CN111587126A - 组合剂型和用于验证的造影剂毒性最小化方案 - Google Patents
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Abstract
利用增强的渗透和保留效应(EPR效应)的优点来屏蔽正常组织接触化疗剂组合。在实体瘤中显示增强的渗透和保留(EPR)效应的造影剂可用于模拟与所述造影剂载体大小和形状类似的载体偶联的化疗剂或其他用于治疗该肿瘤的药物的行为。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求以下优先权:2018年1月12日提交的美国临时申请号62/617,095,2018年5月21日提交的美国临时申请号62/674,483,2018年7月27日提交的美国临时申请号62/711,421,2018年8月9日提交的美国临时申请号62/716,788,2018年8月9日提交的美国临时申请号62/716,796,2018年7月18日提交的美国临时申请号62/700,147,和2018年7月27日提交的美国临时申请号62/711,423,其公开内容通过引用其全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及实体瘤的组合治疗以及评估已施用实体的药物动力学(特别是有关当对实体瘤患者施用纳米尺寸的实体时显示的增强渗透和保留(EPR)效应)的诊断方法领域。更具体来说,本发明涉及利用当对实体瘤患者施用纳米尺寸的偶联物时显示的EPR效应。
背景技术
用于治疗实体瘤的化疗剂对正常组织也有毒性。这些药剂的施用水平受到其最大耐受剂量限制。当使用这些药剂组合时,正常组织也经历所有药剂的毒性,其进一步限制了有效剂量水平。根据没有导致最佳结果的试错法,通过设计避免同时施用不止一种药剂的方案基本上克服了这个问题。另一种方法是使用协同组合的两种或多种药剂,其中通过使用合适的递送载体控制药物动力学来维持其协同比例,见美国专利7,850,990和U.S.9,271,931。由于药物协同作用,低剂量水平也有效,因此也改善了药物固有的毒性。
尽管现有领域已有这些方法,仍然需要成功设计能够使得药物组合对正常组织毒性效应最小化的方案。本发明通过利用可作为屏障的大分子的增强渗透和保留效应(EPR)解决了这个问题,从而控制了正常组织接触有毒药物,且通过本发明确保了这些偶联物显示EPR效应。
早在1986年,Maeda及其同事就在实体瘤中显示了EPR效应(Matsumura,Y.,和Maeda,H.,Cancer Res.(1986)46:6387 6392)。同一小组后来的工作确认了该效应(Maeda,H.等,J.Controlled Release(2001)74:47 61;Maeda,H.等,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2009)71:409 419)。这些作者主要揭示了由于与正常脉管结构不同的新生血管,实体瘤生长可能超过几毫米的直径。虽然正常脉管的截留孔径范围在2-6nm之间,实体瘤的新生血管的截留孔径范围达100-700nm(Dreher,M.R.等,J.Natl.Cancer Inst.(2006)98:335 344;Singh,Y.等,Molecular Pharmaceutics(2012)9:144 155)。肿瘤新生血管的较大孔径导致渗漏,使得大分子和纳米颗粒穿透和渗入肿瘤,与较差的淋巴引流结果一起导致EPR效应,导致大分子、偶联物或纳米颗粒积聚,该效应通常与纳米颗粒或大分子的尺寸和柔性以及接触(即t1/2)相关。这特别如下文的脂质体递送所示:Allen,T.等,Science(2004)303:1818-1822。文献中有用的描述该效应的综述包括Danhier,F.等,J.Control Rel.(2010)148:135-146和Eshun,F.K.等,Gene Ther.(2010)17:922-929。对于各种尺寸的葡聚糖,已显示其最佳尺寸为约40-60kDa,通过EPR效应提供最佳聚集的t1/2(接触时间)(Dreher,M.R.等,J Natl Cancer Inst(2006)见上)。
在一个方面,本发明通过提供纳米分子载体(尤其是柔性载体)偶联物,和通过允许测定与EPR效应相关的药物动力学,依赖于利用甚至对于小分子的EPR效应,这种测定通过提供偶联于载体的造影剂实现,该载体与用于递送作为结合于纳米分子载体(尤其是柔性载体)的偶联物的小分子所使用的载体尺寸类似。
Jain等已经描述了与纳米药物设计相关的EPR效应的特征(Chauhan,V.P.,和Jain,R.K.,Nat.Mater.(2013)12:958-962;Chauhan,V.P.等,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(2011)50:11417-11420;Chauhan,V.P.等,Nat.Nanotechnol.(2012)7:383-388)。肿瘤容器壁和组织基质具有一系列相互连接的孔,且具有可变的横截面。截留孔径仅仅表示穿透的最大颗粒,较大的颗粒通常与较小的颗粒相比穿透肿瘤的性能更不均匀且较差。单个肿瘤内的血管孔径分布可能跨越几个数量级,大部分孔实际上可能比孔截留尺寸要小得多。因此,小颗粒的有效血管穿透性不一定与截留尺寸成比例;较小的颗粒比起较大的颗粒更迅速而均匀地穿透肿瘤,携带药物的较小颗粒应当比较大颗粒对于实体瘤有更好的效力。
纳米颗粒的形状也可以改变EPR效应(Chauhan,V.P.,(2011)见上)。非球形纳米颗粒可更迅速地穿透肿瘤,并以比尺寸相当的球体更高的水平聚集,因为穿透孔的增强与颗粒的最短直径有关。更小的容器孔径也保留了非球形颗粒的优点,但对于大孔径该优点丢失。
许多对用于EPR药物递送和造影的纳米颗粒的研究利用含有合适药物或同位素的较大的约100nm的脂质体/颗粒。如上所述,不论截留孔径,这些较大的纳米颗粒可能在许多肿瘤中并不是聚积的最佳尺寸,因为大部分肿瘤包含孔径不一的新生血管。因此,本发明致力于流体动力学直径小于50nm的载体。
本发明在一些实施方式中使用了特别有利于制备设计成利用EPR效应的偶联物的连接技术。具体公开了通过β消除释放小分子化疗剂(药)的连接。见例如美国专利8,680,315;U.S.9,387,254;U.S.8,754,190;U.S.8,946,405;和U.S.8,703,907,以及WO 2015/051307,全部通过引用纳入本文。这些连接子能够通过调节置于合适离去基团β位的碳氢键酸性来细调偶联药物释放时间。
也业已能够用与纳米颗粒偶联的可检测标记物研究这种效应。Wilks,M.Q.等,(Bioconjug.Chem.(2015)26:1061 1069)报道了一种30kDa的PEG-DFB 89Zr偶联物(还包含荧光Cy5.5)。在小鼠中,其显示消除t1/2为13.5小时,注射后48小时在移植的HT29肿瘤中具有高保留性(约4-5%ID/g)。肿瘤聚积、清除或容纳力的动力学未检测。由于这些纳米颗粒仅约10nm且是柔性的,其在肿瘤组织中的生物分布不显示强EPR效应。然而,该研究显示因此能用标记的偶联物阐明这些参数。
另一种能用于本发明方法的技术是正电子发射断层摄影术(PET),其比起对于这些研究使用荧光标记有更多优点。目前对人肿瘤中EPR效应的认识大多基于对放射性同位素标记的脂质体的低解析度单质子造影技术的研究,参见(Harrington,K.J.等,Clin.Cancer Res.(2001)7:243 254;Khalifa,A.等,Nucl.Med.Commun.(1997)18:17 23),其可使得肿瘤可见但不能定量EPR效应。PET的高检测灵敏度/定量和空间解析度使得该技术能优异地用于纳米颗粒生物分布的定量研究。例如,Lee H等,Clin Cancer Res 23(15):4190-4202显示了64Cu标记的HER2靶向脂质体多柔比星-直径约大于100nm-在人肿瘤中聚积,并可通过PET定量。认为所测得的病人间和病人内的肿瘤药物浓度范围导致了这些脂质体(包括治疗和诊断(PET标记)的基团)的可变抗肿瘤活性,该脂质体在本文中称为治疗诊断性(theranostic)纳米颗粒(TNP)。对肿瘤沉积分类,摄取水平与治疗结果呈反比:高摄取肿瘤对TNP敏感(75%部分缓解/稳定疾病),而低摄取肿瘤相反(43%稳定疾病)。还对脑转移进行造影,提示其血管有增加的孔径,能使得这类转移对TNP敏感。这些结果表明,NP造影法能用作个体化纳米药物的预测策略,从而进行诊断程序然后仅用TNP治疗敏感肿瘤病人。综上所述,这些数据提示可以用肿瘤内NP沉积的预处理造影来鉴别更可能从密切相关的TNP治疗获益的病人。
使用本领域可得的这些工具,构建了能够改善联合治疗对正常组织毒性效应的方案。
发明内容
本发明的一个目的是将联合施用的药物的细胞毒性效应限制在肿瘤组织内,而尽可能不影响正常组织。在一种方法中,这可通过调节剂量施用方案来实现,从而当第一化疗剂螯合到实体瘤而不再存在于全身中从而对正常组织施加影响时,施用第二治疗剂,从而在对肿瘤起到联合效果时,仅第二药物的毒性效应(而不是伴随有第一药物的毒性效应)会对全身产生影响。在第二种方法中,两种药物作为偶联物都螯合到实体瘤中,从而使得肿瘤细胞比正常组织经历较高浓度的两种药物,而药物在仍然存在于肿瘤中时,已从正常组织中被清除。
因此在一个方面,本发明涉及一种改善对象正常组织毒性的方法,该毒性是由于对所述对象以使用第一和第二化疗剂对实体瘤组合治疗方案施用所述第一和第二化疗剂引起的,该方法包括:
施用作为与载体偶联的药剂释放偶联物的第一药剂,其中该载体是纳米颗粒或大分子,其各自具有5-50nm的流体动力学半径(即直径为10-100nm),其中偶联物在实体瘤中显示增强渗透和保留(EPR),从而在肿瘤中浓缩所述偶联物,和其中偶联物从肿瘤释放的速率和第一药剂从偶联物释放的速率要比对象全身循环清除偶联物和所释放药剂的速率显著慢;
从对象全身循环清除偶联物和释放的药剂一段时间;和
在所述时间段后,对对象施用第二药剂。
在一些实施方式中,还可施用与第二药剂没有重叠毒性的额外药剂。
在第二个方面,本发明涉及一种使得第一和第二化疗剂对对象正常组织的毒性效应最小化的方法,该第一和第二化疗剂联合使用以治疗所述对象内的实体瘤,该方法包括施用作为与载体的可释放偶联物的所述第一和第二药剂,其中载体是纳米颗粒或大分子,各自具有5-50nm的流体动力学半径(10-100nm直径),并在所述肿瘤中两种偶联物都显示增强的渗透和保留(EPR)和有效浓度。
在同时给药的一些实施方式中,仅第一药剂偶联,第二药剂为未偶联形式。
在一些情况下,还可使用第三种类似偶联或未偶联的治疗剂。
与前述方法相关,当第二或第三药剂偶联时,载体模拟第一药剂的载体。在任何情况下,包含与偶联药物的载体具有相同性质的载体的标记的不可释放偶联物可用于监测实体瘤对偶联物的摄取。施用这些具有与标记不可释放地连接的载体的偶联物能够验证相应药物偶联物是否显示EPR效应。用于这种监测的标记物优选是能通过正电子发射断层摄影术(PET)检测的那些。
因此,本发明还提供了一种方法,其模拟有关于实体瘤中EPR效应下行为的药物偶联物的药物动力学。提供了具有与偶联于药物的载体尺寸和形状都相似的载体的合适造影剂,药物的药物动力学可以通过监测造影剂的药物动力学来预测。这种诊断剂也可用于确定用治疗剂偶联物是否适合治疗病人。
因此,在一个方面,本发明涉及式(1)的造影剂:
其中PEG代表聚乙二醇,其具有多个40-60kD的2-6臂;
螯合剂代表去铁胺或多-羟基吡啶酮多齿物;
I是适合正电子发射断层摄影术(PET)的放射性同位素;
~表示I在螯合物中的螯合;和
n是1到所述PEG臂数的整数。
本发明还包括式(2)的杂合偶联物:
其中PEG代表聚乙二醇,其包含40-60kD的2-6个臂;
螯合剂代表去铁胺或多-羟基吡啶酮多齿物;
I是适合正电子发射断层摄影术(PET)的放射性同位素;
~表示I在螯合物中的螯合;
L是接头;
D是治疗剂;
n是1到所述PEG的臂数减去x的整数;和X是最大为所述PEG臂数减去n的整数。
多臂PEG的使用是有利的,使得得到的纳米颗粒柔性较低,因此能在肿瘤中更好地保留。造影剂最佳具有约20nm直径(约10nm的流体动力学半径)。直径范围可以是10-100nm,或10-50nm或10-25nm,对应于流体动力学半径5-50、5-25或5-12.5nm。
在另一个方面,本发明涉及一种监测造影剂在肿瘤内的聚积的方法,包括施用所述造影剂并PET检测所述造影剂的位置。
在另一个方面,本发明涉及一种评估药物偶联物的药代动力学以及其在肿瘤内的聚积的方法,包括将所述药物偶联物的大小与造影剂大小匹配,施用所述造影剂并PET监测所述药剂在肿瘤中的聚积,作为药物偶联物行为的诊断结果。
因此,本发明还包括基于诊断剂评估是否合适用偶联药物治疗病人的方法。诊断剂的大小与要用于病人治疗的药物偶联物的大小匹配。更广泛地,诊断剂可简单鉴定能利用EPR效应治疗的对象。
本发明还包括包含本发明的造影剂和与造影剂大小和形状类似的药物偶联物的试剂盒。
在另一个方面,本发明涉及一种鉴定会从经修饰以显示EPR效应的药物治疗获益的对象的方法,包括对候选对象施用本发明的造影剂,并监测造影剂在对象内的分布,在不需要的组织团块中聚积所述造影剂的对象被鉴定为能从该治疗获益。见例如Lee,H.等,Clin.Canc.Res.,(2017)23:4190-4202(见上)。
与治疗方案相关,用包含与偶联药物所用的载体具有相同特征的载体的本发明的造影剂监测实体瘤对偶联物的摄取。这实现了对相应药物偶联物是否显示EPR效应的验证。
在本发明的另一个方面,包括一种鉴定患有能响应DNA修复抑制剂治疗的肿瘤的对象的方法,该方法包括确定是否存在编码影响DNA修复的蛋白质的基因内的突变,其中所述突变在对象中的存在鉴定出患有这种肿瘤的对象。
在另一个方面,本发明涉及用于对实体瘤治疗和造影的杂合偶联物,该偶联物包括柔性载体,其中载体是纳米颗粒或大分子,各自具有5-50nm的流体动力学半径,该偶联物在实体瘤中显示增强渗透和保留(EPR),从而在肿瘤内浓缩所述偶联物,其中所述载体与治疗剂还有造影剂可释放性偶联;还涉及用所述杂合偶联物对实体瘤造影和治疗的方法。图12显示了这种药物的杂合子的示范性通用结构,这种杂合子称作“治疗诊断剂”。
附图说明
图1显示了偶联的SN-38以与四臂40kD PEG(PLX038)偶联物形式在血浆中的浓度随时间的函数。释放的SN-38和药物解毒形式,即葡糖苷酸(SN-38G)的类似的结果显示在同一图中。比例类似,显示大鼠内50小时的半衰期。
图2显示了施给携带HT29异种移植物的大鼠中各种浓度的PLX038的作用,与伊立替康相比。
图3A和3B显示了在不同剂量的游离SN-38下、PLX038的肿瘤内浓度,与血浆进行比较。
图4显示了组合PLX038和第二药物(即多聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂)全身给予人类的假设剂量日程表。第一日施用PLX038;偶联物在肿瘤内聚积,并在肿瘤附近释放游离药物(虚线),偶联物和游离药物都从全身中被清除(实线)。全身清除2个半衰期后,在此为10日,全身PLX038降低到约其原来浓度的约25%,浓度比其最小效应(和毒性)水平低。此时,按照有效时间表施用第二药物。
图5显示了大鼠中从PLX038释放和小鼠中从PLX038A释放的SN-38浓度对时间作图。用先前确定的药物动力学参数对大鼠中从3.2μmol(200mg)/kg的PLX038释放的SN-38的曲线建模(Santi,D.V.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2012)109:6211-6216)。
图6A-6E是PEG40kDa-DFB-89Zr在携带HT-29异种移植物的小鼠中72h和120h时的最大强度投影(MIP):(A)躺在CT扫描仪上,双侧;携带HT-29异种移植物的小鼠中PEG40kDa-DFB-89Zr的离体生物分布研究(B);和HT-29荷瘤小鼠中肿瘤对血液比(C)对时间;在单侧荷瘤小鼠中PEG-(SN-38)3-DFB-89Zr的72h MIP造影(D);和PEG-(SN-38)3-DFB-89Zr(黑色)对PEG-DFB-89Zr(灰色)在72h的生物分布(E)。
图7A-7C显示了荷瘤小鼠中PEG40kDa-(DFB)-89Zr 4的生物分布。
图8显示了各种89Zr偶联物在HT-29异种移植物中的生物分布。
图9显示了各种89Zr偶联物在MX-I异种移植物中的生物分布。
图10显示了PEG-SN38在肿瘤治疗中的效力。
图11A-11C显示了SN38偶联物和独立施用的他拉唑帕尼(talazoparib)的协同。
图12显示了通用的杂合药物/标记偶联物“治疗诊断剂”。
本发明的实施方式
基本上在设计尽可能减少组合治疗的毒性效应的方案中有两种方法。第一种方法是通过将药物与载体偶联,确保第一治疗剂或药物捕获到要治疗的实体瘤内,使得EPR效应导致基本在实体瘤内保留偶联物和释放的药物,而未捕获在肿瘤内的施用的偶联物和释放的药物会更快从全身循环中清除,其中载体是纳米颗粒或大分子,各自具有5-50nm的流体动力学半径,优选约10nm(直径为10-100nm,优选约20nm)。因此,施用的偶联物的相当部分保留在肿瘤中,当偶联物驻留在肿瘤内时,从偶联物释放的药物也是如此。由于从全身循环中清除的速率比起偶联物和释放的药物从肿瘤中清除的速率要高得多,有效量的同时为偶联和游离形式的药物仍然对肿瘤有细胞毒性作用,而其在全身循环中的浓度已被削弱到理想水平。全身循环两个半衰期后,例如循环中和与正常组织接触的偶联物和游离药物的水平减少到最初浓度的25%,这足够低,能改善毒性。由于偶联物保留在肿瘤中释放药物,药物能对肿瘤稳定发挥其细胞毒性作用,虽然其在全身领域中的浓度已相当低,因此药物与正常组织的接触也相当低。
此时,全身施用第二药物,从而使正常组织仅暴露于第二药物的毒性效应,而第一药物仍然在肿瘤中并不可及。这使得对正常组织的组合毒性效应最小化,而在肿瘤中维持组合毒性。第二种药物可以游离形式施用,或也可以作为与类似载体的偶联物或其他合适形式施用,包括包含在递送载体,例如脂质体、纳米颗粒、微囊等中。
此外,还可与所述第二药物依同时或次施用第三种药物,其与第二药物没有重叠毒性。
或者第一和第二药物都可以偶联物形式施用,其由于EPR同时或在不同时间保留在肿瘤内。由于这种保留,每种药物的最大浓度发生在肿瘤中,而不与正常组织接触。因此,这些药物的较高剂量水平主要发生在肿瘤内,施用的偶联物以及释放的药物迅速从全身循环中被清除。
在一些情况下,可以共同施用药物另外的偶联形式。
在上述第一种方法中施用至少第一药剂和在第二种所述方法中释放第一和第二药剂的用于本发明方法的载体是天然柔性载体,具有约10nM的流体动力学半径。合适的大分子载体包括线性或多臂聚乙二醇(PEG),分子量为10-50kD。优选载体是多臂PEG,分子量至少为20kD。载体的这些特征确保了能最大限度利用EPR效应。还包括纳米颗粒载体。
特别有用的能提供纳米分子载体和化疗剂的偶联物可释放形式的是能通过β-消除反应释放药剂的接头,如在上文提到的美国专利8,680,315;9,387,254;8,754,190;8,946,405;和8,703,907中所述的那些,全部通过引用纳入本文;其不仅公开了通过β消除释放药剂的有用接头结构,还公开了可用于本发明的纳米分子载体。
其他接头包括通过水解酯、羧酸酯或羧酸甲酯,通过蛋白水解酰胺或通过硝基还原酶还原芳族硝基而切割的接头。
本发明方法的对象通常是人类对象,但本发明的方法也可用于兽医学,包括牲畜和伴侣动物。该方法还适合用于实验室的动物模型,例如大鼠、小鼠、家兔或其他模式系统,制备用于设计人用方案。
对于组合治疗中可使用的药物,已知多种化疗剂,其任一组合可选作第一和第二药物。优选加成或协同作用的药剂,例如分别抑制DNA修复的药物组合。
导致DNA损伤的药物,例如Topo1抑制物对于基因组在通常帮助DNA修复的基因中含有突变的肿瘤治疗特别有用。这些基因包括BRCA1,BRCA2,ATM(编码共济失调毛细血管扩张症突变(ATM)激酶)和ATR(编码Rad-3相关(ATR)激酶)等。本发明包括鉴定对Topo1抑制剂治疗具有增强的敏感性的肿瘤,其中荷瘤对象的基因组具有至少一个在BRCA1,BRCA2,ATM或ATR或其他基因中的突变,其阻止或阻抑基因增强DNA修复的能力。可通过抑制与DNA修复有关的第二种酶(例如PARP抑制剂)进一步增强反应,然后其导致放大的合成致死率,这是由于Topo抑制剂导致更高水平的DNA断裂造成的。因此,在使用被动靶向的PEG_SN38时,了解肿瘤的基因状态并对DNA损伤响应系统的抑制剂有一个排列选择是有用的。
示范性的药剂包括:
“信号转导抑制剂”,其影响或阻止导致癌细胞生长或分裂的信号;
“细胞毒性剂”;
“细胞周期抑制剂”或“细胞周期控制抑制剂”─它们影响细胞在其正常细胞周期中的进展;细胞的生命周期从提供其起源的有丝分裂直到有丝分裂后使其分裂成子细胞的事件;
“检查点抑制剂”─它们干涉细胞周期检查点,例如S/G2检查点、G2/M检查点和G1/S检查点的正常功能;
“拓扑异构酶抑制剂”,例如喜树碱,其干涉拓扑异构酶I或II(DNA复制和转录必需的酶)的活性;
“受体酪氨酸激酶抑制剂”─它们干涉具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体活性;
“凋亡诱导剂”─它们促进程序性细胞死亡;
“抗代谢物”例如吉西他滨或羟基脲,其与基础代谢物十分相似,因此干涉与其相关的生理活性;
“端粒酶抑制剂”─它们干涉端粒酶(延伸端粒长度并延长细胞生命及其复制能力的酶)活性;
“周期蛋白依赖性激酶抑制剂”─它们干涉周期蛋白依赖性激酶,其通过磷酸化细胞蛋白,例如组蛋白、细胞骨架蛋白、转录因子、肿瘤阻遏物基因等控制细胞周期的不同时期之间的主要步骤;
“DNA损伤剂”;
“DNA修复抑制剂”;
“抗血管生成剂”,其干涉肿瘤生长期间发生的新血管生成或现有血管生长;和
“线粒体毒素”,其直接或间接中断线粒体呼吸链功能。
临床上业已批准了许多这类肿瘤治疗的组合。
可组合使用的优选药剂包括DNA损伤剂,例如卡铂、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素C、米托蒽醌;DNA修复抑制剂包括5-氟尿嘧啶(5-FU)或FUDR,吉西他滨和甲氨蝶呤;拓扑异构酶I抑制剂,例如喜树碱、伊立替康和托泊替康;S/G2或G2/M检查点抑制剂例如博来霉素、多西它赛、多柔比星、依托泊苷、紫杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞宾;G1/早期S检查点抑制剂;G2/M检查点抑制剂;受体酪氨酸激酶抑制剂例如染料木黄酮、曲妥珠单抗、ZD1839;细胞毒性剂;凋亡诱导剂和细胞周期控制抑制剂。
示范性组合为DNA损伤剂联合DNA修复抑制剂,DNA损伤抑制剂联合拓扑异构酶I或拓扑异构酶II抑制剂,拓扑异构酶I抑制剂联合S/G2或G2/M检查点抑制剂,G1/S检查点抑制剂或CDK抑制剂联合G2/M检查点抑制剂,受体酪氨酸激酶抑制剂联合细胞毒性剂,凋亡诱导剂联合细胞毒性剂,凋亡诱导剂联合细胞周期控制抑制剂,G1/S或G2/M检查点抑制剂联合细胞毒性剂,拓扑异构酶I或II抑制剂联合DNA修复抑制剂,拓扑异构酶I或II抑制剂或端粒酶抑制剂联合细胞周期控制抑制剂,拓扑异构酶I抑制剂联合拓扑异构酶II抑制剂,以及两种组合的细胞毒性剂。
示范性具体药剂包括顺铂(或卡铂)和5-FU(或FUDR),顺铂(或卡铂)和伊立替康,伊立替康和5-FU(或FUDR),长春瑞宾和顺铂(或卡铂),甲氨蝶呤和5-FU(或FUDR),伊达比星和AraC,顺铂(或卡铂)和紫杉醇,顺铂(或卡铂)和依托泊苷,顺铂(或卡铂)和托泊替康,顺铂(或卡铂)和柔红霉素,顺铂(或卡铂)和多柔比星,顺铂(或卡铂)和吉西他滨,奥沙利铂和5-FU(或FUDR),吉西他滨和5-FU(或FUDR),阿霉素和长春瑞宾,紫杉醇和多柔比星,弗拉平度和多柔比星,UCN-01和多柔比星,博来霉素和三氯拉嗪,长春瑞宾和依地福新,长春瑞宾和鞘氨醇(和鞘氨醇类似物),长春瑞宾和磷酯酰丝氨酸,长春瑞宾和喜树碱,顺铂(或卡铂)和鞘氨醇(和鞘氨醇类似物),鞘氨醇(和鞘氨醇类似物)和柔红霉素,和鞘氨醇(和鞘氨醇类似物)和多柔比星。
在一个实施方式中,第一药物是本发明SN-38的可释放偶联物,一种拓扑异构酶抑制剂,示范性第二药物包括PARP抑制剂、mTOR抑制剂、曲贝替定、顺铂、奥沙利铂、氟尿嘧啶、替莫唑胺和长春新碱–全部都已被报道与SN-38具有协同性。
一些肿瘤尤其对于PARP抑制剂敏感,在这些肿瘤中PARP抑制剂因此有利于作为组合药物。这些肿瘤在通常有助于提供帮助DNA修复的蛋白质的基因中具有突变,从而消除基因的该性质。这样的肿瘤还响应拓扑异构酶抑制剂,例如SN38,因为拓扑异构酶抑制导致过度的DNA损伤而需要DNA修复,而在这些肿瘤中DNA修复是不足的。这些基因包括BRCA1,BRCA2,ATM(编码共济失调毛细血管扩张症突变(ATM)激酶)和ATR(编码Rad-3相关(ATR)激酶)等。本发明包括鉴定在BRCA1,BRCA2,ATM或ATR或其他基因中具有突变的肿瘤,其中突变阻止或阻遏基因增强DNA修复的能力,和将本发明SN38偶联物的治疗与随后用例如PARP抑制剂或其他DNA修复抑制剂的治疗组合。由于药物从全身的其余部分消除后,聚积和保留在肿瘤内,SN38的毒性仅限于肿瘤,全身整体仅仅需要处理PARP抑制剂的毒性。
上述作为第二药物施用的一些药物可以同时或依次组合施用,只要其毒性不重叠。
造影
由于本发明方法依赖于在上述第一方法中作为第一药剂施用的偶联物和在第二方法中第一和第二药剂受到EPR效应影响的能力,重要的是确保其确实存在,因为肿瘤是异源性的,选择的特定载体必需与驻留在对象体内的实体瘤中的脉管孔结构相容,从而使得EPR效应存在。因此在本发明方法的一些实施方式中,通过同时或单独施用与相同(或与药物相连的载体具有相同性质的)载体不可释放偶联的标记物的偶联物来确认。虽然可使用任何可检测的标记物,例如荧光标记物,通常容易使用能通过正电子发射断层摄影术(PET)检测的同位素。然后监测不可释放的同位素偶联物,以检测肿瘤是否显示优势摄取和保留。如是,使用本发明的方法。如果肿瘤对于标记的不可释放偶联物不显示EPR效应,忌使用本发明方法。因此可检测同位素和将该同位素与大分子载体偶联的手段也是本领域熟知的。
对于造影,使用类似偶联物。如上所述,有利的是设计本发明的造影剂,使其直径为约20纳米,避免过度柔性。这可通过使用40-60kD的多臂PEG聚合物实现。虽然与该聚合物结合的臂数目可以是1-6,本文主要集中在3-5臂,优选4臂的多臂PEG。
式(1)中n值可以是1到与聚合物结合的臂数目,应理解在本发明组合物中n值可能对于组合物中的每一个造影基团并不是一样的。因此例如对于n为4的4臂PEG,或n为1的单臂PEG,组合物中的大部分的单个“分子”将含有分别为4或1的n值。然而例如对于4臂PEG,n=3或n=2代表了平均值或各实体中的一些可能含有4种n值,一些含有3种n值,一些含有2种n值,一些含有1种n值。
对于上述式(1)的造影剂结构,螯合剂代表去铁胺或多齿螯合剂,其包含多个羟基吡啶酮,在本文中缩写为“多羟基吡啶酮多齿物”。这类螯合剂中的许多是本领域熟知的,详述于例如如下:Ma,M.T.等,Dalton Trans(2015)44:4884-4900和Deri,M.A.,J Med Chem(2014)57:4849-4860。这些文献中对这些配体的描述详细地通过引用纳入本文。
式(1)上的共价连接子可以与螯合剂直接键合,或可以存在中间接头,例如二肽或双功能接头,包含1-20个连接原子。本发明中PET可用的放射性同位素(I)是本领域熟知的,特别是如下文表3中列出的其中一个优选亚组:Smith,S.V.等,“Production andSelection of Metal PET Radioisotopes for Molecular Imaging,”于Radioisotopes– Applications in Bio-Medical Science,Nirmal Singh,编,第10章,InTech(Rijeka,Croatia),2011,具有合适半衰期的是例如89Zr,94Tc,101In,81Rb,66Ga,64Cu,62Zn,61Cu或52Fe。
为了用本发明的造影剂作为活性药剂(即药物)递送的替代物,造影剂包含与用于偶联药物的载体相同性质的载体。然后用这些监测实体瘤对偶联物的摄取。这实现了对相应药物偶联物是否显示EPR效应的验证。
使用独立治疗剂和对偶联物造影的另一种方法使用式(2)的杂合偶联物用于治疗和对实体瘤造影,其中偶联物包含柔性载体,其中载体是各自具有5-50nm的流体动力学半径的纳米颗粒或大分子,其中偶联物在实体瘤中显示增强的渗透和保留(EPR),从而使得所述偶联物在肿瘤中浓缩,其中所述载体与治疗剂可释放性偶联,还与造影剂偶联。因此在式(2)和式(1)中,
在一些实施方式中I是89Zr,94Tc,101In,81Rb,66Ga,64Cu,62Zn,61Cu or 52Fe,和/或PEG是约40kD的四臂聚乙二醇,n是1-4,和/或螯合剂是去铁胺-B,和/或是直接键连接。
如所示,PEG的至少一个臂被造影剂占据,至少一个被治疗剂占据。考虑达到PEG聚合物臂总数的许多组合。治疗剂可以是SN38或其他拓扑异构酶抑制剂,或任何其他合适的用于肿瘤治疗的药剂,其能从肿瘤内聚积获益,例如PARP或激酶抑制剂。
本发明的造影剂还可用于鉴定携带肿瘤或其他组织物质的对象,其对显示EPR效应的治疗剂治疗敏感。因此,可对对象施用造影剂并监测,以确定例如肿瘤是否事实上优势摄取和保留类似大小的实体。
在本申请中,“一”、“一个”等表示一或多于一个,除非在上下文中清楚表明另有所指。另外,术语“化疗剂”、“药剂”和“药物”可互换使用。当列出具体数字特征时,所引用的数字通常有±10%,优选±5%,和更优选±1%的误差范围。因此,10-50nm的范围可以包括9-55nm的范围。“流体动力学半径”指表观斯托克斯半径-用与待调查的分子相同速率测定弥散通过溶液的硬球体半径,例如通过凝胶渗透层析。
本发明的对象通常是人类,但也包括非人动物,例如实验室模型和兽医对象。
本文中提到的所有文献通过引用纳入本文。
以下实施例用于说明但非限制本发明。
实施例1偶联SN-38的给药
SN-38是拓扑异构酶I抑制剂,其是从前药伊立替康释放的活性药物。SN-38的偶联物如WO 2015/051307所述。制备了两种不同的SN-38偶联物:PLX038和PLX038A。这些偶联物将药物与40kD的四臂PEG通过接头可释放性偶联,该接头能通过β-消除有效释放。PLX038和PLX038A的结构如下所示,其中PLX038中“Mod”是─CN,PLX038A中是甲基磺酰基。
6只携带HT29肿瘤异种移植物的大鼠注射约200mg/kg的PLX038,通过配有荧光监测的HPLC跟踪血浆和肿瘤中偶联物和释放药物及其葡糖苷酸(SN-38G)的浓度。如图1所示,PLX038在全身循环中的半衰期为约50小时。偶联物和游离药物以及SN-38G显示类似半衰期。
如图2所示,非毒性剂量的20mmol/kg的SN-38(PLX038形式)的效力超过了伊立替康对照的毒性胃肠道剂量。
图3A和3B中的结果对其进行了解释;它们显示不同剂量水平的偶联物PLX038和从偶联物释放的SN-38在肿瘤内的水平。如图3A所示,200mg/kg的给药剂量下PLX038在肿瘤内的水平(左栏)粗略为8nmol/g,而血浆中的浓度(如右栏所示)几乎不可检测。类似地,在图3B中对于释放的SN-38,在相同剂量下,左栏显示肿瘤中的浓度约为80pm/g,而右栏再次显示循环中其浓度几乎不可测。实际上如所示,在较低剂量下偶联物和游离药物在血浆中不可检测,而肿瘤显示显著浓度的这些物质。
实施例2 2
推荐人方案
提出了人中PLX038与第二药物(例如PARP抑制剂)组合全身施用的给药方案,其中PLX038在第1日施用,从而偶联物聚积在肿瘤中并释放游离药物。偶联物和游离药物同时从全身中被清除。全身清除2个半衰期后或10日后,全身PLX038降低到约其初始浓度的约25%,比其最小效应(和毒性)水平低。此时口服施用与SN-38协同的第二药物20天。
如图4所示,EPR效应使PLX038在肿瘤中浓缩(虚线),而全身PLX038(实线)足够低,任何毒性效果仅由如上所示在第10天施用的第二药物引起。此时,肿瘤中偶联物的浓度仍然高于最小效应水平,但低于毒性水平。
实施例3
小鼠模型的设计
由于大部分异种移植物肿瘤模型用小鼠作为宿主,理想的是改变本发明的方案用于小鼠内的测试。需要改变是由于PLX038偶联物在小鼠中的半衰期仅为约24小时,而大鼠中其为约48小时而在人中为约6小时。由于PLX038在小鼠中的更迅速消除在释放足够量的SN-38之前发生,在小鼠实验中使用具有更高清除速率的SN-38的另一种偶联物,PLX038A。
接头切割是物种依赖性的。人中在一个偶联物半衰期内32%的PLX038转化成SN-38,在大鼠中仅有12%转换,在小鼠中仅为6%。对于PLX038A,切割半衰期为70小时,在小鼠中一个偶联物半衰期中26%转化成SN-38。该偶联物还可在小鼠中腹膜内(IP)给药,具有100%的生物利用度。
然而在小鼠中PLX038A仍具有较短的肾消除t1/2,因此单剂可能不引起高肿瘤聚积,需要更多接触来实现。因此在小鼠中使用PLX038A的多剂方案,其模拟大鼠中产生高肿瘤聚积的偶联物的单个有效剂量。
为了比较,在大鼠的结肠癌(HT-29)异种移植物模型中,单个200mg/kg的PLX038剂量产生61%的肿瘤生长抑制,而没有胃肠道(GI)毒性,而显示近乎相当的肿瘤抑制的伊立替康对照显示显著GI毒性。当给药后14天血清水平不可检测时,在肿瘤中有高PLX038和SN-38的聚积。图5显示了模拟大鼠中PLX038的药物动力学(PK)的小鼠PLX038A的给药方案。三天递减剂量的152,60和54mmol/kg有效模拟大鼠中从PLX038释放SN-38的PK情况。SN-38在方案中的“有效”半衰期大于2天,而小鼠中从伊立替康释放SN-38的“有效”半衰期为约2小时。表1显示了支持图5的数据。
实施例4
小鼠测试
对小鼠注射(IP)一剂50nmol的40kD四臂PEG荧光素/100g(15nmol/小鼠)以获得血清中约10μM,测试HT29异种移植物用EPR效应聚积偶联物的能力。在不同时间(6、24、48、和96小时)采集血样和肿瘤样本,测定荧光素水平。(切下肿瘤,用氢氧化钠消化,用于测定)。
在裸鼠HT29肿瘤异种移植物中测试PLX038A的肿瘤生长抑制,使用实施例3中开发的三剂方案。
用实施例3中开发的PLX038A的三剂方案治疗HT29异种移植物裸鼠模型,在14日小鼠每日用口服PARP抑制剂治疗。
对HT29荷瘤裸鼠每日施用与PLX038A类似的PARP抑制剂偶联物,相对于每日施用游离抑制剂进行测试。
还在该模型中同时测试了偶联物PLX038A和相对的PARP抑制剂偶联物的组合。
实施例5
PEG40kDa-PET同位素的合成
PEG-去铁胺偶联物的合成
4-臂PEG40kDa与DFB偶联:
4-臂40-kDa PEG-胺(GL4-400PA,NOF;150mg,3,75umol)和对异硫氰酸根合苄基-去铁胺B(Macrocyclics;4mg,5.3umol)在2mL DMSO中的溶液在室温保持16小时,然后对水透析(SpectraPor 2膜,12-14kDa截留值)以除去未偶联物质。蒸发溶液至干,剩余物溶于2mL THF,缓慢搅拌加到50mL MTBE中。收集沉淀的偶联物并干燥,获得产物(140mg)。2.4mg样品溶于58uL水以获得1mM溶液。将20-uL等份加到100uL的1mM高氯酸铁(III)中,获得显示OD42snm=0.459的溶液。基于2,300M·1cm·1的消光系数,表明DFB浓度为1.1mM,与预期良好一致。
(PEG)40与[DFB=去铁胺B](DFB)偶联:将PEG40kDa(NH2)4和对异硫氰酸根合苄基-DFB如下反应制备PEG40kDa-(DFB)4(Perk,L.R.等,Eur.J.Nucl.Med.Mol.I.(2010)37:250-259;Fischer,G.,et al.,Molecules(2013)18:6469-6490;和van de Watering,F.C.等,Biomed.Res.Int.(2014)2014:203601)(macrocyclics)。
4-臂PEG40kDa与DFB偶联(PEG40kDa-(DFB)4}:
40-kDa 4臂PEG-四(琥珀酰亚胺酯)(JenKem Technologies;100mg,10umol琥珀酰亚胺酯),甲磺酸去铁胺(Sigma;10mg,15umol),N,N-二异丙基乙胺(35uL,200umol),和HATU(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-lH-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧代六氟磷酸酯)(7mg,18umol)在2mL DMF中的溶液在环境温度下维持16小时,然后对水和甲醇透析(SpectraPor2膜,12-14kDa截留值)以除去未偶联物质。蒸发溶液至干,剩余物溶于2mL THF,缓慢搅拌加到50mL MTBE中获得偶联物(84mg)。5.0mg等份溶于500μl水,获得0.21mM偶联物溶液。通过加到1mM高氯酸铁(III)中如上所述测定DFB含量,获得0.84μM DFB,表示每个偶联物有4个DFB。
另选方法
通过用N3-(CH2)nCO-HSE酰化DFB制备另选的DFB试剂用于偶联,N3-(CH2)nCO-DFB与环辛炔衍生的PEG40kDa(NH2)4(SPAAC)反应。
与PET同位素偶联:
用89Zr辛酸盐处理PEG化的DFB,与PET同位素偶联,然后用尺寸排阻层析纯化(Perk,L.R.,见上;和van de Watering,F.C.,见上)。
PEG40kDa-(DFB)4+89Zr-辛酸盐→PEG40kDa-(DFB-89Zr)4
PEG40kDa-(BzI125I)4的制备是通过使如下所示的125I-叠氮化物与环辛炔衍生的PEG40kDa(NH2)4(通过MFCO-HSE+PEG40kDa(NH2)4制备)反应,其导致纯净高产量的张力促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)反应。下面显示了[125I]碘代苯甲酰-PEG-叠氮化物的制备和放射碘化,用于SPAAC稳定碘化大分子。
实施例6
杂合SN38/DFB偶联物
4-臂PEG40kDA与1x稳定-DFB和3x可释放SN-38偶联
(PEG40kDA-(sDFB)1(rSN38)3):
A.杂合SN38/DFB偶联物的制备
N-((6-叠氮己氧基)羰基)去铁胺B:将6-叠氮己基琥珀酰亚胺碳酸酯(35mg,120umol)在2mL乙腈中的溶液加到甲磺酸去铁胺(65mg,100umol)的2mL0.5 MNaHC03溶液中。搅拌16小时后,收集得到的白色沉淀,用水和乙腈洗涤,然后真空干燥获得产物(45mg;62%)。MS:[M+H]+=730.46(C32H60N9O10计算值=730.44)。
叠氮基接头-SN38具有氰基调节子:如PCT公开W02015/051307中所述制备。
PEG40kDa-(DBCO)4:室温搅拌40-kDa4臂PEG-四胺(PTE400-PA,NOF;10umol胺),二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS,ClickChemistryTools;5mg,12umol),和N,N-二异丙基乙胺(2uL,12umol)在1ml乙腈中的溶液1小时。蒸发混合物至干,然后重新溶于1mLTHF,加入10mL MTBE沉淀。收集得到的固体,用MTBE洗涤,干燥提供产物。
PEG40kDa-(sDFB)1(rSN38)3:稳定接头-DFB和可释放接头-SN38的1:3混合物与PEG40kDa(DBCO)4偶联,获得HPLC分析主要是PEG40kDa(sDFB)1(rSN38)3和PEG40kDa(rSN38)4的混合物。通过制备级HPLC,用Phenomenex 300A 5um Jupiter C18柱,21.2x150 mm,30-60%的乙腈在水+0.1%TFA中的梯度以15mL/min分离。在360nmUV测定SN38含量(e360=22,400M- 1cm-1)用上述高氯酸铁(III)测定DFB含量,获得SN-38对DFB比为2.7:1。
B.其他杂合药物/DFB偶联物的制备
i.(5HCO)3-PEG40kDa-DFB中间物的替代制备
步骤1.(H2N)3-PEG40kDa-NHFmoc.将Fmoc-OSu(0.48mL,12μmol)于MeCN的25mM溶液滴加到剧烈搅拌中的PEG40kDa-(NH2)4(406mg,10.0μmol,5mM最终浓度)溶于3.5mL MeCN的溶液中。环境温度下搅拌反应混合物,5分钟后,通过C18HPLC(ELSD)判断混合物包括44%标题化合物。反应溶液旋转蒸发浓缩至约1mL。
浓缩液用H2O(0.1%TFA)稀释到6mL,然后用制备级C18 HPLC纯化,用(35%-60%)MeCN在H2O(0.1%TFA)中的线性梯度洗脱两个注射物。用C18 HPLC分析第一次洗脱的含Fmoc的峰的组分,清除,合并含产物组分并浓缩至干。随后在高真空下除去挥发物30分钟,剩余物溶于少量THF(约1mL),滴加到已配衡的(tared)50mL Falcon管中的40mL 0℃的MTBE中。旋转悬液,冰上维持15分钟,离心(3500xg,1分钟),并倾析。用MTBE(2x 40mL)洗涤沉淀物,如上分离,高真空干燥获得白色粉末状的标题化合物(96mg,2.2μmol给定3TFA,22%产率)。C18 HPLC,用ELSD测定纯度:99.6%(RV=9.39mL)。
步骤2.(环辛-4-炔-1-基氧代羰基-NH)3-PEG40kDa-NHFmoc。将O-(环辛-4-炔-1-基)-O’-琥珀酰亚胺碳酸酯(63μL,9.5μmol)在MeCN中的0.15M溶液滴加到(H2N)3-PEG40kDa-NHFmoc(96mg,2.2μmol,50mg/mL最终浓度;6.7μmol NH2)和DIPEA(2.8μL,16μmol)在1.9mLMeCN的搅拌溶液中。环境温度下搅拌反应混合物,用C18 HPLC监测。起始物质通过两次缓慢洗脱中间峰转换成一个单产物峰。2小时后,旋转蒸发浓缩反应混合物至约0.3mL。用1mLTHF稀释浓缩液,溶液滴加到已配衡的50mL Falcon管内的40mL冰冷MTBE中。冰上维持混合物15分钟,然后离心(3500xg,1分钟),并倾析。用冰冷的MTBE(2x 40mL)洗涤湿固体,离心(3500x g,1分钟)并倾析。高真空除去残余挥发物20分钟,获得白色粉末状标题化合物(40mg,0.93μmol,66%产率)。为了防止降解,用0.78mL无胺DMF立即稀释固体。C18 HPLC,用ELSD测定的纯度:93.5%(RV=9.96mL)和6.5%杂质(RV=9.78mL)。
步骤3.(环辛-4-炔-1-基氧代羰基-NH)3-PEG40kDa-NH2。4-甲基哌啶(39μL,5%v/v终浓度)加到(环辛-4-炔-1-基氧基羰基-NH)3-PEG40kDa-NHFmoc(0.78mL,78mg,1.8μmol)在DMF中的100mg/ml溶液中。环境温度下维持反应混合物,用C18 HPLC监测。30分钟后,将反应溶液滴加到已配衡的50mL Falcon管中的40mL冰冷的MTBE中沉淀PEG。冰上维持混合物15分钟,然后离心(3500xg,1分钟),并倾析。用MTBE(2x 40mL)洗涤湿固体,离心(3500x g,1分钟)并倾析。高真空除去残余挥发物15分钟,获得白色粉末状标题化合物(68mg,1.6μmol,89%产率)。为了防止降解,用0.68mL无胺DMF立即稀释固体。C18 HPLC,用ELSD测定的纯度:87.0%(RV=9.59mL)和13.0%杂质(RV=9.43mL)。
步骤4.(环辛-4-炔-1-基氧代羰基-NH)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNHDFB)。将对异硫氰酸根合苄基-去铁胺B(.8mg,2.4μmol;Macrocyclics)加到(环辛-4-炔-1-基氧基羰基-NH)3-PEG40kDa-NH2(1.36mL,1.6μmol)在DMF中的50mg/ml溶液中。反应混合物置于37℃水浴中,用C18 HPLC监测。4小时后,将反应溶液滴加到已配衡的50mL Falcon管中的40mL冰冷的MTBE中沉淀PEG。冰上维持混合物15分钟,然后离心(3500xg,2分钟),并倾析。用MTBE(2x 40mL)洗涤湿固体,离心(3500x g,2分钟)并倾析。高真空除去残余挥发物15分钟,获得白色固态标题化合物(67mg,1.5μmol,94%产率)。为了防止降解,用MeCN(2.61mL MeCN,25mg/mL)立即将固体稀释到2.68mL总体积。沉淀不溶性DFB-NCS(3500x g,2分钟),除去含产物的MeCN上清液。C18 HPLC,用ELSD测定的纯度:80.3%(RV=9.59mL)和19.7%肩部(RV=9.43mL)。
ii.(药物)3-PEG40kDa-DFB的制备
a.药物=SN38
(SN38-L)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNH-DFB).将稳定的叠氮-SN38(4.0mg5.2μmol,4mM终浓度;Santi等,J.Med.Chem.57:2303-14(2014))加到(环辛-4-炔-1-基氧基羰基-NH)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNHDFB)(1.3mL,0.75μmol PEG,2.3μmol环辛炔,1.8mM环辛炔终浓度)在MeCN中的25mg/mL溶液中。反应混合物置于37℃水浴中,用C18 HPLC监测。44小时后,反应溶液对MeOH(12-14k MWCO)透析。透析物浓缩至干,高真空除去残余挥发物,得到白色膜状的标题化合物(24mg,0.52μmol,69%质量产率),其用A383测定包含1.4μmol的SN38,用Fe3+-DFB中的A490测定包含0.50μmol的DFB。使用SN38ε383=29,100M-1cm-1和Fe3+-DFBε490=3,000M-1cm-1,发现SN38:DFB比为2.8:1。C18 HPLC,用ELSD测定的纯度:83.0%(RV=9.67mL)和14.6%肩部(RV=9.52mL)。
b.药物=瑞卡帕布–PARP抑制剂
(瑞卡帕布-L)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNH-DFB)。将稳定的叠氮化瑞卡帕布(0.11mL,1.1μmol,1.8mM终浓度;通过将瑞卡帕布和6-叠氮己基琥珀酰亚胺碳酸酯根据Santi等,Proc.Natl.Acad.Sci.109:6211-16(2012)的方法反应制备)的10mM溶液加到(环辛-4-炔-1-基氧基羰基-NH)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNHDFB)(0.50mL,0.29μmolPEG,0.86μmol环辛炔,1.4mM环辛炔终浓度)在MeCN中的25mg/ml溶液中。反应混合物置于37℃水浴中,用C18 HPLC监测。68小时后,反应溶液含有约35:65的未修饰PEG化药物-接头的混合物。未观察到一系列的(药物)n-PEG-DFB的单独品种。用SpeedVac浓缩反应溶液至0.1mL,用H2O稀释到1.0mL,加到PD-Midi柱上。用H2O洗脱,获得包含未修饰和PEG化药物-接头的排除物质的混浊组分。混合物然后对MeOH(12-14k MWCO)透析。透析物浓缩至干,高真空除去残余挥发物,得到白色膜状的标题化合物(8.7mg,0.19μmol,66%产率),其用A355测定包含0.51μmol的瑞卡帕布,用Fe3+-DFB中的A490测定包含0.19μmol的DFB。使用瑞卡帕布ε355=13,260M-1cm-1和Fe3+-DFBε490=3,000M-1cm-1,发现瑞卡帕布:DFB比为2.7:1。C18HPLC,用ELSD测定的纯度:78.5%(RV=9.41mL)和21.5%肩部(RV=9.27mL)。
c.药物=VX-970–一种ATR激酶抑制剂
(VX970-L)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNH-DFB).如上对于瑞卡帕布所述,将稳定的叠氮化VX970(0.11mL,1.1μmol,1.8mM终浓度;通过将VX970和6-叠氮己基琥珀酰亚胺碳酸酯根据Santi等,Proc.Natl.Acad.Sci.109:6211-16(2012)的方法反应制备)用(环辛-4-炔-1-基氧基羰基-NH)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNHDFB)(0.50mL,0.29μmolPEG,0.86μmol环辛炔,1.4mM环辛炔终浓度)在MeCN中的25mg/ml溶液处理,获得白色膜状的标题化合物(10mg,0.22μmol,76%质量产率),其用A355测定包含0.55μmol的VX970,用Fe3+-DFB中的A490测定包含0.24μmol的DFB。使用VX970ε383=17,200M-1cm-1(127BH52)和Fe3+-DFBε490=3,000M-1cm-1,发现VX970:DFB比为2.3:1。C18 HPLC,用ELSD测定的纯度:59.2%(RV=9.98mL)和38.4%肩部(RV=9.73mL)。
d.药物=BMN673–PARP抑制剂
(BMN673-L)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNH-DFB).如上对于瑞卡帕布所述,将稳定的叠氮化-BMN673(0.11mL,1.1μmol,1.8mM终浓度;通过将BMN673和6-叠氮己基琥珀酰亚胺碳酸酯根据Santi等,Proc.Natl.Acad.Sci.109:6211-16(2012)的方法反应制备)用(环辛-4-炔-1-基氧基羰基-NH)3-PEG40kDa-NHCSNH-苯基-4-(NHCSNHDFB)(0.50mL,0.29μmolPEG,0.86μmol环辛炔,1.4mM环辛炔终浓度)在MeCN中的25mg/ml溶液处理,获得白色膜状的标题化合物(12mg,0.26μmol,91%质量产率),其用A310测定包含0.65μmol的BMN673,用Fe3+-DFB中的A490测定包含0.20μmol的DFB。使用BMN673ε355=9872M-1cm-1(125SF39)和Fe3+-DFBε490=3,000M-1cm-1,发现BMN673:DFB比为3.3:1。C18 HPLC,用ELSD测定的纯度:69.7%(RV=9.47mL)和30.3%肩部(RV=9.32mL)。
C.与PET同位素偶联:
通过实施例5中的方法将杂合SN38/DFB和替代的杂合药物/DFB偶联物与89Zr偶联。
实施例7
用PET检测动物研究中的EPR
用偶联物PEG-PET同位素(与实施例1-4中的药物偶联物尺寸和形状相似)处理携带HT-29人异种移植物的小鼠和正常小鼠。在荷瘤小鼠中,在t=0,12,24,48和96小时进行PET-造影以测定肿瘤标记强度的聚积,将其与用PEG40kDa-荧光素的类似实验结果比较(Singh,Y.,见上)。在这些时间点收集血清,确定PEG-同位素消除的t1/2(小鼠中PEG40kDa的消除t1/2通常约为24小时),以及进行全身放射活性测定。
用约200uCi/小鼠处理HT-29荷瘤小鼠和正常对照小鼠,在不同时间点进行PET造影以确定聚积的量和速率。在约1uCi/cc观察到信号,因此只要背景组织不聚积示踪物,肿瘤轻易可见。在同一实验中,随着试剂从体内清除,跟踪同位素的丧失。因此测定了a)PEG-同位素的肿瘤聚积(定量PET造影),b)血管消除(血清放射活性),c)全身消除(全身放射活性)和d)肿瘤消除(定量PET造影)的速率。
当肿瘤聚积完成时,用不同量的PEG40kDa-同位素处理荷瘤小鼠,以确定可聚积的纳米颗粒的最大量。
因此在该实施例中,用PET扫描模拟与相同或相似载体偶联的药剂的行为,以评估给药方案的恰当参数。
实施例8
PET造影/PEG40kDa-DFB89Zr的生物分布.
携带异种移植物的小鼠(n=5)注射约300μCi(8.4nmol)的PEG40kDa-DFB-89Zr,在24h(n=2)和48h(n=2)获得小PET/CT影像。肿瘤中%ID/g摄取(PEG40kDa-DFB-89Zr的摄取)在24小时和48小时时分别为15和20%,而除了肝以外的器官为≤3%摄取。小PET/CT研究显示89Zr-DFB-PEG40在MX-1肿瘤中早在24小时时就有高度聚积,而在健康组织中的聚积接近背景。造影数据与肿瘤中从24-48小时的聚积增加一致。然而,肿瘤中存在不均匀的摄取,可能提示迅速生长的肿瘤的坏死。
用较慢生长的HT-29肿瘤重复了该实验。由于在MX-1肿瘤中较低的肿瘤对血液比例和在较早时间点的有限清除(1.1±0.2[24h]-1.2±0.1[48h]),在72小时和120小时研究了HT-29肿瘤中的摄取。小鼠(n=8)注射约160μCi(8.4nmol)的89Zr-DFB-PEG40,在72小时和120小时获得小PET/CT影像。72小时和120小时对小鼠安乐死,用于离体生物分布研究。HT-29肿瘤在72小时和120小时的小PET/CT上清晰可见(图6A),生物分布研究揭示在72小时和120小时有20.6±2.4和4.4±4.5%ID/g的高摄取(图6B),肿瘤/血液在72小时和120小时分别为2.8±0.4和5.1±1.3(图6C)。图6D是单侧荷瘤小鼠中PEG-SN-38)3-DFB89Zr的MIP影像。图6E显示了72小时处PEG-(SN-38)3-DFB-89Zr(黑色)vs PEG-DFB-89Zr(灰色)的生物分布。
在额外的研究中,将实施例5的PEG40kDa-(DFB-89Zr)4注射入携带HT29肿瘤的小鼠中。该实验使用5只小鼠,每只注射100μl盐水中的250-290μCi偶联物。注射后一小时对两只小鼠造影。24小时后,对两只小鼠(一只已经在一小时时造影和另一只小鼠)造影然后杀死,进行分布研究。在48小时,对两只小鼠造影(一只已经在一小时造影和另一只小鼠),这两只和剩余小鼠都杀死进行分布研究。
图7A-7C中显示了这些研究的结果。如图7A所示,在所有测定时间点肿瘤中都存在标记物。如图7B所示,在大部分器官中%注射剂量(ID)/克都是显著的,虽然在骨骼、脾脏和肿瘤中具有最高水平。如图7C所示,当计算成注射剂量/每个器官百分数而不是每克器官时,肿瘤中的聚积相对于其他器官显著更高,尤其在48小时处。仅肝脏显示了显著聚积,其在24-48小时期间下降。因此,造影剂确认了偶联物在肿瘤中比起其他器官选择性聚积。
实施例9
额外分布研究
用4臂PEG40kDa-DFB-89Zr(实施例5),4-臂PEG40kDa-(DFB-89Zr)4(实施例5),和4-臂PEG40kDa-(DFB-89Zr)1(SN38)3(实施例6)在MX-1和HT-29异种移植物中重复了实施例8的实验。用PET造影测定给药后1、24、48、72、96和216小时处89Zr在肿瘤、心脏、肝脏和肾脏中的聚积。用膜限制组织分布模型根据Li等,Intl.J.Nanomedicine(2012)7:1345-56的方法分析得到的数据(表示成衰减矫正的总剂量百分数)。纳入剩余组织的区室,以在不存在更具体组织分析物的情况下匹配将测得的血液水平。用相当于血液到器官的弥散系数(k,表2)和从20小时的血浆半衰期计算得到的消除速率常数之和的总清除对血液数据拟合。
在实验误差范围内,全部三种化合物在特定的肿瘤异种移植物内都显示相同的组织分布。图8显示了89Zr在HT-29异种移植物中的分布,图9显示了89Zr在MX-1异种移植物中的分布。表2提供了模型参数,其中R=组织-血液分配系数,k=弥散系数,V=组织体积,和VVF=组织的血管比例。
表2
膜限制组织分布模型的参数
HT-29 | R | k(h<sup>-1</sup>) | V(mL) | VVF | k/RV |
循环 | 2.8 | 1 | |||
心脏 | 0.7 | 0.0015 | 0.15 | 0.23 | 0.0143 |
肾脏 | 0.6 | 0.0017 | 0.5 | 0.08 | 0.00567 |
肝脏 | 1.5 | 0.013 | 1.65 | 0.15 | 0.00523 |
肿瘤 | 5 | 0.0095 | 1 | 0.04 | 0.0019 |
身体 | 1 | 0.03 | 30 | 0.1 | 0.001 |
MX-1 | |||||
循环 | 2.8 | 1 | |||
心脏 | 0.7 | 0.0015 | 0.15 | 0.23 | 0.0143 |
肾脏 | 0.5 | 0.0015 | 0.5 | 0.09 | 0.006 |
肝脏 | 1.2 | 0.012 | 1.65 | 0.134 | 0.00606 |
肿瘤 | 5 | 0.0062 | 0.45 | 0.075 | 0.00276 |
身体 | 1 | 0.03 | 30 | 0.1 | 0.001 |
在两种异种移植物模型中,观察到89Zr偶联物在肿瘤组织中选择性聚积,并比在其他组织中保留更长的时间。
实施例10
造影剂和活性剂的生物分布关联
在该实施例中,造影剂PEG40kDa-DFB89Zr的药代动力学/生物分布与PEG-SN-38的进行了比较。
SN-38是伊立替康(CPT-11,一种广泛使用的抗癌药)的活性代谢物。
(PEG~SN-38)是4臂PEG40kDa和4当量SN-38的偶联物,得到PEG40kDa(SN-38)4(SantiDV等,J.of Med.Chem.(2014)57(6):2303-2314)。(PEG~SN-38在临床1期试验中剂量递增,显示长达6天的t1/2,β。)
将106到107个HT29细胞移植入NSG小鼠体侧,制备异种移植物小鼠,维持直到肿瘤为约200mm3。用小PET/CT影像的时间对活性曲线,血液,肿瘤和主要器官测定PEG40kDa-DFB-89Zr在肿瘤中的聚积/消除速率,血液和身体的消除速率以及小鼠剩余部分的时序活性分布。PEG40kDa-DFB-89Zr增加的浓度提高了聚积速率,而对肿瘤的一级消除没有影响。
将不同剂量的未标记的PEG~(SN-38)4偶联物注射入动物。根据PEG~(SN-38)的临床前毒性研究,在HT-29肿瘤/裸鼠中提供50%肿瘤生长抑制(TGI)的剂量为150mg/kg。根据异速比例,小鼠中50%TGI应为约280mg/kg。验证了可测定生长抑制(例如约50%TGI)的目标剂量。
制备了PEG~(SN-38)4和PEG-(DFB-89Zr)的混合物,其适用于a)实现治疗目标剂量,和b)在10天内如上所述用PET测定监控PEG-(DFB-89Zr)的肿瘤摄取/消除动力学。除去组织用于定量生物分布,血液采集。通过HPLC测定NaOH消化的肿瘤和血液样本在不同时间点测定肿瘤的总SN-38含量(Santi等,(见上))。在不同时间点测定PEG~(SN-38)4/PEG-(DFB-89Zr)比以验证两种组分肿瘤摄取的比例对时间的药物/同位素特征或其他关系。
建立对应于PEG~(SN-38)4治疗剂量的PEG-(DFB-89Zr)的%ID/g肿瘤。鉴定出高摄取肿瘤,其聚积了足够的PEG~(SN-38)4以达到治疗剂量。
因此,通过最初给予本发明的造影剂鉴定出能够从偶联SN-38的EPR效应获益的对象。
实施例11
PLX038A的效力
在该实施例中使用了实施例1中称作PLX038A和本文中缩写为PEG-SN38的SN38偶联物。
对四组携带MX-1肿瘤异种移植物小鼠(每组5只)注射运载体,或单剂的载体或137μmole/kg伊立替康(0.137/g或约4μmole/只小鼠)或120μmole/kg PEG-SN38qdx x 1d(单剂)。测定作为时间函数的肿瘤体积。在42日,用120μmole/kgPEG-SN28处理接受载体的组。结果示于图10。
如所示,注射载体的小鼠中的MX-1肿瘤生长迅速,在4周后达到1200mm3,而从最初的42天到注射PEG-38SN38后肿瘤体积急剧下降。在时间0的PEG-SN38剂量立即消除肿瘤。伊立替康虽然有一些作用,但是仅比载体要好些-在4周后肿瘤达到了600mm3。
另外,对于未治疗肿瘤的小鼠显示肿瘤生长甚至达到了1.7cm3,一剂MTD的PEGSN38使这些肿瘤萎缩。
这些结果证明PEG-SN38对于治疗实体瘤高度有效,实施例8中造影剂的发现也与该结果一致。
实施例12
PLX038A和PARP抑制剂他拉唑帕尼(称为BMN673或TLZ)的协同效应
小鼠MX-1异种移植物的制备:从Charles River Labs(Frederick,Maryland)获得MX-1细胞系。Ovejera AA等.Ann Clin Lab Sci(1978)8:50-6。细胞在RPMI-1640,10%FBS和1%2mM L-谷氨酰胺中37℃95%空气/5%CO2气氛下培养。
将来自Taconic Bioscience(Cambridge City,Indiana)的雌性NCr裸鼠(NCrTac:NCr-Foxn1nu;约6-7周龄)豢养在UCSF Preclinical Therapeutics Core vivarium(San Francisco,California)。遵照UCSF研究所动物护理和使用委员会进行全部动物研究。通过在雌性NCr裸鼠右侧皮下注射MX-1肿瘤细胞(2x106细胞于100μl无血清培养基1:1混合Matrigel中)建立肿瘤异种移植物。当肿瘤异种移植物在供体小鼠中达到1000-1500mm3,将其切下,切成均匀大小的片段(尺寸约2.5x 2.5x 2.5mm),包埋在Matrigel中,通过皮下套管移植重新移植入受体小鼠。
Morton CL,Houghton PJ.Nat Protoc.(2007)2:247-50。
给药和肿瘤体积测量:在pH5的等渗乙酸盐中制备PLX038A(1.02mM SN38;0.26mMPLX038A偶联物)溶液,使用前灭菌过滤(0.2μm)。BMN673(52μM)的溶液制备在10%二甲基乙酰胺/5%Solutol HS15/85%1X PBS中,使用前灭菌过滤(0.2μm)。
当组平均尺寸达到100-200mm3时,对组(N=4-5/组)给药。小鼠接受运载体,单剂PLX038A(14.7mL/kg腹膜内,15μmol/kg),每日给药的BMN673(7.72mL/kg p.o.,0.4μmol/kg),或PLX038A和BMN673以相同剂量组合。对于接受组合的组,每日BMN673给药与PLX038A给药开始于同一天(图11A)或4天后(图11B)。肿瘤体积(卡尺测量值:0.5x(长x宽2))和体重每周测量两次。当运载体对照肿瘤尺寸达到约3000mm3时,用单剂PLX038A(15μmol/kg)和每日BMN673(0.4μmol/kg)组合治疗小鼠,给药之间没有延迟(图11A)。
如图11A和11B所示,对携带MX-1肿瘤的小鼠施用15μmol/kg的PLX038A和每日给药的0.4μmol/kg他拉唑帕尼组合与这些药物单独相比提供了协同效应。不论TLZ的每日给药与PLX038A一同或4天后开始这都如此。对对照施用一次组合立刻减少肿瘤体积(图11A)。
如图11C所示,组合相对于PLX038A和TLZ单独协同增强了无事件存活。
Claims (33)
1.一种改善对象正常组织毒性的方法,该毒性是由于对所述对象以使用第一和第二化疗剂对实体瘤组合治疗方案施用所述第一和第二化疗剂引起的,该方法包括:
施用作为与柔性载体偶联的药剂释放偶联物的第一药剂,其中该载体是纳米颗粒或大分子,其各自具有5-50nm的流体动力学半径,其中偶联物在实体瘤中显示增强渗透和保留(EPR),从而在肿瘤中浓缩所述偶联物,和其中偶联物从肿瘤释放的速率和第一药剂从偶联物释放的速率要比对象全身循环清除偶联物和所释放药剂的速率显著慢;
从对象全身循环清除偶联物和释放的药剂一段时间;和
在所述时间段后,对对象施用第二药剂。
2.如权利要求1所述的方法,其中第二药剂以游离形式施用,或
其中第二药剂作为与载体的药剂释放偶联物施用,其中载体是纳米颗粒或大分子,各自具有5-50nm的流体动力学半径。
3.如权利要求1所述的方法,其还包括施用第三药剂,其与第二药剂没有重叠毒性。
4.如权利要求1所述的方法,还包括允许一段时间来清除第二药剂;和
在所述时间段后,再次对对象施用所述偶联的第一药剂。
5.如权利要求1所述的方法,其中通过施用与第一药剂相同的载体偶联的不可释放的标记物,并在所述对象体内跟踪标记物来测定与实体瘤中偶联物浓度相关的特征。
6.如权利要求5所述的方法,其中标记物是能通过正电子发射断层摄影术(PET)扫描检测的同位素。
7.如权利要求1所述的方法,其中通过β消除或通过水解酯、羧酸酯或羧酸甲酯,或通过蛋白水解酰胺或通过硝基还原酶还原芳族硝基使偶联物释放所述第一药剂。
8.如权利要求1所述的方法,其中载体包含分子量为10-60kD的聚乙二醇。
9.如权利要求1-8任一所述的方法,其中第一药剂是拓扑异构酶抑制剂,蒽环类,紫杉烷,埃博霉素,酪氨酸激酶抑制剂,同源重组修复抑制剂,生物剂,抗类固醇或核苷。
10.如权利要求9所述的方法,其中第一药剂是拓扑异构酶抑制剂。
11.如权利要求1-8任一所述的方法,其中第二药剂是同源重组修复抑制剂,对PARP抑制剂协同或加成的药剂,或mTOR抑制剂,曲贝替定、顺铂、奥沙利铂、氟尿嘧啶、替莫唑胺和长春新碱。
12.一种使得第一和第二化疗剂对对象正常组织的毒性效应最小化的方法,该第一和第二化疗剂联合使用以治疗所述对象内的实体瘤,该方法包括同时施用所述第一药剂和第二药剂,所述第一药剂的形式是与柔性载体的偶联物,其中所述偶联物显示增强的渗透和保留(EPR)并有效在所述肿瘤内浓缩所述偶联物,
其中载体是流体动力学半径为5-50nm的纳米颗粒或大分子。
13.如权利要求12所述的方法,其中第二药剂偶联或未偶联。
14.如权利要求12所述的方法,其中第二药剂与和第一药剂的载体具有相同结构的载体偶联。
15.如权利要求12所述的方法,其中通过施用与至少第一药剂相同的载体偶联的不可释放的标记物,并在所述对象体内跟踪标记物来测定与实体瘤中偶联物浓度相关的特征。
16.如权利要求15所述的方法,其中标记物是能通过正电子发射断层摄影术(PET)扫描检测的同位素。
17.如权利要求14所述的方法,其中通过β消除或通过水解酯、羧酸酯或羧酸甲酯,或通过蛋白水解酰胺或通过硝基还原酶还原芳族硝基使偶联物释放所述药剂。
18.如权利要求12所述的方法,其中大分子载体包含分子量为10kD-60kD的聚乙二醇。
19.如权利要求12-18任一所述的方法,其中第一药剂是拓扑异构酶抑制剂,蒽环类,紫杉烷,埃博霉素,酪氨酸激酶抑制剂,同源重组修复抑制剂,生物剂,抗类固醇或核苷。
20.如权利要求19所述的方法,其中第一药剂是拓扑异构酶抑制剂。
21.如权利要求12-18任一所述的方法,其中第二药剂是同源重组修复抑制剂,对PARP抑制剂协同或加成的药剂,或mTOR抑制剂,曲贝替定、顺铂、奥沙利铂、氟尿嘧啶、替莫唑胺和长春新碱。
24.一种监测权利要求22或23所述的造影剂在肿瘤内聚积的方法,其中该方法包括施用所述造影剂并通过PET检测所述造影剂的位置。
25.一种评估药物偶联物的药代动力学以及其在肿瘤内的聚积的方法,包括将所述药物偶联物的大小与权利要求22或23所述的造影剂尺寸和形状匹配,对荷瘤对象施用所述造影剂并通过PET监测所述药剂在肿瘤中的聚积。
26.一种试剂盒,包括权利要求22或23的造影剂和药物偶联物。
27.一种鉴定具有不良组织团块的对象是否可能从经修饰以显示EPR效应的药物治疗获益的方法,包括对候选对象施用权利要求22或23所述的造影剂;和
监测对象内造影剂的分布,
其中在所述不良组织团块中聚积所述造影剂的对象被鉴定为将从所述治疗获益的对象。
28.如权利要求27所述的方法,其中还包括确定是否存在编码影响DNA修复的蛋白质的基因内的突变,其中所述对象内所述突变的存在表明对象患有这种肿瘤。
29.如权利要求28所述的方法,其中基因是BRCA1,BRCA2,ATM或ATR。
30.一种用于对实体瘤治疗和造影的杂合偶联物,其中偶联物包含柔性载体,其中载体是各自具有5-50nm的流体动力学半径的纳米颗粒或大分子,其中偶联物在实体瘤中显示增强的渗透和保留(EPR),从而使得所述偶联物在肿瘤中浓缩,其中所述载体与治疗剂可释放性偶联,还与造影剂偶联。
33.一种关联实体瘤造影和治疗的方法,其中该方法包括对携带实体瘤的对象施用权利要求30-32任一所述的杂合偶联物,监测所述偶联物在肿瘤中的聚积和监测所述肿瘤的体积。
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