CN111892720A - 碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法 - Google Patents

碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法，本发明引入了对ALP敏感且具有良好生物相容性和自组装特性的小分子多肽作为凝胶因子前驱体，其在ALP的催化作用下能够脱除分子上的磷酸基团生成NY，触发超分子自组装，从而协同诱导SF共自组装，最终导致SF水凝胶的快速形成。SF‑NY水凝胶网络中包裹的ALP仍然保持着其催化活性，并通过催化β‑甘油磷酸酯释放出游离的磷酸根离子，从而在凝胶中诱导磷灰石矿物质的形成。由于温和的凝胶化过程以及在凝胶基质中形成了磷灰石矿物质，仿生矿化后的SF凝胶不仅可以用作仿生支架，在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞的粘附，增殖和成骨分化，而且还可以在大鼠模型中促进股骨缺损的自然愈合。

Description

碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法
技术领域
本发明涉及一种碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法，属于材料技术领域。
背景技术
在自然界中，生物矿化过程受到许多有机组分的影响，包括蛋白质、多糖和酶，这些有机成分对调控羟基磷灰石晶体的生长具有重要的作用。在天然骨形成的过程中，由成骨细胞分泌的碱性磷酸酶(ALP)通过从有机磷酸盐中释放出无机磷酸根离子，从而增加了局部磷酸盐的浓度，促使羟基磷灰石(HA)矿化。在水环境中，碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)能够催化脱除底物分子上的磷酸基团，使底物疏水性增强。2004年，Xu等第一次报道了在碱性磷酸酶的催化下，底物分子Fmoc-pY(Fmoc＝芴甲氧碳基，pY＝磷酸化酪氨酸)脱除磷酸基团生成Fmoc-Y，在π-π相互作用下形成水凝胶，同时自组装形成纳米纤维网络结构，水凝胶的储能模量在1000Pa左右。而后，从这一开创性的工作开始，大量的基于磷酸酶催化构建的肽水凝胶被陆续报道，包括Fmoc-FpY，Ac-YYYpY-OMe(Ac＝酰基)，Nap-GFFpY-OMe(Nap＝萘基)，Nap-FFGEpY，NapFFpY等。
蚕丝蛋白(Silk Fibroin)又名：丝素蛋白，是一种天然的高分子纤维蛋白，其中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)约占总组成的80％以上。由于其具有优异的生物相容性、可控的生物降解性以及良好的柔韧性和抗拉伸强度等优点，得到了科学家们的广泛研究。大量的以蚕丝蛋白为基材构建的生物材料(如纳米纤维、海绵、薄膜、微球、水凝胶等)被陆续报道，广泛应用于骨组织、皮肤、血管、神经、肌腱和韧带等在内的各种机体组织的修复。其中蚕丝蛋白水凝胶因其具有与天然细胞外基质相似的纤维结构，高含水量，可调的多孔性以及与细胞亲和力好等优点，备受研究者们的青睐。但是，在生理条件下，蚕丝蛋白溶液的凝胶化过程十分缓慢，例如，在室温条件下，浓度为2.0％的蚕丝蛋白水溶液在生理条件下由溶液到凝胶的转变需要超过14天。因此，通常需要在酸性条件下(pH＝4左右)或较高温度(60℃)时才会发生凝胶化。种种这些因素极大地限制了蚕丝蛋白水凝胶在生物医学领域的广泛应用。为了改变蚕丝蛋白凝胶化pH低、温度较高以及所需时间长的特点，科学家们做了很多研究工作。例如，通过超声处理、旋流剪切以及通电等物理方法来诱导蚕丝蛋白的二级结构从溶液时的无规卷曲构象向凝胶状态时的β-折叠构象转变，从而加速蚕丝蛋白的凝胶化进程。科学家们还通过向蚕丝蛋白溶液中加入有机试剂、无机物复合物、离子液体、高压二氧化碳、表面活性剂以及人工合成高分子等化学试剂来调节其与蚕丝蛋白链之间的相互作用，从而改变蚕丝蛋白的凝胶特性，促使蚕丝蛋白凝胶快速成型。此外，科学家们还利用聚(乙二醇二缩水甘油醚)(PGDE)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、京尼平、氯金酸等作为化学交联剂，制备出具有良好的机械强度和稳定性的蚕丝蛋白凝胶材料。
但是这些传统的方法在临床医学应用时，还面临着一些挑战和不足。例如，通过超声处理、旋流剪切和通电等物理方法诱导蚕丝蛋白溶液快速凝胶化时，其由电子仪器触发等非生理条件下的凝胶化过程与临床医用环境不匹配。通过向蚕丝蛋白溶液中添加有机试剂、无机物复合物、离子液体、高压二氧化碳、表面活性剂以及人工合成高分子等化学试剂虽然一定程度上缩短了蚕丝蛋白的凝胶化时间，但是这一系列的凝胶化过程与某些临床使用环境不相容，例如有机分子的潜在细胞毒性，高分子聚合物的生物惰性，在生物体内难以降解等缺点。此外，虽然科学家们还利用聚(乙二醇二缩水甘油醚)(PGDE)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、京尼平、氯金酸等作为化学交联剂，得到了具有良好的机械强度和稳定性的蚕丝蛋白凝胶材料，但是体系中残留的化学交联剂的潜在细胞毒性影响蚕丝蛋白凝胶材料的生物相容性。综上所述，这些措施虽然可以在一定程度上缩短蚕丝蛋白凝胶化时间，但是得到的蚕丝蛋白凝胶材料生物相容性差，以及具有较大的细胞毒性，这些问题导致其在生物医用材料方面的应用受到了极大限制。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过碱性磷酸酶(ALP)触发的连续催化反应来诱导蚕丝蛋白(SF)的凝胶化和仿生矿化。在该体系中我们引入了对ALP敏感且具有良好的生物相容性和优异的自组装特性的小分子多肽(NYp)作为凝胶因子前驱体，其在ALP的催化作用下能够脱除分子上的磷酸基团生成NY，触发超分子自组装，从而协同诱导SF共自组装，最终导致SF水凝胶的快速形成。SF-NY水凝胶网络中包裹的ALP仍然保持着其催化活性，并通过催化β-甘油磷酸酯释放出游离的磷酸根离子，从而在凝胶中诱导磷灰石矿物质的形成。
本发明的第一个目的是提供一种碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化的方法，包括如下步骤：在蚕丝蛋白溶液中添加自组装小分子多肽作为凝胶因子前驱体，得到蚕丝蛋白和自组装小分子多肽混合溶液，向所述的混合溶液中加入碱性磷酸酶，通过碱性磷酸酶脱除自组装小分子多肽分子上的磷酸基团，触发超分子自组装，诱导蚕丝蛋白共自组装形成蚕丝蛋白凝胶材料。
进一步地，所述的自组装小分子多肽为2-萘乙酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-磷酸化酪氨酸(NYp)、2-萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-磷酸化酪氨酸(NapFFKYp)或2-萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-磷酸化酪氨酸(NapFFYp)中的一种或多种。
进一步地，所述的混合溶液中蚕丝蛋白的浓度为0.1％-2.0％。
进一步地，所述的混合溶液中自组装小分子多肽的浓度为0.05wt％-0.3wt％。
进一步地，所述的碱性磷酸酶的添加量为10U/mL-40U/mL。
进一步地，所述的混合溶液的pH为7-8。
本发明的第二个目的是提供一种所述的方法制备得到的蚕丝蛋白凝胶材料。
本发明的第三个目的是提供一种仿生矿化所述的蚕丝蛋白凝胶材料的方法，包括如下步骤：将蚕丝蛋白凝胶材料加入到矿化液中培养5-10天得到仿生矿化水凝胶，所述的矿化液包括10-40mM CaCl2和6-20mMβ-甘油磷酸酯(β-GP)。
本发明的第四个目的是提供所述的方法制备得到的仿生矿化水凝胶。
本发明的第五个目的是提供所述的仿生矿化水凝胶在制备机体组织修复材料中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过碱性磷酸酶(ALP)触发的连续催化反应来诱导蚕丝蛋白(SF)的凝胶化和仿生矿化。在该体系中我们引入了对ALP敏感且具有良好的生物相容性和优异的自组装特性的小分子多肽(NYp)作为凝胶因子前驱体，其在ALP的催化作用下能够脱除分子上的磷酸基团生成NY，触发超分子自组装，从而协同诱导SF共自组装，最终导致SF水凝胶的快速形成。SF-NY水凝胶网络中包裹的ALP仍然保持着其催化活性，并通过催化β-甘油磷酸酯释放出游离的磷酸根离子，从而在凝胶中诱导磷灰石矿物质的形成。由于温和的凝胶化过程以及在凝胶基质中形成了磷灰石矿物质，仿生矿化后的SF凝胶不仅可以用作仿生支架，在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)的粘附，增殖和成骨分化，而且还可以在大鼠模型中促进股骨缺损的自然愈合过程。
附图说明
图1为多肽分子NYp的固相合成步骤；
图2为(a)凝胶因子前驱体NYp溶液(0.08wt％，pH＝7.4)；(b)由ALP(10U/mL)催化NYp溶液发生超分子自组装形成的超分子水凝胶；NY超分子水凝胶(NY＝0.08wt％，pH＝7.4，ALP＝10U/mL)的动态流变学测试(c)应变扫描和(d)频率扫描；
图3为(a)浓度为2.0％的SF溶液；(b)浓度为2.0％的SF水凝胶；SF水凝胶(SF＝2.0％，pH＝7.4，ALP＝10U/mL)的动态流变学测试(c)应变扫描和(d)频率扫描；
图4为混合凝胶Gel 1的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.16wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(0.2％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝10U/mL条件下，含有NY(0.08wt％)和SF(0.1％)的混合水凝胶Gel 1；Gel 1水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图5为混合凝胶Gel 2的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.2wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(0.2％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝10U/mL条件下，含有NY(0.1wt％)和SF(0.1％)的混合水凝胶Gel 2；Gel 2水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图6为混合凝胶Gel 3的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.4wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(0.2％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝10U/mL条件下，含有NY(0.2wt％)和SF(0.1％)的混合水凝胶Gel 3；Gel 3水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图7为混合凝胶Gel 4的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.6wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(0.2％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝10U/mL条件下，含有NY(0.3wt％)和SF(0.1％)的混合水凝胶Gel 4；Gel 4水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图8为混合凝胶Gel 5的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.6wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(1.0％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝10U/mL条件下，含有NY(0.3wt％)和SF(0.5％)的混合水凝胶Gel 5；Gel 5水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图9为混合凝胶Gel 6的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.6wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(2.0％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝10U/mL条件下，含有NY(0.3wt％)和SF(1.0％)的混合水凝胶Gel 6；Gel 6水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图10为混合凝胶Gel 7的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.6wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(4.0％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝10U/mL条件下，含有NY(0.3wt％)和SF(2.0％)的混合水凝胶Gel 7；Gel 7水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图11为混合凝胶Gel 8的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.6wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(4.0％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝20U/mL条件下，含有NY(0.3wt％)和SF(2.0％)的混合水凝胶Gel 8；Gel 8水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图12为混合凝胶Gel 9的凝胶化过程及其力学性能表征；(a)NYp溶液(0.6wt％，pH＝7.4)；(b)SF溶液(4.0％，pH＝7.4)；(c)在pH＝7.4，ALP＝40U/mL条件下，含有NY(0.3wt％)和SF(2.0％)的混合水凝胶Gel 9；Gel 9水凝胶的动态流变学测试(d)应变扫描和(e)频率扫描；
图13为不同钙离子(Ca2+)浓度仿生矿化后水凝胶材料的扫描电子显微镜(SEM)图像及能量色散谱(EDS)数据；(a)和(d)钙离子浓度为10mM；(b)和(e)钙离子浓度为20mM；(c)和(f)钙离子浓度为50mM。HA和仿生矿化前后的SF-NY gel(SF＝2.0％，NY＝0.3wt％，ALP＝10U/mL)和Ca-20gel(SF＝2.0％，NY＝0.3wt％，ALP＝10U/mL，Ca2+＝20mM)水凝胶的(g)X射线衍射分析，(h)傅里叶红外光谱分析和(i)X射线光电子能谱分析。
图14为(a)大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)在空白培养板、SF-NY gel和Ca-20gel表面培养1，4，7天后的死活染色荧光图像和(b)相对应的细胞密度统计；(c)SF-NY gel和Ca-20gel的细胞毒性测试(CCK8法)；
图15为qRT-PCR检测与成骨相关的基因和蛋白表达(a)Runx2，(b)Col1α，(c)OCN，(d)OPN；
图16为(a)大鼠股骨手术后4周和8周的二维Micro-CT图像和(b)三维重建的Micro-CT图像；(c)大鼠股骨手术后4周和8周的定量分析结果：骨密度(BMD)，骨体积与总组织体积比值(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁间隙(Tb.Sp)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
2-氯三苯甲基氯树脂(100～200目，0.3～0.8mmol/g)，Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH和HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)是从上海吉尔生化公司购买的；DIEA(N,N-二异丙基乙胺)从安耐吉公司购买；2-Naphthaleneactic acid从国药公司购买；其他有机溶剂是从江苏强盛公司订购的。
实施例1：蚕丝蛋白溶液的制备与纯化
(1)蚕丝脱胶
称取4.24g无水碳酸钠溶解于2L沸腾的去离子水中(Na2CO3的浓度0.02M)，加入5.0g蚕丝煮沸1小时，在煮沸的过程中要经常剥离蚕丝，使其避免纠缠成束。结束后，捞出蚕丝并用去离子水搓洗3-4次，室温条件下自然过夜风干，称量脱胶后的蚕丝重量为3.5g，约占蚕丝总重量的70％。
(2)蚕丝溶解
称取32.3g无水LiBr配制40mL浓度为9.3M的溶液，并用滤纸过滤。称取2g脱胶后的蚕丝加入到12mL LiBr溶液中，在60℃下加热缓慢搅拌4小时。
(3)溶液透析
首先，将透析袋用去离子水清洗2-3次；然后，将溶解在LiBr溶液中的蚕丝蛋白溶液加入到透析袋中，置入去离子水环境中进行透析，每隔一小时换一次去离子水，至少透析72小时。
(4)溶液浓缩
透析结束后，取出透析袋，将其放入到直径为20cm的结晶皿中，将PEG20000涂抹到透析袋表面进行吸水，待透析袋表面PEG 20000基本溶解后可再补加，至蚕丝蛋白溶液微黄即可。
(5)溶液离心
将浓缩后的蚕丝蛋白溶液转移到50mL离心管中，在4℃，9000r/min的条件下离心两次，每次20分钟，收集上层清液。
(6)浓度测定
称量干净的培养皿的质量，记为m0；移取1mL离心后的蚕丝蛋白溶液加入到培养皿中，称量其质量，记为m1。将含有蚕丝蛋白溶液的培养皿放置到60℃烘箱中过夜，取出后冷却到室温，称量其质量，记为m2。取5次平行样，计算其浓度的平均值，浓度计算公式如下：
Figure BDA0002608093530000081
表1
Figure BDA0002608093530000091
将制备得到的浓度为7.9％的蚕丝蛋白溶液作为储备液，用时稀释。蚕丝是从江苏省南通市新丝路蚕丝蚕业有限公司购买。无水碳酸钠、LiBr和PEG20000从国药公司购买。
实施例2：磷酸化小分子多肽NYp的固相合成
多肽分子NYp的合成过程如图1所示。根据所设计目标分子的序列，利用固相合成技术依次加入磷酸化酪氨酸(Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH)、苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)和二萘乙酸(Nap)结构单元，具体的合成步骤如下：
(1)树脂溶胀
称取0.5g 2-氯三苯甲基树脂加入到固相合成反应器中，在氮气的作用下，加入适量的无水二氯甲烷(DCM)溶胀树脂30分钟，然后挤出无水DCM并用无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次。
(2)接Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH
称取0.845g Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH溶于8mL的无水DMF中，再向其中加入0.76mL的DIEA，超声辅助溶解，待其完全溶解后加入到反应器中，在氮气流下反应1.5小时；之后挤出反应液体并用无水DMF洗涤4次。
(3)Block树脂
向反应器中加入Block溶液(DCM:MeOH:DIEA＝80:15:5)，在氮气流下反应10分钟，之后挤出Block反应液体；随后再次加入Block溶液反应10分钟，挤出Block反应液体，最后使用无水DMF洗涤树脂4次。
(4)脱保护基团Fmoc
将已配制好的20％哌啶溶液(哌啶:DMF＝20:80)加入到反应器中，在氮气流下反应30分钟，之后分别用20％哌啶溶液洗涤3次，无水DMF洗涤4次。
(5)接Fmoc-Phe-OH
称取0.678g Fmoc-Phe-OH和0.657g HBTU溶于8mL的无水DMF中，再向其中加入0.76mL的DIEA，超声辅助溶解，待其完全溶解后加入到反应器中，在氮气流下反应1小时；之后挤出反应液体并用无水DMF洗涤4次。
(6)脱保护基团Fmoc
将已配制好的20％哌啶溶液加入到反应器中，在氮气流下反应30分钟，之后分别用20％哌啶溶液洗涤3次，无水DMF洗涤4次。
(7)接Fmoc-Phe-OH
称取0.678g Fmoc-Phe-OH和0.657g HBTU溶于8mL的无水DMF中，再向其中加入0.76mL的DIEA，超声辅助溶解，待其完全溶解后加入到反应器中，在氮气流下反应1小时；之后挤出反应液体并用无水DMF洗涤4次。
(8)脱保护基团Fmoc
将已配制好的20％哌啶溶液加入到反应器中，在氮气流下反应30分钟，之后分别用20％哌啶溶液洗涤3次，无水DMF洗涤4次。
(9)接Fmoc-Gly-OH
称取0.52g Fmoc-Gly-OH和0.657g HBTU溶于8mL的无水DMF中，再向其中加入0.76mL的DIEA，超声辅助溶解，待其完全溶解后加入到反应器中，在氮气流下反应1小时；之后挤出反应液体并用无水DMF洗涤4次。
(10)脱保护基团Fmoc
将已配制好的20％哌啶溶液加入到反应器中，在氮气流下反应30分钟，之后分别用20％哌啶溶液洗涤3次，无水DMF洗涤4次。
(11)接Nap
称取0.326g Nap和0.657g HBTU溶于8mL的无水DMF中，再向其中加入0.76mL的DIEA，超声辅助溶解，待其完全溶解后加入到反应器中，在氮气流下反应1小时；之后挤出反应液体并用无水DMF洗涤4次。
(12)洗涤树脂
依次使用无水DCM，无水MeOH，无水n-hexane洗涤树脂5次，之后使用氮气吹干树脂。
(13)多肽分离
向反应器中加入95％的TFA溶液(TFA:H2O＝95:5)，在氮气流下反应2小时，之后收集反应液体并用95％的TFA溶液洗涤树脂3次，随后再利用空气泵吹干TFA并使用冰乙醚沉析目标产物。最后，再经过抽滤得到目标产物。
(14)产物提纯
使用分析兼半制备高效液相色谱仪(HPLC)分离提纯(水:乙腈＝80:20～0:100)，经冷冻干燥处理后，得到白色粉末NYp。
实施例3：
(1)称量10mg NYp溶解于玻璃小瓶中，通过加入适量的1mol/L NaOH调节pH使NYp完全溶解于超纯水中，形成澄清透明的溶液；随后加入适量的1mol/L HCl使体系的pH值在7.4左右，补加去离子水总体积定容为2mL，得到浓度为0.5wt％的NYp储备液。
(2)取一定量的浓度为7.9％蚕丝蛋白溶液加入到玻璃小瓶中，通过加入1mol/LNaOH调节pH值在7.4左右，超纯水定容，得到浓度为6.0％，pH＝7.4的SF储备液。
(4)移取5μL的SF储备液加入到玻璃小瓶中，然后分别移取30，48，60，120和180μLNYp储备液加入到SF溶液中，之后再加入3μL ALP，最后体积定容到300μL，得到SF的浓度为0.1％，NYp的浓度分别为0.05，0.08，0.1，0.2和0.3wt％的混合溶液。
(5)室温条件下，水平放置，通过倾斜和倒置玻璃小瓶法观察其凝胶化进程并记录。
(6)同样的方法，可以制得NYp的浓度为0.3wt％，SF的浓度分别为0.1，0.5，1.0和2.0％的混合溶液，室温条件下，观察凝胶状态并记录时间。
(7)此外，还可以得到NYp的浓度为0.3wt％，SF的浓度为2.0％，ALP的浓度分别为10，20和40U/mL的混合溶液，室温条件下，观察凝胶状态并记录时间。
流变学测试实验条件：
取300μL水凝胶样品放置到20mm的平行板上并在Thermo Scientific公司生产的HAAKE RheoStress 600流变仪上进行流变力学测试。测试时用的转子类型为PP20H，平板工作间隙为0.3mm，温度为25℃，模式为ControlledDeformation(CD)。应变扫描参数：频率为1.0Hz，应变扫描范围从0.01％到100％，step为30。频率扫描参数：应变为1.0％，频率扫描范围为0.1Hz到100Hz，Decade为9。
在ALP催化作用下不同浓度的NYp和SF溶液共自组装形成的凝胶性能如表2所示：
表2
Figure BDA0002608093530000121
aThe gelation process did not occur in 48 h
凝胶化过程及力学性能表征结果如图2～12所示，在室温和生理条件(pH＝7.4)下，浓度为2.0％的SF溶液至少需要14天才可以形成水凝胶(图3)。SF的浓度固定为0.1％，ALP的浓度固定为10U/mL，NYp的浓度变化为0.05、0.08、0.1、0.2和0.3wt％。实验研究结果表明，当NYp的浓度为0.05wt％时，不能诱导0.1％的SF溶液形成水凝胶。当NYp的浓度由0.08wt％增加到0.3wt％时，凝胶时间由15h缩减到0.2h，同时凝胶的储能模量(G’)由27Pa增加到165Pa(图4-7)。同样的，NYp的浓度固定为0.3wt％，ALP的浓度固定为10U/mL，改变SF溶液浓度为0.1％，0.5％，1.0％和2.0％时，凝胶时间从0.2h增加到0.5h，1h和4h；同时凝胶的储能模量(G’)由165Pa增加到607Pa，1582Pa和4865Pa(图7-10)。此外，还可以通过增加ALP的浓度，降低其凝胶时间和增加其力学性能。例如，当固定NYp的浓度为0.3wt％，SF的浓度为2.0％时，ALP的浓度从10U/mL增加到20U/mL和40U/mL，其凝胶时间从4h分别降低到3h和1.5h，同时凝胶的储能模量(G’)由4865Pa分别增加到5289Pa和6147Pa(图10-12)。这些实验研究结果表明，NYp是一种优异的凝胶因子前驱体，其不仅能在ALP的催化作用下触发超分子自组装形成NY超分子水凝胶；同时还能够协同诱导蚕丝蛋白共自组装，形成稳定的SF水凝胶。
实施例4：仿生矿化水凝胶的制备和表征
不同浓度矿化液的配制：(a)CaCl2＝10mM，β-GP＝6mM；(b)CaCl2＝20mM，β-GP＝12mM；(c)CaCl2＝50mM，β-GP＝30mM；待SF-NY水凝胶(NY＝0.3wt％，SF＝2.0％，ALP＝10U/mL)稳定后，分别加入矿化液a，b，c进行培养7天，分别记为Ca-10gel，Ca-20gel，Ca-50gel。
结果如图13所示，当Ca2+＝10mM时，一些少量的微晶在SF-NY凝胶材料的孔壁上出现(图13a)。当Ca2+＝20mM时，大量的微球状晶体在SF-NY水凝胶材料的孔壁上均匀分布(图13b)。但是当进一步增加Ca2+的浓度(Ca2+＝50mM)时，在SF水凝胶中观察到花状的聚集体(图13c)。EDS分析结果显示，当Ca2+＝10mM和Ca2+＝20mM时，钙和磷的原子比分别为1.69和1.66，接近于天然骨的主要无机成分羟基磷灰石的钙磷比1.67。然而，当Ca2+＝50mM时，钙和磷的原子比为1.39，低于羟基磷灰石的钙磷比1.67。这些实验结果表明，适量的Ca2+浓度对调节SF-NY水凝胶中磷酸钙晶体的成核和生长是至关重要的。为了研究仿生矿化后的Ca-20水凝胶中的晶相组成，进行了X-射线衍射(XRD)测试，结果如图13g所示。SF-NY水凝胶和Ca-20水凝胶在2θ＝20.5°处的较宽的衍射峰是蚕丝蛋白的特征衍射峰，表明蚕丝蛋白的二级结构是稳定的β-折叠结构。Ca-20水凝胶除了在20.5°处有一个较宽的衍射峰之外，还分别在31.9°、40°、46.9°和49.8°处出现了4个衍射峰，它们分别归属于羟基磷灰石(HA)的(211)、(310)、(222)和(213)。此外，傅里叶红外光谱(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)测试被用来进一步研究Ca-20水凝胶中矿物相的结构信息。从图13h中可以明显地看出，仿生矿化前后水凝胶的红外光谱图具有明显的差异。与SF-NY水凝胶相比，仿生矿化后的Ca-20水凝胶的红外光谱在1022cm-1、960cm-1、599cm-1和562cm-1处显示了四个新的吸收峰，这主要是由于磷酸盐基团的分子振动引起的。如图13i所示，对于SF-NY水凝胶和Ca-20水凝胶，分别在285eV、400eV和532eV处显示了三个峰，其分别归因于C1s，N 1s和O1s。此外，Ca-20水凝胶的XPS光谱分别在134eV、190eV、347eV和439eV处显示了四个峰，它们分别归因于P 2p，P2s，Ca 2p和Ca 2s。
实施例5：生物相容性评价
通过Live/Dead染色法评价混合水凝胶(SF-NY gel)和仿生矿化水凝胶(Ca-20gel)对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的细胞生物相容性。分别将80μL的SF-NY gel和Ca-20gel置于8孔玻璃共聚焦板(Nunc 155409)上，然后将细胞密度为1.5×104个/cm2的rBMSCs细胞种植到凝胶表面，之后将其置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每隔一天更换一次培养基。在培养1，4，7天后，利用钙黄绿素-AM/碘化丙锭-PI对细胞进行染色，在荧光显微镜(Olympus IX71，Olympus)下观察rBMSCs细胞在凝胶表面的形态并拍照记录，使用ImageJ软件计算细胞密度。通过CCK8法进一步评价SF-NY gel和Ca-20gel对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)分别在SF-NY gel和Ca-20gel表面的细胞活力和增殖。在培养1，4，7天后，将含有10％CCK-8溶液的培养液加入到12孔板中，在细胞培养箱中培养2小时后，从每个孔中吸取100μL的混合培养液加入到新的96孔板中，放入到Thermo Fisher Scientific多功能酶标仪中在波长为450nm下记录每个孔的光密度值(OD值)。
结果如图14所示，从细胞呈现绿色荧光和大多数细胞具有多面形态可以看出，种植的rBMSCs可以很好地粘附在SF-NY水凝胶以及Ca-20水凝胶表面，并且在培养1天之后，显示出良好的细胞活力。此外，随着培养时间的增加，rBMSC能够在水凝胶表面快速地生长和良好的增殖。例如，Ca-20水凝胶表面rBMSC的细胞密度从第1天的1.852×104cm-2增加到第7天的7.1067×104cm-2，略高于相应的SF-NY水凝胶和空白对照组(图14b)。CCK8法进一步证实了在Ca-20水凝胶表面培养的rBMSCs的高细胞活力(图14c)。这些实验结果表明，SF-NY水凝胶和Ca-20水凝胶具有良好的生物相容性，作为细胞培养支架材料时有利于rBMSC在其表面的粘附、生长和增殖。
实施例6：体外成骨分化评价
为了进一步评价仿生矿化后的Ca-20gel水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的成骨诱导能力，利用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测与成骨相关的基因和蛋白质表达，包括转录因子(Runx2)，I型胶原蛋白(Col1α)，骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)等。将300μL Ca-20水凝胶种到12孔板上，然后浸入新鲜DMEM中培养30分钟。之后除去培养基，在正常生长培养基中将细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在Ca-20水凝胶表面生长。培养24小时后，用骨诱导培养基替换正常培养基。在不同的时间点(4、7和14天)，使用TRIzol试剂盒(美国，Invitrogen)提取总RNA。然后按照制造商的说明，使用PrimeScriptRT试剂盒(日本TakaRa)将1μg总RNA反转录以获得互补的DNA。然后，使用SYBR Green qRT-PCR试剂盒(日本TakaRa)和ABI Step One Plus实时PCR系统(美国Applied Biosystems)进行qRT-PCR。实验数据通过2-ΔΔCt方法处理。GAPDH用作参考，每个样品重复三次。在相同条件下在SF-NY gel上培养的细胞和空白培养板作为对照组。
结果如图15所示，在培养1天后，Ca-20水凝胶与SF-NY水凝胶和空白对照组相比，成骨分化相关标志物(如Runx2、Col1α、OCN、OPN)的表达并没有显著的差异。然而当培养7天和14天后，成骨分化相关标志物(包括Runx2、Col1α、OCN和OPN)的表达均显著地上调。此外，当培养7天和14天后，Ca-20水凝胶表面培养的rBMSC的基因表达水平高于相应的SF-NY水凝胶组和空白对照组。这些实验结果表明，与SF-NY水凝胶和空白对照组相比，Ca-20水凝胶具有更好的促进成骨分化的能力，
实施例7：体内骨再生能力评价
术后观察4周和8周后，取出股骨并用10％福尔马林固定。使用微型CT机(mCT-80，Scanco Medical，Bassersdorf，瑞士)评估股骨的形态。CT参数设置如下，像素矩阵：1024×1024；分辨率：20μm。使用Scanco软件对扫描后的图像进行3D重建分析，分析骨密度(BMD)、骨体积与总组织体积比值(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)以及骨小梁间隙(Tb.Sp)。
结果如图16所示，在4周后，与SF-NY水凝胶组和空白对照组相比，植入Ca-20水凝胶组的股骨缺损部位形成了更多的新生骨组织。而且随着时间的增加，在骨缺损部位形成了更多的新生骨组织。此外，通过Micro-CT对新形成的骨组织做进一步的定量分析，如骨密度(BMD)，骨体积与总组织体积比值(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁间隙(Tb.Sp)。这些因素都是骨再生能力的重要评价指标。如图16c所示，分别在4周和8周时，与SF-NY水凝胶组和空白对照组相比，Ca-20水凝胶组具有最高的BMD、BV/TV、Tb.Th以及最低的Tb.Sp，这表明Ca-20水凝胶可以显著地促进大鼠股骨缺损部位的骨组织再生。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化的方法，其特征在于，包括如下步骤：在蚕丝蛋白溶液中添加自组装小分子多肽作为凝胶因子前驱体，得到蚕丝蛋白和自组装小分子多肽混合溶液，向所述的混合溶液中加入碱性磷酸酶，通过碱性磷酸酶脱除自组装小分子多肽分子上的磷酸基团，触发超分子自组装，诱导蚕丝蛋白共自组装形成蚕丝蛋白凝胶材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的自组装小分子多肽为2-萘乙酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-磷酸化酪氨酸、2-萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-磷酸化酪氨酸或2-萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-磷酸化酪氨酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合溶液中蚕丝蛋白的浓度为0.1％-2.0％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合溶液中自组装小分子多肽的浓度为0.05wt％-0.3wt％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性磷酸酶的添加量为10U/mL-40U/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合溶液的pH为7-8。
7.一种权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的蚕丝蛋白凝胶材料。
8.一种仿生矿化权利要求7所述的蚕丝蛋白凝胶材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：将蚕丝蛋白凝胶材料加入到矿化液中培养5-10天得到仿生矿化水凝胶，所述的矿化液包括10-40mM CaCl2和6-20mMβ-甘油磷酸酯。
9.一种权利要求8所述的方法制备得到的仿生矿化水凝胶。
10.权利要求9所述的仿生矿化水凝胶在制备机体组织修复材料中的应用。
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