CN111905108A - 用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系及其制备方法。所述纳米药物体系为载药纳米颗粒，由两亲性缀合物纳米颗粒与阿霉素自组装而成，其中，所述两亲性缀合物纳米颗粒包括由亲水性的糖酰肼与含羰基的DOX脱水缩合而成的两亲性缀合物，所述亲水性的糖酰肼选自葡萄糖酰肼、乳糖酰肼等；具体地，所述纳米药物体系可为Lac‑DOX/DOX NPs。本发明提供的纳米药物体系，以两亲性分子药物本身作为载体，通过阿霉素分子结构苯环之间的π‑π堆积作用负载疏水性的阿霉素，形成载药纳米颗粒，使更少的靶标分子可以负载更多药物进入肿瘤细胞，以期在纳米药物毒性改变不大的情况下，提高载药量，为肝癌患者提供更多药物选择。

Description

用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系及其制备方法。
背景技术
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。手术是目前公认的疗效最好、符合根治性治疗标准的治疗方法，但是近年来的临床总结发现，手术切除也已经无法进一步提高肝癌病人的存活率。化疗是肿瘤治疗中除手术、放疗外最重要的治疗方式。但现有的化疗药物临床应用的最大问题是毒性高、副作用大、生理环境溶解性偏低、容易出现耐药性，严重限制了治疗效果。出现这种现象的根本原因是药物缺乏对肿瘤细胞的特异性，肿瘤组织存在广泛的异质性，及给药途径单一不能满足临床多种肿瘤治疗技术的需求。因此，如何提高化疗药物的疗效和安全性、减少毒副作用是肿瘤临床治疗亟待解决的重大科学问题，靶向化疗药物制剂开始引起人们的关注。
肿瘤靶向治疗分为被动靶向、主动靶向和物理化学靶向。被动靶向是纳米药物通过EPR效应(Enhanced permeability and retention effect)这一主要机制被动富集在肿瘤部位的行为。主动靶向一般通过受体介导作用将药物与肿瘤细胞膜表面特有受体相结合进入细胞，纳米药物与抗体、多肽、小分子(叶酸、葡萄糖、乳糖)联用，可以使其主动识别特殊部位肿瘤细胞，促进细胞吞噬，实现主动运输。脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)，在肝癌细胞上高表达，可与修饰半乳糖基的纳米药物特异性结合。物理化学靶向是指应用某些物理化学方法可使药物在特定部位发挥药效。如温度敏感、磁性材料、热敏感、栓塞、pH、酶系等。
随着纳米药物的迅速发展，纳米胶束类药物因其本身特有的性质及优点在肿瘤治疗及诊断领域得到广泛关注。通过化学手段将具有特异性识别功能的靶向基团修饰到胶束载体材料上，可定向将药物送至病变部位并释放发挥疗效，实现主动靶向递送。
基于肿瘤组织的EPR效应、肿瘤微环境及肿瘤细胞内部的酸性环境，发现pH响应性纳米胶束用于抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin，DOX)的递送具有不错的研究意义，前期研究设计合成了可以靶向肝癌细胞的乳糖(lactose，Lac)与DOX通过pH敏感的腙键连接的两亲性分子，可以自组装成纳米胶束(Lac-DOX NPs)实现被动靶向、主动靶向以及物理化学靶向的联合靶向行为，该胶束显示出不错的抗肿瘤效果。但是，单纯Lac-DOX纳米胶束相比DOX原药对细胞的杀伤效率不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系。
本发明所提供的用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系，为载药纳米颗粒，由两亲性缀合物纳米颗粒与阿霉素自组装而成，
其中，所述两亲性缀合物纳米颗粒包括由亲水性的糖酰肼与含羰基的疏水性抗肝癌药物阿霉素(DOX)脱水缩合而成的两亲性缀合物，
所述亲水性的糖酰肼选自葡萄糖酰肼、半乳糖酰肼、核糖酰肼、乳糖酰肼、麦芽糖酰肼、麦芽三糖酰肼、异麦芽三糖酰肼中的一种，具体可为乳糖酰肼；
所述两亲性缀合物纳米颗粒与阿霉素的质量比可为：10：0-6，端点值0不可取，具体可为10：1-5、10：2-5、10：3-5、10：4-5或10：4。
具体地，所述用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系可用Lac-DOX/DOX NPs表示，其中，Lac-DOX表示乳糖酸与阿霉素(DOX)通过pH敏感的腙键连接的两亲性分子—乳糖阿霉素；
Lac-DOX与DOX的质量比可为：10：0-6，端点值0不可取，具体可为10：1-5、10：2-5、10：3-5、10：4-5或10：4。
上述用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系，通过包括下述步骤的方法制备得到：
1)由亲水性的糖酰肼与含羰基的疏水性抗肝癌药物阿霉素(DOX)脱水缩合制备两亲性缀合物；
2)将所述两亲性缀合物与阿霉素(DOX)进行自组装，得到纳米药物体系。
上述方法步骤1)中，所述亲水性的糖酰肼为乳糖酰肼，所述两亲性缀合物的制备包括如下操作：由乳糖酸制备乳糖内酯；将盐酸阿霉素脱酸得到阿霉素(DOX)；由乳糖内酯与水合肼反应制备乳糖酰肼(Lac-NHNH2)；由乳糖酰肼与阿霉素进行脱水缩合得到Lac-DOX，即两亲性缀合物。
上述方法步骤2)中，所述自组装的操作为：
a)将所述两亲性缀合物溶解，得到两亲性缀合物溶液；
b)将盐酸阿霉素脱酸，得到除去HCl的DOX,将所述已除去HCl的DOX溶解，得到DOX溶液；
c)将所述DOX溶液与所述两亲性缀合物溶液混合，制成薄膜，采用薄膜水化法，得到两亲性缀合物/DOX NPs水溶液；
d)从所述两亲性缀合物/DOX NPs水溶液中将纳米颗粒与游离药物分离，得到两亲性缀合物/DOX NPs。
其中，步骤c)中，所述DOX溶液中的DOX与所述两亲性缀合物溶液中的两亲性缀合物的质量比可为：0-6：10，端点值0不可取；
所述薄膜水化法为：将所述薄膜加水后进行超声10min，得到两亲性缀合物/DOXNPs水溶液；
步骤d)中，所述将纳米颗粒与游离药物分离的方法可为：透析法、超滤膜过滤法、冷冻离心法、超滤离心法；具体可为超滤离心法。
所述超滤离心的条件具体可为：3000g，4℃离心15min。
上述纳米药物体系在制备靶向治疗肝癌的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的纳米药物体系，以两亲性分子药物本身作为载体，通过阿霉素分子结构上苯环之间的π-π堆积作用负载疏水性的阿霉素，形成载药纳米颗粒(Lac-DOX/DOXNPs)，使更少的靶标分子可以负载更多药物进入肿瘤细胞，以期在纳米药物毒性改变不大的情况下，提高载药量，为肝癌患者提供更多药物选择。
附图说明
图1为本发明实施例中制备Lac-DOX的路线图。
图2为DOX标准曲线。
图3为细胞蛋白标准曲线。
图4为Lac-DOX和Lac-DOX/DOX纳米颗粒的理化性质表征
图5为Lac-DOX/DOX纳米颗粒的靶向和吞噬行为研究
图6为Lac-DOX/DOX纳米颗粒的体外药效实验。
图7为在荷MHCC97H移植瘤裸鼠模型上，Lac-DOX/DOX纳米颗粒的体内药效实验。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面以Lac-DOX/DOX NPs的制备及活性研究为例阐述本发明所述靶向治疗肝癌的纳米药物体系的制备及活性研究。
实施例
1、根据图1所示的合成路线图制备Lac-DOX
1)乳糖内酯的合成：称取30g乳糖酸粉末倒入1000mL圆底烧瓶中，然后向瓶中倒入约500ml无水甲醇，放入提前用甲醇冲洗过的磁子，装好蛇形冷凝管，搭好回流装置，在磁力搅拌器上75℃搅拌24h后薄层色谱(TCL)点板分析检查反应进度；
2)薄层色谱点板分析：选择二氯甲烷：甲醇＝2:1的展开剂，观察反应进度。当反应进行90％左右的时候终止，将整个反应体系中溶剂旋转蒸发后，得到乳糖酸内酯粉末，于-20℃冰箱保存；
3)盐酸阿霉素(DOX·HCl)脱酸：2g盐酸阿霉素粉末和0.5mL三乙胺分别溶于10mL和5mL DMSO溶剂中，将三乙胺DMSO溶液逐滴加入到盐酸阿霉素DMSO溶液中，室温搅拌24h，除去盐酸阿霉素中的盐酸；
4)乳糖酰肼的合成：将步骤(2)中全部乳糖酸内酯(88.24mmol)溶于约200ml无水甲醇中，固定在铁架台上，取约10ml(198mmol)水合肼加入恒压滴液漏斗，接到反应烧瓶瓶口，逐滴缓慢滴加到反应体系中，此时便可观察到白色沉淀产生，此沉淀即为乳糖酰肼。放入真空干燥烘箱中，温度设置为30～40℃过夜干燥，除去体系中反应产生的水；
5)乳糖阿霉素(Lac-DOX)的合成：称取100mgDox粉末，溶于5ml DMSO，此溶液记为溶液①，另称取500mg Lac-NHNH2溶于5ml DMSO中，配成浓度为0.1g/ml的溶液②，取1.35mL溶液②加入到溶液①中，室温搅拌0.5-1h。加入2g C18填料，搅拌均匀后旋转蒸发除去溶剂，得到砖红色粉末Lac-DOX；
6)分离提纯：将得到的粉末装入空的硅胶柱，压实，用2％乙腈填充，将此柱子与反相C18色谱柱相连，使用中压快速分离机分离，将所收集到的液体旋蒸后得到红色晶状固体，即乳糖阿霉素(Lac-DOX)；
2、Lac-DOX/DOX纳米颗粒的自组装
取10mg Lac-DOX粉末溶于10mL无水甲醇，超声使其充分溶解，得到澄清透明的红色液体，取适量已除去HCl的DOX溶于DMSO，制成1mg/mL的溶液，取适量体积加入到Lac-DOX溶液中，旋转蒸发得到薄膜，采用薄膜水化的方法，缓慢加入5ml去离子水，同时超声震荡10min得到不同质量比例的纳米颗粒溶液。此时溶液(加入5ml去离子水后的溶液)中Lac-DOX的浓度为2mg/mL。
3、纳米颗粒的分离纯化
精密量取一定体积的组装后的纳米颗粒溶液加入到超滤离心管的内管中，3000g离心15min，分离，分别收取超滤离心管外管和内管中液体，内管中液体为Lac-DOX/DOX纳米颗粒溶液。
4、包封率和载药量的测定
1)紫外分光光度计对阿霉素溶液扫描光谱，扫描范围200nm－900nm，确定最大吸收波长；
2)精密称取一定质量的盐酸阿霉素，用甲醇溶解配制成1000μg/mL的溶液，分别稀释成500、250、125、0μg/mL的阿霉素溶液作为标准品溶液；
3)在最大吸收波长处对制备的标准品溶液测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线(图2)；
4)取一定体积超滤离心后的外管中超滤液(3纳米颗粒的分离纯化中的超滤离心管超滤离心出的超滤液)用UV-Vis测定吸光度，根据标准曲线计算超滤液中的游离药物质量，根据下列公式计算包封率(Encapsulation Efficiency,EE)：
Figure BDA0002055407210000051
其中：Wtotal系统中的药物总质量；
Wfree是溶液中游离的药物质量。
5、纳米颗粒表面形态观察
分别取一滴Lac-DOX(浓度为2mg/mL)和Lac-Dox/Dox纳米颗粒溶液(Lac-DOX/DOX纳米颗粒溶液是将制备得到的Lac-Dox/Dox纳米颗粒溶于水制备的，浓度为2mg/mL，Lac-DOX：DOX的质量比为10：4)滴加在疏水介质表面，用pH 4.47、浓度为2.0％的磷钨酸钠溶液负染色，各移取一滴染色后胶束溶液滴加在碳膜覆盖的铜网上，室温下自然晾干后置于透射电子显微镜(TEM)下观察纳米颗粒的形貌和粒径分布。
6、纳米颗粒粒径分布
取Lac-DOX和Lac-DOX/DOX纳米颗粒溶液稀释2倍至1mg/mL，用马尔文动态光散射粒径分析仪(DLS)检测纳米颗粒的粒径大小及粒径分布。
7.Lac-DOX/DOX体外释药行为研究
精密称量配置浓度分别为0、125、250、500、1000μg/mL的DOX标准溶液，紫外分光光度计在480nm处测得吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图得标准曲线(图2)。
一方面，为了在体外更好的模拟肿瘤组织部位与正常组织部位pH的差异，选择不同pH值的PBS缓冲液作为缓冲介质；另一方面，由于本研究所制备的纳米颗粒具有pH响应性，故选取pH5.5、pH6.8、pH7.4三个pH的PBS缓冲介质考察纳米颗粒的释药行为。具体方法如下：
1)分别取浓度为2mg/mL的Lac-DOX和Lac-DOX/DOX纳米颗粒溶液各3ml置于两个经过预溶胀处理的透析管中，各三份。
2)将透析管封闭后，三份装有的纳米颗粒溶液的透析管分别投入100mL的pH5.5、pH6.8、pH7.4缓冲液中，确保外部缓冲液完全没过透析管。
3)将整个体系放入37℃水浴中，加入转子设置转速100r·min-1，开始计时。在0.5h、1后、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、36h、48h、60h时取3ml缓冲液以供检测，并且同时补加3mL相同pH的新鲜缓冲液进入体系内。
4)用UV-Vis在480nm处测定所取缓冲液的吸光度，根据标准曲线计算溶液浓度，根据下述公式计算累计药物释放量：
Figure BDA0002055407210000061
其中：
Er：DOX累计释放量；
Ve：PBS缓冲液的置换体积，mL；
V0：PBS溶液的总体积，100mL；
Ci：第i次置换取样时释放液的浓度，μg/mL；
mdrug：纳米颗粒中DOX的总质量；μg；
n：置换PBS缓冲液的次数。
8、细胞总蛋白提取
1)胰酶消化生长处于对数期的细胞后，1000rpm离心4min；
2)弃上清，用1×PBS轻柔混匀细胞沉淀，清洗细胞，1000rpm离心4min。重复2次；弃上清，加入适量细胞裂解混合液，每隔10min震荡一次，共3次约30min。细胞裂解混合液配方如下:
RIPA:蛋白酶抑制剂:PMSF＝100:1:1；
3)4℃，12000rpm离心30min，取上清保存于-80℃冰箱。
9、蛋白质浓度测定(BCA Protein Assay kit)
1)BSA(Bovine Serum Albumin)标准品进行梯度稀释，稀释为0、125、250、500、1000μg/mL浓度的标准品；
2)准备BCA工作液：按Reagent A/Reagent B＝50/1稀释；
3)96孔板中每孔加200μLBCA工作液；
4)分别取25μL BSA标准品或样品加入到相应的检测孔中；
5)混匀后37℃孵育30min；
6)酶标仪检测吸光度值(波长:570nm)，绘制标准曲线(图3)，依据标准曲线计算样品浓度。
10、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹
1)制胶：按照蛋白分子量要求制备相应浓度的SDS-PAGE分离胶和5％的积层胶。待积层胶凝固后，小心缓慢地拔出梳子，反复冲洗上样孔，将制好的凝胶固定于电泳装置上，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液；
2)上样：取一定量的蛋白(每孔上样量为40μg)，加入适量的上样缓冲液，混匀，95℃加热5min使蛋白变性，准备上样；
3)电泳：以30mA电流电泳使不同大小的蛋白分离，当染料到达分离胶最下沿，关闭电源；
4)蛋白质印迹：裁剪2张滤纸和1张硝酸纤维素膜，使大小与凝胶完全相同。将海绵垫、剪好的滤纸和膜置于转膜缓冲液中提前浸泡。从阳极到阴极按照海绵、滤纸、硝酸纤维素膜、分离胶、滤纸、海绵的顺序放置，注意在此过程中避免产生气泡，以70V恒压转移蛋白4h；
5)染色：取出硝酸纤维素膜，用1×丽春红染液染色，可以观察蛋白条带,，标记Marker位置，用去离子水漂洗，直到膜上的染料洗掉为止；
6)封闭：将硝酸纤维素膜放入5％脱脂奶粉/TBST的封闭液中，4℃封闭过夜；
7)一抗孵育：用封闭液按最佳比例稀释一抗，将封闭后的硝酸纤维素膜和稀释后的一抗装入杂交袋中，室温孵育1.5h，用TBST漂洗3次，10min/次；
8)二抗孵育：按二抗/封闭液＝1/3000的比例稀释二抗，将膜和稀释后的二抗装入杂交袋中，室温孵育1.5h，用TBST漂洗3次，10min/次；
9)显影：将ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate的A液和B液等量混合，均匀地滴在硝酸纤维素膜上，利用ImageQuantTM LAS 4000数字成像系统进行图像采集。
WB实验试剂配方：
5×Tris-Gly电泳缓冲液：
Tris-base 15.11g
甘氨酸 94g
10％SDS 50mL
加蒸馏水定容至1000ml
6×SDS loading buffer：
Figure BDA0002055407210000071
转膜缓冲液：
Tris 3.03g
甘氨酸 14.41g
无水甲醇 200mL
加蒸馏水定容至1000mL
10×丽春红S储备液：
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
加蒸馏水定容至100mL
TBST洗涤缓冲液：
Figure BDA0002055407210000081
调pH值至8.0，加蒸馏水定容至1000mL
11、CCK-8检测细胞增殖
1)铺板：在96孔板接种肿瘤细胞8000-10000/孔，每组每个浓度设置5个复孔。并且有一组空白对照；
2)药物处理：细胞贴壁后，吸弃培养基，加入预先用培养基配置好的不同浓度的纳米药物溶液，在37℃细胞培养箱培养一定的时间；
3)吸除将培养基，PBS清洗2遍，每孔100mL CCK-8溶液；
4)置于孵箱，显色2-3h；
5)在多功能酶标仪450nm处检测各孔OD值。
12、细胞凋亡实验
1)铺板：将生长状态良好用胰酶消化收集后制成一定浓度的细胞悬液，6孔板接种细胞，3×105/孔；
2)按照既定的实验方案不同组别药物处理细胞一定的时间；
3)用预冷的PBS洗涤细胞2次，将细胞沉淀收集到流式管中，每管细胞总数保持在1×105-1×106/管；
4)加入100μL预冷1×Binding Buffer，使细胞重悬；
5)染色：每管加入5μLAnnexin V–APC和5μL DAPI染液(选用DAPI而不使用常用的PI是因为PI检测波长与DOX重叠，DAPI则不会，避免结果出现假阳性)；
6)轻柔涡旋混匀，室温避光孵育15min；
7)每管加入400μL1×Binding Buffer，混匀后流式细胞仪检测分析。
13、细胞吞噬实验
1)爬片：根据所需实验组别，取一定数量的赖氨酸包被的圆形盖玻片置于24孔板中，将生长状态良好的对数期细胞用胰酶消化收集后制成一定浓度的细胞悬液，接种细胞，5×104/孔。
2)药物处理：按照实验设计方案，不同浓度不同组别处理细胞一定时间；
3)固定：PBS洗2遍，用预冷的4％多聚甲醛室温固定15-20min；
4)吸除固定液，PBS清洗三遍；
5)封片：用含DAPI的封片剂封片，置于通风条件下晾干，同时染核；
6)激光共聚焦显微镜下观察并照相。
14、细胞表面受体表达情况检测
消化收集对数生长期的细胞，PBS清洗2遍，细胞计数，稀释成1×106-1×107/mL的细胞悬液，取100μL转移到流式管中，空白对照组、同型对照组、试验组均设置三管，减小误差。取5μL PE-ASGPR抗体加入到试验组、5μL同型抗体加入到同型对照组，轻柔涡旋混匀，室温避光孵育30min。PBS洗涤细胞3遍后上流式细胞仪检测，若不能及时检测，用4％多聚甲醛室温固定20-30min或者4℃冰箱过夜。
15、细胞内DOX荧光强度检测
1)铺板：将生长状态良好用胰酶消化收集后制成一定浓度的细胞悬液，6孔板接种细胞，5×105/孔；
2)按照既定的实验方案纳米药物处理细胞2h；
3)PBS洗涤细胞2次，将未被吞噬或者粘附在细胞表面的药物洗净，最后加入500μLPBS，把细胞悬液转移到流式管中，使每管细胞总数保持在1×105-1×106/管
4)固定：4％多聚甲醛室温固定20-30min或者4℃冰箱过夜。
5)流式细胞仪检测荧光强度，使用PE通道。
图4为Lac-DOX and Lac-DOX/DOX纳米颗粒的理化性质表征。(A)Lac-DOX NPs和(B)Lac-DOX/DOX NPs的TEM照片；(C)Lac-DOX和DOX不同质量比制备的纳米颗粒的粒径大小；(D)具有不同质量比的纳米颗粒的UV-Vis光谱(由下往上的曲线依次对应Lac-DOX：DOX为10:0、10:2、10:4、10:6(w：w))；(E)具有不同质量比的纳米颗粒溶液经超滤管离心后内外管的照片(1、3、5外管溶液，2、4、6内管溶液)；(F)Lac-DOX在不同质量比下对游离DOX的包封率(G)不同质量比的Lac-DOX：DOX对细胞活力的影响；(H)在三种pH条件下Lac-DOX的体外释放曲线；(I)在三种pH条件下Lac-DOX/DOX(质量比为10:4)的体外释放曲线；
透射电子显微镜(TEM)照片可直观反映纳米胶束的形貌，如图4A和4B所示，Lac-DOX NPs和Lac-DOX/DOX NPs均具有类球形结构，在水中组装成的胶束大小分布均一，无团聚等现象。
通过动态光散射(DLS)测量不同质量比例形成的纳米颗粒粒径，如图4C所示，发现粒径分布无明显趋势走向，不同包裹比例的纳米胶束粒径均分布在110±15nm范围内，符合在肿瘤组织部位通过EPR效应进行富集的纳米颗粒粒径大小的要求。经自组装后的纳米胶束混悬液中，可能存在未被胶束包裹的游离或者不溶DOX存在体系当中，超滤管离心分离纳米颗粒与溶液，可以将大部分的游离DOX除去。紫外可见分光光度计(UV-Vis)对DOX溶液、Lac-DOX溶液、Lac-DOX/DOX纳米颗粒溶液扫描全波段，确定最大吸光度均在480nm处。对不同包裹比例10:0、10:2、10:4、10:6(w：w)的Lac-DOX：DOX用DMSO溶解，破坏胶束结构，紫外可见分光光度计(UV-Vis)扫描吸光度光谱(图4D)，观察到吸光度随纳米颗粒中DOX质量的增大而增大，说明两亲性的Lac-DOX形成的胶束已经通过π-π堆积作用成功包裹了疏水的DOX。图4E为超滤后内管和外管的液体照片。
根据下列公式即可求得包封率
包封率＝(CnVn-C1v1)/mn
式中：
Cn：包裹组浓度
Vn：包裹组液体体积
C1：空载组的浓度
v1：空载组液体体体积
mn：投入Dox的总质量
通过上述公式可求得不同质量比例的Lac-Dox纳米胶束对疏水Dox的包封率，如图4F所示，包封率均在90％以上，说明Lac-DOX纳米胶束对DOX的包裹比较完全；随着DOX的质量增加，包封率增大。
为了探究不同质量比的Lac-DOX/DOX NPs对肝癌细胞的杀伤能力，我们利用制备的不同质量比(Lac-DOX：DOX＝10:0、10:1、10:2、10:3、10:4)的Lac-DOX/DOX NPs，选择药物浓度为10μg/mL的培养基培养细胞，作用时间为24h，CCK-8法测量细胞存活率，如图4G所示。可以看出，Lac-DOX/DOX NPs中，随着DOX含量增加，Huh-7肝癌细胞细胞存活率逐渐降低；与未负载DOX的Lac-DOX NPs(Lac-DOX：DOX＝10:0)相比，质量比例为10:1与10:2的Lac-DOX/DOX NPs细胞存活率下降非常明显，说明将DOX载入纳米胶束中对Huh-7细胞杀伤效果显著的提高。Lac-DOX：DOX＝10:4、10:5质量比例的Lac-DOX/DOX NPs对Huh-7肝癌细胞存活率影响逐渐降低，变化趋势变缓，均达到很好的杀伤效果。考虑到量效比，我们选择Lac-DOX：DOX＝10:4这一质量比例进行接下来的实验研究。
由于Lac-DOX具有PH敏感性，选择pH5.5、6.8、7.4的PBS缓冲液分别模拟肿瘤细胞内(pH5～6)、肿瘤组织部位(pH6～7)、正常组织部位(pH7.4)的药物释放情况。在37℃环境下，考察负载DOX与否的胶束Lac-DOX NPs和Lac-DOX/DOX NPs对DOX的释放动力学行为，其累积释药曲线如图4H、4I所示，相比Lac-Dox NPs，Lac-DOX/DOX NPs(w/w＝10:4)体外释放行为符合双相性，即前期阶段的药物快速释放行为以及后期阶段的药物缓慢释放行为。前期阶段约持续2h，药物快速释放行为是由于部分DOX吸附在纳米粒子表面及浅层间隙，透析袋内外介质浓度差别较大，扩散较快的DOX分子便在很短的时间内释放出来。后期阶段的缓释行为是因为Lac-DOX的连接键腙键具有pH敏感性，在偏酸性环境下逐渐断裂，与Lac链接的DOX和胶束核内部的DOX两部分的药物释放出来。
由图H和I可知，在pH5.5的情况下，在24h之后Lac-DOX NPs和Lac-DOX/DOX NPs药物释放量最终均可达到95％以上；而在pH6.8的情况下，Lac-DOX/DOX NPs最终释放量达到80％以上，而Lac-DOX NPs最终释放量只达到60％，这是因为Lac-DOX/DOX NPs在偏酸性条件下腙键断裂、胶束解离后，络合在胶束内部的疏水DOX都释放出来。在pH7.4正常组织偏碱性的环境下，药物最终释放量均在50％以下。说明Lac-DOX/DOX NPs具有良好的控释放能力以及对肿瘤微环境、肿瘤细胞的pH敏感性。
图5为Lac-DOX/DOX的靶向和吞噬行为。(A)ASGPR在A549，H520，Bel-7420，MCCH97H和Huh-7细胞上的表达；(B)24小时后用不同浓度Lac-DOX/DOX NPs处理A549，H520，Bel-7420，MCCH97H和Huh-7的存活率；(C)Huh-7和H520细胞吞噬Lac-DOX/DOX NPs的DOX荧光强度；(D)Lac-DOX NPs和(E)Lac-DOX/DOX NPs在1小时、2小时对细胞的吞噬作用。
为了考察Lac对肝癌细胞表面受体ASGPR的靶向行为，探究药物对细胞表面ASGPR表达量不同的肿瘤细胞(A549、H520、Bel-7402、Huh-7和MCCH97H)的杀伤作用，由图5A可以看出，流式细胞仪检测脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)在肝癌细胞Huh-7和MCCH97H细胞高表达，在肝癌细胞Bel-7402表面低表达，在肺癌细胞(A549、H520)中不表达。在用10μg/mL浓度的Lac-DOX/DOX NPs作用24h后，药物对肿瘤细胞的杀伤效率随ASGPR在细胞表面表达量的升高而增强(图5B)。说明在此过程中，纳米药物表面的乳糖分子被肝癌细胞表面的ASGPR特异性识别，通过受体介导作用将纳米药物转运到胞内，在肿瘤细胞内酸性环境下，释放出阿霉素分子，实现杀伤肿瘤的作用。
同时选择不同癌种细胞(肝癌细胞Huh-7、肺癌细胞H520)，通过相同浓度的Lac-DOX/DOX NPs分别作用于高表达ASPGPR的Huh-7肝癌细胞和不表达ASGPR的H520肺癌细胞2h后，收集并多次洗涤细胞将细胞表面的附着的药物清洗干净后上流式细胞仪检测细胞内DOX的荧光强度，图5C显示，H520细胞内DOX的荧光强度明显弱于Huh-7细胞，同样说明Lac可以与ASGPR特异性结合，提高纳米药物进入细胞的效率。
共聚焦显微镜结果可看出，Lac-DOX NPs在2h内荧光信号较弱，可以理解为其进入细胞较慢。在2h时，Lac-DOX/DOX NPs可明显看到有较强的红色荧光，说明Lac-DOX/DOX NPs可携带更多的DOX进入胞内。
图6.Lac-DOX/DOX纳米颗粒的体外药效实验。(A)不同药物浓度的Lac-DOX/DOXNPs对Huh-7肿瘤细胞的杀伤作用。(B)CCK-8测定乳糖，游离DOX，Lac-DOX NP和Lac-DOX/DOXNP对Huh-7细胞的杀伤作用。经药物处理(C)24h和(D)36h后，Huh-7细胞的凋亡情况。经药物处理24h(E)和36h(F)后，Huh-7细胞凋亡率。(G)经药物处理24h后，Huh-7细胞中p53和PARP的表达情况。
考察纳米药物对肝癌细胞的作用规律，Lac-DOX/DOX NPs对Huh-7细胞的存活率的影响呈浓度-时间依赖性(图6A)。与Lac-DOX NPs组相比，负载了DOX的Lac-DOX/DOX NPs展现出对肿瘤细胞非常显著的杀伤效果，说明疏水DOX已经成功被Lac-DOX/DOX NPs包载形成载药纳米胶束。与Free DOX组相比，Lac-DOX/DOX NPs含有同等浓度可以发挥杀伤作用的DOX，但是Lac-DOX/DOX NPs组细胞存活更低。尤其在高浓度情况下，差别明显，原因可能是Lac分子发挥了靶向作用，可以作到肝癌细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体，通过受体介导的形式将大部分胶束带进细胞释放出DOX发挥作用。而Free DOX只是因为细胞内外存在浓度差，通过单纯的扩散作用进入细胞，并且在细胞内药物浓度达到一定浓度后，细胞更容易通过P-gp等药泵蛋白将药物分子泵出胞外。
Annexin V-APC/DAPI双标记检测流式细胞术结果显示，药物处理Huh-7细胞24h后(图6C)，虽然与Lac-DOX/DOX NPs组含有同等摩尔质量，DOX、Lac-DOX NPs两组细胞凋亡率均比Lac-DOX/DOX组低，DOX组凋亡总量44％、Lac-DOX组14％、而Lac-DOX/DOX组凋亡总量高达51％，差别明显，与细胞毒性试验结果相符合。药物处理36h(图6D)与24h显示出同样的趋势，但凋亡效果更加明显。经过三次重复实验分析，绘制了不同组药物导致的细胞凋亡率柱状图(图6E，图6F)。
肿瘤细胞开始启动细胞凋亡后，凋亡相关的信号通路被激活，通路中关键节点的蛋白会出现表达量上调或者下调的现象。p53是一种重要的抑癌基因，在正常情况下起着监视细胞DNA变异程度的作用，一旦DNA变异程度较大，p53便启动诱导细胞凋亡的过程。PARP是DNA修复酶，可识别损伤DNA片段被激活，同时可作为凋亡的标志。如图6G所示，经Lac-DOX/DOX NPs处理24h后，与Lac-DOX NPs组相比，经Lac-DOX/DOX NPs处理24h后，Huh-7肿瘤细胞的p53表达上调，PARP蛋白剪切说明药物诱导肿瘤细胞凋亡作用增强，细胞启动凋亡程序。
图7.在荷MCC-97H移植瘤裸鼠模型上，Lac-DOX/DOX纳米颗粒的体内药效试验。(A)实验期间荷瘤小鼠的体重变化；(B)静脉注射生理盐水，游离DOX，Lac-DOX和Lac-DOX/DOX纳米颗粒(n＝5)后记录每组的肿瘤体积；(C)主要器官和肿瘤的切片H&E染色图像；(D)肿瘤切片的TUNEL染色图。
同时，我们还进行了Lac-DOX/DOX纳米胶束的小鼠体内药效学研究，我们设计了小动物水平的体内药效学实验，挑选生长状况相同的裸鼠腋下注射MCCH97H人肝癌细胞构建荷瘤裸鼠模型，通过尾静脉注射给药，每三天一次，共七次，每次给药前测量小鼠体重和肿瘤体积。分为生理盐水对照、DOX注射液(DOX Injection)、Lac-DOX NPs、Lac-DOX/DOX NPs四组。与生理盐水对照组相比，各组小鼠体重没有明显变化(图7A)。但是，Lac-DOX/DOX纳米颗粒组的肿瘤生长受到抑制(图7B)。这些结果表明游离等量DOX和Lac-DOX纳米颗粒的治疗效果相当，但是Lac-DOX/DOX的治疗效率显著增强。
心脏和肝脏中游离DOX的积累可能会引起一些毒性作用。因此，在给药后第21天解剖获得小鼠主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏)用于组织学分析，进行H&E染色(图7C)。与PBS对照组相比，用Lac-DOX/DOX纳米颗粒处理的小鼠的主要器官未显示组织损伤。TUNEL反应优先标记细胞凋亡过程中产生的DNA链断裂。这可以区分细胞凋亡和坏死以及由细胞抑制药物或辐射诱导的初级DNA链断裂。TUNEL方法也用于研究药物对体内肿瘤细胞的凋亡作用(图7D)。可以明显看出，与生理盐水组相比，Lac-DOX/DOX组的细胞核着色加深，细胞密度稀疏，表明细胞凋亡增强。从病理学角度来看，Lac-DOX/DOX可以在肿瘤部位有效富集并促进肿瘤细胞凋亡。

Claims (9)

1.一种用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系，为载药纳米颗粒，由两亲性缀合物纳米颗粒与阿霉素自组装而成，
其中，所述两亲性缀合物纳米颗粒包括由亲水性的糖酰肼与含羰基的疏水性抗肝癌药物阿霉素脱水缩合而成的两亲性缀合物，
所述亲水性的糖酰肼选自葡萄糖酰肼、半乳糖酰肼、核糖酰肼、乳糖酰肼、麦芽糖酰肼、麦芽三糖酰肼、异麦芽三糖酰肼中的一种；
所述两亲性缀合物纳米颗粒与阿霉素的质量比为：10：0-6，端点值0不可取。
2.根据权利要求1所述的纳米药物体系，其特征在于：所述用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系用Lac-DOX/DOX NPs表示，其中，Lac-DOX表示乳糖酸与阿霉素通过pH敏感的腙键连接的两亲性分子乳糖阿霉素；
Lac-DOX与DOX的质量比为：10：0-6，端点值0不可取。
3.制备权利要求1中所述的纳米药物体系的方法，包括：
1)由亲水性的糖酰肼与含羰基的疏水性抗肝癌药物阿霉素脱水缩合制备两亲性缀合物；
2)将所述两亲性缀合物与阿霉素进行自组装，得到纳米药物体系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述亲水性的糖酰肼为乳糖酰肼，所述两亲性缀合物的制备包括如下操作：由乳糖酸制备乳糖内酯；将盐酸阿霉素脱酸得到阿霉素；由乳糖内酯与水合肼反应制备乳糖酰肼；由乳糖酰肼与阿霉素进行脱水缩合得到Lac-DOX，即两亲性缀合物。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述自组装的操作为：
a)将所述两亲性缀合物溶解，得到两亲性缀合物溶液；
b)将盐酸阿霉素脱酸，得到除去HCl的DOX,将所述已除去HCl的DOX溶解，得到DOX溶液；
c)将所述DOX溶液与所述两亲性缀合物溶液混合，制成薄膜，采用薄膜水化法，得到两亲性缀合物/DOX NPs水溶液；
d)从所述两亲性缀合物/DOX NPs水溶液中将纳米颗粒与游离药物分离，得到两亲性缀合物/DOX NPs。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤c)中，所述DOX溶液中的DOX与所述两亲性缀合物溶液中的两亲性缀合物的质量比为：0-6：10，端点值0不可取；
所述薄膜水化法为：将所述薄膜加水后进行超声10min，得到两亲性缀合物/DOX NPs水溶液。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤d)中，所述将纳米颗粒与游离药物分离的方法为：透析法、超滤膜过滤法、冷冻离心法或超滤离心法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤d)中，所述将纳米颗粒与游离药物分离的方法为超滤离心法；
所述超滤离心的条件为：3000g，4℃离心15min。
9.权利要求1或2所述的纳米药物体系在制备靶向治疗肝癌的药物中的应用。
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