EA028304B1 - Способы конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа iii (fn3) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).

Description

Настоящее изобретение относится к белковым каркасам с новыми свойствами, включая возможность связываться с клеточными мишенями, а именно к белковому каркасу, основанному на консенсусной последовательности повтора домена фибронектина типа III (ΡΝ3).

Предпосылки создания изобретения

Способом выбора в ситуациях, когда терапевтический белок должен иметь высокую аффинность и специфичность к молекуле-мишени, являются моноклональные антитела. Однако для биофармацевтической промышленности большой интерес также представляет изготовление не являющихся антителами белков, которые способны связываться с такими мишенями. Такие альтернативные белковые каркасы могут иметь преимущества перед традиционными антителами по причине малого размера, отсутствия двусернистых связей, высокой стабильности и возможности экспрессироваться в прокариотических клетках-хозяевах. Они допускают применение новых способов очистки, с легкостью конъюгируются с лекарственными средствами/токсинами, эффективно проникают в ткани и легко упаковываются в мультиспецифические связывающие вещества (8кетга 2000, Βίηζ аиб Р1иекбшп 2005). Одним из таких альтернативных белковых каркасов является укладка цепи иммуноглобулинов (1д). Эта укладка цепи встречается в переменных участках антител, а также в тысячах белков, не являющихся антителами. Исследования показывают, что один из таких белков 1д, десятый повтор домена фибронектина типа III (ΡΝ3) из человеческого фибронектина, может допускать ряд мутаций в поверхностных петлях, сохраняя при этом общую структуру укладки цепи Ц. Таким образом, в эти петли вставили библиотеки вариантов аминокислот и выбрали специфические связывающие вещества для ряда разных мишеней (Ко1бе е! а1. 1998, Ката!аи е! а1. 2004). Было обнаружено, что созданные подобным образом домены ΡΝ3 связывают мишени с высокой аффинностью, сохраняя при этом важные биофизические свойства (Рагкег е! а1. 2005).

К числу желательных физических свойств, которые должны иметь потенциальные альтернативные молекулы каркаса, относятся высокая термальная стабильность и обратимость термального фолдинга и анфолдинга. Для увеличения эффективной термальной стабильности белков и ферментов применяли несколько способов, включая создание рациональной структуры путем сравнения с близкими по строению термостабильными последовательностями, создание стабилизирующих дисульфидных мостиков, мутации с целью увеличения склонности к формированию α-спиралей, создание солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию и создание консенсусных последовательностей (Ьектаии аиб \Уу55 2001). Высокая термальная стабильность относится к числу желательных свойств таких каркасов, поскольку она может увеличивать выход получаемого рекомбинантного белка, улучшать растворимость очищенной молекулы, повышать активность внутриклеточных каркасов, снижать иммуногенность и сводить к минимуму потребность в холодовой цепи при производстве.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3), способам генерации белкового каркаса и выделенному белковому каркасу.

Настоящее изобретение предоставляет белковый каркас на основе белка с повтором домена фибронектина типа III (ΡΝ3), кодирующие или комплементарные нуклеинозые кислоты, векторы, клеткихозяева, композиции, комбинации, препараты, устройства и способы их получения и применения. В предпочтительном воплощении белковый каркас содержит консенсусную последовательность нескольких доменов ΡΝ3 из человеческого тенасцина-С (в дальнейшем тенасцин). В другом предпочтительном воплощении белковый каркас по настоящему изобретению является консенсусной последовательностью 15 доменов ΡΝ3. Белковые каркасы по изобретению могут быть предназначены для связывания различных молекул, например, клеточного белка-мишени.

Белковые каркасы по изобретению могут включать дополнительные молекулы или части, например участок Рс антитела, альбуминсвязывающий домен либо другую часть, влияющую на период полувыведения. В других воплощениях белковые каркасы по изобретению могут связываться с молекулой нуклеиновой кислоты, которая может кодировать белковый каркас.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу экспрессии по меньшей мере одного белкового каркаса на основе консенсусной последовательности нескольких доменов ΡΝ3 в клетке-хозяине, включающему культивирование клетки-хозяина, как описано в настоящем документе, в условиях, которые позволяют экспрессировать по меньшей мере один белковый каркас в количествах, допускающих детекцию и/или восстановление.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, содержащей а) белковый каркас на основе консенсусной последовательности нескольких доменов ΡΝ3 и/или кодирующую нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем документе; и Ь) подходящий и/или фармацевтически приемлемый носитель либо разбавитель.

Настоящее изобретение также относится к способу генерации библиотек белкового каркаса на основе белка с повтором домена фибронектина типа III (ΡΝ3), предпочтительно консенсусной последовательности нескольких доменов ΡΝ3 и наиболее предпочтительно консенсусной последовательности нескольких доменов ΡΝ3 из человеческого тенасцина. Библиотека формируется путем создания последова- 1 028304 тельных генераций каркасов за счет изменения (мутации) аминокислот или количества аминокислот в молекулах в отдельных позициях в частях каркаса, например участках петель. Библиотеки могут быть получены путем изменения аминокислотной композиции одной петли или одновременного изменения нескольких петель либо дополнительных позиций молекулы каркаса. Изменяемые петли могут быть соответствующим образом удлинены или сокращены. Возможна генерация подобных библиотек таким образом, чтобы они содержали все возможные аминокислоты в каждой позиции или особое подмножество аминокислот. Элементы библиотеки могут быть использованы для скрининга с помощью дисплея, например дисплея ίη νίίτο (ДНК, РНК, рибосомного и т.д.), дрожжевого, бактериального и фагового.

Белковые каркасы по настоящему изобретению имеют улучшенные биофизические свойства, например стабильность в условиях восстановления и растворимость при высоких концентрациях; они могут быть экспрессированы и фолдированы в прокариотических системах, например Е. сой, в зукариотических системах, например дрожжах, и в системах транскрипции/трансляции ίη νίίτο, например лизате ретикулоцитов кролика.

Дополнительно настоящее изобретение предоставляет способ генерации молекулы каркаса, способной связываться со специфической мишенью, заключающийся в пэннинге библиотеки каркаса по изобретению относительно мишени и затем детекции связывающих веществ. Помимо этого изобретение включает способы скрининга, которые могут быть использованы для генерации или аффинного созревания белковых каркасов с требуемой активностью, например способных связываться с белкамимишенями с определенной аффинностью. Аффинное созревание может достигаться многократными процедурами мутагенеза и селекции с помощью таких систем, как фаговый дисплей или дисплей ίη νίίτο. Мутагенез в ходе этого процесса может являться результатом сайт-направленного мутагенеза к специфическим остаткам каркаса, случайным мутагенезом из-за ошибок в ПЦР либо перестановки в ДНК и/или комбинации этих способов. Настоящее изобретение также относится к любым изобретениям, описанным в настоящем документе.

Описание фигур

Фиг. 1. Анализ методом 8Ό8-ΡΑΟΕ очищенного Тепсоп с помощью бис-трис-геля ΝηΡΆΟΕ 4-12% (Ιηνίίτο^βη) и окрашивание Кумасси синим. N означает нативные условия, К - условия восстановления.

Фиг. 2. Анализ Теηсοη в ΡΒ8 методом спектроскопии кругового дихроизма.

Фиг. 3. Анализ 3-го домена ΡΝ3 из тенасцина и Теηсοη в ΡΒ8 методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Были получены температуры плавления 54 и 78°С соответственно.

Фиг. 4. Фагмидный плазмидный вектор ρТеηсοη-ρIX. Экспрессию стимулируют промотор Ьас и секреция посредством сигнальной последовательности ОтрА.

Фиг. 5. Дисплей Мус-Теηсοη на фаге М13. Результаты ИФА, показывающие связывание фага с покрытыми α-Мус и 0ΝΤΟ95 лунками, а также непокрытыми лунками.

Фиг. 6. Структура петель 3-го домена ΡΝ3 из человеческого тенасцина.

Фиг. 7. Скрининг результатов селекции 1§С методом ИФА. В качестве контроля отдельные клоны протестировали на связывание с биотинилированным 1§С или биотинилированным Н8А.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3), полученного из консенсусной последовательности домена ΡΝ3, включающий стадии:

получения полипептида из консенсусной последовательности домена ΡΝ3, имеющего по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0:16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 16, для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3).

Настоящее изобретение относится к способу конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3), включающий стадии получения полипептида, имеющего последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей аминокислотную последовательности 8ЕЦ ГО N0:16 для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3).

Настоящее изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетическим белковым каркасам на основе консенсусной последовательности белка с повтором домена фибронектина типа III (ΡΝ3), в частности каркасам, полученным из млекопитающих, а также композициям и кодирующим молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий белковый каркас на основе консенсусной последовательности ΡΝ3. Настоящее изобретение также относится среди прочего к способам изготовления и использования таких нуклеиновых кислот и белковых каркасов, в том числе к диагностическим и терапевтическим композициям, способам и устройствам.

- 2 028304

Белковые каркасы по настоящему изобретению имеют преимущества перед традиционными способами лечения, например возможность местного введения, перорального приема и преодоления гематоэнцефалического барьера, возможность экспрессии в Е. Сой. при которой экспрессия белка увеличивается в зависимости от ресурсов (в отличие от экспрессии в клетках млекопитающего), возможность создания биспецифических молекул, связывающихся с несколькими мишенями или несколькими антигенными детерминантами одной мишени, возможность конъюгирования для получения лекарственного средства, полимеров и проб, возможность создания препаратов с высокими концентрациями и способность таких молекул эффективно проникать в пораженные ткани и опухоли.

Кроме того, белковые каркасы обладают многими свойствами антител с точки зрения укладки, которая имитирует переменный участок антитела. Эта ориентация позволяет делать петли ΡΝ3 поверхностными по аналогии с гипервариабельными участками (СОК) антител. Предполагается, что они смогут связываться с клеточными мишенями и петли можно будет изменять, например подвергать аффинному созреванию, для улучшения некоторых свойств связывания и т.п.

Три из шести петель белкового каркаса по изобретению топологически соответствуют гипервариабельным участкам (СОК 1-3) антитела, т.е. участкам, связывающим антигены, а оставшиеся три петли являются поверхностными по аналогии с участками СОК антител. Эти петли образуются у или возле остатков 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81 в §ЕЦ ГО N0: 16, как показано в табл.3 ниже и на фиг. 6. Для получения специфичности связывания и аффинности предпочтительно связываются участки петель у или возле остатков 22-28, 51-54 и 75-81. Один или несколько этих участков петель перемешиваются случайным образом с другими участками петель и/или другими цепями с сохранением их последовательности в качестве остовных частей библиотеки, при этом из библиотеки могут быть выбраны высокоактивные связывающие вещества с высокой аффинностью к конкретному белку-мишени. Один или несколько участков петель могут взаимодействовать с белком-мишенью по аналогии с тем, как участок СГОР антитела взаимодействует с белком.

Каркасы по настоящему изобретению могут включать другие субъединицы, например, через ковалентное взаимодействие. Постоянный участок антитела может быть полностью или частично связан с каркасом для придания последнему свойств, характерных для антитела, например комплементарной активности (ЛОСС), периода полувыведения и т.д. К примеру можно обеспечивать и/или контролировать эффекторную функцию, изменяя связывание С1с| и/или связывание РсуК, в результате чего изменяется активность СГОС и/или активность ЛОСС. Эффекторные функции отвечают за активацию или уменьшение биологической активности (например, у испытуемого). К эффекторным функциям относятся, в частности, связывание С1ц; комплементзависимая цитотоксичность (СГОС); связывание рецептора Рс; антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ЛОСС); фагоцитоз; супрессирующий эффект на рецепторы клеточной поверхности (например, рецептор клеток В (ВСК)) и т.д. Такие эффекторные функции могут потребовать связывания участка Рс со связывающим доменом (петлями белкового каркаса и т.д.) и могут быть оценены с помощью различных способов анализа (например, анализа связывания Рс, анализа ЛОСС, анализа СОС и т.д.).

Кроме того, для получения требуемых свойств к молекуле каркаса могут быть присоединены молекулы конъюгата токсина, альбумина или связывающего альбумин вещества, полиэтиленгликоля (РЕО). Любые из этих соединений могут быть получены стандартными способами, например путем экспрессии рекомбинантного белка из рекомбинантного гибридного гена, сконструированного из общедоступных последовательностей генов.

Каркасы по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими в мономерной форме и биили мультиспецифическими (для разных белков-мишеней или антигенных детерминант одного белкамишени) в многомерной форме. Присоединения могут быть ковалентными или нековалентными. Например, двумерный биспецифический каркас имеет одну субъединицу со специфичностью к первому белкумишени или первой антигенной детерминанте и вторую субъединицу со специфичностью ко второму белку-мишени или второй антигенной детерминанте. Субъединицы каркаса могут соединяться в разные структуры, тем самым увеличивается валентность и, как следствие, авидность связывания антигенов.

В настоящем документе термин антитело означает любую белок- или пептидсодержащую молекулу, которая состоит по меньшей мере из части молекулы иммуноглобулина, в частности по меньшей мере из одного гипервариабельного участка (СОК) тяжелой или легкой цепи либо его лигандсвязующей части, переменного участка тяжелой или легкой цепи, постоянного участка тяжелой или легкой цепи, каркасного участка или их части. В некоторых случаях такое антитело воздействует на специфический лиганд, в частности может модулировать, снижать, увеличивать, не допускать, предотвращать, уменьшать, смягчать, блокировать, ингибировать, уничтожать и/или нарушать по меньшей мере одну активность или связь либо активность или связь рецептора ίη νίίτο, ίη Ши и/или ίη νίνο.

Дополнительно термин антитело означает антитела, продукты расщепления, указанные части и их варианты, в частности миметики антител или составные части антител, имитирующие структуру и/или функцию антитела или его указанного фрагмента либо части, в том числе одноцепочечные антитела, однодоменные антитела и их фрагменты. Функциональные фрагменты включают антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с конкретной мишенью. Например, в изобретение включены фрагмен- 3 028304 ты антител, способные связываться с определенной мишенью, или их части, в частности фрагменты РаЬ (например, в результате расщепления папаином), РаЬ' (например, в результате расщепления пепсином и частичного восстановления) и Р(аЬ')₂ (например, в результате расщепления пепсином), ГаеЬ (например, в результате расщепления плазмином), рРс' (например, в результате расщепления пепсином или плазмином), Рб (например, в результате расщепления пепсином, частичного восстановления и реагрегации), Ρν или 5сРу (например, с помощью методов молекулярной биологии) (см., например, СоШдаи, 1ттипо1оду, 8ирга).

Такие фрагменты могут быть получены путем ферментативного расщепления, методами синтеза или рекомбинации, известными из уровня техники и/или описанными в настоящем документе. Антитела также могут быть получены в различных усеченных формах с использованием генов антител, в которых один или несколько стоп-кодонов добавлены выше естественного сайта терминации.

Например, возможно создание комбинационного гена, кодирующего часть тяжелой цепи Р(аЬ')₂, содержащего последовательности ДНК, кодирующие домен СН1 и/или шарнирный участок тяжелой цепи. Различные части антител могут быть соединены химическим способом с использованием традиционных способов или получены в виде единого белка с использованием методов генной инженерии.

Белковый каркас по настоящему изобретению может быть использован с целью измерить, вызвать в клетке, ткани, органе или животном (включая млекопитающих и человека), диагностировать, мониторировать, модулировать, вылечить, смягчить, предотвратить или снизить симптомы по меньшей мере одного заболевания или состояния, в частности по меньшей мере одного заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из иммунного нарушения или заболевания, сердечно-сосудистого нарушения или заболевания, инфекции, злокачественного заболевания и/или неврологического нарушения или заболевания, а также других известных или указанных связанных состояний.

Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, которым требуется такого рода модулирование, лечение, смягчение, предотвращение или сокращение симптомов, эффектов либо механизмов. Эффективное количество - это количество от 0,001 до 500 мг/кг за одно (болюсное и т.д.) многократное или постоянное введение либо количество, необходимое для достижения концентрации в сыворотке 0,01-5000 мг/мл за одно многократное или постоянное введение, либо любой эффективный диапазон или значение из него, применяемые и определенные с помощью известных способов, описанных в настоящем документе или известных из уровня техники.

Белковый каркас по настоящему изобретению - изготовление и генерация.

По меньшей мере один белковый каркас по настоящему изобретению может быть в некоторых случаях получен с помощью линии клеток, смешанной линии клеток, иммортализованной клетки или клональной популяции иммортализованных клеток, хорошо известных из уровня техники (см., например, Аи8иЬе1, с1 а1., еб., СиггсШ РгоЮсой ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ίοΐιη \УПсу & §оп8, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1987-2001); 8атЬтоок, е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ (1989); Наг1о\у апб Ьапе, АпйЬоб1е8, а БаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдап, е1 а1., еб8., СиттеШ РгоЮсой ίη 1ттипо1оду, 1оЬп \УПеу & §оп8, 1пс., ΝΥ (1994-2001); СоШдап е! а1., СиггеШ РгоЮсой ίη Рго1еш Бшепсе, 1оЬп \УПеу & §оп8, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2001).

Аминокислоты белкового каркаса могут быть изменены, добавлены и/или удалены для снижения иммуногенности или сокращения, улучшения либо изменения связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, периода полувыведения, стабильности, растворимости или другого соответствующего свойства, известного из уровня техники.

В некоторых случаях могут изготавливаться белковые каркасы с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в некоторых случаях белковые каркасы могут быть получены путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных искусственных продуктов с помощью трехмерных моделей родительских и искусственных последовательностей. Трехмерные модели широкодоступны и известны специалистам в данной области техники. Существуют компьютерные программы, иллюстрирующие и показывающие вероятные трехмерные конформационные структуры отобранных последовательностей-кандидатов и способные измерять потенциальную иммуногеничность (например, программа 1ттипой11ег разработки Хепсог, 1пс., Монровия, Калифорния). Изучение таких иллюстраций позволяет проанализировать предполагаемую роль остатков в функционировании последовательности-кандидата, например остатков, влияющих на способность белкового каркаса-кандидата связывать его антиген. Таким образом, возможны селекция и комбинирование остатков из родительской и референсной последовательностей с целью получения требуемого свойства, например аффинности к антигенам-мишеням. Помимо вышеуказанных процедур или в дополнение к ним могут быть использованы другие подходящие способы инженерии.

Скрининг.

Скрининг белкового каркаса на предмет специфического связывания схожих белков или фрагментов без труда осуществляется с помощью библиотек дисплеев нуклеотидов (дисплея ДНК или РНК) или пептидов, например дисплея ίη νίϋΌ. Этот способ включает скрининг больших количеств пептидов на

- 4 028304 предмет отдельных пептидов, имеющих требуемую функцию или структуру. Последовательности нуклеотидов или пептидов в дисплее могут содержать от 3 до 5000 и более нуклеотидов или аминокислот в длину, часто от 5 до 100 аминокислот в длину и периодически от 8 до 25 аминокислот в длину. Помимо способов прямого химического синтеза из уровня техники известны несколько способов рекомбинантных ДНК для генерации библиотек пептидов. Один из таких способов предусматривает дисплей последовательности пептидов на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или каждая клетка содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую отдельно взятую видимую последовательность пептидов. Такие способы описаны в патентных публикациях РСТ № 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278.

Другие системы для генерации библиотек пептидов применяют как методы химического синтеза ίη νίίτο, так и рекомбинантные методы (см. патентные публикации РСТ № 92/05258, 92/14843 и 96/19256, см. также патенты США №№ 5658754 и 5643768). В продаже имеются библиотеки пептидных дисплеев, векторы и комплекты для скрининга таких производителей, как ПцЦгодеп (Карлсбад, Калифорния) и СатЬпбде АпОЬобу Тсс1то1ощс5 (Кембриджшир, Великобритания) (см., например, патенты США №№ 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, полученные Εηζοη; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, полученные Иуах, 5427908, 5580717, полученные АГГутах; 5885793, полученные СатЬпбде АпОЬобу ТесйпоШщех; 5750373, полученные СспсШссй. 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, полученные Хота, СоШдап, 8ирга; Аи8иЬе1, 8ирга; или §атЬтоок, 8ирта.

Белковые каркасы по изобретению могут связывать белки человека или других млекопитающих с разной степенью аффинности (К_с). В предпочтительном воплощении по меньшей мере один белковый каркас по настоящему изобретению может в некоторых случаях связываться с белком-мишенью с высокой аффинностью, например с К_с, равным или менее чем приблизительно 10^-7 М, в частности 0,1-9,9 (либо любой диапазон или значение из него) X 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13, 10^-14, 10^-15 либо любой диапазон или значение из него, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса или методом, используемыми специалистами в данной области техники.

Аффинность или авидность белковых каркасов к антигену может быть определена экспериментальным путем с помощью любого подходящего способа (см., например, ВегаоГкку, еί а1., АпбЬобу-Апбдеп 1Пегасйоп8, в Еиηбатеηίа1 1ттипо1оду, Раи1 А.Е., Еб., Ра\'еп Рге88: №ν Уогк, ΝΥ (1984); КиЬу, 1аш8 1ттипо1оду, А.Н. Ргеетап апб Сотрапу: №ν Υο^к, ΝΥ (1992); и описанные в настоящем документе способы.). Измеренная аффинность отдельно взятого комплекса белковый каркас-антиген может меняться в зависимости от условий измерения (концентрации соли, рН и т.д.). Следовательно, измерения аффинности и других параметров связывания антигена (К_с, К_оп, К_оГГ и т.д.) предпочтительно производить с использованием стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена и стандартизированного буфера, например, описанного в настоящем документе.

Возможно проведение анализа конкурентного связывания белкового каркаса по настоящему изобретению с целью определить, какие белки, антитела и другие антагонисты конкурируют за связывание белка-мишени с белковым каркасом по настоящему изобретению и/или совместно используют участок антигенной детерминанты. Эти анализы, хорошо известные средним специалистам в данной области техники, предназначены для оценки конкуренции между антагонистами или лигандами за ограниченное количество сайтов связывания у белка. Белок и/или антитела нейтрализуют или переводят в нерастворимую форму до или после конкурентного анализа, и пробу, связавшуюся с белком-мишенью, отделяют от несвязавшейся пробы, например, путем переливания (если белок/антитело предварительно перевели в нерастворимую форму) или центрифугирования (если белок/антитело осадили после реакции конкурентного анализа). Кроме того, конкурентное связывание можно определить по тому, изменена ли функция в результате связывания или несвязывания белкового каркаса с белком-мишенью: например, молекула белкового каркаса может ингибировать или стимулировать ферментативную активность, к примеру, метки. Возможно использование ИФА и других функциональных анализов, хорошо известных из уровня техники.

Молекулы нуклеиновых кислот.

Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, кодирующие белковый каркас, могут иметь форму РНК, например мРНК, гяРНК, тРНК или любую другую форму, либо форму ДНК, в частности кДНК и геномной ДНК, полученной путем клонирования, синтеза или любой комбинации этих способов. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной и одноцепочечной либо комбинированной. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может быть кодирующей цепью, также называемой смысловой цепью, или некодирующей цепью, также называемой антисмысловой цепью.

Выделенные молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут включать молекулы нуклеиновых кислот, содержащие открытую рамку считывания (ОКЕ), в некоторых случаях с одним или несколькими интронами, в частности по меньшей мере одну указанную часть по меньшей мере одного белкового каркаса; молекулы нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность для белкового каркаса или участок петли, который связывается с белком-мишенью; и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность нуклеотидов, существенно отличающуюся от вышеописан- 5 028304 ных, но из-за дегенерации генетического кода по-прежнему кодирующую белковый каркас, как описано в настоящем документе и/или известно из уровня техники. Очевидно генетический код хорошо известен из уровня техники. Следовательно, специалист в данной области техники без труда может получить такие дегенерировавшие варианты нуклеиновой кислоты, которые кодируют специфические белковые каркасы по настоящему изобретению (см., например, ЛикиЬе1, с1 а1., кирга), такие варианты нуклеиновой кислоты относятся к настоящему изобретению.

Как указано в настоящем документе, молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, которые составляют нуклеиновую кислоту, кодирующую белковый каркас, могут включать, в частности, следующее: молекула, кодирующая последовательность аминокислот одного фрагмента белкового каркаса; кодирующая последовательность всего белкового каркаса или его части; кодирующая последовательность белкового каркаса, фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, например кодирующая последовательность по меньшей мере одного сигнального пептида или слитого пептида с вышеуказанными дополнительными кодирующими последовательностями или без них, например по меньшей мере один интрон совместно с дополнительными некодирующими последовательностями, в частности некодирующими 5'- и З'-концевыми последовательностями, например транскрибированными не подвергшимися трансляции последовательностями, которые играют роль в транскрипции, обработке мРНК, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например, связывание рибосом и стабильность мРНК); дополнительная кодирующая последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, например, обеспечивающие дополнительные функции. Таким образом, последовательность, кодирующая белковый каркас, может быть соединена с маркирующей последовательностью, например последовательностью, кодирующей пептид, который способствует очищению слитого белкового каркаса, содержащего фрагмент или часть белкового каркаса.

Селективная гибридизация полинуклеотидов в описанный здесь полинуклеотид.

Настоящее изобретение включает выделенные нуклеиновые кислоты, которые в описанных здесь условиях селективной гибридизации образуют описанный здесь полинуклеотид. Таким образом, полинуклеотиды по этому воплощению могут быть использованы для выделения, детекции и/или подсчета нуклеиновых кислот, составляющих подобного рода полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации, выделения или амплификации частичных либо полноразмерных клонов в подготовленной библиотеке. В некоторых воплощениях полинуклеотиды являются последовательностями геномной ДНК или кДНК, выделенными или иным образом комплементарными относительно кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.

Библиотека кДНК предпочтительно содержит по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полноразмерных последовательностей и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеки кДНК могут быть нормализованы с целью увеличения количества редких последовательностей. Для последовательностей, мало идентичных комплементарным последовательностям, обычно, но не исключительно гибридизацию осуществляют в условиях низкой или умеренной жесткости. Для последовательностей с большей идентичностью в некоторых случаях применяют условия средней и высокой жесткости. Условия низкой жесткости допускают селективную гибридизацию последовательностей с уровнем идентичности приблизительно 70% и могут быть использованы для идентификации ортологических или паралогических последовательностей.

В некоторых случаях полинуклеотиды по настоящему изобретению кодируют по меньшей мере часть белкового каркаса, кодируемого описанными здесь полинуклеотидами. Полинуклеотиды по настоящему изобретению включают последовательности нуклеиновых кислот, которые могут использоваться для селективной гибридизации в полинуклеотид, кодирующий белковый каркас по настоящему изобретению (см., например, ЛикиЬе1, кирга; СоШдаи, кирга), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.

Конструирование нуклеиновых кислот.

Выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть получены с помощью а) рекомбинантных способов, Ь) способов синтеза, с) способов очистки и/или ά) их комбинаций, хорошо известных из уровня техники.

Нуклеиновые кислоты могут быть без труда дополнены последовательностями, помимо полинуклеотида по настоящему изобретению. Например, в нуклеиновую кислоту можно вставить сайт множественного клонирования, содержащий один или несколько сайтов рестрикции эндонуклеазы, чтобы способствовать выделению полинуклеотида. Кроме того, могут быть вставлены транслируемые последовательности, чтобы способствовать выделению транслированного полинуклеотида по настоящему изобретению. К примеру удобным способом очистки белков по настоящему изобретению является гексагистидин-маркирующая последовательность. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, за исключением кодирующей последовательности, может в некоторых случаях являться вектором, адаптером или линкером для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению.

В подобные клонирующие и/или экспрессирующие последовательности могут быть добавлены до- 6 028304 полнительные последовательности, чтобы оптимизировать их функционирование при клонировании и/или экспрессии, способствовать выделению полинуклеотида или улучшить проникновение полинуклеотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессирующих векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно из уровня техники (см., например, АикиЬе1, кирга или §атЬгоок, кирга).

Рекомбинантные способы конструирования нуклеиновых кислот.

Выделенные композиции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например РНК, кДНК, геномная ДНК или их комбинация, могут быть получены из биологических источников с помощью любого количества способов клонирования, известных специалистам в данной области техники. В некоторых воплощениях пробы олигонуклеотидов, в результате селективной гибридизации в жестких условиях образующие полинуклеотиды по настоящему изобретению, используются для идентификации требуемой последовательности в библиотеке кДНК или геномной ДНК. Выделенные РНК и конструирование библиотек кДНК и геномной ДНК хорошо известны средним специалистам в данной области техники (см., например, АикиЬе1, кирга или §атЬгоок, кирга).

Способы скрининга и выделения нуклеиновых кислот.

Библиотека кДНК или геномной ДНК может быть подвергнута скринингу с помощью пробы, основанной на последовательности полинуклеотида по настоящему изобретению, например, описанного здесь. Пробы могут быть использованы для гибридизации с последовательностями геномной ДНК или кДНК для выделения гомологичных генов в одинаковых либо разных организмах. Специалистам в данной области техники будет ясно, что при анализе можно варьировать жесткость условий гибридизации, при этом жесткие условия могут иметь как гибридизационная, так и промывочная среда. Чем жестче условия гибридизации, тем выше должна быть комплементарность между пробой и мишенью, чтобы мог образоваться дуплекс. Жесткость условий можно контролировать одним или несколькими из следующих параметров: температура, ионная сила, рН и присутствие частично денатурирующего разбавителя, например формамида. К примеру жесткость условий гибридизации удобно регулировать путем изменения полярности реагирующего раствора, например через подбор концентрации формамида в диапазоне от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичности последовательностей), необходимая для детекции связывания, зависит от жесткости условий гибридизационной и/или промывочной среды. Оптимальной является степень комплементарности, равная 100, 70-100% либо любой диапазон или значение из него. Однако следует понимать, что незначительные изменения последовательности в пробах и праймерах могут быть компенсированы за счет снижения жесткости гибридизационной и/или промывочной среды.

Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны из уровня техники и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без лишних экспериментов и на основании представленных здесь инструкций и рекомендаций.

К известным способам амплификации РНК или ДНК относятся, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и соответствующие процессы амплификации (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 авторства МиШк, е! а1.; 4795699 и 4921794 авторства ТаЬог, е! а1; 5142033 авторства Пиик; 5122464 авторства ХУНкои, е! а1.; 5091310 авторства !ηηίκ; 5066584 авторства Оу11еик!еи, е! а1.; 4889818 авторства Се1£аиб, е! а1.; 4994370 авторства §Пуег, е! а1.; 4766067 авторства Βίκ\νηκ; 4656134 авторства Ктдо1б) и РНК-опосредованная амплификация, применяющая антисмысловую РНК к целевой последовательности в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238 авторства Ма1ек, е! а1., торговое наименование: ΝΆ8ΒΆ); каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки (см., например, ЛикиЬе1, кирга или §атЬгоок, кирга).

К примеру метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) может быть использован для амплификации последовательностей полинуклеотидов по настоящему изобретению и связанных генов напрямую из библиотек геномной ДНК или кДНК. ПЦР и другие способы амплификации ш уйго могут быть также полезны, например, для клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки, которые требуется экспрессировать, чтобы получить пробы нуклеиновых кислот для детекции присутствия требуемой мРНК в пробах, секвенирования нуклеиновых кислот или иных целей. Примеры способов, на основании которых специалист в данной области техники может уяснить способы амплификации ш уйго, приведены в Вегдег, кирга, 8атЬгоок, кирга, и АикиЬе1, кирга, а также в МиШк, е! а1., патент США № 4683202 (1987); и йипк, е! а1., РСК Рго!осо1к А Ошбе !о МеШобк аиб Аррйсайоик, Ебк., Асабетк Ргекк Пис., 8аи О|едо, СА (1990). Имеющиеся в продаже наборы для ПЦР-амплификации геномной последовательности известны из уровня техники (см., например, набор Абуайаде-ОС Оеиоппс РСК (С1ои!есй)). Кроме того, возможно использование, например, белка Т4 деие 32 рго!еш (ВоеЬгтдег Маиийеш) для увеличения количества продуктов при ПЦР длинных фрагментов.

Синтетические способы конструирования нуклеиновых кислот.

Выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть также получены прямым химическим синтезом с помощью известных способов (см., например, АикиЬе1, е! а1., кирга). Химический синтез обычно позволяет получить одноцепочечный олигонуклеотид, который может быть трансформирован в двухцепочечную ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или полимеризации с использованием ДНК-полимеразы и одиночной цепи в качестве матрицы. Специалистам в данной области техники известно, что химический синтез ДНК может быть ограничен последо- 7 028304 вательностями длиной в 100 или более оснований, однако короткие последовательности можно лигировать, тем самым получив более длинные последовательности.

Рекомбинантные экспрессирующие кассеты.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например последовательность кДНК или геномной ДНК, кодирующая белковый каркас по настоящему изобретению, может быть задействована для конструирования рекомбинантной экспрессирующей кассеты, которая может быть введена по меньшей мере в одну требуемую клеткухозяина. Рекомбинантная экспрессирующая кассета, как правило, содержит полинуклеотид по настоящему изобретению, функционально связанный с транскрипционными инициационными регуляторными последовательностями, которые направляют транскрипцию полинуклеотида в требуемой клетке-хозяине. Для направления экспрессии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут применяться как гетерологичные, так и негетерологичные (т.е. эндогенные) промоторы.

В некоторых осуществлениях выделенные нуклеиновые кислоты, выступающие промотором, энхансером или другим элементом, могут быть введены в соответствующей позиции (выше, ниже или в интроне) негетерологичной формы полинуклеотида по настоящему изобретению, чтобы увеличить или сократить экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению. Например, эндогенные промоторы могут быть изменены ίη νίνο или ίη νίίτο в результате мутации, делеции и/или замены.

Векторы и клетки-хозяева.

Настоящее изобретение также относится к векторам, которые содержат выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, клетки-хозяева, полученные путем генной инженерии при помощи рекомбинантных векторов, и изготовлению по меньшей мере одного белкового каркаса с помощью рекомбинантных способов, хорошо известных из уровня техники (см., например, 8ашЬтоок, с1 а1., кирга; АикиЬе1, с1 а1., кирга), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.

Полинуклеотиды могут быть в некоторых случаях вставлены в вектор, содержащий селектируемый маркер, с целью размножения в клетке-хозяине. Как правило, плазмидный вектор вводят в осадок, например осадок фосфата кальция, или в комплекс с заряженным липидом. Если в качестве вектора используется вирус, то он может быть упакован ίη νίίτο с помощью соответствующей пакующей линии клеток и затем введен в клетки-хозяева.

Вставку ДНК необходимо функционально связать с соответствующим промотором. Экспрессионные конструкции также содержат сайты для инициации транскрипции, терминирования, а в транскрибированном участке - сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемая конструкциями, предпочтительно содержит трансляцию, инициированную в начале, и стоп-кодон (ИЛЛ, ИОЛ или ИЛС и т.д.), соответствующим образом расположенные в конце транслируемой мРНК, причем для экспрессии клеток млекопитающих или эукариотических клеток предпочтительны ИЛЛ и ИЛО.

Экспрессионные векторы предпочтительно, но необязательно содержат по меньшей мере один селектируемый маркер. К подобным маркерам, в частности, относятся метотрексат (МТХ), дигидрофолатредуктаза (ΌΗΡΚ, патенты США №№ 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017, ампициллин, неомицин (О418), микофенолокислота или гены устойчивости к глутаминсинтетазе (О8, патенты США №№ 5122464; 5770359; 5827739) для эукариотических клеточных культур и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования в Е. соН и других бактериях или прокариотических средах (вышеуказанные патенты полностью включены в текст настоящего документа путем ссылки). Соответствующие питательные среды и условия для вышеуказанных клеток-хозяев известны из уровня техники. Подходящие для этих целей векторы известны специалистам в данной области техники. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина может осуществляться путем кальций-фосфатной трансфекции, ΌΕΆΕ-декстран-опосредованной трансфекции, трансфекции, опосредованной катионными липидами, электропорации, трансдукции, инфекции или других известных способов. Такие способы известны из уровня техники, например, описаны у §ашЬтоок, кирга, главы 1-4 и 16-18; АикиЬе1, кирга, главы 1, 9, 13, 15, 16.

По меньшей мере один белковый каркас по настоящему изобретению может быть экспрессирован в измененном виде, например в виде рекомбинантного белка, и может содержать не только сигналы секреции, но и дополнительные гетерологичные функциональные участки. Например, в Ν-конце белкового каркаса может быть добавлен участок дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, для повышения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине в процессе очистки или последующих процедур обработки и хранения. Кроме того, в белковый каркас по настоящему изобретению могут быть добавлены пептидные части для улучшения очистки. Такие участки могут быть удалены перед окончательной подготовкой белкового каркаса или по меньшей мере его одного фрагмента. Такие способы описаны в многочисленных стандартных лабораторных руководствах, например 8ашЬтоок, кирга, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; АикиЬе1, кирга, главы 16, 17 и 18.

Средним специалистам в данной области техники известны многочисленные экспрессионные сис- 8 028304 темы, позволяющие экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению. Кроме того, нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в клетке-хозяине путем манипуляций в клетке-хозяине, которая содержит эндогенную ДНК, кодирующую белковый каркас по настоящему изобретению. Такие способы хорошо известны из уровня техники, например описаны в патентах США №№ 5580734, 5641670, 5733746 и 5733761, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.

Примерами клеточных культур, подходящих для получения белковых каркасов, указанных частей или их вариантов, являются бактериальные, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих, известные из уровня техники. Системы клеток млекопитающих часто используются в виде монослоев клеток, однако также могут быть использованы суспензии или биореакторы клеток млекопитающих. Из уровня техники известны несколько подходящих линий клеток-хозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки, в частности линии клеток СО8-1 (например, АТСС СКЬ 1650), СО8-7 (например, АТСС СКЬ-1651), НЕК293, ВНК21 (например, АТСС СКЬ-10), СНО (например, АТСС СКЬ 1610) и В8С-1 (например, АТСС СКЬ-26), клетки Со8-7, клетки СНО, клетки Ьер С2, клетки Р3Х63Ад8.653, 8Р2/0-Ад14, 293, клетки НеЬа и т.п., например, производства Атепсап Туре СиНиге СоИесНои, Манассас, Вирджиния (\у\у\у.а1сс.огд). К предпочтительным клеткам-хозяевам относятся клетки лимфоидного происхождения, например миеломные и лимфомные. Наиболее предпочтительны клетки-хозяева Р3Х63Ад8.653 (входящий номер АТСС СКЬ-1580) и клетки 8Р2/0-Ад14 (входящий номер АТСС СКЬ1851). В наиболее предпочтительном воплощении в качестве рекомбинантной клетки используется клетка Р3Х63АЬ8.653 или 8Р2/0-Ад14.

Экспрессионные векторы для таких клеток могут содержать, в частности, одну или несколько следующих последовательностей контроля экспрессии: точка начала репликации; промотор (например, поздние или ранние промоторы 8У40, промотор СМУ (патенты США №№ 5168062; 5385839), промотор Н8У 1к, промотор рдк (фосфоглицераткиназа), промотор ЕР-1 а1рЬа (патент США №5266491), по меньшей мере один промотор человека; энхансер и/или сайты обработки информации, например сайты связывания рибосомы, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования (например, сайт добавления 8У40 1агде Т Ад ро1у А) и транскрипционные терминирующие последовательности (см., например, Аи8иЬе1 е! а1., зирга; 8атЬгоок, е! а1., зирга). Для получения нуклеиновых кислот или белков по настоящему изобретению могут использоваться другие известные клетки, в том числе заказываемые по каталогу Атепсап Туре СиНиге Со11ес1юп Са!а1одие о£ Се11 Ьше8 апб НуЬпбота8 (тетете.а!сс.огд) либо у других известных или коммерческих поставщиков.

В случае использования эукариотических клеток-хозяев в вектор обычно добавляют последовательности полиаденилирования или транскрипционные терминирующие последовательности.

Например, в качестве терминирующей последовательности может использоваться последовательность полиаденилирования из гена гормона роста крупного рогатого скота. Возможно также добавление последовательностей для точного сплайсинга транскрипта. Например, в качестве последовательности сплайсинга может быть использован интрон УР1 из 8У40 (8ргадие, е! а1., 1. Уио1. 45:773-781 (1983)). Кроме того, в вектор могут быть добавлены последовательности генов для контроля репликации в клетке-хозяине, известные из уровня техники.

Очистка белкового каркаса.

Белковый каркас может быть восстановлен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными способами, в частности очистка белком А, осаждение сульфатом аммония или спиртом, экстрагирование кислотой, анионо- или катионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография, хроматография на гидроксилапатите и хроматография на лектине. Для очистки можно также использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) (см., например, СоШдап, Сиггеп! Рго!осо18 ш 1ттипо1оду или Сиггеп! Рго!осо18 т Рго!еш 8с1епсе, 1оЬп \УПеу & 8оп8, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2001), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, 10), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.

Белковые каркасы по настоящему изобретению включают натурально очищенные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными способами из прокариотического или эукариотического хозяина, в частности клетки Е. Сой, дрожжевые, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в рекомбинантном способе, белковый каркас по настоящему изобретению может быть гликозилированным или негликозилированным. Такие способы описаны в многочисленных стандартных лабораторных руководствах, например 8атЬгоок, 8ирга, разделы 17.37-17.42; Аи8иЬе1, 8ирга, главы 10, 12, 13, 16, 18 и 20, СоШдап, Рго!ет 8с1епсе, 8ирга, главы 12-14, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.

Коды аминокислот.

Аминокислоты, составляющие белковые каркасы по настоящему изобретению, часто указываются в виде аббревиатур. Наименования аминокислот могут указываться с помощью однобуквенного кода аминокислоты, трехбуквенного кода, названия или кодона из трех нуклеотидов, что хорошо известно из уровня техники (см. Л1Ьег18. В., е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду о£ ТЬе Се11, ТШгб Еб., Оаг1апб РиЬШЫпд, 1пс., Νον Уогк, 1994). Белковый каркас по настоящему изобретению может содержать одну или несколько

- 9 028304 замен, делений или добавлений аминокислот либо в результате естественных мутаций, либо в результате человеческих манипуляций, как указано в настоящем документе. Аминокислоты в белковом каркасе по настоящему изобретению, играющие важную роль в его функционировании, могут быть идентифицированы с помощью известных из уровня техники способов, например сайт-направленного мутагенеза или сканирующего аланином мутагенеза (например, Аи8иЬе1, 8ирта, главы 8, 15; СиишпдЬат апб ^е11§, δοίепсе 244:1081-1085 (1989)). Последняя процедура включает добавление одной мутации аланина в каждом остатке в молекуле. Полученные в результате мутировавшие молекулы затем тестируют на предмет биологической активности, в частности по меньшей мере одной нейтрализующей активности. Особенно важные для связывания белкового каркаса сайты могут быть также идентифицированы путем структурного анализа, например кристаллизации, ядерно-магнитного резонанса или фотоаффинного мечения (ЗтйЬ, е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ. 224:899-904 (1992) апб бе Уо5, е! а1., Зсзепсе 255:306-312 (1992)).

Специалистам в данной области техники будет ясно, что настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному биологически активному белковому каркасу по настоящему изобретению. Биологически активные белковые каркасы имеют специфическую активность по меньшей мере 20, 30 или 40%, предпочтительно 50, 60 или 70% и наиболее предпочтительно 80, 90 либо 95-1000% или более от активности естественного (несинтетического), эндогенного или связанного и известного белкового каркаса. Способы качественного и количественного анализа ферментативной активности и субстратной специфичности хорошо известны специалистам в данной области техники.

Изобретение также относится к белковым каркасам и фрагментам, как описано здесь, которые модифицируются путем ковалентного присоединения органической части. Такая модификация позволяет получить фрагмент белкового каркаса с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, увеличенным периодом полувыведения в сыворотке ш νινο). В качестве органической части может быть использована линейная или разветвленная гидрофильная полимерная группа, группа жирных кислот или группа эфиров жирных кислот. В некоторых воплощениях гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу приблизительно 800-120000 Да и представлять собой полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (РЕО), полипропиленгликоль (РРО)), углеводный полимер, аминокислотный полимер или поливинилпиролидон, а группа жирных кислот или группа эфиров жирных кислот может содержать от приблизительно восьми до приблизительно сорока атомов углерода.

Модифицированные белковые каркасы и фрагменты по изобретению могут содержать одну и более органических частей, ковалентно связанных напрямую или опосредованно с антителом.

Каждая органическая часть, связанная с белковым каркасом или фрагментом по изобретению, может независимо от остальных являться гидрофильной полимерной группой, группой жирных кислот или группой эфиров жирных кислот. В настоящем документе в термин жирная кислота включаются монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. Используемый в настоящем документе термин гидрофильная полимерная группа означает органический полимер, который лучше растворяется в воде, чем в октане. Например, полилизин лучше растворяется в воде, чем в октане. Таким образом, в объем изобретения включен белковый каркас, модифицированный ковалентным присоединением полилизина. К линейным или разветвленным гидрофильным полимерам, пригодным для модификации белкового каркаса по изобретению, относятся, в частности, полиалкангликоли (например, РЕО, монометоксиполиэтиленгликоль (тРЕО), РРО и т.п.), углеводы (например, декстран, целлюлоза, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т.п.), полиалкана оксиды (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинилпиролидон. Гидрофильный полимер, модифицирующий белковый каркас по изобретению, предпочтительно имеет молекулярную массу от приблизительно 800 до приблизительно 150000 Да как отдельная молекулярная субстанция. Например, могут быть использованы РЕО₅₀₀₀ и РЕО₂₀₀₀₀, где индекс означает средний молекулярный вес полимера в Да. Гидрофильная полимерная группа может быть заменена группами алкилов, жирных кислот или эфиров жирных кислот в количестве от одной до приблизительно шести. Гидрофильные полимеры, заменяемые группами жирных кислот или эфиров жирных кислот, могут быть приготовлены с помощью подходящих способов. Например, полимер, содержащий группу аминов, может связываться с карбоксилатом жирной кислоты или эфира жирной кислоты, а активированный карбоксилат (например, активированный с помощью Ν, Ν-карбонил-диимидазола) на жирной кислоте или эфире жирной кислоты может связываться с гидроксильной группой на полимере.

Жирные кислоты и эфиры жирных кислот, пригодные для модификации белковых каркасов по изобретению, могут быть насыщенными или могут содержать одну и более связей ненасыщенности. К жирным кислотам, пригодным для модификации белкового каркаса по изобретению, относятся, в частности, п-додеканоат (С₁₂, лаурат), п-тетрадеканоат (С₁₄, миристат), п-октадеканоат (С₁₈, стеарат), п-эйкозаноат (С₂₀ арахидат), п-докозаноат (С₂₂, бегенат), п-триаконтаноат (С₃₀), п-тетраконтаноат (С₄₀), с18-Д9октадеканоат (С₁₈, олеат), все Ш8-Д5, 8, 11, 14-эйкозатетраэноаты (С₂₀, арахидонат), октандиовая кислота, тетрадекандиовая кислота, октадекандиовая кислота, докозандиовая кислота и т.п. К пригодным эфирам жирных кислот относятся моноэфиры дикарбоновых кислот, содержащие линейную или разветвленную низшую алкильную группу. Низшая алкильная группа может содержать от одного до приблизительно

- 10 028304 двенадцати, предпочтительно от одного до приблизительно шести атомов углерода.

Модифицированные белковые каркасы и фрагменты могут быть получены с использованием подходящих способов, например, путем реакции с одним или несколькими модифицирующими веществами. Используемый в настоящем документе термин модифицирующее вещество означает подходящий органический полимер (например, гидрофильный полимер, жирную кислоту, эфир жирной кислоты), который включает активирующую группу. Под активирующей группой понимаются химический элемент или функциональная группа, которые при соответствующих условиях могут вступать в реакцию со второй химической группой, тем самым образуя ковалентную связь между модифицирующим веществом и второй химической группой. Например, к аминреактивным активирующим группам относятся электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), Ν-гидроксисукцинимидила (ΝΗ8) эфиры и т.п. К активирующим группам, способным реагировать с тиолами, относятся, например, малеимид, йодацетил, акрилолил, пиридила дисульфиды, 5-тиол-2-нитробензойная кислота-тиол (ΤΝΒтиол) и т.п. Функциональная группа альдегида может быть связана с амин- или гидразидсодержащими молекулами, а группа азида может реагировать с трехвалентной фосфорной группой с образованием фосфорамидатных или фосфоримидных связей. Способы введения активирующих групп в молекулы известны из уровня техники (см., например, ^πη;πΐ8οη С.Т., ΒίοΜηρίβηΝ ТесНшсщех. АсаДетк Рге88: δ;·ιη Ό№§ο, СА (1996)). Активирующая группа может быть связана непосредственно с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, эфиром жирной кислоты) или через линкер, например двухвалентную группу С₁-С₁₂, в которой один или несколько атомов углерода могут быть заменены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. К пригодным линкерам относятся, например, тетраэтиленгликоль, -(СН₂)₃-, -ΝΗ-^Η₂)₆-ΝΗ-, -(СН₂)₂-]+Н- и -СН₃-О-СН₃-СН₃-О-СН₃-СН₃-О-СН-]МН-. Модифицирующие вещества, содержащие линкер, могут быть получены, например, путем реакции моноВос-алкилдиамина (например, моно-Вос-этилендиамина, моно-Вос-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (ЕЭС) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Защитная группа Вос может быть удалена из продукта путем обработки с помощью трифторуксусной кислоты (ТРА) с образованием первичного амина, который может быть связан с другой карбоновой кислотой, как описано здесь, или может вступить в реакцию с малеиновым ангидридом, после чего конечный продукт может быть циклизирован для получения активированного малеимидного производного жирной кислоты (см., например, Τΐιοιηρδοη, е1 а1., \ν0 92/16221, информация из этого источника полностью включена в текст настоящего документа путем ссылки).

Модифицированные белковые каркасы по изобретению могут быть получены путем реакции белкового каркаса или фрагмента с модифицирующим веществом. К примеру органические части могут быть связаны с белковым каркасом не сайт-специфичным способом с использованием амин-реактивного модифицирующего вещества, например ΝΗδ-эфира РЕО. Модифицированные белковые каркасы и фрагменты, содержащие органическую часть, связанную со специфическими сайтами белкового каркаса по настоящему изобретению, могут быть получены с использованием соответствующих способов, таких как обратная реакция протеолиза (Р18сЬ е1 а1., Βίο^ηρίβηΝ СЬет., 3:147-153 (1992); Vе^1еη е1 а1., ΒίοΜηρίβηΝ СЬет., 5:411-417 (1994); Китагаи е! а1., Рго1еш δα. 6 (10) :2233-2241 (1997); Ποίι е! а1., Βίοοτ§. СЬет., 24(1): 59-68 (1996); Саре11а8 е! а1., Β^οίесЬηο1. Рюемд., 56 (4) :456-463 (1997)), и способов, описанных в ^πη;πΐ8οη О.Т., Β^οсοη^идаίе ТесЬтцие8, АсаДетк Рге88: δаη Эге^, СА (1996)).

Композиции белкового каркаса, содержащие дополнительные терапевтически активные вещества.

Композиции белкового каркаса по настоящему изобретению могут в некоторых случаях дополнительно содержать эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка (малую или большую молекулу), выбранного из противоинфекционного лекарственного средства, сердечнососудистого лекарственного средства, лекарственного средства для центральной нервной системы (ЦНС), лекарственного средства для вегетативной нервной системы (ВНС), лекарственного средства для респираторного тракта, лекарственного средства для желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства для водно-солевого баланса, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого лекарственного средства, иммуномодулирующего лекарственного средства, лекарственного средства для органов зрения, слуха или обоняния, лекарственного средства местного действия, питательного препарата и т.п. Такие лекарственные средства хорошо известны из уровня техники, включая формулы, показания, дозировку и способ введения для каждого из представленных здесь (см., например, №г8шд 2001 Ηηι^όοοΚ ο£ Пгид8, 218ί еДЬющ δр^^ηдЬοи8е Соцз., δρπηβΐιοι.^, РА, 2001; НеаЬЬ Рго£е88киа1'8 Эгид ОшДе 2001, еД., δЬаηηοη, νίΐ8οη, δΙ;·ιη§, РюШке-НаП, Ью, Иррег 8аДД1е К1уег, N1; ΡЬа^тсοίЬе^ару ΗаηДЬοοк, Vе118 е! а1., еД., Аррк^ & Банде, 81ат1огД, СТ, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).

Противоинфекционное лекарственное средство может быть по меньшей мере одним амебоцидным средством или по меньшей мере одним средством, выбранным из противопротозойного, противоглистного, фунгицидного, противомалярийного, противотуберкулезного, или по меньшей мере одним средством, выбранным из противолепрозного средства, аминогликозидов, пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов, сульфонамидов, фторхинолонов, противовирусных, макролидных и прочих противоинфек- 11 028304 ционных лекарственных средств. Сердечно-сосудистое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из инотропных, антиаритмических, противоангинных, гипотензивных средств, антилипемических и прочих сердечно-сосудистых лекарственных средств. Лекарственное средство для ЦНС может быть выбрано по меньшей мере из ненаркотических анальгетиков или по меньшей мере из жаропонижающих, нестероидных противовоспалительных, наркотических или опиоидных анальгетиков, успокоительных/снотворных средств, антиконвульсантов, антидепрессантов, противотревожных, нейролептических средств, стимуляторов центральной нервной системы, антипаркинсонических и прочих лекарственных средств для ЦНС. Лекарственное средство для ВНС может быть выбрано по меньшей мере из холинергиков (парасимпатомиметиков), антихолинергиков, адренергетиков (симпатомиметиков), адреноблокаторов (симпатолитиков), миорелаксантов скелетных мышц и нервно-мышечных блокаторов. Лекарственное средство для респираторного тракта может быть выбрано по меньшей мере из антигистаминных средств, бронхолитиков, отхаркивающих средств или по меньшей мере из противокашлевых и прочих лекарственных средств для дыхательных путей. Лекарственное средство для ЖКТ может быть выбрано по меньшей мере из антацидов, по меньшей мере из адсорбентов, по меньшей мере из ветрогонных, пищеварительных ферментов или по меньшей мере из лекарственных средств против желчнокаменной болезни, антидиарейных, слабительных, противорвотных и противоязвенных лекарственных средств. Гормональное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из кортикостероидов, андрогенов, по меньшей мере из анаболических стероидов, эстрогенов, по меньшей мере из прогестина, гонадотропина, антидиабетического лекарственного средства или по меньшей мере из глюкагона, гормона щитовидной железы, антагониста гормона щитовидной железы, гормона гипофиза и подобного гормону паращитовидных желез лекарственного средства. Лекарственное средство для водно-солевого баланса может быть выбрано по меньшей мере из мочегонных средств, электролитов, по меньшей мере из замещающих растворов, подкислителей или по меньшей мере из подщелачивающих средств. Гематологическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из лекарственных средств, повышающих количество гемоглобина в крови, антикоагулянтов, производных крови и тромболитических ферментов. Противоопухолевое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из алкилирующих лекарственных средств, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, противоопухолевых лекарственных средств, изменяющих гормональный баланс, а также прочих противоопухолевых лекарственных средств. Иммуномодулирующее лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из иммунодепрессантов, вакцин, по меньшей мере из анатоксинов, антитоксинов или по меньшей мере из противоядия, иммунной сыворотки и модификатора биологического отклика. Лекарственное средство для органов зрения, слуха или обоняния может быть выбрано по меньшей мере из офтальмологических противоинфекционных, офтальмологических противовоспалительных, миотических, мидриатических, офтальмологических вазоконстрикторов, прочих лекарственных средств для органов зрения, слуха или обоняния. Лекарственное средство местного действия может быть выбрано по меньшей мере из противоинфекционных лекарственных средств местного действия, противочесоточных или по меньшей мере из педикулицидов либо кортикостероидов местного действия. Питательный препарат может быть выбран по меньшей мере из витаминов, минералов или питательных веществ (см., например, ИшЦпд 2001 Эгид НаибЬоок, 8ирта).

По меньшей мере одно амебоцидное или противопротозойное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из атовакуона, хлорохина гидрохлорида, хлорохина фосфата, метронидазола, метронидазола гидрохлорида и пентамидина изетионата. По меньшей мере одно противоглистное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из мебендазола, пирантела памоата и тиабендазола. По меньшей мере один фунгицид может быть выбран по меньшей мере из амфотерицина В, холестерил-сульфатного комплекса амфотерицина В, липидного комплекса амфотерицина В, липосомального амфотерицина В, флуконазола, флуцитозина, гризеофульвина микрокристаллической формы, гризеофульвина ультрамикрокристаллической формы, итраконазола, кетоконазола, нистатина и тербинафина гидрохлорида. По меньшей мере одно противомалярийное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлорохина гидрохлорида, хлорохина фосфата, доксициклина, гидроксихлорохина сульфата, мефлохина гидрохлорида, примахина фосфата, пириметамина и пириметамина с сульфадоксином. По меньшей мере одно противотуберкулезное или противолепрозное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из клофазимина, циклосерина, дапсона, этамбутола гидрохлорида, изониазида, пиразинамида, рифабутина, рифампицина, рифапентина и стрептомицина сульфата. По меньшей мере один аминогликозид может быть выбран по меньшей мере из амикацина сульфата, гентамицина сульфата, неомицина сульфата, стрептомицина сульфата и тобрамицина сульфата. По меньшей мере один пенициллин может быть выбран по меньшей мере из амоксициллина/клавуланата калия, амоксициллина тригидрата, ампициллина, ампициллина натрия, ампициллина тригидрата, ампициллина натрия/сульбактама натрия, клоксациллина натрия, диклоксациллина натрия, мезлоциллина натрия, нафциллина натрия, оксациллина натрия, пенициллина О бензатина, пенициллина О калия, пенициллина О прокаина, пенициллина О натрия, пенициллина V калия, пиперациллина натрия, пиперациллина натрия/тазобактама натрия, тикарциллина динатрия и тикарциллина динатрия/клавуланата калия. По меньшей мере один цефалоспорин может быть выбран по меньшей мере из цефаклора, цефадроксила,

- 12 028304 цефазолина натрия, цефдинира, цефепима гидрохлорида, цефиксима, цефметазола натрия, цефоницида натрия, цефоперазона натрия, цефотаксима натрия, цефотетана динатрия, цефокситина натрия, цефподоксима проксетила, цефпрозила, цефтазидима, цефтибутена, цефтизоксима натрия, цефтриаксона натрия, цефуроксима аксетила, цефуроксима натрия, цефалексина гидрохлорида, цефалексина моногидрата, цефрадина и лоракарбефа. По меньшей мере один тетрациклин может быть выбран по меньшей мере из демеклоциклина гидрохлорида, доксициклина кальция, доксициклина гиклата, доксициклина гидрохлорида, доксициклина моногидрата, миноциклина гидрохлорида и тетрациклина гидрохлорида. По меньшей мере один сульфонамид может быть выбран по меньшей мере из ко-тримоксазола, сульфадиазина, сульфаметоксазола, сульфизоксазола и сульфизоксазола ацетила. По меньшей мере один фторхинолон может быть выбран по меньшей мере из алатрофлоксацина мезилата, ципрофлоксацина, эноксацина, левофлоксацина, ломефлоксацина гидрохлорида, налидиксовой кислоты, норфлоксацина, офлоксацина, спарфлоксацина и тровафлоксацина мезилата. По меньшей мере один фторхинолон может быть выбран по меньшей мере из алатрофлоксацина мезилата, ципрофлоксацина, эноксацина, левофлоксацина, ломефлоксацина гидрохлорида, налидиксовой кислоты, норфлоксацина, офлоксацина, спарфлоксацина и тровафлоксацина мезилата. По меньшей мере одно противовирусное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из абакавира сульфата, ацикловира натрия, амантадина гидрохлорида, ампренавира, цидофовира, делавирдина мезилата, диданозина, эфавиренца, фамцикловира, фомивирзена натрия, фоскарнета натрия, ганцикловира, индинавира сульфата, ламивудина, ламивудина/зидовудина, нелфинавира мезилата, невирапина, осельтамивира фосфата, рибавирина, римантадина гидрохлорида, ритонавира, саквинавира, саквинавира мезилата, ставудина, валацикловира гидрохлорида, залцитабина, занамивира и зидовудина. По меньшей мере одно макролидное противоинфекционное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из азитромицина, кларитромицина, диритромицина, эритромицина в виде основания, эритромицина эстолата, эритромицина этилсукцината, эритромицина лактобионата и эритромицина стеарата. По меньшей мере одно прочее противоинфекционное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из азтреонама, бацитрацина, хлорамфеникола натрия сукцината, клиндамицина гидрохлорида, клиндамицина пальмитата гидрохлорида, клиндамицина фосфата, имипенема и циластатина натрия, меропенема, нитрофурантоина макрокристаллической формы, нитрофурантоина микрокристаллической формы, квинупристина/дальфопристина, спектиномицина гидрохлорида, триметоприма и ванкомицинаа гидрохлорид (см., например, с. 24-214 в Ыигктд 2001 Эгид НапбЪоок).

По меньшей мере одно инотропное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из амринона лактата, дигоксина и милринона лактата. По меньшей мере одно антиаритмическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аденозина, амиодарона гидрохлорида, атропина сульфата, бретилия тозилата, дилтиазема гидрохлорида, дизопирамида, дизопирамида фосфата, эсмолола гидрохлорида, флекаинида ацетата, ибутилида фумарата, лидокаина гидрохлорида, мексилетина гидрохлорида, морицизина гидрохлорида, фенитоина, фенитоина натрия, прокаинамида гидрохлорида, пропафенона гидрохлорида, пропранолола гидрохлорида, хинидина бисульфата, хинидина глюконата, хинидина полигалактуроната, хинидина сульфата, соталола, токаинида гидрохлорида и верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно противоангинное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из амлодипидина бесилата, амилнитрита, бепридила гидрохлорида, дилтиазема гидрохлорида, изосорбида динитрата, изосорбида мононитрата, надолола, никардипина гидрохлорида, нифедипина, нитроглицерина, пропранолола гидрохлорида, верапамила и верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно гипотензивное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из ацебутолола гидрохлорида, амлодипина бесилата, атенолола, беназеприла гидрохлорида, бетаксолола гидрохлорида, бисопролола фумарата, кандесартана цилексетила, каптоприла, картеолола гидрохлорида, карведилола, клонидина, клонидина гидрохлорида, диазоксида, дилтиазема гидрохлорида, доксазозина мезилата, эналаприлата, эналаприла малеата, эпросартана мезилата, фелодипина, фенолдопама мезилата, фозиноприла натрия, гуанабенза ацетата, гуанадрела сульфата, гуанфацина гидрохлорида, гидралазина гидрохлорида, ирбесартана, исрадипина, лабеталола гидрохлорида, лизиноприла, лозартана калия, метилдопа, метилдопата гидрохлорида, метопролола сукцината, метопролола тартрата, миноксидила, моэксиприла гидрохлорида, надолола, никардипина гидрохлорида, нифедипина, нисолдипина, нитропруссида натрия, пенбутолола сульфата, периндоприла эрбумина, фентоламина мезилата, пиндолола, празозина гидрохлорида, пропранолола гидрохлорида, квинаприла гидрохлорида, рамиприла, телмисартана, теразозина гидрохлорида, тимолола малеата, трандолаприла, валсартана и верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно антилипемическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аторвастатина кальция, церивастатина натрия, холестирамина, колестипола гидрохлорида, фенофибрата (микронизированного), флувастатина натрия, гемфиброзила, ловастатина, ниацина, правастатина натрия и симвастатина. По меньшей мере одно прочее сердечно-сосудистое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из абциксимаба, алпростадила, арбутамина гидрохлорида, цилостазола, клопидогреля бисульфата, дипиридамола, эптифибатида, мидодрина гидрохлорида, пентоксифиллина, тиклопидина гидрохлорида и тирофибана гидрохлорида (см., например, с. 215-336 в Ыигкшд 2001 Эгид НапбЪоок).

По меньшей мере одно ненаркотическое анальгетическое или жаропонижающее лекарственное

- 13 028304 средство может быть выбрано по меньшей мере из ацетаминофена, аспирина, холина магния трисалицилата, дифлунизала и магния салицилата. По меньшей мере одно нестероидное противовоспалительное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из целекоксиба, диклофенака калия, диклофенака натрия, этодолака, фенопрофена кальция, флурбипрофена, ибупрофена, индометацина, индометацина натрия тригидрата, кетопрофена, кеторолака трометамина, набуметона, напроксена, напроксена натрия, оксапрозина, пироксикама, рофекоксиба и сулиндака. По меньшей мере один наркотический или опиоидный анальгетик может быть выбран по меньшей мере из алфентанила гидрохлорида, бупренорфина гидрохлорида, буторфанола тартрата, кодеина фосфата, кодеина сульфата, фентанила цитрата, фентанила в виде трансдермальной системы, фентанила для введения через слизистую оболочку, гидроморфона гидрохлорида, меперидина гидрохлорида, метадона гидрохлорида, морфина гидрохлорида, морфина сульфата, морфина тартрата, нальбуфина гидрохлорида, оксикодона гидрохлорида, оксикодона пектината, оксиморфона гидрохлорида, пентазоцина гидрохлорида, пентазоцина гидрохлорида и налоксона гидрохлорида, пентазоцина лактата, пропоксифена гидрохлорида, пропоксифена напсилата, ремифентанила гидрохлорида, суфентанила цитрата и трамадола гидрохлорида. По меньшей мере одно успокоительное/снотворное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлоралгидрата, эстазолама, флуразепама гидрохлорида, фенобарбитала, фенобарбитала натрия, фенобарбитала натрия, секобарбитала натрия, темазепама, триазолама, залеплона и золпидема тартрата. По меньшей мере один антиконвульсант может быть выбран по меньшей мере из ацетазоламида натрия, карбамазепина, клоназепама, клоразепата дикалия, диазепама, дивалпроекса натрия, этосуксимида, фосфенитоина натрия, габапентина, ламотриджина, магния сульфата, фенобарбитала, фенобарбитала натрия, фенитоина, фенитоина натрия, фенитоина натрия (пролонгированного действия), примидона, тиагабина гидрохлорида, топирамата, вальпроата натрия и вальпроевой кислоты. По меньшей мере один антидепрессант может быть выбран по меньшей мере из амитриптилина гидрохлорида, амитриптилина памоата, амоксапина, бупропиона гидрохлорида, циталопрама гидробромида, кломипрамина гидрохлорида, дезипрамина гидрохлорида, доксепина гидрохлорида, флуоксетина гидрохлорида, имипрамина гидрохлорида, имипрамина памоата, миртазапина, нефазодона гидрохлорида, нортриптилина гидрохлорида, пароксетина гидрохлорида, фенелзина сульфата, сертралина гидрохлорида, транилципромина сульфата, тримипрамина малеата и венлафаксина гидрохлорида. По меньшей мере одно противотревожное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из алпразолама, буспирона гидрохлорида, хлордиазепоксида, хлордиазепоксида гидрохлорида, клоразепата дикалия, диазепама, доксепина гидрохлорида, гидроксизина эмбоната, гидроксизина гидрохлорида, гидроксизина памоата, лоразепама, мепробамата, мидазолама гидрохлорида и оксазепама. По меньшей мере одно нейролептическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлорпромазина гидрохлорида, клозапина, флуфеназина деканоата, флуфеназина энантата, флуфеназина гидрохлорида, галоперидола, галоперидола деканоата, галоперидола лактата, локсапина гидрохлорида, локсапина сукцината, месоридазина бесилата, молиндона гидрохлорида, оланзапина, перфеназина, пимозида, прохлорперазина, кветиапина фумарата, рисперидона, тиоридазина гидрохлорида, тиотиксена, тиотиксена гидрохлорида и трифлуоперазина гидрохлорида. По меньшей мере один стимулятор центральной нервной системы может быть выбран по меньшей мере из амфетамина сульфата, кофеина, декстроамфетамина сульфата, доксапрама гидрохлорида, метамфетамина гидрохлорида, метилфенидата гидрохлорида, модафинила, пемолина и фентермина гидрохлорида. По меньшей мере одно антипаркинсоническое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из амантадина гидрохлорида, бензотропина мезилата, биперидена гидрохлорида, биперидена лактата, бромокриптина мезилата, карбидопы/леводопы, энтакапона, леводопы, перголида мезилата, прамипексола дигидрохлорида, ропинирола гидрохлорида, селегилина гидрохлорида, толкапона и тригексифенидила гидрохлорида. По меньшей мере одно прочее лекарственное средство для центральной нервной системы может быть выбрано по меньшей мере из бупропиона гидрохлорида, донепезила гидрохлорида, дроперидола, флувоксамина малеата, лития карбоната, лития цитрата, наратриптана гидрохлорида, никотина полакрилекса, никотина в виде трансдермальной системы, пропофола, ризатриптана бензоата, сибутрамина гидрохлорида моногидрата, суматриптана сукцината, такрина гидрохлорид и золмитриптана (см., например, с. 337-530 в Ыигетд 2001 Эгид Наи4Ьоок).

По меньшей мере один холинергик (например, парасимпатомиметик) может быть выбран по меньшей мере из бетанехола хлорида, эдрофониума хлорида, неостигмина бромида, неостигмина метилсульфата, физостигмина салицилата и пиридостигмина бромида. По меньшей мере один антихолинергик может быть выбран по меньшей мере из атропина сульфата, дицикломина гидрохлорида, гликопирролата, гиосциамина, гиосциамина сульфата, пропантелина бромида, скополамина, скополамина бутилбромида и скополамина гидробромида. По меньшей мере один адренергетик (симпатомиметик) может быть выбран по меньшей мере из добутамина гидрохлорида, допамина гидрохлорида, метараминола битартрата, норэпинефрина битартрата, фенилэфрина гидрохлорида, псевдоэфедрина гидрохлорида и псевдоэфедрина сульфата. По меньшей мере один адреноблокатор (симпатолитик) может быть выбран по меньшей мере из дигидроэрготамина мезилата, эрготамина тартрата, метисергида малеата и пропранолола гидрохлорида. По меньшей мере один миорелаксант скелетных мышц может быть выбран по меньшей мере из баклофена, карисопродола, хлорзоксазона, циклобензаприна гидрохлорида, дантролена натрия, метокарба- 14 028304 мола и тизанидина гидрохлорида. По меньшей мере один нервно-мышечный блокатор может быть выбран по меньшей мере из атракурия бесилата, цизатракурия бесилата, доксакурия хлорида, мивакурия хлорида, панкурония бромида, пипекурония бромида, рапакурония бромида, рокурония бромида, сукцинилхолина хлорида, тубокурарина хлорида и векурония бромида (см., например, с. 531-84 в ΝιΐΓ5ίη§ 2001 Эгид НапйЪоок).

По меньшей мере одно антигистаминное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бромфенирамина малеата, цетиризина гидрохлорида, хлорфенирамина малеата, клемастина фумарата, ципрогептадина гидрохлорида, дифенгидрамина гидрохлорида, фексофенадина гидрохлорида, лоратадина, прометазина гидрохлорида, прометазина теоклата и трипролидина гидрохлорида. По меньшей мере один бронхолитик может быть выбран по меньшей мере из альбутерола, альбутерола сульфата, аминофиллина, атропина сульфата, эфедрина сульфата, эпинефрина, эпинефрина битартрата, эпинефрина гидрохлорида, ипратропия бромида, изопротеренола, изопротеренола гидрохлорида, изопротеренола сульфата, левалбутерола гидрохлорида, метапротеренола сульфата, окстрифиллина, пирбутерола ацетата, сальметерола ксинафоата, тербуталина сульфата и теофиллина. По меньшей мере одно отхаркивающее или противокашлевое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бензонатата, кодеина фосфата, кодеина сульфата, декстраметорфана гидробромида, дифенгидрамина гидрохлорида, гуафенизин и гидроморфона гидрохлорида. По меньшей мере одно прочее лекарственное средство для респираторного тракта может быть выбрано по меньшей мере из ацетилцистеина, беклометазона дипропионата, берактанта, будесонида, калфактанта, кромолина натрия, дорназы альфа, эпопростенола натрия, флунизолида, флутиказона пропионата, монтелукаста натрия, недокромила натрия, паливизумаба, триамцинолона ацетонида, зафирлукаста и зилеутона (см., например, с. 585-642 в ШШпд 2001 Эгид НапйЪоок).

По меньшей мере один антацид, адсорбент или одно ветрогонное лекарственное средство может быть выбран по меньшей мере из алюминия карбоната, алюминия гидроксида, кальция карбоната, магалдрата, магния гидроксида, магния оксида, симетикона и натрия бикарбоната. По меньшей мере один пищеварительный фермент или одно лекарственное средство против желчно-каменной болезни может быть выбрано по меньшей мере из панкреатина, панкрелипазы и урсодиола. По меньшей мере одно антидиарейное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аттапульгита, висмута субсалицилата, кальция поликарбофила, дифеноксилата гидрохлорида и атропина сульфата, лоперамида, октреотида ацетата, настойки опия и настойки опия (с камфорой). По меньшей мере одно слабительное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бисакодила, кальция поликарбофила, каскары саграды, ароматического жидкого экстракта каскары саграды, жидкого экстракта каскары саграды, касторового масла, докузата кальция, докузата натрия, глицерина, лактулозы, магния цитрата, магния гидроксида, магния сульфата, метилцеллюлозы, минерального масла, полиэтиленгликоля или раствора электролита, подорожника, сенны и натрия фосфатов. По меньшей мере одно противорвотное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлорпромазина гидрохлорида, дименгидрината, доласетрона мезилата, дронабинола, гранисетрона гидрохлорида, меклизина гидрохлорида, метоклопрамида гидрохлорида, ондансетрона гидрохлорида, перфеназина, прохлорперазина, прохлорперазина эдизилата, прохлорперазина малеата, прометазина гидрохлорида, скополамина, тиэтилперазина малеата и триметобензамида гидрохлорида. По меньшей мере одно противоязвенное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из циметидина, циметидина гидрохлорида, фамотидина, лансопразола, мизопростола, низатидина, омепразола, рабепрозола натрия, ранитидина висмута цитрата, ранитидина гидрохлорида и сукральфата (см., например, с. 643-95 в ШШпд 2001 Эгид НапйЪоок).

По меньшей мере один кортикостероид может быть выбран по меньшей мере из бетаметазона, бетаметазона ацетата или бетаметазона натрия фосфата, бетаметазона натрия фосфата, кортизона ацетата, дексаметазона, дексаметазона ацетата, дексаметазона натрия фосфата, флудрокортизона ацетата, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, гидрокортизона ципионата, гидрокортизона натрия фосфата, гидрокортизона натрия сукцината, метилпреднизолона, метилпреднизолона ацетата, метилпреднизолона натрия сукцината, преднизолона, преднизолона ацетата, преднизолона натрия фосфата, преднизолона тебутата, преднизона, триамцинолона, триамцинолона ацетонида и триамцинолона диацетата. По меньшей мере один андроген или анаболический стероид может быть выбран по меньшей мере из даназола, флюоксиместерона, метилтестостерона, нандролона деканоата, нандролона фенпропионата, тестостерона, тестостерона ципионата, тестостерона энантата, тестостерона пропионата и тестостерона в виде трансдермальной системы. По меньшей мере один эстроген или прогестин может быть выбран по меньшей мере из этерифицированных эстрогенов, эстрадиола, эстрадиола ципионата, эстрадиола/норэтиндронацетата в виде трансдермальной системы, эстрадиола валерата, эстрогенов (конъюгированных), эстропипата, этинилэстрадиола, этинилэстрадиола и дезогестрела, этинилэстрадиола и этинодиола диацетата, этинилэстрадиола и левоноргестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона, этинилэстрадиола и норэтиндрона ацетата, этинилэстрадиола и норгестимата, этинилэстрадиола и норгестрела, этинилэстрадиола, норэтиндрона, ацетата и железа фумарата, левоноргестрела, медроксипрогестерона ацетата, местранола и норэтиндрона, норэтиндрона, норэтиндрона ацетата, норгестрела и прогестерона. По меньшей мере один гонадотропин может быть выбран по меньшей мере из ганиреликса ацетата, гонадо- 15 028304 релина ацетата, гистрелина ацетата и менотропина. По меньшей мере одно антидиабетическое лекарственное средство или глюкагон может быть выбрано по меньшей мере из акарбозы, хлорпропамида, глимепирида, глипизида, глюкагона, глибурида, инсулинов, метформина гидрохлорида, миглитола, пиоглитазона гидрохлорида, репаглинида, розиглитазона малеата и троглитазона. По меньшей мере один гормон щитовидной железы может быть выбран по меньшей мере из левотироксина натрия, лиотиронина натрия, лиотрикса и тироида. По меньшей мере один антагонист гормона щитовидной железы может быть выбран по меньшей мере из метимазола, калия йодида, калия йодида (насыщенного раствора), пропилтиоурацила, радиоактивного йода (натрия йодида 1311) и раствора люголя. По меньшей мере один гормон гипофиза может быть выбран по меньшей мере из кортикотропина, косинтропина, десмопрессина ацетата, лейпролида ацетата, кортикотропина продленного действия, соматрема, соматропина и вазопрессина. По меньшей мере одно подобное гормону паращитовидных желез лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из кальцифедиола, кальцитонина (человека), кальцитонина (лосося), кальцитриола, дигидротахистерола и этидроната динатрия (см., например, с. 696-796 в ΝιΐΓ5ίη§ 2001 Эгид НаийЬоок).

По меньшей мере одно мочегонное средство может быть выбрано по меньшей мере из ацетазоламида, ацетазоламида натрия, амилорида гидрохлорида, буметанида, хлорталидона, этакрината натрия, этакриновой кислоты, фуросемида, гидрохлоротиазида, индапамида, маннитола, метолазона, спиронолактона, торасемида, триамтерена и мочевины. По меньшей мере один электролитический или замещающий раствор может быть выбран по меньшей мере из кальция ацетата, кальция карбоната, кальция хлорида, кальция цитрата, кальция глубионата, кальция глуцептата, кальция глюконата, кальция лактата, кальция фосфата (двухосновного), кальция фосфата (трехосновного), декстрана (с высокой молекулярной массой), декстрана (с низкой молекулярной массой), гидроксиэтилкрахмала, магния хлорида, магния сульфата, калия ацетата, калия бикарбоната, калия хлорида, калия глюконата, раствора Рингера, раствора Рингера (лактата) и натрия хлорида. По меньшей мере один подкислитель или одно подщелачивающее средство может быть выбрано по меньшей мере из натрия бикарбоната, натрия лактата и трометамина (см., например, с. 797-833 в Νυτδίη§ 2001 Эгид НаийЬоок).

По меньшей мере одно лекарственное средство, повышающее количество гемоглобина в крови, может быть выбрано по меньшей мере из железа фумарата, железа глюконата, железа сульфата, железа сульфата (высушенного), железа декстрана, железа сорбита, железополисахаридного комплекса, комплекса натрия и железа глюконата. По меньшей мере один антикоагулянт может быть выбран по меньшей мере из ардепарина натрия, дальтепарина натрия, данапароида натрия, эноксапарина натрия, гепарина кальция, гепарина натрия и варфарина натрия. По меньшей мере одно производное крови может быть выбрано по меньшей мере из альбумина 5%, альбумина 25%, антигемофильного фактора, антиингибиторного коагулянтного комплекса, антитромбина III (человека), фактора IX (человека), комплекса фактора IX и фракции белков плазмы. По меньшей мере один тромболитический фермент может быть выбран по меньшей мере из альтеплазы, анистреплазы, ретеплазы (рекомбинантной), стрептокиназы и урокиназы (см., например, с. 834-66 в Шгбпд 2001 Эгид НаийЬоок).

По меньшей мере одно алкилирующее лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бусульфана, карбоплатина, кармустина, хлорамбуцила, цисплатина, циклофосфамида, ифосфамида, ломустина, хлорметина гидрохлорида, мелфалана, мелфалана гидрохлорида, стрептозоцина, темозоломида и ТиоТЭФ. По меньшей мере один антиметаболит может быть выбран по меньшей мере из капецитабина, кладрибина, цитарабина, флоксуридина, флударабина фосфата, фторурацила, гидроксимочевины, меркаптопурина, метотрексата, метотрексата натрия и тиогуанина. По меньшей мере один противоопухолевый антибиотик может быть выбран по меньшей мере из блеомицина сульфата, дактиномицина, даунорубицина цитрата липосомальной формы, даунорубицина гидрохлорида, доксорубицина гидрохлорида, доксорубицина гидрохлорида липосомальной формы, эпирубицина гидрохлорида, идарубицина гидрохлорида, митомицина, пентостатина, пликамицина и вальрубицина. По меньшей мере одно противоопухолевое лекарственное средство, изменяющее гормональный баланс, может быть выбрано по меньшей мере из анастрозола, бикалютамида, эстрамустина натрия фосфата, экземестана, флутамида, госерелина ацетата, летрозола, лейпролида ацетата, мегестрола ацетата, нилутамида, тамоксифена цитрата, тестолактона и торемифена цитрата. По меньшей мере одно прочее противоопухолевое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аспарагиназы, бациллы Кальметта-Г ерена (БЦЖ) (живой внутрипузырной), дакарбазина, доцетаксела, этопозида, этопозида фосфата, гемцитабина гидрохлорида, иринотекана гидрохлорида, митотана, митоксантрона гидрохлорида, паклитаксела, пэгаспаргазы, порфимера натрия, прокарбазина гидрохлорида, ритуксимаба, тенипозида, топотекана гидрохлорида, трастузумаба, третиноина, винбластина сульфата, винкристина сульфата и винорельбина тартрата (см., например, с. 867-963 в Шгбпд 2001 Эгид НаийЬоок).

По меньшей мере один иммунодепрессант может быть выбран по меньшей мере из азатиоприна, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба, лимфоцитарного иммуноглобулина, муромонаба СЭ3. микофенолятмофетила, микофенолятмофетила гидрохлорида, сиролимуса и такролимуса. По меньшей мере одна вакцина или анатоксин может быть выбран по меньшей мере из вакцины БЦЖ, вакцины холеры, дифтерийно-столбнячных анатоксинов (адсорбированных), дифтерийно-столбнячных анатоксинов и бес- 16 028304 клеточной коклюшная вакцины адсорбированной, дифтерийно-столбнячных анатоксинов и цельноклеточной коклюшной вакцины, конъюгированных вакцин НаеторЬШик В, вакцины против гепатита А (инактивированной), вакцины против гепатита В (рекомбинантной), вакцины против вируса гриппа 19992000 трехвалентных типов А и В (очищенного поверхностного антигена), вакцины против вируса гриппа 1999-2000 трехвалентных типов А и В (субвирионной или очищенной субвирионной), вакцины против вируса гриппа 1999-2000 трехвалентных типов А и В (полностью вирионной), вакцины против вируса японского энцефалита (инактивированной), вакцины против болезни Лайма (рекомбинантной ОкрА), вакцины против кори, эпидемического паротита и краснухи (живая), вакцины против кори, эпидемического паротита и краснухи (живой ослабленной), вакцины против кори (живой ослабленной), полисахаридной менингококковой вакцины, вакцины против эпидемического паротита (живой), вакцины от чумы, пневмококковой вакцины (поливалентной), полиомиелитной вакцины (инактивированной), полиомиелитной вакцины (живой, пероральной, трехвалентной), вакцины против бешенства (адсорбированной), вакцины против бешенства (человеческие диплоидные клетки), вакцины против краснухи и эпидемического паротита (живой), вакцины против краснухи (живой, ослабленной), столбнячного анатоксина (адсорбированного), столбнячного анатоксина (жидкости), вакцины против брюшного тифа (пероральной), вакцины против брюшного тифа (парентеральной), полисахаридной вакцины против брюшного тифа VI, вакцины против ветряной оспы и вакцины против желтой лихорадки. По меньшей мере один антитоксин или одно противоядие может быть выбрано по меньшей мере из противоядия от укуса паука черная вдова, противоядия от укуса змеи Сго1аШае (поливалентное), дифтерийного антитоксина (лошади) и противоядия против укуса змеи Мюгигик ГнЬШк. По меньшей мере одна иммунная сыворотка может быть выбрана по меньшей мере из иммуноглобулина цитомегаловирусного (внутривенно), иммуноглобулина человеческого против гепатита В (человека), иммуноглобулина внутримышечно, иммуноглобулина внутривенно, иммуноглобулина против бешенства (человека), иммуноглобулина против респираторного синцитиального вируса внутривенно (человека), иммуноглобулина Ρ1ι0 (Ό) (человека), иммуноглобулина ΚΜ(Ό) внутривенно (человека), иммуноглобулина против столбняка (человека) и иммуноглобулина против ветряной оспы. По меньшей мере один модификатор биологического отклика может быть выбран по меньшей мере из альдеслейкина, эпоэтина альфа, филграстима, глатирамера ацетата для инъекций, интерферона альфакон-1, интерферона альфа-2а (рекомбинантного), интерферона альфа-2Ь (рекомбинантного), интерферона бета-1а, интерферона бета-1Ь (рекомбинантного), интерферона гамма-1Ь, левамизола гидрохлорида, опрелвекина и сарграмостима (см., например, с. 964-1040 в Ыигктд 2001 Эгид НаибЬоок).

По меньшей мере одно офтальмологическое противоинфекционное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бацитрацина, хлорамфеникола, ципрофлоксацина гидрохлорида, эритромицина, гентамицина сульфата, офлоксацина 0,3%, полимиксина В сульфата, сульфацетамида натрия 10%, сульфацетамида натрия 15%, сульфацетамида натрия 30%, тобрамицина и видарабина. По меньшей мере одно офтальмологическое противовоспалительное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из дексаметазона, дексаметазона натрия фосфата, диклофенака натрия 0,1%, флуорометолона, флурбипрофена натрия, кеторолака трометамина, преднизолона ацетата (суспензии) и преднизолона натрия фосфата (раствора). По меньшей мере одно миотическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из ацетилхолина хлорида, карбахолина (внутриглазного), карбахолина (местного действия), эхотиофата йодида, пилокарпина, пилокарпина гидрохлорида и пилокарпина нитрата. По меньшей мере одно мидриатическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из атропина сульфата, циклопентолата гидрохлорида, эпинефрина гидрохлорида, эпинефрила бората, гоматропина гидробромида, фенилэфрина гидрохлорида, скополамина гидробромида и тропикамида. По меньшей мере один офтальмологический вазоконстриктор может быть выбран по меньшей мере из нафазолина гидрохлорида, оксиметазолина гидрохлорида и тетрагидрозолина гидрохлорида. По меньшей мере одно прочее офтальмологическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из апраклонидина гидрохлорида, бетаксолола гидрохлорида, бримонидина тартрата, картеолола гидрохлорида, дипивефрина гидрохлорида, дорзоламида гидрохлорида, эмедастина дифумарата, флуоресцеина натрия, кетотифена фумарата, латанопроста, левобунолола гидрохлорида, метипранолола гидрохлорида, натрия хлорида (гипертонического) и тимолола малеата. По меньшей мере одно лекарственное средство для органов слуха может быть выбрано по меньшей мере из борной кислоты, карбамида перекиси, хлорамфеникола и триэтаноламина полипептида олеата конденсата. По меньшей мере одно лекарственное средство для носа может быть выбрано по меньшей мере из беклометазона дипропионата, будесонида, эфедрина сульфата, эпинефрина гидрохлорида, флунизолида, флутиказона пропионата, нафазолина гидрохлорида, оксиметазолина гидрохлорида, фенилэфрина гидрохлорида, тетрагидрозолина гидрохлорида, триамцинолона ацетонида и ксилометазолина гидрохлорида (см., например, с. 1041-97 в Шгктд 2001 Эгид НаибЬоок).

По меньшей мере одно противоинфекционное лекарственное средство местного действия может быть выбрано по меньшей мере из ацикловира, амфотерицина В, крема с азелаиновой кислотой, бацитрацина, бутоконазола нитрата, клиндамицина фосфата, клотримазола, эконазола нитрата, эритромицина, гентамицина сульфата, кетоконазола, мафенида ацетата, метронидазола (местного действия), миконазола нитрата, мупироцина, нафтифина гидрохлорида, неомицина сульфата, нитрофуразона, нистатина, сереб- 17 028304 ра сульфадиазина, тербинафина гидрохлорида, терконазола, тетрациклина гидрохлорида, тиоконазола и толнафтата. По меньшей мере одно противочесоточное или один педикулицид может быть выбрано по меньшей мере из кротамитона, линдана, перметрина и пиретринов. По меньшей мере один кортикостероид местного действия может быть выбран по меньшей мере из бетаметазона дипропионата, бетаметазона валерата, клобетазола пропионата, дезонида, дезоксиметазона, дексаметазона, дексаметазона натрия фосфата, дифлоразона диацетата, флуоцинолона ацетонида, флюоцинонида, флурандренолида, флутиказона пропионата, галцинонида, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, гидрокортизона бутирата, гидрокортизона валерата, мометазона фуроата и триамцинолона ацетонида (см., например, с. 1098-1136 в ΝιίΓδίηβ 2001 Эгид НаибЬоок).

По меньшей мере один витамин или минерал может быть выбран по меньшей мере из витамина А, комплекса витаминов группы В, цианокобаламина, фолиевой кислоты, гидроксокобаламина, лейковорина кальция, ниацина, ниацинамида, пиридоксина гидрохлорида, рибофлавина, тиамина гидрохлорида, витамина С, витамина Э, холекальциферола, эргокальциферола, аналога витамина Э, доксеркальциферола, парикальцитола, витамина Е, аналога витамина К, фитонадиона, натрия фторида, натрия фторида (местного действия), микроэлементов, хрома, меди, йода, марганца, селена и цинка. По меньшей мере одно питательное вещество может быть выбрано по меньшей мере из вливания аминокислот (кристаллических), вливания аминокислот в декстрозе, вливания аминокислот с электролитами, вливания аминокислот с электролитами в декстрозе, вливания аминокислот против печеночной недостаточности, вливания аминокислот против высокого метаболического стресса, вливания аминокислот против почечной недостаточности, декстрозы, жировых эмульсий и триглицеридов со средней цепью (см., например, с. 1137-63 в ΝιίΓδίηβ 2001 Эгид НаибЬоок).

Композиции белковых каркасов по настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно любое пригодное и эффективное количество композиции либо фармацевтической композиции, содержащей белковый каркас, путем реакции либо введения взаимодействующий с клеткой, тканью, органом, животным или пациентом, нуждающимися в такого рода модулировании, лечении или терапии, в некоторых случаях дополнительно содержащей по меньшей мере одно вещество, выбранное из антагониста ΤΝΕ (в частности, химического или белкового антагониста ΤΝΕ, моноклонального или поликлонального антитела либо фрагмента ΤΝΕ, растворимого рецептора ΤΝΕ (например, р55, р70 и р85) или фрагмента, их слитых полипептидов или антагониста ΤΝΡ с малой молекулой, например ΤΝΕсвязующего белка I или II (ТВР-1 или ΤΒΡ-ΙΙ), нерелимонмаба, инфликсимаба, этанерцепта, СЭР-571. СЭР-870, афелимомаба, ленерцепта и т.п.), противоревматического лекарственного средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, натрия ауротиомалата, гидроксихлорохина сульфата, лефлуномида, сульфазалцина), миорелаксанта, наркотика, нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП), анальгетика, обезболивающего, успокоительного, местного обезболивающего, нервно-мышечного блокатора, антимикробного лекарственного средства (например, аминогликозида, противогрибкового, противопаразитарного, противовирусного, карбапенемама, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, другого антимикробного средства), противопсориазного, кортикостероида, анаболического стероида, противодиабетического лекарственного средства, минерала, питательного вещества, связанного с щитовидной железой вещества, витамина, связанного с кальцием гормона, антидиарейного, противокашлевого, противорвотного, противоязвенного, слабительного, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, С-С8Р, нейпогена), сарграмостима (СМ-С8Р, лейкина), иммунизации, иммуноглобулина, иммунодепрессанта (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба), гормона роста, гормонзаместительного лекарственного средства, модулятора рецептора эстрогена, мидриатика, лекарственного средства против циклоплегии, алкилирующего лекарственного средства, антиметаболита, митотического ингибитора, радиофармпрепарата, антидепрессанта, противоманиакального, антипсихотического, анксиолитического, гипнотического, симпатомиметика, стимулятора, донепезила, такрина, лекарственного средства против астмы, бета-агониста, вдыхаемого стероида, ингибитора лейкотриенов, метилксантина, кромолина, эпинефрина или аналога, дорназа альфа (пульмозима), цитокина или антагониста цитокинов. Неограничивающими примерами таких цитокинов являются цитокины с 1Ь-1 по 1Э-28 (1Ь-1, 1Ь-2 и т.д.). Подходящие дозы хорошо известны из уровня техники (см., например, \Уе115 е1 а1., еб8., РкаттасоШетару НаибЬоок, 2'¹ ЕбФои, Арр1е1ои апб Раиде, 81атГотб, СТ (2000); РЭК Ркаттасорое1а, ΤηΗΐδΜη Роске! РЬагтасорое1а 2000, Эе1ихе ЕбДюп, Τа^аδсоη РиЬЮЫпд, Ьота Ьшба, СА (2000), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).

Такие противораковые или противоинфекционные лекарственные средства могут также включать молекулы токсина, которые связаны, соединены, объединены в один препарат или вводятся совместно по меньшей мере с одним белковым каркасом по настоящему изобретению. Токсин может в некоторых случаях воздействовать на патологическую клетку или ткань с целью ее уничтожения. В качестве патологической клетки может выступать раковая или другая клетка. В частности, к таким токсинам относятся очищенный или рекомбинантный токсин либо фрагмент токсина, содержащий по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, например, по меньшей мере выбранный из рицина, дифтерийного токсина, ядовитого токсина или бактериального токсина. Термин токсин также включа- 18 028304 ет эндотоксины и экзотоксины, выделяемые любыми естественными, мутантными или рекомбинантными бактериями либо вирусами, которые могут вызывать любое патологическое состояние у человека и других млекопитающих, включая токсический шок, способный привести к смерти. К таким токсинам относятся, в частности, термолабильный энтеротоксин (ГОТ), термостабильный энтеротоксин энтеротоксигенных (ЗТ) Е. сой, цитотоксин шигелл, энтеротоксины аэромонас, токсин-1 токсического шока (ТЗЗТ-1), энтеротоксин А стафилококков (ЗЕА), В (ЗЕВ) или С (ЗЕС), энтеротоксины стрептококков и т.п. К таким бактериям относятся, в частности, штаммы энтеротоксигенных Е. сой (ЕТЕС), энтерогеморрагических Е. сой (например, штаммы серотипа 0157:Н7), разновидностей стафилококков (например, З!арйу1ососси8 аигеи8, З!арйу1ососси8 руодепе8), разновидностей шигелл (например, ЗЫдейа бухеШепае, §й1де11а Лехпеп, ЗЫдеЛа Ьоубп и §й1де11а 8опие1), разновидностей сальмонелл (например, За1топе11а 1урй1, За1топе11а сйо1ега-8И18, За1топе11а еп!егЙ1б18), разновидностей клостридий (например, С1о8йтбшт регГппдеп8, С1о8йтбшт бйтсйе, С1о8йтбшт Ьо!ийпит), разновидностей кампилобактера (например, Сатрй1оЬас1ег _)е.)ит, Сатрй1оЬас1ег Ге1и8), разновидностей хеликобактера (например, НейоЬас!ет ру1оп), разновидностей аэромонас (например, Аеготопа8 8оЬпа, Аеготопа8 йубгорййа, Аеготопа8 са\аае), разновидностей Р1е18отопа8 8й|де11о1бе8, Уегапа еШегосоййса, У1Ьгю8 (например, У1Ьгю8 сйо1егае, У1Ьгю8 ратайето1уйси8), разновидностей клебсиелл, Р8еиботопа8 аегидто8а и стрептококков. См., например, З!еш, еб., ШТЕРНАЙ МЕБЮМЕ, 3гб еб., рр 1-13, ЬйНе, Вгоип апб Со., Во8!оп, (1990); Еνаη8 е! а1., еб8., Вас!епа1 1пГесйоп8 оГ Нитап8: Ер1бет1о1оду апб Соп!го1, 2б. Еб., рр 239-254, Р1епит Меб1са1 Воок Со., №и Υο^к (1991); Мапбе11 е! а1., Ргтар1е8 апб Ргасйсе оГ 1иГесйои8 Б18еа8е8, 3б. Еб., СйигсйШ ЬМпд8!опе, №и Уο^к (1990); Вегкои е! а1., еб8. Тйе Мегск Мапиа1, 1б!й ебйюп, Мегск апб Со., Райиау Ν.Ι, 1992; \Уооб е! а1., РЕМЗ Мй стоЬю1оду 1ттипо1оду, 76:121-134 (1991); Маггаск е! а1, Заепсе, 248:705-711 (1990), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).

Соединения, композиции или комбинации белковых каркасов по настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно подходящее вспомогательное вещество, в частности разбавитель, связывающее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные разбавители, консервант, адъювант и т.п. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Неограничивающие примеры таких стерильных растворов и способов их получения хорошо известны из уровня техники, в частности описаны в Сеппаго, Еб., РепипдЮпА Рйагтасеийса1 Зс1епсе8, 18!й Ебйюп, Маск РиЬЙ8йт§ Со. (Еа8!оп, РА) 1990. Фармацевтически приемлемые носители можно подобрать обычным способом исходя из способа введения, растворимости и/или стабильности белкового каркаса, фрагмента либо варианта композиции, как хорошо известно из уровня техники или описано в настоящем документе.

К фармацевтическим наполнителям и добавкам, пригодным для использования в настоящей композиции, относятся, в частности, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахар, в том числе моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; производные сахаров, например альдит, альдоновая кислота, этерифицированные сахара и т.п.; полисахариды или полимеры сахара), которые могут присутствовать по отдельности или в комбинации, составляя по отдельности или в комбинации 199,99 % по весу или объему. К белковым наполнителям относятся, в частности, сывороточный альбумин, например человеческий сывороточный альбумин (НЗА), рекомбинантный человеческий альбумин (гНА), желатин, казеин и т.п. К аминокислотным/белковым компонентам, которые также могут использоваться как буфер, относятся, в частности, аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т.п. Одной из предпочтительных аминокислот является глицин.

К углеводным наполнителям, пригодным для использования в изобретении, относятся, в частности, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Б-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелицитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмал и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцитол), миоинозитол и т.п. Предпочтительными углеводными наполнителями для использования в настоящем изобретении являются маннит, трегалоза и раффиноза.

Композиции белкового каркаса могут также включать буфер или рН-регулирующее вещество; как правило, буфером является соль, полученная из органической кислоты или основания. К таким буферам относятся, в частности, соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, углекислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; буферы с трис, трометамина гидрохлоридом, фосфатом. Предпочтительными буферами для использования в настоящих композициях являются соли органических кислот, такие как цитрат.

Кроме того, композиции белкового каркаса по изобретению могут включать полимерные наполнители/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-в-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, ароматизаторы, антимикробные агенты, подсластители, антиоксиданты, антистатики, поверхностно-активные вещества (например, полисорбаты, такие как Тиееп 20 и Тиееп 80), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатные агенты (например, ЕБТА).

- 19 028304

Эти и другие известные фармацевтические наполнители и/или добавки, пригодные для использования в белковом каркасе, его части или вариантах композиций по изобретению, известны из уровня техники, например, указаны в КспипдЮп: Тйе 8с1еисе & РгасИсе оГ Рйагтасу, 19* ей., ^ййатв & ^ййатв, (1995) и Рйувгааи'в Иевк КеГегепсе. 52^||й ей., Мейюа1 Есоиотюв, Мои1уа1е, N1 (1998), каждый вышеуказанный источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки. Предпочтительными носителями или наполнителями являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитрат) или полимерные агенты. Образцовой молекулой-носителем является мукополисахарид, гиалуроновая кислота, которая может быть пригодна для внутрисуставного введения.

Препараты.

Как отмечалось выше, изобретение относится к стабильным препаратам, которые предпочтительно содержат фосфатный буфер с физиологическим раствором или выбранной солью, а также консервированные растворы и препараты, содержащие консервант, а также консервированные препараты для многократного использования, подходящие для применения в фармацевтических или ветеринарных целях, содержащие по меньшей мере один белковый каркас в фармацевтически приемлемом препарате. Консервированные препараты содержат по меньшей мере один известный консервант или в некоторых случаях по меньшей мере один консервант, выбранный из фенола, т-крезола, р-крезола, о-крезола, хлорокрезола, бензилового спирта, фенилртути нитрита, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, магния хлорида (например, гексагидрата), алкилпарабена (метила, этила, пропила, бутила и т.п), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала, полимеров или их смесей в водном разбавителе. Возможно использование любой подходящей концентрации или смеси, известной из уровня техники, например 0,0015% либо любого диапазона, его значения или части. Неограничивающими примерами являются (без консервантов) приблизительно 0,1-2% т-крезола (например, 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,9; 1,0%), приблизительно 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5; 0,9; 1,1; 1,5; 1,9; 2,0; 2,5%), приблизительно 0,001-0,5% тимеросала (например, 0,005; 0,01), приблизительно 0,001-2,0% фенола (например, 0,05; 0,25; 0,28; 0,5; 0,9; 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабенов (например, 0,00075; 0,0009; 0,001; 0,002; 0,005; 0,0075; 0,009; 0,01; 0,02; 0,05; 0,075; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75; 0,9; 1,0%) и т.п.

Как отмечалось выше, изобретение относится к изделию, включающему упаковочный материал и по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного белкового каркаса с указанными буферами и/или консервантами, в некоторых случаях в водном разбавителе, при этом данный упаковочный материал содержит этикетку с указанием, что раствор разрешается хранить в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 ч или дольше. Изобретение также относится к изделию, включающему упаковочный материал, один флакон, содержащий по меньшей мере один лиофилизированный белковый каркас, и второй флакон, содержащий водный разбавитель указанного буфера или консерванта, отличающемуся тем, что упаковочный материал содержит этикетку с указанием для пациента разбавить по меньшей мере один белковый каркас в водном разбавителе для получения раствора, который разрешается хранить в течение 24 ч или дольше.

По меньшей мере один белковый каркас, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть получен рекомбинантным способом, в том числе из клеток млекопитающих или трансгенных препаратов, либо путем очистки других биологических источников, как описано здесь или известно из уровня техники.

Диапазон по меньшей мере одного белкового каркаса в изделии по настоящему изобретению включает объемы, дающие после разбавления в случае сухой/влажной системы концентрации от приблизительно 1,0 мкг/мл до приблизительно 1000 мг/мл, хотя более низкие и высокие концентрации также функциональны и зависят от предполагаемого способа доставки, например введение препарата в виде раствора отличается от введения такими способами, как трансдермальный пластырь, через легкие, через слизистую, осмотический насос или микронасос.

Предпочтительно водный разбавитель в некоторых случаях содержит фармацевтически приемлемый консервант. К предпочтительным консервантам относятся: фенол, т-крезол, р-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и т.п), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, натрия дегидроацетат и тимеросал или их смеси. Концентрация консерванта, используемая в препарате, должна быть достаточна для достижения противомикробного действия. Такая концентрация зависит от выбранного консерванта и будет ясна специалисту.

В некоторых случаях и предпочтительно в разбавитель добавляют другие наполнители, например агенты изотонического действия, буферы, антиоксиданты и средства, усиливающие консервацию. Агенты изотонического действия, например глицерин, широко используются в известных концентрациях. Предпочтительно добавление физиологически приемлемого буфера для улучшения контроля рН. Препараты могут включать широкий диапазон рН, например от приблизительно рН 4 до приблизительно рН 10, предпочтительно от приблизительно рН 5 до приблизительно рН 9 и наиболее предпочтительно от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0. Предпочтительно препараты по настоящему изобретению имеют рН приблизительно от 6,8 до приблизительно 7,8. Предпочтительны фосфатные буферы, наиболее предпочтителен натрия фосфат, в частности забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8).

В некоторых случаях для сокращения агрегации в препараты или композиции могут быть добавле- 20 028304 ны другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые разбавители, например Т\\сеп 20 (полиоксиэтилена (20) сорбитана монолаурат), Т\\ееп 40 (полиоксиэтилена (20) сорбитана монопальмитат), Т\\ееп 80 (полиоксиэтилена (20) сорбитана моноолеат), Ииготс Р68 (блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и РЕО (полиэтиленгликоль) или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 либо полоксамер 184 или 188, поли-Ь Р1иготс®, другие блок-сополимеры и хелаторы, такие как ΕΌΤΆ и ЕОТА. Эти добавки особенно полезны, если для введения препарата используется насос или пластиковый контейнер. Наличие фармацевтически приемлемого поверхностноактивного вещества снижает склонность белка к агрегации.

Препараты по настоящему изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и консерванта, выбранного из группы, состоящей из фенола, т-крезола, р-крезола, о-крезола, хлорокрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метила, этила, пропила, бутила и т.п.), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и консерванта в водном разбавителе осуществляется с использованием обычных процедур растворения и смешивания. Например, чтобы подготовить подходящий препарат, отмеренное количество по меньшей мере одного белкового каркаса в буферном растворе связывают с требуемым консервантом в буферном растворе в количестве, достаточном для получения требуемой концентрации белка и консерванта. Вариации этого процесса хорошо ясны среднему специалисту в данной области техники. Например, для оптимизации с учетом концентрации и способа введения могут быть изменены такие факторы, как порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых получают препарат.

Заявляемые препараты могут поставляться пациентам в виде прозрачных растворов или двухкомпонентных флаконов, где первый флакон содержит по меньшей мере один лиофилизированный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находятся вода, консервант и/или наполнители, предпочтительно фосфатный буфер и/или физиологический раствор и выбранная соль, в водном разбавителе. Как однокомпонентный флакон с раствором, так и двухкомпонентный флакон с раствором, предполагающий смешивание, могут быть использованы многократно и подходят для одного или нескольких циклов лечения пациента, что более удобно по сравнению с существующим в настоящее время подходом.

Заявляемые в настоящем документе изделия пригодны для введения как немедленно, так и в течение 24 ч или дольше. Соответственно заявляемые в настоящем документе изделия обеспечивают значительные преимущества для пациентов. Препараты по изобретению в некоторых случаях могут храниться при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 40°С и сохраняют биологическую активность белка в течение длительных периодов времени, поэтому на этикетке упаковки может быть указано, что раствор разрешается хранить и/или использовать в течение б, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 ч или дольше. Если используется разбавитель с консервантом, то на этикетке может быть указан срок годности до 1-12 месяцев, полугода, полутора лет и/или двух лет.

Растворы по меньшей мере одного белкового каркаса по изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса в водном разбавителе. Смешивание осуществляется с использованием обычных процедур растворения и смешивания. Например, чтобы подготовить подходящий разбавитель, отмеренное количество по меньшей мере одного белкового каркаса в воде или буфере связывают в количестве, достаточном для получения требуемой концентрации белка и в некоторых случаях консерванта или буфера. Вариации этого процесса хорошо ясны среднему специалисту в данной области техники. Например, для оптимизации с учетом концентрации и способа введения могут быть изменены такие факторы, как порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых получают препарат.

Заявляемые изделия могут поставляться пациентам в виде прозрачных растворов или двухкомпонентных флаконов, где первый флакон содержит по меньшей мере один лиофилизированный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находится водный разбавитель. Как однокомпонентный флакон с раствором, так и двухкомпонентный флакон с раствором, предполагающий смешивание, могут быть использованы многократно и подходят для одного или нескольких циклов лечения пациента, что более удобно по сравнению с существующим в настоящее время подходом.

Заявляемые изделия могут поставляться пациентам не напрямую (через аптеки, поликлиники или другие учреждения) в виде прозрачных растворов или двухкомпонентных флаконов, где первый флакон содержит по меньшей мере один лиофилизированный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находится водный разбавитель. В этом случае объем прозрачного раствора может составлять один литр и больше, тем самым обеспечивается большая емкость, из которой аптека или поликлиника может отмерять раствор по меньшей мере одного белкового каркаса однократно или многократно небольшими порциями для переноса во флаконы меньшего размера с целью предоставления своим клиентам и/или пациентам.

К известным устройствам, содержащим однофлаконные системы, относятся, в частности, шприцы- 21 028304 ручки для введения растворов, например ΒΌ Репк, ΒΌ Аи1о|ес1ог®, Нита)ес1®, NονοРеη®, В-Э®Реп, АШоРеп®, апб ОрбРеп®, СепоЧортРеп®®, Сепо1гопогт Реп®, Нита!го Реп®, Кесо-Реп®, КоГегоп Реп®, В|о|ес1ог®, [|ес1®, б-11р №еб1е-Егее 1п)ес1ог®, 1п1га)ес1®, МебМес!®®, например, выпускаемые или изготавливаемые ВесЮп Э|скеп5еп (Фрэнклин Лейкс, Нью-Джерси, ууу.ЬесЮпбюкепкоп.сот), О^етошс (Бургдорф, Швейцария, \у\у\у.б®е1гошс.сот; Вкдеск Портленд, Орегон (\у\у\у.Ыо)ес1.сот); №0опа1 Меб® са1 РгобисК Аек!оп Мебка1 (Питерборо, Великобритания, ууу.уе51оп-теб1са1.сот), Меб®1ес1 Согр (Миннеаполис, Миннесота, ууу.тебуесксот), и аналогичные подходящие устройства. К известным устройствам, содержащим двухфлаконные системы, относятся, в частности, шприцы-ручки для разбавления лиофилизированного лекарственного средства в картридже для введения разбавленного раствора, например НитабоРеп®. К числу других подходящих устройств относятся, в частности, предварительно заполненные шприцы, автоматические инъекционные шприцы, безыгольные инъекционные шприцы и безыгольные наборы для в/в вливания.

Заявляемые в настоящем документе изделия включают упаковочный материал. В дополнение к информации в соответствии с предписаниями контролирующих органов на упаковочном материале также указываются условия, при которых может быть использовано изделие. Упаковочный материал по настоящему изобретению содержит инструкции для пациента по разбавлению по меньшей мере одного белкового каркаса в водном разбавителе для получения раствора и использованию раствора в течение 224 ч или дольше в случае двухфлаконного сухого/влажного изделия. В случае однофлаконного изделия в виде раствора на упаковке указывается, что такой раствор может быть использован в течение 2-24 ч или дольше. Заявляемые в настоящем документе изделия предназначены для использования человеком в фармацевтических целях.

Препараты по настоящему изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и выбранного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, содержащего физиологический раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и буфера в водном разбавителе осуществляется с использованием обычных процедур растворения и смешивания.

Например, чтобы подготовить подходящий препарат, отмеренное количество по меньшей мере одного белкового каркаса в воде или буфере связывают с требуемым буферным веществом в воде в количестве, достаточном для получения требуемой концентрации белка и буфера. Вариации этого процесса хорошо ясны среднему специалисту в данной области техники. Например, для оптимизации с учетом концентрации и способа введения могут быть изменены такие факторы, как порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых получают препарат.

Заявляемые стабильные или консервированные препараты могут поставляться пациентам в виде прозрачных растворов или двухкомпонентных флаконов, где первый флакон содержит лиофилизированный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находится консервант или буфер и наполнители в водном разбавителе. Как однокомпонентный флакон с раствором, так и двухкомпонентный флакон с раствором, предполагающий смешивание, могут быть использованы многократно и подходят для одного или нескольких циклов лечения пациента, что более удобно по сравнению с существующим в настоящее время подходом.

Другие препараты или способы стабилизации белкового каркаса могут дать результаты, отличающиеся от прозрачного раствора лиофилизированного порошка, содержащего белковый каркас. К непрозрачным растворам относятся, в частности, препараты, содержащие взвешенные частицы, которые являются композициями, содержащими белковый каркас в структуре переменной размерности, и известны как микросферы, микрочастицы, наночастицы, наносферы или липосомы. Такие относительно однородные, в целом, сферические препараты в виде частиц, содержащие активное вещество, могут быть получены путем связывания водной фазы, содержащей активное вещество и полимер, с неводной фазой с последующим испарением неводной фазы и соединением частиц из водной фазы, как описано в патенте США № 4589330. Пористые микрочастицы могут быть получены, если в качестве первой фазы использовать суспензию, содержащую активное вещество и полимер, диспергированные в непрерывно действующем разбавителе, и удалить указанный разбавитель из суспензии методом сублимационной сушки или разбавления, экстрагирования и осаждения, как описано в патенте США № 4818542. Предпочтительными полимерами для таких препаратов являются естественные или синтетические сополимеры либо полимеры, выбранные из желатинового агара, крахмала, арабиногалактана, альбумина, коллагена, полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты, гликолид-Ь(-)лактида поли(эпсилонкапролактона), поли(эпсилонкапролактон-СО-молочной кислоты), поли(эпсилонкапролактон-СО-гликолевой кислоты), поли(в-гидроксимасляной кислоты), полиэтиленоксида, полиэтилена, поли(алкил-2-цианакрилата), поли (гидроксиэтилметакрилата), полиамидов, поли(аминокислот), поли(2-гидроксиэтил ОЬ-аспартамида), поли(эфира мочевины), поли(Ь-фенилаланин/этиленгликоль/1,6-диизоцианатогексана) и поли(метилметакрилата). Наиболее предпочтительными полимерами являются полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, гликолид-Ь(-) лактид поли(эпсилон-капролактон), поли(эпсилон-капролактон-СО-молочная кислота) и поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевая кислота). К

- 22 028304 разбавителям, пригодным для растворения полимера и/или активного вещества, относятся вода, гексафторизопропанол, метиленхлорид, тетрагидрофуран, гексан, бензол или гексафторацетона полуторагидрат. Процесс диспергирования содержащей активное вещество фазы с помощью второй фазы может включать принудительный пропуск первой фазы через отверстие в сопле для получения каплеобразной формы.

Препараты в виде сухого порошка могут быть получены способами помимо лиофилизации, например путем распылительной сушки, экстрагирования разбавителя испарением либо осаждения кристаллической композиции, за которыми следуют одно или несколько действий по удалению водного или неводного разбавителя. Подготовка препарата белкового каркаса путем распылительной сушки описана в патенте США № 6019968.

Композиции белкового каркаса в виде сухого порошка могут быть получены путем распылительной сушки растворов или суспензий белкового каркаса и в некоторых случаях наполнителей в разбавителе при условиях, обеспечивающих получение вдыхаемого сухого порошка. В качестве разбавителей могут быть использованы, в частности, полярные соединения, такие как вода и этанол, которые можно легко высушить. Стабильность белковых каркасов может быть повышена, если процедуры распылительной сушки проводятся в отсутствии кислорода, например, под азотной подушкой или с помощью азота в качестве сушильного газа. Другой препарат в виде относительно сухого порошка получают диспергированием множества перфорированных микроструктур в суспензионной среде, обычно содержащей пропеллент гидрофторалкан, как описано в νθ 9916419. Стабилизированный диспергированный препарат может быть введен в легкие пациента с помощью ингалятора отмеренных доз. Оборудование, пригодное для коммерческого производства лекарственного средства путем распылительной сушки, выпускается ВисЫ Ыб. или Νίτο Согр.

По меньшей мере один белковый каркас в виде стабильного или консервированного препарата или раствора, как описано здесь, может быть введен пациенту в соответствии с настоящим изобретением с помощью различных способов, включая подкожные или внутримышечные инъекции, трансдермальный, через легкие, через слизистую, имплантат, осмотический насос, картридж, микронасос или другие средства, ясные специалисту, как хорошо известно из уровня техники.

Терапевтическое применение.

Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения заболеваний в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, как известно из уровня техники или описано здесь, с использованием по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению, например посредством взаимодействия терапевтически эффективного количества белкового каркаса с клеткой, тканью, органом, животным или пациентом путем введения либо реакции. Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения заболеваний в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранных из ожирения, иммунного заболевания, сердечнососудистого заболевания, инфекционного заболевания, злокачественного заболевания или неврологического заболевания.

Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного иммунного заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного и: ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита в системной форме в начальной стадии, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, язвы желудка, серонегативных артропатий, остеоартроза, остеолиза, асептического расшатывания ортопедических имплантатов, воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, системной красной волчанки, антифосфолипидного синдрома, иридоциклита/увеита/неврита зрительного нерва, идиопатического легочного фиброза, системного васкулита/гранулематоза Вегенера, саркоидоза, орхита/обратной операции при вазэктомии, аллергических/атопических заболеваний, астмы, аллергического ринита, экземы, аллергического контактного дерматита, аллергического конъюнктивита, пневмонита на фоне гиперчувствительности, заболеваний, связанных с пересадкой органов, отторжения пересаженных органов, болезни трансплантат против хозяина, синдрома системной воспалительной реакции, синдрома сепсиса, грамположительного сепсиса, грамотрицательного сепсиса, отрицательного в культуре сепсиса, грибкового сепсиса, нейтропенической лихорадки, уросепсиса, менингококцемии, травмы/кровотечения, ожогов, ионизирующего облучения, острого панкреатита, респираторного дистресссиндрома взрослых, ревматоидного артрита, алкогольного гепатита, хронических воспалительных патологий, саркоидоза, болезни Крона, серповидно-клеточной анемии, диабета, нефроза, атопических заболеваний, реакций гиперчувствительности, аллергического ринита, сенной лихорадки, перениального ринита, конъюнктивита, эндометриоза, астмы, крапивницы, системной анафилаксии, дерматита, злокачественной анемии, гемолитических заболеваний, тромбоцитопении, отторжения трансплантата органа или ткани, отторжения трансплантата почки, отторжения трансплантата сердца, отторжения трансплантата печени, отторжения трансплантата поджелудочной железы, отторжения трансплантата легкого, отторжения трансплантата костного мозга, отторжения аллотрансплантата кожи, отторжения трансплантата хряща, отторжения трансплантата кости, отторжения трансплантата тонкой кишки, отторжения имплантата тимуса плода, отторжения трансплантата паращитовидных желез, отторжения ксенотрансплантата орга- 23 028304 на или ткани, отторжения аллотрансплантата, реакций гиперчувствительности с участием антирецепторов, болезни Грейвса, болезни Рейно, инсулиннезависимого диабета 2-го типа, астмы, миастении, антитело-опосредованной цитотоксичности, реакций гиперчувствительности типа III, РОЕМ§-синдрома (полинейропатии, органомегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии и синдрома изменения кожи), полиневропатии, органомегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии, синдрома изменения кожи, антифосфолипидного синдрома, пузырчатки, склеродермии, смешанного заболевания соединительной ткани, идиопатической болезни Аддисона, сахарного диабета, хронического активного гепатита, первичного билиарного цирроза, витилиго, васкулита, посткардиотомного синдрома после ИМ, гиперчувствительности типа IV, контактного дерматита, пневмонита на фоне гиперчувствительности, отторжения аллотрансплантата, гранулемов на фоне внутриклеточных организмов, чувствительности к лекарственному средству, метаболического/идиопатического заболевания, болезни ВильсонаКоновалова, гемохроматоза, дефицита альфа-1-антитрипсина, диабетической ретинопатии, тиреоидита Хашимото, остеопороза, оценки гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, первичного билиарного цирроза, тиреоидита, энцефаломиелита, кахексии, кистозного фиброза, неонатального хронического заболевания легких, хронической обструктивной болезни легких (СОРЭ), семейного гемофагоцитарного лимфоцитарного гистиоцитоза, дерматологических состояний, псориаза, облысения, нефротического синдрома, нефрита, клубочкового нефрита, острой почечной недостаточности, гемодиализа, уремии, токсичности, преэклампсии, терапии ОКТ3, терапии анти-СО3, цитокин-терапии, химиотерапии, лучевой терапии (в частности, астении, анемии, кахексии и т.п.)/ хронической интоксикации салицилатами и т.п. (см., например, Мегск Маииа1, 12-17Ш ЕбЩоик, Мегск & Сотраиу, КаНгоау, ΝΙ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), РНагтасоШегару НаибЬоок, Уе11к е! а1., ебк., 8есоиб Ебйгои, Арр1е!ои аиб Ьаиде, ШатГогб, Соии. (1998, 2000), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).

Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного сердечно-сосудистого заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного из синдрома снижения сердечной активности, инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности, инсульта, ишемического инсульта, кровоизлияния, острого коронарного синдрома, артериосклероза, атеросклероза, рестеноза, диабетического артериосклероза, гипертонии, артериальной гипертензии, вазоренальной гипертензии, обморока, шока, сифилиса сердечнососудистой системы, сердечной недостаточности, легочного сердца, первичной легочной гипертензии, сердечной аритмии, предсердной экстрасистолы, трепетания предсердий, фибрилляции предсердий (постоянной или пароксизмальной), постперфузионного синдрома, воспаления на фоне искусственного кровообращения, хаотической или мультифокальной предсердной тахикардии, регулярной тахикардии с узкими ЦК§-комплексами, специфических аритмий, фибрилляции желудочков, аритмий пучка Г иса, атриовентрикулярной блокады, блокады ножки пучка Гиса, ишемических нарушений миокарда, ишемической болезни сердца, стенокардии, инфаркта миокарда, кардиомиопатии, дилатационной застойной кардиомиопатии, рестриктивной кардиомиопатии, пороков сердца, эндокардита, заболевания перикарда, сердечных опухолей, аневризмов аорты и периферийных артерий, расслоения аорты, воспаления аорты, окклюзии брюшной аорты и ее ветвей, периферических сосудистых расстройств, окклюзионных расстройств артериального кровообращения, атеросклеротического заболевания периферических артерий, облитерирующего тромбангиита, функциональных расстройств периферических артерий, явления и болезни Рейно, акроцианоза, эритромелалгии, венозных заболеваний, венозного тромбоза, варикозных вен, артериовенозной фистулы, лимфедемы, жирового отека, нестабильной стенокардии, реперфузионного повреждения, синдрома полиорганной недостаточности после искусственного кровообращения, ишемически-реперфузионного повреждения и т.п. Такой способ может в некоторых случаях включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, в клетки, ткани, органы, животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия.

Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного инфекционного заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного из острой или хронической бактериальной инфекции, острых и хронических паразитарных или инфекционных процессов, включая бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, ВИЧ-инфекции/ВИЧ-невропатии, менингит, гепатит (например, А, В или С и т.п.), септический артрит, перитонит, пневмонию, эпиглоттит, е. сой 0157:Н7, гемолитический уремический синдром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, малярию, геморрагическую лихорадку Денге, лейшманиоз, проказу, синдром токсического шока, стрептококковый миозит, газовую гангрену, микобактериальный туберкулез, тусоЬас!егшт аушт т1гасе11и1аге, пневмоцистную пневмонию, воспалительное заболевание тазовых органов, орхит/эпидидимит, легионеллы, болезнь Лайма, грипп типа а, вирус Эпштейна-Барра, вирус-ассоциированный гемафагоцитарный синдром, вирусный энцефалит/асептический менингит и т.п.

Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного злокачественного заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного из лейкоза, острого лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (АЬЬ), ост- 24 028304 рого лимфоцитарного лейкоза, В-клеточного, Т-клеточного или РАВ АЬЬ, острого миелолейкоза (АМЬ), острого миелогенного лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза (СМЬ), хронического лимфолейкоза (СЬЬ), волосатоклеточного лейкоза, миелодиспластического синдрома (МЭ8), лимфомы, болезни Ходжкина, злокачественной лимфомы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта, множественной миелома, саркомы Капоши, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака носоглотки, злокачественного гистиоцитоза, паранеопластического синдрома/гиперкальциемии при злокачественных новообразованиях, солидных опухолей, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака эндометрия, рака головы, рака шеи, наследственного неполипозного рака, лимфомы Ходжкина, рака печени, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака простаты, почечно-клеточного рака, рака яичек, аденокарциномов, сарком, злокачественной меланомы, гемангиомы, метастаз, связанной с раком резорбции костей, связанных с раком болей в костях и т.п. Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного неврологического заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере одного из следующего ряда: нейродегенеративные заболевания, рассеянный склероз, мигрень, СПИД-дементный комплекс, демиелинизирующие заболевания, например рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидные и мозжечковые расстройства, например поражения кортико-спинальной системы; заболевания базальных ганглиев; гиперкинетические двигательные расстройства, например хорея Хантингтона и старческая хорея; медикаментозные двигательные расстройства, например, вызванные лекарственными средствами, которые блокируют рецепторы дофамина ЦНС; гипокинетические двигательные расстройства, например болезнь Паркинсона; прогрессирующий надъядерный паралич; структурные поражения мозжечка; спиноцеребеллярные дегенерации, например спинная атаксия, атаксия Фридрейха, церебеллярные кортикальные дегенерации, дегенерации множественных систем (Мепсе1, □е)еппе-Т1юта8, 8Ш-Огадег и МасЬабо-1о8ерЬ); системные нарушения (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телеангиэктазия и митохондриальные расстройства множественных систем); демиелинизирующие заболевания мозга, например рассеянный склероз, острый поперечный миелит; расстройства моторной единицы, например нейрогенная мышечная атрофия (дегенерация клеток переднего рога спинного мозга, например боковой амиотрофический склероз, инфантильная спинальная мышечная атрофия и ювенильная спинальная мышечная атрофия); болезнь Альцгеймера; синдром Дауна в среднем возрасте; заболевание с диффузными тельцами Леви; сенильная деменция, ассоциированная с тельцами Леви; синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейтцфельдта-Якоба; подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Халлеррордена-Шпатца; деменция боксеров; нейротравмы (например, травма спинного мозга, черепно-мозговая травма, сотрясение мозга, повторное сотрясение мозга); боль; воспалительные боли; аутизм; депрессия; инсульт; когнитивные расстройства; эпилепсия и т.п. Такой способ может в некоторых случаях включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело к ΊΝΡ, указанную часть или вариант, в клетки, ткани, органы, животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия См., например, Мегск Мапиа1, 16'¹' ЕбШоп, Мегск & Сотрапу, КаЬтеау, N1 (1992).

Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одной раны, травмы, повреждения тканей или связанного хронического состояния в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере одного из следующего ряда: телесные повреждения или травмы, связанные с челюстно-лицевой хирургией, в том числе хирургией пародонта, удаление зубов, эндодонтическое лечение, установка зубных имплантатов, применение и использование зубного протеза; или раны из следующего ряда: асептические раны, ушибы, резаные раны, рваные раны, непроникающие раны, открытые раны, проникающие раны, сквозные раны, колотые раны, гнойные раны, инфаркты и подкожные раны; или раны из следующего ряда: ишемические язвы, пролежни, свищи, сильные укусы, термические ожоги и раны донорского участка; или раны, являющейся афтозной раной, травматической раной или герпес-ассоциированной раной.

Раны и/или язвы обычно выступают на коже или на поверхности слизистой оболочки либо возникают в результате инфаркта в органе. Рана может являться результатом повреждения мягких тканей, поражения или основного заболевания. В данном контексте термин кожа относится к внешней поверхности тела животных, в том числе человека, и включает неповрежденную или почти неповрежденную кожу, а также поврежденную поверхность кожи. Термин слизистая оболочка относится к неповрежденной или поврежденной слизистой оболочке животных, например, человека, и включает слизистую оболочку рта, щек, ушей, носа, легких, глаз, желудочно-кишечного тракта, вагинальную и прямой кишки.

В данном контексте термин рана означает телесные повреждения с нарушением нормальной целостности тканевых структур. Этот термин также включает понятия кожная болезнь, поражение, некроз и язва. Распространенный термин кожная болезнь обычно означает практически любое поражение кожи или слизистых оболочек, а термин язва является локальным дефектом, полостью на поверхности органа или ткани, которая возникает в результате отторжения некротических тканей. Поражение в целом относится к любому дефекту ткани. Некроз относится к ткани, омертвевшей в результате инфекции, травмы, воспаления или инфарктов.

- 25 028304

Термин рана в данном контексте означает любую рану (см. классификацию ран ниже) на любом отдельном этапе процесса заживления, в том числе на этапе до начала лечения или даже нанесения специальной раны, например, хирургического разреза (профилактическое лечение). Настоящее изобретение предназначено для предотвращения и/или лечения, например, следующих ран: асептические раны, ушибы, резаные раны, рваные раны, непроникающие раны (т.е. раны без нарушения кожи, но с повреждением нижележащих структур), открытые раны, проникающие раны, сквозные раны, колотые раны, гнойные раны, подкожные раны и т.д. Примерами кожных болезней являются пролежни, афтозные стоматиты, хромовые язвы, герпес и т.д. Примерами язв являются язвенная болезнь, язва двенадцатиперстной кишки, язва желудка, подагрическая язва, диабетическая язва, гипертоническая ишемическая язва, варикозная язва, язва нижних конечностей (венозная язва), подъязычная язва, подслизистая язва, симптоматическая язва, трофическая язва, тропическая язва и венерическая язва, например, вызванная гонореей (в том числе уретрит, эндоцервицит и проктит). К состояниям, связанным с ранами или кожными болезнями, которые могут успешно излечиваться с помощью изобретения, относятся ожоги, сибирская язва, столбняк, газовая гангрена, скарлатина, рожа, сикоз, фолликулит, контагиозное импетиго или буллезное импетиго и т.д. Термины рана и язва, а также рана и кожная болезнь часто используются для обозначения одного и того же состояния; эти термины также часто являются взаимозаменяемыми без какойлибо последовательности. Поэтому, как упоминалось выше, в данном контексте термин рана включает термины язва, поражение, кожная болезнь и инфаркт, причем, если не указано иного, эти термины являются взаимозаменяемыми.

Типы ран, поддающихся лечению с помощью изобретения, также включают (I) общие раны, например, хирургические, травматические, инфекционные, ишемические, тепловые, химические и буллезные раны; (II) раны, специфические для полости рта, например, возникающие после удаления, эндодонтические раны, особенно связанные с лечением кист и абсцессов, язвы и поражения бактериального, вирусного или аутоиммунного генеза, механические, химические, тепловые, инфекционные и лихеноидные раны, герпес, афтозный стоматит, острый некротизирующий язвенный гингивит и синдром жжения полости рта; а также (III) раны на коже, например, неоплазмы, ожоги (например, химические, тепловые), поражения (бактериальные, вирусные, аутоиммунные), укусы и хирургические разрезы. Согласно другой классификации раны разделяются на (ί) небольшие потери ткани в связи с хирургическими разрезами, небольшими ссадинами и мелкими укусами и (II) значительные потери ткани. В последнюю группу входят ишемические язвы, пролежни, свищи, рваные раны, сильные укусы, тепловые ожоги, раны донорского участка (в мягких и твердых тканях) и инфаркты.

В связи с настоящим изобретением важное значение также имеют такие раны, как ишемические язвы, пролежни, свищи, сильные укусы, тепловые ожоги и раны донорского участка. Ишемические язвы и пролежни - это раны, которые обычно заживают очень медленно, и в таких случаях улучшение и ускорение процесса заживления очень важны для пациента. Кроме того, когда заживление улучшается и ускоряется, стоимость лечения пациентов, страдающих от таких ран, заметно снижается.

Раны донорского участка - это раны, возникающие, к примеру, в связи с переносом твердых тканей из одной части тела в другую, например в результате трансплантации. Раны, возникающие в результате таких операций, крайне болезненны, поэтому задача улучшения лечения является исключительно важной. Термин кожа используется в очень широком смысле и включает эпидермальный слой кожи, а в тех случаях, когда поверхность кожи повреждена в той или ной степени, также дермальный слой кожи. Не считая рогового слоя, эпидермальный слой кожи является внешним (эпителиальным) слоем, а более глубокий слой соединительной ткани кожи называется дермой.

Любой способ по настоящему изобретению может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, в клетки, ткани, органы, животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия. Такой способ в некоторых случаях включает совместное введение или комбинированную терапию для лечения таких заболеваний или расстройств, при которых до, во время и/или после введения по меньшей мере одного указанного белкового каркаса, его указанной части или варианта дополнительно вводится по меньшей мере одно лекарственное средство из следующего ряда: антагонист ΤΝΡ (в частности, химический или белковый антагонист ΤΝΡ, моноклональное или поликлональное антитело либо фрагмент ΤΝΡ, растворимый рецептор ΤΝΡ (например, р55, р70 и р85) или фрагмент, их слитые полипептиды или антагонист ΤΝΡ с малой молекулой, например ΤΝΡ-связующий белок I или II (ТВР-1 или ΤΒΡ-Π), нерелимонмаб, инфликсимаб, этанерцепт (ЕиЬге1™), адалимумаб (Нитка™), СОР571, СЭР-870, афелимомаб, ленерцепт и т.п.), противоревматическое лекарственное средство (например, метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, натрия ауротиомалат, гидроксихлорохина сульфат, лефлуномид, сульфазалцин), миорелаксант, наркотик, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП), анальгетик, обезболивающее, успокоительное, местное обезболивающее, нервномышечный блокатор, антимикробное лекарственное средство (например, аминогликозид, противогрибковое, противопаразитарное, противовирусное, карбапенемам, цефалоспорин, фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин, другое антимикробное), противопсориазное, кортикостероид, анаболический стероид, противодиабетическое лекарственное средство, минерал, питательное вещество,

- 26 028304 связанное с щитовидной железой вещество, витамин, связанный с кальцием гормон, антидиарейное, противокашлевое, противорвотное, противоязвенное, слабительное, антикоагулянт, эритропоэтин (например, эпоэтин альфа), филграстим (например, С-С8Р, нейпоген), сарграмостим (СМ-С8Р, лейкин), иммунизация, иммуноглобулин, иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон роста, гормон-заместительное лекарственное средство, модулятор рецептора эстрогена, мидриатик, лекарственное средство против циклоплегии, алкилирующее лекарственное средство, антиметаболит, митотический ингибитор, радиофармпрепарат, антидепрессант, противоманиакальное, антипсихотическое, анксиолитическое, гипнотическое, симпатомиметик, стимулятор, донепезил, такрин, лекарственное средство против астмы, бета-агонист, вдыхаемый стероид, ингибитор лейкотриенов, метилксантин, кромолин, эпинефрин или аналог, дорназа альфа (пульмозим), цитокин или антагонист цитокинов. Подходящие дозы хорошо известны из уровня техники (см., например, \Уе11к с1 а1., е4к., РЬаттасоШетару Наи4Ьоок, 2'¹ Εάίίίοη, Лрр1е1оп аи4 Раиде, 5>1атГог4. СТ (2000); ΡΌΚ РНагтасорое1а. Тагаксои Роске! РЬаттасорое1а 2000, Ое1и\е Е4Шоп, Тагаксои РиЬЬкЫид, Ьота Ьш4а, СА (2000); Ыигетд 2001 Наи4Ьоок оГ Эгидк, 21^к1 е4Шои, §ргшдЬоике Согр., §ргшдЬоике, РА, 2001; НеаИЬ РгоГеккюиаГк Эгид Ош4е 2001, еТ, §Ьаииои, УПкои, §1аид, РгеиДсе-НаП, 1ис, Иррет §а441е Ищет, N1., каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).

Цитокины включают любые известные цитокины (см., например, Соре\\Ы1Су1октек.сот). Антагонисты цитокинов включают, в частности, белковый каркас, антитело, фрагмент или миметик, растворимый рецептор, фрагмент или миметик, антагонист с малой молекулой или их комбинацию.

Как правило, лечение патологических состояний осуществляется путем введения эффективного количества или дозы по меньшей мере композиции белкового каркаса, которая в среднем содержит по меньшей мере приблизительно 0,01-500 мг по меньшей мере одного белкового каркаса на килограмм пациента за одну дозу и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,1-100 мг белкового каркаса на килограмм пациента за одно или несколько введений в зависимости от конкретного действия активного вещества, содержащегося в композиции. Кроме того, эффективная концентрация в сыворотке может составлять 0,1-5000 мкг/мл сыворотки за одно или несколько введений. Подходящие дозы известны медицинским специалистам и, разумеется, зависят от конкретного патологического состояния, конкретного действия вводимой композиции и конкретного пациента, подвергающегося лечению. В некоторых случаях для достижения требуемого терапевтического количества может потребоваться неоднократное введение, т.е. неоднократные отдельные введения особой мониторируемой или отмеренной дозы, повторяющиеся до достижения требуемой суточной дозы или эффекта.

Предпочтительные дозы могут в некоторых случаях содержать приблизительно 0,1-99 и/или 100500 мг/кг за одно введение либо любой диапазон, его значение или часть либо могут быть направлены на достижение концентрации в сыворотке приблизительно 0,1-5000 мкг/мл за одно или несколько введений либо любой диапазон, его значение или часть. Предпочтительный диапазон дозировки для белкового каркаса по настоящему изобретению составляет от приблизительно 1 до приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 6 или приблизительно 12 мг/кг массы тела пациента.

Кроме того, вводимая доза может варьироваться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного вещества, режим и способ его введения, возраст, состояние здоровья и вес пациента, характер и масштаб симптомов, характер проводимого параллельно лечения, частота лечения и требуемый эффект. Обычно доза активного вещества составляет приблизительно 0,1-100 мг на килограмм веса тела. Для достижения желаемых результатов обычно достаточно 0,1-50 мг и предпочтительно 0,1-10 мг на килограмм за одно введение или в форме длительного действия.

Неограничивающим примером является лечение людей или животных путем однократного или периодического введения по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению в количестве приблизительно 0,1-100 мг/кг или любого диапазона, его значения или части в день по меньшей мере в один из дней 1-40 или в качестве альтернативы либо дополнительно по меньшей мере в одну из недель 1-52 или в качестве альтернативы либо дополнительно по меньшей мере в один из 1-20 лет (возможно любое сочетание временных сроков) с использованием однократного введения, в/в вливания или неоднократного введения.

Лекарственные формы (композиция), пригодные для внутреннего введения, обычно содержат от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 500 мг активного вещества на единицу или контейнер. В этих фармацевтических композициях активное вещество обычно присутствует в количестве приблизительно 0,5-99,999% в пересчете на общую массу композиции.

Для парентерального введения белковый каркас может быть приготовлен в виде раствора, суспензии, эмульсии, частиц, порошка или лиофилизированного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем или может поставляться раздельно с таким носителем. Примерами таких носителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и человеческий сывороточный альбумин приблизительно 1-10%. Возможно также использование липосом и неводных наполнителей, таких как жирные масла. Наполнитель или лиофилизированный порошок может содержать добавки, способствующие изотонности (например, хлорид натрия, маннит) и химической ста- 27 028304 бильности (например, буферы и консерванты). Препарат стерилизуется известными или приемлемыми способами.

Приемлемые фармацевтические носители описаны в последнем издании Кеш1п§1оп'к РНагтасси11са1 8с1епсек, А. Око1, которое является наиболее авторитетным источником в данной области техники.

Альтернативные способы введения.

В соответствии с настоящим изобретением для введения фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению могут быть использованы многие известные и разработанные способы. Далее описано ингаляционное введение, однако в соответствии с настоящим изобретением также могут быть использованы другие способы введения, дающие приемлемые результаты. Белковые каркасы по настоящему изобретению могут доставляться в носителе в виде раствора, эмульсии, коллоида, суспензии или сухого порошка, с помощью разнообразных устройств и способов, пригодных для введения ингаляционным или другим способом, описанным здесь либо известным из уровня техники.

Парентеральные препараты и введение.

Препараты для парентерального введения могут в качестве общих наполнителей содержать стерильную воду, физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и т.п. Водные или масляные суспензии для инъекций могут быть получены с помощью соответствующего эмульгатора или увлажнителя и суспендирующего вещества с использованием известных способов. Для инъекций могут быть использованы нетоксичные разбавители, не предназначенные для перорального введения, например водный раствор, стерильный раствор для инъекций или суспензия в разбавителе. В качестве носителя или разбавителя допускается использовать воду, раствор Рингера, изотонический физиологический раствор и т.д.; в качестве обычного разбавителя или суспендирующего разбавителя может быть использовано стерильное нелетучее масло. Для этих целей допускается использовать любого рода нелетучее масло и жирную кислоту, включая естественные, синтетические и полусинтетические жирные масла или жирные кислоты, естественные, синтетические и полусинтетические моно-, ди- и триглицериды. Парентеральное введение известно из уровня техники и осуществляется, в частности, с помощью традиционных видов инъекций, пневматического безыгольного инъекционного устройства, описанного в патенте США № 5851198, и лазерного перфоратора, как описано в патенте США № 5839446; каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.

Альтернативные способы доставки.

Изобретение также относится к введению по меньшей мере одного белкового каркаса следующими способами: парентеральный, подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрисуставный, внутрибронхиальный, внутрибрюшной, интракапсулярный, внутрихрящевой, внутриполостной, интрацелиальный, интрацеребеллярный, интрацеребровентрикулярный, внутрь толстой/ободочной кишки, интрацервикальный, внутрижелудочный, внутрипеченочный, интрамиокардиальный, внутрикостный, внутритазовый, интраперикардиальный, внутрибрюшинный, внутриплевральный, внутрипростатический, внутрилегочный, интраректальный, интраренальный, интраретинальный, интраспинальный, интрасиновиальный, внутригрудный, внутриматочный, интравезикулярный, внутрь пораженных тканей, болюсный, вагинальный, ректальный, буккальный, сублингвальный, интраназальный или трансдермальный. По меньшей мере одна композиция белкового каркаса может быть приготовлена к использованию для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) или любого другого введения, в частности в виде жидких растворов или суспензий; для вагинального или ректального введения, в частности в полутвердых формах, в том числе в виде кремов и суппозиториев; для буккального или сублингвального введения, в частности в виде таблеток или капсул; для интраназального введения, в частности в виде порошков, капель или аэрозолей в нос либо определенных веществ; для трансдермального введения, в частности в виде геля, мази, лосьона, суспензии или пластыря с химическими усиливающими веществами, такими как диметилсульфоксид, добавленными с целью изменить структуру кожи или увеличить концентрацию препарата в трансдермальном пластыре (.Типдтдег, е1 а1. 1п Эгид Регтеабоп ЕпНапсетепГ; Нк1еН, Ό. 8., Ебк., 59-90 (Магсе1 Эеккег. 1пс. Ыете Уогк 1994, источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки), с окисляющими веществами, позволяющими применять на коже препараты с содержанием белков и пептидов (\УО 98/53847), с применением электрического поля для создания промежуточных путей доставки, например путем электропорации, для ускорения движения заряженных лекарственных средств через кожу, например путем ионофореза, применения ультразвука, например сонофореза (патенты США №№ 4309989 и 4767402) (вышеуказанные публикации и патенты полностью включены в текст настоящего документа путем ссылки).

Легочное/назальное введение.

При легочном введении предпочтительно по меньшей мере одна композиция белкового каркаса доставляется в виде частиц, размер которых достаточен для проникновения в нижние дыхательные пути легких или синусы. В соответствии с изобретением по меньшей мере один белковый каркас может быть доставлен с помощью разнообразных ингаляционных или назальных устройств для введения лекарственного средства при вдыхании, известных из уровня техники. Такие устройства, предназначенные для

- 28 028304 доставки аэрозольных препаратов в полости синуса или альвеолы пациента, включают ингаляторы отмеренных доз, небулайзеры, генераторы сухого порошка, распылители и т.п. Из уровня техники также известны другие устройства, пригодные для легочного или назального введения белковых каркасов. Все устройства такого рода могут доставлять препараты, подходящие для введения белкового каркаса в виде аэрозоля. Такие аэрозоли могут содержать либо растворы (как водные, так и неводные), либо твердые частицы.

Ингаляторы отмеренных доз, например УеШоЪп®, как правило, задействуют пропеллент и должны приводиться в действие во время вдоха (см., например, \У0 94/16970, \У0 98/35888). Порошковые ингаляторы, например ТигЪиЪа1ег™ (А81га), Ко1ака1ег® (О1ахо), Οίχίαιχ® (О1ахо), δρίιυχ™ (Иига), устройства, поставляемые 1пка1е Ткегареи11с8, и порошковые ингаляторы §р1пЬа1ег® (Охопх), приводятся в действие дыханием и подают смешанный порошок (И8 4668218 Ах1га, ЕР 237507 Ах1га, \У0 97/25086 О1ахо, \У0 94/08552 Эига, И8 5458135 1пЬа1е, \У0 94/06498 Р1хоп8, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки). Небулайзеры, например АЕКх™ АгаЛдш, небулайзер иНгауеШ® (МаШпскгой!) и небулайзер Асогп II® (Магсщех! Мейюа1 Ргойис(х) (И8 5404871 АгаЛдш, \У0 97/22376) (вышеуказанные источники полностью включены в текст настоящего документа путем ссылки), подают аэрозоли из растворов, тогда как ингаляторы отмеренных доз, порошковые ингаляторы и т.д. подают аэрозоли с мелкими частицами. Эти имеющиеся в продаже ингаляционные устройства приведены в качестве примеров конкретных устройств, пригодных для применения настоящего изобретения, и не ограничивают объем изобретения.

Предпочтительно композиция, включающая по меньшей мере один белковый каркас, доставляется с помощью порошкового ингалятора или распылителя. Ингаляционное устройство для введения по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению отличается рядом преимуществ. Например, доставка с помощью ингаляционного устройства характеризуется надежностью, воспроизводимостью и точностью. Для улучшения вдыхания ингаляционное устройство может в некоторых случаях доставлять малые сухие частицы, например менее приблизительно 10 мкм, желательно приблизительно 1-5 мкм.

Введение композиций белкового каркаса в виде спрея.

Спрей, содержащий композицию белкового каркаса, может быть получен путем принудительного пропуска суспензии или раствора по меньшей мере одного белкового каркаса через сопло под давлением. Размер и конфигурации сопла, действующее давление и скорость подачи жидкости могут быть выбраны в соответствии с требуемыми результатами и размером частиц. Например, электрораспыление осуществляется с помощью электрического поля и подачи через капиллярную трубку или сопло. Преимуществом распылителя является то, что доставляемые им частицы по меньшей мере одной композиции белкового каркаса имеют размер менее 10 мкм, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 3 мкм.

Препараты по меньшей мере одной композиции белкового каркаса, подходящие для использования с распылителем, обычно включают композицию белкового каркаса в водном растворе с концентрацией по меньшей мере одной композиции белкового каркаса на мл раствора или мг/гм от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 100 мг или с любым диапазоном, его значением или частью. Препарат может включать такие вещества, как наполнитель, буфер, агент изотонического действия, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Препарат может также включать наполнитель или вещество для стабилизации композиции белковых каркасов, например буфер, восстановитель, белокнаполнитель или углевод. К белкам-наполнителям, пригодным для приготовления композиций белкового каркаса, относятся альбумин, протамин и т.п. К типичным углеводам, пригодным для приготовления композиций белкового каркаса, относятся сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза и т.п. Препарат композиции белкового каркаса может также содержать поверхностно-активное вещество, способное уменьшить или предотвратить агрегацию композиции белкового каркаса на поверхности, вызываемую превращением раствора в аэрозоль. Можно использовать ряд традиционных поверхностно-активных веществ, таких как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты и полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот. Количества, как правило, составляют от 0,001 до 14 вес.% препарата. Наиболее предпочтительными поверхностно-активными веществами для целей настоящего изобретения являются полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 и т.п. В препарат могут быть также включены известные из уровня техники дополнительные вещества, подходящие для добавления в препарат белка, такого как белковый каркас, его указанные части или варианты.

Введение композиций белкового каркаса с помощью небулайзера.

Композиции белкового каркаса по изобретению могут вводиться с помощью небулайзера, например компрессорного или ультразвукового. В компрессорном небулайзере обычно используется источник сжатого воздуха для подачи струи воздуха через отверстие с высокой скоростью. По мере того как газ за соплом расширяется, возникает область низкого давления, под действием которой раствор композиции белкового каркаса подается через капиллярную трубку, соединенную с резервуаром с жидкостью. На выходе из капиллярной трубки поток жидкости разделяется на неустойчивые струи и капли, тем самым

- 29 028304 образуется аэрозоль. Для достижения требуемых характеристик можно подобрать компрессорный небулайзер с соответствующими параметрами конфигурации, скорости потока и типа экрана. В ультразвуковом небулайзере высокочастотная электрическая энергия используется для создания механических колебаний, как правило, с помощью пьезоэлектрического преобразователя. Эта энергия передается препарату композиции белкового каркаса напрямую или через связующую жидкость, в результате чего образуется аэрозоль, содержащий композицию белкового каркаса. Преимуществом небулайзера является то, что доставляемые им частицы композиции белкового каркаса имеют размер менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно от приблизительно 1 мкм до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 мкм до приблизительно 3 мкм.

Препараты по меньшей мере одного белкового каркаса, подходящие для использования с компрессорным или ультразвуковым небулайзером, обычно содержат по меньшей мере один белковый каркас в концентрации от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 100 мг на мл раствора. Препарат может включать такие вещества, как наполнитель, буфер, агент изотонического действия, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Препарат может также включать наполнитель или вещество для стабилизации по меньшей мере одной композиции белкового каркаса, например буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. К белкам-наполнителям, пригодным для приготовления композиций, содержащих по меньшей мере один белковый каркас, относятся альбумин, протамин и т.п. К типичным углеводам, пригодным для приготовления композиций, содержащих по меньшей мере один белковый каркас, относятся сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза и т.п. Препарат композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, может также содержать поверхностно-активное вещество, способное уменьшить или предотвратить агрегацию композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, на поверхности, вызываемую превращением раствора в аэрозоль. Можно использовать ряд традиционных поверхностно-активных веществ, таких как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты и полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот. Количества, как правило, составляют приблизительно от 0,001 до 4 вес.% препарата. Наиболее предпочтительными поверхностно-активными веществами для целей настоящего изобретения являются полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 и т.п. В препарат могут быть также включены известные из уровня техники дополнительные вещества, подходящие для добавления в препарат белка, такого как белковый каркас.

Введение композиций белкового каркаса с помощью ингалятора отмеренных доз.

В ингаляторе отмеренных доз (ΜΌΙ) пропеллент, по меньшей мере один белковый каркас и любые наполнители или другие добавки находятся в канистре в виде смеси, содержащей сжиженный сжатый газ. Срабатывание дозирующего клапана приводит к выпуску смеси в виде аэрозоля, предпочтительно содержащего частицы размером менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно от приблизительно 1 мкм до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 мкм до приблизительно 3 мкм. Требуемый размер частиц аэрозоля можно варьировать, используя различные способы приготовления композиции белкового каркаса, известные специалистам в данной области техники, в том числе размол на струйной мельнице, распылительную сушку, конденсацию в критических точках и т.п. Предпочтительными являются ингаляторы отмеренных доз, выпускаемые ЗМ или О1ахо и использующие в качестве пропеллента гидрофторуглерод. Препараты по меньшей мере с одним белковым каркасом для использования в ингаляторе отмеренных доз обычно включают мелкодисперсный порошок, содержащий по меньшей мере один белковый каркас в виде суспензии в неводной среде, например взвешенный в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Пропеллент может быть выбран из числа веществ, традиционно используемых в этих целях, например хлорфторуглерода, гидрохлорфторуглерода, гидрофторуглерода или углеводорода, в том числе трихлорфторметана, дихлордифторметана, тетрафтордихлорэтана и 1, 1, 1,2-тетрафторэтана, НРА-134а (гидрофторалкана-134а), НРА-227 (гидрофторалкана-227) и т.п. Предпочтительным пропеллентом является гидрофторуглерод. Поверхностно-активное вещество может служить таким целям, как стабилизация по меньшей мере одного белкового каркаса в виде суспензии в пропелленте, защита активного вещества от химической деградации и т.п. В качестве поверхностно-активных веществ могут быть использованы, в частности сорбитана триолеат, соевый лецитин, олеиновая кислота и т.п. В некоторых случаях предпочтительными являются аэрозоли растворов, в которых применяются разбавители, такие как этанол. В препарат белка могут быть также включены известные из уровня техники дополнительные вещества, подходящие для добавления в препарат белка. Средним специалистам в данной области техники будет ясно, что способы текущего изобретения могут быть достигнуты путем легочного введения по меньшей мере одной композиции белкового каркаса через устройства, не описанные в настоящем документе.

Пероральные препараты и введение.

Препараты для перорального введения предполагают совместное введение с адъювантами (например, резорцинами и неионогенными поверхностно-активными веществами, такими как полиоксиэтилена олеиловый эфир и п-гексадецил-полиэтилена эфир) для искусственного увеличения проницаемости стенок кишечника, а также совместное введение с ферментативными ингибиторами (например, ингибиторами трипсина поджелудочной железы, диизопропилфлуорофосфатом (ΌΡΡ) и трасилолом) для подавле- 30 028304 ния ферментативной деградации. Препараты для доставки гидрофильных веществ, включая белки, белковые каркасы и комбинации по меньшей мере двух поверхностно-активных веществ, предназначенные для перорального, буккального, мукозального, назального, легочного, вагинального, трансмембранного или ректального введения, описаны в патенте США № 6309663. Активное соединение, входящее в состав твердой лекарственной формы для перорального введения, может быть смешано по меньшей мере с одной добавкой, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу, раффинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакант, гуммиарабик, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Эти лекарственные формы могут также содержать добавки других типов, например неактивный разбавитель, скользящее вещество, такое как стеарат магния, парабен, консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол, антиоксидант, такой как цистеин, дезинтегратор, связывающее вещество, загуститель, буферное вещество, подсластитель, ароматизатор, отдушку и т.п.

Таблетки и пилюли могут быть дополнительно покрыты кишечно-растворимой оболочкой. К жидким препаратам для перорального введения относятся эмульсия, сироп, эликсир, суспензия и раствор, подходящие для медицинского применения. Эти препараты могут содержать неактивные разбавители, традиционно используемые в данной области техники, например воду. В качестве систем доставки инсулина и гепарина также предложены липосомы (патент США № 4239754). В недавнем времени для доставки лекарственного средства были предложены микросферы из искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеиноидов) (патент США № 4925673). Кроме того, из уровня техники известны носители, описанные в патентых США №№ 5879681 и 5871753 и предназначенные для перорального введения биологически активных веществ.

Мукозальные препараты и введение.

Препарат для перорального введения биологически активного вещества, инкапсулированного в одном или нескольких биосовместимых полимерных или сополимерных наполнителях, предпочтительно в биоразлагаемых полимерах или сополимерах, таким образом представляющий собой микрокапсулы, которые в силу соответствующего размера способны обеспечить получение вещества групповыми лимфатическими фолликулами животного, называемыми также бляшками Пейера или САЬТ, без потери эффективности, характерной при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Аналогичные групповые лимфатические фолликулы содержатся в бронхах (ВАЬТ) и толстой кишке. Вышеуказанные ткани в целом называются лимфоретикулярными тканями, ассоциированными со слизистыми оболочками (МАЬТ). К композициям и способам для введения по меньшей мере одного белкового каркаса через слизистые оболочки относится эмульсия, содержащая множество субмикронных частиц, мукоадгезивную макромолекулу, биологически активный пептид и непрерывную водную фазу, способствующую всасыванию через слизистые оболочки за счет мукоадгезии частиц эмульсии (патент США № 5514670). Способы введения эмульсий по настоящему изобретению через слизистые оболочки включают роговичный, конъюнктивальный, буккальный, сублингвальный, назальный, вагинальный, легочный, желудочный, кишечный и ректальный. Препараты для вагинального или ректального введения, например суппозитории, в качестве наполнителей могут содержать, например, полиалкиленгликоли, вазелин, масло какао и т.п. Препараты для интраназального введения могут быть твердыми и в качестве наполнителей содержать, например, лактозу, или могут быть водными либо масляными растворами в виде капель для носа. Для буккального введения могут применяться такие наполнители, как сахар, кальция стеарат, магния стеарат, прежелатинированный крахмал и т.п. (патент США № 5849695).

Трансдермальные препараты и введение.

Для трансдермального введения по меньшей мере один белковый каркас инкапсулируется в средстве доставки, таком как липосомы или полимерные наночастицы, микрочастицы, микрокапсулы или микросферы (совместно именуемые микрочастицами, если не указано иного). Известен ряд приемлемых средств, в том числе микрочастицы из синтетических полимеров, таких как полигидроксикислоты, например полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры, полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены, и естественных полимеров, таких как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды и их комбинации (патент США № 5814599).

Препараты и введение, обеспечивающие пролонгированное действие.

Возможны ситуации, в которых однократно введенные соединения по настоящему изобретению должны доставляться пациенту в течение длительного периода времени, например от одной недели до одного года. Возможно применение различных лекарственных форм для замедленного высвобождения, пролонгированного действия или имплантации. К примеру лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединений, которая имеет низкую степень растворимости в жидкостях организма, например а) соль присоединения кислоты с многоосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памоевая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталина моно- или ди-сульфокислоты, полигалактуроновая кислота и т.п.; Ь) соль с поливалентным катионом металла, таким как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и т.п., либо с органическим катионом, образованным, например, из Ν, Ν-дибензил-этилендиамина или этилендиамина, либо с) комбинации а) и

- 31 028304

Ь), например соль танната цинка. Кроме того, соединения по настоящему изобретению или предпочтительно относительно нерастворимая соль, например, из числа вышеуказанных, могут быть получены в виде геля, в частности подходящего для инъекций гелеобразного алюминия моностеарата, например, с кунжутным маслом. Наиболее предпочтительными солями являются соли цинка, соли танната цинка, соли памоевой кислоты и т.п. Другой тип препарата замедленного высвобождения или пролонгированного действия для инъекций содержит соединение или соль, диспергированные для инкапсуляции в медленно деградирующем, нетоксичном, неантигенном полимере, таком как полимер полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты, как описано, например, в патенте США № 3773919. Соединения или предпочтительно относительно нерастворимые соли, например, из числа вышеуказанных, могут быть также получены в виде капсул 8йак11с с холестериновым матриксом, особенно подходящих для использования у животных. В литературе также упоминаются другие препараты для замедленного высвобождения, пролонгированного действия или имплантации, например липосомы в виде газа или жидкости (патент США № 5770222 и 'Ъикййпеб апб Соп1го11еб Ке1еаке Эгид ОеНуегу 5>ук1етк. РК. КоЬткоп еб., Магсе1 Эеккег. 1пс., Ν.Υ., 1978).

Приведенное выше общее описание изобретения дополнительно разъясняется далее с помощью примеров, которые представлены в качестве иллюстрации и не являются ограничивающими.

Примеры

Пример 1. Конструирование Тепсоп.

Третий домен ΡΝ3 человеческого тенасцина (δΕΟ ГО N0: 3) может быть использован в качестве альтернативного каркаса, способного в результате некоторых трансформаций связываться со специфическими молекулами-мишенями через поверхностные петли, структурно аналогичные гипервариабельным участкам (СОК) антител. Температура плавления этого домена составляет 54°С в ΡΒδ (забуференный фосфатом физиологический раствор) в нативной форме. Для получения молекулы каркаса с аналогичной структурой и улучшенными физическими свойствами, например улучшенной термической стабильностью, была сконструирована консенсусная последовательность на основе сопоставления 15 доменов ΡΝ3 из человеческого тенасцина (δΕΟ ΙΌ N0: 1-15).

Анализ сопоставления последовательностей в табл. 1 показывает, что идентичность последовательностей между собой у этих 15 доменов составляет от 13 до 80%, при этом средняя идентичность последовательностей между парами равна 29%. Была сконструирована консенсусная последовательность (δΕΟ ГО N0: 16) путем включения сохранившейся лучше остальных (наиболее частой) аминокислоты в каждой позиции по результатам согласования, показанного в табл.1. В попарных сопоставлениях консенсусная последовательность по настоящему изобретению (δΕΟ ГО N0: 16), называемая Тепсоп, идентична доменам Р№ из тенасцина в 34-59% позиций, при этом средняя идентичность последовательностей равна 43%.

Экспрессия и очистка.

Последовательность аминокислот Тепсоп (δΕΟ ГО N0: 16) подвергли обратной трансляции, получив последовательность ДНК, показанную на δΕΟ ГО N0: 17. Эту последовательность сконструировали с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами, субклонировали с образованием модифицированного вектора рЕТ15, трансформировали в ΒΡ21δΐ3Γ(ΌΕ3) Е. сой (1п\Щгодеп) и поместили на агаровые пластины с лизогенной культурой, содержащие 75 мкг/мл карбенициллина. Одну колонию выбрали и оставили на ночь для выращивания при 37°С в 50 мл богатой питательной среды, содержащей 2%-ную глюкозу и 100 мкг/мл карбенициллина. Эту культуру использовали для посева в 500 мл аутоиндукционной среды (0уегп1дй1 Εxр^екк 1пк1ап1 ТВ теб1а, Nονадеη) в 2,5-л колбе иНга Υ^е1б (Тйоткоп 1пк1гнтеп1 Сотрапу). Выращивание и экспрессию осуществляли по двойной программе (3 ч при 37°С, 300 об/мин, затем 16 ч при 30 С, 250 об/мин) в шейкере-инкубаторе АТК Миййгоп.

Культуру собрали и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 мин в роторе РБ8.1 для осаждения клеток. Клетки ресуспендировали в 30 мл буфера, содержащего 20 мМ натрия фосфата, рН 7,5, 500 мМ №С1, 10%-ный глицерин, 20 мМ имидазола, 0,37 мг/мл лизоцима, ингибитор 1Х Сотр1е1е Ргсйеаке (без Ε^ΤА; Косйе) и Веп/опаке ^1дта-А1бпсй 0,25 мкл/мл оконч.), и лизировали с помощью соникатора ХБ2020 М1кошх в течение 5 мин на льду в импульсном режиме (работа 5 с, пауза 30 с). Нерастворимый материал удалили центрифугированием при 17000 об/мин в течение 30 мин в роторе 6А-17.

Белок Тепсоп отделили от растворимого лизата с помощью 2-этапного хроматографического процесса. Сначала белок зафиксировали путем аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, добавив в лизат 2 мл гранул агарозы №-ЫТА (О1адеп) и поместив его на качающуюся платформу на 1 ч при 4°С. Смолу затем поместили в колонку Ро1у-Ргер (Вю-Каб) и промыли 20 мМ натрия фосфата, рН 7,5, 500 мМ №С1, 10%-ного глицерина и 20 мМ имидазола для удаления несвязанного материала. Белки элюировали из смолы с помощью 20 мМ натрия фосфата, рН 7,5, 500 мМ №С1, 10%-ного глицерина и 500 мМ имидазола. Фракции проанализировали с помощью δ^δ-ΡАОΕ, включая окрашивание Кумасси и вестерн-блоттинг с использованием НКР-конъюгированных антител к гистамину (1ттипо1оду СопкиЙап1к ЬаЬога1оту). Требуемые фракции объединили и диализовали в ΡΒδ рН 7,4. На второй стадии очистки белок загрузили в колонку δире^беx-75 НЖоаб 16/60 (ΟΕ НеаИйсате), уравновешенную в ΡΒδ. Фракции проанализировали с помощью δ^δ-ΡАОΕ, затем фракции, содержащие Тепсоп, объединили и концен- 32 028304 трировали в концентраторе СеШпргер ИЬгаСе1 ΥΜ-3 (Αιηκοη).

Концентрацию белка определили с помощью измерительного устройства БкТек путем измерения оптической плотности пробы при 280 нм. Окончательный препарат проанализировали путем окрашивания Кумасси (фиг. 1), вестерн-блоттинга с использованием антител к гистамину и с помощью эксклюзионной ВЭЖХ в колонке 03000§ν-ΧΕ (ΤΟδΟΗ Βίο8^ι^8), уравновешенной в ΡΒδ. Анализ δΌδ-РАОЕ показывает, что масса Τеηсοη варьируется от 6 до 14 кДа, что согласуется с ожидаемой массой 10,7 кДа для мономерного белка. Выход чистого белка Τеηсοη составил >50 мг чистого белка на литр культуры.

Биофизическая характеристика.

Структуру и стабильность Τеηсοη характеризовали путем спектроскопии кругового дихроизма и дифференциальной сканирующей калориметрии соответственно. Измерения кругового дихроизма проводили на спектрометре АУГУ при 20°С в ΡΒδ и в концентрации 0,2 мг/мл. Спектр на фиг. 2 показывает минимальное значение при 218 нм, свидетельствующее о структуре β листа, которую, как и предполагалось, должен иметь белок, принадлежащий семейству N3. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии были получены путем нагрева 0,5 мг/мл раствора 3-го домена ΡΝ3 из тенасцина или Τеηсοη в ΡΒδ с 35 до 95°С со скоростью 1°С/мин в калориметре N-^δСII (АррЬеД ТНет-юДущпи^). Отдельную кривую буфера удалили для получения профилей, показанных на фиг. 3. Исходя из этих данных с помощью программного обеспечения СрСа1с (АррНеД ТНет-юДущпи^) рассчитали температуры плавления 54 и 78°С для 3-го домена ΡΝ3 и Τеηсοη соответственно. Фолдинг и анфолдинг обоих доменов обратим при этих температурах.

Анализ иммуногенности.

Для сравнения предполагаемой иммуногенности последовательностей аминокислот, представляющих 3-й домен ΡΝ3 человеческого тенасцина, Τеηсοη и несколько терапевтических антител (см. табл. 2), использовали компьютерную программу, моделирующую иммуногенность человека к последовательностям аминокислот. После анализа химерических моноклональных антител и человеческого моноклонального антитела (адалимумаба) в программе применили порог толерантности (удалив 9-мерные пептиды, на 100% идентичные последовательности, кодируемой зародышевой линией человека). К тенасцину и Τеηсοη порог толерантности не применяли. Порог толерантности предполагает широкую толерантность Т-клеток к последовательностям моноклональных антител, кодируемым зародышевой линией, и позволяет сосредоточить внимание на анализе новой последовательности преимущественно в СОК и фланкирующих доменах.

Результаты этих анализов позволяют предположить низкий иммуногенный риск тенасцина и Τеηсοη исходя из вероятности того, что 9-мерный пептид, полученный из проанализированной последовательности, свяжет одну или несколько молекул НЬА. Оценка является взвешенной по распространенности каждого аллеля НЬА. Оценки для моделей были суммированы по каждой последовательности, чтобы получить одно число, описывающее общий предполагаемый иммуногенный риск каждой последовательности (суммарную оценку). Результаты этого анализа приведены в табл. 2. Тенасцин получил наименьшую общую оценку (11,9). Τеηсοη, как и тенасцин, заработал баллы преимущественно за несвязывающие вещества и агретопы с низким предполагаемым иммуногенным риском (оценка=13,2). Оценки последовательностей тенасцина и Τеηсοη оказались лучше оценок терапевтических антител.

Дисплей Τеηсοη на фаге М13 путем соединения с рЕХ.

Ген, кодирующий последовательность аминокислот Τеηсοη, субклонировали в экспрессионный вектор-фагмид рРер9 с помощью ПЦР и рестрикционного клонирования с частичным расщеплением, в результате чего получили вектор рΤеηсοη-рIX. Эта система экспрессирует Ν-терминально Мус-меченый Τеηсοη как соединение С-конца с Ν-концом белка М13 р!Х (фиг. 4). Промотор Ьас обеспечивает низкий уровень экспрессии без ГОТО и повышенный уровень экспрессии после добавления ГОТО. К Ν-концу Τеηсοη добавили сигнальную последовательность 0трА, чтобы способствовать эффективной транслокации в периплазму. Между Τеηсοη и р!Х сконструировали короткий линкер ΤδООООδ (+ЕЦ ГО N0: 141) для предотвращения стерических взаимодействий между этими белками.

Чтобы подтвердить присутствие на поверхности фаговых частиц М13, рΤеηсοη-рIX трансформировали в ХЬ1-Б1ие Е. сο1^ и одну колонию использовали для посева в 5 мл лизогенной культуры с добавлением ампициллина. Эту культуру выращивали при 37°С до достижения середины логарифмического роста, затем добавили 6¹⁰ БОЕ фага-помощника УСδΜ13, и культуру инкубировали при 37°С в течение 10 мин без встряхивания, затем 50 мин со встряхиванием. Восстановленную с помощью фага-помощника культуру затем разбавили в 50 мл среды 2УТ с добавлением ампициллина и канамицина и выращивали при 37°С со встряхиванием до достижения значения 0,7 у 0ГО.₆₀₀, после чего добавили ГОТО для получения окончательной концентрации 1 мМ, и понизили температуру до 30°С. Спустя 16 ч культуру центрифугировали при 4000 д в течение 20 мин, затем собрали супернатант и поместили его на хранение при 4°С для анализа.

Чтобы подтвердить присутствие композиции Мус-Τеηсοη на поверхности фага М13, использовали связывание фаговых частиц с антителом к микоплазме (Iην^ί^οдеη). Пластину Μаx^8ο^р оставили покрытой α-Мус или антителом анти-ау (отрицательный контроль) на ночь при концентрации 2,5 мкг/мл и

- 33 028304 блокировали с помощью 8ирегВ1оск Т20 (Легсе). Вышеуказанный супернатант фагмидной культуры дважды последовательно разбавили в РВ8 и добавили в лунки покрытой пластины. Через 1 ч пластину промыли ТВ8Т, в каждую лунку добавили антитело а-М13 НКР и после инкубации в течение 1 ч промыли ТВ8Т. Добавили субстрат Косйе ВЭ ЕЫ8Л РОЭ и измерили люминесценцию с помощью измерительного устройства (Тесап). На фиг. 5 показано, что фаговые частицы Мус-Тепсоп связываются с α-тус, но не те лунки пластины, которые были покрыты антителами анти-αν, и непокрытые контрольные лунки (в зависимости от концентрации), что подтверждает специфическое присутствие Мус-Тепсоп на фаговой частице М13.

Возможно сконструировать дополнительный вектор-фагмид для отображения Тепсоп и элементов библиотеки (см. пример 2) на фаге М13 в виде соединений с белком оболочки ρΙΙΙ. В этой системе ген для ρΙΧ заменяется геном, кодирующим усеченную версию ρΙΙΙ (Вазз е! а1. 1990). К дополнительным изменениям по сравнению с системой, показанной на фиг. 4, относится замена сигнальной последовательности ОтрА сигнальной последовательностью ЭзЬА, поскольку известно, что секреция с использованием этой последовательности полезна для подтверждения присутствия стабильных альтернативных молекул каркаса (81етег е! а1. 2006).

Пример 2. Генерация библиотек Тепсоп.

Библиотеки вариантов Тепсоп могут быть получены многими различными способами в зависимости от требуемой сложности и относительного расположения мутаций в молекуле. Для генерации мутаций, распределенных по гену Тепсоп, предпочтительны способы синтеза ДНК. Возможно также использование клонирования с помощью ферментов рестрикции, позволяющее рекомбинировать фрагменты ДНК, содержащие мутации в различных участках гена. Насыщающий мутагенез в узком участке, например одной петле Тепсоп, может быть введен методом направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов и олигонуклеотид-направленного мутагенеза (Кипке1 е! а1. 1987).

Создали библиотеку Тепсоп, библиотеку РО7, предназначенную для замены петли РО на 7 случайных аминокислот с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Синтезировали олигонуклеотид (ТсопРО7-Рог-5'рйо) с вырожденной последовательностью NN8 с 21 парой оснований (п.о.) в позициях, кодирующих петлю РО, и двумя фланкирующими последовательностями нуклеотидов с 20-27 п.о., комплементарных кодирующей последовательности Тепсоп. При такой конструкции все 20 аминокислот могут быть представлены в петле РО. Расчетное разнообразие на уровне нуклеотидов равно 1,3 х10⁹.

ТсопРО7-Рог5'рйо: (8Ер ГО N0: 18) еААТАСАСсетттстАтстАсеететтж5Ж5Ж5Ж5Ж5Ж5Ш5ссестетсте

СССААТТСАС

Матрицу для олигонуклеотид-направленного мутагенеза, рВзЬА-Тепсоп-Азс-1оор-Мус-рШ, сконструировали путем замены последовательности, кодирующей петлю Р:О Тепсоп, на последовательность типа стебель-петля, содержащую сайт рестрикции АзсР Эта система допускает ликвидацию фоновой ДНК-матрицы после мутагенеза за счет расщепления полученной ДНК с помощью Азс-Ι до трансформации. Для очистки одноцепочечной ДНК-матрицы для мутагенеза одну колонию Е. сой С1236, содержащую рОзЬА-Тепсоп-Азс-петля-Мус-рШ, поместили в 5 мл питательной среды 2УТ с карбенициллином (50 мкг/мл окончательной концентрации) и хлорамфениколом (10 мкг/мл). Спустя 6 ч добавили фагпомощник УС8М13 до окончательной концентрации 10¹⁰ БОЕ/мл и инкубировали без встряхивания в течение 10 мин, затем перенесли в 150 мл 2УТ с карбенициллином (10 мкг/мл) и уридином (0,25 мкг/мл) и инкубировали при 37°С со встряхиванием при 200 об/мин в течение ночи. Клетки осадили центрифугированием, супернатант собрали и фаг осадили с помощью РЕО №С1. Одноцепочечную ДНК получили из этого осадка с помощью набора рЩргер 8рт М13 (01адеп) в соответствии с инструкциями производителя.

Чтобы ренатурировать вырожденный олигонуклеотид с ДНК-матрицей, 5 мкг ДНК-матрицы соединили с олигонуклеотидом ТсопРО7-Рог-5-рйо с молярным отношением 10:1 в трис-НС1 (50 мМ, рН 7,5) и МдС12 (10 мМ) и инкубировали при 90°С в течение 2 мин, 60°С - в течение 3 мин и 20°С - в течение 5 мин. После реакции ренатурирования в реакционную смесь добавили АТР (10 мМ), йNТР (25 мМ каждый), ЭТТ (100 мМ), Т4-лигазу (7 единиц) и Т7-ДНК-полимеразу (10 единиц) и инкубировали при 14°С в течение 6 ч, затем при 20°С - в течение 12 ч. Полученную ДНК очистили с помощью набора для очистки ПЦР (О1адеп) и восстановили в 100 мкл воды. Библиотеку ДНК расщепили с помощью 10 единиц АзО в течение 4 ч, затем снова очистили с помощью набора для очистки ПЦР (Р1а§еп). Окончательную библиотеку ДНК восстановили в 50 мкл воды. Полученную двухцепочечную ДНК трансформировали в Е. сой МС1061Р' электропорацией.

Продукты трансформации собрали в 20 мл среды 8ОС и оставили восстанавливаться на 1 ч при 37°С. По завершении восстановления аликвот трансформации последовательно разбавили и посеяли на пластинах с карбенициллином (100 мкг/мл), содержащих 1%-ную глюкозу, для оценки общего количества продуктов трансформации. Оставшуюся культуру 8ОС затем использовали для посева в 1 л среды 2хУТ с карбенициллином и 1 %-ной глюкозой, которую выращивали до достижения значения 0,6 у ОЭ₆₀₀. В 100 мл этой культуры посеяли фаг-помощник М13 до 10¹⁰/мл и инкубировали при 37°С, затем центри- 34 028304 фугировали. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 500 мл свежей среды 2χΥΤ, содержащей карбенициллин (100 мкг/мл) и канамицин (35 мкг/мл), и оставили на ночь для выращивания при 30°С, затем центрифугировали. Фаговые частицы осадили добавлением РЕО/ЛаС1 и поместили на хранение при -80°С.

Вторая библиотека, ВС6/РО7, предназначалась для внесения разнообразия одновременно в петлях В:С и Р:О Тепсоп. Для этого синтезировали два олигонуклеотида, ТС-ВС6-Рог-5'рйоз и РОР149. Начальный олигонуклеотид был фосфорилирован и содержал 18 оснований кодона ΝΝ5 в каждой позиции, кодирующей петлю В:С, в то время как конечный олигонуклеотид был биотинилирован на 5'-конце и содержал 21 основание кодона ΝΝ5 в каждой позиции, кодирующей петлю Р:О. Оба олигонуклеотида фланкируются двумя последовательностями нуклеотидов с 18 п.о., идентичными участку, идущему до и после участка, который подвергается мутагенезу (см. ниже сведения о праймере).

Тс-ВС6-Рог-5'рйоз: (5ЕЦ ГО ΝΟ: 19) дасЕсЕсЕдсдЕсЕдЕсЕЕддМ№М№М№М№М№М№ТТССАСТСТТТССТСАТСС

А6ТАСС

РОР 2149: (5ЕЦ ГО ΝΟ: 20)

6Τ6ΑΑΤΤ0060Α6Α0Α60665ΝΝ5ΝΝ5ΝΝ5ΝΝ5ΝΝ5ΝΝ5ΝΝΑΑ0Α006ΤΑ6ΑΤΑ6ΑΑΑ

СССТС

Для конструирования библиотеки осуществили 16 ПЦР со 100 мкл с использованием ίолигонуклеотидов Тс-СВ6-Рог5'рйоз и РОР2149 для амплификации ДНК-матрицы Тепсоп, при этом одновременно вводили кодоны ΝΝ5 в петли В:С и Р:О. Двухцепочечный продукт ПЦР смешали с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (Оупа1), в буфере В&^ (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 1 мМ ЕОТА. 2М NаС1, 0,1%-ный Т\уееп-20). инкубировали в течение 20 мин, отделили с помощью магнитного поля и дважды промыли буфером В&^. Начальную цепь элюировали из частиц с помощью 300 мкл 150 мМ NаΟН. Этот мегапраймер, смесь длинных праймеров с теоретическим разнообразием свыше 8х10¹⁶, использовали для ренатурирования с матрицей одноцепочечной библиотеки. Библиотеку сконструировали по аналогии с вышеописанной библиотекой РО7.

Пример 3. Селекция связывающих веществ 1дО.

Для селекции элементов библиотеки Тепсоп, связывающихся с 1дО, рекомбинантный 1дО (подтип человеческого 1дО1) биотинилировали с помощью сульфо-ЫН5-1С-биотина (Р1егсе), затем подвергли диализу в РВ5. Чтобы произвести селекцию, 200 мкл библиотек РО7 или ВС6/РО7 на фаговом дисплее блокировали 200 мкл Сйет1Ь1оскег, затем добавили биотинилированный 1дО в концентрациях 500 нМ (стадия 1) или 100 нМ (стадии 2 и 3). Связанные фаги были восстановлены магнитными частицами, покрытыми нейтравидином (5егабупе), на стадии 1 и магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (Рготеда), на стадиях 2 и 3. Несвязанные фаги удалили с частиц путем 5-10 промывок 1 мл трисбуферного физиологического раствора с Т\\ееп (ТВ5Т), затем 2 раза по 1 мл трис-буферного физиологического раствора (ТВ5). Связанные фаги элюировали с частиц добавлением Е. сой МС1061Р' на середине логарифмического роста. Пораженные клетки посеяли на агаровых пластинах с лизогенной культурой с добавлением карбенициллина и глюкозы. На следующий день клетки сняли с пластин и вырастили до середины логарифмического роста, затем восстановили с помощью фага-помощника УС5М13 и оставили на ночь для выращивания. Фаговые частицы выделяли осаждением с РЕО/№С1 и использовали для следующей стадии селекции.

После 3 стадий пэннинга относительно 1дО полученный продукт субклонировали до вектора рЕТ27, модифицированного таким образом, чтобы он включал лигаза-независимый сайт клонирования, путем ПЦР-амплификации гена Тепсоп. Этот продукт ПЦР ренатурировали с вектором и трансформировали в клетки ВЕ21-ООЕО(ОЕ3) (5(га(адепе). Отдельные колонии собрали в культуры по 1 мл на 96-луночных планшетах с глубокими лунками (Согшпд) и оставили на ночь для выращивания до насыщения при 37°С. На следующий день 50 мкл выросшей за ночь культуры использовали для посева свежего 1 мл культуры. Культуры выращивали при 37°С в течение 2 ч, затем добавили 1РТО до 1 мМ, и понизили температуру до 30°С. Клетки собрали путем центрифугирования спустя 16 ч после индукции и лизировали 100 мкл ВидВиз(ег (Nονа§еη). Полученные лизаты осветлили путем центрифугирования и использовали для проверки на предмет связывания с 1дО методом ИФА.

Пластины Мах1зогр (Жтс) покрыли 0,1 мкг антитела к гистамину (Ц|адеп) и оставили на ночь, затем промыли ТВ5Т и блокировали с помощью 5(агйпд В1оск Т20 (Тйегто Заепййс). Осветленные лизаты, разведенные в соотношении 1:4 со 51:агйп§ В1оск, добавили на пластины и оставили на 1 ч для связывания, затем промыли ТВ5Т. Биотинилированный 1дО или биотинилированный Н5А добавили в концентрации 1 мкг/мл и промыли ТВ5Т после инкубации в течение 1 ч. Детекцию связанного 1дО или Н5А осуществляли добавлением стрептавидин-ИРР Цаскзоп 1ттипогезеагсй) и применением хемилюминесцентного субстрата РОЭ. Результаты ИФА показаны на фиг. 7. Композиции, связавшие биотинилированный 1дО в 10 раз больше, чем биотинилированный Н5А согласно сигналу ИФА, секвенировали. После завершения нескольких селекционных экспериментов получили 60 уникальных связывающих после- 35 028304 довательностей из библиотеки РО7 и 10 уникальных последовательностей из библиотеки ВС6РО7; в табл. 4 показаны репрезентативные последовательности связывающих веществ 1дО, где петли В:С и/или Р:О показаны в том объеме, в котором они отличаются от аналогичных в 8Е0 ΙΌ N0: 16. В табл. 4 также показаны многочисленные мутации в других участках каркаса.

Термальная стабильность сконструированного, экспрессированного и очищенного здесь белка Τеηсоη на 26°С лучше этого показателя у 3-го домена ΕΝ3 из человеческого тенасцина, который использовался в качестве альтернативной молекулы каркаса. На основании этого повышения устойчивости можно предположить, что эта молекула каркаса с большой долей вероятности будет податливее для аминокислотной замены и проще в изготовлении. С повышением стабильности каркаса ожидается улучшение порога толерантности к мутациям, уменьшающим стабильность белка, поэтому каркас с повышенной стабильностью, вероятно, обеспечит более функциональные, оптимально фолдированные связывающие вещества из библиотеки вариантов каркаса. Поскольку этот новый белок не относится к белкам, кодируемым геномом человека, при использовании в терапевтических целях риск вызвать иммунный ответ у него ниже по сравнению, например, с нативным человеческим тенасцином (в целом с ним сопряжен меньший риск, чем в случае с лекарственным средством, основанным на домене дикого типа).

Для целей настоящего изобретения 70-100%-ная идентичность последовательности аминокислот или нуклеотидов (то есть 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 либо любой диапазон или значение из него) определяется с помощью подходящего компьютерного алгоритма, известного из уровня техники.

Очевидно изобретение может быть реализовано способами помимо конкретных способов, указанных в вышеприведенных описаниях и примерах. В соответствии с вышеуказанной информацией возможны многочисленные изменения и вариации настоящего изобретения, которые, таким образом, включаются в прилагаемую формулу изобретения.

Таблица 1 (ΐ) ι до_£о_22_42_22_22_Ζ2_£2_22_222 (1) —ЗРРКОЪТОГЕУТЕЕТУЫЪАИОЫ-ЕМКУТЕУЬУтеТРТН—ΕεεΐΕΜΟΗ’ΚνΡ6ϋΟΤδΤΙΙ(2Ε1ΕΡ6νΕΥΓΧΚνΓΑΙΕΕΝΚΚ5ΙΡν5ΑΚνΑΤ------2 (1) ТУЬРАРЕ5ЬКРК31КЕТЗУЕУЕИСРЪС1АРЕТИЕ11РННМЫ-КЕ0Е6Е1ТК8ЪКВРЕТ8УВЙТБ1АРЕ0ЕУЕ18ЬНТ7КНМТКЕРЕЬКЕтаТТКЬВ---3 (1)---0ΑΡ30ΙΕνΚθνΤϋΤΤΑ1ΙΤ«ΡΚΡΙΑΕΙ06ΙΕΙΤΥ6ΙΚϋ--νΡ6ΟΒΤΤΙ0Ι.ΤΕΟΕΝ0Υ5Ι6ΝΚΚΡηΤΕΥΕν5Ι,Ι8ΚΚ6ΟΜ53ΝΡΑΚΕΤΓΤΤ------4 (1) ТС-ЬОАРК:1ЬР.ЕУЗОТОЫ31ТЬЕИКНСКААЗРЗУР1КУАР13ССОНАЕУОУРК32<ЭйТТКТТЕТЕЪЕ?СТЕУС1С‘7г7.УКЕОКЕЗИРАТтаАА.ТЕЬОТРКЗ (1)---ПТРКОЬОУЯЕТАЕТЗЕТЕЬИКТР1АКЕОКУКЪИУЗЪРТ----еОИУеУОЕРКНТТЗУУЕКеЬЕРООЕУМУЪШАЕКеКНКЗКРАКЗКРАЕУК----6 (1) -0АРЕЬЕЯЪТУТЕУСИ1)СЕКИгаТАА00АУЕНР110У0ЕАЫ—КУЕААРЛЪТУРС£Ь?АУО1РСЪКААТРУТУ£1УСУ1<ЭСУКТЕУЬгАЕА8ТСЕ----7 (1) -ΕΤΡΗΕΘΕνλ/νΑΕνεΜΟΑΙιΚΕΝΜΤΑΡΕΕΑΥΕΥΕΈΙΟνΟΕΑΌ--ТУЕАА0МЬТУРСЕЬРЗТ0ЬРеЬКААТНУТ1Т1Р.еУТ00ЕЗТТРЬЗУЕУЗТЕ-----8 (1) -ЕУРЕМСНЬТУТЕУЗИПАЬКЫПИТРОСТУПОРТЮУОЕАО—0УЕЕАНЫЬТУРБЗЬК8МЕ1РСЬКАеТРУТУТЬНеЕтаБНЗТКРЬАУЕ7УТЕ-----9 (1) -ΟΕΡςΕΕΟΙΛνδΕνΟΗϋΘΕΚΕίηίΤΑΑΟΝΑΥΕΗΓνίΟνΟΕνΝ—КУБАА0ЫЬТЕРеЗЕКАУО1РеЬЕААТРтаУ31УбУ1КСУЕТРУЪЗАЕАЗТАКЕРЕ— (1) -КЕРЕ1БЫЮТЗО1ТРЕ8ЕТ!1ЬЗ«1МАТОС1РЕТРТХЕ11ОЗЫ—КЬЬЕТ7ЕУН136АЕКТАН136ЬРРЗТОРП7ГЬ5БЬАР31КТКТ13АТАТТЕ-----11 (1) -АЬРЬЬЕЦЬИЗОПЯРУбРТУЗИМАЗЕИАРОЗРЬУТУУОеб—КЬЬПЕ0ЕРТЬББТ0ККЬЕЬКБЫТС1С¥ЕУМУ36ГТ<ЭСН0ТКРЬКАЕ1УТЕ-----12 (1) -АЕРЕУОЫЬЬУЗПАТР06ЕВЬЗИТАОЕетГОЫЕ'УЬК1КОТК~КОЗЕРЬЕ1ТЫАРЕКТЕОЬТеЬЕЕАТЕУЕ1ЕЬ¥е13КСККЗОТУЗА1АТТАМ----13 (1) —εΒΡΚΕνίΡδϋΙΤΕΗδΑΤνΒΪΙΒΑΡΤΑΟνΕΒΡΚΙΤΥνΡΙΤε---СТЕЗМУТУОбТКТОТКЬУКЫРБУЕУЬУЗИАМКБГЕЕЗЕРУЗБЗРТТАЬ----14 (1) —□ΘΡ36ΒνΤΑΝΙΤϋ3ΕΑ1ΑΚνί0ΡΑΙΑΤν03Υνΐ3ΥΤσΕΚ----'7РЕ1ТЕТУЗСНТ'/ЕУАЕТОЪЕ?АТЕУЕРР.1ЕАЕКСРОР:ЗЗТ1ТАКЕТТЕЬ----15 (1) ОЗРКОЪТАТЕУОЗЕТАЪЬТИКРРЕАЗУТСУЬХУУЕЗУП----еТУКЕиП/ЗР0ТТЗУЗЬА0ЪЗ?ЗТНУ?АК1(2АЬМСРТ,РЗНМТГ)ТТЕТТТГА,---Таблица 2

Последо- вательность		Описание	Сумма 1-й оценки	Сумма 2-й оценки	Сумма оценки (цепь)	Сумма оценки (молекула)
Тенасцин		Альт. карк.	6,01	5,85	11,86	11,86
Тепсоп		Альт. карк.	5,83	7,37	13,20	13,20
Адалимумаб	УЬ	Гуманизированное МКА	9,45	8,06	17,50	45,42
	VI		15,29	12,63	27,92
Цетуксимаб	УЬ	Химерическое МКА	17,63	16,89	34,52	64,44
	VI		14,45	15,47	29,92
Ритуксимаб	УЪ	Химерическое МКА	16,57	14,38	30,96	61,65
	VI		16,63	14,06	30,69
Базиликсимаб	УЬ	Химерическое МКА	16,48	13,40	29,89	58,98
	VI		16,05	13,05	29,09

- 36 028304

Последовательности:

ЗЕО Ю Νο. 1:

зрркс!1лл£ел£ее£лп1аис1петгл£еу1ллу£р£Педд1етд£глрдс1д£з£11де

1ердуеу£1гл£аИепккз1рл8агла£

ЗЕО Ю Νο. 2:

Еу1раред1к£кз1кеЕ5лелетес1р1с11а£еЕтее11£гптпкес1еде1£к81ггреЕ5 угд£д1арддеуе1з1Ыукпп£гдрд1кгл£££г10

ЗЕО Ю Νο. 3:

0арзд1елкОл£О££аИ£и£кр1ае1с1д1е1£уд1кс1лрдс1г££1с11£е0епдуз1д п1крй£еуелзИзггд0тззпраке££££

ЗЕО Ю Νο. 4 £д10аргп1гглзд£с1пз1£1етегпдкаа1с1зуг1куар£здд0]ааел0лркздда££ к££1£д1грд£еуд1длзалке0кезпра£1паа£е10£ркО

ЗЕО Ю Νο. 5

0£ркс11длзе£ае£з1£11ик£р1ак£0гуг1пуз1р£ддилдлд1ргп££зул1гд1 ерддеупл11ЕаекдгПкзкракзкраглк

ЗЕО Ю Νο. 6 даре1еп1£л£елдвд0д1г1пи£аа0дауеП£Идлдеапклеаагп1£лрдз1гал0

1рд1каа£ру£лз1удл1ддуг£рл1заеаз£де

ЗЕО Ю Νο. 7 е£рп1делллаелдвд0а1к1пи£аредауеу££1длдеас1£леаадп1£лрдд1гз£0

1рд1каа£Пу£1£1гдл£дс1£з££р1злел1£е

ЗЕО Ю Νο. 8 елр0тдп1£л£елзвд0а1г1пи££р0д£у0д££1длдеас1длееаЬ.п1£лрдз1гзте

1рд1гад£ру£л£1ПделгдПз£гр1алелл£е

ЗЕО Ю Νο. 9

01рд1д01алзелдвд0д1г1пи£аа0пауеП£л1длделпклеаадп1£1рдз1гал0

1рд1еаа£руглз1удл1гдуг£рл1заеаз£акере

ЗЕО Ιϋ Νο. 10 кере1дп1плз01£рез£п1з«1ла£0д1£е£££1еИ0зпг11е£леуп1здаег£аП

1зд1ррзЕс1£:^у1зд1арз£гЕкЕ£заЕаЕЕе

ЗЕО Ю Νο. 11 а1ρ11еη1£^зά^ηρуд££νзνίIπазеηа£άз£1ν£ννс^здк11с^ρ^е££1зд£^^к1е

1гдИ£д1дуелтщзд££ддПд£кр1гае1л£е

ЗЕО Ιϋ Νο. 12 аерел0п11лз0а£р0д£г1звд£а0едл£0п£л1к1гс1£ккдзер1е1£11арег£г0

1£д1геа£еуе1е1уд1зкдггзд£лза1а££ат

ЗЕО Ιϋ Νο. 13 дзркел1£з01£епза£лзвдгар£адлез£г1£улр1£дд£рзтл£лс1д£к£д£г1лк

11рдлеу1лзИаткд£еезерлздз£££а1

ЗЕО Ιϋ Νο. 14 άдρзд1ν£аη^£с^зеа1а^вд^ρа^а£νάзуν^зу£декνρе^£^£νздη£νеуа1£с^1 ера£еу£1г1£аекдрдкзз£1£ак£££О1

ЗЕО Ю Νο. 15

0зргс11£а£елдзе£а11£игрргазл£ду11луезлс1д£лкел1лдр0££зуз1ас11 зрз£Пу£ак1да1пдр1гзпт1д£1£££1д1

ЗЕО Ю Νο. 16

ЬРАРКИ1ЛЛ/5ЕУТЕО5ЬКЬ5МТАРОААЕО5Е£10У0ЕЗЕКУСЕА1ЫЬТУРС5ЕК5УОЬ ТСЬКРСТЕУТУЗIУСУКССНКЗИРЬЗАЕЕТТ

ЗЕО Ю Νο. 17 сЕдссддсдссдааааассЕддЕЕдЕЕЕсЕдаадЕЕассдаадасЕсЕсЕдсдЕсЕдЕ сЕЕддассдсдссддасдсддсдЕЕсдасЕсЕЕЕссЕдаЕссадЕассаддааЕсЕдааааад ££дд£даадсда£саасс£дассд££ссддд££с£даасд££с££асдасс£дассдд£с£да аассддд£ассдаа£асассд£££с£а£с£асдд£д££ааадд£дд£сассд££с£аасссдс

ЕдЕсЕдсддааЕЕсассасс

Последовательность Тепсоп, показывающая петли (ЗЕО Ю N0:

16)

Петля А-В Петля В-С Петля С-ϋ

1-ΠΡΑΡΚΝΠνν3ΕνΤΕΟ3ΠΚΠ3ΝΤΑΡϋΑΑΕΟ3ΕΠΙ0Υ0Ε3ΕΚνΕΕΑ

Петля ϋ-Ε Петля Е-Е Петля Е-6 таЬТУРСЗЕКЗУОЬТСЬКРСТЕУТУЗIУСУКССНКЗЕРЬЗАЕЕТТ-89

- 37 028304

Таблица 3

Петли Τеηсоη

Петля	Остатки 5Е0 Ю N0: 16	Последовательность аминокислот
А-В	13-16	ΤΕϋ3
В-С	22-28	ТАРБААЕ
С-Ό	38-43	ЗЕКУОЕ
Ό-Ε	51-54	СЗЕК
Е-Е	60-64	СЬКРС
Е-С	75-81	ΚΟΟΗΚ3Ν

Каркасы, связывающиеся с ^О

Таблица 4

Клон №	Петля В:С Остатки 22-28 (ЗЕО Ю ΝΟ)	Петля Е:6 Остатки 75-81 (ЗЕО Ю ΝΟ)	Мутации каркаса
1	3Υ6ΕΝΝ (21)	0ΙΟΡΙΙΡ (46)
2	ΤΥΕ6Ε3 (22)	0ΙΟΡΙΙΡ (46)
3	ΤΥΕ3Ε3 (23)	0ΙΟΡΙΙΡ (46)
4	ΤΝΜΜΌ3 (24)	3ΙΚΤΙΌ3 (47)
5	КЗУЕ1М (25)	РКЕНЗРЬ (48)
6	Υ33ΥΑΤ (26)	ИКТТ1ИЕ (49)
7	КЕНРЕР (27)	ΚΚΝΜΚΤΚ (50)
8	ММСМРЬ (28)	ΚΠΕΚΙΥ0 (51)
9	ΥΟΚνΚϋ (2 9)	Ϊ/Π15Κ5ΥΟ (52)
10	3Υ6ΕΝΝ (21)	Ϊ/Π15Κ5ΥΟ (52)
11	ΜϋΟΕΜΟ (30)	ИЬЗКЗСО (53)
12	ΤΥΚΕΝ3 (31)	ΜΜΟΡΥΟϋ (54)
13	АЗККЗЬ (32)	ΚΚΚΚΥ3Ε (55)
14	ΤΙΕ3Ε3 (33)	Н1УРМУР (56)
15	ТЬ*М03 (34)	ΟΙΕΡΙΙΚ (57)
16	ΙΥΏ3Ε3 (35)	Ρ3ΑΑΝΝΡ (58)
17		νΚΠΚΥνΟ (59)
18		ОУСРЫР (60)
19		К1СР1ЬР (61)
20		ОЮРЬЬР (62)
21		КЮРЬЬР (63)
22		ΟνΟΡΙΤΡ (64)
23		КЮРМЬР (65)
24		ОЮРУЬР (66)
25		КЮРУЬР (67)
26		0ЮРММР (68)
27		ОУСРЬУР (69)
28		ОЮРМЬР (70)	К18Р
29		ОУСР1ЬР (71)
30		ОУСРЬЬР (64)
31		ОУСРМЬР (72)
32		ΟΙΟΡίνΡ (73)	133У
33		МЮРЬЬР (74)
34		ОЮРЬЕР (75)
35		ОЮРУЬР (66)	Т59А
36		0ЮРМУР (76)
37		ΟΙΟΡίνΡ (77)
38		К1ЕРЮР (78)	У74С
39		УАСЗУИР (79)
40		ΚΕΟΑΤΤΥ (80)

- 38 028304

41		К<21РР1Ь (81)
42		ЬЗЬЗЗУЬ (82)
43		НМЬЬРЬР (83)	У74А
44		М1СРЫР (84)
45		ΤΙ6ΡΗΙΡ (85)
46		ЕЮРСЬР (86)
47		ЕЮРУЬР (87)
48		КЮРСЬР (88)	Υ35Η
49		МЮРУЬР (89)
50		<2ЮР1ЬР (90)	352Р
51		<2ЮР1ЬР (90)	<236К
52		<2ЮР1ЬР (90)
53		ЕУСРЮР (91)
54		ОУСРЬЬР (92)	А23Т
55		<2ЮРУМР (93)
56		<2ЮРСУР (94)
57		<2ЮРЬУР (95)
58		КСЬУМРМ (96)	У74А
59		МЮР1ЬР (97)
60		<2ЮР1ЬР (90)	Е376
61		<2ЮР1ЬР (90)	Т68А
62		<2ЮР1ЬР (90)	Τ22Ι
63		<2ЮР1ЬР (90)	352Е
64		<2ЮР1ЬР (90)	Υ56Η
65		<2ЮР1ЬР (90)	А44У
бб		<2ЮР1ЬР (90)	Р243
67		КЮР1ЬР (61)
68		СЮРМУР (98)
69		ЕЮРУЬР (99)
70		НЮР1ЬР (100)
71		НЮР1МР (101)
72		НЮРУЬР (102)
73		НУСР1ЬР (103)
74		1ЮРЬЬР (104)
75		ЬЮРЬЬР (105)
76		МУСРЬЬР (106)
77		ЫЮРУЬР (107)
78		ЫЮРУЬР (108)
79		ОЮРНЬР (109)
80		ОЮРПР (46)
82		<2ЮР1ЬС (110)
83		<2ЮР1Ь5 (111)
83		<2ЮР1ЬТ (112)
84		О1СР1МР (113)
85		О1СР1Р1 (114)
86		ОЮРЬЬИ (115)
87		<2ЮРЬЬР (62)
88		ОЮРУЕР (116)
89		ОЮРУЬЗ (117)
90		<2ЮРМЬР (118)
92		<2УСР1ЬР (71)
93		<2УСР1ЬК (118)
94		ΟνΟΡΙΜΝ (119)
95		ΟνΟΡΙΜΡ (120)
96		ΟνΟΡίνΡ (121)
97		ОУСРЬЬЗ (122)
98		ОУСРУЬР (123)
99		ОУСРУЬТ (124)
100		КЮР1МР (125)
101		КЮР1УР (126)
102		ΗΙ6ΡΜΕΡ (127)
103		КЮРМ1Р (128)
104		КЮРМУР (129)
105		КЮРУ1Р (130)
106		НУ6Р1ЬР (131)
107		КУСРЬЬР (132)
108		ТУСРН1Р (133)

- 39 028304

109	ϋΚΚΚΕΙ (36)	Ρ3ΜΚ3ΝΜ (134)
110	ЕЕИКСЗ (37)	<21СРЬЬР (62)
111	СЫТРЬ (38)	АЬКАТЬЕ (135)
112	СЬУЬРЕ (39)	КУСУЬТР (136)
113	МАЗОСЬ (40)	КЮРМЬР (137)
114	ΝΚΤΕΤΝ (41)	ΝΡΕΟ3ΚΕ (138)
115	<2ΑΕΚΚν (42)	<2ЮРЬЬР (62)
116	<2ΑΕΚΚν (42)	КЮРЬЬР (63)
117	5<2УСТЬ (43)	УУЬНОИС (139)
118	ΥΕϋΚϋ3 (44)	<2ЮРЬЬР (62)
119	УЕЕСЕР (45)	НТУРЬЬК (140)

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЛАСОВЗ, ЗТЕЧЕИ Ο'ΝΕΙΤ, ΚΑΚΥΝ <12 0> КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ КАРКАСА НА ОСНОВЕ ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА ТИПА III <130> ΟΕΝ5240ΡΟΤ <140> РСТ/И32009/062200 <141> 2009-10-26 <150> 61/110120 <151> 2008-10-31 <160> 141 <170> ЕазТЗЕО £ог Νίηάον3 Чегзиоп 4.0 <210> 1 <211> 87 <212> БЕЛОК <213> Ното зарпепз <400> 1

Зег

Рго

Рго

Пуз

Азр

Ьеи

Ча1

Ча1

ТНг

С1и

УаТ

ТНг

СТи

СТи

ТНг

УаТ

1

5

10

15

Азп

Ьеи

АТа

Тгр

Азр

Азп

С1и

Ме£

Агд

УаТ

ТНг

С1и

Туг

Теи

УаТ

УаТ

20

25

30

Туг

ТНг

Рго

ТНг

Низ

С1и

С1у

С1у

Ней

61и

Ме£

С1п

РНе

Агд

Уа1

Рго

35

40

45

С1у

Азр

СТп

ТНг

Зег

ТНг

11е

Не

СТп

С1и

Ьеи

С1и

Рго

СТу

УаТ

С1и

50

55

60

Туг

РНе

Не

Агд

УаТ

РНе

АТа

Не

Ней

61и

Азп

Ьуз

Ьуз

Зег

Не

Рго

65

70

75

80

Уа1

Зег

АТа

Агд

Ча1

АТа

ТНг

85

<210> 2 <211> 95 <212> БЕЛОК <213> Ното :

зар1епз

<400> 2

ТНг Туг

Теи

Рго

А1а

Рго

С1и

С1у

Теи

Туз

РНе

Туз

Зег

Не

Туз

С1и

1

5

10

15

ТНг Зег

Уа1

С1и

УаТ

С1и

Тгр

Азр

Рго

Теи

Азр

Не

АТа

РНе

С1и

ТНг

20

25

30

Тгр С1и

Не

Не

РНе

Агд

Азп

Ме£

Азп

Туз

С1и

Азр

С1и

С1у

С1и

Не

35

40

45

ТНг Ьуз

Зег

Теи

Агд

Агд

Рго

СТи

ТНг

Зег

Туг

Агд

СТп

ТНг

С1у

Теи

50

55

60

А1а Рго

С1у

С1п

С1и

Туг

С1и

Не

Зег

Теи

Низ

Не

Уа1

Туз

Азп

Азп

65

70

75

80

ТНг Агд

СТу

Рго

С1у

Теи

Туз

Агд

Уа1

ТНг

ТНг

ТНг

Агд

Теи

Азр

85

90

95

- 40 028304 <210> 3 <211> 88 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 3

Азр

А1а

Рго

Зег

С1п

11е

С1и

Уа1

Ьуз

Азр

Уа1

ТНг

Азр

ТНг

ТНг

А1а

1

5

10

15

Ьеи

11е

ТНг

Тгр

РНе

Ьуз

Рго

Ьеи

А1а

О1и

11е

Азр

С1у

11е

С1и

Ьеи

20

25

30

ТНг

Туг

С1у

11е

Ьуз

Азр

Уа1

Рго

С1у

Азр

Агд

ТНг

ТНг

11е

Азр

Ьеи

35

40

45

ТНг

С1и

Азр

С1и

Азп

С1п

Туг

Зег

11е

О1у

Азп

Ьеи

Ьуз

Рго

Азр

ТНг

50

55

60

С1и

Туг

С1и

Уа1

Зег

Ьеи

11е

Зег

Агд

Агд

С1у

Азр

МеН

Зег

Зег

Азп

70 75 80

Рго А1а Ьуз С1и ТНг РНе ТНг ТНг <210> 4 <211> 100 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 4

ТНг

С1у

Ьеи

Азр

А1а

Рго

Агд

Азп

Ьеи

Агд

Агд

Уа1

Зег

С1п

ТНг

Азр

1

5

10

15

Азп

Зег

11е

ТНг

Ьеи

С1и

Тгр

Агд

Азп

О1у

Ьуз

А1а

А1а

Не

Азр

Зег

20

25

30

Туг

Агд

11е

Ьуз

Туг

А1а

Рго

11е

Зег

О1у

С1у

Азр

Шз

А1а

С1и

Уа1

35

40

45

Азр

Уа1

Рго

Ьуз

Зег

С1п

С1п

А1а

ТНг

ТНг

Ьуз

ТНг

ТНг

Ьеи

ТНг

С1у

50

55

60

Ьеи

Агд

Рго

С1у

ТНг

С1и

Туг

С1у

11е

С1у

Уа1

Зег

А1а

Уа1

Ьуз

С1и

65

70

75

80

Азр

Ьуз

С1и

Зег

Азп

Рго

А1а

ТНг

11е

Азп

А1а

А1а

ТНг

С1и

Ьеи

Азр

90 95

ТНг Рго Ьуз Азр 100 <210> 5 <211> 88 <212> БЕЛОК <213> Ното зарьепз <400> 5

Азр ТНг 1

Рго Ьуз

Азр Ьеи С1п Уа1 Зег С1и ТНг А1а С1и ТНг Зег Ьеи

5

10

15

ТНг

Ьеи

Ьеи

Тгр

Ьуз

ТНг

Рго

Ьеи

А1а

Ьуз

РНе

Азр

Агд

Туг

Агд

Ьеи

20

25

30

Азп

Туг

Зег

Ьеи

Рго

ТНг

С1у

С1п

Тгр

Уа1

С1у

Уа1

С1п

Ьеи

Рго

Агд

40 45

Азп ТНг ТНг Зег Туг Уа1 Ьеи Агд О1у Ьеи О1и Рго О1у О1п О1и Туг 50 55 60

Азп Уа1 Ьеи Ьеи ТНг А1а С1и Ьуз С1у Агд Н1з Ьуз Зег Ьуз Рго А1а 65 70 75 80

Ьуз Зег Ьуз Рго А1а Агд Уа1 Ьуз <210> б <211> 92 <212> БЕЛОК <213> Ното зарьепз <400> б

С1п А1а Рго О1и Ьеи О1и Азп Ьеи ТНг Уа1 ТНг С1и Уа1 О1у Тгр Азр 15 10 15

С1у Ьеи Агд Ьеи Азп Тгр ТНг А1а А1а Азр С1п А1а Туг С1и Н1з РНе 20 25 30

Не 11е С1п Уа1 С1п С1и А1а Азп Ьуз Уа1 С1и А1а А1а Агд Азп Ьеи 35 40 45

ТНг Уа1 Рго С1у Зег Ьеи Агд А1а Уа1 Азр 11е Рго С1у Ьеи Ьуз А1а 50 55 60

А1а ТНг Рго Туг ТНг Уа1 Зег 11е Туг О1у Уа1 11е О1п О1у Туг Агд 65 70 75 80

ТНг Рго Уа1 Ьеи Зег А1а С1и А1а Зег ТНг О1у О1и

90 <210> 7 <211> 91 <212> БЕЛОК <213> Ното зарьепз <400> 7

С1и ТНг Рго Азп Ьеи С1у С1и Уа1 1 5

А1а Ьеи Ьуз Ьеи Азп Тгр ТНг А1а 20

РНе 11е С1п 35

ТНг Уа1 Рго 50

А1а ТНг Шз 65

ТНг ТНг Рго

Уа1 С1п С1и А1а Азр 40

С1у С1у Ьеи Агд Зег 55

Туг ТНг 11е ТНг 11е 70

Ьеи Зег Уа1 С1и Уа1 85

Уа1

Рго

ТНг

ТНг

Агд

Ьеи

Уа1 А1а 10

С1и СТу

Уа1 С1и

Азр Ьеи

С1у Уа1 75

ТНг С1и 90

С1и Уа1 С1у Тгр Азр 15

А1а Туг С1и Туг РНе 30

А1а А1а С1п Азп Ьеи 45

Рго О1у Ьеи Ьуз А1а 60

ТНг С1п Азр РНе Зег 80 <210> 8 <211> 91 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 8

С1и Уа1 Рго Азр МеН С1у Азп Ьеи ТНг Уа1 ТНг С1и Уа1 Зег Тгр Азр 15 10 15

А1а Ьеи Агд Ьеи Азп Тгр ТНг ТНг Рго Азр С1у ТНг Туг Азр С1п РНе 20 25 30

ТНг Не С1п Уа1 С1п С1и А1а Азр С1п Уа1 С1и С1и А1а Н1з Азп Ьеи 35 40 45

ТНг Уа1 Рго С1у Зег Ьеи Агд Зег МеН С1и 11е Рго С1у Ьеи Агд А1а 50 55 60

С1у ТНг Рго Туг ТНг Уа1 ТНг Ьеи Н1з С1у С1и Уа1 Агд С1у Н1з Зег 65 70 75 80

ТНг Агд Рго Ьеи А1а Уа1 С1и Уа1 Уа1 ТНг С1и

90 <210> 9 <211> 95 <212> БЕЛОК

<213> Ното :

заргепз

<400> 9

Азр

Ьеи

Рго

С1п

Ьеи

С1у

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Зег

С1и

Уа1

С1у

Тгр

Азр

1

5

10

15

С1у

Ьеи

Агд

Ьеи

Азп

Тгр

ТНг

А1а

А1а

Азр

Азп

А1а

Туг

С1и

Ηί3

РНе

20

25

30

Уа1

Не

С1п

Уа1

С1п

С1и

Уа1

Азп

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

А1а

С1п

Азп

Ьеи

35

40

45

ТНг

Ьеи

Рго

С1у

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Уа1

Азр

11е

Рго

С1у

Ьеи

С1и

А1а

50

55

60

А1а

ТНг

Рго

Туг

Агд

Уа1

Зег

11е

Туг

С1у

Уа1

11е

Агд

С1у

Туг

Агд

65

70

75

80

ТНг

Рго

Уа1

Ьеи

Зег

А1а

С1и

А1а

Зег

ТНг

А1а

Ьуз

С1и

Рго

С1и

85

90

95

<210> 10 <211> 91 <212> БЕЛОК <213> Ното £

заргепз

<400> 10

Ьуз С1и Рго

С1и

11е

С1у

Азп

Ьеи

Азп

Уа1

Зег

Азр

11е

ТНг

Рго

С1и

1

5

10

15

Зег РНе Азп

Ьеи

Зег

Тгр

МеН

А1а

ТНг

Азр

С1у

11е

РНе

С1и

ТНг

РНе

20

25

30

ТНг 11е С1и

11е

11е

Азр

Зег

Азп

Агд

Ьеи

Ьеи

С1и

ТНг

Уа1

С1и

Туг

35

40

45

Азп 11е Зег

С1у

А1а

С1и

Агд

ТНг

А1а

Ηί3

11е

Зег

С1у

Ьеи

Рго

Рго

50

55

60

Зег ТНг Азр

РНе

11е

Уа1

Туг

Ьеи

Зег

С1у

Ьеи

А1а

Рго

Зег

11е

Агд

65

70

75

80

ТНг Ьуз ТНг

11е

Зег

А1а

ТНг

А1а

ТНг

ТНг

С1и

85

90

<210> 11 <211> 91 <212> БЕЛОК <213> Ното :

заргепз

<400> 11

А1а Ьеи Рго

Ьеи

Ьеи

С1и

Азп

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Азр

11е

Азп

Рго

Туг

1

5

10

15

С1у РНе ТНг

Уа1

Зег

Тгр

МеН

А1а

Зег

С1и

Азп

А1а

РНе

Азр

Зег

РНе

20

25

30

Ьеи Уа1 ТНг

Уа1

Уа1

Азр

Зег

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

С1п

С1и

РНе

35

40

45

ТНг Ьеи Зег

С1у

ТНг

С1п

Агд

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Агд

С1у

Ьеи

11е

ТНг

50

55

60

С1у Не С1у

Туг

С1и

Уа1

МеН

Уа1

Зег

С1у

РНе

ТНг

С1п

С1у

Ηί3

С1п

65

70

75

80

ТНг Ьуз Рго

Ьеи

Агд

А1а

С1и

11е

Уа1

ТНг

С1и

85

90

<210> 12 <211> 92 <212> БЕЛОК

<213> Ното заргепз

<400> 12

А1а С1и Рго

С1и

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

Ьеи

Уа1

Зег

Азр

А1а

ТНг

Рго

Азр

1

5

10

15

С1у РНе Агд

Ьеи

Зег

Тгр

ТНг

А1а

Азр

С1и

С1у

Уа1

РНе

Азр

Азп

РНе

20

25

30

Уа1 Ьеи Ьуз

11е

Агд

Азр

ТНг

Ьуз

Ьуз

С1п

Зег

С1и

Рго

Ьеи

С1и

Не

35

40

45

ТНг Ьеи Ьеи

А1а

Рго

С1и

Агд

ТНг

Агд

Азр

Ьеи

ТНг

С1у

Ьеи

Агд

С1и

50

55

60

А1а ТНг С1и

Туг

С1и

11е

С1и

Ьеи

Туг

С1у

11е

Зег

Ьуз

СТу

Агд

Агд

65

70

75

80

Зег С1п ТНг

Уа1

Зег

А1а

11е

А1а

ТНг

ТНг

А1а

МеН

85

90

<210> 13 <211> 89 <212> БЕЛОК <213> Ното £

заргепз

<400> 13

С1у Зег Рго

Ьуз

С1и

Уа1

11е

РНе

Зег

Азр

11е

ТНг

С1и

Азп

Зег

А1а

1

5

10

15

ТНг Уа1 Зег

Тгр

Агд

А1а

Рго

ТНг

А1а

С1п

1/а1

С1и

Зег

РНе

Агд

11е

20

25

30

ТНг Туг Уа1

Рго

11е

ТНг

С1у

С1у

ТНг

Рго

Зег

МеН

Уа1

ТНг

Уа1

Азр

35

40

45

С1у ТНг Ьуз

ТНг

С1п

ТНг

Агд

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

11е

Рго

С1у

Уа1

С1и

50

55

60

Туг Ьеи Уа1

Зег

11е

11е

А1а

МеН

Ьуз

СТу

РНе

С1и

С1и

Зег

С1и

Рго

65

70

75

80

Уа1 Зег СТу

Зег

РНе

ТНг

ТНг

А1а

Ьеи

85

<210> 14 <211> 88 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз

<400> 14

Азр С1у Рго

Зег

С1у

Ьеи

Уа1

ТНг

А1а

Азп

11е

ТНг

Азр

Зег

С1и

А1а

1

5

10

15

Ьеи А1а Агд

Тгр

С1п

Рго

А1а

Не

А1а

ТНг

Уа1

Азр

Зег

Туг

Уа1

11е

20

25

30

Зег Туг ТНг

С1у

С1и

Ьуз

Уа1

Рго

С1и

11е

ТНг

Агд

ТНг

Уа1

Зег

С1у

35

40

45

Азп ТНг Уа1

С1и

Туг

А1а

Ьеи

ТНг

Азр

Ьеи

С1и

Рго

А1а

ТНг

С1и

Туг

50

55

60

ТНг Ьеи Агд

11е

РНе

А1а

С1и

Ьуз

СТу

Рго

С1п

Ьуз

Зег

Зег

ТНг

11е

65

70

75

80

ТНг А1а Ьуз

РНе

ТНг

ТНг

Азр

Ьеи

85

- 42 028304 <210> 15 <211> 89 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 15

Азр Зег Рго Агд Азр Ьеи ТЬг А1а ТЬг С1и \/а1 С1п Зег С1и ТЬг А1а 15 10 15

Ьеи Ьеи ТЬг Тгр Агд Рго Рго Агд А1а Зег Йа1 ТЬг С1у Туг Ьеи Ьеи 20 25 30

Уа1 Туг С1и Зег Уа1 Азр СТу ТЬг Уа1 Ьуз С1и Уа1 Не Уа1 СТу Рго

Азр ТЬг ТЬг Зег Туг Зег Ьеи А1а Азр Ьеи Зег Рго Зег ТЬг Н1з Туг 50 55 60

ТЬг А1а Ьуз 11е С1п А1а Ьеи Азп С1у Рго Ьеи Агд Зег Азп Мек 11е 65 70 75 80

С1п ТЬг 11е РЬе ТЬг ТЬг 11е С1у Ьеи <210> 16 <211> 89 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Связывающий полипептид

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Ьуз

Азп

Ьеи

Уа1

Уа1

Зег

С1и

Уа1

ТЬг

С1и

Азр

Зег

1

5

10

15

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Тгр

ТЬг

А1а

Рго

Азр

А1а

А1а

РЬе

Азр

Зег

РЬе

Ьеи

20

25

30

Не

С1п

Туг

С1п

С1и

Зег

С1и

Ьуз

Уа1

С1у

С1и

А1а

11е

Азп

Ьеи

ТЬг

35

40

45

Уа1

Рго

С1у

Зег

С1и

Агд

Зег

Туг

Азр

Ьеи

ТЬг

С1у

Ьеи

Ьуз

Рго

С1у

50

55

60

ТЬг

С1и

Туг

ТЬг

УаТ

Зег

11е

Туг

СТу

УаТ

Ьуз

СТу

СТу

Нгз

Агд

Зег

Азп Рго Ьеи Зег А1а С1и РЬе ТЬг ТЬг <210> 17 <211> 267 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Нуклеотид, кодирующий связывающий полипептид <400> 17 скдссддсдс сдааааасск ддккдкккск даадккассд аадаскскск дсдкскдкск 60 кддассдсдс сддасдсддс дкксдаскск кксскдаксс адкассадда акскдааааа 120 дккддкдаад сдаксаасск дассдккссд ддккскдаас дкксккасда сскдассддк 180 скдааассдд дкассдаака сассдкккск акскасддкд ккаааддкдд ксассдккск 240 аасссдскдк скдсддаакк сассасс 267 <210> 18 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> ипкпоип <222> (28) (29) (31) (32) (34) (35) (37) (38) (40) (41) (43) (44) (46) (47) <223> Праймер, в котором η может представлять собой а, с, к или д даакасассд кккскакска сддкдккппз ппзппзппзп пзппзппзсс дскдкскдсд 60 даакксас 68 <210> 19 <211> 64 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> ипкпоип <222> (22) (23) (25) (26) (28) (29) (30) (31) (32) (34) (35) (37) (38) <223> Праймер, в котором η может представлять собой а, с, к или д даскскскдс дкскдксккд дппзппзппз ппзппзппзк ксдасксккк сскдакссад 60 касс 64 <210> 20 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> ипкпоип <222> (22) (23) (25) (26) (28) (29) (30) (31) (32) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) <223> Праймер, в котором η может представлять собой а, с, к или д и з может представлять собой д или с.

дкдааккссд садасадсдд дппзппзппз ппзппзппзп паасассдка дакадааасд 60 дкд 63 <210> 21 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 21

Зег Туг С1у РЬе Азп Азп <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	22
ТЪг Туг С1и СТу СТи	Зег
1	5
<210>	23
<211>	6
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	23
ТЪг Туг СТи Зег СТи	Зег
Т	5
<2Т0>	24
<2ТТ>	6
<2Т2>	БЕЛОК
<2ТЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	24
ТЪг Азп Тгр МеЬ Азр	Зег
Т	5
<2Т0>	25
<2ТТ>	6
<2Т2>	БЕЛОК
<2ТЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	25
Ьуз Зег УаТ РЪе ТТе	МеЬ
Т	5
<2Т0>	26
<2ТТ>	6
<2Т2>	БЕЛОК
<2ТЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	26
Туг Зег Зег Туг АТа Т 5	ТЪг
<2Т0>	27
<2ТТ>	6
<2Т2>	БЕЛОК
<2ТЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	27
Агд РЪе Нтз Рго РЪе	Рго
Т	5
<2Т0>	28
<2 Т Т>	6
<2Т2>	БЕЛОК
<2ТЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	28
МеЬ МеЬ Суз МеЬ Рго Т 5	Ьеи
<2Т0>	29
<2 Т Т>	6
<2Т2>	БЕЛОК
<2ТЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	29
Туг Суз Агд УаТ Агд	Азр
Т	5
<2Т0>	30
<2ТТ>	6
<2Т2>	БЕЛОК
<2ТЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)

<400> 30

МеА Азр Суз РАе МеА С1у <210> 31 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 31

ТАг Туг Агд РАе Азп Зег <210> 32 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

А1а Зег Агд Агд Зег Ьеи <210> 33 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

ТАг Не О1и Зег О1и Зег <210> 34 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

ТАг Ьеи МеА С1п Зег 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 35

11е Туг Азр Зег О1и Зег <210> 36 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркас человека типа III (ΕΝ3) . основе домена фибронектина <400> 36

Азр Агд Ьуз Агд РАе Не <210> 37 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 37

С1и РАе Тгр Агд С1у Зег <210> 38 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 38

С1у Ьеи Ьеи Азр Рго Ьеи <210> 39 <211> 6

- 45 028304 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 39

О1у Ьеи Уа1 Ьеи Рго О1и <210> 40 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 40

МеЬ А1а Зег Азр С1у Ьеи <210> 41 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 41

Азп Ьуз ТПг С1и ТЬг Азп <210> 42 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 42

С1п А1а О1и Агд Ьуз Уа1 <210> 43 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 43

Зег С1п Уа1 Суз ТПг Ьеи <210> 44 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 44

Туг РПе Азр Ьуз Азр Зег <210> 45 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 45

Туг РПе С1и Суз С1и Рго <210> 46 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 46

С1п Не С1у Рго 11е 11е Рго <210> 47 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

- 46 028304

Зег Не Агд ТАг 11е Азр Зег 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового человека типа III (ΕΝ3) <400> 48 Рго Ьуз РАе Нгз Зег Рго Ьеи	каркаса на	основе	домена фибронектина
1	5
<210>	49
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового	каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа III (ΕΝ3)
<400>	49
Тгр Ьуз ТАг ТАг 11е Тгр РАе 1 5
<210>	50
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового	каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа III (ΕΝ3)
<400>	50
Агд Ьуз Азп Тгр Ьуз ТАг Агд
1	5
<210>	51
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового	каркаса на	основе	домена фибронектина

человека типа III (ΕΝ3) <400> 51

Агд Ьеи РАе Агд 11е Туг О1п

5 <210> 52 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 52

Тгр Ьеи Зег Агд Зег Туг Азр 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 53

Тгр Ьеи Зег Агд Зег Суз Азр

1	5
<210>	54
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)
<400>	54
Тгр МеА С1у Рго Туг Суз Азр
1	5
<210>	55
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)
<400>	55

Агд Агд Агд Агд Туг Зег РАе 1 5

- 47 028304 <210> 56 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 56

Нтз 11е Уа1 Рго Меб Уа1 Рго 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 57

С1п 11е О1и Рго 11е 11е Агд 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 58

Рго Зег А1а А1а Азп Азп Рго 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 59

Уа1 Агд Ьеи Агд Туг Уа1 С1п 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 60

С1п Уа1 О1у Рго Ьеи 11е Рго 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 61

Агд 11е О1у Рго 11е Ьеи Рго 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 62

С1п 11е С1у Рго Ьеи Ьеи Рго 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 63

Агд 11е С1у Рго Ьеи Ьеи Рго 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

- 48 028304 <400> 64

СЬп 7/а1 С1у Рго Ьеи Ьеи Рго <210> 65 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 65

Агд Не О1у Рго МеЬ Ьеи Рго <210> 66 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΡΝ3) <400> 66

СЬп 11е С1у Рго Уа1 Ьеи Рго <210> 67 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 67

Агд 11е С1у Рго Уа1 Ьеи Рго <210> 68 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 68

С1п Не О1у Рго МеЬ МеЬ Рго <210> 69 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 69

С1п Уа1 С1у Рго Ьеи Уа1 Рго <210> 70 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 70

С1п 11е С1у Рго МеЬ Ьеи Рго <210> 71 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 71

С1п Уа1 О1у Рго Не Ьеи Рго <210> 72 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 72

С1п Уа1 С1у Рго МеЬ Ьеи Рго

- 49 028304 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
человека типа <400> 73 С1п 11е СТу Рго 11е	III (ΕΝ3) Уа1 Рго
1	5
<210>	74
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	74
Меб 11е О1у Рго Ьеи 1 5	Ьеи Рго
<210>	75
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	75
С1п 11е С1у Рго Ьеи	РПе Рго
1	5
<210>	76
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	76
С1п 11е СТу Рго Меб	Уа1 Рго
1	5
<210>	77
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	77
С1п 11е Обу Рго 11е 1 5	Уа1 Рго
<210>	78
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	78
Агд 11е С1и Рго 11е	Ьеи Рго
1	5
<210>	79
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	79
УаТ Аба Обу Зег УаТ	Тгр Рго
б	5
<2б0>	80
<2бб>	7
<2б2>	БЕЛОК
<2бЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	80
Агд Оби Обу Аба ТПг б 5	Ьеи Туг
<2б0>	86
<2бб>	7
<2б2>	БЕЛОК
<2бЗ>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на	основе	домена фибронектина

человека типа III (ΕΝ3) <400> 81

Ьуз 01η 11е Рго Рго 11е Ьеи <210> 82 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 82

Ьеи Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Ьеи <210> 83 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 83

Нгз МеА Ьеи Ьеи Рго Ьеи Рго <210> 84 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 84

МеА Не С1у Рго Ьеи Ые Рго <210> 85 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 85

ТАг Ые С1у Рго Нгз 11е Рго 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 86

С1и Ые С1у Рго Суз Ьеи Рго <210> 87 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 87

С1и Ые С1у Рго Уа1 Ьеи Рго <210> 88 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 88

Ьуз 11е 01у Рго Суз Ьеи Рго <210> 89 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 89

МеА 11е 01у Рго Уа1 Ьеи Рго <210> 90 <211> 7

- 51 028304 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	90
С1п Не С1у Рго 11е	Ьеи Рго
1	5
<210>	91
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	ΙΙΙ (ΕΝ3)
<400>	91
С1и Уа1 С1у Рго 11е	Ьеи Рго
1	5
<210>	92
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	92
С1п Уа1 С1у Рго Ьеи	Ьеи Рго
1	5
<2 10>	93
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	ΙΙΙ (ΕΝ3)
<400>	93
С1п Не С1у Рго Уа1	МеЪ Рго
1	5
<210>	94
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	94
С1п 11е С1у Рго Суз	Уа1 Рго
1	5
<210>	95
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	95
С1п 11е С1у Рго Ьеи	Уа1 Рго
1	5
<210>	96
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	96
Агд С1у Ьеи Уа1 МеЪ	Рго МеЪ
1	5
<210>	97
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	97
МеЪ 11е С1у Рго 11е	Ьеи Рго
1	5
<210>	98
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина

человека типа III (ΕΝ3) <400> 98

Суз Не С1у Рго Мек Уа1 Рго 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина
человека типа <400> 99 РПе 11е О1у Рго Уа1	III (ΕΝ3) Ьеи Рго
1	5
<210>	100
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	100
Нгз 11е С1у Рго 11е	Ьеи Рго
1	5
<210>	101
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	101
Нгз 11е О1у Рго 11е	Мек Рго
1	5
<210>	102
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	102
Нгз 11е С1у Рго Туг	Ьеи Рго
1	5
<210>	103
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	103
Нгз Уа1 С1у Рго 11е	Ьеи Рго
1	5
<210>	104
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	104
11е 11е С1у Рго Ьеи	Ьеи Рго
1	5
<210>	105
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	105
Мек Уа1 С1у Рго Ьеи	Ьеи Рго
1	5
<210>	106
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина

человека типа III (ΕΝ3) <400> 106

Мек Уа1 О1у Рго Ьеи Ьеи Рго 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса ι человека типа III (ΡΝ3) основе домена фибронектина <400> 107

Азп Не С1у Рго Туг Ьеи Рго <210> 108 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΡΝ3) <400> 108

Азп 11е С1у Рго Туг Ьеи Рго <210> 109 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

С1п 11е С1у Рго Шз Ьеи Рго <210> 110 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 110

С1п Не О1у Рго 11е Ьеи О1у <210> 111 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 111

С1п 11е С1у Рго 11е Ьеи Зег <210> 112 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 112

О1п 11е О1у Рго 11е Ьеи ТЬг <210> 113 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 113

С1п Не С1у Рго 11е МеЬ Рго <210> 114 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 114

С1п 11е С1у Рго 11е Рго 11е <210> 115 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

- 54 028304

С1п Не О1у Рго Ьеи Ьеи Азп 1 5 <210> 116 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе	домена	фибронектина
человека типа <400> 116 С1п Не О1у Рго Уа1	III (ΕΝ3) РПе Рго
1	5
<210>	117
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	117
С1п 11е О1у Рго Уа1	Ьеи Зег
1	5
<210>	118
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	118
С1п 11е О1у Рго Тгр	Ьеи Рго
1	5
<210>	119
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	119
С1п Уа1 О1у Рго Т1е	МеЬ Азп
1	5
<210>	120
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	120
С1п Уа1 С1у Рго 11е 1 5	МеЬ Рго
<210>	121
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	121
С1п Уа1 С1у Рго 11е 1 5	Уа1 Рго
<210>	122
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина
	человека типа	III (ΕΝ3)
<400>	122
С1п Уа1 С1у Рго Ьеи	Ьеи Зег
1	5
<210>	123
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса	на	основе	домена	фибронектина

человека типа III (ΕΝ3) <400> 123

С1п Уа1 С1у Рго Уа1 Ьеи Рго 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> БЕЛОК

- 55 028304 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 124

С1п Уа1 О1у Рго Уа1 Ьеи Рго 1 5 <210> 125 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 125

Агд 11е С1у Рго 11е Меб Рго 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 126

Агд 11е С1у Рго 11е Уа1 Рго 1 5 <210> 127 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 127

Агд 11е С1у Рго Меб РПе Рго 1 5 <210> 128 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 128

Агд 11е О1у Рго Меб 11е Рго 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 129

Агд 11е О1у Рго Меб Уа1 Рго 1 5 <210> 130 <2ΐι> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 130

Агд 11е С1у Рго Уа1 11е Рго 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 131

Агд Уа1 С1у Рго 11е Леи Рго 1 5 <210> 132 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 132

Агд Уа1 С1у Рго Ьеи Ьеи Рго 1 5 <210> 133 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 133

ТАг Уа1 С1у Рго Нгз Не Рго 1 5 <210> 134 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 134

Рго Зег Тгр Агд Зег Азп Тгр

1	5
<210>	135
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина
	человека типа III (ΓΝ3)
<400>	135
А1а Ьеи Агд А1а ТАг Ьеи О1и
1	5
<210>	136
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина

человека типа III (ΕΝ3) <400> 136

Ьуз Туг С1у Туг Ьеи ТАг Рго 1 5 <210> 137 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 137

Агд 11е 01у Рго МеА Ьеи Рго 1 5 <210> 138 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΓΝ3) <400> 138

Азп Рго РАе Суз Зег Агд РАе 1 5 <210> 139 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 139

Туг Туг Ьеи Нгз С1п Тгр Суз 1 5 <210> 140 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <400> 140

Нгз Не Уа1 Рго Ьеи Ьеи Агд 1 5 <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3)

- 57 028304 <210> 141 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (ΕΝ3) <400> 141

ТЬг Зег С1у С1у С1у С1у Зег

Claims (2)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3), полученного из консенсусной последовательности домена ΡΝ3, включающий стадии получения полипептида из консенсусной последовательности домена ΡΝ3, имеющего по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности 8Ер ГО N0:16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности 8Ер ГО N0: 16, для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3).
2. 2. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3), включающий стадии получения полипептида, имеющего последовательность аминокислот 8Ер ГО Ν0: 16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей аминокислотную последовательность 8Ер ГО Ν0:16 для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (ΡΝ3).