CN111909239A - 具有细菌絮凝和抗菌性能的自组装多肽分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有细菌絮凝和抗菌性能的自组装多肽分子及其应用，本发明基于色氨酸分子丰富的非共价键作用能力以及良好的与脂质膜相互作用能力，设计合成了可使革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细菌絮凝同时具有抗菌活性的自组装多肽分子。本发明的系列分子可在pH 7.4的水溶液中，经碱性磷酸酶作用后发生自组装凝胶化形成稳定水凝胶材料，且分子的去磷酸化和自组装可增强其絮凝活性。本发明的自组装多肽分子具有良好的细菌絮凝和抗菌活性，成分单一、不需要复杂的额外化学修饰。该系列分子由于其生物学来源、序列短小，而具有良好生物相容性、生物降解性以及易于合成生产等优点，具有作为一种高效、环保的新型细菌絮凝剂的应用潜力。

Description

具有细菌絮凝和抗菌性能的自组装多肽分子及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有细菌絮凝和抗菌性能的自组装多肽分子及其应用，属于絮凝剂技术领域。
背景技术
絮凝即将胶体或其他悬浮在液体中的颗粒聚集在一起，形成更大的颗粒(或絮凝体)，以促进这些颗粒从稳定的悬浮液中沉降的过程。而细菌絮凝的机理与细菌粘附到表面的机制密切相关，如聚合物对细菌的絮凝可以看作是细菌通过吸附在其表面的絮凝剂相互粘附的过程，目前研究对细菌絮凝现象的解释主要为絮凝剂与细菌间的电荷吸引中和以及桥联作用。而悬浮胶体颗粒和病原微生物通常是原水中的主要污染物。因此，有效的去除浊度和有效的杀菌是饮用水处理的主要任务。生产饮用水的传统工艺流程包括混凝/絮凝、沉淀、砂滤和消毒。通过加入絮凝剂，可以有效地去除浊度，从而启动混凝/絮凝过程，从而澄清水。水处理厂常用的氯等消毒剂可以有效地控制和杀死大多数微生物。然而，随着全球工业的快速发展，原水的质量已经严重恶化。为达到国家饮用水卫生标准，必须大量使用絮凝剂和消毒剂。这不仅意味着更高的处理成本，而且还意味着更大的二次污染风险，对人类健康造成不利后果，例如在氯消毒过程中产生的消毒副产品。此外，不同的水处理程序中需要不同类型的化学药剂。例如，在饮用水处理的基本步骤混凝/絮凝和消毒过程中，应相应地使用混凝剂/絮凝剂和消毒剂。然而，功能单一的传统药剂常常操作困难，所需剂量高，从而增加最终成本。而且，所使用的不同化学品之间还可能产生相互抑制，降低实际处理效率。因此，应用具有絮凝和抗菌等两种或两种以上功能的水处理剂具有科学和实际意义。絮凝通常是水净化的第一步，由于其简便、经济、高效的特点而成为了水处理技术中最常用和最重要的技术之一。而絮凝剂是决定絮凝效果乃至整个水处理效果的关键因素之一。因此，开发高效、低成本、环保、多功能的新型絮凝剂具有重要意义。
目前，用于处理水中细菌等微生物的絮凝剂一般可分为三大类：i)无机絮凝剂，如明矾和聚合氯化铝；ii)合成有机絮凝剂，如聚丙烯酰胺(PAM)和聚乙烯亚胺(PEI)；iii)天然高分子絮凝剂，如壳聚糖、淀粉、海藻酸钠、纤维素、木质素、单宁等。
在目前水处理中常用絮凝剂中，传统的絮凝剂，如无机金属絮凝剂和合成有机高分子絮凝剂，没有明显的杀菌作用。此外，由于使用过程中残留的金属离子或有害的聚合单体会释放到目标水中，它们本身带有一定的健康风险。例如，丙烯酰胺单体对人体具有致癌性和神经毒性，铝盐絮凝剂可诱发阿尔茨海默病。而天然高分子絮凝剂大多水溶性不好，如纤维素不溶于水、壳聚糖仅可溶于酸性水中、淀粉不溶于冷水等；而且由于自身絮凝及抗菌絮凝较差或不具抗菌性(如淀粉)，其絮凝和抗菌性能常需通过使用阳离子基团(如季铵盐衍生物)进行复杂的化学接枝修饰来实现或增强。
此外，目前虽对具有抗菌活性的天然或人工合成多肽已有大量的报道，但对于多肽尤其是自组装短肽促使细菌产生絮凝或聚集的报道却仍极少。
发明内容
针对目前水处理中常用细菌絮凝中，无机金属絮凝剂和合成有机高分子絮凝剂无抗菌活性且具有潜在毒性以及天然高分子絮凝剂普遍水溶性较差、常需要额外的化学修饰增强细菌絮凝及抗菌活性的问题，且目前对于同时具有细菌絮凝及抗菌活性的多肽尤其是自组装短肽仍鲜有报道，本发明基于色氨酸分子丰富的非共价键作用能力以及良好的与脂质膜相互作用能力，设计合成了可使金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌)细菌絮凝同时具有抗菌活性的自组装多肽分子。
本发明的第一个目的是提供一种具有细菌絮凝和抗菌性能的自组装多肽分子，具有如下通式：
Figure BDA0002608626690000031
其中，R1、R2分别选自
Figure BDA0002608626690000032
中的一种。
本发明的第二个目的是提供所述的自组装多肽分子的制备方法，所述的方法是采用固相合成方法，依次连接磷酸化酪氨酸、赖氨酸、待合成氨基酸以及2-萘乙酸，合成所述的自组装多肽分子，所述的待合成氨基酸中至少包括一个色氨酸。
本发明的第三个目的是提供所述的自组装多肽分子在抗菌絮凝剂中的应用。
进一步地，所述的应用是将自组装多肽分子溶液添加到待处理溶液中，搅拌处理进行絮凝。
进一步地，所述的自组装多肽分子的添加浓度为不低于25μg/mL。
进一步地，所述的应用中还包括在添加自组装多肽分子溶液到待处理溶液中之前，添加碱性磷酸酶到自组装多肽分子溶液中进行孵育。
在自组装多肽分子的细菌絮凝应用中，一般直接利用自组装多肽分子与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌相互作用，达到显著的细菌絮凝作用；也可添加碱性磷酸酶，如果自组装多肽分子样品浓度较低，分子不足以形成凝胶，在经碱性磷酸酶去磷酸化后发生自组装形成了纳米纤维结构，如果自组装多肽分子样品浓度高，则会形成凝胶，但是一般在絮凝应用过程中无需形成凝胶状。
本发明的第四个目的是提供所述的自组装多肽分子在制备水凝胶材料中的应用。
进一步地，所述的水凝胶材料是通过添加碱性磷酸酶到所述的自组装多肽分子溶液中制备得到。
进一步地，所述的自组装多肽分子溶液的pH为6-8。
本发明的第五个目的是提供一种所述的自组装多肽分子制备得到的水凝胶材料。
本发明的有益效果：
本发明的系列分子可在pH 7.4的水溶液中，经碱性磷酸酶作用后发生自组装凝胶化形成稳定水凝胶材料，且分子的去磷酸化和自组装可增强其絮凝活性。本发明的自组装多肽分子具有良好的细菌絮凝和抗菌活性，成分单一、不需要复杂的额外化学修饰。该系列分子由于其生物学来源、序列短小，而具有良好生物相容性、生物降解性以及易于合成生产等优点，具有作为一种高效、环保的新型细菌絮凝剂的应用潜力。
附图说明
图1为多肽分子的固相合成步骤；
图2为多肽分子凝胶过程，(A，C，E)凝胶因子前驱体FWYp，WWYp，WFYp在最低成胶浓度下的溶液(pH＝7.4)和由碱性磷酸酶(10units/mL)触发形成的FWY，WWY，WFY超分子水凝胶(B，D，F)；
图3为多肽水凝胶(1.0wt％)动态流变测试图；(A)应力扫描下的流变力学测试；(B)率扫描下的流变力学测试；
图4为不同浓度的多肽分子溶液对(A)金黄色葡萄球菌和(B)大肠杆菌的细菌絮凝效果；
图5为不同浓度的多肽分子对金黄色葡萄球菌(A，B)和大肠杆菌(C，D)抗菌活性稀释涂布平板菌落计数统计图及琼脂平板上形成的细菌菌落图片；
图6为(A)不同浓度多肽分子及(B)1wt％多肽自组装水凝胶的细胞毒性；
图7为相同浓度(200μg/mL)的各样品对(A)金黄色葡萄球菌和(B)大肠杆菌的细菌絮凝率随时间变化情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：多肽分子的固相合成
多肽分子的合成过程如图1所示。在分子合成的过程中，根据所设计分子的序列，利用固相合成技术依次加入磷酸化酪氨酸[Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH)]、赖氨酸[Fmoc-Lys(Boc)-OH]、苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)或色氨酸[Fmoc-Trp(Boc)-OH]、色氨酸[Fmoc-Trp(Boc)-OH]或苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)和2-萘乙酸分子结构单元，具体制备过程如下：
i)快速称取1000mg 2-氯三苯甲基氯树脂(目数为100～200目，取代度为0.8-1.5mmol/g)于干燥的固相合成反应器中，加入适量无水二氯甲烷(常压蒸馏分析纯二氯甲烷获得)，在氮气的作用下溶胀树脂30分钟，随后，除去无水二氯甲烷并加入无水DMF(HPLC级)洗涤树脂三次；
ii)称取Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH 1691.9mg(3.5mmol)溶于无水DMF中，再加入DIEA1.52mL(8.75mmol)，超声溶解并充分混匀后加入到反应器中，氮气鼓动下反应2小时，除去反应液并用无水DMF洗涤树脂三次；
iii)向树脂中加入由DCM:MeOH:DIEA＝16:3:1(v/v)配制的Block溶液，氮气震荡反应10分钟后除去Block溶液，此步骤进行两次。之后，除去Block溶液并用无水DMF洗涤树脂三次；
iv)配制20％的哌啶DMF溶液，取适量体积加入树脂中，通入氮气震荡30分钟，依次用20％的哌啶DMF溶液和无水DMF洗涤树脂三次；
v)称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 1639.9mg(3.5mmol)和HBTU 1327.3mg(3.5mmol)超声溶解于适量无水DMF中，加入DIEA 1.52mL，混合均匀后快速加入到反应器中，氮气震荡2小时后，除去反应溶液并用无水DMF洗涤树脂三次；
vi)向树脂中加入适量20％的哌啶DMF溶液，氮气震荡30分钟后，依次用20％的哌啶DMF溶液和无水DMF洗涤树脂三次；
vii)称取Fmoc-Phe-OH 1356.0mg或Fmoc-Trp(Boc)-OH 1843.0mg(3.5mmol)和HBTU1327.3mg(3.5mmol)超声溶解于适量无水DMF中，加入DIEA1.52mL，混合均匀后快速加入到反应器中，氮气震荡2小时后，除去反应溶液并用无水DMF洗涤树脂三次；
viii)向树脂中加入适量20％的哌啶DMF溶液，氮气震荡30分钟后，依次用20％的哌啶DMF溶液和无水DMF洗涤树脂三次；
ix)称取Fmoc-Trp(Boc)-OH 1843.0mg或Fmoc-Phe-OH 1356.0mg(3.5mmol)和HBTU1327.3mg(3.5mmol)超声溶解于适量无水DMF中，加入DIEA 1.52mL,混合均匀后快速加入到反应器中，氮气震荡2小时后，除去反应溶液并用无水DMF洗涤树脂三次；
x)向树脂中加入适量20％的哌啶DMF溶液，氮气震荡30分钟后，依次用20％的哌啶DMF溶液和无水DMF洗涤树脂三次；
xi)称取2-萘乙酸651.7mg(3.5mmol)和HBTU 1327.3mg(3.5mmol)超声溶解于适量无水DMF中，加入DIEA 1.52mL,混合均匀后快速加入到反应器中，氮气震荡2小时，除去反应溶液；
xii)依次用无水DMF、无水二氯甲烷、无水甲醇和正己烷分别洗涤树脂五次。洗涤结束后，用氮气吹干树脂；
xiii)向吹干的树脂中加入95％的TFA水溶液(TFA:水＝95:5)，氮气震荡2小时后，收集上述反应后的液体于烧杯中，用95％TFA水溶液洗涤树脂两次并收集液体；
xiv)用空气泵吹干除去烧杯中的溶剂，加入适量冰无水乙醚并于-20℃下沉析过夜，抽滤，收集粉末样固体，使用分析兼半制备高效液相色谱仪(HPLC)分离提纯(水:乙腈＝80:20～0:100)，冷冻干燥机浓缩干燥后，得到白色固体粉末，总产率约为40％。
按照上述步骤，分别合成了2-萘乙酸-苯丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-磷酸化酪氨酸(NapFWKYp，用FWYp表示)、2-萘乙酸-色氨酸-色氨酸-赖氨酸-磷酸化酪氨酸(NapWWKYp，用WWYp表示)和2-萘乙酸-色氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-磷酸化酪氨酸(NapWFKYp，用WFYp表示)三种多肽分子。
实施例2：多肽分子的凝胶测试
称取一定量的纯化后的多肽样品粉末置于小样品瓶中，加入适量超纯水，超声并用NaOH(1M)和HCl(1M)调节pH至7.4使样品充分溶解，再加入2μL的碱性磷酸酶(ALP)，使最终体积为200μL得到具有一定浓度的多肽多肽样品溶液，室温下静置，通过倾斜倒置观察法判断其凝胶化情况。
结果如图2所示，所设计三个分子FWYp，WWYp，WFYp在pH 7.4的水溶液中由碱性磷酸酶(10units/mL)触发，自组装形成稳定超分子水凝胶的最低浓度分别为0.3wt％、0.6wt％、0.8wt％。
实施例3：多肽自组装水凝胶的力学性能测试
移取200μL的多肽自组装水凝胶(浓度均为1wt％)于样品台上，使用ThermoScientic HAAKE RheoStress 6000流变仪进行流变学实验。测试时选择型号为PP20H转子，平板间隔距离为0.2mm。25℃条件下，频率设为6.282rad/s并在0.1～10％应变扫描范围内进行动态应变扫描测试。动态频率扫描测试是在20～0.1rad/s的频率扫描范围内以1.0％的固定应力下进行的，以确保动态粘弹性的线性。
结果如图3所示，在应力扫描(图3A)及频率扫描(图3B)动态流变测试中，样品储能模量(G’)均远高得于其损耗模量(G”)，即说明三个分子通过自组装均形成了稳定水凝胶且表现出显著的粘弹特性。
实施例4：多肽分子的细菌絮凝活性测试
制备浓度为5000μg/mL的各多肽分子样品母液(pH＝7)。将培养过夜的大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)通过离心(5000转/分，5分钟)除去培养基，用生理盐水(0.9％NaCl溶液)洗涤两次，再用生理盐水重悬并稀释至酶标仪测定光密度(OD)值(波长为600nm)为1左右，分别加入到各2mL离心管中，并向各管加入一定量的各样品母液及生理盐水，配制成含特定浓度样品分子的细菌悬浮液(测试浓度：0，25，50，100，200，300，400，500μg/mL)。用旋涡搅拌器(2000转/分，5秒)搅拌，确保混合均匀，在液面下1.0厘米深度处收集样品，并用酶标仪测定OD值(OD0)。之后，在震荡摇床上以200转/分的转速快速摇晃5分钟，然后以50转/分的转速缓慢摇晃15分钟。最后，将混合物静置120分钟。在上清液中1.0厘米深度处收集样品，并用酶标仪测定OD值(OD1)。细菌絮凝率定义为菌液光密度的相对减少百分比，即絮凝率(％)＝[(OD0-OD1)/OD0]*100。本实验中选用商业絮凝剂聚合氯化铝(PAC)作为实验对照。
结果如图4所示，FWYp，WWYp和WFYp在浓度最低为25μg/mL时即表现出一定的絮凝效果，此时，其对金黄色葡萄球菌的絮凝率分别为17.2％，9.0％和12.5％；而对大肠杆菌的絮凝率分别为40.4％，37.2％和23.8％。进一步提高这些多肽样品的浓度可以提高细菌絮凝效率。例如，当分子浓度增加到500μg/mL时，FWYp、WWYp、WFYp对金黄色葡萄球菌的絮凝率分别为83.5、83.7、80.6％，对大肠杆菌的絮凝率为78.8、76.4、75.9％。结果表明，这些多肽能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌相互作用，并产生显著的细菌絮凝作用，且其效率与商用絮凝剂聚合氯化铝(PAC)相当。
实施例5：多肽分子的抗菌活性测试
选用大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)作为实验用菌，并使用稀释涂布平板法测定各多肽分子的抗菌效果。制备浓度为5000μg/mL的各多肽分子样品母液。将培养至指数增长期的细菌悬浊液离心(5000转/分，5分钟)除去培养基，使用生理盐水洗涤两次，再用生理盐水重悬并稀释。向等量的细菌悬浮液(5×105CFU/mL)中加入一定量的样品母液及生理盐水至特定浓度，于37℃培养箱中摇晃孵育2小时。2小时后，将共孵育菌液连续稀释200倍，并移取100μL均匀涂布在琼脂平板上，每组平行三板，于37℃下孵育18小时。随后，对形成的菌落计数和拍照，只使用生理盐水孵育的细菌作为空白对照组。
结果如图5所示，各多肽分子对金黄色葡萄球菌(图5A，5B)及大肠杆菌(图5C，5D)均表现出一定的抗菌活性，其抗菌活性均随浓度的增大而逐渐增强。此外，各多肽分子对金黄色葡萄球菌的抗菌性强于大肠杆菌。
实施例6：多肽分子及自组装水凝胶的CCK-8细胞毒性实验
选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为细胞毒性实验的细胞模型。将HUVEC细胞(2×104CFU/mL)种植在96孔板中，向培养液中加入一定量提前配制好的多肽分子样品溶液(测试样品浓度：250,500,750μg/mL)，置于37℃的恒温培养箱中分别培养24小时。对于凝胶样品，则先将浓度为1wt％的各多肽水凝胶制备于96孔板各孔中(每孔75μL)，静置24小时，使凝胶稳定。向各含有凝胶的各孔中植入细胞，置于37℃的恒温培养箱中分别培养24小时、48小时和72小时。培养期间，每天更换一次培养液。培养完成后，分别向每个孔中加入CCK-8染色剂并于37℃恒温培养箱中温育2小时。细胞染色结束后，通过在450nm下，利用酶标仪测试其光密度。实验中所测细胞的活性用实验的样品组与未处理的对照组的细胞活性百分比表示。其中，未处理的对照组细胞活性设为100％。所有样品都设有至少5个平行试验组且该实验至少重复三次。
结果如图6所示，HUVEC细胞与不同浓度的FWYp、WWYp和WFYp共培养24h，细胞存活率均高于90％(图6A)。且将细胞植入FWY、WWY或WFY(1wt％)自组装水凝胶的表面，在37℃孵育24、48和72h后，细胞仍具有较高的存活率(图6B)。该研究结果表明各多肽分子及其自组装水凝胶均具有良好的细胞生物相容性。
实施例7：
制备浓度为2000μg/mL的各多肽分子及其自组装体样品母液(pH＝7)。将培养过夜的大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)通过离心(5000转/分，5分钟)除去培养基，用生理盐水(0.9％NaCl溶液)洗涤两次，再用生理盐水重悬并稀释至酶标仪测定光密度(OD)值(波长为600nm)为1左右，分别加入到各10mL离心管中，并向各管加入一定量的各样品母液及生理盐水配制成含样品分子浓度均为200μg/mL的细菌悬浮液。用旋涡搅拌器(2000转/分，5秒)搅拌，确保混合均匀，在液面下2.0厘米深度处收集样品，并用酶标仪测定OD值(OD0)。之后，在震荡摇床上以200转/分的转速快速摇晃5分钟，然后以50转/分的转速缓慢摇晃15分钟。最后，将混合物静置并每隔20分钟在液面下2.0厘米深度处收集样品，并用酶标仪测定OD值(OD1)(取样时间点：20，40，60，80，100，120，140，160，180min)。细菌絮凝率定义为菌液光密度的相对减少百分比，即絮凝率(％)＝[(OD0-OD1)/OD0]*100。本实验中选用商业絮凝剂聚合氯化铝(PAC)作为实验对照。
结果如图7所示在没有多肽样品的情况下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液中的细菌均分散良好。但是，在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的悬浮液中添加FWYp，WWYp或WFYp会导致细菌絮凝，并且它们的絮凝率会在180分钟内随时间逐渐增加。此外，将FWYp，WWYp或WFYp以及ALP一起添加到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌悬液中后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液中的细菌比用FWYp，WWYp或WFYp处理的细菌更快地发生凝结并形成细菌絮凝。这表明多肽的自组装增强了其絮凝活性，这是由于在酶触发的脱磷酸作用后增加了分子的阳离子电荷密度并形成了自组装纳米结构。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种具有细菌絮凝和抗菌性能的自组装多肽分子，其特征在于，具有如下通式：
Figure FDA0002608626680000011
其中，R1、R2分别选自
Figure FDA0002608626680000012
中的一种。
2.一种权利要求1所述的自组装多肽分子的制备方法，其特征在于，所述的方法是采用固相合成方法，依次连接磷酸化酪氨酸、赖氨酸、待合成氨基酸以及2-萘乙酸，合成所述的自组装多肽分子，所述的待合成氨基酸中至少包括一个色氨酸。
3.权利要求1所述的自组装多肽分子在抗菌絮凝剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用是将自组装多肽分子溶液添加到待处理溶液中，搅拌处理进行絮凝。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的自组装多肽分子的添加浓度为不低于25μg/mL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用中还包括在添加自组装多肽分子溶液到待处理溶液中之前，添加碱性磷酸酶到自组装多肽分子溶液中进行孵育。
7.权利要求1所述的自组装多肽分子在制备水凝胶材料中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的水凝胶材料是通过添加碱性磷酸酶到所述的自组装多肽分子溶液中制备得到。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的自组装多肽分子溶液的pH为6-8。
10.一种权利要求1所述的自组装多肽分子制备得到的水凝胶材料。
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