JP2023551388A - マクロピノサイトーシス選択的モノボディ－薬物コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本開示は、マクロピノサイトーシス選択的非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物および診断用組成物に関する。これらの非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、薬学的に活性な部分または診断部分に接続されている非結合性フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含む。本開示はまた、その必要のある対象に、本明細書に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、処置方法および診断方法に関する。TIFF2023551388000007.tif63166

Description

本願は、2020年11月10日に出願された米国仮特許出願第63/112,039号の優先権の恩典を主張する。米国仮特許出願第63/112,039号は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる。
分野
本開示は、マクロピノサイトーシス選択的非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物および診断用組成物に関する。これらの非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、薬学的に活性な部分または診断部分に接続された非結合性フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含む。本開示は、本明細書に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む処置方法および診断方法に関する。
背景
全ヒトがんの約1/3はKRasタンパク質変異から生じることが、30年以上にわたって知られてきた。これには、高いパーセントの肺がん(約25％)、膵臓がん(約95％)、および結腸がん(約45％)が含まれる。KRasタンパク質が変異すると、細胞は、制御できずに増殖し、死のシグナルから逃れ、多数の利用可能ながん療法に対して細胞を抵抗性にさえする。過去30年にわたってKRasがんの生物学の理解に大きな進展があったが、これらのがんに対する現行の療法は比較的、効果がないままである。新薬候補の開発およびFDA承認の取得における大きな障害は、オフターゲット効果から生じることが多い毒性問題である。
本開示は、当技術分野における、この制約および関連する制約を克服することに関する。
概要
本開示の第1の局面は、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物に関する。薬学的組成物の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、第1の部分と、アミノ酸リンカーと、第2の部分とを含む。タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分は、非結合性フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含み、タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分は、アミノ酸リンカーを介して第1の部分に接続されており、薬学的に活性な部分または診断部分より選択される。
本開示の別の局面は、対象においてがんを処置する方法に関する。この方法は、がんを有する対象に、がんを処置するのに有効な量の本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む組成物を投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、対象において腫瘍を画像化する方法に関する。この方法は、腫瘍を有する対象を選択する工程、および本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む組成物を対象に投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、対象の免疫応答を調節する方法に関する。この方法は、免疫系調節から利益を得る状態を有する対象に、対象の免疫応答を調節するのに有効な量の、本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む組成物を投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、対象において神経変性状態を処置する方法に関する。この方法は、神経変性状態を有する対象に、神経変性状態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、対象において炎症状態を処置する方法に関する。この方法は、炎症状態を有する対象に、炎症状態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、対象において骨病態を処置する方法に関する。この方法は、骨病態を有する対象に、骨病態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、対象において感染性疾患または感染性状態を処置する方法に関する。この方法は、感染性疾患を有する対象に、感染性疾患を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。
図1A～1Dは、MC-低分子(モノボディ)コンジュゲーションおよび効率の特徴付けを示す。図1Aは、モノボディ-低分子コンジュゲートの模式図を示す。図1Bは、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)コンジュゲーション後にシフトを示したゲルシフトアッセイである。MMAEコンジュゲーションは>95％であることが確かめられた。図1Cは、モノボディへのCy5.5コンジュゲーションを確認することを目的とした800nmで画像化したSDS-PAGEゲルを示す。図1Dは、モノボディへのMMAEコンジュゲーションのパーセントを観察することを目的としたエルマン試験を示す。エルマン試薬は、溶液中の利用可能な遊離チオールを測定する。 図1-1の説明を参照。 図1-1の説明を参照。 図2A～2Cは、本明細書において開示される非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの細胞取り込みがマクロピノサイトーシス(MP)を介して特異的に行われることを示す。図2Aおよび図2Bは、ヒトPDAC MIA PaCaおよびHeLaまたはHeLa KRasV12細胞における蛍光タグ化モノボディおよびMPマーカーの取り込みを示す。DAPI、青色の中にある蛍光タグ化モノボディ(緑色)とMPマーカー(デキストラン、赤色)との共局在。四角で囲んだ領域は拡大挿入図である。図2Cは、発がん性Ras(HeLaKRasV12およびMIAPaCa-2)細胞におけるモノボディ(FN-Cy5.5)のフローサイトメトリー分析を示す。 図2Aの説明を参照。 図2Aの説明を参照。 図3A～3Bは、本明細書において開示される非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの細胞取り込みがマクロピノサイトーシス(MP)を介して特異的に行われることを示す。図3Aは、マウスPDAC KPC1203細胞における蛍光タグ化モノボディおよびMPマーカーの取り込みを示す。DAPI、青色の中にある蛍光タグ化モノボディ(赤色)とMPマーカー(デキストラン、緑色)との共局在。四角で囲んだ領域は拡大挿入図である。図3Bは、WT Rasおよび変異Rasヒト結腸直腸がん細胞における蛍光タグ化モノボディおよびMPマーカーの取り込みを示す。蛍光タグ化モノボディ(緑色)およびMPマーカー(デキストラン、赤色)とDAPI、青色の共局在。 図3Aの説明を参照。 図4A～4Cは、発がん性KRas細胞株においてモノボディ-薬物コンジュゲートの毒性が高いことを示す。図4Aでは、漸増濃度のFN-MMAEで処理したHeLa(-KRas)およびHeLa KRasV12(+KRas)細胞において赤外線色素Syto60でモニタリングした時の細胞生存率を追跡する。図4Bは、漸増濃度のFN-MMAEおよびMMAEで処理した、異なる組織に由来する野生型Ras細胞株(破線の上、白丸)および発がん性Ras細胞株(破線の下、黒丸)を示す。FN-MMAE IC50値をMMAE値に対して正規化した。図4Cは、野生型Ras細胞株(BxPC3)および発がん性Ras細胞株(MiaPaca-2)を漸増濃度のFN-SN38で処理したことを示す。 図4-1の説明を参照。 図5A～5Bは、インビボで発がん性KRas細胞株においてFN-MMAE(モノボディ)の毒性が大きいことを示す。図5Aでは、0日目、7日目、および14日目(黄色の矢印)に、確立した(100～150mm3)MiaPaCaおよびBxPC3皮下腫瘍を、PBS(負の対照)、0.2mg/kgのMMAE単独、または0.2mg/kgのFN-MMAE非結合性タンパク質コンジュゲートで処置した。FN-MMAE処置動物では、体積によって評価した時の腫瘍成長は、MMAE処置単独と比較して遅かった。n=4/処置群。エラーバーは腫瘍体積のSEMを表す。図5Bは、MIA PaCa腫瘍を有するマウスのエクスビボ臓器のH&Eを示す。これにより、FN-MMAEについては明らかな毒性はなかったが、MMAE単独では目に見える肝臓損傷があったことが分かる。 図5Aの説明を参照。 図6A～6BはMMAEのエクスビボ分析および作用機序を示す。図6Aは、PBS、MMAE、およびFN-MMAEと多数のアポトーシスマーカー(すなわち、CC3、HMGB1、および切断Parp1)で処置した、MIAPaCa腫瘍を有するマウスに由来する腎臓のエクスビボ分析を示す。これらの画像におけるマーカー発現から、FN-MMAEはPBSと比較してほとんど差がないか、または全く差がなく、それに対して、遊離MMAEは非特異的毒性が大幅に増加したことが分かる。図6Bの画像は、MMAEの作用機序がチューブリン不安定化を介したものであることを示す。MMAE処置マウスの腎臓ではチューブリン染色は激減したのに対して、FN-MMAEは明らかな効果を示さなかった。 図6A-1の説明を参照。 図6A-1の説明を参照。 図7A～7Eは腫瘍特異的生体内分布を示す。図7Aは、PBS、Cy5.5-COOH、またはFN-Cy5.5で処置した、MIA PaCa腫瘍を有するマウスにおいて24時間の時間経過にわたってIVISを用いて生体内分布が検出されたことを示す。図7Bは、24時間の時点でIVIS画像化によって生検組織がエクスビボ分析されたことを示す。MIA PaCa2およびBxPC3異種移植片をFN-Cy5.5で処置し、エクスビボ画像化を用いてFN-Cy5.5のKRas選択的取り込みを観察した(図7C)。図7Dは、6時間後にマウスを屠殺し、主要臓器を分離し、モノボディの腫瘍取り込みおよび蓄積、全身クリアランス、ならびに潜在的な毒性のある組織を分析するためにエクスビボでIVISによって画像化したことを示す。図7Eは、Cy5.5およびFN-Cy5.5の腫瘍取り込み、保持、およびがん細胞マーカー(CK8)との共局在を図示するために画像化された腫瘍切片を示す。 図7-1の説明を参照。 図7-1の説明を参照。 図8A～8Cは、同所性移植KPC腫瘍を有するマウスにおけるFN-Cy5.5の生体内分布を示す。PBS、またはCy5.5を基準として5nmolのFN-Cy5.5、マウスアルブミン(MSA)-Cy5.5、およびマウスIgG-Cy5.5によって、KPC腫瘍を有するマウスを処置した。エクスビボ生体内分布と血液蛍光(図8C)を観察するために1時間(図8A)および24時間(図8B)でマウスを屠殺した。グラフは、MSAとFN(赤色)およびIgGとFN(青色)を比較した正規化された値を表す。FNは1時間で腎臓および肝臓において2倍激増した。このことは、腫瘍保持がほぼ同じか、または増えながらも素早い排出が起こったことを示している。24時間で、腫瘍値がほぼ同じでありながら(MSAについては90％、IgGについては100％)、腎臓および肝臓にあるFNは低減した。FNは1時間で血液蛍光が1/3になった。このことからも、他のタンパク質コンジュゲートと比較して素早い排出が起こったことが強調される。 図8-1の説明を参照。 図9A～9CはFN-Cy5.5のリンパ節分析を示す。図9Aは、同所性移植KPC腫瘍を有するマウスに投与した、Cy5.5-COOH、FN-Cy5.5、およびCy5.5が表面にコンジュゲーションしたペグ化ナノ粒子の模式図を示す。図9Bでは、エクスビボIVIS画像化から、FN-Cy5.5は気管支リンパ節(BLN)と比較してPDACリンパ節(PLN)の方が2倍多くあることが分かった。図9Cは、樹状細胞(DC)、すなわち、古典的樹状細胞(上のグラフ)および形質細胞様樹状細胞(下のグラフ)におけるCy5.5取り込みを示したグラフである。示したように、細胞へのFN取り込みが2倍増加することが観察された。 図9Aの説明を参照。 図9Aの説明を参照。 図10A～10Dは、PDACの遺伝子組換えマウスモデルにおけるFN-Cy5.5取り込みを示す。自発性(autochonous)LSL-KPCG12V;LSLp53R172H;p48Cre(KPC, 4mo)および野生型(WT, 4mo)マウスをFN-Cy5.5で処置した。図10Aのエクスビボ画像は1時間および24時間での様々な臓器における生体内分布を図示する。正規化された放射効率は、自発性KPCモデルにおいて腫瘍に多く取り込まれることを示す(図10B)。図10C～10Dにおいて、エクスビボ画像(6時間)は、腫瘍への取り込み、保持、およびがん細胞マーカー(CK8)との共局在を図示する。 図10-1の説明を参照。 図10-1の説明を参照。 FN-Cy5.5およびアルブミン-FITCで2時間処置した自発性LSL-KPCG12V;LSLp53R172H;p48Cre(KPC, 4mo)マウスにおけるエクスビボ腫瘍分析を示す。マウスを屠殺し、アルブミン-FITC(緑色)、FN-Cy5.5(紫色)、腫瘍細胞マーカーCK8(オレンジ色)、およびdapi(青色)を示した腫瘍に対してエクスビボ分析を行った。視覚的に、FN-Cy5.5はアルブミン-FITCよりも良好にCK8陽性PDAC腫瘍の管を潜在的に染色することが観察されたが、この観察は腫瘍の場所に基づいて、いくらかの差違を示した。 図12A～12Cは、FN-DOTA-Gd3+を用いたMRI検出を示す。図12Aは、キレート剤(DOTA)単独(左)、またはリンカー分子のC末端にある孤立システインとコンジュゲーションしたキレート剤(DOTA)(右)を示した模式図である。図12Bでは、2μmol/kgのDOTA-Gd3+およびFN-DOTA-Gd3+を、KPC同所性腫瘍を有するマウスに注射した。FN-DOTA-Gd3+については、腫瘍においてシグナルの増大および保持の延長が観察された。図12Cは、4ヶ月齢の自発性KPCマウスに尾静脈を介して注射したFN-DOTA-Gd3+を示す。腹側から背側(それぞれ、上部および下部)の方向に横断した2つの解剖学的平面でのFN-DOTA-Gd3+注射前(左)および注射後(右)のMRI画像化を示した。赤色の矢印は腎臓内でのシグナル検出を指している。赤色の矢じりは、可能性のある膵臓腫瘍を指している。上部の輪郭は、Ki、腎臓;Pa、膵臓;Sp、脾臓;St、胃を示す。 図12Aの説明を参照。 図12Aの説明を参照。 図13A～13BはKPC同所性腫瘍のMRI画像化を示す。(図13A)DOTA-Gd3+および(図13B)FN-DOTA-Gd3+を用いたKPC同所性移植腫瘍のMRI画像化。 図13Aの説明を参照。 図14A～14Cは、ヒト多発性骨髄腫がん細胞株における蛍光タグ化モノボディおよびMPマーカーの取り込みを示す。図14Aおよび14Bは、KMS11 WT Ras、L363変異NRAS、およびRPMI 8226変異KRas細胞における蛍光タグ化モノボディ(赤色)およびMPマーカー(デキストラン、緑色)の共局在を示した画像である。DAPI、青色。FN-Cy5.5は、マクロピノサイトーシス阻害剤EIPAおよびKH7の添加によって消失した、変異Ras細胞株における取り込みの増加を示した。図14Cは、37℃および4℃での変異KRas RPMI 8226細胞におけるFN-Cy5.5取り込みを示す。 図14-1の説明を参照。 図15A～15Cは、WT Ras KMS11多発性骨髄腫細胞において作り出された変異KRas誘導系を示す。図15Aはウエスタンブロットを示し、図15Bは、ドキシサイクリン処理による変異KRas発現を確認する膜ラッフリングアッセイを示す。図15Cは、ドキシサイクリンを添加すると、KMS11細胞は、マイナスドキシサイクリンでは観察されなかったFN-Cy5.5取り込みを示したことを示す。このことも、変異Ras細胞における選択的なFN-Cy5.5取り込みを強調する。 図15Aの説明を参照。 図15Aの説明を参照。 様々な発がん性Ras多発性骨髄腫細胞株におけるCy5.5およびFN-Cy5.5のフローサイトメトリー分析を示す。 多発性骨髄腫におけるRas状態に基づいた腫瘍蓄積の差違を示す。変異NRas L363またはWT Ras KMS1l腫瘍を有するマウスにおけるFN-Cy5.5生体内分布。変異Ras腫瘍はWT腫瘍(下のグラフ)と比較してFN-Cy5.5取り込みの有意な増加を示した。
詳細な説明
本開示の第1の局面は、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物に関する。薬学的組成物の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、第1の部分と、アミノ酸リンカーと、第2の部分とを含む。非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分は、非結合性フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含み、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分は、アミノ酸リンカーを介して第1の部分に接続されており、薬学的に活性な部分または診断部分より選択される。
FN3ドメインは、約100アミノ酸長であり、βサンドイッチ構造を有する進化的に保存されたタンパク質ドメインである。ヒトFN3のβサンドイッチ構造は、鎖A、B、C、D、E、F、Gと呼ばれる7つのβ鎖と、免疫グロブリン結合ドメインに対して構造相同性を示すループAB、BC、CD、DE、EF、およびFGと呼ばれる6つの接続ループとを含む。6つのループのうち3つ、すなわち、ループDE、BC、およびFGは、位相幾何学的に抗体の相補性決定領域、すなわち、CDR1、CDR2、およびCDR3に対応する。残りの3つのループは、抗体CDR3と同様に表面に露出している。多くの天然FN3ドメインおよび改変FN3ドメインが、特定の標的タンパク質またはタンパク質の標的ドメインへの結合を可能にするループおよび鎖領域を含有するが(すなわち、モノボディ)、本開示のタンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインは非結合性FN3ドメインである。本明細書で使用する「非結合性FN3ドメイン」は、他のどのタンパク質またはタンパク質ドメインとも結合せず、相互作用しない天然FN3ドメインおよび改変FN3ドメインを含む。すなわち、前記ドメインはRGD結合ドメインおよび他のタンパク質相互作用領域を欠いている。
本開示のタンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、これらのドメインを含有する、多種多様な動物、酵母、植物、および細菌の細胞外タンパク質のいずれかに由来するFN3ドメインでもよい。一態様では、FN3ドメインは哺乳動物FN3ドメインまたはその非結合性変種である。例示的なFN3ドメインは、例えば、ヒトテネイシンCに存在するFN3ドメイン、またはヒトフィブロネクチン(FN)に存在するFN3ドメインのいずれか一つを含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、FN3ドメインは、表1に示したSEQ ID NO:6-21のアミノ酸配列より選択されるヒトフィブロネクチン(UniProtKBアクセッション番号P02751)の非結合性FN3ドメイン、またはその非結合性変種もしくは誘導体である。一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインは、ヒトフィブロネクチンの第10フィブロネクチンIII型ドメインの変種(すなわち、SEQ ID NO:1の変種)である。一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインは、SEQ ID NO:22-36のアミノ酸配列(表1)より選択されるヒトテネイシン(UniProtKBアクセッション番号P24821)の非結合性FN3ドメイン、またはその変種もしくは誘導体である。一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインは、非天然合成の非結合性FN3ドメイン、例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Jacobsらへの米国特許出願公開第2010/0216708号に記載の非天然合成の非結合性FN3ドメインである。個々のFN3ドメインはドメイン番号とタンパク質名、例えば、フィブロネクチンの第10 FN3ドメイン(10FN3)によって言及される。
(表１)ヒトフィブロネクチンおよびテネイシンに由来する例示的なFN3ドメイン
Figure 2023551388000002
Figure 2023551388000003
*ヒトフィブロネクチンのドメイン命名法は、Potts and Campbell, 「Fibronectin Structure and Assembly」, Curr. Opin. Cell Biol. 6:648-655 (1994)に示される従来の命名法である。ヒトテネイシンのドメイン命名法は、UniProtアクセッション番号P24821において提供される命名法である。
一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインは、機能的結合活性をほとんど有さないか、または機能的結合活性を全く有さないことが知られているFN3ドメインである。適切な非結合性FN3ドメインは、ヒトフィブロネクチンの第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第11、第12、および第13 III型フィブロネクチンドメイン(SEQ ID NO:6～12、16、18、および19)、ならびにヒトフィブロネクチンのEDBおよびEDAドメイン(SEQ ID NO:13および17)を含む。適切なFN3ドメインはまた、SEQ ID NO:6～12、16、18、または19のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％類似するアミノ酸配列を有する非結合性ドメインも含む。
一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの適切なFN3ドメインは、ヒトテネイシンの第1、第2、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、および第15 III型フィブロネクチンドメイン(SEQ ID NO:22、23、25～36)のいずれか一つを含む。非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの適切なFN3ドメインはまた、SEQ ID NO:22、23、および25～36のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％類似するアミノ酸配列を有する非結合性ドメインも含む。
一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインは、ヒトフィブロネクチンの第8、第9、第10、第14、および第15 III型フィブロネクチンドメインの非結合性変種、またはヒトテネイシンの第3 III型フィブロネクチンドメインの非結合性変種である。これらの非結合性変種は、SEQ ID NO:1、14、15、20、21、および24のアミノ酸配列中に少なくとも1つのアミノ酸残基改変を含有する。従って、適切なFN3ドメインは、SEQ ID NO:1、14、15、20、21、または24のアミノ酸配列に対して配列が80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％類似するアミノ酸配列を有するFN3ドメインを含む。適切なFN3ドメインは、SEQ ID NO:1、14、15、20、21、または24のいずれか一つのアミノ酸配列に対して配列が<100％類似するアミノ酸配列を有するFN3ドメインを含む。
一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインはフィブロネクチンの第10 FNドメイン(10FN3)に由来する。一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインはヒト10FN3ドメインに由来する。ヒト10FN3ドメインは、以下に示したようにSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する。SEQ ID NO:1の野生型配列中にあるBC(残基24～30)、CD(残基40～45)、DE(残基51～55)、およびFG(残基75～86)ループの場所に下線を引いた。本開示によれば、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインはSEQ ID NO:1の非結合性変種である、すなわち、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列中に1つまたは複数のアミノ酸付加、置換、または欠失を含む。
Figure 2023551388000004
本開示によれば、本開示のタンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、FN3ドメインのFGループ、すなわち、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基75～86のRGDアミノ酸配列中に少なくとも1つの改変を含有する、SEQ ID NO:1の変種を含む。適切な改変にはアミノ酸置換、挿入、および/または欠失が含まれる。一局面では、RGDを介した結合を無くすように、FN3ドメインのFGループのRGDアミノ酸残基の少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つが改変される。一部の態様では、本開示の非結合性FN3ドメインは、SEQ ID NO:1の位置78に対応する位置にあるアルギニン(R)(R78)が置換または欠失されている、SEQ ID NO:1の変種を含む。適切なアミノ酸置換は、セリン(S)、アラニン(A)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、およびグルタミン(Q)より選択される残基との置換を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置78のアルギニンに対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからセリンへの置換(R78S)である。一部の態様では、本開示の非結合性FN3ドメインは、SEQ ID NO:1の位置79に対応する位置にあるグリシン(G)(G79)が置換または欠失されている、SEQ ID NO:1の変種を含む。適切なアミノ酸置換は、S、A、E、D、K、N、またはQより選択される残基との置換を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置79にあるグリシンに対応するアミノ酸残基におけるグリシンからセリンへの置換(G79S)である。一部の態様では、本開示の非結合性FN3ドメインは、SEQ ID NO:1の位置80に対応する位置にあるアスパラギン酸(D)(D80)が置換または欠失されている、SEQ ID NO:1の変種を含む。適切なアミノ酸置換は、S、A、E、G、K、N、またはQより選択される残基との置換を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置80にあるアスパラギン酸に対応するアミノ酸残基におけるアスパラギン酸からセリンへの置換(D80S)である。
一部の態様では、本開示のタンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、FGループ中にある、すなわち、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基75～86に対応する、もう1つのさらなるアミノ酸改変を含む。適切なアミノ酸置換は、S、A、E、G、K、N、またはQより選択される残基との置換を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、タンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、FGループがSSSSSSSSS(SEQ ID NO:4)のアミノ酸配列を含むSEQ ID NO:1の変種を含む。
一部の態様では、タンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、BCループのアミノ酸配列中に、すなわち、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基24～30において1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。適切なアミノ酸置換は、S、A、E、G、K、N、またはQより選択される残基との置換を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、タンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、BCループがSSSSSVS(SEQ ID NO:5)のアミノ酸配列を含むSEQ ID NO:1の変種を含む。
一部の態様では、タンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、以下に示したSEQ ID NO:2のアミノ酸配列:
Figure 2023551388000005
を含み、
式中、
X3は、D、S、A、E、G、K、N、およびQより選択され、
X7は、D、S、A、E、G、K、N、およびQより選択され、
X24は、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X25は、P、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X26は、A、S、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X27は、V、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X28は、T、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X30は、R、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X75は、V、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X76は、T、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X77は、G、S、A、E、K、N、D、およびQより選択され、
X78は、R、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X79は、G、S、A、E、K、N、D、およびQより選択され、
X80は、D、S、A、E、G、K、N、およびQより選択され、
X81は、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X82は、P、S、A、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
X83は、A、S、E、G、K、N、D、およびQより選択され、
但し、非結合性FN3ドメインはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含まない。
一部の態様では、タンパク質-薬物コンジュゲートの非結合性FN3ドメインは、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023551388000006
一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分は、タンデムに連結された2つ以上の非結合性FN3ドメインを含む。一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分は、タンデムに連結された本明細書に記載の2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くの非結合性FN3ドメインを含む。
一部の態様では、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分は、1つまたは複数のタグ配列、例えば、精製/生産目的のポリ-ヒスチジン(His6-)タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST-)タグ、ビオチン化タグ、もしくはマルトース結合タンパク質(MBP-)タグ、および/または1つもしくは複数のプロテアーゼ切断部位をさらに含む。タグおよび切断部位は、非結合性FN3ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端に組み込むことができる。
本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分をコンジュゲートの第2の部分に接続するアミノ酸リンカーをさらに含む。一部の態様では、アミノ酸リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の態様では、アミノ酸リンカーは、切断不可能なリンカーである。適切なリンカーには、グリシンおよびセリンまたはアラニンおよびプロリンなどのアミノ酸の1つまたは複数の反復モジュールで構成されるペプチドが含まれる。例示的なリンカーペプチドには、例えば、(Gly-Gly)n、(Gly-Ser)n、(Gly3-Ser)n、(Ala-Pro)nが含まれ、式中、nは1～25の整数である。リンカーの長さは非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの機能に影響を及ぼさない限り、適切に調節され得る。標準的な15アミノ酸(Gly4-Ser)3リンカーペプチドは十分に特徴付けられており、構造不定で柔軟なコンホメーションをとることが示されている。さらに、このリンカーペプチドは、リンカーペプチドが接続するドメインの集合および活性を妨害しない(Freund et al., 「Characterization of the Linker Peptide of the Single-Chain Fv Fragment of an Antibody by NMR Spectroscopy」, FEBS 320:97 (1993)。この開示は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる)。
第1の部分と第2の部分とを、ペプチドまたは他のリンカーを用いて取り付けて非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを生成するために、周知の化学カップリング法が使用され得る。例えば、共有結合による第1の部分と第2の部分とのコンジュゲーションは活性化エステルまたはイソチオシアネートを用いてリジン側鎖を介して成し遂げられてもよく、マレイミド、ハロアセチル誘導体、または活性化ジスルフィドを用いてシステイン側鎖を介して成し遂げられてもよい。第1の部分と第2の部分との部位特異的コンジュゲーションはまた、非天然アミノ酸、自己標識タグ(例えば、SNAPもしくはDHFR)、またはソルターゼA、リポ酸リガーゼ、およびホルミルグリシン生成酵素などの別の酵素によって特異的に認識および修飾されるタグを組み込むことでも成し遂げることができる。一部の態様では、第1の部分と第2の部分との部位特異的コンジュゲーションは、非結合性FN3部分のC末端に、またはその全体が本明細書において参照により組み入れられる、Goldberg et al.,「Engineering a Targeted Delivery Platform Using Centyrins」, Protein Engineering, Design & Selection 29(12):563-572 (2016)およびAndersonらへの米国特許出願公開第20200325210号に記載のように、特定の部位にシステイン残基を導入することによって成し遂げられる。
一部の態様では、本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分は薬学的に活性な部分である。適切な薬学的に活性な部分は、低分子、核酸分子、抗体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、およびタンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)を含む。
一部の態様では、薬学的に活性な部分はがん治療剤である。適切ながん治療剤は、代謝拮抗物質、アルカロイド、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、DNA結合薬、毒素、抗増殖薬、DNAアンタゴニスト、放射性核種、サーモアブレーティブ剤、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、核酸阻害剤、および免疫調節剤を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤はアルカロイドである。適切なアルカロイドは、デュオカルマイシン、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤はアルキル化剤である。適切なアルキル化剤は、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロランブシル、クロラナファジン(chloranaphazine)、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドHCl、メルファラン、ノベメビキン(novemebichin)、ペルホスファミド フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、セムスチン ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミド、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は抗腫瘍性抗生物質である。適切な抗腫瘍性抗生物質は、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン(cromomycin)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-l-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピラビシン(epirabicin)、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン(nogalamycine)、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は代謝拮抗剤である。適切な代謝拮抗剤は、SN-38、デノプテリン、エダトレキセート、メルカプトプリン(6-MP)、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン、ペントスタチン(2'-DCF)、トムデックス、トリメトレキセート、クラドリジン(cladridine)、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、ヒドロキシウレア、ウレタン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は抗増殖薬である。適切な抗増殖薬は、アセグラトン、アムサクリン、ビサントレン、カンプトテシン、デホスファミド、デメコルシン、ジアジクオン、ジフロモテカン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、エトプシド(etopside)、フェンレチニド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、ラメラリンD、ロニダミン、ミルテホシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ポドフィリン酸(podophillinic acid)2-エチル-ヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、ソブゾキサン、スピロゲルマニウム、テニポシド、テヌアゾン酸、トリアジクオン2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は有糸分裂阻害剤である。適切な有糸分裂阻害剤は、アウリスタチン、マイタンシノイド、ドラスタチン、ツブリシン、タキサン、エポシロン、ビンカアルカロイド、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、有糸分裂阻害剤はアウリスタチンである。一部の態様では、アウリスタチンはモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である。
一部の態様では、がん治療剤はPROTACである。適切なPROTACは、BETデグレーダー(BET degrader)、例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Pillow et al., 「Antibody Conjugation of a Chimeric BET Degrader Enables In vivo Activity」, ChemMedChem 15(1): 17-25 (2020)に開示されるBETデグレーダーを含むが、それに限定されるわけではない。適切なPROTACはRasデグレーダーも含む。
一部の態様では、本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は免疫調節剤である。一部の態様では、免疫調節剤は、1つまたは複数のタイプの免疫細胞、例えば、1型マクロファージ、2型マクロファージ、樹状細胞、好中球、B細胞、およびT細胞の表現型を調節する薬剤である。例えば、一部の態様では、免疫調節剤は、免疫細胞を活性化するように免疫細胞表現型を調節する薬剤である。一部の態様では、免疫調節剤は、免疫細胞を抑制するように免疫細胞表現型を調節する薬剤である。
一部の態様では、免疫調節剤はマクロファージ1型刺激剤である。適切なマクロファージ1型刺激剤は、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニストを含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、マクロファージ1型刺激剤はCSF-1受容体アンタゴニストである。適切なCSF-1受容体アンタゴニストは、ABT-869(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Guo et al., 「Inhibition of Phosphorylation of the Colony-Stimulating Factor-1 Receptor (c-Fms) Tyrosine Kinase in Transfected Cells by ABT-869 and Other Tyrosine Kinase Inhibitors」, Mol. Cancer. Ther. 5(4):1007-1012 (2006))、イマチニブ(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Guo et al., 「Inhibition of Phosphorylation of the Colony-Stimulating Factor-1 Receptor (c-Fms) Tyrosine Kinase in Transfected Cells by ABT-869 and Other Tyrosine Kinase Inhibitors」, Mol. Cancer. Ther. 5(4):1007-1012 (2006))、PLX3397(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Mok et al., 「Inhibition of CSF1 Receptor Improves the Anti-tumor Efficacy of Adoptive Cell Transfer Immunotherapy」, Cancer Res. 74(1):153-161 (2014))、PLX5622(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Dagher et al., 「Colony-stimulating Factor 1 Receptor Inhibition Prevents Microglial Plaque Association and Improves Cognition in 3xTg-AD Mice」, J. Neuroinflamm. 12:139 (2015))、DCC-3014(Deciphera Pharmaceuticals)、BLZ945(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Krauser et al., 「Phenotypic and Metabolic Investigation of a CSF-1R Kinase Receptor Inhibitor (BLZ945) and its Pharmacologically Active Metabolite」, Xenobiotica 45(2):107-123 (2015))、およびGW2580(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Olmos-Alonso et al., 「Pharmacological Targeting of CSF1R Inhibits Microglial Proliferation and Prevents the Progression of Alzheimer’s-like Pathology」, Brain 139:891-907 (2016))を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、マクロファージ1型刺激剤はIL-10受容体アンタゴニストである。適切なIL-10受容体アンタゴニストは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Naiyer et al., 「Identification and Characterization of a Human IL-10 Receptor Antagonist」, Hum. Immunol. 74(1):28-31 (2013)に記載のペプチドアンタゴニスト、およびその全体が本明細書において参照により組み入れられる、Von Herrathらへの米国特許第7,553,932号に記載のIL-10受容体アンタゴニスト抗体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、マクロファージ1型刺激剤は、TLRアゴニスト、すなわち、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、またはTLR9アゴニストである。本明細書に記載の方法において使用するための適切なTLR-2アゴニストは、合成トリアシル化リポタンパク質であるPam3CSK4、およびリポテイコ酸(LTA)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Brandt et al., 「TLR2 Ligands Induce NF-κB Activation from Endosomal Compartments of Human Monocytes」 PLoS One 8(12):e80743)を含む。適切なTLR-3アゴニストは、ポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Smole et al., 「Delivery System for the Enhanced Efficiency of Immunostimulatory Nucleic Acids」, Innate Immun. 19(1):53-65 (2013))を含むが、それに限定されるわけではない。適切なTLR-4アゴニストは、MPL(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011))、グルコピラノシルリピド-A(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Matzner et al., 「Perioperative treatment with the new synthetic TLR-4 agonist GLA-SE reduces cancer metastasis without adverse effects」, Int. J. Cancer 138(7):1754-64 (2016))、およびImmunomax(登録商標)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Ghochikyan et al., 「Targeting TLR-4 with a novel pharmaceutical grade plant derived agonist, Immunomax(登録商標), as a therapeutic strategy for metastatic breast cancer」, J. Trans. Med. 12:322 (2014))を含むが、それに限定されるわけではない。
適切なTLR-7アゴニストは、ウリジン/グアニジンリッチ一本鎖RNA(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011))、852A (その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Dudek et al., 「First in Human Phase I Trial of 852A, a Novel Systemic Toll-like Receptor 7 Agonist, to Activate Innate Immune Responses in Patients With Advanced Cancer」, Clin. Cancer Res. 13(23):7119-7125 (2007))、レシキモド(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Chang et al., 「Topical resiquimod Promotes Priming of CTL to Parenteral Antigens」, Vaccine 27(42):5791-5799 (2009))、イミダゾキノリン(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Itoh et al., 「The Clathrin-mediated Endocytic Pathway Participates in dsRNA-induced IFN-beta Production」, J. Immunol. 181:5522-9 (2008))、ANA975(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Fletcher et al., 「Masked oral Prodrugs of Toll-like Receptor 7 Agonists: a New Approach for the Treatment of Infectious Disease」, Curr. Opin. Investig. Drugs 7(8):702-708 (2006))、およびイミキモド(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011))を含むが、それに限定されるわけではない。
適切なTLR-8アゴニストは、レシキモド(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Chang et al., 「Topical resiquimod Promotes Priming of CTL to Parenteral Antigens」, Vaccine 27(42):5791-5799 (2009))、およびイミダゾキノリン(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Itoh et al., 「The Clathrin-mediated Endocytic Pathway Participates in dsRNA-induced IFN-beta Production」, J. Immunol. 181:5522-9 (2008))を含むが、それに限定されるわけではない。
適切なTLR-9アゴニストは、CpG-ODN(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Yao et al., 「Late Endosome/Lysosome-localized Rab7b Suppresses TLR-9-initiated Proinflammatory Cytokine and Type I IFN Production in Macrophages」, J. Immunol. 183:1751-8 (2009))を含むが、それに限定されるわけではない。使用に適した特定のCpG-ODNは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011)に記載されている。
2型マクロファージを1型マクロファージにリプログラミングするための当技術分野において公知の他の薬剤(すなわち、マクロファージ1型刺激剤)は、二酸化マンガンナノ粒子(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Song et al.,「Bioconjugated Manganese Dioxide Nanoparticles Enhance Chemotherapy Response by Priming Tumor-Associated Macrophages toward M1-like Phenotype and Attenuating Tumor Hypoxia」 ACS Nano. 10:633-647 (2016)を参照されたい)、フェルモキシタール(ferumoxytal)ナノ粒子(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Zanganeh, et al. 「Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues」, Nat. Nanotechnol. 11:986-994 (2016))、IκBαに対するマンノシル化ナノ粒子カプセル化siRNA(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Ortega et al. 「Manipulating the NF-kappaB pathway in macrophages using mannosylated, siRNA-delivering nanoparticles can induce immunostimulatory and tumor cytotoxic functions」, Int. J. Nanomed. 2163-2177 (2016))を含む。本開示によれば、これらの薬剤を、本明細書に記載の非結合性FN3ドメインに接続して、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを形成することができる。
一部の態様では、免疫調節剤はマクロファージ2型刺激剤である。適切なマクロファージ2型刺激剤は、IL-33、IL-4受容体アゴニスト、グルココルチコイド、IL-10受容体アゴニスト、およびIL-1受容体アゴニストを含むが、それに限定されるわけではない。
適切なIL-4受容体アゴニストは変異IL-4タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。例示的な変異IL-4タンパク質は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Sebaldへの米国特許第5,723,118号に記載の変異IL-4タンパク質を含むが、これに限定されない。
グルココルチコイドは、当技術分野において周知であり、かつマクロファージ2型表現型を誘導するのに適したコルチコステロイドの一種である。本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートに組み込むための例示的なグルココルチコイドは、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン、およびアルドステロンを含むが、それに限定されるわけではない。
IL-10受容体アゴニストも、本明細書に記載のコンジュゲートおよび方法に従ってマクロファージ2型表現型を誘導することができる。適切なIL-10受容体アゴニストは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Sommerらへの米国特許第7,749,490号に記載の変異IL-10タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。
IL-1受容体アゴニストもマクロファージ2型表現型を誘導することができ、従って、本明細書に記載の非結合性タンパク質コンジュゲートの薬物成分として組み込むことができる。適切なIL-1受容体アゴニストは、IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、および IL-36γ(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Palomo et al., 「The Interleukin (IL)-1 Cytokine Family- Balance Between Agonists and Antagonists in Inflammatory Diseases」, Cytokine 76(1):25-37 (2015))を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、免疫調節剤はマクロファージ2型枯渇剤である。適切なマクロファージ枯渇剤はクロドロネート、ゾレドロン酸、アレンドロネート、およびトラベクテジンを含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、免疫調節剤はT細胞刺激剤である。適切なT細胞刺激剤は、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストを含むが、それに限定されるわけではない。STINGアゴニストは、環状ジヌクレオチド(CDN)、例えば、環状二量体グアノシン一リン酸(c-di-GMP)、環状二量体アデノシン一リン酸(c-di-AMP)、環状GMP-AMP(cGAMP)、およびジチオ-(RP,RP)-[環状[A(2',5')pA(3',5')p(ADU-S100, Aduro Biotech)、ならびに低分子、例えば、5,6-ジメチルキサテンテノン-4-酢酸(DMXAA)および連結されたアミドベンズイミダゾールを含むが、それに限定されるわけではない。本開示に従う適切な免疫調節剤でもある開発中の他のSTINGアゴニストは、BMS-986301、E7766、GSK3745417、MK-1454、MK-2118、およびSB11285を含む。
一部の態様では、免疫調節剤は樹状細胞刺激剤である。本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートに含めるのに適した樹状細胞刺激剤は、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、トポイソメラーゼI阻害剤(例えば、カンプトテシンおよびその誘導体)、微小管脱重合薬(例えば、コルヒチン、ポドフィロトキシン、およびその誘導体)を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、免疫調節剤は好中球刺激剤である。適切な好中球刺激剤は組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質(フィルグラスチム)またはペグ化組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分はオリゴヌクレオチドである。適切なオリゴヌクレオチドは、siRNA、アプタマー、miRNA、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、およびガイドRNAを含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は創傷治癒剤である。本開示のこの局面に従う適切な創傷治癒剤は、免疫細胞の炎症誘発性表現型を刺激する薬剤を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、創傷治癒を処置するための薬学的に活性な部分は、前記のマクロファージ1型刺激剤である。
一部の態様では、本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、神経変性疾患を処置するのに適した治療剤部分である。例示的な神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象においてALSを処置するのに適したALS治療剤である。適切なALS治療剤は、グルタミン酸遮断薬(例えば、リルゾール、リルテック、および他の誘導体)、エンダラボン(Endaravone)、ラジカヴァ、筋弛緩剤(例えば、バクロフェン、チザニジン、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象においてパーキンソン病を処置するためのパーキンソン病治療剤である。パーキンソン病を処置するのに適した治療剤は、ドーパミン促進剤(例えば、カルビドパ、レボドパ、カルビドパ・レボドパ、エンタカポン、カベルゴリン、トルカポン、ブロモクリプチン、アマンタジン、および他の誘導体)、ドーパミンアゴニスト(例えば、プラミペキソール、ミラペックス、ロピニロール、レキップ、ロチゴチン、ニュープロ、アポモルフィン、アポカイン)、認知向上薬(リバスチグミン、および他の誘導体)、抗振戦薬(例えば、ベンゾトロピン、および他の誘導体)、MAOB阻害剤(セレギリン、ゼラパー(Zelapar)、ラサギリン、アジレクト、サフィナミド、ザダーゴ、および他の誘導体)、カテコールO-メチルトランスフェラーゼ(COMT)阻害剤(例えば、エンタカポン、コムタン、オピカポン、オンジェンティス、トルカポン、タスマール、抗コリン作用薬(例えば、ベンゾトロピン、コジェンティン、トリヘキシフェニジル、および他の誘導体)、ならびにその類似体および組み合わせを含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象においてハンチントン病を処置するためのハンチントン病治療剤である。ハンチントン病の症状を処置するのに適した治療剤は、運動制御薬(例えば、テトラベナジン、キセナジン、デューテトラベナジン、アウステド(Austedo)、および他の誘導体)、抗精神薬(例えば、ハロペリドール、ハルドール、フルフェナジン、リスペリドン、リスパダール、オランザピン、ジプレキサ、クエチアピン、セロクエル、および他の誘導体)、舞踏病抑制薬(例えば、アマンタジン、ゴコブリ(Gocovri)ER、オスモレックス(Osmolex)ER、レベチラセタム、ケプラ、エレプシア(Elepsia)XR、スプリタム(Spritam)、クロナゼパム、クロノピン(Klonopin)、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象においてアルツハイマー病を処置するためのアルツハイマー病治療剤である。アルツハイマー病を処置するのに適した治療剤は、認知向上薬(例えば、メマンチン、ナメンダ、および他の誘導体)、コリンエステラーゼ阻害剤(例えば、ドネペジル、アリセプト、ガランタミン、ラザダイン、リバスチグミン、イクセロン、および他の誘導体)、アデュカヌマブ、アデュヘルム(Aduhelm)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、炎症状態を処置するのに適した治療剤部分である。この非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを利用して処置することができる例示的な炎症状態は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、骨粗鬆症、免疫炎症、非免疫炎症、腎臓炎症、結核、多発性硬化症、関節炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、およびアルツハイマー病を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)(例えば、イブプロフェン、アドビル、モトリンIB、ナプロキセンナトリウム、アリーブ、および他の誘導体)、コルチコステロイド薬(例えば、プレドニゾンおよび他の誘導体)、従来の疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)(例えば、メトトレキセート、トレキサル(Trexall)、オトレキアプ(Otrexup)、レフルノミド、アラバ、ヒドロキシクロロキン、プラケニル、スルファサラジンアザルフィジン、および他の誘導体)、生物DMARD(アバタセプト、オレンシア、アダリムマブ、ヒュミラ、アナキンラ、キネレット、セルトリズマブ、シムジア、エタネルセプト、エンブレル、ゴリムマブ、シンポニー、インフリキシマブ、レミケード、リツキシマブ、リツキサン、サリルマブ、ケブザラ、トシリズマブ、アクテムラ、および他の誘導体)、標的化合成DMARD(例えば、バリシチニブ、オルミエント、トファシチニブ、ゼルヤンツ、ウパダシチニブ、リンヴォック、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体である。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、スタチン(例えば、アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、および他の誘導体)、ならびに他のコレステロール薬(例えば、エキセチミベ(exetimibe)、ゼチーア、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、および他の誘導体)、抗凝固剤(例えば、アスピリンおよび他の誘導体)、抗血栓薬、ならびにその類似体および誘導体より選択される抗炎症性治療剤である。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、骨病態を処置するのに適した治療剤である。この非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを用いて処置することができる適切な骨病態は、例えば、骨粗鬆症および骨パジェット病を含む。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象において骨粗鬆症を処置するのに適した骨粗鬆症治療剤である。適切な骨粗鬆症治療剤は、ビスホスホネート(例えば、アレンドロネート、ビノスト(Binosto)、フォサマックス、イバンドロネート、ボニバ、リセドロネート、アクトネル、アテルビア(Atelvia)、ゾレドロン酸、リクラスト、ゾメタ、および他の誘導体)、デノスマブ(例えば、プロリア、ザイゲバ(Xgeva)、および他の誘導体)、ホルモン関連療法(例えば、エストロゲン、ラロキシフェン、エビスタ、テストステロン、および他の誘導体)、骨を作る薬(例えば、テリパラチド、ボンシティ(Bonsity)、フォルテオ(Forteo)、アバロパラチド、チムロス(Tymlos)、ロモソズマブ、イベニティ、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象において骨パジェット病を処置するのに適した骨パジェット病治療剤である。骨パジェット病に適した治療剤は、ビスホスホネート(例えば、ゾレドロン酸、リクラスト、ゾメタ、パミドロネート、アレディア、イバンドロネート、ボニバ、および他の誘導体)、ならびに経口ビスホスホネート(例えば、アレンドロネート、ビノスト、リセドロネート、アクトネル、アテルビア、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象において感染症を処置するのに適した抗ウイルス治療剤である。適切な抗ウイルス治療剤は、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、バロキサビル、ペンシクロビル、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、ウミフェノビル(Umifenovir)、アタザナビル、アトリプラ、バロキサビルマルボキシル、ビクタルビィ(Biktarvy)、ボセプレビル、ブレビルチド(Bulevirtide)、シドホビル、コンビビル、ダクラタスビル、ダルナビル、デラビルジン、デシコビ、ドコサノール、ドルテグラビル、イバシタビン、イドクスウリジン、イミキモド、イムノビル(Imunovir)、レテルモビル、ロピナビル、マラビロク、メチサゾン、モロキシジン、ネルフィナビル、ニタゾキサニド、オセルタミビル、レムデシビル(Remdesivir)、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、ソホスブビル、チプラナビル、バラシクロビル、ビクリビロック、およびザナミビルを含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、感染症を有する対象はフィロウイルスを有する。一部の態様では、フィロウイルスはエボラウイルスまたはマールブルグウイルスである。エボラおよび他のフィロウイルスはエンドサイトーシスを介して宿主細胞に取り付き、侵入する。内部移行したウイルスは後期エンドソーム/リソソームに局在し、システインプロテアーゼによって切断される。この態様によれば、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象においてフィロウイルスを処置するのに適した抗ウイルス治療剤である。適切な抗ウイルス治療剤は、レムデシビル、mAb114(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Kugelman et al. 「Emergence of Ebola virus escape variants in infected nonhuman primates treated with the MB-003 antibody cocktail」, Cell Rep 2015; 12: 2111-20)、REGN-EB3(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Pascal et al. 「Development of clinical-stage human monoclonal antibodies that treat advanced Ebola virus disease in nonhuman primates」, J Infect Dis 2018; 218 (suppl 5): S612-26)、および ZMapp (その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Qiu et al. 「Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp」, Nature 2014; 514: 47-53)を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、感染症を有する対象はコロナウイルスを有する。一部の態様では、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)または中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)である。この態様によれば、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの薬学的に活性な部分は、対象においてコロナウイルスを処置するのに適した抗ウイルス治療剤である。適切な抗ウイルス治療剤は、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、イベルメクチン、レムデシビル、バリシチニブ、およびパキロビッドを含むが、それに限定されるわけではない。
従って、対象において感染症を阻害する、感染症の進行を阻害する、および/または感染症を軽減する治療的手段として、本明細書に記載のNPC1結合分子を、コロナウイルス感染症を有するか、またはコロナウイルス感染症を有するリスクのある対象に投与することができる。
一部の態様では、本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分は診断部分である。適切な診断部分は、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの検出、定量、分離、および/または精製を容易にする部分である。適切な診断部分は、精製タグ(例えば、ポリ-ヒスチジン(His6-)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST-)、マルトース結合タンパク質(MBP-))、蛍光色素もしくはタグ(例えば、キレート(ユーロピウムキレート)、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、ならびにテキサスレッド)、酵素タグ、放射性同位体もしくは放射性標識(例えば、4C、11C、14N、35S、3H、32P、99mTc、111In、62/64Cu、125I、18F、67/68Ga、90Y、177Lu、および186/188Re)、キレート剤を有する放射性核種(例えば、MAG3、DTPA、およびDOTA。その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Liu S., 「Bifunctional Coupling Agents for Radiolabeling of Biomolecules and Target Specific Delivery of Metallic Radionuclides」, Adv. Drug Deli.Ref. 60(12):1347-1370 (2008)も参照されたい)、マイクロバブル(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Abou-Elkacem et al., 「Ultrasound molecular imaging of the breast cancer neovasculature using engineered fibronectin scaffold ligands: A novel class of targeted contrast ultrasound agent」, Theranostics 6:1740-1752 (2016))、画像化に適した造影剤、または光増感剤を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、診断部分は、キレート剤に結合した放射標識、放射性核種、または放射性同位体である。キレート剤に結合することができる特に有用な診断用放射標識、放射性核種、または放射性同位体は、110In、mIn、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、9V、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、158Gd、32P、nC、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、または他のγ、β、もしくはポジトロン放射体を含むが、それに限定されるわけではない。診断用放射標識は、25～10,000keV、より好ましくは25～4,000keV、さらにより好ましくは20～1,000keV、さらにより好ましくは70～700keVの崩壊エネルギーを含む。有用なポジトロン放射放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは<2,000keV、より好ましくは1,000keV未満、および最も好ましくは<700keVである。
様々な放射標識、放射性核種、放射性同位体、金属、および放射性金属と共に、NOTA(1,4,7-トリアザ-シクロノナン-N,N',N''-三酢酸)、DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-l,4,7,10-四酢酸)、DTPA(1,1,4,7,7-ジエチレントリアミンペンタ酢酸)、TETA(p-ブロモアセトアミド-ベンジル-テトラエチルアミン四酢酸)、およびDf(デスフェリオキサミンB)などのキレート剤が役立つ。リガンドが、カルボキシレートまたはアミン基などのハード塩基キレート化官能基を含むDOTA型キレート剤が、ハード酸カチオンをキレート化するのに最も有効である。このような金属キレート錯体は環のサイズを関心対象の金属に合わせることで非常に安定化することができる。同様に、複数のタイプのキレート剤が、複数の金属イオン、例えば、診断用放射性核種および/または治療用放射性核種に結合するように、ターゲティング可能な構築物とコンジュゲーションされ得る。
キレート剤は、標準的なバイオコンジュゲーション法を用いてコンジュゲートの非結合性FN3ドメインに共有結合される。FN3ドメイン中のアミン含有残基(例えば、リジン)は、活性化エステル(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)を含有するキレート剤とアミド結合を形成する。硫黄含有残基(例えば、システイン)は、活性化エステルまたはマレイミド部分を含有するキレート剤とコンジュゲーションする。または、FN3ドメインの活性化カルボキシレート残基が、キレート剤上にあるアミン基とアミド形成するか、またはチオール基とチオイエステル(thoiester)形成する時にバイオコンジュゲートは形成される。例えば、PEG-マレイミド(PEG-Mal)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート(SMCC)、またはN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)などの二官能性リンカーを代わりに使用することができる。
一部の態様では、本開示の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは第3の部分をさらに含む。一部の態様では、本開示のタンパク質-薬物コンジュゲートの第3の部分は半減期延長部分を含む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン変種(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Andersenらへの米国特許第8,822,417号、Desaiらへの米国特許第8,314,156号、およびPlumridgeらへの米国特許第8,748,380号を参照されたい)、アルブミン結合タンパク質および/またはドメイン、トランスフェリンならびにその断片および類似体(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Priorらへの米国特許第7,176,278号を参照されたい)、Fc領域および変種Fc領域(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Lazarらへの米国特許第8,546,543号、Tsuiへの米国特許出願公開第20150125444号、ならびにSeehraらへの米国特許第8,722,615号を参照されたい)を含むが、それに限定されるわけではない。
非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの他の半減期延長部分は、望ましい特性のために、ポリエチレングリコール(PEG)分子、例えば、PEG5000またはPEG20,000、様々な鎖長の脂肪酸および脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物(デキストラン、セルロース、オリゴ糖、または多糖類)を含むが、それに限定されるわけではない。ペギル部分が、例えば、当技術分野において周知の方法を用いてシステイン残基を分子のC末端に付加し、ペギル基をシステインに取り付けることによって、第1の部分、すなわち、非結合性FN3部分に付加されてもよい。
治療的または診断的使用のために、本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、薬学的に許容される担体中に、活性成分として有効量のタンパク質-薬物コンジュゲートを含有する薬学的組成物および診断用組成物として調製される。「担体」という用語は、活性化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなビヒクルは、液体、例えば、水、および石油、動物、植物、または合成由来の油を含む油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などでもよい。例えば、0.4％食塩水と0.3％グリシンを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に粒子状物質を含まない。これらの溶液は従来の周知の滅菌法(例えば、濾過)によって滅菌され得る。前記組成物は、生理学的条件に近づくように、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、ならびに着色剤などを含有してもよい。このような薬学的製剤の中の本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの濃度は大きく異なることがある、すなわち、約0.5重量％未満、通常、約1重量％または少なくとも約1重量％から15重量％または20重量％と大きな濃度になることがあり、主として、選択された特定の投与方法に応じて、必要とされる用量、流体の体積、粘性などに基づいて選択される。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む適切なビヒクルおよび製剤は、例えば、REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092に記載されている。特に、その全体が本明細書において参照により組み入れられる958～989頁を参照されたい。
本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、単離されていない形で、または単離された形で使用することができる。さらに、本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは単独で、または少なくとも1種類の他の本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む混合物中で使用することができる。言い換えると、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、組み合わされて、例えば、2種類以上の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物として使用することができる。例えば、望ましい治療効果を実現するように、異なるが、補完的な活性を有する非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを単一療法において組み合わせることができる。だが、代わりに、望ましい治療効果または診断効果を実現するように、同一の活性を有する非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートも単一療法において組み合わせることができる。任意で、混合物は少なくとも1種類の他の治療剤をさらに含む。
本開示の別の局面は、対象においてがんを処置する方法に関する。この方法は、がんを有する対象に、がんを処置するのに有効な量の本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートまたは非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物を投与する工程を含む。
本明細書に記載の方法の全てによれば、「対象」は任意の動物を指す。一部の態様では、対象は哺乳動物である。例示的な哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウマ、畜牛および乳牛、ヒツジ、ならびにブタを含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、対象はヒトである。
一部の態様では、対象は、対応する非がん細胞と比べて増大したマクロピノサイトーシスを有するがん細胞を特徴とするがんの一種を有する。一部の態様では、がんは、rasに発がん変異を有するがん細胞、すなわち、H-ras、N-ras、またはK-rasに発がん変異を有するがん細胞を特徴とする。一部の態様では、対象は、膵臓がん、肺がん、乳がん、結腸がん、神経膠腫、固形腫瘍、メラノーマ、多形性神経膠芽腫、白血病、腎細胞がん、肝細胞がん、前立腺がん、およびミエローマより選択されるがんを有する。
一部の態様では、対象は、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲート、または非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物を投与する工程の前に、原発がんの治療的処置に対して抵抗性であるか、または抵抗性になっている、例えば、化学療法処置に対して抵抗性であるか、または抵抗性になっているがんの一種を有する。がん治療剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲート、またはがん治療剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物を投与する工程は、がん細胞を直接、標的とし、死滅させるのに有効な量で行われる。がん治療剤、例えば、代謝拮抗物質、アルカロイド、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、DNA結合薬、微小管標的薬、毒素、抗増殖薬、DNAアンタゴニスト、放射性核種、サーモアブレーティブ剤、またはPROTACを含む適切な非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートが前記で説明されている。
一部の態様では、対象は、免疫寛容であるか、免疫寛容になっているがんの一種を有する。免疫調節剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲート、または免疫調節剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物を投与する工程は、抗腫瘍性免疫応答を強化するのに有効な量で行われる。免疫調節剤、例えば、マクロファージ1型刺激剤、マクロファージ2型枯渇剤、T細胞刺激剤、樹状細胞刺激剤、および/または好中球刺激剤を含む適切な非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートが前記で説明されている。
一部の態様では、がんを有する対象を処置する方法は、さらなるがん治療剤を、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートまたは非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物と一緒に投与する工程をさらに含む。併用療法として本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートと組み合わせて投与することができる適切ながん治療剤は化学療法剤を含むが、それに限定されるわけではない。適切な化学療法剤は、例えば、アルキル化剤(例えば、クロランブシル、シクロホファミド(cyclophophamide)、CCNU、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、BCNU、およびブスルファン)、代謝拮抗物質(例えば、メトトラキサート(methotraxate)、6-メルカプトプリン、および5-フルオロウラシル)、アントラサイクリン(ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、およびミトキサントロン)、抗腫瘍性抗生物質(例えば、ブレオマイシン、モノクローナル抗体(例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツキサマブ(Trastuxmab))、プラチニウム(platinium)(例えば、シスプラチンおよびオキサリプラチン)、または植物アルカロイド(例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、タキサン(例えば、パクリタキセル)、ならびにエピポドフィロトキシン)を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、がん化学療法剤は、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ボリノスタット、テモゾロミド、ボルテゾミブ、カルムスチン、およびパクリタキセルより選択される。
本明細書に記載の方法によれば、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートまたは非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物は単独で、または1種類もしくは複数種のさらなるがん治療剤と組み合わされて全身投与または局所投与によって投与される。本明細書において開示されるタンパク質-薬物コンジュゲートおよび/または組み合わせ治療剤の適切な全身投与方法は、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与、皮内投与、肺内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、または鼻腔内注入、腔内注入もしくは膀胱内注入による投与、眼内投与、動脈内投与、病巣内投与、あるいは粘膜への適用を含むが、それに限定されるわけではない。ある特定の態様では、本明細書に記載の方法の治療剤は経口送達される。本明細書において開示される治療剤および/または組み合わせの適切な局所投与方法は、カテーテル法、移植、直接注射、皮膚/経皮適用、または関連組織への門脈投与、または当技術分野において一般的に知られている他の任意の局所投与の技法、方法、もしくは手順を含むが、それに限定されるわけではない。薬剤の送達に影響を及ぼす方法は、送達されるがん治療剤のタイプおよび処置しようとするがんのタイプに応じて異なる。
本明細書において開示される方法において単独の、またはさらなるがん治療剤と組み合わされる、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートまたは非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物の治療的有効量とは、特定の時間間隔にわたって投与された時に、1つまたは複数の治療ベンチマーク(例えば、腫瘍成長の減速または停止、腫瘍の退縮、症状の停止など)を実現する量である。本発明で開示される方法において使用するための、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートまたは非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物は対象に一回または複数回投与されてもよい。治療用組成物が複数回投与される態様では、所定の間隔で、毎日、隔日、毎週、または毎月投与されてもよい。または、治療用組成物は、不規則な間隔で、例えば、症状、患者の健康状態などに基づいて必要に応じて投与することができる。例えば、治療的有効量は、1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも10日、または少なくとも15日にわたって1日1回(q.d.)投与されてもよい。任意で、処置の間または後に、がんの状態またはがんの退縮が、例えば、対象のマルチパラメトリック超音波(mpUS)、マルチパラメトリック磁気共鳴画像法(mpMRI)、および核イメージング(ポジトロン放出断層撮影法[PET])によってモニタリングされる。対象に投与される非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートまたは併用療法の投与量は、がんの状態または検出されたがんの退縮に応じて増加または減少することができる。
当業者は、一人一人の対象に基づいて(例えば、処置されている対象において特定の治療ベンチマークを実現するのに必要な非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの量)、または集団に基づいて(例えば、ある特定の集団からの平均的な対象において特定の治療ベンチマークを実現するのに必要な非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの量)、この量を容易に決定することができる。理想的には、治療的有効量は、処置されている対象の50％以上が、さらなる薬物投与を妨げる副作用を経験する最大許容量を超えない。
対象の治療的有効量は、症状の種類および程度、対象の性別、年齢、体重、または身体全体の健康、投与方法、ならびに塩または溶媒和化合物のタイプ、薬物に対する感受性のバリエーション、疾患の特定のタイプなどを含む様々な要因に応じて変化することがある。
本開示の別の局面は、対象の免疫応答を調節する方法に関する。この方法は、免疫系の調節から利益を得る状態を有する対象に、対象の免疫応答を調節するのに有効な量の本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。本開示のこの局面によれば、適切な非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、コンジュゲートの第2の部分として免疫調節剤を含むコンジュゲートを含む。適切な免疫調節剤、例えば、1型マクロファージ刺激剤、2型マクロファージ刺激剤、T細胞刺激剤、樹状細胞刺激剤、および好中球刺激剤は全て、前記で説明されている。
少なくとも部分的に、免疫応答および/または免疫系の細胞、例えば、1型マクロファージ、2型マクロファージ、T細胞、B細胞、樹状細胞、好中球によって引き起こされるか、または悪化する疾患または状態を処置するか、予防するか、またはその進行を遅くする目的で、本開示のこの局面に従って対象の免疫応答の調節または改変が行われる。例えば、黄斑変性、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、免疫炎症、非免疫炎症、腎臓炎症、結核、多発性硬化症、関節炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、およびアルツハイマー病を含むが、これに限定されない炎症性疾患および状態は、望ましくない1型マクロファージ作用を伴う。本発明の方法を用いて、これらの疾患プロセスに関与または寄与する1型炎症誘発性マクロファージにおいてマクロファージ2型表現型変化を誘導すると、疾患の1つまたは複数の症状または原因が軽減する。従って、一態様では、インビボまたはエクスビボで、上記で列挙された炎症性状態もしくは自己免疫状態のいずれかを含むが、これに限定されない炎症性状態もしくは自己免疫状態を有する対象の中にあるか、またはそれに由来する1型マクロファージ集団に、投与が行われる。この状況において2型マクロファージ刺激剤を1型マクロファージ集団に投与すると2型表現型変化が誘導され、それによって、疾患に関連する望ましくない1型マクロファージ作用が低減する。
免疫細胞表現型の調節または改変はまた様々な種類のがんを処置する状況でも治療上有益である。最近の研究から、腫瘍関連マクロファージ(TAM)はマクロファージ2型様表現型を示すことが分かっている。これらの2型マクロファージは重要な腫瘍浸潤細胞であり、腫瘍の成長および転移において中心的な役割を果たしている。ほとんどの固形腫瘍において、TAMの存在は腫瘍の成長および転移にとって有利である。これらのTAMは、一般的な抗腫瘍性免疫応答を抑制するようにインターロイキンIL-10およびトランスフォーミング成長因子(TGF)βを産生する。その間に、TAMは血管新生促進性因子を分泌することで腫瘍血管新生を促進し、腫瘍の転移および播種を容易にするように浸潤性微小環境の境界を定める。従って、本開示の方法を用いて、マクロファージ1型刺激剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与して、TAMにおいて1型表現型変化を誘導して抗腫瘍免疫を強化するとがんの進行が大きく変化する。2型マクロファージ関連成分を通常有するがんは、膵臓がん、乳がん、および非小細胞肺がんを含むが、それに限定されるわけではない。代わりに、またはマクロファージ1型刺激剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程と一緒に、T細胞刺激剤、樹状細胞刺激剤、または好中球刺激剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与して、抗腫瘍性免疫応答を活性化または強化することができる。
一部の態様では、免疫系の調節を必要とする対象はインターフェロノパチーに罹患している対象である。本明細書において言及される、インターフェロノパチーは、I型インターフェロン、例えば、IFN-α、IFN-β、およびIFN-Ωの発現上昇を伴う状態である。本開示に従って処置することができるインターフェロノパチーは、アイカルディ・グティエール症候群、クリー脳炎(Cree encephalitis)、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症、免疫調節異常を伴う脊椎骨端異形成症(spondyloenchondrodysplasia with immune dysregulation)、乳児発症STING関連血管炎(stimulator of interferon genes(STING)-associated vasculopathy with onset in infancy)(SAVI)、脂肪異栄養症を伴う日本自己炎症症候群(Japanese autoinflammatory syndrome with lipodystrophy)(JASL)、ユビキチン特異的ペプチダーゼ18欠損症、脂肪異栄養症を伴う慢性非典型的好中球性皮膚炎(chronic atypical neutrophilic dermatitis with lipodystrophy)、DNA II欠損症、シングルトン・メルテン症候群、ならびに脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患症候群(chronic atypical neutrophilic dermatosis with lipodystrophy and elevated temperature)(CANDLE)を含むが、それに限定されるわけではない。インターフェロノパチーを処置するのに適した、本開示に従う非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、I型インターフェロンアンタゴニストに接続された非結合性FN3ドメインを含む。一部の態様では、I型インターフェロンアンタゴニストは、I型インターフェロン受容体アンタゴニスト、例えば、ヤヌスキナーゼ(JAK)阻害剤である。適切なJAK阻害剤は、バリシチニブ(CAS No. 1187594-09-7)、トファシチニブ(CAS No. 477600-75-2)、ルキソリチニブ(941678-49-5)、AG490(チロホスチンファミリー)(CAS No. 133550-30-8)、レスタウルチニブ(CEP-701; CAS No. 111358-88-4)、WP-1034(チロホスチンファミリー; CAS No. 857064-42-7)、BMS-911543(CAS No. 1271022-90-2)、フェドラチニブ(TG101348; CAS No. 936091-26-8)、パルクリチニブ(SB1518; CAS No. 937272-79-2)、およびモメロチニブ(CYT387; CAS No. 1056634-68-4)などがあるが、それに限定されるわけではないJAK1/JAK2阻害剤を含む。
一部の態様では、免疫系の調節を必要とする対象は、創傷を有するか、または創傷治癒を受けている対象である。この態様によれば、創傷を有するか、創傷治癒を必要とする対象には、マクロファージ1型刺激剤を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートが投与される。適切な1型刺激剤、例えば、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニストは前記で説明されている。
一部の態様では、免疫系の調節を必要とする対象は、炎症状態を有する対象であり、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートはマクロファージ枯渇剤を含む。マクロファージ枯渇剤、例えば、クロドロネート、ゾレドロン酸、およびトラベクテジンで処置することができる適切な炎症状態は、関節リウマチ、肥満および肥満関連合併症、子宮内膜症、肺の炎症状態(例えば、慢性閉塞性肺疾患および肺結核)を含むが、それに限定されるわけではない。
本開示の別の局面は、対象において神経変性状態を処置する方法に関する。この方法は、神経変性状態を有する対象に、神経変性状態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。例示的な神経変性疾患(例えば、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病)、およびこれらの状態を処置するのに適した非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは前記で開示されている。
本開示の別の局面は、対象において炎症状態を処置する方法に関する。この方法は、炎症状態を有する対象に、炎症状態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。この方法に従って処置することができる例示的な炎症状態は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、骨粗鬆症、免疫炎症、非免疫炎症、腎臓炎症、結核、多発性硬化症、関節炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、およびアルツハイマー病を含むが、それに限定されるわけではない。これらの状態を処置するための薬学的に活性な部分を含む適切な非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは前記で開示されている。
本開示の別の局面は、対象において骨病態を処置する方法に関する。この方法は、骨病態を有する対象に、骨病態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程を含む。例示的な骨病態は骨粗鬆症および骨パジェット病を含むが、それに限定されるわけではなく、これらの状態を処置するのに適した非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは前記で開示されている。
本開示の別の局面は、対象において感染性疾患または感染性状態を処置する方法に関する。この方法は、感染性疾患を有する対象に、感染性疾患を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む本明細書に記載の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲート投与する工程を含む。例示的な感染症(フィロウイルス感染症およびコロナウイルス感染症)、ならびにこれらの状態を処置するのに適した非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートは、前記で開示されている。
本開示の別の局面は、対象において腫瘍を画像化する方法に関する。この方法は、腫瘍を有する対象を選択する工程、および前記対象に、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを含む組成物を投与する工程を含む。本開示のこの局面によれば、非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分は診断部分を含む。適切な診断部分、例えば、蛍光色素、放射性同位体、放射性核種、放射性同位体、マイクロバブル、画像化に適した造影剤、および光増感剤は前記で説明されている。
本開示のこの局面によれば、画像される腫瘍は、対応する非がん細胞と比べて増大したマクロピノサイトーシスを有するがん細胞を特徴とする。一部の態様では、画像される腫瘍は、H-ras、N-ras、またはK-rasに発がん変異を有するがん細胞を特徴とする。一部の態様では、画像される腫瘍は、膵臓腫瘍、肺腫瘍、乳腺腫瘍、結腸腫瘍、神経膠腫、固形腫瘍、メラノーマ、多形性神経膠芽腫、白血病、腎細胞がん、肝細胞がん、前立腺腫瘍、およびミエローマである。
本開示の診断用非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを用いた対象における腫瘍の存在の検出はインビボ画像化法を用いて成し遂げられる。インビボ画像化は、本明細書に記載の非結合性タンパク質-診断部分コンジュゲートを対象に投与する工程、およびインビボでマクロピノサイトーシスを介した、腫瘍細胞のコンジュゲート取り込みを検出する工程を含む。
本開示のこの局面によれば、診断用非結合性タンパク質コンジュゲートは対象の身体への静脈内注射によって投与されるか、または腫瘍に直接、投与される。非結合性タンパク質-診断部分コンジュゲートの投与量は処置方法と同じ範囲内でなければならない。この態様によれば、非結合性FN3ドメインにコンジュゲーションされる診断部分は、インビボ画像化を容易にする画像化剤である。適切な画像化剤は前記で説明されており、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)剤、ポジトロン放出断層撮影法(PET)剤、磁気共鳴画像(MRI)剤、核磁気共鳴画像(NMR)剤、X線剤、光学的薬剤(例えば、フルオロフォア、生物発光プローブ、近赤外線色素、量子ドット)、超音波剤および中性子捕獲療法剤、コンピュータ支援断層撮影剤、2光子蛍光顕微鏡画像化剤、ならびに多光子顕微鏡画像化剤を含むが、それに限定されるわけではない。例示的な検出可能なマーカーは、ラジオアイソタイプ(radioisotype)(例えば、PETおよび/またはSPECT使用に適した、18F、11C、13N、64Cu、124I、76Br、82Rb、68Ga 99mTc、111In、201Tl、または15O)、およびMRIに適した酸化鉄の極小超常磁性粒子(ultra-small superparamagnetic particle)(USPIO)を含む。
対象における腫瘍の画像化は、対象において、検出された非結合性タンパク質-診断部分コンジュゲートの数、サイズ、および/または強度を検出することによって行われる。一部の態様では、検出された診断コンジュゲートのレベルは、対応するベースライン値と比較される。適切なベースライン値は、非罹患個体集団の細胞内で見出された非結合性タンパク質診断コンジュゲートの平均レベルである場合がある。または、適切なベースライン値は、もっと早い時間に求められた、同じ対象の細胞内で見出された非結合性タンパク質診断コンジュゲートのレベルでもよい。
本明細書に記載の診断画像化法はまた、療法に対する対象の応答をモニタリングするのにも使用することができる。この態様において、対象における非結合性タンパク質診断コンジュゲートの検出は処置の開始前に確かめられる。この時点での対象における非結合性タンパク質診断コンジュゲートのレベルはベースライン値として用いられる。処置中の様々な時間で、非結合性タンパク質診断コンジュゲートの投与と検出が繰り返され、その後に測定値がベースライン値と比較される。ベースラインシグナルと比べた値の減少は処置に対するプラスの応答である。
以下の実施例は本開示の態様を例示するために提供されるが、決して、本開示の範囲を限定することを目的としない。
実施例1-非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの生成
初期研究として、非結合性FNドメイン(コンジュゲーション用のC末端セリンおよびシステイン残基を付加した、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む)をモノメチルアウリスタチンE(MMAE)とコンジュゲーションした(図1Aの模式図を参照されたい)。MMAEは、抗体薬物コンジュゲート(ADC)において一般的に用いられる毒性の強い薬剤である。カテプシンによって切断可能なリンカー、および非結合性FNドメインタンパク質上のC末端遊離システインにコンジュゲーションするためのマレイミド基を含有するリンカーを用いて、MMAE分子を非結合性FNドメインに取り付けた(FN-MMAE)。マレイミドコンジュゲーションは2段階プロセスと1.5モル過剰量の薬物を用いて行った。コンジュゲーションは、ゲルシフトアッセイ(図1B)、エルマン試験、および分光分析(図1D)によって確認した。インビトロ画像化およびインビボ画像化において、新しく設計された複合体の薬物動態をモニタリングするために薬物分子とCy5.5とを交換した(図1C)。
実施例2-非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのマクロピノサイトーシス取り込み
非結合性FNドメインが内部移行できたかどうか確かめるために、十分に確立したドキシサイクリン誘導性変異KRasV12 HeLa細胞系(以下、HeLa KRasV12)を使用した。この系では、高分子量(70kDa)テトラメチル-ローダミン標識(TMR-)デキストランによってマクロピノサイトーシスがモニタリングされる。図2Bに示したように、蛍光標識非結合性FNドメイン(FN-Cy5.5)はTMR-デキストランと共局在した。重要なことに、ドキシサイクリンが添加されてない細胞(HeLa)には、検出可能な非結合性FNドメイン取り込みがなかったので、内部移行は発がん性Rasに依存した。さらに、マクロピノサイトーシス阻害剤であるEIPAは、非結合性FNドメインとデキストランとが両方ともHeLa KRasV12細胞に取り込まれるのを阻止した(図2B)。同様に、変異KRas PDAC細胞株MIA PaCa-2(ヒト、図2A)およびKPC 1203(マウス、図3A)は、デキストランとFN-Cy5.5との間に発生する共局在を示した。これに対して、EIPAによって両高分子の取り込みは消失した(図2Aおよび図3A)。図3Bにおいて、Ras変異のあるヒト結腸直腸がん株HCT116はデキストランとFN-Cy5.5との間に発生する共局在を示したが、WT Rasを有するHCA7細胞では取り込みは認められなかった。非結合性FNドメインで処理したHeLa KTO+KRas V12およびMIA PaCa-2のフローサイトメトリーによる分析は、FN-Cy5.5取り込みについて陽性であった(図2C)。
取り込みの差違は固形腫瘍の細胞株だけでなく、多発性骨髄腫などの血液がんでも証明された。野生型Ras細胞株(KMS11)は変異NRas(L363)または変異KRas(RPMI-8226)多発性骨髄腫細胞株と比較してマクロピノサイトーシスをほとんど示さないか、マクロピノサイトーシスを全く示さない(図14および図16)。HeLa KRasV12誘導系と同様の系を用いて、本発明者らは野生型KRas KMS11多発性骨髄腫細胞において誘導性KRasV12細胞系を作り出した。HeLa系で見られたように、KMS11細胞におけるKRasV12発現はドキシサイクリン処理において明らかであり、FN-Cy5.5細胞取り込みはKRasV12発現に依存した(図15)。
実施例3-非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの細胞傷害性の差違
細胞不透過性のタンパク質複合体を作り出すことによって、マクロピノサイトーシスのない細胞に非結合性FNドメインが進入する能力が妨げられ、それによって、選択的な細胞取り込み経路が作り出される。Ras変異状態が細胞傷害性の差違を付与するかどうか調べるために、HeLaおよびHeLa KRasV12細胞における細胞生存率について漸増濃度のFN-MMAE コンジュゲートを試験した。実際に、HeLa細胞と比較してHeLa KRasV12細胞ではIC50が1/16になることが検出された(図4A)。FN-MMAEはまた変異Ras膵臓、多発性骨髄腫、肺、および結腸がん細胞株でも効果が高かった(図4B)。細胞差のために対照に対してFN-MMAEと遊離MMAEのIC50値を正規化した後に、変異Rasのある細胞株(マクロピノサイトーシス陽性)と比較して、変異Rasのない細胞株(マクロピノサイトーシス陰性)の細胞傷害性は有意に減少することが観察された。このことからマクロピノサイトーシス依存性が示唆される。
非結合性FNドメインプラットフォームのユニークな特質はカーゴコンジュゲーションの融通性である。これを図4Cにおいて試験した。図4Cでは、イリノテカン代謝産物であるSN-38をFNとコンジュゲーションした。FN-MMAEと同様に、処理されたPDAC細胞株において変異Ras特異的細胞傷害性が観察された。
インビボでの効果を試験するために、MIA PaCa-2皮下腫瘍モデルを用いてPBS、MMAE、およびFN-MMAEの効力を比較した(図5A)。腫瘍を確立した後に、MMAE濃度に対して0.2mg/kg薬物の注射液を7日ごとに3回投与した。MMAEと比較して、FN-MMAEコンジュゲートは腫瘍サイズエンドポイントに到達する時間を47日延ばす(2.2倍増加する)ことで腫瘍成長を効果的に低減した。FN-MMAEはまた腎臓と肝臓の両方において非特異的毒性の低下、特に、切断カスパーゼ3、HMGB1の低下、チューブリン染色の増加も示した(MMAEの細胞傷害性様式はチューブリン不安定化因子として働くものである)(図5B、図6A、および図6B)。このことは、遊離薬物に対する非マクロピノサイトーシス細胞による取り込み低下の特異性を強調し、この特異性は非結合性FNドメイン-薬物コンジュゲートの選択的効果に寄与する。
実施例4-非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの生体内分布
非結合性FNドメインのサイズは血清中で非常に短い半減期を付与し、クリアランスが腎臓排出に供され、腎臓と肝臓において多量に収集される。非結合性FNドメインの生体内分布が変化したかどうか試験するために、MIA PaCa-2異種移植片マウスモデルを使用した。確立した腫瘍を有するマウスにFN-Cy5.5またはCy5.5を注射した後に、IVIS時間経過によって、遊離Cy5.5と比較して非結合性FNドメインの薬物動態学的プロファイルが変化することが明らかになった(図7Aおよび図7B)。次に、変異状態が保持に影響を及ぼすかどうか見るために、MIA PaCa-2およびBxPC3異種移植片マウスを同じ時間経過で処置した(図7C)。1時間、4時間、および24時間の時点でMIA-PaCa-2腫瘍における取り込みは2倍以上になった。次に、PBS、Cy5.5-COOH、またはFN-Cy5.5の処置および生体内分布を評価するために、KPC細胞をマウス膵臓の同所に注射した。全腫瘍と腫瘍スライスのエクスビボ画像化を6時間の時点で分析した(図7Dおよび図7E)。これにより、腫瘍形成膵臓では野生膵臓と比較して選択的取り込みが示され、これは低分子処置では認められなかった。
図8では、IP注射して1時間後および24時間後の、同所性移植KPC腫瘍を有するマウスにおいてPBS、FN-Cy5.5、マウスアルブミン(MSA)-Cy5.5、またはマウスIgG-Cy5.5の生体内分布が観察された。エクスビボ生体内分布および血液蛍光(図8C)を観察するために、マウスを1時間(図8A)および24時間(図8B)で屠殺した。1時間で、腎臓および肝臓にあるFN-Cy5.5は他のタンパク質コンジュゲートと比較して2倍激増した。このことは、腫瘍保持がほぼ同じかまたは増えながらも、素早い排出が起こったことを示している。24時間で腫瘍値がほぼ同じでありながら(MSAについては90％、IgGについては100％)、腎臓と肝臓にあるFN-Cy5.5は低減した。FN-Cy5.5は1時間の血液蛍光が1/3になった。このことからも、他のタンパク質コンジュゲートと比較して素早い排出が起こったことが強調される。
図9では、膵臓流入領域リンパ節における非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの取り込みを調べた。PDAC患者には膵臓流入領域リンパ節内への転移の感受性があると同時に、現在開発されている、期待の持てる多数の腫瘍免疫調節剤療法に対する標的組織でもある。この組織に、より具体的には樹状細胞に選択的に取り込まれるかどうか評価するために、同所性移植KPC腫瘍を有するマウスをPBS、Cy5.5-COOH、およびFN-Cy5.5で処置した。エクスビボIVIS画像化から、FN-Cy5.5はPDAC流入領域リンパ節内に局在化し(図9A)、気管支リンパ節と比較してPDACリンパ節の方が2倍多くあることが分かった。さらに、リンパ節を消化し、フローサイトメトリーを用いてCy5.5陽性細胞を観察した(図9Bおよび図9C)。遊離薬物と比較してFNコンジュゲートの場合、陽性Cy5.5細胞は2倍以上増加した。このことは、物質送達によって樹状細胞の取り込みが改善したことを示している。合わせると、このデータは、FNプラットフォームが膵臓リンパ節において選択的に保持されるだけでなく、FNコンジュゲートが薬物取り込みを有意に改善できることを示している。
膵臓上皮内新生物(PanIN)病変部からPDACおよび転移へのヒトPDAC進行を再現する遺伝子組換えマウスモデルであるKrasG12D;Trp53R172H;p48Cre(KPC)を用いた、さらなる分析でも、膵臓において腫瘍選択的な取り込みが増大することが示された(図10A～C)。重要なことに、野生型マウスの膵臓の方が取り込みは少ないことが観察された(図10A～C)。腫瘍全体にわたって、一貫したCy5.5染色が観察され、このことから、よく浸透し、がん細胞マーカー(CK8)と共局在することが分かる(図10D)。重要なことに、FN-Cy5.5複合体は腫瘍に達し、腫瘍細胞によって内部移行されることが見出された。さらに、アルブミン結合FITCとFN-Cy5.5との同時送達を用いて同様の実験を行った。アルブミンに基づく療法はPDAC処置における現行の標準治療である。アルブミン-FITCとFN-Cy5.5とは両方とも、マウスの確立した膵臓腫瘍の中で共存した(図11)。エクスビボ分析から、CK8染色との共局在によって示されたように、FN-Cy5.5はPanINに取り込まれる傾向が大きいのに対して、アルブミン-FITCは細胞外腫瘍微小環境に多量に蓄積することが分かった。
腫瘍蓄積の差違は固形腫瘍だけでなく、多発性骨髄腫などの血液がんでも証明された。変異NRas異種移植片(L363)は野生型Ras異種移植片(KMS11)と比較して多量のFN-Cy5.5腫瘍蓄積を示す(図17)。
示された薬物動態学的プロファイルは、非結合性FNドメイン処置が化学療法と画像化の両方にとって優れた利点であることを示している。腫瘍保持と高浸透とを維持しながら短い半減期を生み出すと、毒性の限定された高用量投与計画が可能になり、それによって処置の効果がより高くなる可能性がある。
実施例5-非結合性タンパク質コンジュゲートを用いた画像化
現行の画像化方法は初期のPDACを検出する、ほどほどの解決策であった。詳細に述べると、現在のMRI画像化システムは空間分解能が不十分であり、病変部を検出する能力が中程度である。従来のPET薬剤(18FDG)の研究では、入り交じった結果が報告されている。18FDGは炎症応答も検出することがあり、このため膵炎とPDACとの区別は困難である。同所性移植KPC腫瘍(図12Bおよび図13)ならびに自発性KPCマウスモデル(図12Cおよび図13)を用いた予備研究では、FN-DOTA-Gd3+は蛍光プローブ(図10A)と同じ生体内分布を辿り、注射後10分以内に腎臓に局在化し(図12Cおよび図13)、腫瘍塊が検出された(図7Bおよび図7C 下-赤色の矢じり)。
好ましい態様が本明細書において詳細に描写および説明されたが、本発明の精神から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを加えることができ、従って、これらが、添付の特許請求の範囲に定義されるように本発明の範囲内だとみなされることは、関連する分野の当業者に明らかである。

Claims (83)

  1. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートと、
    薬学的に許容される担体と
    を含む、薬学的組成物であって、
    該非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートが、
    非結合性フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含む、第1の部分と、
    該第1の部分の中にあるか、または該第1の部分に接続されている、アミノ酸リンカーと、
    該アミノ酸リンカーを介して該第1の部分に接続され、薬学的に活性な部分または診断部分より選択される、第2の部分と
    を含む、
    薬学的組成物。
  2. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインが、そのFGループのそのRGDアミノ酸配列中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項1記載の組成物。
  3. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインが、BCループのアミノ酸配列中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項1または請求項2記載の組成物。
  4. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインが、非結合性ヒトFN3ドメインである、請求項1記載の組成物。
  5. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインが、ヒトフィブロネクチンの第10 III型フィブロネクチンドメイン(10Fn3)の非結合性変種である、請求項1～4のいずれか一項記載の組成物。
  6. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の組成物。
  7. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインが、SEQ ID NO:4のFGループアミノ酸配列を含む、請求項1～6のいずれか一項記載の組成物。
  8. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートのFN3ドメインが、SEQ ID NO:5のBCループアミノ酸配列を含む、請求項3～7のいずれか一項記載の組成物。
  9. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
  10. アミノ酸リンカーが、タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分のFN3ドメイン中にシステイン残基置換を含む、請求項1～9のいずれか一項記載の組成物。
  11. アミノ酸リンカーが、FN3ドメインC末端におけるシステイン残基付加を含む、請求項1～10のいずれか一項記載の組成物。
  12. アミノ酸リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項1～11のいずれか一項記載の組成物。
  13. アミノ酸リンカーが、切断不可能なリンカーである、請求項1～11のいずれか一項記載の組成物。
  14. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第1の部分が、タンデムに連結された2つ以上のFN3ドメインを含む、請求項1～11のいずれか一項記載の組成物。
  15. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分が、薬学的に活性な部分である、請求項1～14のいずれか一項記載の組成物。
  16. 薬学的に活性な部分が、がん治療剤である、請求項15記載の組成物。
  17. がん治療剤が、代謝拮抗物質、アルカロイド、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、DNA結合薬、毒素、抗増殖薬、DNAアンタゴニスト、放射性核種、サーモアブレーティブ剤、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、核酸阻害剤、および免疫調節剤より選択される、請求項16記載の組成物。
  18. アルカロイドが、デュオカルマイシン、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項16記載の組成物。
  19. アルキル化剤が、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロランブシル、クロラナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドHCl、メルファラン、ノベメビキン、ペルホスファミド フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、セムスチン ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミド、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項16記載の組成物。
  20. 抗腫瘍性抗生物質が、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-l-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピラビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項16記載の組成物。
  21. 代謝拮抗物質が、SN-38、デノプテリン、エダトレキセート、メルカプトプリン(6-MP)、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン、ペントスタチン(2'-DCF)、トムデックス、トリメトレキセート、クラドリジン、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、ヒドロキシウレア、ウレタン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項16記載の組成物。
  22. 抗増殖薬が、アセグラトン、アムサクリン、ビサントレン、カンプトテシン、デホスファミド、デメコルシン、ジアジクオン、ジフロモテカン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、エトプシド、フェンレチニド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、ラメラリンD、ロニダミン、ミルテホシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ポドフィリン酸2-エチル-ヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、ソブゾキサン、スピロゲルマニウム、テニポシド、テヌアゾン酸、トリアジクオン2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項16記載の組成物。
  23. 有糸分裂阻害剤が、アウリスタチン、マイタンシノイド、ドラスタチン、ツブリシン、タキサン、エポシロン、ビンカアルカロイド、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項16記載の組成物。
  24. 薬学的に活性な部分が、免疫調節剤である、請求項15記載の組成物。
  25. 免疫調節剤が、マクロファージ1型刺激剤である、請求項24記載の組成物。
  26. マクロファージ1型刺激剤が、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニストからなる群より選択される、請求項25記載の組成物。
  27. 免疫調節剤が、マクロファージ2型刺激剤である、請求項24記載の組成物。
  28. マクロファージ2型刺激剤が、IL-33、IL-4受容体アゴニスト、グルココルチコイド、IL-10受容体アゴニスト、IL-1受容体アゴニストからなる群より選択される、請求項25記載の組成物。
  29. 免疫調節剤が、T細胞刺激剤である、請求項24記載の組成物。
  30. T細胞刺激剤が、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストである、請求項29記載の組成物。
  31. 免疫調節剤が、樹状細胞刺激剤である、請求項24記載の組成物。
  32. 樹状細胞刺激剤が、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、カンプトテシン、コルヒチン、ポドフィロトキシン、およびその誘導体からなる群より選択される、請求項31記載の組成物。
  33. 免疫調節剤が、好中球刺激剤である、請求項24記載の組成物。
  34. 好中球刺激剤が、組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質(フィルグラスチム)またはペグ化組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質である、請求項33記載の組成物。
  35. 薬学的に活性な部分が、オリゴヌクレオチドである、請求項15記載の組成物。
  36. オリゴヌクレオチドが、siRNA、アプタマー、miRNA、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、およびガイドRNAからなる群より選択される、請求項35記載の組成物。
  37. 薬学的に活性な部分が、創傷治癒剤である、請求項15記載の組成物。
  38. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分が、診断部分である、請求項1～14のいずれか一項記載の組成物。
  39. 診断部分が、蛍光色素、放射性同位体、画像化に適した造影剤、キレート剤を有する放射性核種、および光増感剤からなる群より選択される、請求項38記載の組成物。
  40. 対象においてがんを処置する方法であって、以下の工程:
    がんを有する対象に、該がんを処置するのに有効な量の請求項1～35のいずれか一項記載の組成物を投与する工程
    を含む、方法。
  41. がんが、その対応する非がん細胞と比べて増大したマクロピノサイトーシスを有するがん細胞を特徴とする、請求項40記載の方法。
  42. がんが、H-ras、N-ras、またはK-rasに発がん変異を有するがん細胞を特徴とする、請求項40記載の方法。
  43. 前記組成物の非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの第2の部分が、薬学的に活性な部分であり、該薬学的に活性な部分が、がん治療剤である、請求項40～42のいずれか一項記載の方法。
  44. がん治療剤が、代謝拮抗物質、アルカロイド、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、DNA結合薬、微小管標的薬、毒素、抗増殖薬、DNAアンタゴニスト、放射性核種、サーモアブレーティブ剤、およびPROTACである、請求項43記載の方法。
  45. アルカロイドが、デュオカルマイシン、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
  46. アルキル化剤が、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロランブシル、クロラナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドHCl、メルファラン、ノベメビキン、ペルホスファミド フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、セムスチン ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミド、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
  47. 抗腫瘍性抗生物質が、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-l-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピラビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
  48. 代謝拮抗物質が、SN-38、デノプテリン、エダトレキサート、メルカプトプリン(6-MP)、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン、ペントスタチン(2'-DCF)、トムデックス、トリメトレキセート、クラドリジン、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、ヒドロキシウレア、ウレタン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
  49. 抗増殖薬が、アセグラトン、アムサクリン、ビサントレン、カンプトテシン、デホスファミド、デメコルシン、ジアジクオン、ジフロモテカン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、エトプシド、フェンレチニド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、ラメラリンD、ロニダミン、ミルテホシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ポドフィリン酸2-エチル-ヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、ソブゾキサン、スピロゲルマニウム、テニポシド、テヌアゾン酸、トリアジクオン2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
  50. 有糸分裂阻害剤が、アウリスタチン、マイタンシノイド、ドラスタチン、ツブリシン、タキサン、エポシロン、ビンカアルカロイド、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
  51. がん治療剤が、免疫調節剤である、請求項44記載の方法。
  52. 免疫調節剤が、マクロファージ1型刺激剤、マクロファージ2型枯渇剤、T細胞刺激剤、樹状細胞刺激剤、および好中球刺激剤より選択される、請求項51記載の方法。
  53. マクロファージ1型刺激剤が、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニストからなる群より選択される、請求項52記載の方法。
  54. T細胞刺激剤が、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストである、請求項52記載の方法。
  55. 樹状細胞刺激剤が、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、カンプトテシン、コルヒチン、ポドフィロトキシン、およびその誘導体からなる群より選択される、請求項52記載の方法。
  56. 好中球刺激剤が、組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質(フィルグラスチム)またはペグ化組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質である、請求項52記載の方法。
  57. マクロファージ2型枯渇剤が、クロドロネート、ゾレドロン酸、アレンドロネート、およびトラベクテジンからなる群より選択される、請求項52記載の方法。
  58. 対象において腫瘍を画像化する方法であって、以下の工程:
    腫瘍を有する対象を選択する工程、および
    請求項38記載の組成物を該対象に投与する工程
    を含む、方法。
  59. 非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートの診断部分が、蛍光色素、放射性同位体、画像化に適した造影剤、キレート剤を有する放射性核種、および光増感剤からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
  60. がんが、その対応する非がん細胞と比べて増大したマクロピノサイトーシスを有するがん細胞を特徴とする、請求項58記載の方法。
  61. がんが、H-ras、N-ras、またはK-rasに発がん変異を有するがん細胞を特徴とする、請求項58記載の方法。
  62. 対象の免疫応答を調節する方法であって、以下の工程:
    免疫系の調節から利益を得る状態を有する対象に、該対象の免疫応答を調節するのに有効な量の、請求項24～36のいずれか一項記載の組成物を投与する工程
    を含む、方法。
  63. 免疫調節剤が、マクロファージ1型刺激剤である、請求項62記載の方法。
  64. マクロファージ1型刺激剤が、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニストからなる群より選択される、請求項63記載の方法。
  65. 免疫調節剤が、マクロファージ2型刺激剤である、請求項62記載の方法。
  66. マクロファージ2型刺激剤が、IL-33、IL-4受容体アゴニスト、グルココルチコイド、IL-10受容体アゴニスト、およびIL-1受容体アゴニストからなる群より選択される、請求項65記載の方法。
  67. 免疫調節剤が、T細胞刺激剤である、請求項62記載の方法。
  68. T細胞刺激剤が、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストである、請求項67記載の方法。
  69. 免疫調節剤が、樹状細胞刺激剤である、請求項62記載の方法。
  70. 樹状細胞刺激剤が、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、カンプトテシン、コルヒチン、ポドフィロトキシン、およびその誘導体からなる群より選択される、請求項69記載の方法。
  71. 免疫調節剤が、好中球刺激剤である、請求項62記載の方法。
  72. 好中球刺激剤が、組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質(フィルグラスチム)またはペグ化組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質である、請求項71記載の方法。
  73. 免疫調節剤が、オリゴヌクレオチドである、請求項62記載の方法。
  74. オリゴヌクレオチドが、siRNA、アプタマー、miRNA、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、およびスプライススイッチングオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項73記載の方法。
  75. 対象がインターフェロノパチーを有し、免疫調節剤が1型インターフェロンアンタゴニストである、請求項62記載の方法。
  76. 対象が、創傷を有し、免疫調節剤が、1型マクロファージ刺激剤である、請求項62記載の方法。
  77. 対象が、免疫寛容型のがんを有し、免疫調節剤が、1型マクロファージ刺激剤、T細胞刺激剤、好中球刺激剤、および樹状細胞刺激剤より選択される、請求項62記載の方法。
  78. 対象が、ヒトである、請求項40～77のいずれか一項記載の方法。
  79. 投与する工程が、静脈内投与である、請求項40～77のいずれか一項記載の方法。
  80. 対象において神経変性状態を処置する方法であって、以下の工程:
    神経変性状態を有する対象に、該神経変性状態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程
    を含む、方法。
  81. 対象において炎症状態を処置する方法であって、以下の工程:
    炎症状態を有する対象に、該炎症状態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程
    を含む、方法。
  82. 対象において骨病態を処置する方法であって、以下の工程:
    骨病態を有する対象に、該骨病態を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程
    を含む、方法。
  83. 対象において感染性疾患または感染性状態を処置する方法であって、以下の工程:
    感染性疾患を有する対象に、該感染性疾患を処置するのに適した薬学的に活性な部分を含む非結合性タンパク質-薬物コンジュゲートを投与する工程
    を含む、方法。
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