜电压(tube lens)为 250，离子吹扫气(Ion sweep gas，N2)流速为0arb；扫描范围：900～2000；样品进样量 为2μL。
本实施例将结合胰蛋白酶和Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法用于 动物源蚕丝蛋白中还原性N-糖链释放，也得到了具有末端半缩醛羟基的N-糖链。
家蚕为生物学研究模式昆虫，其糖基化修饰N-糖链有一般类型的N-糖链，还有核心α-1,3-岩藻糖修饰的N-糖链。因此，以其为标准糖蛋白样品，按照实施例1的实验条 件和方法进行酶解释放其中所有类型N-糖链，经纯化后，再结合质谱结果对实验结果进 行鉴定和解析，以对方法的可行性进行评估。
本实施例的质谱分析结果显示，蚕卵中糖蛋白共检测到11个分子离子峰 ([M+Na]+)，其中m/z为933.42、1136.42、1257.50、1339.50、1419.58、1581.58、1743.67 和1905.75等8个分子离子峰，经鉴定为一般类型还原性N-糖链，糖链组成为 [Hex]3[HexNAc]2，[Hex]3[HexNAc]3，[Hex]5[HexNAc]2，[Hex]3[HexNAc]4， [Hex]6[HexNAc]2，[Hex]7[HexNAc]2，[Hex]8[HexNAc]2和[Hex]9[HexNAc]2，为一般类型 还原性N-糖链；而m/z为917.42、1079.42、1241.42和1403.42等分子离子峰，经解析 鉴定为[Hex]2[HexNAc]2[Fuc]，[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]，[Hex]4[HexNAc]2[Fuc]和 [Hex]5[HexNAc]2[Fuc]，经鉴定为含有α-1,3-岩藻糖修饰的还原性N-糖链(注，Hex是 hexanose；HexNAc是acetylaminohexose；Fuc是Fucose)，具体质谱结果如图3所示。 同时我们发现这些糖链与植物来源的核心结构被α-1,3岩藻糖修饰的糖链具有较大的差 异，在昆虫中没有β-1,2-木糖修饰的还原性N-糖链，这与现有研究结论有一致性。
以上实验结果进一步证明，本专利糖链释放方法对于五糖核心未发生α-1,3-岩藻糖 修饰，以及五糖核心未发生α-1,3-岩藻糖修饰的糖蛋白均可以适用，本实验中我们不仅得到了所有类型的还原性N-糖链，而且进一步扩展了Glycosylasparaginase酶的作用底物。
实施例3：烟草中N-糖链的酶解法释放、纯化及质谱分析方法
1、酶解法释放N-糖链
取烟草叶片100mg，将植物叶子剪碎或粉碎后，置于研磨器中在液氮中研磨，后溶于冰的1mL 100mM Tris-HCl(pH 8.0)中，于4℃，10000r/min的条件下离心10min， 取上清，弃掉沉淀；后加入1/3体积的50％TCA水溶液，充分搅拌，于4℃冰箱过夜沉淀 蛋白，然后在离心机中以6000r/min的条件，离心5min，取沉淀，沉淀复溶于pH＝8 Tris-HCl缓冲液中，重复加入50％TCA进行沉淀；重复2次实验，以充分除去游离的多糖； 再将沉淀溶于90％(V/V)丙酮水溶液中，超声处理，离心，弃上清，重复两次，除去 色素、脂类和TCA等杂质，即得拟南芥粗蛋白。
称取拟南芥粗蛋白2.0mg，溶于500μL 5mM的DTT中，置于50℃水浴中反应 30min，待反应液冷却至室温后，加入10μL 100mM的IAM，避光振荡反应30min。。 置于氮气吹干仪下氮气吹干，得到变性的糖蛋白样品，再溶解于1mL Tris-HCl缓冲液 (与实施例1中相同，pH8.0，内含1.0mM CaCl2)中，加入适量胰蛋白酶0.01mg， 所得混合物置于37℃条件下，恒温反应12h(滴加少量甲苯，抑制细菌的生长)。反 应完成后，置于100℃水浴中反应3min，使胰蛋白酶失活，待样品冷却后，加入1μL Glycosylasparaginase酶(750Unit，100μL)，置于37℃恒温条件下，反应24h，终止 反应，氮气吹干仪吹干，得到还原性N-糖链粗品。
2、柱层析纯化
使用微晶纤维素柱结合石墨碳柱纯化酶解法释放后的N-糖链粗品。首先用微晶纤维素除去反应样品中的大量蛋白质杂质和少量的盐，然后使用石墨碳柱进一步除去大量的盐和色素等杂质。
微晶纤维素柱纯化过程：
(1)活化柱子：用Mill-Q去离子水(大约为柱体积的10倍)洗脱微晶纤维素柱(1cm×3cm)，除去填料本身含有的杂质，然后用约2倍柱体积蛋白洗脱液(正丁醇：甲醇： 水＝4：1：1，V/V/V)平衡柱子。
(2)上样：将吹干后的N-糖链粗品以适量蛋白洗脱液(恰能溶解即可)溶解上样，待样品在柱子上吸附5min。
(3)冲洗杂质：用约50倍柱体积的蛋白洗脱液洗脱，除去杂多肽和无机盐等杂质。
(4)回收样品：用2mL Mill-Q去离子水缓慢洗脱目标糖链，收集洗脱液，氮气 吹干仪中40℃吹干样品，得初步纯化的N-糖链样品。
石墨碳柱纯化过程：
(1)活化柱子：用5倍柱体积100％乙腈活化石墨碳柱(1cm×1cm)，再用5倍柱 体积去离子水冲洗柱子。
(2)上样：将初步纯化的N-糖链样品溶于水中，上样，待样品在柱子上吸附5min。
(3)冲洗杂质：用5倍柱体积的去离子水洗脱，除盐、色素等可溶性杂质。
(4)回收样品：用1倍柱体积的25％的乙腈水溶液，洗脱目标糖链，收集洗脱液， 氮气吹干仪中40℃吹干样品，得纯化的N-糖链。
3、质谱分析
将纯化得到的N-糖链进行质谱分析，以确定目标糖链结构。
质谱分析条件：质谱为电喷雾离子源(ESI)，质谱模式为正离子模式；喷雾电压 为4.2Kv；流动相为甲醇：水＝1:1(V/V)，流速为200μL/min；离子传输毛细管温度 (CapillaryTemp)是370℃，毛细管电压(Capillary Voltage)为47Kv；鞘气(Sheath gas， N2)流速为30arb，辅助气(Aux gas，N2)流速为4arb；离子透镜电压(tube lens)为 250；离子吹扫气(Ion sweep gas，N2)流速为0arb；扫描范围：900～2000；样品进样量 为2μL。
本实施例将结合胰蛋白酶和Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法用于 植物源拟南芥蛋白中还原性N-糖链释放，也得到了具有末端半缩醛羟基的N-糖链，包括核心结构被α-1,3岩藻糖或β-1,2-木糖修饰的N-糖链。
烟草为生物学研究的模式植物，其糖基化修饰N-糖链有一般类型的N-糖链，还有核心α-1,3-岩藻糖修饰的N-糖链。从烟草中提取糖蛋白为样品，按照本发明的释放方法 和条件，进行酶解释放其中所有类型N-糖链，经纯化后再结合质谱结果对实验结果进行 鉴定和解析，以对方法的可行性和应用范围进行评估。
本实施例的质谱分析结果显示，烟草中糖蛋白共检测到12个分子离子峰 ([M+Na]+)，其中m/z为1065.33，1227.13、1257.50、1268.42、1419.58、1471.52、 1581.48、1592.42和1743.67等9个分子离子峰，经鉴定为一般类型还原性N-糖链，糖 链组成为[Hex]3[HexNAc]2[Xyl]，[Hex]4[HexNAc]2[Xyl]，[Hex]3[HexNAc]2， [Hex]3[HexNAc]3[Xyl]，[Hex]6[HexNAc]2，[Hex]7[HexNAc]2，[Hex]5[HexNAc]3[Xyl]和 [Hex]9[HexNAc]2，为一般类型还原性N-糖链；而m/z为1211.42、1414.42和1617.42等 分子离子峰，经解析鉴定糖链组成为[Hex]3[HexNAc]2[Xyl][Fuc]， [Hex]3[HexNAc]3[Xyl][Fuc]和[Hex]3[HexNAc]4[Xyl][Fuc]，经鉴定为含有α-1,3-岩藻糖修 饰的N-糖链(注，Hex是hexanose；HexNAc是acetylaminohexose；Xyl是Xylose；Fuc 是Fucose)，具体质谱结果如图3所示。
结果显示，本发明释放的植物来源的还原性N-糖链核心结构被α-1,3岩藻糖或β-1,2- 木糖修饰，而在昆虫中只检测N-糖链或核心结构被α-1,3岩藻糖修饰的N-糖链，未检测 到β-1,2-木糖修饰的N-糖链。
以上实验结果进一步证明，本专利实施方法，对于五糖核心未发生α-1,3-岩藻糖修 饰，以及五糖核心未发生α-1,3-岩藻糖修饰的糖蛋白，均可以适用。本实验中我们不仅得到了所有类型的还原性N-糖链，而且进一步扩展了Glycosylasparaginase酶的作用底物。
综合以上实施例，本发明提供了一种利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖 链的方法，该方法先以胰蛋白酶把糖蛋白酶解为糖肽；再利用在大肠杆菌中表达的Glycosylasparaginase酶，在溶液中释放所有类型还原性N-糖链，经过实验验证可以用于所有类型的还原性N-糖链的释放，例如，动物源、植物来源的番茄叶、烟草叶、油菜花 粉和植物辣根过氧化物酶，还有昆虫来源的蚕卵样品中的所有类型还原性N-糖链，其中， 包括α-1,3-Fuc修饰的还原性N-糖链的释放。释放的还原性N-糖链保留了完整的糖链结 构，糖链末端具有半缩醛羟基结构，易于化学标记和便于后续的结构分析，对于含有 α-1,3-Fuc修饰的还原性N-糖链，不会造成糖链降解，释放效率可达到接近100％，在生 命科学和医药领域均具有重要的研究和应用价值。
本发明所公开的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，采用的胰 蛋白酶和Glycosylasparaginase酶，成本低，酶活性高，反应条件温和，直接在溶液中就可进行高效地糖链解离和释放，不需要进行酶固定化，避免了在在固定化酶的过程中， 酶活力有所损失，固定化的成本高等缺点；也克服了固定化酶与底物之间接触不充分， 规模化运用，成本高，难度大的问题；非常有利于还原性N-糖链的大规模释放和制备研 究。经本发明的酶解法释放后的还原性N-糖链，使用微晶纤维素结合石墨碳色谱柱进行 纯化，实现了从混合物中对目标还原性N-糖链的纯化和富集。柱层析进行纯化的方法操 作简便，纯化富集效果好，且便于大规模、产业化应用，为所有类型还原性N-糖链的释 放和大规模制备提供了一种便宜、高效的新方法和途径，有利于植物源、动物源还原性 N-糖链的结构与功能的构效关系研究，以及有特殊药用价值的还原性N-糖链尤其是 α-1,3-Fuc修饰还原性N-糖链的大规模制备。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本 发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明 的保护范围。

Claims (10)

1.利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，其包括以下步骤：
(a)向变性处理后的糖蛋白样品中加入Tris-HCl缓冲液，溶解样品，然后加入适量的胰蛋白酶，在适宜条件下进行酶解反应，得到含有N-糖肽的酶解液，终止胰蛋白酶的反应，冷却至室温；
(b)向步骤(a)所得到的含有N-糖肽的酶解液中加入适量的Glycosylasparaginase酶，合适条件下进行酶解反应，得到还原性N-糖链。
2.根据权利要求1所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，其特征在于，所述步骤(a)具体过程为：向变性处理后的糖蛋白样品中加入pH为8，含有1.0mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液，至完全溶解样品；
然后向其中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的用量为：胰蛋白酶与蛋白样品的质量比为1：40～200；
将所得混合物置于37℃恒温水浴中，反应12小时，得到含有N-糖肽的酶解液；
将酶解液置于100℃条件下，反应3分钟，终止胰蛋白酶的反应，并冷却至室温。
3.根据权利要求1所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，其特征在于：所述步骤(b)具体过程为：向步骤(a)所得到的酶解液中加入Glycosylasparaginase酶，所述Glycosylasparaginase酶的含量为750unit/100μL，Glycosylasparaginase酶的用量为：每1μL酶液作用于2mg～10mg蛋白样品；
然后所得混合物体系置于37℃恒温条件下，反应12小时～24小时，得到还原性N-糖链粗品。
4.根据权利要求1所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法，其特征在于：步骤(a)中所述的Tris-HCl缓冲液为pH为8，含有1.0mM氯化钙的0.1M的Tris-HCl缓冲液。
5.权利要求1～4任一项所述的方法释放得到的还原性N-糖链的纯化方法，其特征在于：将酶解法释放得到还原性N-糖链粗品，依次经微晶纤维素柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化，以除去杂质和盐，得到纯化后的还原性N-糖链样品。
6.权利要求1～4任一项所述的利用Glycosylasparaginase酶释放还原性N-糖链的方法用于释放所有类型还原性N-糖链的用途，其特征在于：所述所有类型还原性N-糖链包括核心α-1,3-Fuc修饰的N-糖链。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶释放后得到的所述还原性N-糖链为末端带有半缩醛羟基的N-糖链。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶释放得到的还原性N-糖链的类型有以下三种：高甘露糖型、复杂型和杂合型，N-糖链模式如下所示：
(1)高甘露糖型N-糖链模式：
(2)复杂型N-糖链模式：
(3)杂合型N-糖链模式：
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶释放所有类型还原性N-糖链时，可对一般类型还原性N-糖链和核心α-1,3-Fuc修饰还原性N-糖链同时进行释放。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：使用Glycosylasparaginase酶释放的所有类型还原性N-糖链的结构类型如下所示：
(1)一般类型还原性N-糖链
(2)植物或昆虫中α-1,3-Fuc和β-1,2木糖(Xylose，Xyl)修饰的还原性N-糖链
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