KR20220071357A - 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 조성물 - Google Patents

난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복강 내 투여를 통해 난소암 치료 또는 재발 방지를 위한 약학 조성물에 관한 것으로, 종래 항암제(Doxorubicin)에 비해 지속적이고, 우수한 난소암 치료 효능을 기대할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 복강 내 투여용 조성물은 정확한 투여경로와 용량의 제어를 통해 종래 항암제 대비 우수한 난소암 축적 효율 및 선택성을 가지며, 동량의 항암제와 달리 정상 조직에 대한 독성을 거의 나타내지 않는다.

Description

난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 조성물{Composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer}
본 발명은 종양 특이적 항암제 전구체 나노입자를 유효성분으로 하는 복강 내 투여를 통해 난소암 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
난소암은 모든 부인과 암 중에서 가장 높은 사망률을 나타내는 암에 해당하며, 최근 생활양식이 서구화되고 노령인구가 증가함에 따라 그 빈도가 증가하고 있다. 난소암의 경우 초기에는 뚜렷한 증상이 나타나지 않으므로 약 70% 이상의 환자가 3기 이상인 진행성 난소암으로 최초 발견되며 약 75% 이상의 환자에서 최초 치료 후 2년 내 재발 및 전이가 일어나는 것으로 보고되어 있다.
난소암으로 확인된 시점에는 이미 대부분 암이 많이 진행되어 복강 내외로 전이가 일어난 경우가 많다. 또한, 난소는 골반 내를 자유롭게 이동하기 때문에, 다른 암종에 비해서 자궁, 난소, 맹장, 대망 등 여러 부위로 전이가 쉽고 빠르게 진행된다고 알려져 있다.
난소암을 치료하기 위해서 수술요법, 항암화학요법, 방사선요법과 더불어 면역요법을 이용한 다양한 시도가 이루어지고 있다. 난소암의 기본적인 치료방법은 수술로 종양을 최대한 제거하고, 항암제를 복강 내에 투여하는 방법이 주로 사용되고 있다. 상기 방법에는 임상에서 난소암에 사용되는 대표적인 항암제인 Paclitaxel, Cisplatin, Doxorubicin과 같은 항암제가 사용되는데, 이는 종양 선택성이 없어 난소암 조직뿐만 아니라, 난소암 주변의 정상조직에도 독성을 나타내어 치료 후 심각한 부작용을 나타낸다. 즉 난소암을 치료하기 위한 다양한 치료 물질들이 개발되지만, 실제 임상에서 효과를 기대할 수 없거나, 부작용으로 인해 장기간 치료가 어려운 등의 문제가 발견되고 있다.
특히, 난소암은 다른 암과는 다른 특이적 성질을 가지고 있어, 다른 암에서 효과를 나타내는 항암제를 처리하더라도 암세포 사멸이 효과적으로 유도되지 않으며, 다양한 항암제에 대한 저항성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, 정상조직에 대한 독성을 최소화하고 난소암을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
특허문헌 1. 대한민국 등록특허공보 제10-1668349호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머; 및 c) 생리식염수;를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 폴록사머는 폴록사머 68, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 약학 조성물은, 상기 (a) 약물복합체 100 중량부에 대하여, (b) 폴록사머 10 내지 60 중량부를 함유하고 있는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은, 상기 (a) 약물복합체 100 중량부에 대하여, (c) 생리식염수 0.1 내지 1 중량부를 함유하는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 3일 1회 투여하되, 단위 kg당 (a) 약물복합체가 40 내지 60 mg 투여되도록 포함하는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 복강 주사로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 복강 내 투여용 약학 조성물은 종래 항암제(Doxorubicin)에 비해 지속적이고, 우수한 난소암 치료 효능을 기대할 수 있다.
또한, 펩타이드와 항암제가 결합한 약물복합체를 바로 주입하는 것보다 난소암에 대한 선택성이 우수하므로, 별도의 담체나 전달체를 처리하지 않고 주사 제형으로 바로 제조 및 사용할 수 있어, 항암제, 담체 및 전달체로 인한 치료 후 부작용이 없다.
특히, 본 발명에 따른 복강 내 투여용 조성물은 정확한 투여경로와 용량의 제어를 통해 종래 항암제 대비 우수한 난소암 축적 효율 및 선택성을 가지며, 동량의 항암제와 달리 정상 조직에 대한 독성을 거의 나타내지 않는다.
도 1은 제1실험군과 비교군으로부터, 시간에 따라 채취한 각 장기(간, 폐, 심장, 비장, 신장, 장(intestine), 혈장(plasma) 및 복수(ascties))의 약동학/약력학(PK/PD)을 평가한 결과이다.
도 2a는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 후, 시간에 따라 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이다.
도 2b는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 뒤 6 시간이 지난 후의 모습(좌측), IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지(우측)이다.
도 2c는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 6 시간이 지난 후, 각 장기(간, 폐, 비장, 신장, 심장) 및 암 조직을 적출하여 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이다.
도 3a는 대조군, 제1실험군 및 비교군을 투여한 후, 20일째 종양 조직의 모습을 촬영한 사진이다.
도 3b는 대조군, 제1실험군(1xFDOX), 제2실험군(2xFDOX) 및 비교군(DOX) 투여 후, 20일째에 종양 무게를 측정한 그래프이다.* p<0.01, ** p<0.001.
도 3c는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 종양 조직의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과이다.
도 4a는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 각 주요조직(폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직)의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과이다.
도 4b는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 각 주요조직(간 조직, 폐 조직, 비장 조직, 신장 조직, 장(intestine) 조직 및 심장 조직)의 무게를 측정한 그래프이다.
도 4c는 투여기간에 따른 대조군, 제1실험군 및 비교군의 치료 20일 동안 체중을 측정한 그래프이다. * p<0.01, ** p<0.001.
도 4d는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 투여 기간에 따른 생존율을 평가한 그래프이다.
도 4e는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 채취한 혈액으로부터 혈액검사를 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
앞서 서술한 바와 같이, 최근 임상에서 난소암 치료를 위해 가장 많이 사용되는 화학 요법제는 독소루비신, 파클리탁셀, 시스플라틴이지만, 이들 치료제는 종양 선택성이 매우 낮아 심각한 부작용을 나타낸다는 단점을 가지며, 치료 효과를 높이기 위해 많은 양을 사용하는 경우에는 난소와 인접한 장기인 자궁, 난소, 맹장, 대망 등에 독성을 나타내어 심각한 부작용으로 이어질 수 있다.
따라서 본 발명은 상술한 문제들은 해결하면서, 기존 항암제 대비 월등히 독성이 감소하면서 난소암 특이적 축적 효율은 우수한 복강 내 투여용 조성물을 제시하고자 한다.
본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머; 및 c) 생리식염수;를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복강 내 투여용 조성물은 (a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제인 독소루비신이 결합된 약물복합체와 (b) 폴록사머를 포함하는 약학성분을 혼합하여 (c) 생리식염수로 제제화하여 비경구적인 방법으로 투여하기 위한 것일 수 있다.
또한 본 발명은 유효성분으로 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체, 폴록사머 및 생리식염수를 유효량 포함하는 약학성분을 포함하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머; 및 c) 생리식염수;를 포함하는 약학성분을 복강 내 투여함으로써, 기존 항암제 사용에서는 얻을 수 없는 현저히 향상된 난소암에 대한 특이적 암효과를 기대할 수 있다.
또한, 상기 복강 내 투여용 약학 조성물은 난소암에 대해서만 특이적으로 독성을 가지기 때문에, 정상조직에 대해서는 전혀 세포 독성을 유발하지 않는다는 점에서 매우 안정적이다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K)과 같다.
본 발명에 따른 약물복합체는 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되는 양친매성 펩타이드와 항암제가 결합된 것으로, 상기 양친매성 펩타이드와 항암제 사이의 상호작용에 의해, 카텝신 B 효소에 의해 분해될 경우, 분해된 양친매성 펩타이드와 이의 일부가 결합된 항암제가 생성되고, 이는 종양세포에 대해 우수한 약물 효과를 나타내는데 유용하게 적용될 수 있다.
상기 양친매성 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 약물복합체는 용액상에서 자기조립을 통해 구형의 입자로 존재하나, 그 크기가 균일하지 않고, 생체 내에서 다소 불안정하므로, 폴록사머를 혼합하여 생체 내 안정성을 확보함과 동시에 정확한 약물용량으로 투여할 수 있다는 장점이 있다.
상기 카텝신 B 효소는 정상세포에서는 발현이 제한되면서 종양세포에서는 특이적으로 발현되는 것으로써, 특히 전이암에서 특이적으로 발현되나, 본 발명의 약학조성물은 복강 내 투여하는 것으로써, 암 중에서 난소암 예방 또는 치료에 대해서 효과를 나타내나, 가장 바람직하게는 전이 난소암의 난소암 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다 할 수 있다.
상기 항암제는 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 독소루비신일 수 있다.
본 발명에서, 상기 약물복합체는 바람직하게 하기 구조식 1로 표시될 수 있다.
[구조식 1]
Figure pat00001
상기 폴록사머(poloxamer)는 소수성의 프로필렌옥사이드를 중심으로 양 끝에 친수성의 에틸렌옥사이드가 결합된 비이온성의 트리블록공중합체로서, 온도 민감성의 특징을 갖고 있어, 농도와 온도에 따라 졸(sol)과 젤(gel)의 변환이 가능하고, 폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌의 비율에 따라 폴록사머의 성질이 달라진다.
본 발명의 상기 플록사머는 100 내지 20,000 Da의 평균 분자량을 갖는 것일 수 있다.
상기 폴록사머 68, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 폴록사머 68일 수 있다.
상기 약학 조성물은, 상기 약물복합체 100 중량부에 대하여, 폴록사머 10 내지 50 중량부 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 폴록사머 30 내지 50 중량부일 수 있으며, 보다 바람직하게는 40 내지 45 중량부일 수 있다.
상기 약학 조성물은, 상기 약물복합체 100 중량부에 대하여, 용해도를 높이거나 안정화시키기 위해 별도의 첨가물없이 생리식염수를 0.1 내지 1 중량부 포함할 수 있고, 바람직하게는 생리식염수를 0.3 내지 0.6 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
상기 약물복합체와 폴록사머 및 생리식염수는 상기 중합비로 혼합하여 제형화된 복강 내 투여용 약학 조성물로써, 상기 조성물은 평균 직경 80 내지 200 nm의 구형 입자 형태의 에멀젼 제형이 형성된 것일 수 있다. 이때 분산도는 0.2 미만인 것이 바람직하다. 만약 상기 폴록사머 대신 다른 첨가제가 사용되거나, 상기 중량비를 범위를 벗어나 혼합할 경우에는, 평균 직경 80 내지 200 nm, 분산도 0.2 미만인 구형 입자 형태의 에멀젼 제형을 얻을 수 없게 될 수 있다.
상기 약학 조성물의 제형이 평균 직경 80 nm 미만일 경우에는 (a) 약물복합체가 안정적이지 못해 생체 내에서 쉽게 분해되는 문제가 발생할 수 있고, 분산도가 0.2 이상일 경우에는 균일하지 못하기 때문에 정확하게 약물용량을 제어할 수 없어지는 문제가 발생할 수 있다.
상기 약학 조성물은 생체 내에서는 매우 안정적으로 존재하다가 종양세포의 카텝신 B 효소 존재 하에서, (a) 약물복합체의 양친매성 펩타이드가 분해되어, 상기 약물복합체 나노입자 코어 부분에 위치하던 상기 항암제가 방출되는 것이다.
본 발명에서 '난소암'은 내성 난소암, 재발 난소암 및 전이 난소암을 포함하는 것일 수 있다. 상기 전이 난소암이란, 난소암세포가 원발 장기를 떠나 다른 장기로 이동하여 증식되어 발생된 암을 의미한다. 바람직하게는 난소암에서 암세포가 주위 장기로 침습하거나, 혈관이나 림프관을 따라 다른 장기로 전이된 것을 의미할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 재발 난소암이란, 최초 난소암 발생 후 치료로 인해 완치 판정을 받은 후, 난소에 다시 암이 발생한 경우를 의미한다.
본 발명에서 내성 난소암이란, 방사선 치료법과 같은 암 치료요법 또는 암 치료용 약물, 특히 항암제 치료에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어, 상기 치료법에 의해 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료 증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성 난소암은 특정한 치료법에 대하여 처음부터 내성을 갖는 것일 수 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 난소암 세포 내의 유전자 변이 등에 의하여 동일한 치료에 대해 더 이상 감수성을 나타내지 않게되어 발생할 수도 있다.
본 발명에서 예방은 약학 조성물의 투여에 의한 난소암 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 치료는 약학 조성물의 투여에 의해 난소암 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학 조성물의 투여형태는 주사에 의한 복강내 투여경로인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 복강 투여 또는 복강 내 투여는 복강 내로의 주사를 말한다. 본 발명의 약학 조성물을 복강 투여하면 전신 방출이 거의 없고, 난소암에 대해 특이적 항암 효과를 선택적으로 제한할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 약제학적으로 유효한 양은 "치료 유효량" 및 "예방 유효량"을 포함한다. 용어 "치료 유효량"은 약물 또는 치료제가 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 나타낼 수 있는 약물의 임의의 양을 의미한다. 용어 "예방 유효량"은 난소암 발생 위험이 있는 개체 또는 난소암 전이 또는 재발로 인해 고통받을 위험이 있는 개체에서 난소암의 발생, 전이 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양을 의미한다. 유효량의 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 난소암을 갖는 개체의 질환 발병 정도에 따라 본 발명의 약학 조성물을 1회 또는 수회로 나누어 바람직한 투여간격, 예컨대 3일 간격으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 복강을 통해 그 효과를 나타냄에 있어, 최적의 용량은 투여되는 개체의 단위 무게(1 kg) 기준으로, (a) 약물복합체가 1 내지 1000 mg 포함되는 것이며, 가장 바람직하게는 40 내지 60 mg임을 확인하였다. 상기 용량보다 적은 경우 약물의 효과를 기대하기 어려우며, 상기 용량보다 많은 경우에는 약물의 과잉투여로 인한 비특이적인 부작용 또는 치료 효눙의 감소가 나타나는 문제가 있다.
동물실험결과에 따르면, (a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제인 독소루비신이 결합된 약물복합체와 (b) 폴록사머 및 (c) 생리식염수를 혼합한 제제를 준비하고, 이를 동물모델에 복강 내 주사를 통해 투여되었을 때, 난소암에 대한 특이적 축적효율과 다른 조직에 대한 부작용을 최소화하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 약학 조성물이 투여될 때, 난소암에 대한 항암효과를 나타내기 위해서는, 단위 무게(1 kg) 기준으로, (a) 약물복합체를 1 내지 1000 mg 포함하는 것이 바람직하며, 2 배 이상의 항암효과를 얻기 위해서는 40 내지 60 mg 포함되는 조성물을, 3일 간격으로 투여하는 것이 가장 바람직하다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 다른 치료제와 병용하여 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물과 다른 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 다른 치료제는 암 퇴행을 촉진하거나 또는 추가로 종양 성장을 방지하는 화합물, 단백질 등의 약물일 수 있으며, 또한 방사선 치료 등 약물 요법 이외의 기타 항암 요법을 모두 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 난소암을 갖는 개체에 복강 내 투여용 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 난소암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 복강 내 투여용 약학 조성물은 a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체; b) 폴록사머 68; 및 c) 생리식염수;를 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 난소암 예방 또는 치료 방법에서 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한, 상기 복강 내 투여용 약학 조성물에서 상기한 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서 용어 "개체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그일 수 있다. 상기 개체는 바람직하게 인간일 수 있다. 용어 "개체"는 본 명세서에서 "대상체" 및 "환자"와 상호교환적으로 사용 가능하다.
상기 난소암 치료는 예를 들면 비치료 개체에 비해 종양 성장을 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 40% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 투여방법은, 난소암에 대한 항암효과를 나타내기 위해, 단위 무게(1 kg) 기준으로, (a) 약물복합체를 1 내지 1000 mg 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것이 바람직하며, 2 배 이상의 항암효과를 얻기 위해서는 (a) 약물복합체가 40 내지 60 mg 포함되는 약학 조성물을, 3일 간격으로 투여하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여형태는 주사에 의한 복강내 투여경로인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 복강 투여 또는 복강 내 투여는 복강 내로의 주사를 말한다. 본 발명의 약학 조성물을 복강 투여하면 전신 방출이 거의 없고, 난소암에 대해 특이적 항암 효과를 선택적으로 제한할 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다
실시예 1. 종양 특이적 항암제 전구체 나노입자(FRRG-DOX)(약물복합체) 합성
1) 실험재료
Trt-Cl 수지와 모든 Fmoc 아미노산은 GL Biochem(Shanghai, China)로부터 구입하였다. 커플링 시약(coupling reagent)과 cleavage cocktail 시약은 Sigma Aldrich에서 구입하였으며, 이외 다른 용매들은 대정 화학(Daejung Chemical, Korea)에서 구입하였다.
2) 양친매성 펩타이드(FRRG) 합성
각 펩타이드는 일방적인 Fmoc SPPS(고상 펩타이드 합성; Solid phase peptide synthesis)에 따라 합성하였고, 이때 ASP48S(Peptron, Inc., Korea)의 펩티드 합성기를 이용하여 합성하고자 하는 아미노산 서열(FRRG(서열번호 1))을 합성하였다. 합성과정에서 표준 아미노산 보호기(fmoc)를 사용하였다.
구체적으로 상기 Fmoc 보호기를 제거하기 위하여, 10 분 동안 2차례에 걸쳐 20% piperidine를 포함하는 DMF로 rocking하였고, DMF 용매 하에서, Fmoc 아미노산(8 eq), HOBT(8 eq), HBTU(8 eq), DIPEA(16 eq)를 사용하여 2 시간 동안 커플링(coupling)을 수행하였다. 각 단계에서 레진을 DMF와 메탄올로 2 차례에 걸쳐 세척한다.
설계된 시퀀스의 펩타이드가 완성된 후, crude 펩타이드를 레진으로부터 분리하기 위하여, TFA/EDT/Thioanisole/TIS/DW 용액(90/2.5/2.5/2.5/2.5 Volume)으로 2 시간동안 반응시켰다. 상기 용액을 차가운 에테르(Ether)로 침전시키고, 원심분리하여 펠렛(pellet)을 분리하였다. 이를 증발 과정을 통해 분말형태로 수득하였다.
상기 수득한 crude 펩타이드를 증류수에 용해하고, Vydac Everest C18 컬럼(250 ㎜×22 ㎜, 10 ㎛, USA)를 사용한 역상 HPLC(Shimadzu prominence HPLC, Japan)으로 정제하였다. 이때 용리(elution)는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)를 함유하는 물-아세토니트릴 선형 구배 용리액(water-acetonitrile linear gradient)(10~75%(v/v) of acetonitrile)으로 수행하였다. 정제한 펩타이드의 분자량(molercular weights)은 LC/MS(Shimadzu LC/MS-2020 series, Japan)을 사용하여 확인하였고, FDT12012(Operon, Korea)을 사용하여 동결건조하였다.
3) FRRG-DOX 약물복합체 합성
상기 단계를 통해 제조된 FRRG의 양친매성 펩타이드를 각각 물에 녹이고, 독소루비신(doxorubicin)을 첨가한 후, 상온에서 24 시간동안 교반하였다. 얻어진 펩타이드를 역상 HPLC(물-아세토나이트릴, 0.1% TFA)로 정제하였다.
독소루비신(doxorubicin), FRRG 펩타이드 및 이들이 결합하여 형성된 약물복합체(FRRG-DOX)의 화학적 구조를 분석하기 위하여, DMSO-d6에 용해하고 600 MHz 1H-NMR(DD 2600 MHz FT NMR, Agilent Technologies, USA)로 특징 피크를 확인하였다. FRRG-DX와 G-DOX(FRRG-DOX로부터 절단된 펩타이드 단편)의 분자량은 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization)(AB Sciex TOF/TOF 5800 System, USA)(with cyano-4-hydroycinnamic acid matrix)로 분석하였다.
실시예 2. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)
상기 실시예 1을 통해 합성된 약물복합체(FRRG-DOX)의 생체 내 안정성을 향상시키 위하여 수용액 상에서 상기 약물복합체와 폴록사머 68(poloxamer-68)을 혼합(simple mixing)하여 제형화하였다. 상기 약물복합체는 수용액 내에서 자기조립을 통해 구형의 나노입자를 형성하나, 생체 내에서 불안정하므로 폴록사머 68을 통해 고분자 기반 나노 제형화하였다.
구체적으로 상기 FRRG-DOX 약물복합체(21 mg; 독소루비신 함량: 10.2 mg)와 폴록사머 68(9 mg)을 3차 증류수 5 ㎖에 각각 분산시킨 후, FRRG-DOX를 분산시킨 수용액에 폭록사머 68을 분산시킨 수용액을 천천히 떨어뜨린 뒤, 4시간 교반 후 동결건조하여 붉은색 분말의 제형화된 제제(FDOX)를 수득하였다. 상기 제제는 투여하기 전까지 분말상태로 보관하고, 투여 직전에 제제 30 mg(약물복합체 21 mg+폴록사머 9 mg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시켜 복강 내 투여용 조성물로 제조한 다음 사용하였다. 분명한 구분을 위해 이를 "FDOX"라고 표기하였다.
실험예 1. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 생체 내 약력학/약동학(PK/PD) 평가
종양 특이적 항암제 전구체 나노입자를 복강 내 투여용 조성물(FDOX)(실시예 2)로 제형화한 후, 이에 대한 생체 내 약력학/약동학(PK/PD) 평가를 수행하고자 하였다. 우선, Nara Bio(경기도, 한국)에서 구입한 흉선 누드 마우스(6 주령, 20 - 25 g, 수컷)(Balb/c nu/nu)를 이용하여 수행하였다. 상기 실험동물은 실험 전 약 1주간 표준먹이와 물을 자유롭게 공급하였고, 25 ℃ 무균 clean room에서 사육하였다. 모두 건강한 상태에서 동물실험에 적용하였다.
상기 실험동물에 1 × 106 개의 HeyA8 난소암 세포를 복강 내에 접종하여 난소암 동물모델을 제작하였다. 난소암 세포를 이식하고 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.
상기한 바와 같이 제작된 난소암 동물모델을 2개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 또는 독소루비신을 복강 내 투여하도록 준비하였다.
구체적으로 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 복강 내에 3일마다 주사하였고, 비교군은 독소루비신 6.4 mg/kg을 생리식염수 0.1 ㎖에 분신시킨 용액을 복강 내에 3일마다 주사하였다. 투여 시점부터 0, 1, 2, 3, 6, 9, 24, 48 시간 후에 동물모델로부터 각 장기(간, 폐, 심장, 비장, 신장, 장(intestine), 혈장(plasma) 및 복수(ascties))를 채취한 뒤 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여, 각 장기 내에 존재하는 항암제의 농도를 검출하여 도 1에 나타내었다. 도 1의 결과를 기반으로 Origin 2020 소프트웨어를 이용하여 각 장기의 Area Under(the) Curve를 산출하여 하기 표 1에 정리하였다. *<0.05, **<0.01, ***<0.001 (compared to control group given DOX)
Organ AUC(0-24h)
비교군(DOX) 제1실험군(FDOX)
Liver 1613.04 ± 197.26 908 ± 95.97**
Lung 175.57 ± 8.3 94.76 ± 3.55***
Spleen 37.48 ± 4.43 15.85 ± 3.47*
Kidney 87.05 ± 19.86` 40.58 ± 9.33*
Heart 25.28 ± 3.88 16.47 ± 1.41*
Intestine 4226.073 ± 477.55 2400.93 ± 298.73**
Plasma 8.66 ± 1.14 76.04 ± 9.78***
Ascites 10.85 ± 3.57 41.23 ± 5.96*
도 1 및 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 복강 투여용 조성물은 종래 항암제에 비해 종양세포 외에 다른 장기에 축적이 현저히 낮음을 알 수 있다(약 1.5~2배). 실시예 2의 복강 투여용 조성물은 혈액과 복수 내에 존재하고, 이외 주변 장기로는 거의 축적되지 않음을 확인하였다.
실험예 2. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 종양 축적 효율 평가
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 제1실험군(복강 내 투여용 조성물 20.1 mg/kg; 독소루비신 기준 6.4 mg/kg)과 비교군(독소루비신 6.4 mg/kg)을 제조하고 투여한 후, 1 시간, 3 시간, 6 시간마다 각각의 제1실험군과 비교군을 마취하고 희생시킨 다음, 배 부위 피부를 제거하고 생체 형광 분석장치(IVIS)를 이용하여 실시예 2의 복강내 투여용 조성물과 종래 독소루비신의 축적 정도를 평가하였다.
도 2a는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 후, 시간에 따라 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이고, 도 2b는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 뒤 6 시간이 지난 후의 모습(좌측), IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지(우측)이며, 도 2c는 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)을 투여한 6 시간이 지난 후, 각 장기(간, 폐, 비장, 신장, 심장) 및 암 조직을 적출하여 IVIS 장비로 측정하여 나타낸 이미지이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 복강 내 난소암의 위치를 확인하기 위하여 실험예 1로부터 제조된 제1실험군(복강 내 투여용 조성물)과 비교군(독소루비신)의 배 부위 피부를 제거한 뒤, IVIS 장비를 이용해 촬영하였다. 그 결과 실험예 1로부터 제조된 제1실험군은 복강 내 투여용 조성물이 특이적으로 암 조직에 다량 축적됨을 확인하였다. 비교군의 경우, 6시간이 지나도 독소루비신이 암조직에서 전혀 확인되지 않음을 알 수 있다.
실험예 3. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 생체 내 난소암 치료 효능 평가
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 난소암 동물모델을 제작하였고, 난소암 세포를 이식하고, 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.
난소암 동물모델을 3개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 또는 독소루비신을 복강 내 투여하도록 준비하였다. 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고 제2실험군은 난소암 동물모델에 복강 내 투여용 조성물을 40.2 mg/kg(독소루비신 기준 12.8 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고, 비교군은 독소루비신(6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였다. 대조군(control)으로는 생리식염수 0.1 ㎖을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사한 난소암 동물모델을 사용하였다.
투여 20일이 지난 후, 실험군과 비교군의 난소암 동물모델을 안락사하여 복강 내 난소암 조직을 수득하였다. 적출한 난소암 조직은 크기와 무게를 저울로 측정하였다. 또한 각 군으로부터 얻은 난소암 조직을 파라핀 블록 및 10 ㎛ 두께의 조직 슬라이드를 만든 후, 상기 조직 슬라이드를 이용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V로 염색하고, 현미경으로 측정하였다.
도 3a는 대조군, 제1실험군 및 비교군을 투여한 후, 20일째 종양 조직의 모습을 촬영한 사진이고, 이에 따르면 제1실험군 및 비교군의 종양 조직 부피가 가장 작은 것을 확인하였다. 다만 비교군의 경우 종양조직 외에 다른 장기의 색 역시 좋지 않았으나, 제1실험군은 종양조직의 부피가 작음에도 다른 장기의 빛이 건강한 선홍빛을 띄고 있음을 확인하였다.
도 3b는 대조군, 제1실험군(1xFDOX), 제2실험군(2xFDOX) 및 비교군(DOX) 투여 후, 20일째에 종양 무게를 측정한 그래프로(* p<0.01, ** p<0.001), 이에 따르면 제1실험군에서의 종양 무게가 가장 작은 것을 확인하였다.
도 3c는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 종양 조직의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과로, 이에 따르면 제1실험군 및 비교군의 경우 종양 세포 사멸이 유의하게 유도됨을 확인하였다.
실험예 4. 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 생체 내 독성 평가
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 난소암 동물모델을 제작하였고, 난소암 세포를 이식하고, 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.
난소암 동물모델을 2개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 또는 독소루비신을 복강 내 투여하도록 준비하였다. 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX) 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고, 비교군은 독소루비신(6.4 mg/kg)을 생리식염수 0.1 ㎖에 분산시킨 용액을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였다. 대조군(control)으로는 생리식염수 0.1 ㎖을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사한 난소암 동물모델을 사용하였다.
투여 20일이 지난 후, 제1실험군과 비교군의 난소암 동물모델을 안락사하여 간 조직, 폐 조직, 비장 조직, 신장 조직, 장(intestine) 조직 및 심장 조직을 수득하였다. 적출한 각 조직의 무게를 저울로 측정하였다(도 4b). 또한 각 군으로부터 얻은 주요조직(폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직)을 파라핀 블록 및 10 ㎛ 두께의 조직 슬라이드를 만든 후, 상기 조직 슬라이드를 이용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V로 염색하고, 현미경으로 측정하였다(도 4a). 또한 대조군, 제1실험군 및 비교군 제조 후, 실험 동안 각 개체의 체중을 2일 마다 측정하였다(도 4c).
생존율 평가로, 총 2주간의 실험기간 중 2일 마다 대조군, 제1실험군 및 비교군을 관찰하여, 사망한 개체와 생존한 개체를 기록하고, 이의 비율을 기록하여 평가하였다(도 4d).
혈액학적 분석(Blood examination)은, 대조군, 제1실험군 및 비교군 제조 후, 20일째 혈액을 채취한 다음, 전혈구검사(CBC; WBCB, LYM, HCT, MCV, MCHC, MPV, NEUT, PLT), 혈청화학검사(BUN, ALT, AST, ALP, Albumin), 혈당(glucose), 혈중 단백질(Total protein), 중성지방(TG), 콜레스테롤(cholesterol) 분석을 실시하여 이상 유무를 체크하였다.
도 4a는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일 째 각 주요조직(폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직)의 조직형태학적 변화에 미치는 영향을 조사한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Annexin V 염색 결과로, 이에 따르면 비교군은 폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직에서 세포 사멸이 관찰되었다. 이에 반해 제1실험군은 폐 조직, 비장 조직 및 심장 조직에서 세포 사멸이 전혀 관찰되지 않았다.
도 4b는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 각 주요조직(간 조직, 폐 조직, 비장 조직, 신장 조직, 장(intestine) 조직 및 심장 조직)의 무게를 측정한 그래프로, 이에 따르면 비교군은 다른 장기조직에서 대조군보다 무게가 크게 감소하였다(특히, 간 조직과 장 조직). 반면, 제1실험군은 종양 조직을 제외한 다른 조직(간, 폐, 비장, 신장, 심장, 장)의 무게가 대조군과 차이가 없었다.
도 4c는 투여기간에 따른 대조군, 제1실험군 및 비교군의 치료 20일동안 체중을 측정한 그래프(* p<0.01, ** p<0.001)로, 비교군의 체중은 2일이 지난후부터 급격히 감소하였다. 제1실험군은 대조군과 체중 차이가 없음을 확인하였다.
도 4d는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 투여 기간에 따른 생존율을 평가한 그래프로, 이에 따르면 비교군은 10일부터 급격하게 사망률이 증가하여, 14일째에는 생존율이 0%였다. 이에 반해 제1실험군은 대조군과 생존율에 별 차이가 없음을 확인하였다(생존율 100%). 또한 제1실험군은 기력저하, 과민반응, 소화기 부작용 등의 약물 부작용도 관찰되지 않았다.
도 4e는 대조군, 제1실험군 및 비교군 투여 후, 20일째 채취한 혈액으로부터 혈액검사를 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 제1실험군은 대조군과 유사한 정도로, 특이할만한 변화는 관찰되지 않았고, 모든 수치는 참고범위 내에 존재하는 것으로 확인되었다. 다만 비교군의 경우 대조군과 비교하여 혈액학적 지표가 크게 변화한 것으로 확인되었다.
실험예 5. 투여경로에 따른 복강 내 투여용 조성물(FDOX)의 효과
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 난소암 동물모델을 제작하였고, 난소암 세포를 이식하고, 14일이 경과한 후 실험을 진행하였다.
난소암 동물모델을 3개의 그룹으로 나누어 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물(FDOX)을 정맥 및 복강 내 경로로 투여하도록 준비하였다. 제1실험군은 난소암 동물모델에 실시예 2로부터 제조된 복강 내 투여용 조성물 20.1 mg/kg(독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사하였고, 제1비교군은 복강 내 투여용 조성물(FDOX; 독소루비신 기준 6.4 mg/kg)을 정맥 투여로 3일 마다 20일 동안 투여하였다. 대조군(control)으로는 생리식염수 0.1 ㎖을 복강 내에 3일 마다 20일 동안 주사한 난소암 동물모델을 사용하였다.
투여 20일이 지난 후, 제1실험군, 제1비교군 및 대조군의 난소암 동물모델을 안락사하여 난소암 조직, 간 조직, 폐 조직, 신장 조직을 수득하였다. 적출한 각 조직의 무게를 저울로 측정하여, 평균값을 표 2에 나타내었다(표 2).
Organ 대조군 제1비교군
(정맥)		 제1실험군
(복강)
Liver 1104 g 1141 g 1126 g
Lung 171 g 161 g 183 g
Kidney 382 g 391 g 401 g
난소암 2.55 g 0.87 g 0.57 g
표 2에 나타난 바와 같이, 복강 내 주사를 통해 투여되었을 때, 난소암에 대한 우수한 치료 효과를 얻을 수 있고, 다른 조직에 대한 부작용을 최소화할 수 있음을 확인하였다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Composition for intraperitoneal administration for the prevention or treatment of ovarian cancer <130> HPC9632 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amphipathic peptide <400> 1 Phe Arg Arg Gly 1

Claims (6)

  1. a) 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 항암제가 결합된 약물복합체;
    b) 폴록사머; 및
    c) 생리식염수;를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴록사머는 폴록사머 68, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은, 상기 (a) 약물복합체 100 중량부에 대하여, (b) 폴록사머 10 내지 60 중량부를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은, 상기 (a) 약물복합체 100 중량부에 대하여, (c) 생리식염수 0.1 내지 1 중량부를 함유하는 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 3일 1회 투여하되, 단위 kg당 (a) 약물복합체가 40 내지 60 mg 투여되도록 포함하는 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 복강 주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 약학 조성물.
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Jinseong Kim et al., Journal of Controlled Release, 2021, vol.330, pp.920-932(2020.11.02. 온라인 공개) *

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