MX2011004550A - Composiciones de de supercóntigos a base de dominios de fibronectina tipo iii, métodos y usos. - Google Patents

Abstract

Una estructura de proteína a base de una secuencia de consenso de proteínas de fibronectina tipo III (FN3), como la décima repetición FN3 de fibronectina humana (Tenascina humana), incluyendo ácidos nucleicos aislados que codifican una estructura de proteína, vectores, células hospederas y métodos para hacer y utilizar las mismas que tienen aplicaciones en el diagnóstico y/o composiciones terapéuticas y métodos para hacer y utilizar las mismas que tienen aplicaciones en el diagnóstico y/o composiciones terapéuticas, métodos y dispositivos; en particular, moléculas de estructura de proteína que se unen a lgG han sido identificadas como útiles para diagnóstico y/o aplicaciones terapéuticas.

Description

COMPOSICIONES DE SUPERCÓNTIGOS A BASE DE DOMINIOS DE FIBRONECTINA TIPO III, MÉTODOS Y USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con supercóntigos de proteína con propiedades novedosas, que incluyen la capacidad de unirse a objetivos celulares. Más particularmente, la presente invención se dirige a un supercóntigo de proteína a base de una secuencia consenso de una repetición de fibronectina tipo III (FN3).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales son la clase de proteínas terapéuticas más ampliamente usada cuando se requiere alta afinidad y especificidad para una molécula objetivo. Sin embargo, las proteínas que no son anticuerpos que se pueden diseñar para unirse a tales objetivos también son de gran interés en la industria biofarmacéutica. Estas proteínas "supercóntigo alternativas" pueden tener ventajas en comparación con los anticuerpos tradicionales debido a su pequeño tamaño, falta de enlaces disulfuro, alta estabilidad y capacidad de expresarse en huéspedes procariotas. Se aplica fácilmente novedosos métodos de purificación; éstos se combinan fácilmente con fármacos/toxinas, penetran eficazmente en los tejidos y se constituyen fácilmente en ligandos multiespecíficos (Skerra 2000, Binz and Pluckthun 2005).

Uno de estos supercóntigos alternativos es el grupo de la inmunoglobulina (Ig). Este grupo se encuentra en las regiones variables de los anticuerpos, así como en miles de proteínas que no son anticuerpos. Se ha demostrado que una proteína Ig así, la décima repetición de fibronectina tipo III (FN3) de fibronectina humana, puede tolerar muchas mutaciones en las ondas de superficie expuestos mientras retiene la estructura general del grupo de Ig. De este modo, se ha construido genotecas de variantes de aminoácidos en estas ondas y ligandos específicos seleccionados para muchos objetivos distintos (Koide y otros; 1998, Karatan y otros; 2004). Se ha descubierto que tales dominios FN3 diseñados se unen a los objetivos con gran afinidad, mientras retienen importantes propiedades biofísicas (Parker y otros; 2005).

Las propiedades físicas deseadas de las potenciales moléculas supercóntigo alternativas incluyen alta estabilidad térmica y reversibilidad del grupo y desgrupo térmico. Se ha aplicado muchos métodos para incrementar la aparente estabilidad térmica de las proteínas y enzimas; estos métodos incluyen el diseño racional en base a la comparación con secuencias termoestables altamente similares, el diseño de puentes disulfuro estabilizantes, las mutaciones para incrementar la propensión de la hélice a, la creación de puentes de sal, la alteración de la carga de superficie de la proteína, la evolución dirigida y la composición de secuencias consenso (Lehmann and Wyss 2001). La alta estabilidad térmica es una propiedad deseada de tales supercóntigos debido a que puede incrementar la producción de proteina recombinante obtenida, mejorar la solubilidad de la molécula purificada, mejorar la actividad de supercóntigos intracelulares, disminuir la inmunogenicidad y minimizar la necesidad de una cadena fría en la fabricación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un supercóntigo de proteína en base a una repetición de proteína fibronectina tipo III (FN3), ácidos nucleicos codificantes o complementarios, vectores, células huésped, composiciones, combinaciones, formulaciones, dispositivos y métodos de fabricación y uso. En una modalidad preferida el supercóntigo de proteína está comprendido de una secuencia consenso de múltiples dominios FN3 de tenascina-C humana (de aquí en adelante "tenascina"). En una modalidad preferida adicional, el supercóntigo de proteína de la presente invención es una secuencia consenso de 15 dominios FN3. Los supercóntigos de proteína de la invención se pueden diseñar para unir varias moléculas, por ejemplo, una proteína objetivo celular.

Los supercóntigos de proteína de la invención pueden incluir moléculas o porciones adicionales, por ejemplo, la región Fe de un anticuerpo, el dominio de unión de albúmina u otra porción que afecte la vida media. En otras modalidades los supercóntigos de proteína de la invención se pueden unir a una molécula de ácido nucleico que puede codificar el supercóntigo de proteína.

La presente invención proporciona, además, por lo menos un método para expresar por lo menos un supercóntigo de proteína a base de una secuencia consenso de múltiples dominios FN3 en una célula huésped; el método comprende cultivar una célula huésped tal como se describe en la presente descripción bajo condiciones en donde por lo menos un supercóntigo de proteína se expresa en cantidades detectables y/o recuperables.

La presente invención proporciona, además, por lo menos una composición que comprende (a) un supercóntigo de proteína a base de una secuencia consenso de múltiples dominios FN3 y/o que codifica ácido nucleico, tal como se describe en la presente; y (b) un portador o diluyente adecuado y/o farmacéuticamente aceptable.

La presente invención comprende, además, un método para generar genotecas de un supercóntigo de proteína en base a una repetición de proteína fibronectina tipo III (FN3), preferentemente, una secuencia consenso de múltiples dominios FN3 y, con mayor preferencia, una secuencia consenso de múltiples dominios FN3 de tenascina humana. La genoteca se forma con la elaboración de generaciones sucesivas de supercóntigos mediante la alteración (por mutación) de aminoácidos o de la cantidad de aminoácidos en las moléculas en posiciones en particular en las porciones del supercóntigo, por ejemplo, regiones de ondas. Las genotecas se pueden generar mediante la alteración de la composición de aminoácidos de una onda único o la alteración simultánea de múltiples ondas o posiciones adicionales de la molécula supercóntigo. Las ondas que se encuentran alterados se pueden alargar o acortar según el caso. Tales genotecas se pueden generar para incluir todos los aminoácidos posibles en cada posición o un subgrupo diseñado de aminoácidos. Los miembros de la genoteca se pueden usar para analizar por visualización, tal como visualización in vitro (visualización de ADN, RNA, ribosomas, etc.) visualización de levaduras, bacterias y fagos.

Los supercóntigos de proteína de la presente invención proporcionan propiedades biofísicas mejoradas, tales como estabilidad bajo condiciones de reducción y solubilidad a altas concentraciones; se pueden expresar y plegar en sistemas procariotas, tales como E. coli, en sistemas eucariotas, tales como levaduras, y en sistemas de transcripción/traducción in vitro, tales como el sistema de lisado de reticulocitos de conejo En un aspecto adicional la presente invención proporciona un método para generar una molécula supercóntigo que se une a un objetivo en particular mediante la extracción de la genoteca de supercóntigos de la invención con el objetivo y la detección de ligandos. En otros aspectos relacionados la presente invención comprende métodos de ensayo que se pueden usar para generar o madurar la afinidad de los supercóntigos de proteína con la actividad deseada, por ejemplo, la capacidad de unirse a proteínas objetivo con cierta afinidad. La maduración de la afinidad se puede obtener mediante ciclos repetitivos de mutagénesis y selección con el uso de sistemas, tales como visualización de fagos o visualización in vitro. La mutagénesis durante este proceso puede ser resultado de la mutagénesis sitio dirigida a residuos de un supercóntigo específico, la mutagénesis aleatoria debido a la PCR propensa a errores, el barajado de ADN y/o una combinación de estas técnicas. La presente invención proporciona, además, cualquier invención descrita en la presente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. El análisis SDS-PAGE de Tencon purificado realizado en un gel Bis-Tris NuPAGE al 4-12 % (Invitrogen) y teñido con azul de Coomassie. N representa las condiciones naturales y R las condiciones reducidas.

Figura 2. Análisis de dicroísmo circular de Tencon en PBS.

Figura 3. Análisis de DSC (por sus siglas en inglés) del 3.° dominio FN3 de Tenascina y Tencon en PBS. Se obtuvo temperaturas de fusión de 54 °C y 78 °C, respectivamente.

Figura 4. Diseño de plásmidos Phagemid de pTencon-pIX. La expresión está dirigida por un promotor Lac y la secreción por medio de la secuencia señal de OmpA.

Figura 5. Visualización de Myc-Tencon en el fago M13. Resultados del análisis ELISA que muestran unión del fago a las cajas recubiertas de a-Myc, recubiertas de CNT095 y sin recubrimiento.

Figura 6. Estructura día onda del 3.° dominio FN3 de tenascina humana.

Figura 7. Análisis de la salida de las selecciones de IgG por medio de ELISA. Se analizó la unión de clones individuales a IgG biotinilada o HSA biotinilada como control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un supercóntigo de proteína aislada, recombinante y/o sintético a base de una secuencia consenso de repetición de proteína fibronectina tipo III (FN3) que incluye, sin limitarse a, un supercóntigo derivado de mamíferos, así como composiciones y moléculas de ácido nucleico codificantes que comprenden por lo menos un polinucleótido que codifica supercóntigos de proteína en base a la secuencia FN3 consenso. La presente invención incluye, además, pero no se limita a, métodos para elaborar y usar tales ácidos nucleicos y supercóntigos de proteína, que incluyen composiciones diagnósticas y terapéuticas, métodos y dispositivos.

Los supercóntigos de proteína de la presente invención ofrecen ventajas en comparación con la terapéutica convencional, tales como la capacidad de administrar localmente, oralmente o cruzar la barrera hematoencefálica, la capacidad de expresarse en E. Coli, lo que permite una expresión incrementada de proteína en función de los recursos en comparación con la capacidad de expresión de las células de mamíferos de ser integradas en moléculas biespecíficas que se unen a objetivos múltiples o epítopes múltiples del mismo objetivo, la capacidad de combinarse con fármacos, polímeros y sondas, la capacidad de formularse a altas concentraciones y la capacidad de tales moléculas de penetrar efectivamente tejidos enfermos y tumores.

Además, los supercóntigos de proteína tienen muchas de las propiedades de los anticuerpos en lo que respecta a su grupo, el cual imita la región variable de un anticuerpo. Esta orientación permite que las ondas FN3 se expongan de manera similar a las regiones determinantes de la complementariedad de los anticuerpos (CDR). Deberían tener la capacidad de unirse a objetivos celulares y las ondas se pueden alterar, por ejemplo, al madurar la afinidad, para mejorar cierta unión o propiedades relacionadas.

Tres de las seis ondas del supercóntigo de proteína de la invención corresponden de manera topológica a las regiones determinantes de complementariedad (CDR 1-3), es decir, regiones de unión a antígenos, de un anticuerpo, mientras que las tres ondas restantes tienen la superficie expuesta de forma similar a las CDR de los anticuerpos. Estas ondas se encuentran en o cerca de los residuos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 y 75-81 de la SEQ ID NO:16, tal como se muestra más adelante en la Tabla 3 y en la Figura 6. Preferentemente, las regiones onda en o cerca de los residuos 22-28, 51-54 y 75-81 están alteradas en su especificidad de unión y afinidad. Una o más de estas regiones onda están aleatorizadas con otras regiones onda y/u otras cadenas para mantener sus secuencias como porciones de la cadena principal para alimentar una genoteca y de la genoteca se puede seleccionar ligandos potentes con alta afinidad por una proteína objetivo en particular. Una o más de las regiones onda pueden interactuar con una proteína objetivo de forma similar a una interacción de la CDR de un anticuerpo con la proteína.

Los supercóntigos de la presente invención pueden incorporar otras subunidades, por ejemplo, mediante la interacción covalente. Toda la región constante de un anticuerpo o una porción de ésta se puede unir al supercóntígo para impartir propiedades similares a las de los anticuerpos, por ejemplo, actividad de complemento (ADCC), vida media, etc. Por ejemplo, se puede proporcionar o controlar la función efectora, por ejemplo, mediante la modificación de la unión a C1 q y/o la unión a FcyR y, de ese modo, se cambia la actividad CDC y/o la actividad ADCC. Las "funciones efectoras" son responsables de activar o disminuir una actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto). Los ejemplos de funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a: unión a C1 q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras pueden requerir la combinación de la región Fe con un dominio de unión (por ejemplo, ondas de supercóntigos de proteína) y se pueden analizar con el uso de varios ensayos (por ejemplo, ensayos de unión a Fe, ensayos de ADCC, ensayos de CDC, etc.).

Además, a la molécula supercóntígo se puede unir una combinación de toxinas, albúmina o ligandos de albúmina y moléculas de polietilenglicol (PEG) para obtener las propiedades deseadas. Cualquiera de estas funciones se puede generar por medio de técnicas estándar, por ejemplo, mediante la expresión de la proteína de fusión de un gen recombinante de fusión que se fabrica con el uso de secuencias de genes disponibles al público.

Los supercóntigos de la presente invención se pueden usar como monoespecíficos en forma monomérica o como bi- o multiespecíficos (para distintos objetivos de proteina o epítopes en el mismo objetivo de proteína) en forma multimérica. Las uniones pueden ser covalentes o no covalentes. Por ejemplo, un supercóntigo dimérico biespecífico tiene una subunidad con especificidad para una primera proteína objetivo o epítope y una segunda subunidad con especificidad para una segunda proteína objetivo o epítope. Las subunidades el supercóntigo se pueden unir en una variedad de configuraciones que pueden incrementar la valencia y, por lo tanto, aumentar la avidez de la unión a antígenos.

Como se usa en la presente invención, un "anticuerpo" incluye cualquier molécula que contenga una proteína o péptido con por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero sin limitarse a, por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión de ligandos de ésta, una región variable de cadena pesada o ligera, una región constante de cadena pesada o ligera, una región supercóntigo o cualquier porción de ésta. Tal anticuerpo también afecta, opcionalmente, un ligando específico, tal como, pero sin limitarse a, en donde tal anticuerpo modula, disminuye, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloquea, inhibe, abroga y/o interfiere con por lo menos una actividad o unión o con la actividad de los receptores o unión, in vitro, in situ y/o in vivo.

El término "anticuerpo" también pretende abarcar anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones específicas y variantes de éstas, que incluyen, pero no se limitan a, miméticos de anticuerpos o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento específico o porción de éstos, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de cadena única, anticuerpos de dominio único y fragmentos de éstos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión a antígenos que se unen a un objetivo en particular. La invención abarca, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos con la capacidad de unirse a un objetivo en particular o porciones de éstos, que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab (por ejemplo, por digestión por papaína), Fab' (por ejemplo, por digestión por pepsina y reducción parcial) y F(ab')2 (por ejemplo, por digestión por pepsina), facb (por ejemplo, por digestión por plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión por pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión por pepsina, reducción parcial y reagregación), Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular) (ver, por ejemplo, Colligan, Immunology, supra).

Tales fragmentos se pueden producir mediante clivaje enzimático, técnicas sintéticas o recombinantes, como se sabe en la técnica y/o tal como se describe en la presente. Los anticuerpos pueden producirse, además, en una gran variedad de formas truncadas con el uso de genes de anticuerpos, en donde uno o más codones de terminación se han introducido corriente arriba del sitio natural de terminación. Por ejemplo, un gen de combinación que codifica una porción de la cadena pesada F(ab')2 se puede diseñar para incluir secuencias de ADN que codifiquen el dominio CHi y/o la región bisagra de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos se pueden unir químicamente mediante técnicas convencionales o se pueden preparar como una proteína contigua con técnicas de ingeniería genética.

Una proteína supercóntigo de la presente invención se puede usar para determinar o efectuar en una célula, tejido, órgano o animal (que incluye mamíferos y seres humanos), para diagnosticar, monitorear, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de o reducir los síntomas de, por lo menos una enfermedad o condición, seleccionada de, pero que no se limita a, por lo menos un trastorno o enfermedad inmune, un trastorno o enfermedad cardiovascular, un trastorno o enfermedad infecciosa, maligna y/o neurológica u otra condición relacionada conocida o específica.

Tal método puede comprender administrar una cantidad efectiva de una composición o una composición farmacéutica que comprende por lo menos una proteína supercóntigo a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que requiera tal modulación, tratamiento, alivio, prevención o reducción de síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad efectiva puede comprender una cantidad de aproximadamente 0.001 a 500 mg/kg por administración única (por ejemplo, el bolo), múltiple o continua o para alcanzar una concentración sérica de 0.01-5000 pg/ml de concentración sérica por administración única, múltiple o continua o cualquier intervalo efectivo o valor dentro de éste, como se ha hecho y determinado con el uso de métodos conocidos, tal como se describe en la presente o como se conoce en las materias relevantes.

Proteína supercóntigo de la presente invención. Producción y generación Por lo menos una proteína supercóntigo de la presente invención se puede producir, opcionalmente, mediante una línea celular, una línea celular mezclada, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, como se conoce bien en la materia. Ver, por ejemplo, Ausubel, y otros; ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, y otros; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lañe, anticuerpos, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Collígan, y otros; eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan y otros; Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Los aminoácidos de una proteína supercóntigo se pueden alterar, agregar y/o eliminar para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, constante de asociación, constante de disociación, avidez, especificidad, vida media, estabilidad, solubilidad o cualquier otra característica adecuada, tal como se conoce en la materia.

Opcionalmente, las proteínas supercóntigo se pueden diseñar con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo las proteínas supercóntigo se pueden preparar, opcionalmente, mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y distintos productos diseñados con el uso de modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y diseñadas. Los modelos tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con experiencia en la materia. Están disponibles los programas informáticos que ilustran y muestran las posibles estructuras de conformación tridimensional de las secuencias candidatas seleccionadas y pueden determinar la posible inmunogenicidad (por ejemplo, el programa de inmunofiltros de Xencor, Inc. de Monrovia, CA). La inspección de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata, es decir, el análisis de los residuos que afectan la capacidad de la proteína supercóntigo candidata de unirse a su antígeno. De este modo, los residuos se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias progenitoras y de referencia de tal manera que se obtenga la característica deseada, tal como la afinidad por el antígeno o antígenos objetivo. Alternativa o adicionalmente a los procedimientos mencionados anteriormente, se puede usar otros métodos adecuados para el diseño.

Ensayo El ensayo de supercóntigos de proteína para detectar la unión específica a proteínas o fragmentos similares se puede lograr convenientemente con el uso de genotecas de visualización de nucleótidos (visualización de ADN o RNA) o péptidos, por ejemplo, la visualización in vitro.

Este método involucra el ensayo de grandes recolecciones de péptidos para detectar miembros individuales que tengan la función o estructura deseada. Las secuencias de nucleótidos o péptidos mostrados pueden ser de 3 a 5000 o más nucleótidos o aminoácidos de longitud, frecuentemente, de 5-100 aminoácidos de largo y, frecuentemente, de aproximadamente 8 a 25 aminoácidos de largo. Además de los métodos sintéticos químicos directos para generar genotecas de péptidos, también se ha descrito diversos métodos de ADN recombinante. Un tipo requiere la visualización de una secuencia de péptidos sobre la superficie de un bacteriófago o una célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de péptidos visualizada en particular. Tales métodos se describen en la publicación de las patentes del PCT núms. 91/17271 , 91/18980, 91/19818 y 93/08278.

Otros sistemas para generar genotecas de péptidos tienen aspectos tanto de métodos de síntesis química in vitro como recombinantes. Ver, la publicación de las patentes del PCT núms. 92/05258, 92/14843 y 96/ 9256. Ver también las patentes de los Estados Unidos núms. 5,658,754 y 5,643,768. Las genotecas de visualización de péptidos, el vector y los kits de ensayo están disponibles comercia Imente de proveedores tales como Invitrogen (Carlsbad, CA) y Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621 , 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, asignadas a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, asignadas a Dyax, 5427908, 5580717, asignadas a Affymax; 5885793, asignada a Cambridge Antibody Technologies; 5750373, asignada a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, asignadas a Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; o Sambrook, supra.

Los supercóntigos de proteína de la invención pueden unir proteínas humanas o de otros mamíferos con una amplia variedad de afinidades (KD). En una modalidad preferida, por lo menos un supercóntigo de proteína de la presente invención se puede unir, opcionalmente, a una proteína objetivo con gran afinidad, por ejemplo, con una KD igual o menor que aproximadamente 10'7 M, tal como, pero sin limitarse a, 0.1-9.9 (o cualquier intervalo o valor dentro de éste) X 10~8, 10~9, 10 "10, 10 10~12, 0" 13, 10"14, 10"15 o cualquier intervalo o índice dentro de éstos, tal como lo determina la resonancia de plasmones superficiales o el método Kinexa, tal como lo practican las personas con experiencia en la materia.

La afinidad o avidez de un supercóntigo de proteína para un antígeno se puede determinar experimentalmente con cualquier método adecuado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, y otros; " Antibody- Antigen Interactions," En Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); y los métodos descritos en la presente descripción). La afinidad determinada de una interacción en particular de supercóntigo de proteína-antígeno puede variar si se determina bajo distintas condiciones (por ejemplo, concentración de sal, pH). De este modo, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno (por ejemplo, KD, KON, K0ff) se realizan, preferentemente, con soluciones estandarizadas de supercóntigo de proteína y antígeno y un regulador estandarizado, tal como el regulador descrito en la presente descripción.

Se puede realizar ensayos competitivos con el supercóntigo de proteina de la presente invención para determinar qué proteínas, anticuerpos y otros antagonistas compiten por unirse a una proteína objetivo con el supercóntigo de proteína de la presente invención y/o comparten la región epitope. Estos ensayos los conocen fácilmente las personas de habilidad ordinaria en la materia para evaluar la competencia entre antagonistas o ligandos por una cantidad limitada de sitios de unión en una proteína. La proteína y/o anticuerpo se inmoviliza o se insolubiliza antes o después de la competencia y la muestra unida a la proteína objetivo se separa de la muestra no unida, por ejemplo, por decantación (en donde la proteína/anticuerpo se preinsolubilizó) o por centrifugación (en donde la proteína/anticuerpo se precipitó después de la reacción de competencia). Además, la unión competitiva se puede determinar con la alteración de la función mediante la unión o falta de unión del supercóntigo de proteína a la proteína objetivo, por ejemplo, ya sea que la molécula de supercóntigo de proteína inhiba o potencialice la actividad enzímática de, por ejemplo, un marcador. ELISA y otros ensayos funcionales se pueden usar, como se conoce bien en la materia.

Moléculas de ácido nucleico Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican los supercóntigos de proteína pueden estar en forma de RNA, tal como ARNm, ARNnh, ARNt. o cualquier otra forma o en forma de ADN, incluso, pero sin limitarse a, ADNc y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido sintéticamente o cualquier combinación de éstos. El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario o cualquier combinación de éstos. Cualquier porción de por lo menos una cadena del ADN o RNA puede ser la cadena codificante, también denominada secuenciador, o puede ser la cadena no codificante, también denominada cadena no codificante.

Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto (ORF), opcionalmente, con uno o más intrones, por ejemplo, pero que no se limitan a, por lo menos una porción específica de por lo menos un supercóntigo de proteína; moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificante para un supercóntigo de proteína o región onda que se une a la proteína objetivo; y moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica sustancialmente distinta de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, aún codifican el supercóntigo de proteína, tal como se describe en la presente y/o como se conoce en la materia. Por supuesto, el código genético se conoce bien en la materia. De este modo, sería rutinario para un experimentado en la materia generar tales variantes de ácidos nucleicos degenerados que codifican los supercóntigos de proteina específicos de la presente invención. Ver, por ejemplo, Ausubel, y otros; supra y tales variantes de ácido nucleico se incluyen en la presente invención.

Tal como se indica en la presente descripción, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden un ácido nucleico que codifica un supercóntigo de proteína pueden incluir, pero no se limitan a, las que codifican la secuencia de aminoácidos de un fragmento de supercóntigo de proteína por sí mismas; la secuencia codificante para todo el supercóntigo de proteína o una porción de éste; la secuencia codificante para un supercóntigo de proteína, fragmento o porción, así como las secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de por lo menos un líder de señal o péptido de fusión, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, tales como por lo menos un intrón, junto con secuencias no codificantes adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que desempeñan una función en la transcripción, procesamiento de ARNm, que incluyen señales de empalme y poliadenilación (por ejemplo, unión de ribosomas y estabilidad del ARNm); una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. De este modo, la secuencia que codifica un supercóntigo de proteína se puede fusionar a una secuencia de marcadores, tal como una secuencia que codifica el péptido que facilita la purificación del supercóntigo fusionado de proteína que comprende un fragmento o porción del supercóntigo de proteína.

Polinucleótidos que se hibridizan selectivamente con un polinucleótido, tal como se describe en la presente La presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que se hibridizan bajo condiciones de hibridación selectiva con un polinucleótido descrito en la presente descripción. De este modo, los polinucleótidos de la presente modalidad se pueden usar para aislar, detectar y/o cuantificar los ácidos nucleicos que comprenden tales polinucleótidos. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para identificar, aislar o amplificar clones parciales o de longitud total en una genoteca de depósito. En algunas modalidades los polinucleótidos son secuencias genómicas o de ADNc aisladas, o complementarias de otra forma con, un ADNc de una genoteca de ácidos nucleicos humanos o de mamíferos.

Preferentemente, la genoteca de ADNc comprende por lo menos 80 % de secuencias de longitud total, preferentemente, por lo menos 85 % o 90 % de secuencias de longitud total y, con mayor preferencia, por lo menos 95 % de secuencias de longitud total. Las genotecas de ADNc se pueden normalizar para incrementar la representación de secuencias raras. Las condiciones de hibridación de rigurosidad leve o moderada se usan típica, más no exclusivamente, con secuencias que tienen una identidad de secuencias reducida con relación a las secuencias complementarias. Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada o alta se pueden usar, opcionalmente, para secuencias de mayor identidad. Las condiciones de baja rigurosidad permiten una hibridación selectiva de secuencias que tienen aproximadamente 70 % de identidad de secuencias y se pueden usar para identificar secuencias ortólogas o parálogas.

Opcionalmente, los polinucleótidos de la presente invención codifican por lo menos una porción de un supercóntigo de proteína codificado por los polinucleótidos descritos en la presente descripción. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen secuencias de ácido nucleico que se pueden usar para la hibridación selectiva a un polinucleótido que codifica un supercóntigo de proteína de la presente invención. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Construcción de ácidos nucleicos Los aminoácidos aislados de la presente invención se pueden elaborar con el uso de (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación y/o (d) combinaciones de éstos, como se sabe bien en la materia Los ácidos nucleicos pueden comprender, convenientemente, secuencias a parte de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de multiclonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa se puede insertar en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. Además, las secuencias traducibles se pueden insertar para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia de marcadores de hexahistidina proporciona un conveniente medio para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención, sin incluir la secuencia codificante es, opcionalmente, un vector, adaptador o conector para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención.

Es posible agregar secuencias adicionales a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y conectores se conoce bien en la materia. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra) Métodos recombinantes para construir ácidos nucleicos Las composiciones de ácidos nucleicos aislados de la presente invención, tales como RNA, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de éstos, se pueden obtener de fuentes biológicas con el uso de muchísimas metodologías de clonación conocidas para las personas con experiencia en la materia. En algunas modalidades las sondas de oligonucleótidos que se hibridizan selectivamente bajo condiciones rigurosas con los polinucleótidos de la presente invención se usan para identificar la secuencia deseada en una genoteca de ADNc o ADN genómico. El aislamiento de RNA y la construcción de ADNc y genotecas genómicas son bien conocidos por las personas de habilidad ordinaria en la materia. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra) Métodos de ensayo y aislamiento de ácidos nucleicos Una genoteca genómica o de ADNc se puede analizar con el uso de una sonda en base a la secuencia de un polinucleótido de la presente invención, tal como las descritas en la presente descripción. Las sondas se pueden usar para hibridizarse con secuencias de ADN o ADNc genómico para aislar genes homólogos en organismos iguales o diferentes. Las personas con experiencia en la materia notarán que en el ensayo es posible usar varios niveles de rigurosidad de hibridación; y ya sea la hibridación o el medio de lavado puede ser riguroso. A medida que las condiciones de hibridación se hacen más rigurosas, se requiere un nivel mayor de complementariedad entre la sonda y el objetivo para que ocurra la formación de dúplex. El nivel de rigurosidad se puede controlar mediante uno o más de temperatura, fuerza iónica, pH y la presencia de un solvente parcialmente desnaturalizante, tal como la formamida. Por ejemplo, la rigurosidad de hibridación se altera convenientemente al cambiar la polaridad de la solución reactante a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de formamida en el intervalo de 0 % a 50 %. El grado de complementariedad (identidad de secuencias) que se requiere para una unión detectable variará de conformidad con la rigurosidad del medio de hibridación y/o medio de lavado. El grado de complementariedad será, óptimamente, de 100 % o de 70-100 % o cualquier intervalo o valor dentro de éste. Sin embargo, se debe comprender que las variaciones menores de secuencias en las sondas y cebadores se pueden compensar mediante la reducción de la rigurosidad del medio de hibridación y/o de lavado.

Los métodos de amplificación de RNA o ADN se conocen bien en la materia y se pueden usar de conformidad con la presente invención sin experimentación indebida, en base a las enseñanzas y en la guía que se exponen en la presente.

Los métodos conocidos de amplificación de ADN o RNA incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y procesos de amplificación relacionados (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965, 188, otorgadas a Mullís, y otros; 4,795,699 y 4,921 ,794 otorgadas a Tabor, y otros; 5,142,033 otorgada a Innis; 5,122,464 otorgada a Wílson, y otros; 5,091 ,310 otorgada a Innis; 5,066,584 otorgada a Gyllensten, y otros; 4,889,818 otorgada a Gelfand, y otros; 4,994,370 otorgada a Silver, y otros; 4,766,067 otorgada a Biswas; 4,656,134 otorgada a Ringold) y amplificación mediada por RNA que usa RNA no codificante para la secuencia objetivo como plantilla para la síntesis de ADN bicatenario (patente de los Estados Unidos núm. 5,130,238 otorgada a Malek, y otros, con el nombre comercial NASBA), que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra.).

Por ejemplo, la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede usar para amplificar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención y genes relacionados directamente a partir de las genotecas de ADNc o ADN genómico. La PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácidos nucleicos para codificar las proteínas que se expresan, para elaborar ácidos nucleicos para usarlos como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en las muestras, para secuenciación de ácidos nucleicos o para otros propósitos. Los ejemplos de las técnicas que pueden dirigir a personas con experiencia en los métodos de amplificación in vitro se encuentran en Berger, supra, Sambrook, supra y Ausubel, supra, así como Mullís, y otros; patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202 (1987); e Innis, y otros; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Los kits disponibles comercialmente para la amplificación genómica de PCR se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, el kit Advantage-GC Genomic PCR (Clontech). Además, por ejemplo, la proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) se puede usar para mejorar la producción de productos de PCR larga.

Métodos sintéticos para construir ácidos nucleicos Los aminoácidos aislados de la presente invención también se pueden preparar mediante síntesis química directa mediante métodos conocidos (ver, por ejemplo, Ausubel, y otros; supra). La síntesis química produce, generalmente, un oligonucleótido monocatenario que se puede convertir en ADN bicatenario mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una ADN polimerasa con el uso de la cadena única como plantilla. Un experto en la materia sabrá que aunque la síntesis química de ADN puede limitarse a secuencias de aproximadamente 100 o más bases, es posible obtener secuencias más largas mediante la ligación de secuencias más cortas.

Casetes de expresión recombinante La presente invención proporciona, además, casetes de expresión recombinante que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, un ADNc o una secuencia genómica que codifica un supercóntigo de proteína de la presente invención se puede usar para construir un cásete de expresión recombinante que se puede introducir en por lo menos una célula huésped deseada. Un cásete de expresión recombinante comprenderá, típicamente, un polinucleótido de la presente invención unido operativamente a secuencias reguladoras de iniciación transcripcional que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula huésped que se desea. Tanto los promotores heterologos como los no heterologos (es decir, endógenos) se pueden usar para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención.

En algunas modalidades los aminoácidos aislados que funcionan como promotores, potenciadores u otros elementos se pueden introducir en la posición adecuada (corriente arriba, corriente abajo o en el intrón) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención para regular o desregular la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar in vivo o in vitro mediante mutación, deleción y/o sustitución.

Vectores y células huésped La presente invención se relaciona, además, con vectores que incluyen las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención, células huésped diseñadas mediante ingeniería genética con los vectores recombinantes y la producción de por lo menos un supercóntigo de proteína por medio de técnicas recombinantes, como se conoce bien en la materia. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros; supra; Ausubel, y otros; supra, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Los polinucleótidos se pueden unir, opcionalmente, a un vector que contiene un marcador de selección para propagación en un huésped . Generalmente, se introduce un vector plasmídico en un pricipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico o en un complejo con un lípido con carga. Si el vector es un virus, se puede empacar ¡n vitro con el uso de una línea celular apropiada para empacar y después transducir en células huésped.

El inserto de ADN debe estar unido operativamente a un promotor adecuado. Los constructos de expresión también contendrán sitios para la iniciación y terminación de la transcripción y en la región transcrita, un sitio de unión a ribosomas para traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirá, preferentemente, una traducción que empieza en el inicio y un codón de terminación (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) adecuadamente posicionado al final del ARNm que se va a traducir; se prefiere UAA y UAG para la expresión de células de mamíferos o eucariotas.

Los vectores de expresión incluirán, preferente más no opcionalmente, por lo menos un marcador de selección. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR, patentes de los Estados Unidos núms. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017, ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico o glutamina sintetasa (GS, patentes de los Estados Unidos núms. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739) resistencia para el cultivo de células eucariotas y tetraciclina o genes de resistencia a la ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias o procariotas (las patentes mencionadas anteriormente se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad). Los medios y condiciones de cultivo adecuados para las células huésped descritas anteriormente se conocen en la materia. Los vectores adecuados serán fácilmente evidentes para un técnico con experiencia. La introducción de un constructo de vectores en una célula huésped se puede afectar por medio de transfección de fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos conocidos. Tales métodos se describen en la materia, tal como en Sambrook, supra, capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, capítulos 1 , 9, 13, 15, 16.

Por lo menos un supercóntigo de proteína de la presente invención se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no únicamente señales de secreción, sino también regiones funcionales heterologas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente, aminoácidos con carga, se puede agregar al N-terminal de un supercóntigo de proteína para mejora la estabilidad y la persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante el manejo y almacenamiento posteriores. Además, se puede agregar porciones de péptidos a un supercóntigo de proteína de la presente invención para facilitar la purificación. Tales regiones se pueden eliminar antes de la preparación final de un supercóntigo de proteína o por lo menos un fragmento de éste. Tales métodos se describen en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Sambrook, supra, capítulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, capítulos 16, 17 y 18.

Las personas de habilidad ordinaria en la materia son conocedoras de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden expresar en una célula huésped al activarse (mediante manipulación) en una célula huésped que contiene ADN endógeno que codifica un supercóntigo de proteína de la presente invención. Tales métodos se conocen bien en la materia, por ejemplo, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,580,734, 5,641 ,670, 5,733,746 y 5,733,761 , que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Los ejemplos de cultivos celulares útiles para la producción de los supercóntigos de proteína, porciones específicas o variantes de éstos, son las células bacterianas, de levadura y de mamíferos, tal como se conoce en la materia. Los sistemas de células de mamíferos estarán, frecuentemente, en forma de monocapas de células aunque también se puede usar suspensiones de células de mamíferos o bioreactores. En la materia se ha desarrollado varias líneas de células huésped adecuadas con la capacidad de expresar proteínas glucosiladas intactas e incluyen la línea celular COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26), las células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, células HeLa y similares, que están fácilmente disponibles de, por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). Las células huésped preferidas incluyen células de origen linfoide, tales como células de mieloma y linfoma. Las células huésped particularmente preferidas son las células P3X63Ag8.653 (número de registro de la ATCC CRL-1580) y las células SP2/0-Ag14 (número de registro de la ATCC CRL- 851 ). En una modalidad particularmente preferida, la célula recombinante es una célula P3X63Ab8.653 o SP2/0-Ag 4.

Los vectores de expresión para estas células pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de expresión, tales como, pero que no se limitan a, un origen de replicacíón; un promotor (por ejemplo, promotores SV40 prematuros y tardíos, el promotor CMV (patentes de los Estados Unidos núms. 5,168,062; 5,385,839), un promotor HSV tk, un promotor pgk (fosfoglicerato cinasa), un promotor EF-1 alfa (patente de los Estados Unidos núm. 5,266,491), por lo menos un promotor humano; un potenciador y/o sitios de información de procesamiento, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de empalme de RNA, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición grande SC40 de T Ag poli A) y secuencias terminadoras de transcripción. Ver, por ejemplo, Ausubel y otros; supra; Sambrook, y otros; supra. Se conoce otras células útiles para la producción de los ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención y/o están disponibles, por ejemplo, del catálogo de la American Type Culture Collection de líneas celulares e híbridomas (www.atcc.org) u otras fuentes conocidas o comerciales.

Cuando se usa células huésped eucariotas, las secuencias de poliadenilación o secuencias terminadoras de transcripción se incorporan, típicamente, en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen bovino de la hormona del crecimiento. También se puede incluir secuencias para el empalme exacto del transcrito. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, y otros; J. Vírol. 45:773-781 (1983)). Además, las secuencias de genes para controlar la replicación en la célula huésped se pueden incorporar en el vector, como se conoce en la materia.

Purificación de un supercóntigo de proteína Un supercóntigo de proteína se puede recuperar y purificar de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen, pero que no se limitan a, purificación de proteína A, precipitación de sulfato amónico o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. También se puede usar la cromatografía de líquidos de alto rendimiento ("HPLC") para la purificación. Ver, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por ejemplo, capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Los supercóntigos de proteína de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos químicos sintéticos y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota, que incluye, por ejemplo, E. Coli, levaduras, plantas superiores, insectos y células de mamíferos. Dependiendo del huésped que se use en un procedimiento de producción recombinante, el supercóntigo de proteína de la presente invención puede ser glucosilado o no glucosilado. Tales métodos se describen en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Sambrook, supra, secciones 17.37-17.42; Ausubel, supra, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, supra, capítulos 12-14, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Códigos de aminoácidos Frecuentemente los aminoácidos que constituyen los supercóntigos de proteina de la presente invención se abrevian. Las designaciones de los aminoácidos se pueden indicar con la denominación del aminoácido por su código de una sola letra, su código de tres letras, nombre o codón o codones de nucleótidos, tal como se sabe en la materia (véase Alberts, B., y otros; Molecular Biology of The Cell, tercera ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). Un supercóntigo de proteína de la presente invención puede incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones de de aminoácidos, ya sea de mutaciones naturales o manipulación humana, tal como se especifica en la presente descripción. Los aminoácidos en un supercóntigo de proteína de la presente invención, que son esenciales para funcionar, se pueden identificar mediante métodos conocidos en la materia, tales como mutagénesis sitio dirigida o mutagénesis de escaneo de alanina (por ejemplo, Ausubel, supra, capítulos 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo en la molécula. Después las moléculas mutantes resultantes se evalúan para detectar actividad biológica, tal como, pero que no se limita a, por lo menos cierta actividad de neutralización. Los sitios que son críticos para la unión del supercóntigo de proteína también se pueden identificar mediante análisis estructural, como cristalización, resonancia magnética nuclear o etiquetado por fotoafinidad (Smith, y otros; J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos, y otros; Science 255:306-312 (1992)).

Tal como lo notarán los expertos en la materia, la presente invención incluye por lo menos un supercóntigo de proteína biológicamente activo de la presente invención. Los supercóntigos de proteína biológicamente activos tienen una actividad específica de por lo menos 20 %, 30 % o 40 % y, preferentemente, por lo menos 50 %, 60 % o 70 % y, con la máxima preferencia, por lo menos 80 %, 90 % o 95 %-1000 % o más que el supercóntigo de proteína natural (no sintético), endógeno o relacionado y conocido. Los métodos para realizar los ensayos y cuantificar las mediciones de la actividad enzimática y especificidad del sustrato son bien conocidos para los expertos en la materia.

En otro aspecto la presente invención se relaciona con supercóntigos de proteína y fragmentos, tal como se describe en la presente descripción, que se modifican mediante la unión covalente de una porción orgánica. Tal modificación puede producir un fragmento de supercóntigo de proteína con propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, una vida media sérica in vivo aumentada). La porción orgánica puede ser un grupo polimérico hídrofílico lineal o ramificado, un grupo de ácidos grasos o un grupo éster de ácidos grasos. En modalidades particulares, el grupo polimérico hidrofílico puede tener un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120,000 dalton y puede ser un políalcano glicol (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG)), polímero de carbohidrato, polímero de aminoácidos o polivinil pirolidona y el grupo de ácido graso o grupo éster de ácido graso pueden comprender de aproximadamente ocho a aproximadamente cuarenta átomos de carbono.

Los supercóntigos de proteína y fragmentos modificados de la invención pueden comprender una o más porciones orgánicas unidas covalentemente, directa o indirectamente, al anticuerpo. Cada porción orgánica que está unida a un supercóntigo de proteína o fragmento de la invención puede ser independientemente un grupo polimérico hidrofílico, un grupo de ácidos grasos o un grupo éster de ácidos grasos. Como se usa en la presente descripción, el término "ácidos grasos" abarca ácidos monocarboxilicos y dicarboxílicos. Un "grupo polimérico hidrofílico," como se usa en la presente descripción, se refiere a un polímero orgánico que es más soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polilisina es más soluble en agua que en octano. De este modo, un supercóntigo de proteína modificado mediante la unión covalente de polilisina está comprendido en la presente invención. Los polímeros hidrofílicos adecuados para modificar los supercóntigos de proteína de la invención pueden ser lineales o ramificados e incluyen, por ejemplo, polialcano glicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi-polietilenglicol (mPEG), PPG y similares), carbohidratos (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y similares), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato y similares), óxidos de polialcano (por ejemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno y similares) y polivinil pirolidona. Preferentemente, el polímero hidrofílico que modifica el supercóntigo de proteína de la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 150,000 dalton como una entidad molecular por separado. Por ejemplo, se puede usar PEG5000 y PEG2o,ooo, en donde el subíndice es el peso molecular promedio del polímero en dalton. El grupo polimérico hidrofílico se puede sustituir con uno hasta aproximadamente seis grupos alquilo, de ácidos grasos o éster de ácidos grasos. Los polímeros hidrofílicos que se sustituyen con un grupo de ácidos grasos o grupo éster de ácidos grasos se pueden preparar con el uso de métodos adecuados. Por ejemplo, un polímero que comprende un grupo amina se puede acoplar a un carboxilato del ácido graso o éster de ácido graso y un carboxilato activado (por ejemplo, activado con N, N-carbonilo diimidazol) en un ácido graso o éster de ácido graso se puede acoplar a un grupo hidroxilo en un polímero.

Los ácidos grasos y los ésteres de ácido graso adecuados para modificar los supercóntigos de proteína de la invención pueden ser saturados o pueden contener una o más unidades de insaturación. Los ácidos grasos adecuados para modificar los supercóntigos de proteína de la invención incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (Ci8, estearato), n-eicosanoato (C2o, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), c s-A9-octadecanoato (C-i8, oleato), todos los c/s-A5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoatos (C2o, araquidonato), ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares. Los ésteres de ácidos grasos incluyen monoésteres de ácidos dicarboxílicos que comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferentemente, de uno a aproximadamente seis átomos de carbono.

Los supercóntigos de proteína y fragmentos modificados se pueden preparar con el uso de métodos adecuados, tales como la reacción con uno o más agentes modificadores. El término "agente modificador", como se usa en la presente descripción, se refiere a un grupo orgánico adecuado (por ejemplo, un polímero hidrofílico, un ácido graso, un éster de ácidos grasos) que comprende un grupo de activación. Un "grupo de activación" es una porción química o un grupo funcional que puede, bajo las condiciones adecuadas, reaccionar con un segundo grupo químico y así formar un enlace covalente entre el agente modificador y el segundo grupo químico. Por ejemplo, los grupos de activación reactivos con amina incluyen grupos electrofílicos, tales como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluoro, iodo), ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) y similares. Los grupos de activación que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, iodoacetilo, acrilolilo, bisulfuros de piridilo, tiol de ácido 5-tiol-2-nitrobenzoico (TNB-tiol) y similares. Un grupo funcional aldehido se puede acoplar a moléculas que contienen amina o hídrazida y un grupo azida puede reaccionar con un grupo de fósforo trivalente para formar enlaces de fosforamidato o fosforimida. Los métodos adecuados para introducir grupos de activación en moléculas se conocen en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo de activación se puede unir directamente al grupo orgánico (por ejemplo, polímero hidrofílico, ácido graso, éster de ácidos grasos) o a través de una porción conectora, por ejemplo, un grupo C1-C12 divalente, en donde uno o más átomos de carbono se pueden reemplazar por un heteroátomo, como oxígeno, nitrógeno o azufre. Las porciones conectoras adecuadas incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-O-CH-NH-. Los agentes de modificación que comprenden una porción conectora se pueden producir, por ejemplo, con la reacción de una mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para formar un enlace de amida entre la amina libre y el carboxilato de ácidos grasos. El grupo protector Boc se puede eliminar del producto mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria que se puede acoplar a otro carboxilato, tal como se describe, o se puede hacer reaccionar con anhídrido maleico y el producto resultante se puede ciclar para producir un derivado activado de maleimido del ácido graso. (Ver, por ejemplo, Thompson, y otros, patente núm. WO 92/16221, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.).

Los supercóntigos de proteína modificados de la invención se pueden producir al hacer reaccionar un supercóntigo de proteína o fragmento con un agente modificador. Por ejemplo, las porciones orgánicas se pueden unir al supercóntigo de proteína en una manera no específica del sitio con el uso de un agente modificador reactivo con amina, por ejemplo, un éster NHS de PEG. Los supercóntigos de proteína y fragmentos modificados que comprenden una porción orgánica unida a sitios específicos de un supercóntigo de proteína de la presente invención se pueden preparar con el uso de métodos adecuados, tales como proteólisis inversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen y otros; Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran y otros; Protein Sci. 6( 0):2233-2241 (1997); Itoh y otros; Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas y otros; Biotechnol.

Bioeng., 56(4):456-463 (1997)) y los métodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Composiciones de supercóntigos de proteína que comprenden ingredientes adicionales terapéuticamente activos Las composiciones de supercóntigos de proteína de la invención pueden comprender, además, opcionalmente, una cantidad efectiva de por lo menos un compuesto o proteína (molécula pequeña o grande) que se selecciona de por lo menos uno de un fármaco antiinfeccioso, un fármaco del sistema cardiovascular (CV), un fármaco del sistema nervioso central (CNS), un fármaco del sistema nervioso autónomo (ANS), un fármaco del tracto respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal (Gl), un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio de fluidos o electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco inmunomodulador, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un fármaco nuthcional o similares. Tales fármacos se conocen bien en la materia e incluyen formulaciones, indicaciones, dosificación y administración para cada uno de los que se presentan en la presente (véase, por ejemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21.° edición, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001 ; Health Professional's Drug Guide 2001 , ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells y otros; ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad).

El fármaco antiinfeccioso puede ser por lo menos uno seleccionado de amebicidas o por lo menos uno de antiprotozoarios, antihelmínticos, antimicóticos, antipalúdicos, antifímicos o por lo menos un a nti infeccioso antileprótico, aminoglucósido, penicilina, cefalosporina, tetraciclina, sulfonamida, fluoroquinolona, antiviral, macrólido y fármacos antiinfecciosos misceláneos. El fármaco CV puede ser por lo menos uno seleccionado de inotrópicos, antiarrítmicos, antianginosos, antihipertensivos, antilipémicos y fármacos cardiovasculares misceláneos. El fármaco para el SNC puede ser por lo menos uno seleccionado de analgésicos no narcóticos o por lo menos uno seleccionado de antipiréticos, fármacos antiinflamatorios no esferoides, narcóticos o por lo menos un analgésico opioide, sedantes-hipnóticos, anticonvulsionantes, antidepresivos, fármacos contra la ansiedad, antipsicóticos, estimulantes del sistema nervioso central, antiparkinsonianos y fármacos misceláneos para el sistema nervioso central. El fármaco para el SNA puede ser por lo menos uno seleccionado de colinérgicos (parasimpaticomiméticos), anticolinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgicos (simpaticolíticos), relajantes de músculo esquelético y bloqueadores neuromusculares. El fármaco para el tracto respiratorio puede ser por lo menos uno seleccionado de antihistamínícos, broncodilatadores, expectorantes o por lo menos un antitusivo y fármacos respiratorios misceláneos. El fármaco para el tracto Gl puede ser por lo menos uno seleccionado de antiácidos o por lo menos un adsorbente o por lo menos un antiflatulento, enzima digestiva o por lo menos un solubilizador de cálculos biliares, antidiarreico, laxante, antiemético y fármacos antiulcerosos. El fármaco hormonal puede ser por lo menos uno seleccionado de corticosteroides, andrógenos, o por lo menos un esteroide anabólico, estrógeno o por lo menos un fármaco progestínico, gonadotropínico, antidiabético o por lo menos un fármaco de glucagon, hormona tiroidea, antagonista de hormona tiroidea, hormona pituitaria y similar a hormona paratiroidea. El fármaco para el equilibrio de fluidos y electrolitos puede ser por lo menos uno seleccionado de diuréticos, electrolitos o por lo menos una solución de reemplazo, acidificante o por lo menos un alcaiinizante. El fármaco hematológico puede ser por lo menos uno seleccionado de enzimas hematínicas, anticoagulantes, sanguíneas derivadas y trombolíticas. El antineoplásico puede ser por lo menos uno seleccionado de fármacos de alquilación, antimetabolitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que alteran el equilibrio hormonal y antineoplásicos misceláneos. El fármaco inmunomodulador puede ser por lo menos uno seleccionado de inmunosupresores, vacunas o por lo menos una anatoxina, antitoxina o por lo menos un antiveneno, suero inmune y modificador de la respuesta biológica. El fármaco oftálmico, ótico y nasal puede ser por lo menos uno seleccionado de antiinfecciosos oftálmicos, antiinflamatorios oftálmicos, mióticos, midriáticos, vasoconstrictores oftálmicos, fármacos oftálmicos misceláneos, óticos y nasales. El fármaco tópico puede ser por lo menos uno seleccionado de antiinfecciosos locales, escabicidas o por lo menos un pediculicida o corticosteroide tópico. El fármaco nutricional puede ser por lo menos uno seleccionado de vitaminas, minerales o calorías. Ver, por ejemplo, el contenido efe Nursing 2001 Drug Handbook, supra.

El por lo menos único amebicida o antiprotozoario puede ser por lo menos uno seleccionado de atovaquona, clorhidrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazol, clorhidrato de metronidazol y pentamidina isetionato. El por lo menos único antihelmíntico puede ser por lo menos uno seleccionado de mebendazol, pirantel pamoato y tiabendazol. El por lo menos único antimícótico puede ser por lo menos uno seleccionado de anfotericina B, complejo de anfotericina B con sulfato de colesterilo, complejo de anfotericina B y lípidos, anfotericina B liposomal, fluconazol, flucitosina, griseofulvina micronizada, griseofulvina ultramicronizada, itraconazol, ketoconazol, nistatina y clorhidrato de terbinafina. El por lo menos único antipalúdico puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquina, clorhidrato de mefloquina, fosfato de primaquina, pirimetamina y pirimetamina con sulfadoxina. El por lo menos único antifimico o antileprótico puede ser por lo menos uno seleccionado de clofazimina, cicloserina, dapsona, clorhidrato de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampina, rifapentina y sulfato de estreptomicina. El por lo menos único aminoglucósido puede ser por lo menos uno seleccionado de sulfato de amikacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina y sulfato de tobramicina. La por lo menos única penicilina puede ser por lo menos una seleccionada de amoxicilina/clavulanato de potasio, trihidrato de amoxicilina, ampicilina, ampicilina de sodio, trihidrato de ampicilina, ampicilina sódica/sulbactamo de sodio, cloxacilina sódica, dicloxacilina sódica, mezlocilina sódica, nafcilina sódica, oxacilina sódica, penicilina G benzatina, penicilina G potasio, penicilina G procaína, penicilina G sodio, penicilina V potasio, piperacilina de sodio, piperacilina sódica/tazobactama sódica, ticarcilina disódica y ticarcilina disódica/clavulanato de potasio. La por lo menos única cefalosporina puede ser por lo menos una seleccionada de cefaclor, cefadroxilo, sodio cefazolina, cefdinir, clorhidrato de cefepima, cefixima, sodio cefmetazol, cefonicida sódica, cefoperazona sódica, cefotaxima sódica, cefotetano disódico, cefoxitina sódica, cefpodoxima proxetilo, cefprozilo, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima sódica, ceftriaxona sódica, cefuroxima axetilo, cefuroxima sódica, clorhidrato de cefalexina, monohidrato de cefalexina, cefradina y loracarbef. La por lo menos única tetraciclina puede ser por lo menos una seleccionada de clorhidrato de demeclociclina, calcio de doxiciclina, hiclato de doxiciclina, clorhidrato de doxiciclina, monohidrato de doxiciclina, clorhidrato de minociclina y clorhidrato de tetraciclina. La por lo menos única sulfonamida puede ser por lo menos una seleccionada de co-trimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol y sulfisoxazol acetilo. La por lo menos única fluoroquinolona puede ser por lo menos una seleccionada de alatrofloxacina mesilato, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, clorhidrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina y trovafloxacina mesilato. La por lo menos única fluoroquinolona puede ser por lo menos una seleccionada de alatrofloxacina mesilato, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, clorhidrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina y trovafloxacina mesilato. El por lo menos único antiviral puede ser por lo menos uno seleccionado de abacavir sulfato, aciclovir sódico, clorhidrato de amantadina, amprenavir, cidofovir, delavirdina mesilato, didanosina, efavirenz, famciclovir, fomivirseno sódico, foscarnet sódico, ganciclovir, indinavir sulfato, lamivudina, lamivudina/zidovudina, nelfinavir mesilato, nevirapina, oseltamivir fosfato, ribavirina, clorhidrato de rimantadina, ritonavir, saquinavir, saquinavir mesilato, estavudina, clorhidrato de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir y zidovudina. El por lo menos único antiinfeccioso de macrolina puede ser por lo menos uno seleccionado de azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina base, eritromicina estolato, eritromicina etilsuccinato, eritromicina lactobionato y eritromicina estearato. El por lo menos único antünfeccioso misceláneo puede ser por lo menos uno seleccionado de aztreonam, bacitracina, succinato sódico de cloranfenicol, clorhidrato de clindamicina, clorhidrato de clindamicina palmitato, fosfato de clindamicina, imipenem y cilastatina sódica, meropenem, macrocristales de nitrofurantoina, microcristales de nitrofurantoina, quinupristina/dalfopristina, clorhidrato de espectinomicina, trimetoprim y clorhidrato de vancomicina. (Ver, por ejemplo, las págs. 24-214 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único inotrópico puede ser por lo menos uno seleccionado de amrinona lactato, digoxina y milrinona lactato. El por lo menos único antiarritmico puede ser por lo menos uno seleccionado de adenosina, clorhidrato de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretilio, clorhidrato de diltiazem, disopiramida, fosfato de disopiramida, clorhidrato de esmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutilida, clorhidrato de lidocaína, clorhidrato de mexiletina, clorhidrato de moricizina, fenitoína, fenitoína sódica, clorhidrato de procainamida, clorhidrato de propafenona, clorhidrato de propranolol, bisulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, clorhidrato de tocainida y clorhidrato de verapamilo. El por lo menos único antianginoso puede ser por lo menos uno seleccionado de amlodipidina besilato, nitrito de amilo, clorhidrato de bepridilo, clorhidrato de diltiazem, dinitrato isosórbido, mononitrato isosórbido, nadolol, clorhidrato de nicardipina, nifedipina, nitroglicerina, clorhidrato de propranolol, verapamilo y clorhidrato de verapamilo. El por lo menos único antihipertensivo puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de acebutolol, besilato de amlodipina, atenolol, clorhidrato de benazepril, clorhidrato de betaxolol, fumarato de bisoprolol, candesartán cilexetil, captopril, clorhidrato de carteolol, carvedilol, clonidina, clorhidrato de clonidina, diazóxido, clorhidrato de diltiazem, doxazosina mesilato, enalaprilat, enalapril maleato, eprosartán mesilato, felodipina, fenoldopam mesilato, fosinopril sódico, acetato de guanabenz, sulfato de guanadrel, clorhidrato de guanfacina, clorhidrato de hidralazina, irbesartán, isradipina, clorhidrato de labetalol, lisinopril, losarían potásico, metildopa, clorhidrato de metildopato, succinato de metoprolol, tartrato de metoprolol, minoxidilo, clorhidrato de moexipril, nadolol, clorhidrato de nicardipina, nifedipina, nisoldipina, nitroprusida sódica, sulfato de penbutolol, perindopril erbumina, mesilato de fentolamina, pindolol, clorhidrato de prazosina, clorhidrato de propranolol, clorhidrato de quinapril, ramipril, telmisartán, clorhidrato de terazosina, maléate de timolol, trandolapril, valsartán y clorhidrato de verapamilo. El por lo menos único antilipémico puede ser por lo menos uno seleccionado de atorvastatina de calcio, cerivastatina de sodio, colestiramina, clorhidrato de colestipol, fenofibrato (micronizado), fluvastatina de sodio, gemfibrozil, lovastatina, niacina, pravastatina de sodio y simvastatina. El por lo menos único fármaco CV misceláneo puede ser por lo menos uno seleccionado de abciximab, alprostadil, clorhidrato de arbutamina, cilostazol, bisulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, clorhidrato de midodrina, pentoxifilina, clorhidrato de ticlopidina y clorhidrato de tirofibán. (Ver, por ejemplo, las págs. 215-336 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único analgésico o antipirético no narcótico puede ser por lo menos uno seleccionado de acetaminofeno, aspirina, trisalicilato magnésico de colina, diflunisal y salicilato magnésico. El por lo menos único fármaco antiinflamatorio no esteroide puede ser por lo menos uno seleccionado de celecoxib, diclofenaco potásico, diclofenaco sódico, etodolaco, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ¡ndometacina sódica trihidrato, cetoprofeno, ketorolaco trometamina, nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib y sulindaco. El por lo menos único analgésico narcótico u opioide puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de alfentanil, clorhidrato de buprenorfina, tartrato de butorfanol, fosfato de codeína, sulfato de codeína, citrato de fentanilo, sistema transdérmico de fentanilo, fentanilo transmucoso, clorhidrato de hidromorfona, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de metadona, clorhidrato de morfina, sulfato de morfina, tartrato de morfina, clorhidrato de nalbufina, clorhidrato de oxicodona, pectinato de oxicodona, clorhidrato de oximorfona, clorhidrato de pentazocina, clorhidrato de pentazocina y clorhidrato de naloxona, lactato de pentazocina, clorhidrato de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, clorhidrato de remifentanilo, citrato de sufentanilo y clorhidrato de tramadol. El por lo menos único sedante-hipnótico puede ser por lo menos uno seleccionado de hidrato de doral, estazolam, clorhidrato de flurazepam, pentobarbital, pentobarbital sódico, fenobarbital sódico, secobarbital sódico, temazepam, triazolam, zaleplón y tartrato de zolpidem. El por lo menos único anticonvulsante puede ser por lo menos uno seleccionado de acetazolamida sódica, carbamazepina, clonazepam, clorazepato dipotásico, diazepam, divalproex sódico, etosuximida, fosfenitoína sódica, gabapentina, lamotrigina, sulfato magnésico, fenobarbital, fenobarbital sódico, fenitoína, fenitoina sódica, fenitoína sódica (extendida), primidona, clorhidrato de tiagabina, topiramato, valproato sódico y ácido valproico. El por lo menos único antidepresivo puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de amitriptilina, pamoato de amitriptiina, amoxapina, clorhidrato de bupropión, bromhidrato de citalopram, clorhidrato de clomipramina, clorhidrato de desipramina, clorhidrato de doxepina, clorhidrato de fluoxetina, clorhidrato de imipramina, pamoato de imipramina, mirtazapina, clorhidrato de nefazodona, clorhidrato de nortriptilina, clorhidrato de paroxetina, sulfato de fenelzina, clorhidrato de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina y clorhidrato de venlafaxina. El por lo menos único fármaco contra la ansiedad puede ser por lo menos uno seleccionado de alprazolam, clorhidrato de buspirona, clordiazepoxida, clorhidrato de clordiazepóxido, clorazepato dipotásico, diazepam, clorhidrato de doxepina, embonato de hidroxizina, clorhidrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, meprobamato, clorhidrato de midazolam y oxazepam. El por lo menos único fármaco antipsicótico puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de clorpromazina, clozapina, decanoato de flufenazina, enantato de flufenazina, clorhidrato de flufenazina, haloperidol, decanoato de haloperidol, lactato de haloperidol, clorhidrato de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, clorhidrato de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumarato de quetiapina, risperidona, clorhidrato de tioridazina, tiotixeno, clorhidrato de tiotixeno y clorhidrato de trifluoperazina. El por lo menos único estimulante del sistema nervioso central puede ser por lo menos uno seleccionado de sulfato de anfetamina, cafeína, sulfato de dextroanfetamina, clorhidrato de doxapram, clorhidrato de metanfetamina, clorhidrato de metilfenidato, modafinilo, pemolino y clorhidrato de fentermina. El por lo menos único antiparkinsoniano puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de amantadina, mesilato de benzotropina, clorhidrato de biperideno, lactato de biperideno, mesilato de bromocriptina, carbidopa-levodopa, entacapone, levodopa, mesilato de pergolida, diclorhidrato de pramipexol, clorhidrato de ropinirol, clorhidrato de selegilina, tolcapona y clorhidrato de trihexifenidilo. El por lo menos único fármaco misceláneo del sistema nervioso central puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de bupropión, clorhidrato de donepezilo, droperidol, maleato de fluvoxamina, carbonato de litio, citrato de litio, clorhidrato de naratriptano, nicotina polacrilex, sistema transdérmico de nicotina, propofol, benzoato de rizatriptano, monohidrato clorhidrato de sibutramina, succinato de sumatriptán, clorhidrato de tacrina y zolmitriptán. (Ver, por ejemplo, las págs. 337-530 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único colinérgico (por ejemplo, parasimpaticomimético) puede ser por lo menos uno seleccionado de cloruro de betanecol, cloruro de edrofonio, bromuro de neostigmina, metilsulfato de neostigmina, salicilato de fisostigmina y bromuro de piridostigmina. El por lo menos único anticolinérgico puede ser por lo menos uno seleccionado de sulfato de atropina, clorhidrato de diciclomina, glucopirrolato, hiosciamina, sulfato de hiosciamina, bromuro de propantelina, escopolamina, butilbromuro de escopolamina y bromhidrato de escopolamina. El por lo menos único adrenérgico (simpatomimético) puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de dobutamina, clorhidrato de dopamina, bitartrato de metaraminol, bitartrato de norepinefrina, clorhidrato de fenilefrina, clorhidrato de pseudoefedrina y sulfato de pseudoefedrina. El por lo menos único bloqueador adrenérgico (simpaticolítico) puede ser por lo menos uno seleccionado de mesilato de dihidroergotamina, tartrato de ergotamina, maleato de metisergida y clorhidrato de propranolol. El por lo menos único relajante de músculo esquelético puede ser por lo menos uno seleccionado de baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, clorhidrato de ciclobenzaprina, dantroleno sódico, metocarbamol y clorhidrato de tizanidina. El por lo menos único bloqueador neuromuscular puede ser por lo menos uno seleccionado de besilato de atracurio, besilato de cisatracurio, cloruro de doxacurio, cloruro de mivacurio, bromuro de pancuronio, bromuro de pipecuronio, bromuro de rapacuronio, bromuro de rocuronio, cloruro de succinilcolina, cloruro de tubocurarina y bromuro de vecuronio. (Ver, por ejemplo, las págs. 531-84 de Nursing 2001 Drug Handbook.) La por lo menos única antihistamina puede ser por lo menos una seleccionada de maleato de bromfeniramina, clorhidrato de cetirizina, maleato de clorfeniramina, fumarato de clemastina, clorhidrato de ciproheptadina, clorhidrato de difenhidramina, clorhidrato de fexofenadina, loratadina, clorhidrato de prometazina, teoclato de prometazina y clorhidrato de triprolidina. El por lo menos único broncodilatador puede ser por lo menos uno seleccionado de albuterol, sulfato de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefrina, bitartrato de epinefrina, clorhidrato de epinefrina, bromuro de ipratropio, isoproterenol, clorhidrato de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, clorhidrato de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafoato de salmeterol, sulfato de terbutalina y teofilina. El por lo menos único expectorante o antitusivo puede ser por lo menos uno seleccionado de benzonatato, fosfato de codeína, sulfato de codeína, bromhidrato de dextrametorfano, clorhidrato de difenhidramina, guaifenesina y clorhidrato de hidromorfona. El por lo menos único fármaco misceláneo del tracto respiratorio puede ser por lo menos uno seleccionado de acetilcisteína, dipropionato de beclometasona, beractante, budesonida, calfactante, cromolina de sodio, dornasa alfa, epoprostenol sódico, flunisolida, propionato de fluticasona, montelukast sódico, nedocromil sódico, palivizumab, acetonida de triamcinolona, zafirlukast y zileutón. (Ver, por ejemplo, las págs. 585-642 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único antiácido, adsorbente o antiflatulento puede ser por lo menos uno seleccionado de carbonato alumínico, hidróxido aluminico, carbonato calcico, magaldrato, hidróxido magnésico, óxido magnésico, simeticona y bicarbonato sódico. La por lo menos única enzima digestiva o solubilizador de cálculos biliares puede ser por lo menos uno seleccionado de pancreatina, pancrelipasa y ursodiol. El por lo menos único antidiarreico puede ser por lo menos uno seleccionado de atapulguita, subsalicilato de bismuto, policarbofil cálcico, clorhidrato de difenoxilato y sulfato de atropina, loperamida, acetato de octreotida, tintura de opio y tintura de opio (alcanforado). El por lo menos único laxante puede ser por lo menos uno seleccionado de bisocodilo, policarbofil cálcico, cáscara sagrada, extracto fluido aromático de cáscara sagrada, extracto fluido de cáscara sagrada, aceite de ricino, docusato cálcico, docusato sódico, glicerina, lactulosa, citrato magnésico, hidróxido magnésico, sulfato magnésico, metilcelulosa, aceite mineral, polietilenglicol o solución de electrolitos, zaragatona, sen y fosfatos sódicos. El por lo menos único antiemético puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de clorpromazina, dimenhidrinato, mesilato de dolasetrón, dronabinol, clorhidrato de granisetrón, clorhidrato de meclizina, clorhidrato de metocloproamida, clorhidrato de ondansetrón, perfenazina, proclorperazina, edisilato de proclorperazina, maleato de proclorperazina, clorhidrato de prometazina, escopolamina, maleato de tietilperazina y clorhidrato de trimetobenzamida. El por lo menos único fármaco antiulceroso puede ser por lo menos uno seleccionado de cimetidina, clorhidrato de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omeprazol, rabeprozol sódico, citrato bismuto de ranitidina, clorhidrato de ranitidina y sucralfato. (Ver, por ejemplo, las págs. 643-95 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único corticosteroide puede ser por lo menos uno seleccionado de betametasona, betametasona acetato o fosfato sódico de betametasona, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, tebutato de prednisolona, prednisona, triamcinolona, acetonida de triamcinolona y diacetato de triamcinolona. El por lo menos único estoroide andrógeno o anabólico puede ser por lo menos uno seleccionado de danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona y sistema transdérmico de testosterona. El por lo menos único estrógeno o progestina puede ser por lo menos uno seleccionado de estrógenos esterificados, estradiol, cipionato de estradiol, sistema transdérmico de acetato de estradiol/noretindrona, valerato de estradiol, estrógenos (conjugados), estropipato, estradiol de etinilo, estradiol de etinilo y desogestrel, estradiol de etinilo y diacetato de etinodiol, estradiol de etinilo y desogestrel, estradiol de etinilo y diacetato de etinodiol, estradiol de etinilo y levonorgestrel, estradiol de etinilo y noretindrona, estradiol de etinilo y acetato de noretindrona, estradiol de etinilo y norgestimato, estradiol de etinilo y norgestrel, estradiol de etinilo y noretindrona y acetato y fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de medroxiprogesterona, mestranol y noretindrona, noretindrona, acetato de noretindrona, norgestrel y progesterona. La por lo menos única gonadotropina puede ser por lo menos una seleccionada de acetato de ganirelix, acetato de gonadorelina, acetato de histrelina y menotropinas. El por lo menos único antidiabético o glucagón puede ser por lo menos uno seleccionado de abarbosa, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagón, gluburida, insulinas, clorhidrato de metformina, miglitol, clorhidrato de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona y troglitazona. La por lo menos única hormona tiroidea puede ser por lo menos una seleccionada de levotiroxina de sodio, liotironina de sodio, liotrix y tiroidea. La por lo menos única hormona tiroidea antagonista puede ser por lo menos una seleccionada de metimazol, yoduro potásico, yoduro potásico (solución saturada), propiltiouracilo, yodo radioactivo (yoduro sódico 1311) y fuerte solución de yodo. La por lo menos única hormona pituitaria puede ser por lo menos una seleccionada de corticotropina, cosintropina, acetato de desmopresina, acetato de leuprolida, corticotropina repositorio, somatrem, somatropina y vasopresina. El por lo menos único fármaco similar a paratiroides puede ser por lo menos uno seleccionado de calcifediol, calcitonina (humana), calcitonina (de salmón), calcitriol, dihidrotaquisterol y etidronato disódico. (Ver, por ejemplo, las págs. 696-796 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único diurético puede ser por lo menos uno seleccionado de acetazolamida, sodio de acetazolamida, clorhidrato de amilorida, bumetanida, clortalidona, etacrinato sódico, ácido etacrínico, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona, espironolactona, torsemida, triamtereno y urea. El por lo menos único electrólito o solución de reemplazo puede ser por lo menos uno seleccionado de acetato cálcico, carbonato cálcico, cloruro cálcico, citrato cálcico, glubionato cálcico, gluceptato cálcico, gluconato cálcico, lactato cálcico, fosfato cálcico (dibásico), fosfato cálcico (tribásico), dextrano (alto peso molecular), dextrano (bajo peso molecular), hetaalmidón, cloruro magnésico, sulfato magnésico, acétato potásico, bicarbonato potásico, cloruro potásico, gluconato potásico, inyección de Ringer, inyección de Ringer (lactada) y cloruro sódico. El por lo menos único acidificante o alcalinizante puede ser por lo menos uno seleccionado de bicarbonato sódico, lactato sódico y trometamina. (Ver, por ejemplo, las págs. 797-833 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único hematínico puede ser por lo menos uno seleccionado de fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (seco), dextrano de hierro, sorbitol de hierro, complejo de polisacárido-hierro y complejo de gluconato férrico de sodio. El por lo menos único anticoagulante puede ser por lo menos uno seleccionado de ardeparina sódica, dalteparina sódica, danaparoide sódico, enoxaparina sódica, heparina cálcica, heparina sódica y warfarina sódica. El por lo menos único derivado sanguíneo puede ser por lo menos uno seleccionado de albúmina 5 %, albúmina 25 %, factor antihemofílico, complejo coagulante antiinhibidor, antitrombina III (humana), factor IX (humano), complejo del factor IX y fracciones de proteínas del plasma. La por lo menos única enzima trombolítíca puede ser por lo menos una seleccionada de alteplasa, anistreplasa, reteplasa (recombinante), estreptoquinasa y uroquinasa. (Ver, por ejemplo, las págs. 834-66 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único fármaco de alquilación puede ser por lo menos uno seleccionado de busulfano, carboplatino, carmustina, clorambucil, cisplatino, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, clorhidrato de mecloretamina, melfalano, clorhidrato de melfalano, estreptozocina, temozolomida y tiotepa. El por lo menos único antimetabolito puede ser por lo menos uno seleccionado de capecítabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracil, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato, metotrexato sódico y tioguanina. El por lo menos único antibiótico antineoplásíco puede ser por lo menos uno seleccionado de sulfato de bleomicína, dactinomicina, citrato de daunorubicina liposomal, clorhidrato de daunorubicina, clorhidrato de doxorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina liposomal, clorhidrato de epirubicina, clorhidrato de idarubicina, mitomicina, pentostatina, plicamicina y valrubicina. El por lo menos único antineoplásico que altera el equilibrio hormonal puede ser por lo menos uno seleccionado de anastrozol, bicalutamida, fosfato sódico de estramustina, exemestano, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolactona y citrato de toremifeno. El por lo menos único antineoplásico misceláneo puede ser por lo menos uno seleccionado de asparaginasa, bacilo de Calmette-Guerin (BCG) (vivo intravesical), dacarbazina, docetaxel, etoposida, fosfato de etoposida, clorhidrato de gemcitabina, clorhidrato de irinotecano, mitotano, clorhidrato de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspargase, porfímero sódico, clorhidrato de procarbazina, rituximab, teniposida, clorhidrato de topotecán, trastuzumab, tretinoína, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y tartrato de vinorelbina. (Ver, por ejemplo, las págs. 867-963 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único ¡nmunosupresor puede ser por lo menos uno seleccionado de azatioprina, basiliximab, ciclosporina, daclizumab, inmunoglobulina linfocitaria, muromonab-CD3, micofenolato mofetilo, clorhidrato de micofenolato mofetilo, sirolimús y tacrolimús. La por lo menos única vacuna o anatoxina puede ser por lo menos una seleccionada de vacuna BCG, vacuna contra el cólera, anatoxinas de difteria y tétanos (absorbidas), anatoxinas de difteria y tétanos y vacuna absorbida aceluiar contra la tos ferina, anatoxinas de difteria y tétanos y vacuna de células completas contra la tos ferina, vacunas de conjugado contra Haemophilius b, vacuna contra hepatitis A (inactivada), vacuna contra hepatitis B (recombinante), vacuna trivalente tipo A y B contra el virus de la influenza de 1999-2000 (antigeno purificado de superficie), vacuna trivalente tipo A y B contra el virus de la influenza de 1999-2000 (subvirión o subvirión purificado), vacuna trivalente tipo A y B contra el virus de la influenza de 1999-2000 (virión completo), vacuna contra el virus de la encefalitis japonesa (inactivado), vacuna contra la enfermedad de Lyme (recombinante OspA), vacuna contra los virus de sarampión, paperas y rubéola (vivo), vacuna contra los virus de sarampión, paperas y rubéola (vivo atenuado), vacuna contra el virus del sarampión (vivo atenuado), vacuna polisacárida contra el meningococo, vacuna contra el virus de las paperas (vivo), vacuna contra la peste bubónica, vacuna contra el neumococo (polivalente), vacuna contra el virus de la polio (inactivado), vacuna contra el virus de la polio (vivo, oral, trivalente), vacuna contra la rabia (absorbida), vacuna contra la rabia (de células diploides humanas), vacuna contra el virus de las paperas y la rubéola (vivo), vacuna contra el virus de la rubéola (vivo, atenuado), anatoxina tetánica (absorbida), anatoxina tetánica (líquida), vacuna contra la tifoidea (oral), vacuna contra la tifoidea (parenteral), vacuna de polisacárido Vi contra la fiebre tifoidea, vacuna contra la varicela y vacuna contra la fiebre amarilla. La por lo menos única antitoxina o antiveneno puede ser por lo menos uno seleccionado de antiveneno de araña viuda negra, antiveneno de crótalos (polivalentes), antitoxina de difteria (equina) y antiveneno de Micrurus fulvius. El por lo menos único suero inmune puede ser por lo menos uno seleccionado de inmunoglobulina contra el citomegalovirus (intravenosa), inmunoglobulina contra hepatitis B (humana), inmunoglobulina intramuscular, inmunoglobulina intravenosa, inmunoglobulina contra la rabia (humana), inmunoglobulina intravenosa contra el virus sincitial respiratorio (humana), inmunoglobulina contra Rh0(D) (humana), inmunoglobulina intravenosa contra Rho(D) (humana), inmunoglobulina antitetánica (humana) y inmunoglobulina contra la varicela zoster. El por lo menos único modificador de la respuesta biológica puede ser por lo menos uno seleccionado de aldesleucina, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatiramer para inyección, interferón alfacon-1 , interferón alfa-2a (recombinante), interferón alfa-2b (recombinante), interferón beta-1 a, interferón beta-1b (recombinante), interferón gamma-1 b, clorhidrato de levamisol, oprelvecina y sargramostim. (Ver, por ejemplo, las págs. 964-1040 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único antiinfeccioso oftálmico se puede seleccionar de bacitracina, cloranfenicol, clorhidrato de ciprofloxacina, eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina 0.3 %, polimixina B sulfato, sulfacetamida sódica 10 %, sulfacetamida sódica 15 %, sulfacetamida sódica 30 %, tobramicina y vidarabina. El por lo menos único antiinflamatorio oftálmico puede ser por lo menos uno seleccionado de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diclofenaco sódico 0.1 %, fluometolona, flurbiprofeno sódico, ketorolaco trometamina, acetato de prednisolona (suspensión) y fosfato sódico de prednisolona (solución). El por lo menos único miótico puede ser por lo menos uno seleccionado de cloruro de acetilcolina, carbacol (intraocular), carbacol (tópico), yoduro de ecotiofato, pilocarpina, clorhidrato de pilocarpina y nitrato de pilocarpina. El por lo menos único midriático puede ser por lo menos uno seleccionado de sulfato de atropina, clorhidrato de ciclopentolato, clorhidrato de epinefrina, borato de epinefril, bromhidrato de homatropina, clorhidrato de fenilefrina, bromhidrato de escopolamina y tropicamida. El por lo menos único vasoconstrictor oftálmico puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de nafazolina, clorhidrato de oximetazolina e clorhidrato de tetrahidrozolina. El por lo menos único agente oftálmico misceláneo puede ser por lo menos uno seleccionado de clorhidrato de apraclonidina, clorhidrato de betaxolol, tartrato de brimonidina, clorhidrato de carteolol, clorhidrato de dipivefrina, clorhidrato de dorzolamida, difumarato de emedastina, fluoresceína sódica, fumarato de ketotifeneno, latanoprost, clorhidrato de levobunolol, clorhidrato de metipranolol, cloruro sódico (hipertónico) y maleato de timolol. El por lo menos único agente ótico puede ser por lo menos uno seleccionado de ácido bórico, peróxido de carbamida, cloranlenicol y polipéptido de trietanolamina oleato-condensado. El por lo menos único fármaco nasal puede ser por lo menos uno seleccionado de dipropionato de beclometasona, budesonida, sulfato de efedrina, clorhidrato de epinefrina, flunisolida, propionato de fluticasona, clorhidrato de nafazolina, clorhidrato de oximetazolina, clorhidrato de fenilefrina, clorhidrato de tetrahidrozolina, acetonida de triamcinolona y clorhidrato de xilometazolina. (Ver, por ejemplo, las págs. 1041-97 de Nursing 2001 Drug Handbook.) El por lo menos único antiinfeccioso local puede ser por lo menos uno seleccionado de aciclovir, anfotericina B, ácido acelaico en crema, bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econazol, eritromicina, sulfato de gentamicina, ketoconazol, acetato de mafenida, metronidazol (tópico), nitrato de miconazol, mupirocina, clorhidrato del naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de plata, clorhidrato de terbinafina, terconazol, clorhidrato de tetraciclina, tioconazol y tolnaftato. El por lo menos único escabicida o pediculicida puede ser por lo menos uno seleccionado de crotamitón, lindano, permetrina y piretrinas. El por lo menos único corticosteroide tópico puede ser por lo menos uno seleccionado de dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, propionato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diacetato de diflorasona, acetonida de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenolida, propionato de fluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, furoato de mometasona y acetonida de triamcinolona. (Ver, por ejemplo, las págs. 1098-1136 de Nursing 2001 Drug Handbook.) La por lo menos única vitamina o mineral puede ser por lo menos uno seleccionado de vitamina A, complejo vitamínico B, cianocobalamina, ácido fólico, hidroxocobalamina, leucovorina cálcica, niacina, niacinamida, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, clorhidrato de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecaliferol, ergocalciferol, análogo de vitamina D, doxercalciferol, paricalcitol, vitamina E, análogo de vitamina K, fitonadiona, fluoruro sódico, fluoruro sódico (tópico), oligoelementos, cromo, cobre, yodo, manganeso, selenio y zinc. El por lo menos único agente calórico puede ser por lo menos uno seleccionado de infusiones de aminoácidos (cristalino), infusiones de aminoácidos en dextrosa, infusiones de aminoácidos con electrolitos, infusiones de aminoácidos con electrolitos en dextrosa, infusiones de aminoácidos para la falla hepática, infusiones de aminoácidos para alto estrés metabólico, infusiones de aminoácidos para la falla renal, dextrosa, emulsiones de grasa y triglicéridos de cadena media. (Ver, por ejemplo, las págs. 1137-63 de Nursing 2001 Drug Handbook.) Las composiciones de supercóntigos de proteína de la presente invención pueden comprender, además, por lo menos una de cualquier cantidad adecuada y la cantidad efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende un supercóntigo de proteína en contacto o administrado a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que requiera tal modulación, tratamiento 0 terapia, que además comprende, opcionalmente, por lo menos uno seleccionado de por lo menos un antagonista TNF (por ejemplo, pero que no se limita a, una sustancia química de TNF o antagonista de proteínas, anticuerpo o fragmento de TNF monoclonal o policlonal, un receptor soluble de TNF (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de fusión de éstos o un antagonista de TNF de molécula pequeña, por ejemplo, proteína de unión a TNF 1 o II (TBP-1 o TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept, CDP-571 , CDP-870, afelimomab, lenercept y similares), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un antimicótico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antipsoriático, un corticosteroide, un estoroide anabólico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un agente nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un medicamento de reemplazo hormonal, un modulador de los receptores de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor de la mitosis, un radiofármaco, un antidepresivo, agente antimaníaco, un antipsicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpaticomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocinas. Los ejemplos no limitantes de tales citocinas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de IL-1 a IL-28 (por ejemplo, IL-1 , IL-2, etc.). Las dosificaciones adecuadas se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Wells y otros; eds., Pharmacotherapy Handbook, 2.° edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000), cuyas referencias se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Tales fármacos anticáncer o antiinfecciosos también pueden incluir moléculas de toxinas que están relacionadas, unidas, formuladas o administradas junto con por lo menos un supercóntigo de proteína de la presente invención. La toxina puede funcionar, opcionalmente, para eliminar selectivamente la célula o tejido patológico. La célula patológica puede ser una célula de cáncer u otra célula. Tales toxinas puede ser, pero no se limitan a, purificadas o recombinantes o fragmentos de toxinas que comprenden por lo menos un dominio citotóxico funcional de la toxina, por ejemplo, seleccionado de por lo menos uno de ricina, toxina de difteria, una toxina de veneno o una toxina bacteriana. El término toxina también incluye tanto endotoxinas como exotoxinas producidas de manera natural, bacterias o virus mutantes o recombinantes que pueden causar cualquier condición patológica en los seres humanos y otros mamíferos, que incluyen choque tóxico, que puede resultar en muerte. Tales toxinas pueden incluir, pero no se limitan a, enterotoxina lábil al calor (LT) E. coli enterotoxigénico, enterotoxina estable al calor (ST), citotoxina Shigella, enterotoxinas Aeromonas, toxína-1 (TSST-1) del síndrome de choque tóxico, enterotoxinas de estafilococo A (SEA), B (SEB) o C (SEC), enterotoxinas de estreptococo y similares. Tales bacterias incluyen, pero no se limitan a, cepas de una especie de E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enterohemorrágico (por ejemplo, cepas de serotipo 0157:H7), especies de estafilococo (por ejemplo, especies de Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei), especies de Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostrídium botulinum), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), especies de Heliobacter, (por ejemplo, Heliobacter pylorí), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), especies de Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa y Streptococci. Ver, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3.° ed., págs.1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans y otros; eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2.° Ed., págs. 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell y otros; Principies and Practice of Infectious Diseases, 3.° Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow y otros; eds., The Merck Manual, 16.° edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood y otros; FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack y otros; Science, 248:705-71 1 (1990), cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Los compuestos de supercóntigos de proteína, composiciones o combinaciones de la presente invención pueden comprender, además, por lo menos uno de cualquiera de los auxiliares adecuados, tales como, pero que no se limitan a, diluyente, aglutinante, estabilizante, regulador, sales, solventes lipofílicos, conservantes, adyuvantes o similares. Se prefiere los auxiliares farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos no limitantes y métodos para preparar tales soluciones estériles se conocen bien en la materia, tales como, pero que se limitan a, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.° edición, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Los portadores farmacéuticamente aceptables se pueden seleccionar rutinariamente, que sean adecuados para el modo de administración, solubilidad y/o estabilidad de la composición de supercóntigo de proteína, fragmento o variante, como se sabe en la materia o tal como se describe en la presente.

Los excipientes y aditivos farmacéuticos útiles en la presente composición incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos (por ejemplo, azúcares, que incluyen monosacáridos, di-, tri-, tetra- y oligosacáridos; derivados de azúcares, tales como alditoles, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares; así como polisacáridos o polímeros de azúcares), que pueden estar presentes solos o en combinación, que comprenden solos o en combinación de 1-99.99 % en peso o volumen. Los excipientes de proteínas ilustrativos incluyen albúmina sérica, tal como la albúmina sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína y similares. Los componentes de aminoácidos/proteínas representativos, que también pueden funcionar en una capacidad reguladora, incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame y similares. Un aminoácido preferido es la glicina.

Los excipientes de carbohidratos adecuados para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafmosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes preferidos de carbohidratos para usar en la presente invención son manitol, trehalosa y rafinosa.

Las composiciones de supercóntigos de proteína también pueden incluir un regulador o un agente ajustador de pH; típicamente, el regulador es una sal preparada a partir de un ácido o base orgánica. Los reguladores representativos incluyen sales acidas orgánicas, tales como los ácidos de sal de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido itálico; Tris, clorhidrato de trometamina o amortiguador fosfato. Los reguladores preferidos para usar en las presentes composiciones son sales ácidas orgánicas, tales como citrato.

Además, las composiciones de supercóntigos de proteína de la invención pueden incluir excipientes/aditivos poliméhcos, tales como polivinilpirrolidonas, ficoll (un azúcar polimérica), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil- -ciclodextrina), polietilenglicoles, agentes saborizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, surfactantes (por ejemplo, polisorbatos, tales como "TWEEN 20" y "TWEEN 80"), lípidos [por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol) y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).

Estos y otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos conocidos adecuados para usar en las composiciones del supercóntigo de proteína, porción o vahante de conformidad con la presente invención se conocen en la materia, por ejemplo, tal como se mencionan en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19.° ed., Williams & Williams, (1995) y en "Physician's Desk Reference", 52.° ed., Medical Economics, ontvale, NJ (1998), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad. Los materiales de portadores o excipientes preferidos son carbohidratos (por ejemplo, sacáridos y alditoles) y reguladores (por ejemplo, citrato) o agentes poliméricos. Una molécula portadora ilustrativa es el mucopolisacárido, ácido hialurónico, que puede ser útil para el suministro intraarticular.

Formulaciones Como se mencionó anteriormente, la invención proporciona formulaciones estables, las cuales comprenden, preferentemente, un amortiguador de fosfato con solución salina o una sal seleccionada, asi como soluciones y formulaciones conservadas que contienen un conservante así como formulaciones conservadas multiuso adecuadas para el uso farmacéutico y veterinario, que comprenden al menos un supercóntigo de proteína en una formulación farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante conocido o seleccionado, opcionalmente, del grupo que consiste de al menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro magnésico (por ejemplo, hexahidrato), alquilparaben (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, timerosal y deshidroacetato sódico, polímeros o mezclas de estos en un diluyente acuoso. Puede usarse cualquier mezcla o concentración adecuada como se conoce en la materia, tal como aproximadamente 0.0015 %, o cualquier intervalo, valor o fracción en este. Los ejemplos no limitantes incluyen, sin conservante, aproximadamente 0.1-2 % de m-cresol (por ejemplo, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0 %), aproximadamente 0.1-3 % de alcohol bencílico (por ejemplo, 0.5, 0.9, 1.1 , 1.5, 1.9, 2.0, 2.5 %), aproximadamente 0.001-0.5 % de timerosal (por ejemplo, 0.005, 0.01), aproximadamente 0.001-2.0 % de fenol (por ejemplo, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0 %), 0.0005-1.0 % de alquilparabeno(s) (por ejemplo, 0.00075, 0.0009, 0.001 , 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01 , 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0 %), y similares.

Como se mencionó anteriormente, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende material de envasado y al menos un frasco que comprende una solución de al menos un supercóntigo de proteína con los amortiguadores y/o conservantes prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso, en donde el material de envasado comprende una etiqueta que indica que tal solución puede mantenerse durante un período de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o mayor. La invención además comprende un articulo de fabricación que comprende material de envasado, un primer frasco que comprende liofilizado de al menos un supercóntigo de proteína y un segundo frasco que comprende un diluyente acuoso de conservante o amortiguador prescrito, en donde el material de envasado comprende una etiqueta que instruye a un paciente a reconstituir el al menos un supercóntigo de proteína en un diluyente acuoso para formar una solución que puede mantenerse durante un período de veinticuatro horas o mayor.

El al menos un supercóntigo de proteína usado de conformidad con la presente invención puede producirse mediante medios recombinantes, que incluyen a partir de células de mamíferos o preparaciones transgénicas, o puede purificarse a partir de otras fuentes biológicas, como se describe en la presente descripción o como se conoce en la materia.

El intervalo de al menos un supercóntigo de proteina en el producto de la presente invención incluye cantidades que proporcionan al reconstituirse, si están en un medio húmedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1.0 pg/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, aunque concentraciones más bajas y más altas son operables y dependen del vehículo de suministro independiente por ejemplo, las formulaciones de solución diferirán de los métodos pulmonar, transmucoso, osmótico, de microbomba o de parche transdérmico.

Preferentemente, el diluyente acuoso comprende, además, opcionalmente, un conservante farmacéuticamente aceptable. Los conservantes preferidos incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquillparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de éstos. La concentración de conservante usado en la formulación es una concentración suficiente para obtener un efecto antimicrobiano. Tales concentraciones son dependientes del conservante seleccionado y un técnico con experiencia puede determinarlas fácilmente.

Otros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad, amortiguadores, antioxidantes y potenciadores de conservantes, pueden adicionarse, opcional y preferentemente, al diluyente. Un agente de isotonicidad, tal como glicerina, se usa comúnmente a concentraciones conocidas. Un amortiguador fisiológicamente tolerado se adiciona, preferentemente, para proporcionar un control de pH mejorado. Las formulaciones pueden cubrir una amplia variedad de pH, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, y los intervalos preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y un intervalo más preferido de 6.0 a aproximadamente 8.0. Preferentemente, las formulaciones de la presente invención tienen un pH entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7.8. Los amortiguadores preferidos incluyen amortiguadores de fosfato, con la máxima preferencia, fosfato de sodio, particularmente, solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés).

Opcionalmente, a fin de reducir la agregación, pueden adicionarse a las formulaciones o composiciones otros aditivos, tales como solubilizantes farmacéuticamente aceptables como Tween 20 (monolaurato de sorbitán polioxietilénico (20)), Tween 40 (monopalmitato de sorbitán polioxietilénico (20)), Tween 80 (monooleato de sorbitán polioxietilénico (20)), Pluronic F68 (copolímeros de bloque de polioxietileno polioxipropileno) y PEG (polietilenglicol) o surfactantes no iónicos, tales como polisorbato 20 u 80, o poloxámero 184 o 188, polioles Pluronic®, otros copolímeros de bloque y quelantes, tales como EDTA y EGTA. Estos aditivos son particularmente útiles si se usa una bomba o un envase plástico para administrar la formulación. La presencia de surfactante farmacéuticamente aceptable mitiga la propensión de la proteína a agregarse.

Las formulaciones de la presente invención pueden prepararse mediante un proceso, el cual comprende mezclar al menos un supercóntigo de proteína y un conservante seleccionado del grupo que consiste de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno, (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal o mezclas de estos en un diluyente acuoso. El mezclado del al menos un supercóntigo de proteína y el conservante en un diluyente acuoso se lleva a cabo mediante el uso de procedimientos de disolución y mezclado convencionales. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un supercóntigo de proteína en solución amortiguada con el conservante deseado en una solución amortiguada en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el conservante a las concentraciones deseadas. El experto en la materia reconocerá las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se adicionan las composiciones, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los cuales se prepara la formulación, son todos factores que pueden optimizarse para la concentración y los medios de administración usados.

Las formulaciones reivindicadas puede proporcionarse a pacientes como soluciones transparentes o como frascos que comprenden un frasco de liofilizado de al menos un supercóntigo de proteína que se reconstituye con un segundo frasco que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferentemente, un amortiguador de fosfato y/o solución salina y una sal seleccionada, en un diluyente acuoso. Tanto un frasco de solución simple o un frasco doble que requiere reconstitución puede volver a usarse varias veces y puede bastar para un solo ciclo o para múltiples ciclos de tratamiento de pacientes y, por lo tanto, puede proporcionar un régimen de tratamiento más conveniente que el disponible actualmente.

Los artículos de fabricación reivindicados en la presente invención son útiles para la administración durante un período de tiempo que va desde inmediatamente a veinticuatro horas o más. De conformidad, los artículos de fabricación reivindicados en la presente invención ofrecen ventajas significativas al paciente. Las formulaciones de la invención, opcionalmente, pueden almacenarse de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 40 °C y retener la actividad biológica de la proteína por períodos de tiempo prolongados, lo que permite que la etiqueta del envase indique que la solución puede mantenerse y/o usarse durante un período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 o 96 horas o más. Si se usa diluyente conservado, tal etiqueta puede incluir usar hasta 1-12 meses, medio año, un año y medio y/o dos años.

Las soluciones de al menos un supercóntigo de proteína de la invención pueden prepararse mediante un proceso que comprende mezclar al menos un supercóntigo de proteína en un diluyente acuoso. El mezclado se lleva a cabo mediante el uso de procedimientos de disolución y mezclado convencionales. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un supercóntigo de proteína en agua o amortiguador en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y, opcionalmente, un conservante o amortiguador a las concentraciones deseadas. El experto en la materia reconocerá las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se adicionan las composiciones, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los cuales se prepara la formulación, son todos factores que pueden optimizarse para la concentración y los medios de administración usados.

Los productos reivindicados pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como frascos dobles que comprenden un frasco de liofilizado de al menos un supercóntigo de proteína que se reconstituye con un segundo frasco que contiene el diluyente acuoso. Tanto un frasco sencillo o un frasco doble que requiere reconstitución puede volver a usarse varias veces y puede bastar para un solo ciclo o para múltiples ciclos de tratamiento de pacientes y, por lo tanto, proporciona un régimen de tratamiento más conveniente que el disponible actualmente.

Los productos reivindicados pueden proporcionarse indirectamente a pacientes al proporcionar a farmacias, clínicas u otras instituciones o centros así, soluciones transparentes o frascos dobles que comprenden un frasco de liofilízado de al menos un supercóntigo de proteína que se reconstituye con un segundo frasco que contiene el diluyente acuoso. Las solución transparente en este caso puede ser de hasta un litro o aún más grande y proporciona un receptáculo más grande del cual pueden retirarse, una o múltiples veces, porciones más pequeñas del al menos una solución de supercóntigo de proteína para transferirlas a frascos más pequeños que las farmacias o clínicas proporcionan a sus clientes y/o pacientes.

Los dispositivos reconocidos que comprenden sistemas de frasco simple incluyen dispositivos inyectores de pluma para el suministro de una solución, tales como plumas BD, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por ejemplo, como los faricados y desarrollados por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suiza, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www. weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www. mediject.com), y dispositivos similarmente adecuados. Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de frasco doble incluyen aquellos sistemas inyectores de pluma para reconstituir un fármaco liofilizado en un cartucho para suministrar la solución reconstituida, tal como el HumatroPen®. Los ejemplos de otros dispositivos adecuados incluyen jeringas prellenadas, autoinyectores, inyectores libres de agujas y conjuntos de infusión libre de aguja IV.

Los productos que se reivindican en la presente invención incluyen el material de envasado. El material de envasado proporciona, además de la información requerida por las agencias reguladoras, las condiciones bajo las cuales se puede usar el producto. El material de envasado de la presente invención proporciona instrucciones al paciente para reconstituir al menos un supercóntigo de proteína en el diluyente acuoso para formar una solución y para usar la solución durante un período de 2-24 horas o más para el producto húmedo/seco, de dos frascos. Para el producto de solución de frasco simple, la etiqueta indica que tal solución puede usarse durante un período de 2-24 horas o más. Los productos reivindicados en la presente son útiles para el uso en productos farmacéuticos para humanos.

Las formulaciones de la presente invención pueden prepararse por un proceso que comprende el mezclado de al menos un supercóntigo de proteína y un amortiguador seleccionado, preferentemente, un amortiguador de fosfato que contiene solución salina o una sal seleccionada. Mezclar al menos un supercóntigo de proteína y conservante en un diluyente acuoso se lleva a cabo mediante el uso de procedimientos de disolución y mezclado convencionales. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un supercóntigo de proteína en agua o amortiguador con el agente amortiguador deseado en agua en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el amortiguador a las concentraciones deseadas. El experto en la materia reconocerá las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se adicionan las composiciones, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los cuales se prepara la formulación, son todos factores que pueden optimizarse para la concentración y los medios de administración usados.

Las formulaciones conservadas o estables reivindicadas pueden proporcionarse a pacientes como soluciones transparentes o como frascos dobles que comprenden un frasco de supercóntigo de proteína liofilizado que se reconstituye con un segundo frasco que contiene un conservante o amortiguador y excipientes en un diluyente acuoso. Tanto un frasco sencillo o un frasco doble que requiere reconstitución puede volver a usarse varias veces y puede bastar para un solo ciclo o para múltiples ciclos de tratamiento de pacientes y, por lo tanto, proporciona un régimen de tratamiento más conveniente que el disponible actualmente.

Otras formulaciones o métodos para estabilizar el supercóntigo de proteína podrían resultar en algo distinto a una solución transparente de polvo liofilizado que comprende el supercóntigo de proteína. Entre las soluciones no transparentes están las formulaciones que comprenden suspensiones de partículas, las partículas son una composición que contiene el supercóntigo de proteína en una estructura de dimensión variable y denominada de distintas formas, tales como una microesfera, micropartícula, nanopartícula, nanoesfera o liposoma. Tales formulaciones particuladas, esencialmente esféricas, que contienen un agente activo pueden formarse haciendo contactar una fase acuosa que contiene el agente activo y un polímero y una fase no acuosa seguida por evaporación de la fase no acuosa para causar la coalescencia de partículas a partir de la fase acuosa como se enseña en la patente de los Estados Unidos núm. 4,589,330. Las micropartículas porosas pueden prepararse mediante el uso de una primera fase que contiene agente activo y un polímero dispersado en un solvente continuo, y la eliminación de tal solvente de la suspensión mediante liofilización o dilución-extracción-precipitación como enseña la patente de los Estados Unidos núm. 4,818,542. Los polímeros preferidos para tales preparaciones son polímeros o copolímeros naturales o sintéticos seleccionados del grupo que consiste de agar de gelatina, almidón, arabinogalactano, albúmina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L(-) láctido poli(episilon-caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido láctico), poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido glicólico), poli(P-hidroxi ácido butírico), óxido de polietileno, polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), poli(hidroxietil metacrilato), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), poli(éster urea), poli(L-fenilalanina/etilenglicol/1,6-diisocianatohexano) y poli(metil metacrilato). Los polímeros particularmente preferidos son poliésteres, tales como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L(-) láctido pol¡(episilon-caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido láctico) y poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido glicólico. Los solventes útiles para disolver el polímero y/o el activo incluyen: agua, hexafluoroisopropanol, metilencloruro, tetrahidrofurano, hexano, benceno o sesquihidrato de hexafluoracetona. El proceso de dispersar la fase que contiene el activo con una segunda fase podría incluir forzar por presión esa primera fase a través de un orificio en una tobera para permitir la formación de gotículas.

Las formulaciones en polvo podrían resultar de procesos que no son liofilización, tales como por secado por aspersión o extracción de solvente por evaporación o por precipitación de una composición cristalina seguido por una o más etapas para eliminar el solvente acuoso o no acuoso. La preparación de una preparación de supercóntigo de proteína secado por aspersión se enseña en la patente de los Estados Unidos núm. 6,019,968. Las composiciones en polvo a base de supercóntigo de proteína podrían producirse mediante el secado por aspersión de soluciones o suspensiones acuosas y, opcionalmente, excipientes, en un solvente bajo condiciones para proporcionar un polvo respirable. Los solventes podrían incluir compuestos polares, tales como agua y etanol, los cuales podrían secarse fácilmente. La estabilidad del supercóntigo de proteína podría aumentarse llevando a cabo procedimientos de secado por aspersión en ausencia de oxígeno, tal como bajo un manto de nitrógeno o mediante el uso de nitrógeno como el gas de secado. Otra formulación relativamente seca es una dispersión de una pluralidad de microestructuras perforadas dispersadas en un medio de suspensión que, típicamente, comprende un propulsor de hidrofluoroalcano como se enseña en la patente núm. WO 9916419. Las dispersiones estabilizadas podrían administrarse al pulmón de un paciente mediante el uso de un inhalador de dosis medidas. Al equipamiento útil en la fabricación comercial de medicamentos secados por aspersión lo fabrica Buchi Ltd. o Niro Corp.

Al menos un supercontigo de proteína, tanto en las soluciones o formulaciones conservadas o estables descritas en la presente descripción, puede administrarse a un paciente de conformidad con la presente invención a través de una variedad de métodos de suministro que incluyen inyección subcutánea o intramuscular; métodos transdérmico, pulmonar, transmucoso, implante, de bomba osmótica, cartucho, microbomba, u otros medios apreciados por el técnico con experiencia, como se conoce muy bien en la materia.

Aplicaciones terapéuticas La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar una enfermedad en una célula, un tejido, un órgano o un paciente, como se conoce en la materia o como se describe en la presente descripción, mediante el uso de al menos un supercontigo de proteína de la presente invención, por ejemplo, al administrar o poner en contacto la célula, el tejido, el órgano, el animal o el paciente con una cantidad terapéuticamente eficaz de supercontigo de proteína. La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar una enfermedad en una célula, un tejido, un órgano, un animal o un paciente que incluye, pero no se limita a, al menos uno de obesidad, una enfermedad inmune relacionada, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad maligna o una enfermedad neurológica.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad inmune relacionada en una célula, un tejido, un órgano, un animal o un paciente que incluye, pero no se limita a, al menos uno de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatías seronegativas, osteoartritis, osteolisis, aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico, síndrome antifosfolipido, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de wegener, sarcoidosis, orquitis/procedimientos de reversión de vasectomía, enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eczema, dermatitis de contacto alérgica, conjuntivitis alérgica, neumonitis de hipersensibilidad, transplantes, rechazo de transplante de órgano, enfermedad del injerto contra el huésped, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de sepsis, sepsis gram positiva, sepsis gram negativa, sepsis con cultivo negativa, sepsis fúngica, fiebre neutropénica, urosepsis, meningococcemia, trauma/hemorragia, quemaduras, exposición a radiación ionizante, pancreatitis aguda, síndrome de dificultad respiratoria adulta, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, patología de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrosis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, rinitis alérgica, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxis sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolítica, tromobocitopenia, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de transplante de corazón, rechazo de transplante de hígado, rechazo de transplante de páncreas, rechazo de transplante de pulmón, rechazo de transplante de médula ósea (BMT, por sus siglas en inglés), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de transplante de cartílago, rechazo de injerto óseo, rechazo de transplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de transplante paratiroideo, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjertos, reacciones de hipersensibilidad antirreceptor, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynaud, diabetes resistente a la insulina tipo B, asma, miastenia gravis, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad tipo III, síndrome POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gamopatía monoclonal y síndrome de cambios cutáneos), polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gamopatía monoclonal, síndrome de cambios cutáneos, síndrome antifosfolípido, penfigo, escleroderma, enfermedad de tejido conectivo mezclado, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitíligo, vasculitis, síndrome de cardiotomía post-MI, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis de contacto, neumonitis de hipersensibilidad, rechazo de aloinjertos, granulomas debido a organismos intracelulares, sensibilidad a los fármacos, metabólico/idiopático, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, retinopatía diabética, tiroiditis de hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis cística, enfermedad pulmonar crónica neonatal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, condiciones dermatológicas, soriasis, alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia renal aguda, hemodiálisis, uremia, toxicidad, preeclampsia, terapia okt3, terapia anti-cd3, terapia de citocina, quimioterapia, terapia de radiación (por ejemplo, que incluyen pero no se limitan a, astenia, anemia, caquexia, y similares), intoxicación crónica por salicilatos, y similares. Ver, por ejemplo, Merck Manual, Ediciones 12.°-17.°, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells y otros, eds., Segunda edición, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), incorporados, en su totalidad, como referencia.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos uno de síndrome de aturdimiento cardíaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico, hemorragia, síndrome coronario agudo, arteriesclerosis, aterosclerosis, restenosis, enfermedad ateriosclerótica diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, síncope, ataque, sífilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardíaca, cor pulmonale, hipertensión pulmonar primaria, arritmias cardíacas, latido ectópico atrial, aleteo atrial, fibrilación atrial (sostenida o paroxismal), síndrome de post perfusión, respuesta de inflamación de derivación cardiopulmonar, taquicardia atrial multifocal o caótica, taquicardia QRS estrecho regular, arritmias específicas, fibrilación ventricular, arritmias de fascículo de His, bloqueo atrioventricular, bloqueo de rama, trastornos isquémicos del miocardio, enfermedad de la arteria coronaria, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatía, cardiomiopatía congestiva dilatada, cardiomiopatía restrictiva, cardiopatías valvulares, endocarditis, enfermedad pericárdica, tumores cardíacos, aneurismas periféricas y aórticas, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad aterosclerótica periférica, tromboangeitis obliterante, trastornos arteriales periféricos funcionales, enfermedad y fenómeno de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fístula arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina inestable, lesión por reperfusión, síndrome post-bomba, lesión por reperfusión-isquemia, y similares. Tal método puede comprender, opcionalmente, administrar una cantidad eficaz de una composición o composición farmacéutica que comprende al menos un supercóntigo de proteína a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita tal modulación, tratamiento o terapia.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad infecciosa en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluye, pero no se limita a: infección bacteriana aguda o crónica, procesos parasíticos o infecciosos agudos y crónicos, que incluyen infecciones bacterianas, virales y fúngicas, infección por HlV/neuropatía por HIV, neuropatía, meningitis, hepatitis (A, B o C, o similares), artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, e. coli 0157:h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, malaria, fiebre por dengue hemorrágico, leishmaniasis, lepra, síndrome de ataques tóxicos, miositis estreptococica, gangrena gaseosa, tuberculosis por mycobacterium, mycobacterium avium intracelular, neumonía por pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionela, enfermedad de Lyme, influenza a, virus epstein-barr, síndrome hemafagocítico asociado a virus, encefalitis viral/meningitis aséptica, y similares.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad maligna en una célula, un tejido, un órgano, un animal o paciente, que incluye pero no se limita a, al menos una de: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica aguda, ALL de células B, células T o FAB, leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), leucemia mielógena aguda, leucemia mielocítica crónica (CML, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), leucemia de célula peluda, síndrome mielodiplástico (MDS, por sus siglas en inglés), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma que no es de hodkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplástico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer no polipósico hereditario, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer prostético, carcinoma de células renales, cáncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, reabsorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer, y similares.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad neurológica en una célula, un tejido, un órgano, un animal o un paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos una de: enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, cefalea migrañosa, complejo de demencia de SIDA, enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos cerbelares y extrapiramidales, tales como lesiones del sistema corticoespinal; transtornos de los ganglios básales; trastornos de movimientos hiperquinéticos, tales como corea de Huntington y corea senil; trastornos de movimiento inducido por fármacos, tales como los inducidos por fármacos que bloquean receptores de la dopamina en el SNC; trastornos de movimientos hipoquinéticos, tales como enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelosas, tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeraciones corticales cerebelosas, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, and Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia y trastorno multisistema mitocondrial); trastornos desmielinizantes principales, tales como esclerosis múltiple, mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad motora, tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración de la célula del cuerno anterior de la médula, tal como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; Síndrome de Down en la edad media; enfermedad difusa de cuerpo de Lewy; demencia senil del tipo de cuerpo de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda; enfermedad de Hallerrorden-Spatz; demencia pugilística; lesión neurotraumática (por ejemplo, lesión en la médula espinal, lesión cerebral, trama, trauma repetitivo); dolor; dolor inflamatorio; autismo; depresión, ataques; trastornos cognitivos; epilepsia; y similares. Tal método puede comprender, opcionalmente, administrar una cantidad eficaz de una composición o composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo TNF o variante o porción específica a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita de tal modulación, tratamiento o terapia. Ver, por ejemplo, Merck Manual, 16.° Edición, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una herida, trama o lesión tisular o condición crónica relacionada, en una célula, un tejido, un órgano, un animal o un paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos uno de: lesión físicas o un trauma asociado con cirugías orales que incluye cirugía periodontal, extracción(es) dental(es), tratamiento endodóntico, inserción de implantes dentales, aplicación y uso de prótesis dentales; o en donde la herida se selecciona del grupo que consiste de heridas asépticas, heridas contusas, heridas incisas, heridas laceradas, heridas no penetrantes, heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas punzantes, heridas sépticas, infartos y heridas subcutáneas; o en donde la herida se selecciona del grupo que consiste de úlceras isquémicas, escaras, fístulas, mordeduras severas, quemaduras térmicas y heridas de ditio donador; o en donde la herida es una herida aftosa, una herida traumática o una herida asociada a un herpes.

Las heridas y/o úlceras se encuentran, normalmente, sobresaliendo de la piel o sobre una superficie de la mucosa o como resultado de un infarto en un órgano ("ataque"). Una herida podría ser el resultado de una lesión o un defecto del tejido blando o de una condición subyacente. En el presente contexto, el término "piel" se relaciona con la superficie externa del cuerpo de un animal, que incluye un humano, y comprende piel intacta o casi intacta así como una superficie cutánea lesionada. El término "mucosa" se relaciona con la mucosa dañada o no dañada de un animal, tal como un humano, y podría ser mucosa oral, bucal, auditiva, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal o rectal.

En el presente contexto, el término "herida" denota una herida corporal con la interrupción de la integridad normal de las estructuras tisulares. El término también pretende abarcar los términos "llaga", "lesión", "necrosis" y "úlcera". Normalmente, el término "llaga" es un término popular para casi cualquier lesión de la piel o membranas mucosas y el término "úlcera" es un defecto local, o excavación, de la superficie de un órgano o tejido, el cual se produce por la descamación del tejido necrótico. Lesión se relaciona, generalmente, con cualquier defecto tisular. Necrosis se relaciona con el tejido muerto que resulta de una infección, lesión, inflamación o infartos.

El término "herida" usado en el presente contexto denota cualquier herida (ver más abajo la clasificación de heridas) en cualquier etapa particular del proceso curativo, que incluye la etapa anterior a comenzar cualquier curación o incluso anterior a que se haga una herida específica como una incisión quirúrgica (tratamiento profiláctico). Los ejemplos de heridas que se pueden prevenir y/o tratar de conformidad con la presente invención son, por ejemplo, heridas asépticas, heridas contusas, heridas incisas, heridas laceradas, heridas no penetrantes (es decir, heridas en las cuales no hay interrupción de la piel, pero hay lesión a las estructuras subyacentes), heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas punzantes, heridas sépticas, heridas subcutáneas, etc. Los ejemplos de llagas son las llagas que se producen por estar en la cama, llagas ulcerosas, llagas de cromo, aftas, escaras, etc. Los ejemplos de úlceras son, por ejemplo, una úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera gotosa, úlcera diabética, úlcera isquémica hipertensiva, úlcera de éstasis, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical y úlcera venérea, por ejemplo, causada por gonorrea (que incluye uretritis, endocervicitis y proctitis). Las condiciones relacionadas con heridas o llagas, las cuales podrían tratarse exitosamente de conformidad con la invención, son quemaduras, ántrax, tétanos, gangrena gaseosa, escarlatina, erisipela, sicosis de la barba, foliculitis, impétigo contagioso o impétigo bulloso, etc. Frecuentemente, existe una superposición entre el uso de los términos "herida" y "úlcera, y "herida" y "llaga" y, además, los términos se usan, frecuentemente, de forma aleatoria. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, en el presente contexto el término "herida" abarca los términos "úlcera", "lesión", "llaga" e "infarto", y los términos se usan indiscriminadamente a menos que se indique de cualquier otra forma.

Los tipos de heridas a tratarse de conformidad con la invención incluyen también (i) heridas generales, tales como, por ejemplo, heridas quirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquémicas, térmicas, químicas, bullosas; (ii) heridas específicas de la cavidad oral, tal como, por ejemplo, heridas postextracción, heridas endodónticas especialmente en conexión con el tratamiento de quistes y abscesos, úlceras y lesiones de origen bacteriano, viral o autoinmunológico, heridas mecánicas, químicas, térmicas, infecciosas y liquenoides; úlceras de herpes, estomatitis aftosa, gingivitis ulcerativa necrotizante aguda y síndrome de boca ardiente son ejemplos específicas; y (iii) heridas sobre la piel, tales como, por ejemplo, neoplasia, quemaduras (por ejemplo, químicas, térmicas), lesiones (bacterianas, virales, autoinmunológica), mordeduras e incisiones quirúrgicas. Otra forma de clasificar heridas es como (i) pérdida tisular pequeña debido a incisiones quirúrgicas, abrasiones menores y mordeduras menores, o como (ii) pérdida tisular significativa. El último grupo incluye úlceras isquémicas, escaras, fístulas, laceraciones, mordeduras severas, quemaduras térmicas y heridas del sitio donador (en tejidos blandos y duros) e infartos.

Otras heridas de importancia en conexión con la presente invención son las heridas como las úlceras isquémicas, escaras, fístulas, mordeduras severas, quemaduras térmicas y heridas de sitio donador. Las úlceras isquémicas y las escaras son heridas, las cuales, normalmente, sólo sanan muy lentamente y, especialmente en esos casos, un proceso curativo más rápido y mejorado es, por supuesto, de gran importancia para el paciente. Además, los costos involucrados en el tratamiento de pacientes que sufren de tales heridas se reducen marcadamente cuando la curación se mejora y se lleva a cabo más rápidamente.

Las heridas de sitio donador son heridas, las cuales, por ejemplo, suceden en conexión con la eliminación de tejido duro de una parte del cuerpo y la colocación en otra parte del cuerpo, por ejemplo, en conexión con los transplantes. Las heridas que resultan de tales operaciones son muy dolorosas y, por lo tanto, una curación mejorada es más valiosa. El término "piel" se usa en un sentido muy amplio para abarcar la capa epidérmica de la piel y, en los casos donde la superficie cutánea está más o menos lesionada, también la capa dérmica de la piel. Aparte del estrato córneo, la capa epidérmica de la piel es la capa exterior (epitelial), y la capa de tejido conectivo más profunda de la piel se denomina dermis.

Cualquier método de la presente invención puede comprender administrar una cantidad eficaz de una composición o composición farmacéutica que comprende al menos un supercóntigo de proteína a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita tal modulación, tratamiento o terapia. Tal método puede comprender, además, opcionalmente, terapia de combinación o coadministración para tratar tales enfermedades o trastornos, en donde la administración del al menos un supercóntigo de proteína, porción especificada o variante de este comprende, además, administrar, antes, durante y/o después, al menos uno seleccionado de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero sin limitarse a, antagonista de proteína o químico de TNF, fragmento o anticuerpo monoclonal o policlonal de TNF, un receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de fusión de estos, o un antagonista de TNF de molécula pequeña, por ejemplo, proteína de unión de TNF I o II (TBP-1 o TBP II), nerelimonmab, infliximab, etanercept (Enbrel™), adalimulab (Humira™), CDP-571 , CDP-870, afelimomab, lenercept, y similares), un antirreumático (por ejemplo, metotrexato, auranofin, aurotioglucosa, azatioprina, tiomalato de oro y sodio, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esferoide (NSAID, por sus siglas en inglés), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antibiótico (por ejemplo, aminoglicósido, un antifúngico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una flurorquinolona, una macrolida, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otros antibióticos), un antisoriásico, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un agente nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada al calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (G -CSF, Leucina), una vacuna, una inmunoglobulina, un ¡nmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un modulador de receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un agente antimaníaco, un antisicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepecil, tacrina, una medicación para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotriena, un metilxantino, un cromolin, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocina. Las dosificaciones adecuadas son muy conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Wells y otros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2 ° edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000, edición Deluxe, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21.° edición, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001 ; Health Professional's Drug Guide 2001 , ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddie River, NJ. cada uno de los cuales se incorpora en la presente, en su totalidad, como referencia.

Las citocinas incluyen cualquier citocina conocida. Ver, por ejemplo, CopewithCytokines.com. Los antagonistas de citocina incluyen, pero no se limitan a, cualquier supercóntigo de proteína, anticuerpo, fragmento o mimético, cualquier receptor soluble, fragmento o mimético, cualquier antagonista de molécula pequeña, o cualquier combinación de estos.

Típicamente, el tratamiento de condiciones patológicas se realiza mediante la administración de una cantidad o dosis eficaz de al menos una composición de supercóntigo de proteína que totaliza, en promedio, un intervalo de al menos aproximadamente 0.01 a 500 miligramos de al menos un supercóntigo de proteína por kilogramo de paciente por dosis y, preferentemente, de al menos aproximadamente 0.1 a 100 miligramos supercóntigo de proteína/kilogramo de paciente por administración simple o múltiple, dependiendo de la actividad específica del agente activo contenido en la composición. Alternativamente, la concentración de suero eficaz puede comprender 0.1-5000 pg/ml de concentración de suero por administración simple o múltiple. Las dosificaciones adecuadas son conocidas por el personal médico y, por supuesto, dependerá del estado de la enfermedad particular, la actividad específica de la composición que se administra y el paciente particular que sobrelleva el tratamiento. En algunas instancias, para lograr la cantidad terapéutica deseada, puede ser necesario proporcionar administraciones repetidas, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis particular monitoreada o medida, en donde las administraciones individuales se repiten hasta que se alcanza la dosis diaria o el efecto deseado.

Las dosis preferidas pueden incluir, opcionalmente, aproximadamente 0.1-99 y/o 100-500 mg/kg/administración, o cualquier intervalo, valor o fracción de estos, o para lograr una concentración de suero de aproximadamente 0.1-5000 pg/ml de concentración de suero por administración simple o múltiple, o cualquier intervalo, valor o fracción de estos. Un intervalo de dosificación preferido para el supercóntigo de proteína de la presente invención es de aproximadamente 1 mg/kg, hasta aproximadamente 3, aproximadamente 6 o aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal del paciente.

Alternativamente, la dosificación administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular, y su modo y ruta de administración; edad, salud y peso del receptor; naturaleza y el grado de síntomas, tipo de tratamiento simultáneo, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. Usualmente, una dosificación de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0.1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Comúnmente, 0.1 a 50 y, preferentemente, 0.1 a 10 miligramos por kilogramo por administración o en forma de liberación sostenida es eficaz para obtener los resultados deseados.

Como un ejemplo no limitante, el tratamiento de seres humanos o animales puede proporcionarse como una dosificación única o periódica de al menos un supercóntigo de proteína de la presente invención de aproximadamente 0.1 a 100 mg/kg o cualquier intervalo, valor o fracción de este por día, en al menos uno de los días 1-40 o, alternativamente o adicíonalmente, al menos una de las semanas 1-52 o, alternativamente o adicíonalmente, al menos uno de 1-20 años, o cualquier combinación de estos, mediante el uso de dosis única, en infusión o repetida.

Las formas de dosificación (composición) adecuadas para la administración interna contienen, generalmente, de aproximadamente 0.001 miligramos a aproximadamente 500 miligramos de ingredientes activos por unidad o envase. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo, comúnmente, estará presente en una cantidad de aproximadamente 0.5-99.999 % en peso sobre la base del peso total de la composición.

Para administración parenteral, el supercóntigo de proteína puede formularse como una solución, suspensión, emulsión, partícula, polvo o polvo liofilizado en conjunto, o proporcionarse separadamente, con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y aproximadamente 1-10 % de albúmina sérica humana. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos, tales como aceites fijos. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, amortiguadores y conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas conocidas o adecuadas.

Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo.

Administración alternativa Pueden usarse muchos modos conocidos y desarrollados de conformidad con la presente invención para administrar cantidades farmacéuticamente eficaces de al menos un supercóntigo de proteína de conformidad con la presente invención. Si bien en la siguiente descripción se usa administración pulmonar, pueden usarse otros modos de administración de conformidad con la presente invención con resultados adecuados. Los supercóntigos de proteína de la presente invención pueden proporcionarse en un vehículo, como una solución, emulsión, coloide o suspensión, o como un polvo, mediante el uso de cualquiera de una variedad de dispositivos y métodos adecuados para la administración por inhalación u otros modos descritos aquí o conocidos en la materia.

Administración y formulaciones parenterales Las formulaciones de administración parenteral pueden contener como excipientes comunes agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles, tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, ñafíatenos hidrogenados, y similares. Las suspensiones acuosas o oleosas para inyección pueden prepararse mediante el uso de un emulsionante o humidificador apropiado y un agente de suspensión, de conformidad con métodos conocidos. Los agentes para inyección pueden ser un agente de dilución no tóxico administrable no oralmente, tal como una solución acuosa, una solución inyectable estéril o una suspensión en un solvente. Como el solvente o vehículo usable, se permiten agua, solución de Ringer, solución salina isotónica, etc.; como un solvente común o solvente de suspensión se puede usar un aceite no volátil estéril. Para estos propósitos puede usarse cualquier ácido graso y aceite no volátil, que incluyen aceites o ácidos grasos naturales, sintéticos o semisintéticos; mono, di o triglicéridos naturales, sintéticos o semisintéticos. La administración parental es conocida en la materia e incluye, pero no se limita a, medios convencionales de inyección, un dispositivo de inyección sin aguja presurizado a gas como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,851 ,198, y un dispositivo perforador láser como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,839,446, incorporada en la presente descripción en su totalidad como referencia.

Suministro alternativo La invención se relaciona, además, con la administración de al menos un supercóntigo de proteína por un medio parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, ¡ntracartilaginoso, intracavidad, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolos, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico. Se puede preparar al menos una composición de supercóntigo de proteína para su uso para administración parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa) o cualquier otra administración, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para su uso en administración vaginal o rectal, particularmente en formas semisólidas tal como, pero sin limitarse a, cremas y supositorios; para administración oral o sublingual tal como, pero sin limitarse a, en forma de tabletas o cápsulas; o por vía intranasal tal como, pero sin limitarse a, la forma de polvo, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; o por vía transdérmica tal como, pero sin limitarse a, un gel, una pomada, una loción, una suspensión o un sistema de distribución de parche con potenciadores químicos, tales como sulfóxido de dímetilo, para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentración del fármaco en el parche transdérmico (Junginger y otros en "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D. S., Eds., pág. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nueva York 1994, incorporado en la presente como referencia), o con agentes oxidantes que permiten la aplicación de proteínas y péptidos que contienen la formulación en la piel (patente núm. WO 98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear rutas de transporte transitorias, tales como electroporación, o para aumentar la movilidad de fármacos cargados por la piel, tal como iontoforesis, o aplicación de ultrasonido, tal como sonoforesis (patentes de los Estados Unidos núms. 4,309,989 y 4,767,402) (las patentes y publicaciones anteriores se incorporan totalmente en la presente descripción como referencia).

Administración pulmonar/nasal Para la administración pulmonar, preferentemente, al menos una composición de supercóntigo de proteína se suministra en un tamaño de partícula eficaz para alcanzar las vías aéreas inferiores del pulmón o los senos nasales. De conformidad con la invención se puede suministrar al menos un supercóntigo de proteína mediante cualquiera de una variedad de dispositivos nasales o de inhalación conocidos en la materia para la administración de un agente terapéutico por inhalación. Estos dispositivos capaces de depositar formulaciones aerosolizadas en la cavidad sinusal o los alvéolos de un paciente incluyen inhaladores de dosis medida, nebulizadores, generadores de polvo, rociadores, y similares. Otros dispositivos adecuados para dirigir la administración pulmonar o nasal de supercóntigos de proteína también se conocen en la materia. Todos estos dispositivos pueden usar formulaciones adecuadas para la administración para dispensar un supercóntigo de proteína en un aerosol. Tales aerosoles pueden comprender soluciones (acuosas y no acuosas) o partículas sólidas.

Los inhaladores de dosis medida como el inhalador de dosis medida Ventolín® usan, típicamente, un gas propulsor y requieren la activación durante la inspiración (véanse, por ejemplo, las patentes núms. WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalador Spiros™ (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, y el inhalador de polvo Spinhaler® (Fisons), usan activación por respiración de un polvo mezclado (patente de los Estados Unidos núm. 4668218 de Astra, patentes núms. EP 237507 de Astra, WO 97/25086 de Glaxo, WO 94/08552 de Dura, 5458135 de Inhale, WO 94/06498 de Fisons, incorporadas en la presente descripción en su totalidad como referencia). Los nebulizadores como AERx™ Aradigm, el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt) y el nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (patente de los Estados Unidos núm. 5404871 de Aradigm, patente núm. WO 97/22376), las referencias mencionadas anteriormente se incorporan, en su totalidad, como referencia, producen aerosoles a partir de soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo, etc. generan aerosoles de partícula pequeña. Estos ejemplos específicos de dispositivos de inhalación disponibles comercialmente pretenden ser una representación de los dispositivos específicos adecuados para la práctica de esta invención, y no pretenden limitar el ámbito de la invención.

Preferentemente, una composición que comprende al menos un supercóntigo de proteína se suministra mediante un inhalador de polvo o un rociador. Existen varias características deseables de un dispositivo de inhalación para administrar al menos un supercóntigo de proteína de la presente invención. Por ejemplo, el suministro por un dispositivo de inhalación es ventajosamente confiable, reproducible y preciso. El dispositivo de inhalación puede suministrar, opcionalmente, partículas secas pequeñas, por ejemplo, menos que aproximadamente 10 pm, preferentemente, aproximadamente 1-5 pm, para una buena capacidad de respiración.

Administración de una composición de supercóntigo de proteína como un rocío Un rociador que incluye una composición de supercóntigo de proteína puede producirse al forzar una suspensión o una solución de al menos un supercóntigo de proteína a través de una tobera bajo presión. El tamaño y la configuración de la tobera, la presión aplicada y la velocidad de alimentación del líquido pueden seleccionarse para lograr la salida y el tamaño de partícula deseados. Puede producirse un electrorocío, por ejemplo, mediante un campo eléctrico en conexión con una alimentación de tobera o capilar. Ventajosamente, las partículas de al menos una composición de supercóntigo de proteína suministradas mediante un rociador tienen un tamaño de partícula menor que aproximadamente 10 pm, preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y, con la máxima preferencia, aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

Las formulaciones de al menos una composición de supercóntigo de proteína adecuadas para usarse con un rociador incluyen, típicamente, una composición de supercóntigo de proteína en una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una composición de supercóntigo de proteína por mi de solución o mg/gm, o cualquier intervalo, valor o fracción en este. La formulación puede incluir agentes, tal como un excipiente, un amortiguador, un agente de isotonicidad, un conservante, un surfactante y, preferentemente, cinc. La formulación puede incluir, además, un excipiente o agente para la estabilización de la composición de supercóntigo de proteína, tal como un amortiguador, un agente reductor, una proteína a granel o un hidrato de carbono. Las proteínas a granel útiles en la formulación de composiciones de supercóntigo de proteína incluyen albúmina, protamina, o similares. Los hidratos de carbono típicos útiles en la formulación de composiciones de supercóntigo de proteína incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La formulación de la composición de supercóntigo de proteína puede incluir, además, un surfactante, el cual puede reducir o evitar la agregación inducida por superficie de la composición de supercóntigo de proteína causada por el rociado de la solución en la formación de un aerosol. Pueden usarse varios surfactantes convencionales, tal como alcoholes y esteres del ácido graso del polioxietileno, y ésteres del ácido graso del polioxietileno sorbitol. Las cantidades se encontrarán, generalmente, en el intervalo de 0.001 y 14 % en peso de la formulación. Los surfactantes especialmente preferidos para los fines de esta invención son monooleato de polioxietileno sorbitán, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. En la formulación pueden incluirse agentes adicionales conocidos en la materia para la formulación de una proteína, tal como supercóntigos de proteína, o porciones o variantes especificadas.

Administración de composiciones de supercóntigo de proteína mediante un nebulizador Las composiciones de supercóntigo de proteína de la invención pueden administrarse mediante un nebulizador, tal como un nebulizador a chorro o un nebulizador ultrasónico. Típicamente, en un nebulizador a chorro se usa una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire de alta velocidad a través de un orificio. A medida que el gas se expande más allá de la tobera, se crea una región de baja presión, la cual lleva una solución de composición de supercóntigo de proteína a través de un tubo capilar conectado a un receptáculo de líquido. La corriente de líquido del tubo capilar se cizalla en filamentos inestables y goticulas a medida que sale del tubo, lo que crea un aerosol. Puede emplearse una variedad de configuraciones, regímenes de flujo y tipos de amortiguadores para lograr las características de desempeño deseadas de un nebulizador a chorro. En un nebulizador ultrasónico, se usa energía eléctrica de alta frecuencia para crear energía mecánica vibratoria, típicamente, medíante el empleo de un transductor piezoeléctrico. Esta energía se transmite a la formulación de composición de supercóntigo de proteina directamente o a través de un fluido de acoplamiento, lo que crea un aerosol que incluye la composición de supercóntigo de proteína. Ventajosamente, las partículas de composición de supercóntigo de proteína suministradas mediante un nebulizador tienen un tamaño de partícula menor que aproximadamente 10 pm, preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y, con la máxima preferencia, aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

Las formulaciones de al menos un supercóntigo de proteína adecuadas para usarse con un nebulizador, tanto a chorro como ultrasónico incluyen, típicamente, una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos un supercóntigo de proteína por mi de solución. La formulación puede incluir agentes, tal como un excipiente, un amortiguador, un agente de isotonicidad, un conservante, un surfactante y, preferentemente, cinc. La formulación puede incluir, además, un excipiente o agente para la estabilización de una composición de al menos un supercóntigo de proteína, tal como un amortiguador, un agente reductor, una proteína a granel o un hidrato de carbono. Las proteínas a granel útiles en la formulación de composiciones de al menos un supercóntigo de proteína incluyen albúmina, protamina, o similares. Los hidratos de carbono típicos útiles en la formulación de al menos un supercóntigo de proteína incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La formulación de al menos un supercóntigo de proteína puede incluir, además, un surfactante que puede reducir o evitar la agregación inducida por superficie de la composición de al menos un supercóntigo de proteína causada por la atomización de la solución en la formación de un aerosol. Pueden usarse varios surfactantes convencionales, tal como alcoholes y ésteres del ácido graso del polioxietileno, y ésteres del ácido graso del polioxietileno sorbital. Las cantidades se encontrarán, generalmente, en el intervalo de aproximadamente 0.001 y 4 % en peso de la formulación. Los surfactantes especialmente preferidos para los fines de esta invención son monooleato de polioxietileno sorbitán, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. En la formulación pueden incluirse agentes adicionales conocidos en la materia para la formulación de una proteína, tal como supercóntigo de proteína.

Administración de supercóntiqo de proteina mediante un inhalador de dosis medida En un inhalador de dosis medida (MDI, por sus siglas en inglés), un propulsor, al menos un supercóntigo de proteína y cualquier excipiente u otro aditivo se encuentran contenidos en un bote como una mezcla que incluye un gas comprimido líquido. La activación de la válvula de medición libera la mezcla como un aerosol que, preferentemente, contiene partículas con un tamaño en el intervalo menor que aproximadamente 10 pm, preferentemente, aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y, con la máxima preferencia, aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm. El tamaño de partícula de aerosol deseado puede obtenerse mediante el empleo de una formulación de composición de supercóntigo de proteína producida mediante varios métodos conocidos para aquellas personas con experiencia en la materia, que incluyen molienda a chorro, secado por aspersión, condensación en el punto crítico, o similares. Los inhaladores de dosis medida incluyen los fabricados por 3M o Glaxo, y que emplean un propulsor de hidrofluorocarbonos. Las formulaciones de al menos un supercóntigo de proteína para usarse con un dispositivo inhalador de dosis medida incluirán, generalmente, un polvo finamente dividido que contiene al menos un supercóntigo de proteína como una suspensión en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propulsor con la asistencia de un surfactante. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como clorofluorocarbonos, un hidroclorofluorocarbono o un hidrocarburo, que incluye triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1 ,1,1,2-tetrafluometano, HFA-134a (h¡drofluroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluroalcano-227), o similares. Preferentemente, el propulsor es un hidrofluorocarbono. El surfactante puede seleccionarse para estabilizar el al menos un supercóntigo de proteína como una suspensión en un propulsor, para proteger el agente activo contra la degradación química, y similares. Los surfactantes adecuados incluyen trioleato de sorbitán, lecitina de soya, ácido oleico, o similares. En algunos casos se prefieren los aerosoles de solución con el uso de solventes, tales como etanol. En la formulación pueden incluirse agentes adicionales conocidos en la materia para la formulación de una proteína. Una persona con experiencia en la materia reconocerá que los métodos de la invención actual pueden lograrse por la administración pulmonar de al menos una composición de supercóntigo de proteína mediante dispositivos que no se describen en la presente invención.

Administración y formulaciones orales Las formulaciones para administración oral dependen de la coadministración de adyuvantes (por ejemplo, resorcinol y surfactantes no iónicos, tal como éter de oleílo polioxietileno y éter de n-hexadecilpolietileno) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, asi como la coadministración de inhibidores enzimáticos (por ejemplo, inhibidores de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. Las formulaciones para suministrar agentes hidrofílicos que incluyen proteínas y supercóntigos de proteína y una combinación de al menos dos surfactantes destinados a la administración oral, bucal, a través de la mucosa, nasal, pulmonar, transmembrana vaginal o rectal se enseñan en la patente de los Estados Unidos núm. 6,309,663. El compuesto de constituyente activo de la forma de dosificación del tipo sólido para la administración oral puede mezclarse con al menos un aditivo, que incluye sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidones, agar, arginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, gomas de tragacanto, goma arábiga, gelatina, colágeno, caseína, albúmina, polímero sintético o semisintético y glicérido. Estas formas de dosificación pueden contener, además, otro(s) tipo(s) de aditivo(s), por ejemplo, agente diluyente inactivo, lubricante, tal como estearato magnésico, parabén, agente conservante, tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, .alfa.-tocoferol, antioxidante, tal como cisteína, disintegrador, aglutinante, espesante, agente amortiguador, agente endulzante, agente saborizante, agente perfumante, etc. Las tabletas y las pildoras pueden procesarse aún más en preparaciones con recubrimiento entérico. Las preparaciones líquidas para la administración oral incluyen preparaciones de emulsiones, jarabes, elíxires, suspensiones y soluciones admisibles para el uso médico. Estas preparaciones pueden contener agentes inactivos usados comúnmente en tal campo, por ejemplo, agua. También se describieron liposomas como sistemas de suministro de fármacos para insulina y heparina (patente de los Estados Unidos núm. 4,239,754). Más recientemente se han usado microesferas de polímeros artificiales o aminoácidos mezclados (proteinoides) para suministrar productos farmacéuticos (patente de los Estados Unidos núm. 4,925,673). Además, los compuestos vehículo descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,879,681 y la patente de los Estados Unidos núm. 5,5,871 ,753 y usados para suministrar oralmente agentes biológicamente activos se conocen en la materia.

Administración y formulaciones para mucosas Una formulación para administrar oralmente un agente bioactivo encapsulado en uno o más excipientes de polímeros o copolímeros biocompatibles, preferentemente, un polímero o copolímero biodegradable, que proporcionan microcápsulas, las cuales debido al tamaño adecuado de las microcápsulas resultantes resulta en que el agente alcanza, y es tomado por los folículos linfoides agregados, también denominados "placas de Peyer" o "GALT" del animal sin pérdida de eficacia debido al paso del agente por el tracto gastrointestinal. Pueden encontrarse agregados de folículos linfoides similares en los tubos bronquiales (BALT) y el intestino grueso. Los tejidos descritos anteriormente se denominan, generalmente, tejidos linforeticulares asociados a mucosas (MALT, por sus siglas en inglés). Para la absorción a través de superficies de mucosas, las composiciones y los métodos para administrar al menos un supercóntigo de proteína incluyen una emulsión que comprende una pluralidad de partículas submicrónicas, una macromolécula mucoadhesiva, un péptido bioactivo y una fase continua acuosa, la cual promueve la absorción a través de las superficies de mucosas al lograr la microadhesión de las partículas de la emulsión (patente de los Estados Unidos núm. 5,514,670). Las superficies de mucosas adecuadas para la aplicación de las emulsiones de la presente invención pueden incluir vías de administración corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomática, intestinal y rectal. Las formulaciones para la administración vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de cacao, y similares. Las formulaciones para la administración intranasal pueden ser sólidas y contener como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser acuosas o soluciones oleosas de gotas nasales. Para la administración bucal, los excipientes incluyen azúcares, estearato calcico, estearato magnésico, almidón pregelatinado, y similares (patente de los Estados Unidos núm. 5,849,695).

Administración y formulaciones transdérmicas Para la administración transdérmica, el al menos un supercóntigo de proteína se encapsula en un dispositivo de suministro, tal como liposomas o nanopartículas poliméricas, microparticulas, microcápsuláV o microesferas (denominadas colectivamente microparticulas, a menos que se indique de cualquier otra forma). Se conocen varios dispositivos adecuados, que incluyen microparticulas fabricadas de polímeros sintéticos, tales como polihidroxi ácidos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y copolímeros de estos, políortoésteres, polianhídridos y polifosfacenos, y polímeros naturales, tales como colágeno, ácidos poliaminos, albúminas y otras proteínas, alginato y otros polisacáhdos, y combinaciones de estos (patente de los Estados Unidos núm. 5,814,599).

Administración prolongada y formulaciones Podría preferirse suministrar los compuestos de la presente invención al sujeto durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo, durante periodos de una semana a un año, a partir de una administración simple. Pueden usarse varias formas de dosificación de liberación lenta, absorción lenta o implante. Por ejemplo, una forma de dosificación puede contener una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable de los compuestos, que tiene un grado bajo de solubilidad en fluidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adición de ácido con un ácido polibásico, tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácidos mono o disulfónicos de naftaleno, ácido poligalacturónico, y similares; (b) una sal con un catión de metal polivalente, tal como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, y similares, o con un catión orgánico formado a partir de, por ejemplo, ?,?'-dibencil-etilendíamina o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, una sal de tanato de cinc. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención o, preferentemente, una sal relativamente insoluble, tal como las que se describieron recientemente, pueden formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato alumínico con, por ejemplo, aceite de sésamo, adecuado para la inyección. Las sales particularmente adecuadas incluyen sales de cinc, sales de tanato de cinc, sales de pamoato, y similares. Otro tipo de formulación de depósito de liberación lenta para la inyección contendría la sal o el compuesto disperso para la encapsulación en un polímero no antigénico, no tóxico, de degradación lenta, tal como un polímero de ácido poliláctico/ácido poliglícólico, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 3,773,919. Los compuestos o, preferentemente, las sales relativamente insolubles, tales como las descritas anteriormente, también pueden formularse en bolillas silásticas de matriz de colesterol, particularmente para usarse en animales. Adicionalmente, las formulaciones de liberación lenta, depósito o implante, por ejemplo, liposomas de líquido o gas, son conocidas en la literatura (patente de los Estados Unidos núm. 5,770,222 y "Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

Habiendo descrito la invención generalmente, la misma se enténderá más fácilmente en referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1. Diseño de Tencon El tercer dominio FN3 de tenascina humana (SEQ ID NO: 3) puede usarse como un supercóntigo alternativo capaz de diseñarse para que se una a moléculas destino específicas a través de ondas expuestas en la superficie estructuralmente análogos a las regiones determinadoras de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de los anticuerpos. La temperatura de fusión de este dominio es 54 °C en PBS en su forma nativa. A fin de producir una molécula de supercóntigo con una estructura similar y propiedades físicas mejoradas, tal como una estabilidad térmica mejorada, se diseñó una secuencia consenso sobre la base de un alineamiento de dominios 15 FN3 de tenascina humana (SEQ ID NO: 1-15).

El análisis del alineamiento de secuencias múltiple de la Tabla 1 muestra que estos 15 dominios tienen identidades de secuencia entre sí que se encuentran en el intervalo de 13 a 80 %, con un promedio de identidad de secuencia entre pares de 29 %. Se diseñó una secuencia consenso (SEQ ID NO: 16) mediante la incorporación del aminoácido más conservado (frecuente) en cada posición a partir del alineamiento mostrado en la Tabla 1. En los alineamientos en pares, la secuencia consenso de la presente invención (SEQ ID NO:16), designada Tencon, es idéntica a los dominios FN3 de tenascina en 34 - 59 % de las posiciones con un promedio de identidad de secuencia de 43 %.

Expresión y purificación La secuencia de aminoácidos de Tencon (SEQ ID NO: 16) se retradujo, lo que resultó en la secuencia de ADN que se muestra en la SEQ ID NO: 17. Esta secuencia se ensambló mediante PCR de superposición, se subclonó en un vector pET15 modificado, se transformó en E. coli BL21 Star(DE3)(lnvitrogen) y se sembró en placas sobre placas de agar LB que contenían 75 Dg/ml de carbenicilina. Se eligió una sola colonia y se cultivó durante la noche a 37 °C en 50 mi de medio TB que contenía 2 % de glucosa y 100 pg/ml de carbenicilina. Este cultivo se usó para sembrar 500 mi de medios de autoinducción (Overnight Express Instant TB media, Novagen) en un matraz Ultra Yield de 2.5 I (Thomson Instrument Company). El cultivo y la expresión se realizó mediante el uso de un programa doble (3 horas a 37 °C, 300 rpm, seguido por 16 horas a 30 °C, 250 rpm) en una incubadora de agitación ATR Multitron.

El cultivo se cosechó y se centrifugó a 7000 rpm durante 15 minutos en un rotor JL8.1 para convertir las células en bolillas. Las células se volvieron a suspender en 30 mi de tampón que contenía 20 mM de fosfato sódico, pH 7.5, 500 mM de NaCI, 10 % de glicerol, 20 mM de imidazol, 0.37 mg/mL de lisozima, Inhibidor de proteasa completo 1X (libre de EDTA; Roche) y benzonasa (Sigma-Aldrich, 0.25 µ?/ml final) y se lisaron con un sonicador Misonix XL2020 durante 5 minutos sobre hielo en modo pulso (5 segundos encendido, 30 segundos apagado). El material soluble se eliminó por centrifugación a 17,000 rpm durante 30 minutos en un rotor JA-17.

La proteína Tencon se purificó del lisado soluble en un proceso cromatográfico de 2 etapas. Primero, la proteína se capturó por cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, mediante la adición de 2 mi de glóbulos de agarosa Ni-NTA (Qiagen) al lisado y la colocación de éste en una plataforma vibratoria durante 1 hora a 4 °C. Después, la resina se compactó en una columna Poly-Prep (Bio-Rad) y se lavó con 20 mM de fosfato sódico, pH 7.5, 500 mM de NaCI, 10 % de glicerol y 20 mM de imidazol para eliminar el material libre. Las proteínas se eluyeron de la resina con 20 mM de fosfato sódico, pH 7.5, 500 mM de NaCI, 10 % de glicerol y 500 mM de imidazol. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE, tanto mediante tinte Coomassie como mediante Membrana de Western con un anticuerpo antí-His de conjugado HRP (Immunology Consultants Laboratory). Las fracciones deseadas se agruparon y dializaron en PBS de pH 7.4. Como una segunda etapa de purificación, la proteína se cargó en una columna Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare) equilibrada en PBS. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y las fracciones que contenían Tencon se agruparon y concentraron mediante el uso de un concentrador Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).

La concentración de proteínas se determinó mediante el uso de un lector de platina BioTek para medir la absorbancia de la muestra a 280 nm. La preparación final se analizó mediante tinte Coomassie (Figura 1 ), Membrana de Western con anticuerpo anti-His y mediante HPLC-SEC con el uso de una columna G3000SW-XL (TOSOH Biosciences) equilibrada en PBS. El análisis SDS-PAGE muestra que Tencon migra entre 6 y 14 kDa, de acuerdo con la masa esperada de 10.7 kDa para la proteína monomérica. Se obtuvo un rendimiento de >50 mg de proteína Tencon pura por litro de cultivo.

Caracterización biofísica La estructura y estabilidad de Tencon se caracterizó por espectroscopia de dicroísmo circular y calorimetría diferencial de barrido, respectivamente. Las mediciones de CD se realizaron en un espectrómetro AVIV a 20 °C en PBS y una concentración de 0.2 mg/ml. El espectro en la Figura 2 muestra un mínimo a 218 nm, lo que sugiere estructura de hoja ß como se espera para una proteína que pertenece a la familia FN3 como se designó. La información de DSC se obtuvo al calentar 0.5 mg/ml de soluciones del 3.° dominio FN3 de Tenascina o Tencon en PBS desde 35 °C a 95 °C a una velocidad de 1 °C/minuto en un calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). Se sustrajo la única curva de un amortiguador para producir los perfiles mostrados en la Figura 3. A partir de esta información se calcularon las temperaturas de fusión de 54 °C y 78 °C para el 3.° dominio de FN3 y Tencon, respectivamente, mediante el uso del programa de computadora CpCalc (Applied Thermodynamics). El plegado y desplegado de los dos dominios es reversible a estas temperaturas.

Análisis de inmunoqenicidad Se usó un programa que modela para inmunogenicidad a humanos de secuencias de aminoácidos para comparar la inmunogenicidad predicha de secuencias de aminoácidos que representan el 3.° dominio FN3 de Tenascina humana, Tencon, y varios anticuerpos terapéuticos (mostrados en la Tabla 2). Las mAb quiméricas y una mAb humana (adalimumab) analizadas con el programa fueron seguidas por la aplicación de un umbral de tolerancia (quita 9-mer de péptidos con 100 % de identidad con la secuencia codificada por la linea germinal humana. El umbral de tolerancia no se aplicó a Tenascina o Tencon. El umbral de tolerancia asume amplia tolerancia de células T a las secuencias mAB codificadas por la línea germinal y centra el análisis en la secuencia novedosa, principalmente en dominios flanqueadores y CDR.

Estos análisis predicen un riesgo inmunogénico bajo para Tenascina y Tencon sobre la base de la posibilidad de que un péptido de 9-mer derivado de la secuencia analizada se una a una o más moléculas de HLA. El puntaje se pondera con respecto a la prevalencia de cada alelo de HLA. Los puntajes para los modelos se sumaron para cada secuencia para proporcionar un único número que describa la PIR general de cada secuencia (suma de puntos). Los resultados de este análisis se resumen en la Tabla 2. Se mostró que la Tenascina tiene el puntaje general más bajo (11.9). Tencon, como Tenascina, puntuó principalmente no aglutinantes y agretopos con un riesgo inmunogénico predicho bajo (Puntaje = 13.2). Las secuencias de Tenascina y Tencon obtuvieron un puntaje favorable comparadas con los anticuerpos terapéuticos.

Presencia de Tencon en el fago M13 por fusión de Pix El gen que codifica la secuencia de aminoácidos de Tencon se subclonó en el vector de expresión fagómido pPep9 por PCR y clonación por digestión de restricción, lo que resultó en el vector pTencon-pIX. Este sistema expresa Tencon marcada con Myc N-terminalmente como una fusión C-terminal al extremo N de la proteína M13 pIX (Figura 4). El promotor Lac permite niveles más bajos de expresión sin IPTG y expresión aumentada después de la adición de IPTG. La secuencia señal OmpA se adjuntó al extremo N de Tencon para promover el traslado eficaz al periplasma. Se construyó un ligador TSGGGGS corto (SEQ ID NO: 141 ) entre Tencon y pIX para evitar las interacciones estéricas entre estas proteínas.

Para confirmar la presencia en la superficie de la partícula del fago M13, se transformó pTencon-plX en XL1-Blue E. coli y se usó una sola colonia para inocular un cultivo de LB de 5 mi complementado con ampicilina. Este cultivo se cultivó a 37 °C hasta que alcanzó la fase media de crecimiento logarítmico, punto en el cual se adicionaron 610 pfu de fago auxiliar VCSM13, y el cultivo se incubó a 37 °C durante 10 minutos sin agitar, seguido de 50 minutos con agitación. El cultivo rescatado por fago auxiliar se diluyó, después, en 50 mi de medios 2YT complementados con ampicilina y canamicina, y se cultivó a 37 °C con agitación hasta que el O. D.600 alcanzó 0.7, punto en el cual se adicionó IPTG a una concentración final de 1 mM, y la temperatura se redujo a 30 °C. Después de 16 horas el cultivo se centrifugó a 4000 X g durante 20 minutos y se recolectó el sobrenadante y se almacenó a 4 °C para el análisis.

La unión de las partículas de fago a un anticuerpo anti-Myc (Invitrogen) se usó para confirmar la presencia del constructo Myc-Tencon en la superficie del fago M13. Se recubrió una placa Maxisorp durante la noche a una concentración de 2.5 pg/ml con anticuerpo a-Myc o anti-av (control negativo) y se bloqueó con SuperBIock T20 (Pierce). Se elaboraron diluciones dobles seriales del sobrenadante de cultivo de fagómido mencionado anteriormente en PBS y se adicionaron a pocilios de la placa recubierta. Después de 1 hora, la placa se lavó con TBST, se adicionó un anticuerpo HRP a-M13 a cada pocilio, se lavó con TBST y se incubó durante 1 hora. Se adicionó sustrato BD ELISA POD de Roche y se detectó luminiscencia en un lector de platina (Tecan). La Figura 5 muestra que las partículas de fago Myc-Tencon se unen al a-myc, pero no los pocilios recubiertos con anticuerpo anti-a? o los pocilios de control sin recubrir de la placa en una forma dependiente de la concentración, lo que confirma la presencia específica de Myc-Tencon en la partícula de fago M13.

Un vector fagómido adicional puede construirse para que presente Tencon y elementos de la genoteca (ver el Ejemplo 2) en el fago M13 como fusiones para recubrir la proteí a plll. Para este sistema, el gen para pIX se reemplaza con un gen que codifica una versión truncada de plll (Bass y otros 1990). Los cambios adicionales, comparados con el sistema mostrado en la Figura 4, incluyen reemplazo de la secuencia señal OmpA con la secuencia señal para DsbA, ya que se ha mostrado que la secreción mediante el uso de esta secuencia beneficia la existencia de moléculas de supercóntigo alternativas estables (Steíner y otros 2006).

Ejemplo 2. Generación de qenotecas de Tencon Las genotecas de variantes Tencon pueden elaborarse mediante muchos métodos distintos, dependiendo de la complejidad deseada y la ubicación relativa de las mutaciones en la molécula. Se prefieren los métodos de síntesis de ADN para crear mutaciones dispersas por todo el gen Tencon. También puede usarse clonación de enzima de restricción para recombinar fragmentos de ADN que contienen mutaciones en distintas regiones del gen. La mutagénesis de saturación en una región definida pequeña, tal como un solo onda de Tencon, puede introducirse mediante el uso de un oligo-nucleótido redundante y mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (Kunkel y otros 1987).

Se construyó una genoteca de Tencon, genoteca FG7, designada para reemplazar la onda FG con 7 aminoácidos aleatorios mediante el uso de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Se sintetizó un oligonucleótido (TconFG7-For-5'pho) para que tenga una secuencia redundante de 21 pares de bases (bp) de NNS en las posiciones que codifican la onda FG y dos secuencias de nucleótidos flanqueadoras de 20-27 bp de complementariedad con la secuencia codificante de Tencon. En este diseño, los veinte aminoácidos son capaces de representarse en la onda FG. La diversidad calculada a nivel nucleótido es 1.3x109.

TconFG7-For5'pho: (SEQ ID NO: 18) GAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSC CGCTGTCTGCGGAATTCAC La plantilla para mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-plll, se construyó al reemplazar la secuencia que codifica la onda de Tencon F.G con una secuencia de horquilla que contiene un sitio de restricción Ascl. Este sistema permite la eliminación del ADN plantilla subyacente después de la mutagénesis mediante la digestión del ADN resultante con Ascl antes de la transformación. Para purificar una plantilla de ADN de cadena simple para la mutagénesis, se eligió una sola colonia de E. coli CJ236 que alberga pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-plll y se colocó en 5 mi de medio de cultivo 2YT con carbenicilina (50 ug/ml de concentración final) y cloranfenicol (10 ug/ml). Después de 6 horas se adicionó fago auxiliar VCSM13 a una concentración final de 1010 pfu/ml, se incubó sin agitación durante 10 minutos antes de transferirlo a 150 mi de 2YT con carbenicilina (10 ug/ml) y uridina (0.25 ug/ml), y se incubó a 37 °C con agitación a 200 rpm durante la noche. Las células se convirtieron en bolillas por centrifugación, se recolectó el sobrenadante y el fago se convirtió en bolilla con PEG NaCI. Se purificó ADN de cadena simple mediante el uso de un estuche QIAprep Spin M13 (Qiagen) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Para hibridar el oligonucleótido redundante a la plantilla, se combinaron 5 pg de ADN plantilla con oligo TconFG7-For-5-pho a una relación molar de 10:1 en Tris-HCI (50 mM, pH7.5) y MgCI2 (10 mM) y se incubaron a 90 °C durante 2 minutos, 60 °C durante 3 minutos y 20 °C durante 5 minutos! Después de la reacción de hibridación, se adicionaron ATP (10 mM), dNTP (25 mM cada uno), DTT (100 mM), T4 ligasa (7 unidades), y ADN polimerasa T7 (10 unidades) a la mezcla de reacción y se incubaron a 14 °C durante 6 horas seguido por 20 °C durante 12 horas. El ADN resultante se purificó mediante el uso del estuche de purificación por PCR (Qiagen) y se recuperó en 100 µ?_ de agua. El ADN de la genoteca se digirió con 10 unidades de Ascl durante 4 horas y, después, se purificó nuevamente con el estuche de purificación por PCR de Qiagen. El ADN de la genoteca final se recuperó en 50 µ?_ de agua. El producto de ADN de cadena doble resultante se transformó, después, en MC1061 F' de E. coli por electroporación.

Los transformantes se recolectaron en 20 mi de medio SOC y se dejaron recuperar durante 1 hora a 37 °C. Al final de la recuperación se diluyó en serie una alícuota de la transformación y se sembró en placas sobre placas de carbenicilina (100 ug/ml) que contenían 1 % de glucosa para evaluar el número total de transformados. El cultivo de SOC restante se usó, después, para inocular 1 I de medio 2xYT con carbinicilina y 1 % de glucosa, y se cultivó hasta que el OD6oo alcanzó 0.6. Se inocularon 100 mi de este cultivo con fago auxiliar M13 a 10 0/ml y se incubaron a 37 °C antes de la centrifugación. La bolilla celular resultante se volvió a suspender en 50 mi de medio 2xYT fresco que contiene carbenicilina (100 ug/ml) y canamicina (35 ug/ml) y se cultivó a 30 °C durante la noche antes de la centrifugación. Las partículas de fago se precipitaron mediante la adición de PEG/NaCI y se almacenaron a -80 °C.

Se diseñó una segunda genoteca, BC6/FG7, para introducir diversidad dentro de las ondas B:C y F:G de Tencon simultáneamente. Para llevarlo a cabo se sintetizaron dos oligonucleótidos Tc-BC6-For-5'phos y POP149. El oligo directo se fosforiló y contenía 18 bases de codón NNS en cada posición que codifica la onda B:C, mientras que el oligo inverso se biotiniló en el extremo 5' y contenía 21 bases de codón NNS en cada posición que codifica la onda F:G. Ambos oligonucleótidos se encuentran flanqueados por dos secuencias de nucleótidos de 18 bp idénticas a la región anterior y que sigue a la región que se mutagenizará (para obtener detalles del iniciador, ver abajo).

Tc-BC6-For-5'phos: (SEQ ID NO: 19) gactctctgcgtctgtcttggNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTCGACTCTTTCCTGATCC AGTACC POP 2149: (SEQ ID NO: 20) GTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNAACACCGT AGATAGAAACGGTG Para construir la genoteca se llevaron a cabo dieciséis reacciones de PCR de 100 µ!_ mediante el uso de t oligos Tc-CB6-For5'phos y POP2149 para amplificar la plantilla de ADN de Tencon, al introducir codones NNS en las ondas B:C y F:G simultáneamente en el proceso. El producto de PCR de cadena doble se mezcló con perlas de estreptavidina magnéticas (Dynal) en amortiguador B&W (10 mM de Tris-HCI, pH7.5, 1 mM de EDTA, NaCI 2 M, 0.1 % de Tween-20), se incubó durante 20 minutos, se bajó con un imán y se lavó dos veces con amortiguador B&W. La hebra directa se eluyó de las perlas con 300 µ?_ de NaOH de 150 mM. Este "megainiciador", una mezcla de iniciadores largos con más de 8x1016 en diversidad teórica, se uso para hibridar a una plantilla de genoteca de cadena simple. La construcción de la genoteca se llevó a cabo como se describió anteriormente para la genoteca FG7.

Ejemplo 3. Selección de aglutinantes IgG A fin de llevar a cabo selecciones de miembros de la genoteca Tencon que se ligan a IgG, se biotiniló IgG recombinante (subtipo lgG1 humano) mediante el uso de sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) antes de dializar en PBS. Para las selecciones se bloquearon 200 pL de genotecas que presentan fagos FG7 o BC6/FG7 con 200 pL de bloqueante químico antes de adicionar IgG biotinilado a concentraciones de 500 nm (ronda 1) o 100 nm (rondas 2 y 3). Los fagos ligados se recuperaron mediante perlas de neutravidina magnéticas (Seradyne) en la ronda 1 o perlas de estrepavidina magnéticas (Promega) en las rondas 2 y 3. Los fagos no ligados se lavaron de las perlas mediante el uso de 5-10 lavados con 1 mi de solución salina amortiguada Tris con tween (TBST, por sus siglas en inglés) seguido por lavados de 2 1 mi con solución salina amortiguada Tris (TBS, por sus siglas en inglés). Los fagos ligados se eluyeron de las perlas por la adición de MC1061 F' de E. coli de fase media de crecimiento logarítmico. Las células infectadas se sembraron en placas sobre placas de agar LB complementadas con carbenicilina y glucosa. Al día siguiente, las células se rasparon de la placa y se cultivaron hasta la fase media de crecimiento logarítmico antes del rescate con fago auxiliar VCSM13, y se cultivaron durante la noche. Las partículas de fago se aislaron por precipitación de PEG/NaCI y se usaron la siguiente ronda de selecciones.

Después de 3 rondas de cribado contra IgG, el resultado se subclonó en un vector pET27 modificado para que incluya un sitio de clonación independiente de ligasa mediante la amplificación del gen Tencon por PCR. Este producto de PCR se híbrido al vector y se transformó en células BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). Se seleccionaron colonias individuales en 1 mi de cultivos en 96 placas de pocilios profundos (Corning) y se cultivaron a saturación durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se usaron 50 µ?_ del cultivo realizado durante la noche para inocular 1 mi de cultivo fresco. Los cultivos se cultivaron a 37 °C durante 2 horas antes de adicionar IPTG a 1 mM y reducir la temperatura a 30 °C. Las células se cosecharon por centrifugación 16 horas después de la inducción y se lisaron con 100 pL de BugBuster (Novagen). Los lisados resultantes se clarificaron por centrifugación y se usaron para probar la unión a IgG por ELISA.

Se recubrieron placas Maxisorp (Nunc) con 0.1 pg de anticuerpo anti-HIS (Qiagen) durante la noche, se lavaron con TBST y se bloquearon con Starting Block T20 (Thermo Scientific). Se adicionaron lisados clarificados diluidos 1 :4 en Starting Block a las placas y se dejaron ligar durante 1 hora antes del lavado con TBS. Se adicionó IgG biotinilado o HSA biotinilado a una concentración de 1 pg/ml y se lavó con TBST después de 1 hora de incubación. La detección de IgG o HSA ligado se logró mediante la adición de estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch) y la detección con sustrato de quimiluminiscencia POD. Los resultados del ELISA se muestran en la Figura 7. Se secuenciaron los constructos que ligaron IgG biotinilado más de 10 veces sobre HSA biotinilado según se juzgó por señal de ELISA. Después de completar varios experimentos de selección, se obtuvieron 60 secuencias ligantes únicas de la genoteca FG7 y 10 secuencias únicas de la genoteca BC6FG7; la Tabla 4 muestra secuencias representativas de aglutinantes de IgG, en las cuales las ondas B:C y/o F:G se muestran en la medida en que son distintos de los de la SEQ ID NO:16. La Tabla 4 también muestra numerosas mutaciones en otras regiones del supercóntigo.

La proteína Tencon designada, expresada y purificada aquí tiene una estabilidad térmica mejorada por 26 °C con respecto a la del 3.° dominio FN3 de la Tenascina humana, la cual se usó como una molécula de supercóntigo alternativa. Sobre la base de este aumento en la estabilidad, es probable que esta molécula de supercóntigo sea más susceptible a la sustitución de aminoácidos y más fácil de fabricar. Es probable que las mutaciones que disminuyen la estabilidad proteínica se toleren mejor en el contexto de un supercóntigo más estable y, por lo tanto, es probable que un supercóntigo con estabilidad mejorada ofrezca aglutinantes bien plegados y más funcionales a partir de una genoteca de variantes de supercóntigos. Dado que esta proteína novedosa no es una proteína codificada por el genoma humano, también podría proporcionar menos riesgo hacía la generación de una respuesta inmune que el riesgo contra, por ejemplo, Tenascina humana nativa, cuando se usa como un terapéutico (prácticamente, menos riesgo que con un terapéutico basado en el dominio silvestre).

Para los fines de esta invención se determina un 70-100 % de identidad de secuencia de nucleótidos o aminoácidos (es decir, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ó cualquier intervalo o valor en este) mediante un algoritmo de computadora adecuado, como se conoce en la materia.

Quedará claro que la invención puede practicarse de maneras distintas a las descritas particularmente en la presente descripción y los ejemplos. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en vista de las enseñanzas mencionadas anteriormente y, por lo tanto, se encuentran dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

TABLA 1 (1)1 ¿0 ¿(5 30 40 50 60 70 ,80 ,90 1 (1) SPPKDLVVTEVTEETVNLAWDN-EMRVTEYLVVYTPTH—EGGLEMQFRVPGDQTSTIIQELEPGVEYFI VFAILENKKSIPVSARVAT 2 (1) TYLPAPEGLKFKSIKETSVEVE DPLDI FETWEIIFRNMN-KEDEGEITKSLRRPETSYRQTGLAPGQEYEISLHI KNNTRGPGL RVTTT 3 (1) DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKD— PGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLI SRRGDMSSNPAKETFTT A (1) TGLDAPR LRRVSQTDNSITLEWRNGKAAIDSYRIKYAPISGGDHAEVDVPKSQQATTKTTLTGLRPGTEYGIGVSAVKEDKESNPATINAAT 5 (1) DT KDLQVSETAETSLTLLWKTPLAKFDRYRLNYSLPT GQWVGVQLPRNTTSYVLRGLEPGQEYNVLLTAEKGRHKSKPAKSKPAR 6 (1) -QAPELENLTVTEVGWDGLRLNW AADQAYEHFIIQVQEAN—KVEAARNLTVPGSLRAVDIPGLKAATPYTVSIYGVIQGY TPVLSAEAST 7 (1) -ETPNLGEVVVAEVGWDALKLNWTAPEGAYEYFFIQVQEAD—TVEAAQNLTVPGGLRSTDLPGLKAATHYTITIRGVTQDFSTTPLSVEVLT 8 (1) -EVPDMGNLTVTEVSWDALRLNWTTPDGTYDQFTIQVQEAD—QVEEAHNLTVPGSLRS EIPGLRAGTPYTVTLHGEVRGHSTRPLAVEWr 9 (1) -DLPQLGDLAVSEVGWDGLRLNWTAADNAYEHFVIQVQEV —KVEAAQNLTLPGSLRAVDIPGLEAATPYRVSIYGVIRGYRTPVLSAEAST. 10 (1) -KEPEIGNLNVSDITPESFNLSWMATDGIFETFTIEIIDS —RLLETVEYNISGAERTAHISGLPPSTDFIVYLSGLAPSIRTKTISATATT 11 (1) -ALPLLENLTISDINPYGFTVSWMASENAFDSFLVTVVDSG— LLDPQEFTLSGTQRKLELRGLITGIGYEV VSGFTQGHQTKPLRAEIVT 12 (1) -AEPEVDNLLVSDATPDGFRLSWTADEGVFDNFVLKIRDT —KQSEPLEITLLAFERTRDLTGLREATEYEIELYGISKGRRSQTVSAIATT. 13 (1) GSPKEVIFSDITENSATVSWRAPTAQVESFRITYVPITG GTPSMVTVDGTKTQTRLVKLIPGVEYLVSI IAMKGFEESEPVSGSFTT. 14 (1) DGPSGLVTANITDSEALARWQPA1ATVDSYVISYTGEK VPEITRTVSGNTVEYALTDLEPATEYTLRIFAE GPQ SSTITAKFTT TABLA 2 Secuencias de Tencon que muestran ondas (SEQ ID NO: 16) onda A-B onda B-C onda C-D 1-LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEA onda D-E onda E-F onda F-G INLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT-89 TABLA 3. BUCLES DE TENCON Bucle Residuos de SEQ ID NO:16 Secuencia de aminoácidos A-B 13-16 TEDS B-C 22-28 TAPDAAF C-D 38-43 SEKVGE D-E 51-54 GSER E-F 60-64 GLKPG F-G 75-81 KGGHRSN TABLA 4. SUPERCONTIGOS QUE SE UNEN A IGG Bucle B:C Bucle F:G Mutaciones de Clon núm.

Residuos 22-28 (SEQ ID NO) Residuos 75-81 (SEQ ID NO) supercóntigo 1 SYGFNN (21) QIGPIIP (46) 2 TYEGES (22) QIGPIIP (46) 3 TYESES (23) QIGPIIP (46) 4 TNW DS (24) SIRTIDS (47) 5 KSVFIM (25) PKFHSPL (48) 6 YSSYAT (26) WKTTIWF (49) 7 RFHPFP (27) RKNWKTR (50) 8 MMCMPL (28) RLFRIYQ (51) 9 YCRVRD (29) WLSRSYD (52) 10 SYGFNN (21) WLSRSYD (52) 11 DCFMG (30) WLSRSCD (53) 12 TYRFNS (31) WMGPYCD (54) 13 ASRRSL (32) RRRRYSF (55) 14 TIESES (33) HIVPMVP (56) 15 TL'MQS (34) QIEPIIR (57) 16 IYDSES (35) PSAANNP (58) 17 VRLRYVQ (59) 18 QVGPLIP (60) 19 RIGPILP (61) 20 QIGPLLP (62) 21 RIGPLLP (63) 22 QVGPLLP (64) 23 RIGP LP (65) 24 QIGPVLP (66) 25 RIGPVLP (67) 26 QIGPM P (68) 27 QVGPLVP (69) 5 28 QIGP LP (70) R18P 29 QVGPILP (71) 30 QVGPLLP (64) 31 QVGP LP (72) 32 QIGPIVP (73) I33V 33 MIGPLLP (74) 34 QIGPLFP (75) 35 QIGPVLP (66) T59A 10 36 QIGPMVP (76) 37 QIGPIVP (77) 38 RIEPILP (78) V74G 39 VAGSVWP (79) 40 REGATLY (80) 41 KQIPPIL (81) S38G 42 LSLSSVL (82) 43 H LLPLP (83) V74A 44 MIGPLIP (84) 45 TIGPHIP (85) 46 EIGPCLP (86) 47 EIGPVLP (87) 48 KIGPCLP (88) Y35H 49 MIGPVLP (89) 50 QIGPILP (90) S52P 51 QIGPILP (90) Q36R 52 QIGPILP (90) 53 EVGPILP (91) 54 QVGPLLP (92) A23T 55 QIGPVMP (93) 56 QIGPCVP (94) 57 QIGPLVP (95) 58 RGLVMPM (96) V74A 59 IGPILP (97) 60 QIGPILP (90) E37G 61 QIGPILP (90) T68A 62 QIGPILP (90) T22I 63 QIGPILP (90) S52F 64 QIGPILP (90) Y56H 5 65 QIGPILP (90) A44V 66 QIGPILP (90) P24S 67 RIGPILP (61) 68 CIGP VP (98) 69 FIGPVLP (99) 70 HIGPILP (100) 71 HIGPIMP (101) 72 HIGPYLP (102) 10 73 HVGPILP (103) 74 IIGPLLP (104) 75 LIGPLLP (105) 76 MVGPLLP (106) 77 N!GPYLP (107) 78 NIGPYLP (108) 79 QIGPHLP (109) 80 QIGPIIP (46) 82 QIGPILG (110) 83 QIGPILS (111) 83 QIGPILT (112) 84 QIGPI P (113) 85 QIGPIPI (114) 86 QIGPLLN (115) 87 QIGPLLP (62) 88 QIGPVFP (116) 89 QIGPVLS (117) 90 QIGPWLP (118) 92 QVGPILP (71) 93 QVGPILR (118) 94 QVGPIMN (119) 95 QVGPIMP (120) 96 QVGPIVP (121) 97 QVGPLLS (122) 98 QVGPVLP (123) 99 QVGPVLT (124) 100 RIGPIMP (125) 101 RIGPIVP (126) 102 RIGPMFP (127) 103 RIGP IP (128) 104 RIGP VP (129) 105 RIGPVIP (130) 106 RVGPILP (131) 107 RVGPLLP (132) 108 TVGPHIP (133) 109 DRKRFI (36) PSWRSNW (134) 110 EFWRGS (37) QIGPLLP (62) 111 GLLDPL (38) ALRATLE (135) 112 GLVLPE (39) KYGYLTP (136) 113 MASDGL (40) RIGPMLP (137) 114 NKTETN (41) NPFCSRF (138) 115 QAERKV (42) QIGPLLP (62) 116 QAERKV (42) RIGPLLP (63) 117 SQVCTL (43) YYLHQWC (139) 118 YFDKDS (44) QIGPLLP (62) 119 YFECEP (45) HIVPLLR (140)

Claims (38)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un supercóntigo de proteína basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de consenso de un dominio FN3, en donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos 75 % de identidad con la secuencia de consenso de dominio FN3.

2. Un supercóntigo de proteína basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de consenso de los dominios FN3 de tenascina, en donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 16.

3. Un supercóntigo de proteína basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de consenso de un dominio FN3, que comprende 7 hebras y 6 ondas entre las hebras.

4. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque uno o más de las ondas es capaz de ligarse a proteínas celulares y/o moléculas de ácido nucleico.

5. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y forma ondas en o cerca de los residuos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64, y 75-81 de SEQ ID NO:16; las ondas son capaces de ligar un destino que comprende proteínas celulares y/o moléculas de ácido nucleico.

6. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque uno o más de las ondas se altera a fin de que se una al destino.

7. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el supercóntigo de proteína une un destino con al menos una afinidad seleccionada de un KD de al menos 10"9M, al menos 10" 0M, al menos 10"11M y al menos 10" 2M, al menos 10"13M, al menos 10" M y al menos 10"15M, como se determinó por resonancia de plasmones superficiales o por el método Kinexa.

8. Un método para construir una genoteca de un supercóntigo de proteína basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3) derivado de una secuencia de consenso de un dominio FN3; el método comprende las etapas de: proporcionar un polipéptido derivado de una secuencia de consenso de un dominio FN3; e introducir diversidad en copias del polipéptido para formar la genoteca de supercóntigo de proteína.

9. Una genoteca producida mediante el método de la reivindicación 8.

10. Un método para generar un supercóntigo de proteína que se une a un destino específico con una afinidad de unión predefinida; el método comprende poner en contacto la genoteca de la reivindicación 9 con el destino específico y aislar un supercóntigo de proteína que se une al destino específico con la afinidad predeterminada.

1 1. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la etapa de aislamiento comprende aislar moléculas de supercóntigo que se unen a un destino especifico y probar las moléculas de supercóntigo aisladas en busca de afinidad de unión al destino específico.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la etapa de aislamiento comprende cribar la genoteca con el destino específico, identificar las moléculas de supercóntigo que se unen al destino específico y aislar las moléculas de supercóntigo que se unen.

13. El método de la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque la afinidad es menor o igual que aproximadamente 10"7M.

14. Un método para construir una genoteca de un supercóntigo de proteína basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3); el método comprende las etapas de: proporcionar un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16; e introducir diversidad en copias del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 para formar la genoteca de supercóntigo de proteína.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la etapa de introducción de diversidad comprende mutar al menos una región de onda seleccionada del grupo que consiste de residuos en o cerca de las posiciones 13-16, 22-28, 38-43, 51 -54, 60-64, y 75-81 de la SEQ ID NO:16.

16. Una genoteca producida mediante el método de la reivindicación 15.

17. Un método para generar un supercóntigo de proteina que se une a un destino específico con una afinidad de unión predefinida; el método comprende poner en contacto la genoteca de la reivindicación 16 con el destino específico y aislar un supercóntigo de proteína que se une al destino específico con la afinidad predeterminada.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la etapa de aislamiento comprende aislar moléculas de supercóntigo que se unen a un destino específico y probar las moléculas de supercóntigo aisladas en busca de afinidad de unión al destino específico.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la etapa de aislamiento comprende cribar la genoteca con el destino específico, identificar las moléculas de supercóntigo que se unen al destino específico y aislar las moléculas de supercóntigo que se unen.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la afinidad es menor o igual que aproximadamente 10"7M.

21. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el supercóntigo de proteína de la reivindicación 5.

22. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque la molécula comprende la secuencia de nucleótidos que se expone en la SEQ ID NO: 17.

23. Un vector de ácido nucleico aislado que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 21.

24. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende la molécula ácido nucleico aislada de la reivindicación 21.

25. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque la célula huésped es al menos una seleccionada de BL21 Star(DE3) de E. coli, otra célula de E. coli, célula de levadura COS-1 , COS-7, HEK293, BHK21 , CHO, BSC-1 , Hep G2, 653, SP2/0, 293, células HeLa, de mieloma, o linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de éstas.

26. Una composición que comprende el supercóntigo de proteina de la reivindicación 5 y al menos un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos un compuesto o polipéptido seleccionado de un indicador o marcador detectable, un antagonista de TNF, un fármaco antiinfeccioso, un fármaco de sistema cardiovascular (CV), un fármaco de sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés), un fármaco de sistema nervioso autónomo (ANS, por sus siglas en inglés), un fármaco del tracto respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal, un fármaco hormonal, un fármaco para el balance fluido o de electrólitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco inmunomodulador, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un fármaco nutricional, una citocina, y un antagonista de citocina.

28. Un dispositivo médico que comprende el supercóntigo de proteína de la reivindicación 5, en donde el dispositivo es adecuado para contactar o administrar el supercóntigo de proteína mediante al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, ¡ntracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardial, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmíco.

29. Un articulo de fabricación para uso farmacéutico o de diagnóstico humano, que comprende material de envasado y un contenedor que comprende una solución o una forma liofilizada del supercóntigo de proteína de la reivindicación 5.

30. El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el contenedor es un componente de un dispositivo o sistema de suministro parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, ¡ntracapsular, ¡ntracartilaginoso, intracavidad, ¡ntracelial, ¡ntracerebelar, intracerebroventricular, ¡ntracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, ¡ntraperitoneal, intrapleural, ¡ntraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolos, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico.

31. Un supercóntigo de proteina aislado basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de consenso de los dominios FN3 de tenascina, en donde la secuencia de aminoácios tiene al menos 75 % de identidad con cualquiera de una onda B:C o F:G de las SEQ ID NO:21-140 y el supercóntigo de proteína se una a IgG humano.

32. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el supercóntigo comprende 7 hebras y 6 ondas entre las hebras.

33. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una onda B:C o F:G de las SEQ ID NO:21-140, en donde el supercóntigo de proteína forma ondas en o cerca de los residuos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64, y 75-81.

34. Un supercóntigo de proteína basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3); el supercóntigo comprende: una porción de cadena principal con una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 16 en los residuos 1-21 , 29-74, y 82-89; una porción de onda B:C entre los residuos 21 y 29 de la SEQ ID NO:16 con al menos 75 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:21-45; y una porción de onda F:G entre los residuos 74 y 82 de la SEQ ID NO: 16 con al menos 75 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:46-140, en donde el supercóntigo de proteína es capaz de unirse a IgG humano.

35. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 34; caracterizado además porque comprende: una porción de cadena principal con una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 16 en los residuos 1-21 , 29-74, y 82-89; una porción de onda B:C entre los residuos 21 y 29 de la SEQ ID NO:16 que comprende cualquiera de las SEQ ID NO:21-45; y una porción de onda F:G entre los residuos 74 y 82 de la SEQ ID NO:16 que comprende cualquiera de las SEQ ID NO:46-140, en donde el supercóntigo de proteína es capaz de unirse a IgG humano.

36. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el supercóntigo une- un destino con al menos una afinidad seleccionada de un KQ menor o igual que 10"9M, menor o igual que 10" 0M, menor o igual que 10"11 , menor o igual que 10"12M, menor o igual que 10"13M, menor o igual que 10" M y menor o igual que 10"15M, como se determinó por resonancia de plasmones superficiales o por el método Kinexa.

37. El supercóntigo de proteína de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque las ondas forman sitios de unión a IgG.

38. Un supercóntigo de proteína basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de consenso de los dominios FN3 de tenascina, caracterizado porque el supercóntigo de proteína es capaz de unirse a un IgG humano.