CN113181435A - 一种基于螺旋聚异腈多肽仿生矿化复合水凝胶的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料,由螺旋聚异腈多肽经仿生矿化改性制得,所述螺旋聚异腈多肽,其结构式如式(I)所示。所述仿生复合材料中,羟基磷灰石在碱性磷酸酶的催化下沿着螺旋聚异腈多肽胶束表面生长,使得螺旋聚异腈多肽水凝胶的线性与非线性机械性能均得到增强。同时羟基磷灰石作为生物矿物为螺旋聚异腈多肽水凝胶提供了细胞粘附位点。此外,基于螺旋聚异腈多肽水凝胶应力刚化的特点,促进了胞外基质的强度对前成骨细胞行为的影响,从而赋予了羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽仿生复合材料培养并诱导成骨细胞分化的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种基于螺旋聚异腈多肽仿生矿化复合水凝胶的制备及其应用。
背景技术
细胞外基质(ECM)是细胞周围由胶原蛋白、蛋白聚糖等多种大分子组成的复杂网络,为细胞生存和发展提供物理支架和生物化学因子。生物组织(包括较软的脂肪以 及较硬的骨)和天然ECM,并非简单的线性弹性材料,而是具有复杂的非线性力学性 质,包括应力刚化、应力松弛和机械可塑性等。越来越多的实验表明,这些独特的机 械性质能够调控细胞的增殖、分化、迁移等行为,以及细胞与细胞基质间双向的相互 作用。因此。构建具有非线性力学性质的仿生胞外基质对组织工程和再生医学有重要 的意义。
螺旋聚异腈多肽(PIC)是一种与生物凝胶高度相似的人工合成水凝胶。PIC聚合物由半柔性的螺旋异腈主链与其上的乙二醇侧链组成。聚异腈多肽(PIC)水凝胶作为 一种具有良好的生物相容性、温敏性以及与生物聚合物类似的应力刚化性能的新型合 成聚合物材料克服了传统水凝胶的力学性能较差及组织粘附力弱等方面的不足,已经 在生物医学领域中的许多方面如伤口敷料、组织工程支架、药物输送以及细胞三维培 养等得到应用。
但PIC水凝胶自身的硬度相对较弱,通常小于1000Pa,不能够充分地模拟类似于软骨、骨骼等硬组织的机械物理环境。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶及其制备方 法与应用。本发明构建了一种基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶材料,其中羟基磷灰石结合在螺旋聚异腈多肽胶束表面,增强了螺旋聚异腈多肽水凝胶的机械性 能同时提供了细胞粘附位点,赋予了羟基磷灰石和螺旋聚异腈多肽仿生复合材料调控 细胞行为的能力,并将其做为仿生胞外基质应用于骨组织工程领域。
本发明所提供的基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料,由螺旋聚异腈多肽经仿生矿化改性制得,
所述螺旋聚异腈多肽,其结构式如式(I)所示:
式(I)中,n表示聚合度,n=50~50000,具体可为200-8000;x=2-4,具体可为 3。
所述仿生复合材料中,羟基磷灰石在碱性磷酸酶的催化下沿着螺旋聚异腈多肽胶束表面生长。
上述基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料通过包括如下步骤的方法制备得到:
1)将螺旋聚异腈多肽溶于缓冲溶液,使其浓度为0.8mg/mL;
所述螺旋聚异腈多肽,其结构式如式(I)所示:
式(I)中,n表示聚合度,n=50~50000,具体可为200-8000;x=2-4;
2)向所得体系中加入氯化钙与β-甘油磷酸钠,使钙离子浓度为0.4-2.4M(具体 可为0.4-2.0M、0.6-1.6M、0.6M或0.8M);加入碱性磷酸酶,使碱性磷酸酶的浓度为 7.5U/mL;
3)将所得混合溶液孵育,得到羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽仿生复合材料。
上述方法步骤1)中,所述缓冲溶液具体可为Tris缓冲液和2M氯化镁溶液的混 合溶液,Tris缓冲液和2M氯化镁溶液的体积比可为5:1,
上述方法步骤3)中,所述孵育的温度可为25-45℃,时间可为5min-5h,具体 可为在37℃环境下孵育30分钟。
上述基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料在调控细胞行为中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中,所述调控细胞行为具体可为:将前成骨细胞培养、分化至成骨细胞。
上述基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料在构建仿生胞外基质制备骨组织工程材料中的应用也属于本发 明的保护范围。
本发明的实质特点为:基于螺旋聚异腈多肽,构建了一种可以调控细胞行为的仿生矿化水凝胶体系。在该体系中,羟基磷灰石在碱性磷酸酶的催化下沿着螺旋聚异腈 多肽胶束表面生长,使得螺旋聚异腈多肽水凝胶的线性与非线性机械性能均得到增强。 同时羟基磷灰石作为生物矿物为螺旋聚异腈多肽水凝胶提供了细胞粘附位点。此外, 基于螺旋聚异腈多肽水凝胶应力刚化的特点,促进了胞外基质的强度对前成骨细胞行 为的影响,从而赋予了羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽仿生复合材料培养并诱导成骨细胞 分化的能力。
本发明的有益效果为:利用螺旋聚异腈多肽的生物相容性与应力刚化的性能,通过仿生矿化的方式增强了其机械性能,包括线性区域的温敏特性和非线性区域应力刚 化特性,并使其具备了细胞粘附位点。因此,相较于单独的螺旋聚异腈多肽水凝胶, 细胞在羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽复合材料上粘附情况更好,存活率更高。此外,由 于细胞行为受到胞外基质的影响,培养在羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽复合材料上的前 成骨细胞分化至成骨细胞,并表达出相应的mRNA。因此,羟基磷灰石/螺旋聚异腈 多肽仿生复合材料能够构建仿生胞外基质并应用于骨组织工程。
附图说明
图1为本发明实施例1中螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料的存储模量与温度的关系(图1a),积分模量与施加应力的关系(图1b),压缩模量与压缩应变的关系(图 1c)和羟基磷灰石物理交联PIC网络(图1d)。
图2为本发明实施例2中观察到的螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料的表面形貌的变化。a,单独的PIC水凝胶,b,钙离子浓度为1.6M的PIC/HA复合材料。
图3为本发明实施例3中观察到的前成骨细胞在螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料上培养后的表面形貌。
图4为本发明实施例3中在不同HA含量的PIC/HA复合材料上的成骨细胞的碱 性磷酸酶,骨钙素以及Collagen 1α蛋白表达量。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明提供一种基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料,由螺旋聚异腈多肽经仿生矿化改性制得,
所述螺旋聚异腈多肽,其结构式如式(I)所示:
式(I)中,n表示聚合度,n=50~50000,具体可为200-8000;x=2-4,具体可为 3。
所述仿生复合材料中,羟基磷灰石在碱性磷酸酶的催化下沿着螺旋聚异腈多肽胶束表面生长。
上述基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料在调控细胞行为中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中,所述调控细胞行为具体可为:将前成骨细胞培养、分化至成骨细胞。
上述基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料在构建仿生胞外基质制备骨组织工程材料中的应用也属于本发 明的保护范围。
下述实施例中所使用的螺旋聚异腈多肽具体为:所述n=200-8000;x=3。缩写为PIC,其结构如式(II)所示:
式(Ⅳ)化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的:
在反应瓶中依次加入2mL四氢呋喃,100mg的PIC单体(H.Yuan,J.Xu,E.P. vanDam,G.Giubertoni,Y.L.A.Rezus,R.Hammink,H.J.Bakker,Y.Zhan,A. E.Rowan,C.Xing,P.H.J.Kouwer,Macromolecules 2017,50,9058-9065.), 然后加入催化剂高氯化镍(2mg,0.8mmol),在室温条件下反应48-96小时。反应产 物用异丙醚洗涤3次,得到PIC。不同n值的PIC可通过催化剂高氯化镍与单体的比 例制得。
实施例1、
仿生矿化螺旋聚异腈多肽水凝胶,测量其线性与非线性机械性能的变化,温度扫描范围为5-40℃,升温速率为1.0℃/min,应变为4%,频率为1.0Hz,应力施加范围 为0.5-200Pa。
(a)将80μL 4M氯化钙溶液和40μL 4Mβ-甘油磷酸钠溶液加入40μL超纯水中, 再加入5μL Tris缓冲液和1μL 2M氯化镁溶液,最后加入40μL 4mg/mL螺旋聚异腈多 肽,用移液枪吹匀置于冰上。
(b)在上述混合溶液中加入1.5μL 1U/μL碱性磷酸酶,用移液枪吹匀,孵育30min;
(c)用DHR-2型旋转流变仪测量步骤(b)种样品的线性与非线性机械性能。
图1为本发明实施例1中螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料的模量(图1a), 积分模量(图1b),压缩模量(图1c)和羟基磷灰石物理交联PIC网络(图1d)。
由图1a可知,与单独的PIC水凝胶相比,螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料 的模量提高了200倍左右。由图1b可得,在非线性方面,临界应力左移,说明复合材 料可以响应更小的应力。图1c说明PIC/HA复合材料是粘弹性材料,并对形变更敏感。 由图1d可知,PIC水溶液受热时会形成凝胶,降温时恢复成液态。HA的物理交联作 用使HA/PIC复合材料不会在降温时恢复成液体,增加了其稳定性。
实施例2、观察螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料的表面形貌的变化。
(a)通过实施例1中的方法分别制备不同HA含量的PIC/HA复合材料。
(b)将得到的PIC/HA复合材料用液氮骤冷,之后在冻干机中冻干。
(c)用扫描电子显微镜观察步骤(b)得到样品。
图2为本发明实施例2中观察到的螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料的表面形貌的变化。a,单独的PIC水凝胶,b,钙离子浓度为1.6M的PIC/HA复合材料。
由图2可知,HA沿PIC凝胶胶束生长,球状的HA晶体出现在水凝胶中并与凝 胶网络良好结合。
实施例3、观察前成骨细胞在螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料上培养后的表面形貌。
(a)通过实施例1中的方法分别制备不同HA含量的PIC/HA复合材料。
(b)将前成骨细胞MC3T3-E1细胞悬浮液加在PIC/HA复合材料表面,并置于培 养箱中孵育24h。
(c)将上述步骤(b)得到的样品的培养基吸出,加入多聚甲醛4℃固定4h。然 后加入液氮骤冷,之后在冻干机中冻干。
(d)用扫描电子显微镜观察上述步骤(c)得到的样品。
图3为本发明实施例3中观察到的前成骨细胞在螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料(钙离子浓度为0.6M)上培养后的表面形貌。
图3a可以看出:细胞在单独的螺旋聚异腈多肽水凝胶表面呈球形,说明前成骨细胞无法粘附在PIC水凝胶表面。在图3b中可以观察到细胞的丝状伪足,说明相较于单 独的PIC水凝胶,PIC/HA复合材料更适合细胞粘附与生长。
实施例4、通测量碱性磷酸酶,骨钙素以及Collagen 1α蛋白的含量来表征前成骨细胞在螺旋聚异腈多肽/羟基磷灰石复合材料上的分化程度。
(a)通过实施例1中的方法分别制备不同HA含量的PIC/HA复合材料。
(b)将前成骨细胞MC3T3-E1细胞悬浮液加在PIC/HA复合材料表面,并置于培 养箱中孵育24h。
(c)在上述步骤(b)中的样品中加入碱性磷酸酶染色试剂,在37℃环境中避光 孵育15分钟。之后吸取上清液并用紫外分光光度计观察吸光度。
(d)将上述步骤(b)中样品的培养基吸出,加入200μLTrizol试剂,静置3-5分 钟,用无RNA的枪头吹打。
(e)在上述步骤中得到的液体中加入1/5体积的三氯甲烷,震荡摇匀后,室温静 置5分钟。之后在4℃以12000r离心5分钟。
(f)取上述步骤(e)得到样品的上清液,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室 温静置10分钟。之后在4℃以12000r离心10分钟。
(g)取上述步骤得到样品的沉淀,置于离心管中干燥,之后溶解于40-100μL DEPC水中。
(h)在上述步骤(g)得到的样品中加入反转录试剂,之后在70℃保温5分钟后 迅速在冰上冷却2分钟,随后在42℃水浴60分钟,最后在95℃加热5分钟以终止反 应。
(i)在上述步骤(h)得到的样品中加入碱性磷酸酶,骨钙素以及Collagen 1α蛋 白的正反两种引物和荧光检测试剂盒,之后用实时荧光定量逆转录仪测量三种mRNA 的含量。
图4为本发明实施例3中在不同HA含量的PIC/HA复合材料上的成骨细胞的碱 性磷酸酶,骨钙素以及Collagen 1α蛋白表达量。
由图4a可以看出,相较于单独的PIC水凝胶,在PIC/HA复合材料上培养的成骨 细胞分泌出的碱性磷酸酶经由染色后颜色更深。图4b是经由紫外分光光度计得到的碱 性磷酸酶的表达量。图4c,d,e说明了在不同矿化程度的PIC/HA复合材料上,碱性 磷酸酶,骨钙素以及Collagen 1α蛋白的表达量不同,意味着细胞的分化程度不同。碱 性磷酸酶,骨钙素以及Collagen 1α蛋白是成骨细胞形成过程中分泌的mRNA,因此,PIC/HA仿生复合材料可以诱导前成骨细胞分化。由图4说明钙离子浓度为0.8mol/L 时制备得到的复合材料的诱导前成骨细胞分化的活性最好。
Claims (9)
1.一种基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,为:基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤1)中,所述缓冲溶液为pH值9.8的Tris缓冲液和2M氯化镁溶液的混合溶液,Tris缓冲液和2M氯化镁溶液的体积比为5:1。
5.根据权利要求3或4所述的方法,其特征在于:所述缓冲溶液中,螺旋聚异腈多肽的浓度为0.8mg/mL;钙离子浓度为0.4-2.4M。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法,其特征在于:步骤3)中,所述孵育的温度为25-45℃,时间为5min-5h。
7.权利要求1或2所述的基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料在调控细胞行为中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述应用中,所述调控细胞行为为:将前成骨细胞培养、分化至成骨细胞。
9.权利要求1或2所述的基于螺旋聚异腈多肽的仿生矿化复合水凝胶,即,基于羟基磷灰石/螺旋聚异腈多肽的仿生复合材料在构建仿生胞外基质制备骨组织工程材料中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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