CN116829192A

CN116829192A - 大型胞饮作用选择性单体-药物缀合物

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Publication number: CN116829192A
Application number: CN202180089794.1A
Authority: CN
Inventors: C·拉米雷兹; A·豪瑟; N·比尔斯; D·巴尔-萨希; 小出秋子; 小出正平
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2021-11-10
Publication date: 2023-09-29
Also published as: JP2023551388A; AU2021377232A1; EP4243874A1; MX2023005435A; CA3198138A1; US20240016944A1; WO2022103856A1

Abstract

本公开内容涉及药物和诊断组合物，其包含大型胞饮作用选择性非结合蛋白质‑药物缀合物。这些非结合性蛋白质‑药物缀合物包含与药物活性部分或诊断部分相偶联的非结合性纤连蛋白III型(FN3)结构域。本公开也涉及治疗和诊断方法，这些方法涉及将本文描述的药物组合物施用给有需要的对象。

Description

大型胞饮作用选择性单体-药物缀合物

本申请要求于2020年11月10日提交的美国临时专利申请第63/112,039号的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开内容涉及药物和诊断组合物，其包含大型胞饮作用选择性非结合性蛋白质-药物缀合物。这些非结合性蛋白质-药物缀合物包含与药物活性部分或诊断部分相偶联的非结合性纤连蛋白III型(FN3)结构域。本公开也涉及治疗和诊断方法，这些方法涉及将本文描述的药物组合物施用给有需要的对象。

背景技术

30多年来，人们已知道大约三分之一的人类癌症由KRas蛋白中的突变引起。这包括高比例的肺癌(～25％)、胰腺癌(～95％)、和结肠癌(～45％)。当KRas蛋白发生突变时，细胞会不受控制地生长、逃避死亡信号，甚至使细胞对许多可用的癌症疗法产生耐药性。虽然在过去30年中在了解KRas癌症的生物学方面取得了长足进步，但是目前针对这些癌症的疗法仍然是相对无效的。开发新的候选药物和获得FDA批准的主要障碍是通常由脱靶效应引起的毒性问题。

本公开涉及克服本领域中的这一限制和相关限制。

发明内容

本公开的第一方面涉及一种药物组合物，其包含非结合性蛋白质-药物结合物和药学上可接受的载体。该药物组合物的非结合性蛋白质-药物缀合物包含第一部分、氨基酸接头、和第二部分。该蛋白质-药物缀合物的第一部分包含非结合性纤连蛋白III型(FN3)结构域，该蛋白质-药物缀合物的第二部分选自药物活性部分或诊断部分，并经由该氨基酸接头与第一部分偶联。。

本公开的另一个方面涉及用于治疗对象的癌症的方法。该方法包括以有效治疗癌症的量向患有癌症的对象施用包含如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物的组合物。

本公开的另一个方面涉及用于对对象的肿瘤进行成像的方法。该方法包括选择患有肿瘤的对象并向该对象施用包含如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物的组合物。

本公开的另一个方面涉及用于调节对象的免疫应答的方法。该方法涉及以有效调节对象的免疫应答的量向患有受益于免疫系统调节的病症的对象施用包含如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物的组合物。

本公开的另一个方面涉及用于治疗对象的神经退行性病症的方法。该方法包括向患有神经退行性病症的对象施用本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗神经退行性病症的药物活性部分。

本公开的另一个方面涉及用于治疗对象的炎性病症的方法。该方法包括向患有炎性病症的对象施用如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适于治疗炎性病症的药物活性部分。

本公开的另一个方面涉及用于治疗对象的骨病的方法。该方法包括向患有骨病的对象施用如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适于治疗骨病的药物活性部分。

本公开的另一个方面涉及用于治疗对象的传染性疾病或病症的方法。该方法涉及向患有传染性疾病的对象施用如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗传染性疾病的药物活性部分。

附图说明

图1A至图1D示出了MC-小分子(单体)接合和效率的表征。图1A示出了单体-小分子缀合物的示意性设计。图1B是凝胶位移实验，示出了与一甲基澳瑞他汀E(MMAE)接合后的凝胶位移。MMAE的接合被确定为>95％。图1C示出了在800nm成像的SDS-PAGE凝胶，以确认Cy5.5与单体的接合。图1D示出Ellman测试以观察MMAE接合到单体的百分比。Ellman试剂测量在溶液中游离的可用硫醇。

图2A至图2C示出本文所披露的非结合性蛋白质-药物缀合物的细胞摄取明确地是通过大型胞饮作用(MP)进行的。图2A和图2B示出了人类胰腺癌(PDAC)MIA PaCa和HeLa或HeLa KRas^V12细胞中的荧光标记的单体和MP标记物的摄取。荧光标记的单体(绿色)和MP标记物(右旋糖酐，红色)在DAPI(蓝色)中的共定位。方框区域被放大、插入。图2C示出致癌Ras(HeLa KRas^V12和MIAPaCa-2)细胞中的单体(FN-Cy5.5)的流式细胞术分析。

图3A至图3B示出本文所披露的非结合性蛋白质-药物缀合物的细胞摄取明确地是通过大型胞饮作用(MP)进行的。图3A示出了小鼠PDAC KPC 1203细胞中的荧光标记的单体和MP标记物的摄取。荧光标记的单体(红色)和MP标记物(右旋糖酐，绿色)在DAPI(蓝色)中的共定位。方框区域被放大、插入。图3B示出了荧光标记的单体和MP标记物在WT Ras和突变体Ras人类结肠直肠癌细胞中的摄取。荧光标记的单体(绿色)和MP标记物(右旋糖酐，红色)与DAPI(蓝色)的共定位。

图4A至图4C示出单体-药物缀合物在致癌KRas细胞系中的增强的毒性。图4A跟踪用浓度逐渐升高的FN-MMAE处理的HeLa(-KRas)和HeLa KRas^V12(+KRas)细胞中的通过红外染料Syto60监控的细胞活力。图4B示出来自用增加浓度的FN-MMAE和MMAE处理的不同组织的野生型Ras细胞系(虚线以上，空心圆)和致癌Ras细胞系(虚线以下，实心圆)。将FN-MMAEIC₅₀值归一化为MMAE值。图4C示出用浓度逐渐升高的FN-SN38处理野生型Ras细胞系(BxPC3)和致癌Ras细胞系(MiaPaca-2)。

图5A至图5B示出了FN-MMAE(单体)在致癌KRas细胞系中增强的体内毒性。在图5A中，在第0天、第7天、和第14天(黄色箭头)，用PBS(阴性对照)、单独的0.2mg/kg的MMAE、或0.2mg/kg的FN-MMAE非结合性蛋白缀合物来处理经确定的(100mm³-150mm³)皮下的MiaPaCa和BxPC3肿瘤。与单独经MMAE处理相比，经FN-MMAE处理的动物中的肿瘤生长(按体积评估)更慢。每个治疗组n＝4。误差棒代表肿瘤体积的SEM。图5B示出了MIA-PaCa荷瘤小鼠的离体器官的H&E，其示出FN-MMAE没有明显毒性，而单独的MMAE可见视觉上的肝损伤。

图6A至图6B示出了MMAE的离体分析和作用模式。图6A示出经带有多种细胞凋亡标记物(即，CC3、HMGB1和裂解的Parp1)的PBS、MMAE、和FN-MMAE处理的MIA PaCa荷瘤小鼠的肾脏的离体分析。这些图像中的标记物表达指示，与PBS相比，FN-MMAE几乎没有差异或没有差异，而游离MMAE的非特异性毒性显著增加。图6B中的图像示出MMAE的作用方式是通过微管蛋白去稳定化来进行的。经MMAE处理的小鼠肾脏中的微管蛋白染色被大幅度减少，而FN-MMAE未示出明显效果。

图7A至图7E示出肿瘤特异性生物分布。图7A示出在24hr的时间过程中，使用IVIS在用PBS、Cy5.5-COOH、或FN-Cy5.5处理的、MIA PaCa荷瘤小鼠中检测到生物分布。图7B示出在24hr的时间点通过IVIS成像在离体分析活检组织。用FN-Cy5.5处理MIA PaCa2和BxPC3异种移植物，使用体外成像来观察FN-Cy5.5的KRas选择性摄取(图7C)。图7D示出在6hr后，将小鼠处死、分离重要器官并通过IVIS进行体外成像，以分析单体的肿瘤摄取和积累、全身清除率、以及具有潜在毒性的组织。图7E示出成像的肿瘤切片以描述Cy5.5、和带有癌细胞制造者(CK8)的FN-Cy5.5肿瘤摄取、滞留和共定位。

图8A至图8C示出了FN-Cy5.5在原位移植KPC荷瘤小鼠中的生物分布。用PBS或5nmol的FN-Cy5.5(参考Cy5.5)、小鼠白蛋白(MSA)-Cy5.5、和小鼠IgG-Cy5.5处理KPC荷瘤小鼠。在1hr时(图8A)和24hr时(图8B)处死小鼠以观察离体生物分布和血液荧光(图8C)。图表代表比较MSA与FN(红色)、以及IgG与FN(蓝色)的归一化值。在1hr时，FN在肾脏和肝脏中急剧增加2倍，表现出快速的排泄，同时具有相似或增加的肿瘤滞留。在24hr时，FN显示出在肾脏和肝脏中减少，同时具有相似的肿瘤值(MSA和IgG分别为90％和100％)。在1hr时，FN表现出血液荧光减少3倍，再次强调相较于其他蛋白缀合物的快速排泄。

图9A至图9C示出FN-Cy5.5的淋巴结分析。图9A提供了Cy5.5-COOH、FN-Cy5.5、以及具有Cy5.5接合到其表面的聚乙二醇化纳米颗粒的示意图，将这些纳米施用给原位移植的KPC荷瘤小鼠。在图9B中，离体IVIS成像示出了FN-Cy5.5对PDAC淋巴结(PLN)的偏好是支气管淋巴结(BLN)的2倍。图9C是示出树突状细胞(DC)，即，经典树突状细胞(顶部图)和浆细胞样树突状细胞(底部图)中的Cy5.5摄取的图。如图所示，观察到FN的细胞摄取量增加了2倍。

图10A至图10D示出了PDAC的基因修饰小鼠模型中的FN-Cy5.5摄取。用FN-Cy5.5处理自主LSL-KPC^G12V；LSLp53^R172H；p48Cre(KPC，4mo)和野生型(WT，4mo)小鼠。图10A中的体外图像描绘了在1hr时和在24hr时各种器官中的生物分布。归一化的辐射效率展示了在自主KPC模型中对肿瘤摄取的偏好(图10B)。在图10C至图10D中，离体图像(6hr)描绘了肿瘤摄取、滞留和与癌细胞标记物(CK8)的共定位。

图11示出在用FN-Cy5.5和白蛋白-FITC处理2小时的自体LSL-KPC^G12V；LSLp53^R172H；p48Cre(KPC，4mo)小鼠中的离体肿瘤分析。将小鼠处死并对显示了白蛋白-FITC(绿色)、FN-Cy5.5(紫色)、肿瘤细胞标记物CK8(橙色)、和dapi(蓝色)的肿瘤进行离体分析。在视觉上，观察到FN-Cy5.5可能比白蛋白-FITC更好地将CK8阳性PDAC肿瘤导管染色，但是该观察结果确实显示出一些基于肿瘤位置的差异。

图12A至图12C示出使用FN-DOTA-Gd³⁺的MRI检测。图12A是示出单独的(左)或与接头分子的C-末端处的单独半胱氨酸接合的(右)螯合剂(DOTA)的示意图。在图12B中，将DOTA-Gd³⁺和FN-DOTA-Gd³⁺以2μmol/kg注射到KPC原位荷瘤小鼠中。在肿瘤中观察到FN-DOTA-Gd³⁺的增强的信号和更长的滞留时间。图12C示出了经由尾静脉注射到4个月大的自发KPC小鼠中的FN-DOTA-Gd³⁺。示出了FN-DOTA-Gd³⁺注射前(左)和注射后(右)在横跨腹侧到背侧方向(分别为顶部和底部)的2个解剖平面的MRI成像。红色箭头指向肾脏中检测到的信号；红色三角指向可能的胰腺肿瘤。顶部的轮廓示出Ki、肾脏；Pa、胰腺；Sp、脾；St、胃。

图13A至图13B示出KPC原位肿瘤的MRI成像。使用DOTA-Gd³⁺(图13A)和FN-DOTA-Gd³ ⁺(图13B)的KPC原位移植肿瘤的MRI成像。

图14A至图14C示出了人多发性骨髓瘤癌细胞系中的荧光标记的单体和MP标记物的摄取。图14A和图14B是示出KMS11 WT Ras、L363突变体NRAS、和RPMI 8226突变KRas细胞(DAPI，蓝色)中的荧光标记的单体(红色)和MP标记物(葡聚糖，绿色)的共定位的图像。FN-Cy5.5在突变Ras细胞系中显示出增加的摄取，这随着添加大型胞饮作用抑制剂EIPA和KH7而被消除。图14C示出了在37℃和4℃的突变体KRas RPMI 8226细胞中的FN-Cy5.5的摄取。

图15A-15C示出了在WT Ras KMS11多发性骨髓瘤细胞中产生的突变KRas诱导系统。图15A示出了蛋白质印迹，图15B示出用多西环素处理来确认突变KRas表达的膜皱褶测定。图15C示出添加多西环素后，KMS11细胞展示出对FN-Cy5.5的摄取，这在未添加多西环素的情况下未观察到。这再次突出了突变Ras细胞中的FN-Cy5.5的选择性摄取。

图16示出致癌Ras各种多发性骨髓瘤细胞系中的Cy5.5和FN-Cy5.5流式细胞术分析。

图17示出了基于多发性骨髓瘤中Ras状态的分化肿瘤积聚。FN-Cy5.5在携带突变NRas L363或WT Ras KMS1l肿瘤的小鼠中的生物分布。与WT肿瘤相比，突变Ras肿瘤展示出FN-Cy5.5摄取的显著增加(底部图)。

具体实施方式

本公开的第一方面涉及一种药物组合物，其包含非结合性蛋白质-药物缀合物和药学上可接受的载体。该药物组合物的非结合性蛋白质-药物缀合物包含第一部分、氨基酸接头、和第二部分。该非结合性蛋白质-药物缀合物的第一部分包含非结合III型纤连蛋白(FN3)结构域，该非结合性蛋白质-药物缀合物的第二部分选自药物活性部分或诊断部分，其经由氨基酸接头与该第一部分偶联。

FN3结构域是进化保守的蛋白质结构域，其长度约为100个氨基酸并具有β三明治结构。人类FN3的β三明治结构包含七个β链，称为链A、链B、链C、链D、链E、链F、链G，具有六个连接环，称为环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，其表现出与免疫球蛋白结合域的结构同源性。这六个环中的三个环，即环DE、环BC、和环FG，在拓扑上对应于抗体的互补性决定区，即CDR1、CDR2、和CDR3。其余三个环以类似于抗体CDR3的方式暴露在表面。虽然许多天然存在的FN3结构域和经修饰的FN3结构域含有能够结合特定的靶蛋白、或蛋白质的靶结构域(即，单体)的环和链区，但是本公开的蛋白质-药物缀合物的FN3结构域是非结合性FN3结构域。如本文所用，“非结合性FN3结构域”涵盖不与任何其他蛋白或蛋白结构域相结合或相互作用的天然存在和经修饰的FN3结构域，即，该结构域缺少RGD结合结构域和任何其他蛋白质相互作用区。

本公开的蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域可以是衍生自含有这些结构域的多种动物、酵母、植物、和细菌胞外蛋白中的任何一个的FN3结构域。在一个实施例中，FN3结构域是哺乳动物FN3结构域或其非结合变体。示例性FN3结构域包括，例如但不限于，人类生腱蛋白C中存在的FN3结构域中的任何一个FN3结构域、或人类纤连蛋白(FN)中存在的FN3结构域。在一些实施例中，FN3结构域是人类纤连蛋白(UniProtKB登录号P02751)的非结合性FN3结构域，其选自如表1中示出的SEQ ID NO:6至SEQ ID NO：21的氨基酸序列或者其非结合变体或衍生物。在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的FN3结构域是人类纤连蛋白的第10个纤连蛋白III型结构域的变体(即，SEQ ID NO:1的变体)。在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的FN3结构域是人类生腱蛋白(UniProtKB登录号P24821)的非结合性FN3结构域，选自SEQ ID No:22至SEQ ID NO：36的氨基酸序列(表1)或者其变体或衍生物。在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的FN3结构域是非天然合成的非结合性FN3结构域，例如Jacobs等人的美国专利公布号2010/0216708中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。通过结构域编号和蛋白质名称来引用各个FN3结构域，例如，纤连蛋白的第10个FN3结构域(10FN3)。

表1.来自人类纤连蛋白和生腱蛋白的示例性FN3结构域

*人类纤连蛋白的结构域命名法是如在Potts和Campbell的“FibronectinStructure and Assembly”，Curr.Opin.Cell Biol.6:648-655(1994)中提出的常规命名法。人类生腱蛋白的结构域命名法是UniProt(蛋白质分析数据库)登录号P24821中提供的命名法。

在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的FN3结构域是已知具有很少或没有功能性结合活性的FN3结构域。合适的非结合性FN3结构域包括人类纤连蛋白的第1个、第2个、第3个、第4个、第5个、第6个、第7个、第11个、第12个、和第13个III型纤连蛋白结构域(SEQ ID NOs：6至SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、和SEQ ID NO：19)以及人类纤连蛋白的EDB和EDA结构域(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17)。合适的FN3结构域还包括具有与SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：19的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相似的氨基酸序列的非结合性结构域。

在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的合适的FN3结构域包含人类生腱蛋白的第1个、第2个、第4个、第5个、第6个、第7个、第8个、第9个、第10个、第11个、第12个、第13个、第14个、和第15个III型纤连蛋白结构域(SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：36)中的任何一个结构域。非结合性蛋白质-药物缀合物的合适的FN3结构域还涵盖具有与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、以及SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相似的氨基酸序列的非结合性结构域。

在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的FN3结构域是人类纤连蛋白的第8个、第9个、第10个、第14个、和第15个III型纤连蛋白结构域的非结合变体或人类生腱蛋白的第3个III型纤连蛋白结构域的非结合变体。这些非结合变体在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、和SEQ ID NO：24的氨基酸序列中含有至少一个氨基酸残基修饰。因此，合适的FN3结构域包括具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、或SEQ ID NO：24的氨基酸序列在序列方面80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相似的氨基酸序列的FN3结构域。合适的FN3结构域包括具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、或SEQ IDNO：24中的任何一个的氨基酸序列在序列方面相似程度<100％的氨基酸序列的FN3结构域。

在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的FN3结构域源自纤连蛋白的第10个FN结构域(¹⁰FN3)。在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的FN3结构域源自人类¹⁰FN3结构域。人类¹⁰FN3结构域具有如下所示的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。BC(残基24至残基30)环、CD(残基40至残基45)环、DE(残基51至残基55)环、和FG(残基75至残基86)环的位置在SEQ ID NO：1的野生型序列中标有下划线。根据本公开内容，非结合性蛋白质-药物缀合物的非结合FN3结构域是SEQ ID NO：1的非结合变体，即，它包含一个或更多个氨基酸添加、取代、或SEQ ID NO：1的氨基酸序列内的缺失。

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDA₂₄PAVTVR₃₀ YYR₃₃ITYGETG₄₀GNSPV₄₅ QEFTVP₅₁GSKS₅₅

TATISGLKPGVDYTITVYAV₇₅TGRGDSPASSK₈₆ PISINYRT(SEQ ID NO:1)

根据本公开，本公开的蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域包含变体SEQ IDNO：1，其在FN3结构域的FG环的RGD氨基酸序列(即，SEQ ID NO：1的氨基酸残基75-86)内含有至少一个修饰。合适的修饰包括氨基酸残基置换、插入、和/或缺失。在一些实施例中，对FN3结构域的FG环的RGD氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基、至少两个氨基酸残基、或至少三个氨基酸残基进行修饰以消除RGD介导的结合。在一些实施例中，本公开的非结合FN3结构域包含SEQ ID NO：1的变体，其中在对应于SEQ ID NO：1(R78)的第78位的位置的精氨酸(R)被取代或缺失。合适的氨基酸取代物包括但不限于，用选自丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、和谷氨酰胺(Q)的残基取代。在一些实施例中，氨基酸取代是在对应于SEQ ID NO：1的第78位(R78S)处的精氨酸的氨基酸残基处的精氨酸到丝氨酸的取代。在一些实施例中，本公开的非结合性FN3结构域包含SEQ ID NO：1的变体，其中在对应于SEQ ID NO：1的第79位(G79)的位置处的甘氨酸(G)被取代或缺失。合适的氨基酸取代包括但不限于，用选自S、A、E、D、K、N、或Q的残基取代。在一些实施例中，氨基酸取代是在对应于SEQ ID NO：1的第79位(G79S)的位置处的甘氨酸的氨基酸残基处的甘氨酸到丝氨酸的取代。在一些实施例中，本公开的非结合性FN3结构域包含SEQ ID NO：1的变体，其中对应于SEQ ID NO：1的第80位(D80)的位置处的天冬氨酸(D)被取代或缺失。合适的氨基酸取代基包括但不限于，选自S、A、E、G、K、N、或Q的残基取代基。在一些实施例中，氨基酸置换是在对应于SEQ ID NO：1的第80位(D80)的位置处的天冬氨酸的氨基酸残基处的天冬氨酸到丝氨酸的取代。

在一些实施例中，本公开的蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域包含在FG环中的一个或更多个附加的氨基酸修饰，即，对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基75至86。合适的氨基酸取代基包括但不限于，选自S、A、E、G、K、N、或Q的残基取代基。在一些实施例中，蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域包含SEQ ID NO：1的变体，其中FG环包含SSSSSSSSS(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列。

在一些实施例中，本公开的蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域还包含在BC环的氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸取代，即，SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-30。合适的氨基酸取代基包括但不限于，选自S、A、E、G、K、N、或Q的残基取代基。在一些实施例中，蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域包含SEQ ID NO：1的变体，其中BC环包含SSSSSVS(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列。

蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域包含如下所示的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

VSX₃VPT X₇LEVVAATPTSLLISWDX₂₄X₂₅ X₂₆ X₂₇ X₂₈V X₃₀YYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYA X₇₅ X₇₆ X₇₇ X₇₈ X₇₉ X₈₀ X₈₁ X₈₂ X₈₃SSKPISINYRT(SEQ ID NO：2)

其中，

X₃选自D、S、A、E、G、K、N、和Q

X₇选自D、S、A、E、G、K、N、和Q

X₂₄选自S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₂₅选自P、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₂₆选自A、S、E、G、K、N、D、和Q

X₂₇选自V、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₂₈选自T、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₃₀选自R、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₇₅选自V、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₇₆选自T、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₇₇选自G、S、A、E、K、N、D、和Q

X₇₈选自R、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₇₉选自G、S、A、E、K、N、D、和Q

X₈₀选自D、S、A、E、G、K、N、和Q

X₈₁选自S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₈₂选自P、S、A、E、G、K、N、D、和Q

X₈₃选自A、S、E、G、K、N、D、和Q

条件是，该非结合性FN3结构域不包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施例中，蛋白质-药物缀合物的非结合性FN3结构域包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDASSSSVSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYASSSSSSSSSSSKPISINYRT(SEQ ID NO:3).

在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的第一部分包含串联连接在一起的两个或更多个非结合性FN3结构域。在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的第一部分包含串联连接在一起的两个、三个、四个、五个、六个、或更多个如本文所述的非结合性FN3结构域。

在一些实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的第一部分还包含一个或更多个标签序列，例如，用于纯化/生产目的的多组氨酸(His_6-)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST-)标签、生物素化标签、或麦芽糖结合蛋白(MBP-)标签，和/或一个或更多个蛋白酶切割位点。可以将标签和切割位点并入非结合FN3结构域的氨基或羧基末端。

本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物还包含将该非结合性蛋白质-药物缀合物的第一部分偶联到该缀合物的第二部分的氨基酸接头。在一些实施例中，氨基酸接头是可裂解的接头。在一些实施例中，氨基酸接头是不可裂解的接头。合适的接头包括由一种或更多种氨基酸的重复模块组成的肽，例如甘氨酸和丝氨酸、或丙氨酸和脯氨酸。示例性接头肽包括，例如，(Gly-Gly)_n、(Gly-Ser)_n、(Gly₃-Ser)_n、(Ala-Pro)_n，其中n是从1至25的整数。可以适当地调整接头的长度，只要不影响非结合性蛋白质-药物缀合物的功能即可。标准的15氨基酸(Gly₄-Ser)₃接头肽已经被充分表征，并已显示出采用非结构化、灵活的构象。此外，该接头肽不会干扰其连接的结构域的组装和活性(Freund等人，“Characterization ofthe Linker Peptide of the Single-Chain Fv Fragment of an Antibody by NMRSpectroscopy”，FEBS 320:97(1993)，其公开内容通过引用整体并入本文)。

众所周知的化学偶联方法可以用于使用肽或其他接头将第一部分和第二部分附接，以产生非结合性蛋白质-药物缀合物。例如，第一部分和第二部分的共价缀合可以经由使用活化酯或异硫氰酸酯的赖氨酸侧链，或经由使用马来酰亚胺、卤代乙酰基衍生物、或活化二硫化物的半胱氨酸侧链来实现。第一部分和第二部分的位点特异性缀合也可以通过引入非天然氨基酸、自标记标签(例如，SNAP或DHFR)、或被另一种酶(例如分选酶A、硫辛酸、和甲酰甘氨酸生成酶)特异性识别和修饰的标签来实现。在一些实施例中，第一部分和第二部分的位点特异性缀合是通过在非结合FN3部分的C-末端或特定位点引入半胱氨酸残基来实现的，如在Goldberg等人，“Engineering a Targeted Delivery Platform UsingCentyrins”，Protein Engineering,Design&Selection 29(12):563-572(2016)和Anderson等人的美国专利申请公开号20200325210所描述的，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，如本文所描述的非结合性蛋白质-药物缀合物的第二部分是药物活性部分。合适的药物活性部分包括小分子、核酸分子、抗体、蛋白质或其多肽片段、以及蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。

在一些实施例中，药物活性部分是癌症治疗剂。合适的癌症治疗剂包括但不限于，抗代谢物、生物碱、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗肿瘤抗生素、DNA结合药物、毒素、抗增殖药物、DNA拮抗剂、放射性核素、热消融剂、蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)、核酸抑制剂、和免疫调节剂。

在一些实施例中，癌症治疗剂是生物碱。合适的生物碱包括但不限于，多卡霉素、多西他赛、依托泊苷、伊立替康、紫杉醇、替尼泊苷、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春地辛、及其类似物和衍生物。

在一些实施例中，癌症治疗剂是烷化剂。合适的烷化剂包括但不限于，白消安、异丙硫丹、匹泊消、苯佐替派、苯并多巴、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲密胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氮芥、美法仑、新恩比兴、培磷酰胺、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、曼诺莫司汀、二溴甘露醇、米托洛尔、哌泊溴烷、替莫唑胺、及其类似物和衍生物。

在一些实施例中，癌症治疗剂是抗肿瘤抗生素。合适的抗肿瘤抗生素包括但不限于，阿克拉霉素、放线菌素、蒽霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、亲癌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表拉比星、伊达比星、美诺加利、丝裂霉素、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培普霉素、吡柔比星、普利霉素、泊福霉素、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮卓、链黑素、链佐星、结核菌素、净司他丁、佐柔比星、及其类似物和衍生物。

在一些实施例中，癌症治疗剂是抗代谢剂。合适的抗代谢剂包括但不限于，SN-38、地诺蝶呤、依达曲沙、巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、吡利曲昔、蝶呤、喷司他丁(2'-DCF)、托优得、曲美曲沙、克拉啶、氟达拉滨、硫胺普林、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、多西氟尿苷、依替氟、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、替加氟、羟基脲、氨基甲酸酯、及其类似物和衍生物。

在一些实施例中，癌症治疗剂是抗增殖药物。合适的抗增殖药物包括但不限于，醋葡醛内酯、安吖啶、比生群、喜树碱、地磷酰胺、秋水仙碱、地吖醌、二氟替康、依氟鸟氨酸、依利醋铵、依托格鲁、依托苷、芬维A胺、硝酸镓、羟基脲、片螺素D、氯尼达明、米替福新、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、鬼臼酸、2-乙基酰肼、甲基苄肼、丙亚胺、索布佐生、锗螺胺、替尼泊苷、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2,2-三氟乙基胺、以及其类似物和衍生物。

在一些实施例中，癌症治疗剂是抗有丝分裂剂。合适的抗有丝分裂剂包括但不限于，奥瑞他汀、美登木素、多拉司他汀、微管溶素、紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱、及其类似物和衍生物。在一些实施例中，抗有丝分裂剂是澳瑞他汀。在一些实施例中，澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀E(MMAE)。

在一些实施例中，癌症治疗剂是PROTAC。合适的PROTAC包括但不限于BET降解剂，例如由Pillow等人，“Antibody Conjugation of a Chimeric BET Degrader Enables Invivo Activity”，ChemMedChem 15(1):17-25(2020)所公开的，其通过引用整体并入。合适的PROTAC还包括Ras降解剂。

在一些实施例中，如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是免疫调节剂。在一些实施例中，免疫调节剂是修饰一种或更多种类型的免疫细胞的表型的试剂，例如，1型巨噬细胞、2型巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、B细胞、和T细胞。例如，在一些实施例中，免疫调节剂是修饰免疫细胞的表型以产生免疫细胞激活的试剂。在一些实施例中，免疫调节剂是修饰免疫细胞的表型以产生免疫细胞抑制的试剂。

在一些实施例中，免疫调节剂是1型巨噬细胞刺激剂。合适的1型巨噬细胞刺激剂包括但不限于，紫杉醇、集落刺激因子-1(CSF-1)受体拮抗剂、IL-10受体拮抗剂、Toll样受体(TLR)-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、和TLR-9激动剂。

在一些实施例中，1型巨噬细胞刺激剂是CSF-1受体拮抗剂。合适的CSF-1受体拮抗剂包括但不限于ABT-869(Guo等人，“Inhibition of Phosphorylation of the Colony-Stimulating Factor-1 Receptor(c-Fms)Tyrosine Kinase in Transfected Cells byABT-869 and Other Tyrosine Kinase Inhibitors”，Mol.Cancer.Ther.5(4):1007-1012(2006)，其全部内容通过引用并入本文)、伊马替尼(Guo等人，“Inhibition ofPhosphorylation of the Colony-Stimulating Factor-1 Receptor(c-Fms)TyrosineKinase in Transfected Cells by ABT-869 and Other Tyrosine Kinase Inhibitors”，Mol.Cancer.Ther.5(4):1007-1012(2006)，其全文通过引用并入本文)、PLX3397(Mok等人，“Inhibition of CSF1 Receptor Improves the Anti-tumor Efficacy of Aptive CellTransfer Immunotherapy”，Cancer Res.74(1):153-161(2014)，其全部内容通过引用并入本文)、PLX5622(Dagher等人，“Colony-stimulating Factor 1Receptor InhibitionPrevents Microglial Plaque Association and Improves Cognition in 3xTg-ADMice”J.Neuroinflamm.12:139(2015)，其全部内容通过引用并入本文)、DCC-3014(Deciphera Pharmaceuticals)、BLZ945(Krauser等人，“Phenotypic and MetabolicInvestigation of a CSF-1R Kinase Receptor Inhibitor(BLZ945)and itsPharmacologically Active Metabolite”，Xenobiotica 45(2):107-123(2015)，其全部内容通过引用并入本文)、以及GW2580(Olmos-Alonso等人，“Pharmacological Targeting ofCSF1R Inhibits Microglial Proliferation and Prevents the Progression ofAlzheimer’s-like Pathology”，Brain 139:891-907(2016)，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，1型巨噬细胞刺激剂是IL-10受体拮抗剂。合适的IL-10受体拮抗剂包括但不限于肽拮抗剂，如在Naiyer等人，“Identification and Characterization ofa Human IL-10 Receptor Antagonist”，Hum.Immunol.74(1):28-31(2013)中所述的，其通过引用整体并入本文，以及IL-10受体拮抗抗体，如Von Herrath等人的美国专利7,553,932号中所述的，其通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，1型巨噬细胞刺激剂是TLR激动剂，即TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、或TLR9激动剂。适用于本文所述方法的TLR-2激动剂包括Pam3CSK4、合成的三酰化脂蛋白、和脂磷壁酸(LTA)(Brandt等人，“TLR2 Ligands Induce NF-κB Activation fromEndosomal Compartments of Human Monocytes”，PLoS One 8(12):e80743，其全部内容通过引用并入本文)。合适的TLR-3激动剂包括但不限于，聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚肌胞(polyI:C))(Smole等人，“Delivery System for the Enhanced Efficiency ofImmunostimulatory Nucleic Acids”，Innate Immun.19(1):53-65(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。合适的TLR-4激动剂包括但不限于MPL(Engel等人，“ThePharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the ImmuneSystem”，Expert Rev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011)，其全部内容通过引用并入本文)、吡喃葡糖苷脂质-A(Matzner等人，“Perioperative treatment with the newsynthetic TLR-4agonist GLA-SEreduces cancer metastasis without adverseeffects”，Int.J.Cancer 138(7):1754-64(2016)，其全部内容通过引用并入本文)、和(Ghochikyan等人，“Targeting TLR-4 with a novel pharmaceuticalgrade plant derived agonist,/>as a therapeutic strategy formetastatic breast cancer”，J.Trans.Med.12:322(2014)，其全部内容通过引用并入本文)。

合适的TLR-7激动剂包括但不限于，富含尿苷/胍的单链RNA(Engel等人，“ThePharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the ImmuneSystem”，Expert Rev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011)，其全部内容通过引用并入本文)、852A(Dudek等人，“First in Human Phase I Trial of 852A,a Novel SystemicToll-like Receptor 7Agonist,to Activate Innate Immune Responses in PatientsWith Advanced Cancer”，Clin.Cancer Res.13(23):7119-7125(2007)，其全部内容通过引用并入本文)、雷西莫特(Chang等人，“Topical resiquimod Promotes Priming of CTL toParenteral Antigens”，Vaccine 27(42):5791-5799(2009)，其全部内容通过引用并入本文)、咪唑并喹啉(Itoh等人，“The Clathrin-mediated Endocytic Pathway Participatesin dsRNA-induced IFN-beta Production”，J.Immunol.181:5522-9(2008)，其全部内容通过引用并入本文)、ANA975(Fletcher等人，“Masked oral Prodrugs of Toll-likeReceptor 7Agonists:a New Approach for the Treatment of Infectious Disease”，Curr.Opin.Investig.Drugs 7(8):702-708(2006)，其全部内容通过引用并入本文)、和咪喹莫特(Engel等人，“The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and theImpact on the Immune System”，Expert Rev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011)，其全部内容通过引用并入本文)。

合适的TLR-8激动剂包括但不限于，雷西莫特(Chang等人，“Topical resiquimodPromotes Priming of CTL to Parenteral Antigens”，Vaccine 27(42):5791-5799(2009)，其全部内容通过引用并入本文)、和咪唑并喹啉(Itoh等人，“The Clathrin-mediated Endocytic Pathway Participates in dsRNA-induced IFN-betaProduction”，J.Immunol.181:5522-9(2008)，其全部内容通过引用并入本文)。

合适的TLR-9激动剂包括但不限于CpG-ODN(Yao等人，“Late Endosome/Lysosome-localized Rab7b Suppresses TLR-9-initiated Proinflammatory Cytokine and TypeI IFN Production in Macrophages”，J.Immunol.183：1751-8(2009)，其全部内容通过引用并入本文)。适合使用的特定CpG-ODN在Engel等人的“The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System”，ExpertRev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011)中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。

本领域已知的将2型巨噬细胞重编程为1型巨噬细胞的其他试剂(即，1型巨噬细胞刺激剂)包括，二氧化锰纳米颗粒(参考例如，Song等人，“Bioconjugated ManganeseDioxide Nanoparticles Enhance Chemotherapy Response by Priming Tumor-Associated Macrophages toward M1-like Phenotype and Attenuating TumorHypoxia”，ACS Nano.10:633-647(2016)，其全部内容通过引用并入本文)、超顺磁纳米氧化铁纳米颗粒(Zanganeh等人，“Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth byinducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues”，Nat.Nanotechnol.11:986-994(2016)，其全部内容通过引用并入本文)、针对IκBα封装了siRNA的甘露糖化纳米颗粒(Ortega等人，“Manipulating the NF-kappaB pathway inmacrophages using mannosylated,siRNA-delivering nanoparticles can induceimmunostimulatory and tumor cytotoxic functions”，Int.J.Nanomed.2163-2177(2016)，其全部内容通过引用并入本文)。根据本公开，这些试剂可以与本文所述的非结合FN3结构域相偶联以形成非结合蛋白质-药物缀合物。

在一些实施例中，免疫调节剂是2型巨噬细胞刺激剂。合适的2型巨噬细胞刺激剂包括但不限于，IL-33、IL-4受体激动剂、糖皮质激素、IL-10受体激动剂、和IL-1受体激动剂。

合适的IL-4受体激动剂包括但不限于突变IL-4蛋白。示例性突变IL-4蛋白包括但不限于Sebald的美国专利5,723,118号中描述的那些，该专利的全部内容通过引用并入本文。

糖皮质激素是一类皮质类固醇，其在本领域中是众所周知的并且适用于诱导2型巨噬细胞表型。用于并入本公开的非结合蛋白质-药物缀合物中的示例性糖皮质激素包括但不限于，皮质醇、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、去炎松、倍氯米松、氟氢可的松、脱氧皮质酮、和醛固酮。

根据本文所述的缀合物和方法，IL-10受体激动剂也能够诱导2型巨噬细胞表型。合适的IL-10受体激动剂包括但不限于，如Sommer等人的美国专利7,749,490号中所述的突变IL-10蛋白，该专利的全部内容通过引用并入本文。

IL-1受体激动剂也能够诱导2型巨噬细胞表型，因此可以作为本文所述的非结合蛋白质缀合物的药物组分并入。合适的IL-1受体激动剂包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、和IL-36γ(Palomo等人，“The Interleukin(IL)-1CytokineFamily-Balance Between Agonists and Antagonists in Inflammatory Diseases”，Cytokine 76(1):25-37(2015)，其全部内容通过引用并入本文)。

在一些实施例中，免疫调节剂是2型巨噬细胞耗竭剂。合适的巨噬细胞耗竭剂包括但不限于，氯膦酸盐、唑来膦酸、阿仑膦酸盐、和曲贝替定。

在一些实施例中，免疫调节剂是T细胞刺激剂。合适的T细胞刺激剂包括但不限于干扰素基因刺激因子(STING)激动剂。STING激动剂包括但不限于，环状二核苷酸(CDN)，例如环状二聚鸟苷一磷酸(c-di-GMP)、环状二聚腺苷一磷酸(c-di-AMP)、环状GMP-AMP(cGAMP)、和二硫代-(R_P,R_P)-[cyclic[A(2',5')pA(3',5')p(ADU-S100，Aduro Biotech)；和小分子，例如5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、以及连接的氨基苯并咪唑。其他正在开发的也是根据本公开的合适的免疫调节剂的STING激动剂包括BMS-986301、E7766、GSK3745417、MK-1454、MK-2118、以及SB11285。

在一些实施例中，免疫调节剂是树突状细胞刺激剂。包含在本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物中的合适的树突状细胞刺激剂包括但不限于，CpG寡核苷酸、咪喹莫特、拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱及其衍生物)、微管解聚药物(例如，秋水仙碱、鬼臼毒素、及其衍生物)。

在一些实施例中，免疫调节剂是中性粒细胞刺激剂。合适的中性粒细胞刺激剂包括但不限于，重组粒细胞集落刺激因子蛋白(非格司亭)或聚乙二醇化重组粒细胞集落刺激因子蛋白。

在一些实施例中，本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是寡核苷酸。合适的寡核苷酸包括但不限于，siRNA、适体、miRNA、免疫刺激性寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、和向导RNA。

在一些实施例中，本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是伤口愈合剂。根据本公开的该方面的合适的伤口愈合剂包括但不限于，刺激免疫细胞的促炎表型的试剂。在一些实施例中，用于治疗伤口愈合的药物活性部分是如上所述的1型巨噬细胞刺激剂。

在一些实施例中，本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗神经退行性疾病的治疗部分。示例性的神经退行性疾病包括但不限于，肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、及其类似物和衍生物。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗对象的ALS的ALS治疗剂。合适的ALS治疗剂包括但不限于，谷氨酸盐阻滞剂(例如，利鲁唑、力如太和其他衍生物)、恩达拉奉、瑞替卡瓦、肌肉松弛剂(例如，巴氯芬、替扎尼定、和其他衍生物)、及其类似物和衍生物。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是治疗对象的帕金森氏病的帕金森病治疗剂。治疗帕金森氏病的合适治疗剂包括但不限于，多巴胺促进剂(例如，卡比多巴、左旋多巴、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、卡麦角林、托卡朋、溴隐亭、金刚烷胺、和其他衍生物)、多巴胺激动剂(例如，普拉克索、米拉派克斯、罗匹尼罗、罗替高汀、纽普罗、阿扑吗啡、阿波金)、认知增强药物(利斯的明、和其他衍生物)、抗震颤药物(例如，苯佐托品、和其他衍生物)、单胺氧代醄(MAO B)抑制剂(司来吉兰(selegiline)、司来吉兰(Zelapar)、雷沙吉兰(rasagiline)、雷沙吉兰(Azilect)、沙芬酰胺(safinamide)、沙芬酰胺(Xadago)、和其他衍生物)、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(例如，恩他卡朋(entacapone)、恩他卡朋(Comtan)、阿片哌酮(opicapone)、奥匹卡朋、托卡朋、答是美)、抗胆碱能药(例如，苯并托品、苯甲托品、苯海索、和其他衍生物)、及其类似物和组合。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是治疗对象的亨廷顿病的亨廷顿病治疗剂。治疗亨廷顿病症状的合适疗法包括但不限于，运动控制药物(例如，丁苯那嗪(tetrabenazine)、丁苯那嗪(Xenazine)、安泰坦(deutetrabenazine)、安泰坦(Austedo)、和其他衍生物)、抗精神病药(例如，氟哌啶醇、氟哌啶醇、氟奋乃静、利培酮、利培酮、奥氮平、再普乐、喹硫平、思瑞康、和其他衍生物)、舞蹈症抑制剂(例如，金刚烷胺(amantadine)、金刚烷胺(Gocovri ER)、金刚烷胺(Osmolex ER)、左乙拉西坦(levetiracetam)、左乙拉西坦(Keppra)、左乙拉西坦(Elepsia XR)、左乙拉西坦(Spritam)、氯硝西泮、可乐平等衍生物)、以及其类似物和衍生物。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是治疗对象的阿尔茨海默病的阿尔茨海默病治疗剂。治疗阿尔茨海默病的合适疗法包括但不限于，认知增强药物(例如，美金刚(memantine)、美金刚(Namenda)、和其他衍生物)、胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐、安理申、加兰他敏、加兰他敏、卡巴拉汀、艾斯能、和其他衍生物)、阿杜那单抗(aducanumab)、阿杜那单抗(Aduhelm)、及其类似物和衍生物。

在一些实施例中，本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗发炎症状的治疗部分。可以使用这种非结合性蛋白质-药物缀合物治疗的示例性发炎症状包括但不限于，类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、黄斑变性、骨质疏松症、免疫炎症、非免疫炎症、肾脏炎症、结核病、多发性硬化症、关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、和阿尔茨海默病。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是非甾体类抗炎药(NSAID)(例如，布洛芬、艾德维尔、美林(Motrin IB)、萘普生钠、萘普生、和其他衍生物)、皮质类固醇药物(例如，泼尼松和其他衍生物)、常规的疾病缓解抗风湿药(DMARDs)(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氨蝶呤(Trexall)、甲氨蝶呤(Otrexup)、来氟米特(leflunomide)、来氟米特(Arava)、羟氯喹、硫酸羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、和其他衍生物)，生物DMARD(阿巴西普(abatacept)、阿巴西普(Orencia)、阿达木单抗、修美乐、阿那白滞素(anakinra)、阿那白滞素(Kineret)、赛妥珠单抗、希敏佳、依那西普、恩利、戈利木单抗、西米普利单抗、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗(Remicade)、利妥昔单抗(rituximab)、利妥昔单抗(Rituxan)、sarilumab、Kevzara、托珠单抗(tocilizumab)、托珠单抗(Actemra)、和其他衍生物)、靶向合成的DMARD(例如，巴瑞替尼(baricitinib)、巴瑞替尼(Olumiant)、托法替尼(tofacitinib)、托法替尼(Xeljanz)、乌帕替尼(upadacitinib)、乌帕替尼(Rinvoq)、和其他衍生物)、及其类似物和衍生物。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是选自以下的抗炎治疗剂：他汀类药物(例如，阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、和其他衍生物)和其他胆固醇药物(例如，依替米贝、艾泽庭、非诺贝特、吉非贝齐、和其他衍生物)、抗凝剂(例如，阿司匹林和其他衍生物)、血液稀释剂、及其类似物和衍生物。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗骨病症的治疗剂。可以使用这种非结合性蛋白质-药物缀合物治疗的合适的骨骼病症包括，例如，骨质疏松症和佩吉特骨病。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗对象骨质疏松症的骨质疏松症治疗剂。合适的骨质疏松症治疗剂包括但不限于，双膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐(Alendronate)、阿仑膦酸盐(Binosto)、福善美、伊班膦酸盐(Ibandronate)、伊班膦酸盐(Boniva)、利塞膦酸盐(Risedronate)、利塞膦酸盐(Actonel)、利塞膦酸盐(Atelvia)、唑来膦酸(Zoledronic acid)、唑来膦酸(Reclast)、唑来膦酸(Zometa)、和其他衍生物)、地诺单抗(例如，普罗力、地诺单抗、和其他衍生物)、激素相关疗法(例如，雌激素、雷洛昔芬、易维特、睾酮、和其他衍生物)、骨骼构建药物(例如，特立帕肽(Teriparatide)、特立帕肽(Bonsity)、复泰奥、阿巴洛肽(Abaloparatide)、阿巴洛肽(Tymlos)、罗莫单抗、Evenity、和其他衍生物)、及其类似物和衍生物。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗对象的佩吉特骨病的佩吉特骨病治疗剂。佩吉特骨病的合适治疗剂包括但不限于，双膦酸盐(例如，唑来膦酸、Reclast、Zometa、帕米膦酸盐、阿雷迪亚、伊班膦酸盐、和博尼瓦等衍生物)、和口服双膦酸酯(例如，阿仑膦酸盐、Binosto、利赛膦酸盐)、阿克内尔、阿替维、和其他衍生物)、及其类似物和衍生物。

在任何实施例中，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗对象感染性疾病的抗病毒治疗剂。合适的抗病毒治疗剂包括但不限于，奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、巴洛沙韦、喷昔洛韦、阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、乌米诺韦、阿扎那韦、阿特里普拉、巴洛沙维马尔博西尔、比克塔维、波塞普维尔、布列维特、西多福韦、康比维尔、达拉塔斯韦、达芦那韦、德拉维丁、德斯科维、多卡沙醇、多卢特格雷、伊巴西坦、依度唑啶、依米克莫德、伊姆诺韦、莱特莫维尔、洛匹那韦、马拉维、美他沙酮、莫罗西定、奈尔菲那韦、尼塔唑沙尼、奥斯他米韦、雷德西韦、利巴韦林，金刚乙胺，利托那韦，沙奎那韦，索非布韦、替拉那韦、伐昔洛韦、维克韦罗、以及扎那米韦。

在任何实施例中，患有传染性疾病的对象具有丝状病毒。在一些实施例中，丝状病毒是埃博拉病毒或马尔堡病毒。埃博拉病毒和其他丝状病毒经由内吞作用附着并进入宿主细胞。内化病毒位于晚期核内体/溶酶体中，并被半胱氨酸蛋白酶切割。根据该实施例，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是抗病毒治疗剂，适用于治疗对象中的丝状病毒。合适的抗病毒治疗剂包括但不限于，瑞德西韦、mAb114(Kugelman等人，“Emergence ofEbola virus escape variants in infected nonhuman primates treated with theMB-003antibody cocktail”，Cell Rep 2015；12:2111-20，其全部内容通过引用并入本文)\REGN-EB3(Pascal等人，“Development of clinical-stage human monoclonalantibodies that treat advanced Ebola virus disease in nonhuman primates”，JInfect Dis 2018；218(增刊5):S612-26，其全部内容通过引用并入本文)、和ZMapp(Qiu等人，“Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates withZMapp”，Nature 2014；514:47-53，其全部内容通过引用并入本文)。

在一些实施例中，患有传染性疾病的对象具有冠状病毒。在一些实施例中，冠状病毒是严重急性呼吸系统综合症冠状病毒-2(SARS-CoV-2)或中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)。根据该实施例，非结合性蛋白质-药物缀合物的药物活性部分是适用于治疗对象冠状病毒的抗病毒治疗剂。合适的抗病毒治疗剂包括但不限于，氯喹、羟氯喹、伊维菌素、瑞德西韦、巴瑞替尼、和帕克斯洛维。

因此，可以将本文所述的NPC1结合分子作为抑制感染、抑制感染进展、和/或降低对象感染的治疗手段，施用给患有冠状病毒感染或处于感染风险的对象。

在一些实施例中，本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物的第二部分是诊断部分。合适的诊断部分是那些有助于非结合性蛋白质-药物缀合物的检测、定量、分离、和/或纯化的部分。合适的诊断部分包括但不限于，纯化标签(例如聚组氨酸(His_6-)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST-)、麦芽糖结合蛋白(MBP-))、荧光染料或标签(例如，螯合物(铕螯合物)、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红、酶标签)、放射性同位素或放射性标记(例如，⁴C、¹¹C、¹⁴N、³⁵S、³H、³²P、^99mTc、¹¹¹In、^62/64Cu、¹²⁵I、¹⁸F、^67/68Ga、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu和^186/188Re)、带有螯合剂的放射性核苷酸(例如，MAG3、DTPA、和DOTA，另外参考Liu S.，“Bifunctional Coupling Agents for radiolabeling of Biomolecules and TargetSpecific Delivery of Metallic Radionuclides”，Adv.Drug Deli.Ref.60(12):1347-1370(2008)，其全部内容通过引用并入本文)、微泡(Abou-Elkacem等人，“Ultrasoundmolecular imaging of the breast cancer neovasculature using engineeredfibronectin scaffold ligands:A novel class of targeted contrast ultrasoundagent”，Theranostics 6:1740-1752(2016)，其全部内容通过引用并入本文)、适用于成像的造影剂、或光敏剂。

在一些实施例中，诊断部分是与螯合剂结合的放射性标记、放射性核素、或放射性同位素。可以与螯合剂结合的特别有用的诊断放射性标记、放射性核素、或放射性同位素包括但不限于，¹¹⁰In、^mIn、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹V、⁸⁹Zr、⁹⁴Tc、⁹⁴Tc、^99mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁵⁴Gd、¹⁵⁸Gd、³²P、ⁿC、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、^52mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr、或其他γ、β或正电子发射体。诊断放射性标记包括在25keV至10,000keV的范围内的衰变能量，更优选地在25keV至4,000keV的范围内、甚至更优选地在20keV至1,000keV的范围内、并且还更优选地在70keV至700keV的范围内。有用的发射正电子的放射性核素的总衰变能量优选地<2,000keV、更优选地低于1,000keV、最优选地<700keV。

螯合剂，例如NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-N,N',N"-三乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(1,1,4,7,7-二亚乙基三胺五乙酸)、TETA(对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)、和Df(去铁胺B)与各种放射性标记、放射性核素、放射性同位素、金属一起使用。DOTA型螯合剂，其中配体包含硬碱螯合功能，例如羧酸盐或胺基基团，对于螯合硬酸阳离子最有效。通过根据感兴趣的金属调整环的尺寸，可以使这种金属螯合物非常稳定。此外，一种以上类型的螯合剂可以缀合至可靶向的构建体以结合多种金属离子，例如，诊断放射性核素和/或治疗性放射性核素。

使用标准的生物结合方法，将螯合剂共价地结合到缀合物的非结合性FN3结构域。FN3结构域中的含胺残基(例如，赖氨酸)与含有活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)的螯合剂进行酰胺键的形成。含硫残基(例如，半胱氨酸)与含有活化酯或马来酰亚胺部分进行螯合剂的缀合。或者，当FN3结构域的活化羧酸盐残基在螯合剂上分别与胺基或硫醇基形成酰胺或硫酯时，就会形成生物缀合物。可以交替地使用双功能接头，例如，PEG-马来酰亚胺(PEG-Mal)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)或N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶硫基)丙酸酯(SPDP)。

在一些实施例中，本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物还包含第三部分。在一些实施例中，本公开的蛋白质-药物缀合物的第三部分包含半衰期延长部分。示例性的半衰期延长部分包括但不限于，白蛋白、白蛋白变体(参考例如，Andersen等人的美国专利8,822,417号、Desai等人的美国专利8,314,156号、和Plumridge等人的美国专利8,748,380号，其全部内容通过引用并入本文)、白蛋白结合蛋白质和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物(参考例如，Prior等人的美国专利7,176,278号，其全部内容通过引用并入本文)、Fc区和变体Fc区(参考例如，Lazar等人的美国专利8,546,543号、Tsui的美国专利公开号20150125444、和Seehra等人的美国专利8,722,615号，其全部内容通过引用并入本文)。

非结合性蛋白质-药物缀合物的其他半衰期延长部分包括但不限于，聚乙二醇(PEG)分子，例如PEG5000或PEG20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、山萮酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等；聚赖氨酸；辛烷；碳水化合物(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)以获得所需的性质。例如，可以通过使用本领域熟知的方法将半胱氨酸残基添加到分子的C-末端并将聚乙二醇基团附接到半胱氨酸，以将聚乙二醇部分添加到第一部分，即非结合FN3部分。

对于治疗或诊断用途，可以将本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物制备作为药物或诊断组合物，其含有有效量的蛋白质-药物缀合物，作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指与活性化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或运输媒介。这样的运输媒介可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可以使用0.4％的盐水和0.3％的甘氨酸。这些溶液是无菌的，总体上不含颗粒物质。可以通过常规的、公知的灭菌技术(例如，过滤)将它们灭菌。组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在这样的药物制剂中的如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物的浓度可以广泛地变化，即，从小于约0.5％，通常为或至少约1％到多至15％或20％(按重量计)，并且将根据所选择的施用具体模式，主要根据所需的剂量、流体体积、粘度等来选择。合适的运输媒介和制剂，包括其他人类蛋白质，例如人类血清白蛋白，在例如以下中描述，REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY,第21版,Troy,D.B.Ed.,Lipincott Williams和Wilkins，2006，第5部分，PharmaceuticalManufacturing，第691页至1092页，特别参考第958页至989页，其全部内容通过引用并入本文。

本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物可以按非分离或分离的形式使用。此外，本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物可以单独使用或以包含至少一种本文所述的其它非结合性蛋白质-药物缀合物的混合物使用。换句话说，非结合性蛋白质-药物缀合物可以组合使用，例如，作为包含两种或更多种非结合性蛋白质-药物缀合物的药物组合物。例如，可以将具有不同、但互补活性的非结合性蛋白质-药物缀合物组合在单个疗法中以达到期望的治疗效果，但是可选择地，也可以将具有相同活性的非结合性蛋白质-药物缀合物组合在单个疗法中以达到期望的治疗或诊断效果。可选择地，该混合物还包含至少一种其他治疗剂。

本公开的另一方面涉及用于治疗对象的癌症的方法。该方法包括以有效治疗癌症的量向患有癌症的对象施用本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物或包含该非结合性蛋白质-药物缀合物的药物组合物。

根据本文所述的所有方法，“对象”是指任何动物。在一些实施例中，对象是哺乳动物。示例性哺乳动物对象包括但不限于，人类、非人类灵长类动物、狗、猫、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、马、牛和奶牛、绵羊和猪。在一些实施例中，对象是人类。

在一些实施例中，对象患有一种类型的癌症，其特征在于癌细胞相对于其对应的非癌细胞具有增强的大型胞饮作用。在一些实施例中，癌症的特征在于癌细胞在ras中具有致癌突变，即，在H-ras、N-ras、或K-ras中具有致癌突变。在一些实施例中，对象患有选自以下的癌症：胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、神经胶质瘤、实体瘤、黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤、白血病、肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌、和骨髓瘤。

在一些实施例中，在施用非结合性蛋白质-药物缀合物或包含其的药物组合物之前，对象患有一种类型的癌症，其对原发性癌症治疗方法具有抗性或已经变得有抗性，例如，对化疗治疗具有抗性。以有效直接靶向和杀死癌细胞的量施用包含癌症治疗剂的非结合性蛋白质-药物缀合物或包含其的药物组合物。在上文描述了合适的非结合性蛋白质-药物缀合物包含癌症治疗剂，例如抗代谢物、生物碱、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗肿瘤抗生素、DNA结合药物、微管靶向药物、毒素、抗增殖剂药物、DNA拮抗剂、放射性核素、热消融剂或PROTAC。

在一些实施例中，对象患有免疫耐受或已经变得免疫耐受的类型的癌症。以有效增强抗肿瘤免疫应答的量施用包含免疫调节剂的非结合蛋白质-药物缀合物或包含其的药物组合物。在上文描述了合适的非结合性蛋白质-药物缀合物包含免疫调节剂，例如，1型巨噬细胞刺激剂、2型巨噬细胞耗竭剂、T细胞刺激剂、树突状细胞刺激剂、和/或中性粒细胞刺激剂。

在一些实施例中，用于治疗患有癌症的对象的方法还包括联合该非结合性蛋白质-药物缀合物或包含其的药物组合物施用附加的癌症治疗剂。可以与本文描述的非结合性蛋白质-药物缀合物组合施用作为组合疗法的合适的癌症治疗剂包括例如但不限于化学治疗剂。合适的化学疗法包括但不限于，烷化剂(例如，苯丁酸氮芥、环磷酰胺、CCNU、美法仑、丙卡巴肼、噻替派、BCNU、和白消安)、抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤和、5-氟尿嘧啶)、蒽环类药物(柔红霉素、多柔比星、伊达比星、表柔比星、和米托蒽醌)、抗肿瘤抗生素(例如，博来霉素、单克隆抗体(例如，阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、伊布单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西单抗、和曲妥单抗)、铂类(例如，顺铂和奥沙利铂)或植物生物碱(例如，拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷类(例如，紫杉醇)、以及鬼臼素)。在一些实施例中，癌症化学治疗剂选自环磷酰胺、吉西他滨、伏立诺他、替莫唑胺、硼替佐米、卡莫司汀、和紫杉醇。

根据本文所述的方法，通过全身或局部施用来进行非结合性蛋白质-药物缀合物或包含其的药物组合物单独或与一种或多种附加的癌症治疗剂组合的施用。本文公开的蛋白质-药物缀合物和/或组合疗法的合适的全身给药方式包括但不限于，口服、局部、经皮、肠胃外、皮内、肺内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下或通过鼻内滴注、通过腔内或膀胱内滴注，眼内，动脉内，病灶内、或通过施用于粘膜。在某些实施例中，本文所述方法的治疗剂是口服递送的。本文公开的治疗剂和/或组合的合适的局部给药方式包括但不限于，导管插入术、植入、直接注射、皮肤/经皮施用、或门静脉给药至相关组织，或通过任何其他本领域公知的局部给药技术、方法或过程。影响药剂递送的方式将根据所递送的癌症治疗剂的类型和待治疗的癌症的类型而变化。

在本文公开的方法中，非结合性蛋白质-药物缀合物或包含其的药物组合物，其单独地或与附加的癌症治疗剂组合的治疗有效量，是当在特定时间间隔施用时产生达到一个或更多个治疗基准的量(例如，减缓或停止肿瘤生长、肿瘤消退、症状停止等)。可以将用于本公开方法的非结合性蛋白质-药物缀合物或包含其的药物组合物施用给对象一次或多次。在那些多次施用治疗组合物的实施例中，可以按设定的间隔施用，例如，每天、每隔一天、每周、或每月。或者，可以按不规律的间隔施用，例如，基于症状、患者健康等按需给药。例如，可以按一天一次、至少2天一次、至少3天一次、至少4天一次、至少5天一次、至少6天一次、至少7天一次、至少10天一次、或至少15天一次来施用治疗有效量。任选地，在治疗期间或之后监测癌症的状态或癌症的消退，例如，通过对象的多参数超声(mpUS)、多参数磁共振成像(mpMRI)、和核成像(正电子发射断层扫描[PET])。根据检测到的癌症的状态或癌症消退，可以增加或减少施用给对象的非结合性蛋白质-药物缀合物或组合疗法的剂量。

普通技术人员可以根据个体对象(例如，在接受治疗的对象中达到特定治疗基准所必需的非结合性蛋白质-药物缀合物的量)或群体基础(例如，在给定人群的普通对象中达到特定治疗基准所必需的非结合性蛋白质-药物缀合物的量)来确定该量。理想情况下，治疗有效量不超过最大耐受剂量，在该最大耐受剂量，50％或更多的经治疗的对象经历阻止进一步给药的副作用。

对象的治疗有效量可以取决于多种因素而变化，包括症状的种类和程度、性别、年龄、体重、或对象的总体健康状况、施用方式和盐或溶剂化物类型、对药物的敏感性、疾病的具体类型等。

本公开的另一个方面涉及一种用于调节对象免疫应答的方法。该方法包括以有效调节对象的免疫应答的量向患有受益于免疫系统调节的病症的对象施用本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物。根据本公开的此方面，合适的非结合性蛋白质-药物缀合物包括那些包含免疫调节剂作为缀合物的第二部分的缀合物。合适的免疫调节剂，例如，1型巨噬细胞刺激剂、2型巨噬细胞刺激剂、T细胞刺激剂、树突状细胞刺激剂、和中性粒细胞刺激剂都在上文描述。

根据本公开的这个此方面调节或改变对象的免疫应答是为了治疗、预防、或减缓至少部分地由免疫应答和/或免疫系统的细胞引起或加剧的疾病或病症的进展，例如，1型巨噬细胞、2型巨噬细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、中性粒细胞。例如，炎性疾病和病症，包括但不限于，黄斑变性、动脉粥样硬化、骨质疏松症、免疫炎症、非免疫炎症、肾脏炎症、结核病、多发性硬化症、关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、和阿尔茨海默病，涉及1型巨噬细胞的不良行为。采用本发明的方法在参与或促成这些疾病过程的1型促炎性巨噬细胞中诱导2型巨噬细胞表型变化减轻疾病的一个或更多个症状或原因。因此，在一个实施例中，对患有炎症或自身免疫病症的对象体内的或来自该对象的1型巨噬细胞群体进行体内或离体施用，包括但不限于上文列举的那些。在这种情况下，向1型巨噬细胞群施用2型巨噬细胞刺激剂将诱导2型表型改变，由此减少与该疾病相关联的1型巨噬细胞的不良行为。

调节或修饰免疫细胞表型在治疗各种形式的癌症场景中也有治疗益处。最近的研究表明，肿瘤相关联的巨噬细胞(TAM)表现出类似于2型巨噬细胞的表型。这些2型巨噬细胞是重要的肿瘤浸润细胞，在肿瘤生长和转移中起着关键作用。在大多数实体瘤中，TAM的存在有利于肿瘤的生长和转移。这些TAM产生白细胞介素IL-10和转化生长因子(TGF)β以抑制总体的抗肿瘤免疫应答。同时，TAM通过分泌促血管生成因子促进肿瘤新血管生成，并定义侵入性微环境以有助于肿瘤转移和扩散。因此，采用本公开的方法施用包含1型巨噬细胞刺激剂的非结合性蛋白质-药物缀合物以诱导TAM中的1型表型改变来增强抗肿瘤免疫力将显著地改变癌症的进展。典型地具有2型巨噬细胞相关组分的癌症包括但不限于，胰腺癌、乳腺癌、和非小细胞肺癌。可选择地，或与包含1型巨噬细胞刺激剂的非结合性蛋白质-药物缀合物联合施用，可以施用包含T细胞刺激剂、树突状细胞刺激剂、或中性粒细胞刺激剂的非结合蛋白质-药物缀合物以激活或增强抗肿瘤免疫应答。

在一些实施例中，需要免疫系统调节的对象是患有干扰素病的对象。如本文所提到的，干扰素病是涉及I型干扰素，例如，IFN-α、IFN-β、和IFN-Ω的表达增强的病症。可以根据本公开内容治疗的干扰素病包括但不限于，Aicardi-Goutieres综合征、Cree脑炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、综合征、皮肌炎、多发性硬化、伴有免疫失调的脊椎软骨发育不良、干扰素基因刺激物(STING)-相关血管病伴发于婴儿期(SAVI)、日本自身炎症综合征伴脂肪代谢障碍(JASL)、泛素特异性肽酶18缺乏症、慢性非典型中性粒细胞性皮炎伴脂肪营养不良、DNA II缺陷、Singleton-Merten综合征、和慢性非典型中性粒细胞性皮肤病伴脂肪营养不良和体温升高(CANDLE)。适用于治疗干扰素病的、根据本公开的非结合性蛋白质-药物缀合物包含与I型干扰素拮抗剂相偶联的非结合FN3结构域。在一些实施例中，I型干扰素拮抗剂是I型干扰素受体拮抗剂，例如janus激酶(JAK)抑制剂。合适的JAK抑制剂包括，JAK1/JAK2抑制剂，例如但不限巴瑞替尼(CAS号1187594-09-7)、托法替尼(CAS号477600-75-2)、鲁索替尼(941678-49-5)、AG490(酪氨酸磷酸化抑制剂家族)(CAS号133550-30-8)、来他替尼(CEP-701；CAS号111358-88-4)、WP-1034(酪氨酸磷酸化抑制剂家族；CAS号857064-42-7)、BMS-911543(CAS号1271022-90-2)、菲卓替尼(TG101348；CAS号936091-26-8)、普拉替尼(SB1518；CAS号937272-79-2)、以及莫洛替尼(CYT387；CAS号1056634-68-4)。

在一些实施例中，需要免疫系统调节的对象是具有伤口或正在经历伤口愈合的对象。根据该实施例，向具有伤口或需要伤口愈合的对象施用包含1型巨噬细胞刺激剂的非结合性蛋白质-药物缀合物。合适的1型刺激剂，例如，紫杉醇、集落刺激因子-1(CSF-1)受体拮抗剂、IL-10受体拮抗剂、Toll样受体(TLR)-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、和TLR-9激动剂在上文进行了描述。

在一些实施例中，需要免疫系统调节的对象是患有炎性病症的对象，并且非结合性蛋白质-药物缀合物包含巨噬细胞耗竭剂。可以用巨噬细胞消耗剂，例如，氯膦酸盐、唑来膦酸、和曲贝替定治疗的合适的炎性病症包括但不限于，类风湿性关节炎、肥胖和肥胖相关并发症、子宫内膜异位症、肺部炎性病症(例如，慢性阻塞性肺病和肺结核)。

本公开的另一个方面涉及用于治疗对象的神经退行性病症的方法。该方法包括向患有神经退行性病症的对象施用本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗神经退行性病症的药物活性部分。示例性神经退行性疾病(例如，肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病)和适用于治疗这些病症的非结合性蛋白质-药物缀合物在上文中公开。

本公开的另一个方面涉及治疗对象的炎性病症的方法。该方法包括向患有炎性病症的对象施用如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适于治疗炎性病症的药物活性部分。可以根据该方法治疗的示例性炎性病症包括但不限于，类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、黄斑变性、骨质疏松症、免疫性炎症、非免疫性炎症、肾脏炎症、肺结核、多发性硬化症、关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、和阿尔茨海默病。包含用于治疗这些病症的药物活性部分的合适的非结合性蛋白质-药物缀合物在上文中公开。

本公开的另一个方面涉及一种用于治疗对象的骨病的方法。该方法包括向患有骨病的对象施用如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适于治疗骨病的药物活性部分。示例性骨病包括但不限于骨质疏松症和佩吉特骨病，并且适用于治疗这些病症的非结合性蛋白质-药物缀合物在上文中公开。

本公开的另一个方面涉及用于治疗对象的传染性疾病或病症的方法。该方法涉及向患有传染性疾病的对象施用如本文所述的非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗传染性疾病的药物活性部分。上文公开了示例性传染性疾病(丝状病毒感染和冠状病毒感染)和适用于治疗这些病症的非结合蛋白质-药物缀合物。

本公开的另一个方面涉及一种用于对对象中的肿瘤进行成像的方法。该方法涉及选择患有肿瘤的对象并向所述对象施用包含非结合性蛋白质-药物缀合物的组合物。根据本公开的此方面，非结合性蛋白质-药物缀合物的第二部分包含诊断部分。上文描述了合适的诊断部分，例如，荧光染料、放射性同位素、放射性核素、放射性同位素、微泡、适用于成像的造影剂、和光敏剂。

根据本公开的此方面，待成像的肿瘤的特征在于，癌细胞相对于它们相应的非癌细胞具有增强的大型胞饮作用。在一些实施例中，待成像的肿瘤的特征在于，在H-ras、N-ras、或K-ras中具有致癌突变的癌细胞。在一些实施例中，待成像的肿瘤是胰腺肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、神经胶质瘤、实体瘤、黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤、白血病、肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺肿瘤、和骨髓瘤。

使用本公开的诊断性非结合性蛋白质-药物缀合物检测对象中肿瘤的存在是使用体内成像技术实现的。体内成像包括向对象施用本文所述的非结合性蛋白质-诊断部分缀合物，并检测体内肿瘤细胞大型胞饮介导的缀合物摄取。

根据本公开的此方面，诊断性非结合性蛋白质缀合物通过静脉内注射到对象体内、或直接注射到肿瘤中施用。非结合性蛋白诊断部分缀合物的剂量应在与治疗方法相同的范围内。根据该实施例，与非结合性FN3结构域相偶联的诊断部分是有助于体内成像的成像剂。合适的显像剂如上文所述，包括但不限于，单光子发射计算机断层扫描(SPECT)剂、正电子发射断层扫描(PET)剂、磁共振成像(MRI)剂、核磁共振成像(NMR)剂、X射线试剂、光学试剂(例如，荧光团、生物发光探针、近红外染料、量子点)、超声试剂和中子俘获治疗试剂、计算机辅助层析成像试剂、双光子荧光显微成像剂、和多光子显微成像剂。示例性的可检测的标记包括放射性同种型(例如，¹⁸F、¹¹C、¹³N、⁶⁴Cu、¹²⁴I、⁷⁶Br、⁸²Rb、⁶⁸Ga、^99mTc、¹¹¹In、²⁰¹Tl、或¹⁵O，它们适用于PET和/或SPECT使用)和适用于MRI的超小超顺磁性氧化铁颗粒(USPIO)。

通过检测对象中检测到的非结合性蛋白质-诊断部分缀合物的数量、大小、和/或强度来对对象中的肿瘤进行成像。在一些实施例中，将检测到的诊断缀合物的水平与相应的基线值进行比较。适当的基线值可以是在未患病个体群体的细胞内发现的非结合性蛋白诊断缀合物的平均水平。或者，适当的基线值可以是在较早时间确定的同一对象的细胞内发现的非结合性蛋白诊断缀合物的水平。

本文所述的诊断成像方法也可以用于监测对象对治疗的反应。在该实施例中，在治疗开始之前确定对象中非结合性蛋白诊断缀合物的检测。将在此时间点的对象中的非结合性蛋白诊断缀合物的水平用作基线值。在治疗过程中的不同时间重复非结合性蛋白诊断缀合物的施用和检测，然后将测得的值与基线值进行比较。相对于基线值的降低表明对治疗有积极反应。

实例

提供以下实例以说明本公开的实施例但决不旨在限制其范围。

实例1-非结合性蛋白药物缀合物的生产

作为一项初步研究，将非结合性FN结构域(包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并添加C-端丝氨酸和半胱氨酸残基用于缀合)与一甲基奥瑞他汀E(MMAE)接合(参考图1A中的示意图)。MMAE是常用于抗体药物缀合物(ADC)的剧毒试剂。MMAE分子通过接头连接到非结合FN结构域，该接头包含组织蛋白酶可切割的接头和马来酰亚胺基团，用于与非结合性FN结构域蛋白(FN-MMAE)上的C-末端游离半胱氨酸相缀合。利用两步法和1.5摩尔过量的药物进行马来酰亚胺结合。通过凝胶迁移分析(图1B)、Ellman测试和光谱分析(图1D)验证缀合。对于体外和体内成像，Cy5.5代替药物分子以监测新设计的复合物的药代动力学(图1C)。

实例2-非结合性蛋白药物缀合物的大型胞饮摄取

为了确定非结合性FN结构域是否可以被内化，使用了成熟的多西环素诱导突变体KRas^V12 HeLa细胞系统(以下称为HeLa KRas^V12)，在其中通过高分子量(70kDa)四甲基-罗丹明标记的(TMR-)葡聚糖来监测大型胞饮作用。如图2B所示，荧光标记的非结合性FN结构域(FN-Cy5.5)与TMR-右旋糖酐共定位。重要的是，内化依赖于致癌Ras，因为未添加多西环素(HeLa)的细胞没有可检测的非结合性FN结构域摄取。此外，大型胞饮作用抑制剂EIPA阻断了非结合性FN结构域和右旋糖酐摄取到HeLa KRas^V12细胞中(图2B)。类似地，突变体KRasPDAC细胞系MIA PaCa-2(人类，图2A)和KPC 1203(小鼠，图3A)示出在右旋糖酐和FN-Cy5.5之间发生共定位；而EIPA消除了两个大分子的摄取(图2A和图3A)。在图3B中，具有Ras突变的人类结肠直肠癌细胞系HCT116示出在葡聚糖和FN-Cy5.5之间发生共定位，但在具有WTRas的HCA7细胞中未见摄取。通过流式细胞术分析非结合性FN结构域处理的HeLa KTO+KRas^V12和MIA PaCa-2对FN-Cy5.5摄取呈阳性(图2C)。

差异摄取不仅在实体瘤细胞系中存在，而且在多发性骨髓瘤等血癌中也存在。与突变体NRas(L363)或突变KRas(RPMI-8226)多发性骨髓瘤细胞系(图14和图16)相比，野生型Ras细胞系(KMS11)几乎没有或没有大型胞饮作用。使用与HeLa KRas^V12诱导系统类似的系统，我们在野生型KRas KMS11多发性骨髓瘤细胞中创建了可诱导的KRas^V12细胞系统。如在HeLa系统中所见，KMS11细胞中的KRas^V12表达在多西环素处理下很明显并且依赖于FN-Cy5.5细胞摄取(图15)。

实例3-非结合性蛋白药物缀合物的差异细胞毒性

通过创建细胞不可渗透的蛋白质络合物，非结合性FN结构域进入细胞而没有大型胞饮作用的能力受到阻碍，从而创建选择性细胞摄取途径。为了研究Ras突变状态是否赋予不同的细胞毒性，测试了增加浓度的FN-MMAE缀合物对HeLa和HeLa KRas^V12细胞中的细胞活力的影响。事实上，检测到与HeLa细胞相比HeLa KRas^V12细胞的IC50降低了16倍(图4A)。FN-MMAE在突变型Ras胰腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、和结肠癌细胞系中也非常有效(图4B)。在将FN-MMAE的IC50值标准化为游离MMAE以控制细胞差异后，观察到与具有突变Ras(大型胞饮作用阳性)的细胞系相比，没有突变Ras(大型胞饮作用阴性)的细胞系的细胞毒性显著降低，表明大型胞饮作用依赖性。

非结合性FN结构域平台的独特属性是货物缀合物的灵活性。这在图4C中进行了测试，在其中伊立替康代谢物SN-38与FN缀合。与FN-MMAE类似，在处理的PDAC细胞系中观察到突变Ras特异性细胞毒性。

为了测试体内效果，使用MIA PaCa-2皮下肿瘤模型来比较PBS、MMAE、和FN-MMAE的功效(图5A)。在确定肿瘤后，每7天注射三次相对于MMAE浓度为0.2mg/kg的药物。与MMAE相比，FN-MMAE缀合物通过将达到肿瘤大小终点的时间延长47天(增加2.2倍)，更有效地减少了肿瘤生长。FN-MMAE还示出肾脏和肝脏中的非特异性毒性降低，特别是裂解半胱天冬酶3、HMGB1减少、和微管蛋白染色增加(细胞毒性的MMAE模式作为微管蛋白去稳定剂)(图5B、图6A、和图6B)。这突出了与游离药物相关的非大型胞饮作用细胞摄取减少的特异性，这有助于非结合性FN结构域-药物缀合物的选择性作用。

实例4-非结合性蛋白药物缀合物的生物分布

非结合性FN结构域的大小使其在血清中的半衰期非常短，清除率受到肾脏排泄的影响，并在肾脏和肝脏中大量收集。为了测试非结合性FN结构域生物分布是否发生改变，使用了MIA PaCa-2异种移植小鼠模型。在用FN-Cy5.5或Cy5.5给携带已确定的肿瘤的小鼠注射后，IVIS时间进程揭示了与游离的Cy5.5相比，非结合性FN结构域的药代动力学特征发生了变化(图7A和图7B)。接下来，在相同的时间过程中处理MIA PaCa-2和BxPC3异种移植小鼠，以查看突变状态是否影响其滞留(图7C)。在1hr、4hr、和24rh的时间点，MIA-PaCa-2肿瘤的摄取量增加了一倍以上。接下来，将KPC细胞原位注射到小鼠的胰腺中，以评估PBS、Cy5.5-COOH或FN-Cy5.5的治疗和生物分布。在6hr时间点分析整个肿瘤和肿瘤切片的离体成像(图7D和图7E)，显示出相较于野生胰腺的致瘤胰腺的选择性摄取，这在小分子治疗中未见。

在图8中，在腹腔(IP)注射后1hr和24hr时，在原位移植的KPC荷瘤小鼠中观察到PBS、FN-Cy5.5、小鼠白蛋白(MSA)-Cy5.5、或小鼠IgG-Cy5.5的生物分布。在1hr时(图8A)和24hr时(图8B)处死小鼠以观察体外生物分布和血液荧光(图8C)。在1hr时，与其他蛋白质缀合物相比，FN-Cy5.5在肾脏和肝脏中急剧增加2倍，显示出快速排泄，同时具有相似或增加的肿瘤滞留。在24hr时，FN-Cy5.5示出肾脏和肝脏减少，同时具有相似的肿瘤值(MSA和IgG分别为90％和100％)。FN-Cy5.5在1hr时显示出血液荧光减少3倍，再次强调相较于其他蛋白质缀合物的快速排泄。

在图9中，检查了胰腺引流淋巴结中的非结合性蛋白药物缀合物的摄取。PDAC患者的胰腺引流淋巴结内存在转移的易感性，同时也是目前正在开发的许多令人鼓舞的肿瘤免疫调节剂疗法的靶组织。为了评估该组织中是否存在选择性摄取，更具体地说是树突状细胞，用PBS、Cy5.5-COOH、和FN-Cy5.5处理原位移植的KPC荷瘤小鼠。离体IVIS成像示出FN-Cy5.5位于PDAC引流淋巴结内(图9A)，相较于支气管淋巴结，FN-Cy5.5对PDAC淋巴结有2倍的偏好。另外，将淋巴结消化并使用流式细胞仪观察Cy5.5阳性细胞(图9B和图9C)。与游离药物相比，FN缀合物的阳性Cy5.5细胞增加了2倍以上，这表明树突状细胞的摄取随着材料递送的改善而改进。这些数据共同表明，不仅FN平台选择性地滞留在胰腺淋巴结中，而且FN缀合物也可以显著地改进药物摄取。

使用转基因小鼠模型KrasG12D；Trp53R172H；p48Cre(KPC)的进一步分析概括了人类PDAC从胰腺上皮内肿瘤(PanIN)病变到PDAC和转移的进展，也展示了胰腺中增强的肿瘤选择性摄取(图10A至图10C)。重要的是，在野生型小鼠的胰腺中观察到较少的摄取(图10A至图10C)。观察到整个肿瘤一致的Cy5.5染色，表明良好的渗透和与癌细胞标记物(CK8)的共定位(图10D)。重要的是，发现FN-Cy5.5络合物到达肿瘤并被肿瘤细胞内化。此外，利用共同递送白蛋白结合的FITC和FN-Cy5.5进行了类似的实验。基于白蛋白的疗法是PDAC治疗中的当前护理标准。白蛋白-FITC和FN-Cy5.5都共定位在小鼠中已确定的胰腺肿瘤内(图11)。离体分析示出FN-Cy5.5在PanINs中具有更强的摄取倾向，如通过与CK8染色的共定位所见，而白蛋白-FITC在细胞外肿瘤微环境中积累得更多。

差异性肿瘤积累不仅在实体瘤中存在，而且在多发性骨髓瘤等血癌中也存在。相较于野生型Ras异种移植物(KMS11)，突变NRas异种移植物(L363)显示出增加的FN-Cy5.5的肿瘤积累(图17)。

展示出的药代动力学曲线表明非结合性FN结构域治疗将具有在化疗和成像领域中的出众优势。在保持肿瘤滞留和增强渗透的同时创造较短的半衰期将允许更大的剂量团和有限的毒性，使治疗可能更有效。

实例5-使用非结合性蛋白缀合物成像

目前的成像方法已经创建了适度的解决方案来检测PDAC的早期阶段。具体而言，当前的MRI成像系统空间分辨率较差，检测病变的能力一般。对传统PET试剂(¹⁸FDG)的调查报告了不同的结果。¹⁸FDG还可以检测炎症应答，这使得区分胰腺炎和PDAC具有挑战性。在使用原位移植KPC肿瘤(图12B和图13)和本地KPC小鼠模型(图12C和图13)的初步研究中，FN-DOTA-Gd³⁺遵循与荧光探针相同的生物分布(图10A)，在注射后的10分钟内在肾脏中定位(图12C和图13)并检测肿瘤块(图7B和图7C底部红色箭头)。

虽然本文已经详细描绘和描述了优选实施例，但是对于相关领域的技术人员来说明显的是，可以进行各种修改、添加、替换等而不会脱离本发明的精神，因此这些被认为是落在所附权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims

1.一种药物组合物，其包含：

非结合性蛋白质-药物缀合物，其中所述非结合性蛋白质-药物缀合物包含：

第一部分，所述第一部分包含非结合性纤连蛋白III型(FN3)结构域；

氨基酸接头，其在所述第一部分内或与所述第一部分偶联；和

第二部分，其经所述氨基酸接头与所述第一部分偶联，所述第二部分选自药物活性部分或诊断部分；以及

药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述FN3结构域在其FG环的RGD氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述FN3结构域在BC环的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述FN3结构域是非结合性人类FN3结构域。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述FN3结构域是人类纤连蛋白的第10个III型纤连蛋白结构域(¹⁰Fn3)的非结合性变体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述第一部分包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述FN3结构域包含SEQ ID NO：4的FG环氨基酸序列。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述FN3结构域包含SEQ ID NO：5的BC环氨基酸序列。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述第一部分包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中，所述氨基酸接头包含在所述蛋白质-药物缀合物的所述第一部分的所述FN3结构域内的半胱氨酸残基取代基。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中，所述氨基酸接头包含在FN3结构域C-末端添加的半胱氨酸残基。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述氨基酸接头是可裂解的接头。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述氨基酸接头是不可裂解的接头。

14.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述第一部分包含串联连接在一起的两个或两个以上FN3结构域。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述非结合蛋白质-药物缀合物的所述第二部分是药物活性部分。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述药物活性部分是癌症治疗剂。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述癌症治疗剂选自：抗代谢物、生物碱、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗肿瘤抗生素、DNA结合药物、毒素、抗增殖药物、DNA拮抗剂、放射性核素、热消融剂、蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)、核酸抑制剂、以及免疫调节剂。

18.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述生物碱选自由以下组成的组：多卡霉素、多西他赛、依托泊苷、伊立替康、紫杉醇、替尼泊苷、托泊替康、长春花碱、长春新碱、长春地辛、以及其类似物和衍生物。

19.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述烷化剂选自由以下组成的组：白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲密胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新美比星、培磷酰胺、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、替莫唑胺、以及其类似物和衍生物。

20.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述抗肿瘤抗生素选自由以下组成的组：阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、伊达比星、美诺立尔、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、吡柔比星、普卡霉素、泊菲霉素、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮杂卓、链黑霉素、链脲佐菌素、杀结核菌素、净司他丁、佐柔比星、以及其类似物和衍生物。

21.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述抗代谢物选自由以下组成的组：SN-38、二甲叶酸、依达曲沙、巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶罗呤、喷司他丁(2'-DCF)、拓优得、三甲曲沙、克拉屈滨、氟达拉滨、硫咪嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、乙嘧替氟、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、替加氟、羟基脲、氨基甲酸乙酯、以及其类似物和衍生物。

22.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述抗增殖药选自由以下组成的组：醋葡醛内酯、安吖啶、比生群、喜树碱、地磷酰胺、秋水仙碱、地吖醌、二氟替康、依氟鸟氨酸、依利醋铵、依托格鲁、依托苷、芬维A胺、硝酸镓、羟基脲、片螺素D、氯尼达明、米替福新、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、鬼臼酸、2-乙基酰肼、甲基苄肼、丙亚胺、索布佐生、锗螺胺、替尼泊苷、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2,2-三氟乙基胺、以及其类似物和衍生物。

23.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述抗有丝分裂剂选自由以下组成的组：澳瑞他汀、美登木素、多拉司他汀、微管溶素、紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱、以及其类似物和衍生物。

24.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述药物活性部分是免疫调节剂。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述免疫调节剂是1型巨噬细胞刺激剂。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述1型巨噬细胞刺激剂选自由以下组成的组：紫杉醇、集落刺激因子-1(CSF-1)受体拮抗剂、IL-10受体拮抗剂、Toll样受体(TLR)-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、以及TLR-9激动剂。

27.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述免疫调节剂是2型巨噬细胞刺激剂。

28.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述2型巨噬细胞刺激剂选自由以下组成的组：IL-33、IL-4受体激动剂、糖皮质激素、IL-10受体激动剂、IL-1受体激动剂。

29.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述免疫调节剂是T细胞刺激剂。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述T细胞刺激剂是干扰素基因刺激因子(STING)激动剂。

31.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述免疫调节剂是树突状细胞刺激剂。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中，所述树突状细胞刺激剂选自由以下组成的组：CpG寡核苷酸、咪喹莫特、喜树碱、秋水仙碱、鬼臼毒素、以及其衍生物。

33.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述免疫调节剂是中性粒细胞刺激剂。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中，所述中性粒细胞刺激剂是重组粒细胞集落刺激因子蛋白(非格司亭)或聚乙二醇化重组粒细胞集落刺激因子蛋白。

35.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述药物活性部分是寡核苷酸。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中，所述寡核苷酸选自由以下组成的组：siRNA、适体、miRNA、免疫刺激性寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、以及向导RNA。

37.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述药物活性部分是伤口愈合剂。

38.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述第二部分是诊断部分。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中，所述诊断部分选自由以下组成的组：荧光染料、放射性同位素、适用于成像的造影剂、具有螯合剂的放射性核苷酸、以及光敏剂。

40.一种用于治疗对象的癌症的方法，所述方法包括：

以有效治疗所述癌症的量给患有所述癌症的所述对象施用根据权利要求1至35中任一项所述的组合物。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述癌症的特征在于，癌细胞相对于它们相应的非癌细胞具有增强的大型胞饮作用。

42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述癌症的特征在于，癌细胞在H-ras、N-ras、或K-ras中具有致癌突变。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中，所述组合物的所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述第二部分是药物活性部分，并且所述药物活性部分是癌症治疗剂。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述癌症治疗剂是抗代谢物、生物碱、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗肿瘤抗生素、DNA结合药物、微管靶向药物、毒素、抗增殖药物、DNA拮抗剂、放射性核素、热消融剂、以及PROTAC。

45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述生物碱选自由以下组成的组：多卡霉素、多西他赛、依托泊苷、伊立替康、紫杉醇、替尼泊苷、托泊替康、长春花碱、长春新碱、长春地辛、以及其类似物和衍生物。

46.根据权利要求44所述的方法，其中，所述烷化剂选自由以下组成的组：白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲密胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新美比星、培磷酰胺、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、替莫唑胺、以及其类似物和衍生物。

47.根据权利要求44所述的方法，其中，所述抗肿瘤抗生素选自由以下组成的组：阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、伊达比星、美诺立尔、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、吡柔比星、普卡霉素、泊菲霉素、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮杂卓、链黑霉素、链脲佐菌素、杀结核菌素、净司他丁、佐柔比星、以及其类似物和衍生物。

48.根据权利要求44所述的方法，其中，所述抗代谢物选自由以下组成的组：SN-38、二甲叶酸、依达曲沙、巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶罗呤、喷司他丁(2'-DCF)、拓优得、三甲曲沙、克拉屈滨、氟达拉滨、硫咪嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、乙嘧替氟、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、替加氟、羟基脲、氨基甲酸乙酯、以及其类似物和衍生物。

49.根据权利要求44所述的方法，其中，所述抗增殖药物选自由以下组成的组：醋葡醛内酯、安吖啶、比生群、喜树碱、地磷酰胺、秋水仙碱、地吖醌、二氟替康、依氟鸟氨酸、依利醋铵、依托格鲁、依托苷、芬维A胺、硝酸镓、羟基脲、片螺素D、氯尼达明、米替福新、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、鬼臼酸、2-乙基酰肼、甲基苄肼、丙亚胺、索布佐生、锗螺胺、替尼泊苷、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2,2-三氟乙基胺、以及其类似物和衍生物。

50.根据权利要求44所述的方法，其中，所述抗有丝分裂剂选自由以下组成的组：澳瑞他汀、美登木素、多拉司他汀、微管溶素、紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱、以及其类似物和衍生物。

51.根据权利要求44所述的方法，其中，所述癌症治疗剂是免疫调节剂。

52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述免疫调节剂选自：1型巨噬细胞刺激剂、2型巨噬细胞耗竭剂、T细胞刺激剂、树突状细胞刺激剂、以及中性粒细胞刺激剂。

53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述1型巨噬细胞刺激剂选自由以下组成的组：紫杉醇、集落刺激因子-1(CSF-1)受体拮抗剂、IL-10受体拮抗剂、Toll样受体(TLR)-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、以及TLR-9激动剂。

54.根据权利要求52所述的方法，其中，所述T细胞刺激剂是干扰素基因刺激因子(STING)激动剂。

55.根据权利要求52所述的方法，其中，所述树突状细胞刺激剂选自由以下组成的组：CpG寡核苷酸、咪喹莫特、喜树碱、秋水仙碱、鬼臼毒素、以及其衍生物。

56.根据权利要求52所述的方法，其中，所述中性粒细胞刺激剂是重组粒细胞集落刺激因子蛋白(非格司亭)或聚乙二醇化重组粒细胞集落刺激因子蛋白。

57.根据权利要求52所述的方法，其中，所述2型巨噬细胞耗竭剂选自由以下组成的组：氯膦酸盐、唑来膦酸、阿仑膦酸盐、以及曲贝替定。

58.一种用于对对象的肿瘤进行成像的方法，所述方法包括：

选择具有肿瘤的对象，以及

向所述对象施用根据权利要求38所述的组合物。

59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述非结合性蛋白质-药物缀合物的所述诊断部分选自由以下组成的组：荧光染料、放射性同位素、适用于成像的造影剂、具有螯合剂的放射性核苷酸、以及光敏剂。

60.根据权利要求58所述的方法，其中，所述肿瘤的特征在于，癌细胞相对于它们相应的非癌细胞具有增强的大型胞饮作用。

61.根据权利要求58所述的方法，其中，所述肿瘤的特征在于，癌细胞在H-ras、N-ras、或K-ras中具有致癌突变。

62.一种用于调节对象的免疫应答的方法，所述方法包括：

以有效调节所述对象的免疫应答的量向患有受益于免疫系统调节的病症的所述对象施用根据权利要求24至36中任一项所述的组合物。

63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述免疫调节剂是1型巨噬细胞刺激剂。

64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述1型巨噬细胞刺激剂选自由以下组成的组：紫杉醇、集落刺激因子-1(CSF-1)受体拮抗剂、IL-10受体拮抗剂、Toll样受体(TLR)-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、以及TLR-9激动剂。

65.根据权利要求62所述的方法，其中，所述免疫调节剂是2型巨噬细胞刺激剂。

66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述2型巨噬细胞刺激剂选自由以下组成的组：IL-33、IL-4受体激动剂、糖皮质激素、IL-10受体激动剂、IL-1受体激动剂。

67.根据权利要求62所述的方法，其中，所述免疫调节剂是T细胞刺激剂。

68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述T细胞刺激剂是干扰素基因刺激因子(STING)激动剂。

69.根据权利要求62所述的方法，其中，所述免疫调节剂是树突状细胞刺激剂。

70.根据权利要求69所述的方法，其中，所述树突状细胞刺激剂选自由以下组成的组：CpG寡核苷酸、咪喹莫特、喜树碱、秋水仙碱、鬼臼毒素、以及其衍生物。

71.根据权利要求62所述的方法，其中，所述免疫调节剂是中性粒细胞刺激剂。

72.根据权利要求71所述的方法，其中，所述中性粒细胞刺激剂是重组粒细胞集落刺激因子蛋白(非格司亭)或聚乙二醇化重组粒细胞集落刺激因子蛋白。

73.根据权利要求62所述的方法，其中，所述免疫调节剂是寡核苷酸。

74.根据权利要求73所述的方法，其中，所述寡核苷酸选自由以下组成的组：siRNA、适体、miRNA、免疫刺激性寡核苷酸、以及剪接转换寡核苷酸。

75.根据权利要求62所述的方法，其中，所述对象患有干扰素病并且所述免疫调节剂是1型干扰素拮抗剂。

76.根据权利要求62所述的方法，其中，所述对象具有伤口并且所述免疫调节剂是1型巨噬细胞刺激剂。

77.根据权利要求62所述的方法，其中，所述对象患有免疫耐受形式的癌症，并且所述免疫调节剂选自：1型巨噬细胞刺激剂、T细胞刺激剂、中性粒细胞刺激剂、以及树突状细胞刺激剂。

78.根据权利要求40至77中任一项所述的方法，其中，所述对象是人类。

79.根据权利要求40至77中任一项所述的方法，其中，所述施用是静脉内施用。

80.一种用于治疗对象的神经退行性病症的方法，所述方法包括：

向患有所述神经退行性病症的所述对象施用非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗所述神经退行性病症的药物活性部分。

81.一种用于治疗对象的炎性病症的方法，所述方法包括：

向患有所述炎性病症的所述对象施用非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗所述炎性病症的药物活性部分。

82.一种用于治疗对象的骨病的方法，所述方法包括：

向患有所述骨病的所述对象施用非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗所述骨病的药物活性部分。

83.一种用于治疗对象的传染性疾病或病症的方法，所述方法包括：

向患有所述传染性疾病的所述对象施用非结合性蛋白质-药物缀合物，其包含适用于治疗所述传染性疾病的药物活性部分。