JP2024510777A - Ｃｄ３抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用 - Google Patents

Ｃｄ３抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む、分化抗原群３（ＣＤ３）タンパク質に結合する抗原結合ドメイン、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、それらを作製及び使用する方法を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年３月２４日に出願された米国特許仮出願第６３／１６５，１８４号に対する優先権を主張するものである。上記出願の全容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、２０２２年３月１７日付で作成された、「ＪＢＩ６５１６ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」というファイル名のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、１，２８２ＫＢのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
本開示は、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを含む、分化抗原群３（cluster of differentiation 3、ＣＤ３）タンパク質に結合する抗原結合ドメイン、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、それらを作製及び使用する方法を提供する。
二重特異性抗体及び抗体断片は、腫瘍細胞を殺傷するために細胞溶解性Ｔ細胞を動員する手段として検討されている。しかしながら、多くのＴ細胞動員二重特異性抗体の臨床的使用は、好ましくない毒性、免疫原性の可能性、及び製造上の問題を含む課題によって制限されている。したがって、例えば、低い毒性及び好ましい製造プロファイルを含む、腫瘍細胞を殺傷するために細胞溶解性Ｔ細胞を動員する改善された二重特異性抗体に対する大きな必要性が存在する。
ヒトＣＤ３ Ｔ細胞抗原受容体タンパク質複合体は、６本の異なる鎖：ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０４２３４）、２本のＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０７７６６）、及び１本のＣＤ３ζ鎖ホモダイマー（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ２０９６３）（εγ：εδ：ζζ）で構成され、これは、Ｔ細胞受容体のα及びβ鎖に会合する。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を認識する抗原結合において重要な役割を果たす。ＣＤ３複合体はシグナル伝達を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらす。ＣＤ３は、免疫応答に必要である。
腫瘍細胞を殺傷するための細胞傷害性Ｔ細胞の再指向は、多数の腫瘍学的適応症のための重要な治療機序となっている（Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．，Ｊａｎｍａａｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，５８５－６０８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７３－０１９－００２８－１（２０１９））。Ｔ細胞活性化は、２シグナル仮説に従い、第１のシグナルは、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）複合体の、抗原提示細胞（antigen presenting cell、ＡＰＣ）上でのその同族ペプチドＭＨＣ複合体との結合によって供給され、第２のシグナルは、共刺激性又は共阻害性のいずれかであり得る（Ｃｈｅｎ，Ｌ．＆Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，２２７－２４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ３４０５（２０１３））。腫瘍は、多くの場合、Ｔ細胞ベースの免疫応答を誘導するのに十分な非自己抗原を提示することができず、Ｔ細胞結合性ｂｓＡｂ（Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ＢｓＡｂ、ｂｓＴＣＥ）が、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用の非存在下でＴ細胞性活性化を誘導することによって、この課題を克服することができる。Ｔ細胞受容体シグナル伝達は、ＴＣＲのＣＤ３サブユニットの細胞質領域におけるＩＴＡＭモチーフを介して起こる（Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．＆Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｍｅｅｔｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ－ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｃｙｃｌｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９，１－１０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１３．０７．０１２（２０１３））。特に、ＣＤ３εサブユニットは、１つのＴＣＲ複合体当たり２つのコピーで存在し、Ｔ細胞結合のための魅力的な抗原を示す。実際に、ＣＤ３εを標的とする多数のｂｓＴＣＥは、ｍＡｂが失敗した状況で臨床抗腫瘍有効性を示しており、いくつかの腫瘍標的に対する著しい医薬開発努力が進行中である（Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ｂｓＴＣＥの臨床開発のための３つの主要な課題は、１）全身又はオフ腫瘍のＴ細胞活性化を介したサイトカイン放出と関連する急速かつ重度である毒性の可能性、２）高い効力及び著しい治療指数を有するｂｓＴＣＥの製剤化及び投薬の実用的課題、並びに３）腫瘍浸潤Ｔ細胞（tumor-infiltrating T cell、ＴＩＬ）がｂｓＴＣＥによる過剰活性化に応答してアポトーシスを受ける、再活性誘導性Ｔ細胞死の可能性、である（Ｗｕ，Ｚ．＆Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎ．Ｖ．Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｔ－ＢｓＡｂ）：Ｆｒｏｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １８２，１６１－１７５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｈａｒｍｔｈｅｒａ．２０１７．０８．００５（２０１８））。
まとめると、これらの観察は、より有利であり、がんを治療するために使用することができる新規なＣＤ３特異的結合タンパク質が当技術分野において必要とされていることを示唆している。
本開示は、例えば、腫瘍抗原に対する高い親和性及びＴ細胞に対する弱い親和性を有する新規なＣＤ３ε特異性結合タンパク質を提供することによって、この必要性を満たす。本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質は、高い熱安定性、低減された脱アミド化リスクを有するように生成され、免疫原性を減少させるためにヒト化された。
ある特定の実施形態では、本開示は、分化抗原群３ε（cluster of differentiation 3ε、ＣＤ３ε）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質を提供し、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、分化抗原群３ε（ＣＤ３ε）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質を含み、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、
配列番号５５の重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region、ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号４８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸は、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、残基の番号付けは、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質も提供する。
他の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、
約５～５０個のアミノ酸、
約５～４０個のアミノ酸、
約１０～３０個のアミノ酸、又は
約１０～２０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３～３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨ及び配列番号５９、５８、又は５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ
配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号９６～１２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、単離タンパク質は、多重特異性タンパク質である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、二重特異性タンパク質である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、三重特異性タンパク質である。
他の実施形態では、単離タンパク質は、免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）定常領域又はそのＩｇ定常領域の断片を更に含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートする。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートする。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、第２のリンカー（second linker、Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートする。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３～３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３ε以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。
他の実施形態では、細胞抗原は、腫瘍関連抗原である。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、タンパク質のＦｃγ受容体（Fcγ receptor、ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
他の実施形態では、タンパク質は、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
本開示はまた、単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、単離タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本開示はまた、ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本開示はまた、単離タンパク質を産生する方法であって、タンパク質が発現される条件で宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたタンパク質を収集することと、を含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の単離タンパク質を対象に投与して、がんを治療することを含む、方法も提供する。
本開示はまた、単離タンパク質に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
本開示はまた、配列番号１２７～１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、配列番号２２４の抗体重鎖及び配列番号２２６の抗体軽鎖を含む単離タンパク質を提供する。
発明の概要、並びに以下の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて読むことで、更に理解される。開示される抗体及び方法を説明する目的で、抗体及び方法の例示的な実施形態を図面中に示すが、ただし、抗体及び方法は、開示される特定の実施形態に限定されるものではない。
ＥＬＩＳＡによって決定された、ｓｃＦｖ形式のマウスＣｒｉｓ－７（ＣＤ３Ｂ１１２７及びＣＤ３１１２８）配列及びヒト生殖系列移植Ｃｒｉｓ－７バリアント配列の結合を示す。 マウスＶＬと対にしたヒト化ＶＨについて（２Ａ）又は、マウスＶＨと対にしたヒト化ＶＬについて（２Ｂ）、６０℃の熱ショック後に、ＥＬＩＳＡによって決定された、少なくとも７５％の結合を保持するＥ．ｃｏｌｉ発現ｓｃＦｖクローンの％を示し、Ｘ軸上の数字は、残基位置を示す。 マウスＶＬと対にしたヒト化ＶＨについて（２Ａ）又は、マウスＶＨと対にしたヒト化ＶＬについて（２Ｂ）、６０℃の熱ショック後に、ＥＬＩＳＡによって決定された、少なくとも７５％の結合を保持するＥ．ｃｏｌｉ発現ｓｃＦｖクローンの％を示し、Ｘ軸上の数字は、残基位置を示す。 ヒトからマウスへの復帰突然変異を含有するヒト化ＣＤ３特異的ｓｃＦｖの結合能力のＥＬＩＳＡベースの比較を示す。 ＥＬＩＳＡによって決定された、ｓｃＦｖとしてフォーマット化されたＣＤ３Ｂ２０３０バリアントの組換えＣＤ３（ＴＲＣＷ５）への結合を示し、「ＮｔｏＸ」は、ＶＨ（配列番号５５）の位置１０６においてなされるアミノ酸置換を示し、式中、「Ｘ」は、図に示されるアミノ酸である。 ヒトＣＤ３εに結合したＣｒｉｓ７の錯体（二価又は一価のいずれか）、又はヒトＣＤ３εに結合したＯＫＴ３の錯体（ＣＤ３ε：ＯＫＴ３）について測定された、水素－重水素交換質量分析（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry、ＨＤＸ－ＭＳ）を使用して決定された水素－重水素交換速度を示す（ＣＤ３ε（配列番号１）の断片を示す）。ＣＤ３ε単独と比較して、抗体の存在において重水素化レベルが＞３０％減少したセグメントを下線で示す。図５は、出現順に、それぞれ、配列番号１５０８、１５０９、１５０９、及び１５０９を開示する。 例示的なＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の描出である。 ＨＬＢ－１細胞株（図７Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図７Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図７Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図７Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合親和性である。丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＨＬＢ－１細胞株（図７Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図７Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図７Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図７Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合親和性である。丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＨＬＢ－１細胞株（図７Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図７Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図７Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図７Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合親和性である。丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＨＬＢ－１細胞株（図７Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図７Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図７Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図７Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合親和性である。丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＨＬＢ－１細胞株（図８Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図８Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図８Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図８Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合親和性である。黒丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒三角は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。白三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、白菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、アスタリスクは、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９に対応し、Ｘは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＨＬＢ－１細胞株（図８Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図８Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図８Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図８Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合親和性である。黒丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒三角は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。白三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、白菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、アスタリスクは、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９に対応し、Ｘは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＨＬＢ－１細胞株（図８Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図８Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図８Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図８Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合親和性である。黒丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒三角は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。白三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、白菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、アスタリスクは、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９に対応し、Ｘは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＨＬＢ－１細胞株（図８Ａ）、ＯＣＩ－ＬＹ１０細胞株（図８Ｂ）、Ｃａｒｎａｖａｌ細胞株（図８Ｃ）、及びＷＩＬＬ－２細胞株（図８Ｄ）における選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合親和性である。黒丸は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒三角は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、黒菱形は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。白三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、白菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、アスタリスクは、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９に対応し、Ｘは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における３つの選択されたｂｓＡｂの結合動態である（図９Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＤＬＢＣＬ細胞株に対する選択されたＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の結合動態である。３００ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ａ）。６０ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｂ）。１２ｎｍでのＨＢＬ－１細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｃ）。３００ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｄ）。６０ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｅ）。１２ｎｍでのＣａｒｎａｖａｌ細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｆ）。３００ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｇ）。６０ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｈ）。１２ｎｍでのＯＣＩ－ＬＹ１０細胞における選択された抗体の結合動態である（図１０Ｉ）。逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂ対照に対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂ対照に対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂ対照に対応する。三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、四角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、アスタリスクは、対照ヌル三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９８に対応する。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体の一次汎Ｔ細胞結合である。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ２２１８３７における選択された抗体の結合動態である（図１１Ａ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３１２における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｂ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３３５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｃ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ１６０１１５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｄ）。丸は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、逆三角、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応する。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体の一次汎Ｔ細胞結合である。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ２２１８３７における選択された抗体の結合動態である（図１１Ａ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３１２における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｂ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３３５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｃ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ１６０１１５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｄ）。丸は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、逆三角、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応する。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体の一次汎Ｔ細胞結合である。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ２２１８３７における選択された抗体の結合動態である（図１１Ａ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３１２における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｂ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３３５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｃ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ１６０１１５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｄ）。丸は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、逆三角、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応する。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体の一次汎Ｔ細胞結合である。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ２２１８３７における選択された抗体の結合動態である（図１１Ａ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３１２における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｂ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ３２９３３５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｃ）。汎Ｔ細胞ドナー株Ｄ１６０１１５における選択された抗体の結合動態である（図１１Ｄ）。丸は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、四角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、逆三角、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、菱形は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応する。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞傷害性である。ＨＥＬ Ｔ細胞株における選択された抗体の細胞傷害性である（図１２Ａ）。Ｋ５６２ Ｔ細胞株における選択された抗体の細胞傷害性である（図１２Ｂ）。網掛けの丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、透明な白丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、黒い四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応し、白い四角は、Ｃ９２３Ｂ９８ ｂｓＡｂに対応する。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞傷害性である。ＨＥＬ Ｔ細胞株における選択された抗体の細胞傷害性である（図１２Ａ）。Ｋ５６２ Ｔ細胞株における選択された抗体の細胞傷害性である（図１２Ｂ）。網掛けの丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ７４に対応し、透明な白丸は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ９９に対応し、三角は、三重特異性抗体Ｃ９２３Ｂ３８に対応し、逆三角は、７９Ｃ３Ｂ６４６ ｂｓＡｂに対応し、菱形は、７９Ｃ３Ｂ６５１ ｂｓＡｂに対応し、黒い四角は、７９Ｃ３Ｂ６０１ ｂｓＡｂに対応し、白い四角は、Ｃ９２３Ｂ９８ ｂｓＡｂに対応する。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性構築物は、Ｂ細胞の細胞傷害性及びＴ細胞の活性化を媒介した。Ｂ細胞（図１３Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞傷害性をリード抗体について示す。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性構築物は、Ｂ細胞の細胞傷害性及びＴ細胞の活性化を媒介した。Ｂ細胞（図１３Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞傷害性をリード抗体について示す。 ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性構築物は、Ｂ細胞の細胞傷害性及びＴ細胞の活性化を媒介した。Ｂ細胞（図１３Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞傷害性をリード抗体について示す。 ＰＳ３Ｂ１３５２（上）及びＰＳ３Ｂ１３５３（下）に対するＰＳＭＡのＨＤＸ－ＭＳエピトープマッピングを示す。Ｇは、グリコシル化部位である。黒枠は、エピトープであり、灰色は、推定エピトープである。白枠は、抗体の存在下で重水素化レベルの変化がない／ほとんどないことを示す。枠のない残基は、残基をカバーするペプチドが存在しないか、又は残基がペプチドの最初の２つの残基であるため、ＨＤＸ挙動がモニタされなかったことを示す。ＰＳ３Ｂ１３５２及びＰＳ３Ｂ１３５３のエピトープは同一である。エピトープは、残基５９７～５９８（ＣＲ）であるが、これは、セグメント５９７～５９８が結合時に有意に保護されたためである（重水素化レベルの平均差＞１０％）。エピトープは、残基５９９（Ｄ）、６０２～６０３（ＶＶ）、及び６０５（Ｒ）を含むが、これらは、結合時にわずかに保護され（重水素化レベルの平均差５％～１０％）、より長い時点をモニタした場合により大きな保護を示す可能性が高いためである。エピトープは、これらの４つのセグメントより大きくてもよいが、これは、５９３～５９４（ＬＰ）、５９５（Ｆ）、５９６（Ｄ）、６００（Ｙ）、６０１（Ａ）、６０４（Ｌ）、６０６～６０７（ＫＹ）、６０７～６０９（ＹＡＤ）、及び６１０～６１２（ＫＩＹ）など、これらの４つのセグメントの周囲のセグメントは、使用した時間ウィンドウ内で全く交換せず、より長い時間点をモニタすれば保護することができるためである。図１４は、配列番号１５１０を開示する。 Ｘ線結晶構造上にオーバーレイされたＰＳＭＡのＨＤＸ－ＭＳ同定エピトープを示す。青色：エピトープ、スカイブルー：推定エピトープ、及びシアン：可能性のあるエピトープ。 汎Ｔ細胞結合アッセイを示す。ヒト汎Ｔ細胞を様々な濃度のＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体で処理し、３７℃で３０分間インキュベートした後、フローサイトメトリによるＣＤ３細胞表面発現分析を行った。 Ｃ４－２Ｂヒト前立腺腫瘍細胞のＰＳＭＡリガンド結合の４パラメータ関数の非線形回帰適合を示す。 標的細胞結合アッセイを示す。Ｃ４－２Ｂヒト前立腺腫瘍細胞を様々な濃度のＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体で処理し、３７℃で３０分間インキュベートした後、フローサイトメトリによるＰＳＭＡ細胞表面発現分析を行った。 ＰＳＭＡの内在化を示す。ヒトＣ４－２Ｂ前立腺腫瘍細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ－ｆｌｕｏｒ－ｐＨ Ｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＤｙｅにコンジュゲートしたＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間インキュベートした。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイにおいて評価された二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。（Ａ）ＰＳ３Ｂ１３５２、（Ｂ）ＰＳ３Ｂ１３５６、（Ｃ）ＰＳ３Ｂ１３５３、（Ｄ）ＰＳ３Ｂ１３５７、（Ｅ）ＰＳ３Ｂ１３５４、（Ｆ）ＰＳ３Ｂ９３７、（Ｇ）ＰＳ３Ｂ１３５５、及び（Ｈ）ＰＳ３Ｂ１３５８についてのデータを示す。 Ｔ細胞再指向死滅アッセイを示す。正常ヒトＰＢＭＣを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ赤色核色素で形質導入したＣ４－２Ｂヒト前立腺腫瘍細胞と組み合わせ、ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体で５日間処理した。 二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体によるサイトカイン誘導を示す。単離された汎Ｔ細胞を、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と、二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗Ｔ細胞再指向抗体の存在下で、示された時点で共インキュベートした。ＩＦＮ－ガンマ濃度を、示された時点で収集した上清から測定した。
発明の詳細な説明
本明細書に引用される、特許及び特許出願を含むがそれらに限定されない全ての刊行物は、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用することができるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。
リストが提示される場合、別途記載されない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」という移行句は、特許用語において概ね受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲を制限する。「備える／含む」という語句（又はその同義語）を伴って記載される実施形態はまた、「からなる」及び「から本質的になる」を伴って独立して記載される実施形態として提供する。
「約」は、当業者によって求められた特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において、実施例又は本明細書の他の箇所に別途明示的に記載されない限り、「約」は、当該技術分野の慣行による１標準偏差、又は５％までの範囲のうちのいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
「活性化」又は「刺激」又は「活性化された」又は「刺激された」は、活性化マーカーの発現、サイトカイン産生、増殖、又は標的細胞の細胞傷害の媒介をもたらす、細胞の生物学的状態の変化の誘導を指す。細胞は、一次刺激シグナルによって活性化され得る。共刺激シグナルは、一次シグナルの大きさを増幅し、初期刺激後の細胞死を抑制することができ、その結果、より耐久性のある活性化状態、ひいてはより高い細胞傷害能をもたらす。「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞及び／若しくはＮＫ細胞の増殖、並びに／又は鍵となる分子の上方制御若しくは下方制御を引き起こすシグナルを指す。
「代替足場」は、立体配座許容度が高い可変ドメインに会合する構造化コアを含有する、単鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、足場の完全性を損なうことなく、導入される多型を許容するため、可変ドメインは、特異的抗原に結合するように遺伝子操作及び選択され得る。
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」、又は「ＡＤＣＣ（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）」とは、抗体でコーティングされた標的細胞と、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ）、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との、エフェクター細胞上で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介した相互作用に依存する細胞死を誘導する機序を指す。
「抗体依存性細胞貪食作用」又は「ＡＤＣＰ（Antibody-dependent cellular phagocytosis）」は、マクロファージ又は樹状細胞などの貪食細胞による内在化によって、抗体でコーティングされた標的細胞を排除する機序を指す。
「抗原」は、免疫応答を媒介することができる抗原結合ドメイン又はＴ細胞受容体が結合することができる任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、それらの部分、又はそれらの組み合わせ）を指す。例示的な免疫応答には、抗体産生、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分を有する流体、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、死滅若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体サンプルからの遺伝子によって発現し得るか、サンプルから合成され得るか、又はサンプルから精製され得る。
「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原に結合するタンパク質の一部分を指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝的に操作されたポリペプチドであってもよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの部分、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（domain antibody、ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合する代替足場、並びに抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質が挙げられる。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結して、ＶＨ及びＶＬドメインが別々の一本鎖により発現された場合にＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又はダイアボディを形成することができる、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を遺伝子操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又は代替足場にコンジュゲートさせてもよい。
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（light chain constant region、ＣＬ）で構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
「二重特異性」とは、２つの異なる抗原、又は同じ抗原内の２つの異なるエピトープに特異的に結合する分子（例えば、タンパク質又は抗体）を指す。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
「二重特異性抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３抗体」、「ＰＳＭＡ／ＣＤ３抗体」、「ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体」、「抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３タンパク質」などは、ＰＳＭＡ及びＣＤ３に結合し、かつＰＳＭＡに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、を含む抗体を指す。ＰＳＭＡ及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体は、ＰＳＭＡ又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってもよい。
「二重特異性抗ＣＤ７９ｂ／抗ＣＤ３抗体」、「抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３」、「ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体」、「ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３抗体」、「抗ＣＤ７９ｂ／抗ＣＤ３タンパク質」などは、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に結合し、かつＣＤ７９ｂに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、を含む抗体を指す。ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３抗体は、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってもよい。
「がん」は、身体における異常細胞の制御されていない成長を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。制御されていない細胞分裂及び成長は、隣接組織を浸潤する悪性腫瘍の形成をもたらし、リンパ系又は血流を介して身体の遠位部分にも転移し得る。「がん」又は「がん組織」は、腫瘍を含み得る。
「分化抗原群３ε」又は「ＣＤ３ε」とは、「Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖」又は「Ｔ３Ｅ」とも呼ばれる、知られているタンパク質を指す。ＣＤ３εは、ＣＤ３－ガンマ、ＣＤ３－デルタ、及びＣＤ３－ゼータ、並びにＴ細胞受容体アルファ／ベータ、及びガンマ／デルタヘテロダイマーと一緒に、Ｔ細胞受容体－ＣＤ３複合体を形成する。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を認識する抗原結合において重要な役割を果たす。ＣＤ３複合体はシグナル伝達を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらす。ＣＤ３は、免疫応答に必要である。完全長ＣＤ３εのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＣＤ３εの細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書全体を通して、「ＣＤ３ε特異的」又は「ＣＤ３εに特異的に結合する」又は「抗ＣＤ３ε抗体」は、ＣＤ３ε細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号２）に特異的に結合する抗体を含む、ＣＤ３εポリペプチド（配列番号１）に特異的に結合する抗体を指す。
配列番号１（ヒトＣＤ３イプシロン）：
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ
配列番号２（ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメイン）
ＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤ
「分化抗原群ＣＤ７９Ｂタンパク質」又は「ＣＤ７９ｂ」は、Ｂ細胞抗原受容体（B-cell antigen receptor、ＢＣＲ）シグナル伝達成分Ｉｇβを指す。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ３２６５１．１、ＥＡＷ９４２３２．１、ＡＡＨ０２９７５．２、ＮＰ＿０００６１７．１、及びＮＰ＿００１０３５０２２．１から検索可能である。完全長ヒトＣＤ７９ｂのアミノ酸配列を以下に示す（配列番号２４１）。配列は、細胞外ドメイン（残基２９～１５９）及び細胞質ドメイン（残基１８１～２２９）を含む。
ＭＡＲＬＡＬＳＰＶＰＳＨＷＭＶＡＬＬＬＬＬＳＡＥＰＶＰＡＡＲＳＥＤＲＹＲＮＰＫＧＳＡＣＳＲＩＷＱＳＰＲＦＩＡＲＫＲＧＦＴＶＫＭＨＣＹＭＮＳＡＳＧＮＶＳＷＬＷＫＱＥＭＤＥＮＰＱＱＬＫＬＥＫＧＲＭＥＥＳＱＮＥＳＬＡＴＬＴＩＱＧＩＲＦＥＤＮＧＩＹＦＣＱＱＫＣＮＮＴＳＥＶＹＱＧＣＧＴＥＬＲＶＭＧＦＳＴＬＡＱＬＫＱＲＮＴＬＫＤＧＩＩＭＩＱＴＬＬＩＩＬＦＩＩＶＰＩＦＬＬＬＤＫＤＤＳＫＡＧＭＥＥＤＨＴＹＥＧＬＤＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩＶＴＬＲＴＧＥＶＫＷＳＶＧＥＨＰＧＱＥ（配列番号２４１）。
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ（Complement-dependent cytotoxicity）」は、標的に結合したタンパク質のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合し、これを活性化し、次に、補体カスケードを活性化して標的細胞死をもたらす、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面上に補体成分の沈着を生じさせ得、これが、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＣＤＣを容易にする。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体の領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５，１９９６）などの様々な記述を使用して定義することができる。様々な記述と、可変領域の番号付けとの対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３０９：６５７－７０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ、ＩＭＧＴ）データベース、ウェブリソース（例えば、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ＞から検索することができる）参照）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを記述することができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、明細書で別途明示的に記載されない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
「減少する」、「低下する」、「低くする」、「低減する」、又は「軽減する」は、概して、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、試験分子が低減された応答（すなわち、下流効果）を媒介する能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。減少は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。
「分化」は、細胞の能力若しくは増殖を減少させるか、又は細胞をより発達的に制限された状態に移動させる方法を指す。
「コードする」又は「コードすること」は、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）か、又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異性配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞又は他の生物系において、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳がタンパク質を産生する場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖とはいずれも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするとして言及され得る。
「増強する」、「促進する」、「増加させる」、「拡大する」、又は「改善する」は、概して、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、より大きな応答（すなわち、下流効果）を媒介する試験分子の能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。
「エピトープ」とは、抗体、又はその抗体結合部分が特異的に結合する抗原の一部分を指す。エピトープは、典型的には、化学的に活性な（極性、非極性、又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。抗体「エピトープ」は、エピトープを識別するために使用する方法論によって異なる。
「拡大」は、細胞分裂及び細胞死の結果を指す。
「発現する」及び「発現」は、細胞内又はインビトロで起こる周知の転写及び翻訳を指す。したがって、発現産物、例えば、タンパク質は、細胞によって又はインビトロで発現し、細胞内タンパク質であっても、細胞外タンパク質であっても、膜貫通タンパク質であってもよい。
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成された生物系で利用することができるベクターを指す。
「ｄＡｂ」又は「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインで構成される抗体断片を指す（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６（１９８９））。
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆ（ａｂ’）２」又は「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
「Ｆｄ」又は「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」は、抗体の単一のアーム由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成される抗体断片を指す。
「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメインで構成され、重鎖定常ドメインは、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
「遺伝子修飾」は、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを指す。導入された遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来」遺伝子又は配列と呼ばれる場合もあり、開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、又は細胞の遺伝機序によって使用される他の配列などのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した調節配列又は制御配列を含んでもよい。遺伝子又は配列は、既知の機能を有しない非機能的配列を含んでもよい。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「遺伝的に操作されている」。宿主細胞に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同じ属若しくは種の細胞を含む任意の起源、又は異なる属若しくは種に由来し得る。
「異種」は、自然界では互いに対して同じ関係で見られない、２つ若しくは３つ以上のポリヌクレオチド又は２つ若しくは３つ以上のポリペプチドを指す。
「異種ポリヌクレオチド」は、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原をコードする、天然には存在しないポリヌクレオチドを指す。
「異種ポリペプチド」は、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原ポリペプチドを含む、天然には存在しないポリペプチドを指す。
「宿主細胞」は、異種核酸を含有する任意の細胞を指す。例示的な異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されたときに免疫応答が最小限になるように最適化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、その定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットである。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
「～と組み合わせて」は、２つ又は３つ以上の治療剤を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に、又は単剤として任意の順序で順次に、対象に投与することを意味する。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」又は「細胞質シグナル伝達ドメイン」とは、分子の細胞内部分を指す。これは、タンパク質の機能的部分であり、セカンドメッセンジャを生成することにより定められたシグナル伝達経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用する、又はかかるメッセンジャに応答することによりエフェクターとして機能することによって作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。
「単離された」は、組換え細胞などにおいて分子が産生される系の他の成分から離して実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されているタンパク質を指す。「単離された」は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
「調節する」は、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較したときに、増強された又は低減された応答を媒介する（すなわち、下流効果）試験分子の増強された又は減少した能力のいずれかを指す。
「モノクローナル抗体」とは、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又はアミノ酸の異性化若しくは脱アミド、メチオニンの酸化、又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなどの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である、抗体分子の実質的に均質な母集団から得られた抗体、すなわち、集団を構成する個別の抗体を意味する。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってもよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってもよく、一価、二価、又は多価であってもよい。
「多重特異性」は、２つ若しくは３つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ若しくは３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する、抗体などの分子を指す。多重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
「ナチュラルキラー細胞」及び「ＮＫ細胞」は、本明細書では互換的かつ同義的に使用される。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、死滅させる能力、腫瘍細胞又はＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を死滅させる能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
「動作可能に連結された」及び類似の語句は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置された核酸配列又はアミノ酸配列の動作上の連結を指す。例えば、動作可能に連結されたプロモータ、エンハンサエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、並びにターミネータ配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらし、場合によっては、ポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。動作可能に連結されたペプチドは、ペプチドの機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するペプチドを指す。
「パラトープ」という用語は、抗原の結合に関与し、抗原と相互作用する残基を含む抗体分子のエリア又は領域を指す。パラトープは、高次構造的空間単位を形成する連続的及び／又は不連続なアミノ酸で構成され得る。所与の抗体のパラトープは、様々な実験及び計算方法を使用して、様々なレベルで詳細に定義及び特性評価することができる。実験方法は、水素／重水素交換質量分析（hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry、ＨＸ－ＭＳ）を含む。パラトープは、用いられるマッピング方法に応じて異なって定義される。
「医薬的組み合わせ」は、一緒に又は別々に投与される２つ若しくは３つ以上の活性成分の組み合わせを指す。
「医薬組成物」は、活性成分と医薬的に許容される担体とを組み合わせて得られる組成物を指す。
「医薬的に許容される担体」又は「賦形剤」は、対象に対して毒性のない、活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。例示的な医薬的に許容される担体は、緩衝液、安定剤、又は防腐剤である。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む、合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。
疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防」、又は「予防法」は、対象において障害が発生するのを防ぐことを意味する。
「増殖」は、細胞の対称的又は非対称的な分裂のいずれかである細胞分裂の増加を指す。
「プロモータ」は、転写を開始させるために必要な最小配列を指す。プロモータはまた、それぞれ転写を増強又は抑制するエンハンサ又はリプレッサエレメントを含み得る。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用され、各々がペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基で構成されている１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、モノマーであってもよく、又は同一若しくは異なる２つ若しくは３つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であってもよい。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化又はビオチン化などの翻訳後修飾によって修飾されたタンパク質であり得る。タンパク質は、抗体であっても、抗体の抗原結合断片を含んでもよい。タンパク質は、組換え発現させてもよい。
「前立腺特異的膜抗原」又は「ＰＳＭＡ」は、ある特定の細胞上で発現されるＩＩ型膜タンパク質を指す。ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列を配列番号２４０に示す。配列番号２４０のうち、細胞外ドメインは残基４４～７５０にわたり、膜貫通ドメインは残基２０～４３にわたり、細胞質ドメインは残基１～１９にわたる。
配列番号２４０
ＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
「組換え体」は、組換え手段によって調製、発現、創出、又は単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。
「調節エレメント」は、核酸配列の発現のある側面を制御する任意のシス又はトランス作用性遺伝要素を指す。
「再発性」とは、治療薬による以前の治療後の改善期間後に疾患又は疾患の徴候及び症状が再開することを指す。
「難治性」とは、治療に応答しない疾患を指す。難治性疾患は、治療前若しくは治療開始時に治療に抵抗性であり得るか、又は難治性疾患は、治療中に抵抗性疾患となり得る。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指し、ＶＬ及びＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を、例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を基準として、いずれの順序で有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでも、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
「（ｓｃＦｖ）２」又は「タンデムｓｃＦｖ」又は「ビス－ｓｃＦｖ」断片とは、２つの軽鎖可変領域（ＶＬ）と、２つの重鎖可変領域（ＶＨ）と、を含む融合タンパク質を指し、２つのＶＬ及び２つのＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。２つのＶＬ及び２つのＶＨは、ペプチドリンカーによって融合されて、二価分子ＶＬＡ－リンカー－ＶＨＡ－リンカー－ＶＬＢ－リンカー－ＶＨＢを形成して、２つの異なる抗原又はエピトープに同時に結合することができる２つの結合部位を形成する。
「特異的に結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合すること」、又は「結合する」は、タンパク質性分子が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約１×１０－７Ｍ以下、例えば約５×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、典型的には、ＫＤは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫＤよりも少なくとも１００倍小さい。本明細書に記載の前立腺ネオ抗原の文脈において、「特異的結合」は、タンパク質性分子が、前立腺ネオ抗原がそのバリアントである野生型タンパク質に検出可能には結合することなく、前立腺ネオ抗原に結合することを指す。
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類が挙げられる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は、互換的であり、本明細書では同義的に使用される。Ｔ細胞には、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、メモリＴ細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（T helper、Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。また、「ＮＫＴ細胞」も含まれ、これは、半インバリアントαβＴ細胞受容体を発現するだけでなく、ＮＫ１．１などの典型的にはＮＫ細胞と関連する様々な分子マーカーも発現する、Ｔ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、及びＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ Ｉｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、それらの表面に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットの特殊な集団を指し、ＴＣＲがα及びβ－ＴＣＲ鎖と表記される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であること、及び強固なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たす、Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、かつ、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性調節性Ｔ細胞も含み得る。
本明細書において互換的に使用される「治療有効量」又は「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってもよい。有効な治療薬又は治療薬の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の低減、腫瘍の増殖の停止若しくは鈍化、及び／又は体内の他の場所へのがん細胞の転移の非存在が含まれる。
「形質導入」は、ウイルスベクターを使用する、外来核酸の細胞への導入を指す。
がんなどの疾患又は障害を「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、以下のうちの１つ若しくは２つ以上を達成することを指す：障害の重症度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害の特徴的な症状の悪化を阻害する、以前障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害の症状を有していた対象における症状の再発を制限若しくは予防する。
「腫瘍細胞」又は「がん細胞」は、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自発的な又は誘導された表現型の変化を有するがん性、前がん性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は発がん物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換／がんは、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される。
「バリアント」、「変異体」、又は「変化した」は、１つ若しくは２つ以上の修飾、例えば、１つ若しくは２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載されない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
Ｉｇ定常領域の変異は、以下のように称される。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、１つの免疫グロブリン定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を指す。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗは、１つの多量体タンパク質中に存在する、第１のＩｇ定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異並びに第２のＩｇ定常領域におけるＴ３９４Ｗ変異を指す。
「ＶＨＨ」とは、重鎖ホモ二量体によって排他的に構成される単一ドメイン抗体又はナノボディを指す。ＶＨＨ単一ドメイン抗体は、従来のＦａｂ領域の軽鎖及び重鎖のＣＨ１ドメインを欠く。
別途記載されない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載されない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
Figure 2024510777000002
ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単一特異性又は多重特異性タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれを作製及び使用する方法を提供する。本明細書で同定されたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、いくつかの有利な特性を示した。第１に、ＣＤＲ移植のためにＩＧＨＶ１－６９＊０２－ＩＧＨＪ１－０１及びＩＧＫＶ３－１１＊０２－ＩＧＫＪ４－０１生殖系列を選択することで、マウスＣｒｉｓ－７親抗体と比較して増強された結合が確実となった。第２に、ヒトからマウスへの突然変異を導入すると、選択されたクローンは、５５℃、６０℃、及び／又は６５℃を含む熱ショック後に結合を保持することによって改善された熱安定性を示し、これは改善された製造可能性及び貯蔵をもたらす特徴を示した。これは、マウスＣｒｉｓ－７親抗体には当てはまらず、本発明のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと比較した場合、熱ショック後に組換えＣＤ３及びＴ細胞に対してとにかく最小限の結合を示した。第３に、翻訳後修飾（Post Translational Modification、ＰＴＭ）リスクは、配列番号５５、５４、及び４８における位置Ｎ１０６で置換することによって軽減され、したがって、未修飾のままである場合、活性の喪失をもたらし得るＡｓｎ脱アミド化を防止した。残基Ｎ１０６における遺伝子操作された位置は、ＨＣＤＲ３内にあった。ＨＣＲ３内のこの位置に突然変異があっても、抗体は、抗原に強固に結合する能力を依然として保持しながら、追加の有益な特性（例えば、改善された熱安定性）も有していた。
本開示はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質を提供する。配列番号８６（ＰＱＶＨＹＤＹＸＧＦＰＹ、ＸはＱ、Ａ、Ｇ、又はＳであり得る）は、「Ｘ」の代わりのアミノ酸に応じて、改善された熱安定性、低減された脱アミド化リスク、及びＣＤ３に対する様々な親和性を含む、改善された特性を示すバリアントを包含するＨＣＤＲ３属のアミノ酸を表す。例えば、配列番号８６のＸがＱ又はＡのいずれかで置換されている場合、ＣＤ３親和性は、親（Ｘの代わりにＮを有する）と同様であり、ＸがＧ又はＳのいずれかで置換されている場合、ＣＤ３親和性は、Ｑ又はＡと比較して低い。これは、対象におけるサイトカイン応答を軽減する可能性、及び多重特異性タンパク質又は二重特異性タンパク質の腫瘍分布を増強する可能性のために、本開示のＣＤ３ε結合ドメインを含む多重特異性タンパク質又は二重特異性タンパク質のＴ細胞再指向能力の活性を調整する有利な能力を提供した。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号５５の重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号４８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸が、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、残基の番号付けが、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨと、配列番号５９、５８、又は５６のＶＬと、を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、又は
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む、単離タンパク質を提供する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、（ｓｃＦｖ）２である。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２である。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｄである。
他の実施形態では、ＣＤ３ε抗原結合ドメインは、ｄＡｂである。
他の実施形態では、ＣＤ３ε抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
ＣＤ３ε結合ｓｃＦｖ
ＣＤ３εに結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖフォーマットで遺伝子操作され得る。また、本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ。ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ。ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ。ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、又はＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨなどのｓｃ（ＦＶ）２構造を生成するために使用され得る。
本明細書で同定されたＶＨ及びＶＬドメインは、ｓｃＦｖフォーマットに組み込むことができ、得られたｓｃＦｖのＣＤ３εへの結合及び熱安定性は、既知の方法を使用して評価することができる。結合は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、若しくはＫｉｎＥｘＡ機器、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に既知の競合的結合アッセイを使用して評価することができる。結合は、精製されたｓｃＦｖ又はＥ．ｃｏｌｉ上清、又は発現したｓｃＦｖを含有する溶解細胞を使用して評価することができる。試験ｓｃＦｖのＣＤ３εに対する親和性の測定値は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及びその他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、典型的には、標準的な条件、及び標準化緩衝液を用いて行われる。熱安定性は、５０℃、５５℃、又は６０℃などの高温で、５分（ｍｉｎ）、１０分、１５分、２０分、２５分、又は３０分などの期間、試験ｓｃＦｖを加熱し、試験ｓｃＦｖのＣＤ３εへの結合を測定することによって評価することができる。非加熱ｓｃＦｖサンプルと比較したときに、ＣＤ３εと同等の結合を保持しているｓｃＦｖが、熱安定性であると称される。
組換え発現系にて、リンカーはペプチドリンカーであり、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、及びＴｈｅである。リンカーは、ＣＤ３εへの結合などの所望の活性を保持するように、互いに対して正確な高次構造を形成するような方式でＶＨ及びＶＬを連結させるのに適切である長さを有している必要がある。
リンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。他の実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１６～１９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１１個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１２個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１３個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１４個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２１個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２２個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２３個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２４個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３１個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３２個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３３個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３４個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに他の柔軟なリンカーである。
他のリンカー配列は、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含み得る。代替的に、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールと、ポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む様々な非タンパク質性ポリマーは、リンカーとしての使用が見出され得る。使用され得る例示的なリンカーを表２に示す。追加のリンカーは、例えば、国際公開第２０１９／０６０６９５号に記載されている。
Figure 2024510777000003
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、Ｌ１、及びＶＨを含む（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）。
他の実施形態では、Ｌ１は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、
配列番号５５の重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号４８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸は、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、残基の番号付けは、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨ及び配列番号５９、５８、又は５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、又は１２６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。
ＣＤ３εに結合する他の抗原結合ドメイン
ＣＤ３εに結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖフォーマットに遺伝子操作することができ、それらのＣＤ３εへの結合及び熱安定性は、本明細書に記載されるアッセイを使用して評価することができる。ある特定の実施形態では、熱安定性は、本明細書に記載の方法によって、５５℃、６０℃、及び／又は６５℃で、マウスＣｒｉｓ－７親抗体と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、最大１００倍、その間のあらゆる整数（例えば、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍など）で改善される。
他の実施形態では、Ｆａｂは、
配列番号５５の重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号４８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸は、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、残基の番号付けは、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる。
他の実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、
配列番号５５の重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号４８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸は、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、残基の番号付けは、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、
配列番号５５の重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号４８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸は、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、残基の番号付けは、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる。
他の実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、
配列番号５５、５４、又は４８の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、それぞれ配列番号７０、７１、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、それぞれ配列番号７０、７１、及び７２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、それぞれ配列番号７０、７１、及び８７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、それぞれ配列番号７０、７１、及び９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、配列番号５５のＶＨを含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、配列番号５４のＶＨを含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、配列番号４８のＶＨを含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、配列番号８８のＶＨを含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、配列番号２４２のＶＨを含む。
相同な抗原結合ドメイン及び保存的置換を有する抗原結合ドメイン
ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのバリアントは、本開示の範囲内である。例えば、バリアントは、親抗原結合ドメインと比較したときに改善された機能的性質を保持するか又は有する限り、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９個のアミノ酸置換を含んでもよい。他の実施形態では、配列同一性は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってもよい。他の実施形態では、バリアントは、フレームワーク領域に存在する。他の実施形態では、バリアントは、保存的置換により生成される。
例えば、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、残基位置Ｎ１０６（配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端からの残基番号付け）に置換を含み得る。保存的置換は、任意の指定の位置で行うことができ、得られたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのバリアントを、本明細書に記載のアッセイで所望の特性について試験する。
また、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬと少なくとも８０％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインも提供される。
他の実施形態では、同一性は、８５％である。他の実施形態では、同一性は、９０％である。他の実施形態では、同一性は、９１％である。他の実施形態では、同一性は、９１％である。他の実施形態では、同一性は、９２％である。他の実施形態では、同一性は、９３％である。他の実施形態では、同一性は、９４％である。他の実施形態では、同一性は、９４％である。他の実施形態では、同一性は、９５％である。他の実施形態では、同一性は、９６％である。他の実施形態では、同一性は、９７％である。他の実施形態では、同一性は、９８％である。他の実施形態では、同一性は、９９％である。
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ４：１１－１７（１９８８））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定し得る。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ＞から検索することができる）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及びギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することができる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合するバリアント抗原結合ドメインは、ＣＤ３εに結合する親抗原結合断片の所望の機能的特性を保持しながら、ＣＤＲ領域のうちのいずれかに１つ又は２つの保存的置換を含む。
「保存的改変」は、アミノ酸修飾を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、ポリペプチド中の任意の天然残基はまた、アラニンスキャニング変異誘発（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）について以前に記載されているように、アラニンで置換され得る。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、既知の方法、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）により行うことができる。代替的に、バリアントのライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば、１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。得られるバリアントは、本明細書に記載のアッセイを用いて、その特徴について試験することができる。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を生成する方法
本開示で提供されるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、様々な技術を使用して生成することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法を使用して、ＣＤ３εに結合するＶＨ／ＶＬ対を同定することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えば、ハムスター、ラット、若しくはニワトリを、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３εで免疫し、続いて、標準的な方法を使用して骨髄腫細胞で免疫した動物の脾臓細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、抗原に対する親和性、及び任意の所望の機能性などの所望の特性を有するＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含有する抗体の生成についてスクリーニングしてもよい。
非ヒト動物を免疫することによって生成されたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインをヒト化してもよい。ヒトアクセプタフレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術としては、ＣＤＲ移植（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲ移植（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：４８９－４９９）、特異性決定残基リサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適合（米国特許第８，７４８，３５６号）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）が挙げられる。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はそれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに、親抗体のＣＤＲ又はＣＤＲ残基のサブセットを移植する。
ヒト化抗原結合ドメインは、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術により、変化させたフレームワーク支持残基を組み込んで結合親和性を保持することによって（復帰変異）、又はＣＤＲのいずれかに多様性を導入して、例えば抗原結合ドメインの親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化してもよい。
自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有するマウス、ラット、又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を作製することができ、これらは例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第１９９９／４５９６２号、国際公開第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号に記載されている。このような動物の内因的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ．ｃｏｍ＞）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｔｉｎｃ．ｎｅｔ＞）、ＫｙＭａｂ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｙｍａｂ．ｃｏｍ＞）、Ｔｒｉａｎｎｉ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ．ｃｏｍ＞）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｌｅｘｉｓ．ｃｏｍ＞）などの企業は、上記の技術を使用して、選択された抗原を対象としたヒト抗体を提供するように従事し得る。
ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン又はその部分、例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は不対若しくは対合抗体可変領域を発現するようにファージが遺伝子操作されているファージディスプレイライブラリから選択することができる。ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６、及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載されるバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３εへのファージ結合についてスクリーニングしてもよく、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローン溶解物からＦａｂを単離し、ｓｃＦｖ又は抗原結合断片の他の構成に変換してもよい。
免疫原性抗原の調製並びに本開示の抗原結合ドメインの発現及び生成は、組換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を使用して行うことができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、あるいは、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードする核酸から動物の体内で新規に（de novo）形成されてもよい。
半減期延長部分へのコンジュゲーション
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、半減期延長部分にコンジュゲートさせてもよい。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン並びにその断片及び類似体、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はその断片、例えばＦｃ領域である。前述の半減期延長部分のアミノ酸配列は既知である。Ｉｇ又はその断片は、全てのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）を含む。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインにコンジュゲートさせることができる追加の半減期延長部分としては、所望の特性のための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えば、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖類）が挙げられる。これらの部分は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと直接融合させてもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって生成されてもよい。代替的に、周知の化学的カップリング方法を使用して、組換えで産生された本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインにその部分を結合させてもよい。
例えば、システイン残基を本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのＣ末端に組み込むか、又は遺伝子操作してシステインをＣＤ３ε結合部位から離れる方向に面する残基位置にし、周知の方法を使用してペギル基をシステインに結合させることによって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインにペギル部分をコンジュゲートさせることができる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を、半減期延長部分にコンジュゲートさせる。
他の実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇの断片である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域の断片である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｆｃ領域である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、アルブミンである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、アルブミン結合ドメインである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、トランスフェリンである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコールである。
半減期延長部分にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、知られているインビボモデルを利用して、それらの薬物動態特性について評価することができる。
免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片へのコンジュゲーション
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートして、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御を含む、抗体様特性を付与することができる。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片はまた、本明細書で考察されるように、半減期延長部分としても機能する。本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して遺伝子操作されて従来の完全長抗体にすることができる。ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む完全長抗体は、本明細書に記載のとおり、更に遺伝子操作されてもよい。
免疫グロブリン重鎖定常領域は、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。ＥＵインデックスに従う残基番号付けで、重鎖においてＣＨ１ドメインは残基Ａ１１８～Ｖ２１５にわたり、ＣＨ２ドメイン残基はＡ２３１～Ｋ３４０にわたり、ＣＨ３ドメイン残基Ｇ３４１～Ｋ４４７にわたる。いくつかの例では、Ｇ３４１は、ＣＨ２ドメイン残基と称される。ヒンジは、概して、Ｅ２１６を含み、ヒトＩｇＧ１のＰ２３０で終結すると定義される。Ｉｇ Ｆｃ領域は、Ｉｇ定常領域の少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、したがって、Ｉｇ重鎖定常領域の少なくともおよそＡ２３１～Ｋ４４７までの領域を含む。
本発明はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを提供する。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域は、重鎖定常領域である。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域は、軽鎖定常領域である。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。ヒンジの一部分は、Ｉｇヒンジの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を指す。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートする。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートする。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、第２のリンカー（Ｌ２）を介して、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートする。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、いくつかの知られているアッセイを使用してそれらの機能性について評価することができる。ＣＤ３εへの結合は、本明細書に記載の方法を使用して評価することができる。Ｉｇ定常ドメイン又はＩｇ定常領域の断片、例えばＦｃ領域によって付与される変化した特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、若しくはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶性形態を使用するＦｃ受容体結合アッセイにおいて、又は例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ、若しくはＡＤＣＰを測定する細胞ベースのアッセイを使用して、アッセイすることができる。
ＡＤＣＣは、ＣＤ３ε発現細胞を標的細胞として、及びＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用するインビトロアッセイを使用して評価することができる。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、１つの標的細胞の、４つのエフェクター細胞に対する比で使用する。標的細胞はＢＡＴＤＡで予め標識し、エフェクター細胞及び試験抗体と組み合わせる。サンプルを２時間インキュベートし、上清に放出したＢＡＴＤＡを測定することにより、細胞溶解を測定する。０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、またあらゆる抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。
ＡＤＣＰは、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として、及び、ＧＦＰ又は他の標識分子を発現するように遺伝子操作されている任意のＣＤ３ε発現細胞を標的細胞として使用することによって評価することができる。例示的なアッセイでは、エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加して、又は添加せずに、標的細胞と共に４時間インキュベートしてもよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを使用して剥離され得る。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体を用いて特定することができ、貪食作用の割合は、標準的な方法を使用して、ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光％に基づいて求めることができる。
細胞のＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％のＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５個の細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）でプレーティングし、５０μＬの試験タンパク質を０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュベートし、１１μＬのプールヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間インキュベートすることによって測定され得る。溶解した細胞の割合（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して様々な設計の単一特異性又は多重特異性タンパク質に遺伝子操作され得る。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する単離抗原結合ドメインを含む単一特異性タンパク質を提供する。
他の実施形態では、単一特異性タンパク質は、抗体である。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を提供する。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、二重特異性である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、三重特異性である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、四重特異性である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３εへの結合について一価である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３εへの結合について二価である。
本開示はまた、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインと、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む単離多重特異性タンパク質を提供する。他の実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞上に存在するか、又はがん細胞に特異的なタンパク質又はその断片である。
他の実施形態では、腫瘍抗原は、ＢＣＭＡ抗原である。他の実施形態では、腫瘍抗原は、ＰＳＭＡ抗原である。他の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ７９ｂ抗原である。他の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ２０抗原である。他の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ２０抗原及びＣＤ７９ｂ抗原である。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第一の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第二の抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＶＨＨを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆｖを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆｄを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約５～５０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約５～４０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約１０～３０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約１０～２０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号７０のＨＣＤＲ１、配列番号７１のＨＣＤＲ２、配列番号７２、８７、９０、又は８６のＨＣＤＲ３、配列番号７９のＬＣＤＲ１、配列番号８０のＬＣＤＲ２、及び配列番号８１のＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
それぞれ配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
それぞれ配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨ及び配列番号５９、５８、又は５６のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、又は１２６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＰＳＭＡに特異的である。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２４２のＨＣ及び配列番号１２４３のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２４４のＨＣ及び配列番号１２４５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２４６のＨＣ及び配列番号１２４７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２４８のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２５０のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２５２のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２５４のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２５６のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２５８のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２６０のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２６２のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２６４のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２６６のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２６８のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２７０のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２７２のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２７４のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２７６のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２７８のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８０のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８２のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８４のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８６のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８８のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２９０のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２９２のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２９４のＨＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４５９のＨＣ及び配列番号１４６０のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４６１のＨＣ及び配列番号１４６２のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３５６のＨＣ及び配列番号１３５７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３５８のＨＣ及び配列番号１３５９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３６０のＨＣ及び配列番号１３６１のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３６２のＨＣ及び配列番号１３６３のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３６４のＨＣ及び配列番号１３６５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３６６のＨＣ及び配列番号１３６７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３６８のＨＣ及び配列番号１３６９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３７０のＨＣ及び配列番号１３７１のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３７２のＨＣ及び配列番号１３７３のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３７４のＨＣ及び配列番号１３７５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３７６のＨＣ及び配列番号１３７７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３７８のＨＣ及び配列番号１３７９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３７８のＨＣ及び配列番号１３７９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３８０のＨＣ及び配列番号１３８１のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３８２のＨＣ及び配列番号１３８３のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３８４のＨＣ及び配列番号１３８５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３８６のＨＣ及び配列番号１３８７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３８８のＨＣ及び配列番号１３８９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９０のＨＣ及び配列番号１３９１のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９２のＨＣ及び配列番号１３９３のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９４のＨＣ及び配列番号１３９５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９６のＨＣ及び配列番号１３９７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９６のＨＣ及び配列番号１３９７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９６のＨＣ及び配列番号１３９７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９６のＨＣ及び配列番号１３９７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３９８のＨＣ及び配列番号１３９９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４００のＨＣ及び配列番号１４０１のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４０２のＨＣ及び配列番号１４０３のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４０４のＨＣ及び配列番号１４０５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４０６のＨＣ及び配列番号１４０７のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４０８のＨＣ及び配列番号１４０９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４１０のＨＣ及び配列番号１４１１のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４１２のＨＣ及び配列番号１４１３のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４１４のＨＣ及び配列番号１４１５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ７９ｂに特異的である。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４８９のＨＣ及び配列番号１４９１のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４９３のＨＣ及び配列番号１４９５のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４９７のＨＣ及び配列番号１４９９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１５０２のＨＣ及び配列番号１４９９のＬＣを含む。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４８９のＨＣ及び配列番号１４９１のＬＣを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートし、かつ／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートする。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインと第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片との間、及び腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、本明細書に記載のとおり更に遺伝子操作されてもよい。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を、かつ／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異、及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、以下の変異を含む：
第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、又は
第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ。
三重特異性抗体
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、及びＣＤ３に結合する三重特異性抗体、並びにその三重特異性結合断片が本明細書に提供される。これは、例えば、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する第１の領域、ＣＤ３に特異的に結合する第２の結合領域、及びＣＤ２０に特異的に結合する第３の結合領域を含む分子を作製することによって達成することができる。抗原結合領域は、標的の特異的な認識を可能にする任意の形態を取ることができ、例えば、結合領域は、重鎖可変ドメイン、Ｆｖ（重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの組み合わせ）、一本鎖Ｆｖ（single-chain Fv、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づいた結合ドメイン（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のＣｅｎｔｙｒｉｎ分子など、フィブロネクチン由来、若しくはフィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づいたもの、又はテネイシン由来、若しくはテネイシン由来のＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づいたもの、例えば、国際公開第２０１０／０５１２７４号及び国際公開第２０１０／０９３６２７号を参照されたい）であっても、これらを含んでいてもよい。したがって、それぞれ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、及びＣＤ３に結合する３つの異なる抗原結合領域を含む三重特異性分子が提供される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３多重特異性抗体は、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位を対合して形成する、第１の重鎖（first heavy chain、ＨＣ１）及び軽鎖（ＬＣ）を含み、第２の重鎖（second heavy chain、ＨＣ２）は、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む。ＨＣ１又はＨＣ２のいずれかは、第３の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合ドメインを更に含み得る。ＨＣ１及びＨＣ２は各々、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む結晶化可能断片（Fragment crystallizable、Ｆｃ）ドメインを含み得る。好ましい実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する第１の抗原結合部位を対合して形成する第１の重鎖（ＨＣ１）及び軽鎖（ＬＣ）と、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、を含む、ＣＤ７９ｂ特異的アームを含む三重特異性抗体であり、ＨＣ１又はＨＣ２は、第３の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部位を更に含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ２０であり、第３の抗原は、ＣＤ３である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３であり、第３の抗原は、ＣＤ２０である。
いくつかの実施形態では、ＨＣ２は、第３の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部位を含む。例えば、ＨＣ２は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２の抗原結合部位、Ｆｃドメイン、リンカー、及び第３の抗原結合部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＨＣ１は、第３の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部位を含む。例えば、ＨＣ１は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１の抗原結合部位と関連する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＣＨ１ドメイン、Ｆｃドメイン、リンカー、及び第３の抗原結合部位を含み得る。
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する第１の抗原結合部位を対合して形成する、ＨＣ１及びＬＣと、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含むＨＣ２と、を含む、ＣＤ７９ｂ特異的アームを含む三重特異性抗体であり、ＨＣ２は、ＣＤ２０に特異的に結合する第３の抗原結合部位を更に含む。
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する第１の抗原結合部位を対合して形成する、ＨＣ１及びＬＣと、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含むＨＣ２と、を含む、ＣＤ７９ｂ特異的アームを含む三重特異性抗体であり、ＨＣ２は、ＣＤ３に特異的に結合する第３の抗原結合部位を更に含む。
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する第１の抗原結合部位を対合して形成する、ＨＣ１及びＬＣと、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含むＨＣ２と、を含む、ＣＤ７９ｂ特異的アームを含む三重特異性抗体であり、ＨＣ１は、ＣＤ３に特異的に結合する第３の抗原結合部位を更に含む。
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、抗原結合断片（antigen-binding fragment、Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、一本鎖可変断片（single-chain variable fragment、ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部位は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、抗原結合断片（Ｆａｂ）を含み、ＣＤ３結合アームは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ＣＤ２０結合アームは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
本開示の例示的な三重特異性結合タンパク質の例示的な重鎖及び軽鎖を表３１に示す。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質の生成。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合断片は、多重特異性抗体に遺伝子操作されてもよく、これらもまた、本発明の範囲内に包含される。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片は、Ｆａｂアーム交換を使用して生成される完全長多重特異性抗体に遺伝子操作されてもよく、インビトロでＦａｂアーム交換を促進する、Ｉｇ定常領域ＣＨ３ドメイン内の２つの単一特異性二価抗体に置換が導入される。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を遺伝子操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において一緒にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを使用することができる。
使用され得るＣＨ３変異としては、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、静電的マッチ変異（Ｃｈｕｇａｉ、Ａｍｇｅｎ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、鎖交換遺伝子操作ドメインボディ（Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）などの技術が挙げられる。
ノブインホール変異は、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号に開示されており、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が第１のＣＨ３領域に導入され、大きい側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が第２のＣＨ３領域に導入され、第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間に優先的な相互作用をもたらす、ＣＨ３領域の界面上の変異が含まれる。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３領域変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。
重鎖ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載のように、第１のＣＨ３領域上の正に荷電した残基及び第２のＣＨ３領域上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進され得る。
重鎖ヘテロ二量体化を促進するために使用することができる他の非対称変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗである。
ＳＥＥＤｂｏｄｙ変異は、米国特許出願公開第２００７０２８７１７０号に記載のように、選択ＩｇＧ残基をＩｇＡ残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進することを伴う。
使用され得る他の例示的な変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号、及び米国特許出願公開第２０１８／０１１８８４９号に記載のＲ４０９Ｄ＿Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ＿Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｋ／Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ３５６Ｋ、Ｋ２５３Ｅ＿Ｄ２８２Ｋ＿Ｋ３２２Ｄ／Ｄ２３９Ｋ＿Ｅ２４０Ｋ＿Ｋ２９２Ｄ、Ｋ３９２Ｄ＿Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３５６Ｋ＿Ｄ３９９Ｋである。
Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）は、例えば、米国特許第９１５０６６３号及び米国特許出願公開第２０１４／０３０３３５６号に開示されており、Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、野生型／Ｆ４０５Ｌ＿Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３５０Ｉ＿Ｋ３７０Ｔ＿Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、Ｋ３７０Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９ＡＦＧＨＩＬＭＮＲＳＴＶＷＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６ＡＤＥＦＧＨＩＬＭＱＶＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８ＡＤＥＧＨＮＲＳＴＶＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｄ３９９ＦＨＫＲＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｆ４０５ＩＫＬＳＴＶＷ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、及びＹ４０７ＬＷＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨの変異が含まれる。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を組み込むことができる更なる二重特異性又は多重特異性構造としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Dual Variable Domain Immunoglobulin、ＤＶＤ）（国際公開第２００９／１３４７７６号；ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意選択的である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートした２つ又は３つ以上のドメイン抗体（domain antibodies、ｄＡｂｓ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び遺伝子操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみの抗体、二重標的（Dual Targeting、ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、２ｉｎ１抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ボディ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ））、二重親和性再標的技術（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及び二重（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、二重活性又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、二価二重特異性（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Bispecific T Cell Engager、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Dual Affinity Retargeting Technology、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインはまた、３本のポリペプチド鎖を含む多重特異性タンパク質に遺伝子操作されてもよい。このような設計では、少なくとも１つの抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖの形態である。例示的な設計としては以下が挙げられる（「１」が第１の抗原結合ドメインを示し、「２」が第２の抗原結合ドメインを示し、「３」が第３の抗原結合ドメインを示す。
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
ＣＨ３遺伝子操作は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗの変異など、設計１～４に組み込まれ得る。
アイソタイプ、アロタイプ、及びＦｃ遺伝子操作
本開示のタンパク質中に存在するＩｇ定常領域又はＦｃ領域などのＩｇ定常領域の断片は、いずれのアロタイプ又はアイソタイプのものであってもよい。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプであり得る。アロタイプは結合又はＦｃ媒介性エフェクター機能などのＩｇ定常領域の特性に影響を与えないことが予想される。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質の免疫原性は、輸注反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮と関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２－０８）。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ｉｇ定常領域のアロタイプによってある程度決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。Ｉｇ定常領域のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表３は、選択ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
Figure 2024510777000004
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、Ｉｇ定常領域から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４－４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。タンパク質のＣＴＬ含量は、既知の方法を使用して測定することができる。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合断片は、約１０％～約９０％のＣ末端リジン含有量を有する。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約２０％～約８０％である。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約４０％～約７０％である。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約５５％～約７０％である。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約６０％である。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに対してＦｃ領域変異を行って、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／若しくはＡＤＣＰなどのエフェクター機能、並びに／又は薬物動態特性を調節することができる。これは、変異したＦｃの活性化ＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃγＲＩＩｂ、及び／又はＦｃＲｎへの結合を制御する変異をＦｃに導入することによって達成可能である。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｆｃ領域にある。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｃ領域に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、抗体のＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合）を調節するために変異させることが可能なＦｃの位置としては、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、変異Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を増加させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。半減期を低減させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、タンパク質の活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減する、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
タンパク質の活性化ＦｃγＲへの結合を低減させ、続いて、エフェクター機能を低減させるために変異され得るＦｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓの変異である。また、ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
ＣＤＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。
周知のＳ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に加えて、ＩｇＧ４の安定性を増強することができる。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ｋ３２２、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を増強する、並びに／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び／若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を増強する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
タンパク質の活性化ＦｃγＲへの結合を増加させるため、及び／又はＦｃエフェクター機能を増強するために変異させることが可能なＦｃ位置としては、位置２３６、２３９、２４３、２５６、２９０、２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３４５、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０（ＥＵインデックスに従う残基番号付け）が挙げられる。単一で又は組み合わせて行われ得る例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌである。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
ＣＤＣを増強させるように変異され得るＦｃ位置としては、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０が挙げられる。単一で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｆ１２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔである。ＣＤＣが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔである。
本明細書に記載される特異性変異は、それぞれ配列番号２３７、２３８、及び２３９のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４野生型アミノ酸配列と比較した場合の変異である。
配列番号２３７、野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２３８、野生型ＩｇＧ２
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２３９、野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合は、フローサイトメトリを使用して、各受容体を発現するように遺伝子操作された細胞にて評価することができる。例示的な結合アッセイでは、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルの細胞を播種し、ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中、４℃で３０分間ブロッキングする。細胞を、氷上で、４℃で１．５時間、試験抗体と共にインキュベートする。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ－ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４℃で４５分間、インキュベートする。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬの染色緩衝液中に再懸濁する。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって、それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使用して検出する。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲーティングし、収集された少なくとも１０，０００生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを決定する。分析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用する。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットする。非線形回帰分析を実行する。
糖鎖遺伝子操作
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を遺伝子操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化され、グリカンの大部分は、既知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も変化させることなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介してタンパク質のＡＤＣＣが増強される。このようなタンパク質は、二分岐の複合型のＦｃオリゴ糖を有する比較的高い脱フコシル化免疫グロブリンの発現の成功に導くと報告された異なる方法を使用して達成することができ、以下が含まれる：培養物の浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６；Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）。
他の実施形態では、本開示のＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、約１％～約１５％、例えば、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％のフコース含有量を有する二分岐グリカン構造を有する。他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％のフコース含有量を有するグリカン構造を有する。
「フコース含量」は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらの糖構造は、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６２号に記載されるような、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理サンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ－並びに高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）によるｍＡｂの構成ペプチドへの消化、その後のＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による分離、検出及び定量化、５）Ａｓｎ ２９７にＰＮＧａｓｅ Ｆを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、ｍＡｂタンパク質からｍＡｂオリゴ糖を分離すること、により特性評価及び定量化され得る。このように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリクス支援レーザ脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析によるグリカン構造の細かな特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量化、並びに高性能キャピラリ電気泳動－レーザ誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量化、を可能にする様々な補足的技術によって分離及び同定することができる。
「低フコース」又は「低フコース含有量」は、本明細書で使用される場合、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、約１％～１５％のフコース含有量を有することを指す。
「正常フコース」又は「正常フコース含有量」は、本明細書で使用される場合、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、約５０％超、典型的には８０％超又は８５％超のフコース含有量を有することを指す。
抗イディオタイプ抗体
抗イディオタイプ抗体は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗体である。
本発明はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
本発明はまた、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
抗イディオタイプ（idiotypic、Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原ブロッキングＩｄは、サンプル中の遊離抗原結合ドメイン（例えば、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン）を検出するために使用され得る。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に部分的に結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製され得る。
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗－抗Ｉｄ抗体を産生することもできる。抗－抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元の抗原結合ドメインとエピトープが同一であり得る。したがって、抗原結合ドメインのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗原結合ドメインを発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な技術によって変動（それにより、抗Ｉｄ抗体バリアントを産生する）、及び／又は誘導し得る。
免疫コンジュゲート
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、又はＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質（本明細書ではまとめてＣＤ３ε結合タンパク質と称される）は、異種分子にコンジュゲートし得る。
他の実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は細胞傷害性剤である。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する、抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、タンパク質を提供する。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、多重特異性タンパク質を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、タンパク質を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、多重特異性タンパク質を提供する。
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質を使用して、治療薬を腫瘍抗原発現細胞に向けることができる。代替的に、内在化させてから細胞機能を修飾することを意図した治療剤に結合させた本開示のＣＤ３ε結合タンパク質を用いて、ＣＤ３ε発現細胞を標的とすることもできる。
他の実施形態では、検出可能な標識は、細胞傷害性剤でもある。
検出可能な標識にコンジュゲートした本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、様々なサンプルにおけるＣＤ３εの発現を評価するために使用することができる。
検出可能な標識は、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質にコンジュゲートさせたとき、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段を介して後者を検出可能なものにする組成物を含む。
例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、α放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユーロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
他の実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
他の実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
他の実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及びＺｎ２＋などの＋１、＋２、又は＋３酸化状態の形態の金属イオンであり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
好適な色素としては、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質は、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質は、造影剤として使用することができる。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞傷害性剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機序によってその細胞傷害性又は細胞増殖抑制作用を誘発し得る。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の未結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセンなどの酵素活性毒素である。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、ドラスタチン若しくはドロスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン、又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０－３５８４）、抗がん及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬剤部位は、ペプチド薬剤部位のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又は抗体内に遺伝子操作された任意のシステインを介して、本発明の抗体に結合することができる。
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、既知の方法を使用して検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。
他の実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
他の実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本開示のＣＤ３ε結合タンパク質にコンジュゲートする。
検出可能な標識又は細胞傷害性部分は、既知の方法を使用して、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質に直接又は間接的に連結させることができる。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ－スクシミジル－ベンゾエートの誘導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（１，４，７，１０－ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ－１，４，７，１０，ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（diethylenetriaminepentaacetic avid、ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（Ｓ－２－（４－Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｂｅｎｚｙｌ）－１，４，７－ｔｒｉａｚａｃｙｃｌｏｎｏｎａｎｅ－１，４，７－ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（１，４，８，１１－ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｃｅｄａｎ－１，４，８，１１－ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（iminothiolane、ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分を含む。好適なペプチドリンカーは周知である。
他の実施形態では、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、腎クリアランスを介して血液から除去される。
キット
本発明はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むキットを提供する。
本発明はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を含むキットを提供する。
本発明はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を含むキットを提供する。
キットは、治療用途のために、及び診断キットとして使用することができる。
キットを使用して、サンプル中のＣＤ３εの存在を検出することができる。
他の実施形態では、キットは、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質と、ＣＤ３ε結合タンパク質を検出するための試薬と、を含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療剤、又はキレート化若しくは別様のカップリングに有用な薬剤、標識若しくは治療剤に対する抗体、又は放射線防護組成物；投与するために抗体を調製するためのデバイス又は他の材料；医薬的に許容される担体、及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含む、１つ又は２つ以上の他の要素を含み得る。
他の実施形態では、キットは、容器内のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと、キットの使用説明書と、を含む。
他の実施形態では、キットは、容器内のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質と、キットの使用説明書と、を含む。
他の実施形態では、キットは、容器内のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質と、キットの使用説明書と、を含む。
他の実施形態では、キットにおけるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが標識される。
他の実施形態では、キットにおけるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質が標識される。
他の実施形態では、キットにおけるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質が標識される。
他の実施形態では、キットは、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む。
他の実施形態では、キットは、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、又は１２６を含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む。
ＣＤ３εを検出する方法
本発明はまた、サンプル中のＣＤ３εを検出する方法であって、サンプルを入手することと、サンプルを本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと接触させることと、サンプル中の結合したＣＤ３εを検出することと、を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、組織に会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどに由来し得る。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、既知の方法を使用して検出することができる。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、あるいは本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ－ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、サンプル中のＣＤ３εを検出するための様々なアッセイで使用してもよい。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。ＣＤ３ε結合タンパク質は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を含む。
本発明はまた、ＣＤ３ε結合タンパク質又はその断片のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５９、５８、又は５６のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５５のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５４のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号４８のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５９のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５８のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５６のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨ、及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、又は１２６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号９６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号９７のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号９８のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号９９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１００のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０１のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０３のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０７のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０８のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１０９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１０のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１３のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１７のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１８のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１１９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１２０のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１２１のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１２２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１２３のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１２４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１２５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号１２６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本開示のいくつかの実施形態はまた、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、単離又は精製核酸を提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」は、ポリヌクレオチドが、非特異的なハイブリダイゼーションよりも強い検出可能な量で標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又は点在する不一致をほんのわずかに含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域（例えば、３～１２塩基）を偶然に有するランダム配列と識別する条件を含む。そのような相補的な小領域は、１４～１７以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーな条件は、例えば、約５０～７０℃の温度で約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物によって提供されるものなど、低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間の不一致を、たとえあったとしても、ほとんど許容しない。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。
本開示のポリヌクレオチド配列は、意図とする宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現させる１つ又は２つ以上の調節エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサ）に動作可能に連結し得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。プロモータは、強い、弱い、組織特異的、誘導性、又は発生段階特異的なプロモータであってもよい。使用され得る例示的なプロモータは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどである。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載される実施形態での使用に好適である。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられる。メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータ、タンパク質キナーゼＲ２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（interferon-stimulated response element、ＩＳＲＥ）を含有するプロモータなどの誘導性プロモータを使用してもよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本開示はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってもよい。本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３ε結合タンパク質の発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に動作可能に連結され得る。そのような調節エレメントとしては、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクターはまた、１つ若しくは２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製起点、発現する遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサ、他の５’若しくは３’隣接非転写配列、５’若しくは３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプタ部位、又は転写終結配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた、組み込まれ得る。
発現ベクターは、天然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含み得る。天然に存在しない若しくは改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間連結は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。
ベクターを適切な宿主に組み込んだら、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる本開示のＣＤ３ε結合タンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）によって記載されるように構築され得る。
本開示のベクターはまた、１つ又は２つ以上の内部リボソーム侵入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列を融合ベクターに含めることは、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。他の実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなり、これは、前述の核酸配列のうちのいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよいか、又は別の方式で位置付けられてもよい。また、調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフが、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
本開示のベクターは、環状であっても線形であってもよい。これらは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来してもよい。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。
更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で知られており、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリルを含む。ベクターはまた、当該技術分野で周知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーは、陽性及び陰性選択マーカーを含む。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。例示的なマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、ヒスチジノール×耐性遺伝子）、グルタミン合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が挙げられる（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８－１７４３（２０００））。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。追加のベクターとしては、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。例示的な植物発現ベクターとしては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。例示的な動物発現ベクターとしては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクター．ａｓｅ、及びニトロレダクターゼであってもよい。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号５５のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号５４のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号４８のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号５９のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号５８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号５６のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨ、及び配列番号５９、５８、又は５６のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、又は１２６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号９６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号９７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号９８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号９９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１００のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１０９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１２０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１２１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１２２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１２３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１２４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１２５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号１２６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
また、本発明は、本発明の１つ又は２つ以上のベクターを含む、宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後続世代においてある特定の改変が生じることがあるため、そのような後代は親細胞と同一ではないことがあるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。原核宿主細胞の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの桿菌、及びサルモネラ、セラチア、及び様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌科である。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキアである。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞は、ハイブリドーマなどの不死化細胞株、又はＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株などの骨髄腫の細胞株を含む。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
本開示はまた、ＣＤ３ε結合タンパク質が発現する条件下で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたＣＤ３ε結合タンパク質を回収することと、を含む、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質の産生方法も提供する。タンパク質を作製し、それを精製する方法は既知である。（化学的に又は組換えのいずれかで）合成したら、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従ってＣＤ３ε結合タンパク質を精製することができる（全般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照されたい）。対象タンパク質は、実質的に純粋、例えば、純度が少なくとも約８０％～８５％、純度が少なくとも約８５％～９０％、純度が少なくとも約９０％～９５％、又は純度が少なくとも約９８％～９９％、若しくはそれ以上であってもよく、例えば、細胞残屑、対象タンパク質以外の巨大分子などの夾雑物を含んでいなくてもよい。
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学的方法を使用してベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。
修飾ヌクレオチドを使用して、本開示のポリヌクレオチドを生成することができる。例示的な修飾ヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５”－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンである。
医薬組成物／投与
本発明はまた、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと、本開示の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと、を含む多重特異性タンパク質、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
治療用途では、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。本組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含むことができる。
医薬組成物に関して本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、動物及び／又はヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
治療及び使用の方法
本開示はまた、治療において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、細胞増殖性障害の治療において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がん細胞の死滅において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がん細胞を死滅させるための医薬の製造において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、細胞溶解性Ｔ細胞の再指向において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、細胞溶解性Ｔ細胞の再指向のための医薬の製造において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、腫瘍微小環境における細胞溶解性Ｔ細胞の再指向において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、腫瘍微小環境における細胞溶解性Ｔ細胞の再指向において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がんの治療において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がんを治療するための医薬の製造において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
一態様では、本開示は、概して、がんを発症するリスクのある対象の治療に関する。本発明はまた、化学療法及び／又は免疫療法により対象において著しく免疫が抑制され、それによって対象のがんを発症するリスクを増加させる、悪性腫瘍を治療することを含む。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示の免疫コンジュゲートを対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与して非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、がんを治療するために、対象に投与することを含み、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
本開示はまた、対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、がんを治療するために、対象に投与することを含み、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、又は１２６のアミノ酸配列を含む、方法を提供する。
本開示の更なる態様は、細胞増殖性障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む二重又は多重特異性タンパク質を、対象に投与することを含む、方法である。他の実施形態では、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む二重又は多特異性タンパク質が、対象に投与される。
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、細胞増殖性疾患は、がんである。他の実施形態では、がんは、食道がん、胃がん、小腸がん、大腸がん、結腸直腸がん、乳がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphoma、ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、腎がん、前立腺がん、肝臓がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、神経膠芽腫、胚中心Ｂ細胞様（germinal-center B-cell-like、ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、活性化Ｂ細胞様（activated B-cell-like、ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma、ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma、ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia、ＣＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma、ＭＺＬ）、小リンパ性白血病（small lymphocytic leukemia、ＳＬＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma、ＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（Waldenstrom macroglobulinemia、ＷＭ）、中枢神経系リンパ腫（central nervous system lymphoma、ＣＮＳＬ）、バーキットリンパ腫（Burkitt's lymphoma、ＢＬ）、Ｂ細胞性リンパ性白血病、脾臓辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、脾臓リンパ腫／白血病・分類不能型、脾臓びまん性赤色髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病バリアント、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯リンパ腫（mucosa-associated lymphoid tissue、ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＣＮＳの原発性ＤＬＢＣＬ、原発性皮膚ＤＬＢＣＬ・下肢型、高齢者のＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、慢性炎症と関連するＤＬＢＣＬ、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫。血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との中間の特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、及び軽鎖アミロイドーシスからなる群から選択される。
他の実施形態では、がんは、食道がんである。他の実施形態では、がんは、腺がん、例えば、転移性腺がん（例えば、結腸直腸腺がん、胃腺がん、又は膵臓腺がん）である。
別の態様では、本開示は、（ａ）ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、前述の二重又は多重特異性抗体のうちのいずれか１つを含む組成物と、（ｂ）細胞増殖性障害を治療又は進行を遅延させるために、対象に組成物を投与するための指示書を含む添付文書と、を含むキットを特徴とする。
前述の使用又は方法のいずれにおいても、対象はヒトであることができる。
併用療法
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて投与してもよい。
他の実施形態では、１つの治療の送達は、投与に関して重複があるように、第２の治療の送達が開始されるときにまだ行われている。これは、本明細書において「同時」又は「同時送達」と称されることがある。他の実施形態では、１つの治療の送達は、もう１つの治療の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、併用投与であることから、治療はより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、同等の効果が、第２の治療を少なくして見られるか、又は第２の治療が、第１の治療なく第２の治療が施される場合に見られるよりも、大幅に症状を軽減するか、又は第１の治療と同様の状況が見られる。他の実施形態では、送達は、障害に関連する症状又は他のパラメータの低減が、他方の治療なしで送達される一方の治療で観察される低減よりも大きくなるようなものである。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の送達時に依然として検出可能であるようなものであり得る。
本明細書に記載されるＣＤ３ε結合タンパク質及び少なくとも１つの追加の治療剤は、同時に、同じ若しくは別個の組成物で、又は連続して、投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載されるＣＤ３ε結合タンパク質を最初に投与し、次に追加の薬剤を投与することができ、又は投与の順序を逆にすることができる。
実施形態：
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１．分化抗原群３ε（ＣＤ３ε）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号５５の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号５５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｃ．配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｄ．配列番号４８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸が、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、残基の番号付けは、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる、単離タンパク質。
２．それぞれ配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質。
３．
ａ．それぞれ、配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
ｂ．それぞれ、配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
ｃ．それぞれ、配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１又は２に記載の単離タンパク質。
４．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
５．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、実施形態４に記載の単離タンパク質。
６．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、実施形態４に記載の単離タンパク質。
７．ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、実施形態６に記載の単離タンパク質。
８．Ｌ１が、
ａ．約５～５０個のアミノ酸、
ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ．約１０～２０個のアミノ酸を含む、実施形態７に記載の単離タンパク質。
９．Ｌ１が、配列番号３～３６のアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の単離タンパク質。
１０．Ｌ１が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の単離タンパク質。
１１．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号５５、５４、又は４８のＶＨ及び配列番号５９、５８、又は５６のＶＬを含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
１２．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号５５のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
ｂ．配列番号５５のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
ｃ．配列番号５４のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
ｄ．配列番号４８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、
ｅ．配列番号８８のＶＨ及び配列番号５８のＶＬ、又は
ｆ．配列番号２４２のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む、実施形態１１に記載の単離タンパク質。
１３．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号９６～１２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
１４．単離タンパク質が、多重特異性タンパク質である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
１５．多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、実施形態１４に記載の単離タンパク質。
１６．多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、実施形態１４に記載の単離タンパク質。
１７．免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はそのＩｇ定常領域の断片を更に含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
１８．Ｉｇ定常領域の断片が、Ｆｃ領域を含む、実施形態１７に記載の単離タンパク質。
１９．Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ２ドメインを含む、実施形態１７に記載の単離タンパク質。
２０．Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ３ドメインを含む、実施形態１７に記載の単離タンパク質。
２１．Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態１７に記載の単離タンパク質。
２２．Ｉｇ定常領域の断片が、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態１７に記載の単離タンパク質。
２３．Ｉｇ定常領域の断片が、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態１７に記載の単離タンパク質。
２４．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる、実施形態１７～２４のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
２５．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる、実施形態１７～２４のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
２６．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、第２のリンカー（Ｌ２）を介して、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる、実施形態１７～２４のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
２７．Ｌ２が、配列番号３～３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載の単離タンパク質。
２８．多重特異性タンパク質が、ＣＤ３ε以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、実施形態１４～２７のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
２９．細胞抗原が、腫瘍関連抗原である、実施形態１４～２８のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
３０．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態１４～２９のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
３１．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
３２．タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けはＥＵインデックスに従う、実施形態３１に記載の単離タンパク質。
３３．ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態３１又は３２に記載の単離タンパク質。
３４．タンパク質が、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、実施形態１４～３３のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
３５．Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態３４に記載の単離タンパク質。
３６．実施形態１～３５のいずれか１つに記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
３７．実施形態１～３５のいずれか１つに記載の単離タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
３８．実施形態３５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
３９．実施形態３８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
４０．実施形態１～３５のいずれか１つに記載の単離タンパク質を産生する方法であって、タンパク質が発現する条件で実施形態３９に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたタンパク質を収集することと、を含む、方法。
４１．対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量の、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質を、がんを治療するために、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
４２．実施形態１～３５のいずれか１つに記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体。
４３．配列番号１２７～１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
４４．配列番号２２４の抗体重鎖及び配列番号２２６の抗体軽鎖を含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
実施例１．抗ＣＤ３ｍＡｂｓの生成及び特性評価
ヒトＣＤ３εに特異的な公開されているマウスＣｒｉｓ７抗体（Ａｌｂｅｒｏｌａ－ＩＩａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ＣＤ２ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６，１０８５－１０９２（１９９１））をこれらの実験に使用した。Ｃｒｉｓ－７のＶＨ及びＶＬ配列を、以下に示す。
Ｃｒｉｓ－７ ＶＨ（配列番号３７）：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＳＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＳＡＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＰＱＶＨＹＤＹＮＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
Ｃｒｉｓ－７ ＶＬ（配列番号３８）：
ＱＶＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＦＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＳＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＴＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＲＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＱＩＴ
ＣＤ３結合ドメインのヒト化及びｓｃＦｖフォーマット化
最適な生殖系列配列の評価
マウスＣｒｉｓ－７を一本鎖断片可変ドメイン（single-chain fragment variable-domain、ｓｃＦｖ）形式でヒト化した。Ｃｒｉｓ７に適合した結合親和性、及びｓｃＦｖフォーマットのためのヒト生殖系列受容体ＨＣとＬＣとの対の最も熱安定性の高い組み合わせを見つけるために、２つのヒト重可変ドメイン（heavy variable-domain、Ｈｖ）生殖系列配列、及び２つのヒト軽可変ドメイン（light variable-domain、Ｌｖ）生殖系列配列、すなわち、ＨｖについてはＩＧＨＶ１－６９＊０２－ＩＧＨＪ１－０１及びＩＧＨＶ５－１０－１＊０１－ＩＩＧＨＪ１－０１であり、ＬｖについてはＩＧＫＶ３－１１＊０２－ＩＧＫＪ４－０１又はＩＧＫＶ１－３９＊０１－ＩＧＫＪ４－０１生殖系列（インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ｖｑｕｅｓｔ／ｒｅｆｓｅｑｈ．ｈｔｍｌ＞から検索）を抗体ヒト化のために選択した。安定性を増強するために、限定された復帰突然変異を用いてＣＤＲ移植配列を生成した（下記の表４を参照されたい）。次いで、これらのＣＤＲ移植ｖ領域を、重鎖－リンカー－軽鎖（heavy chain-linker-light chain、ＨＬ）及び軽鎖－リンカー－重鎖（light chain-linker-heavy chain、ＬＨ）配向の両方で、ｓｃＦｖ形式でＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。ＨｖとＬｖとの対合のマトリックスを、以下に記載されるように、Ｌｖ、続いてＨｖ、又はＨｖ、続いてＬｖの両方の配向においてｓｃＦｖ形式で評価し、これらの可変ドメイン間の柔軟なリンカーを有した。ＣＤ３Ｂ１１２７及びＣＤ３Ｂ１１２８は、マウスＶＨ及びＶＬ配列を含んでいた（表４）。この実験から２つの主要な結論があった。第１に、全ての場合において、Ｃｒｉｓ－７由来のｓｃＦｖ分子は、ＥＬＩＳＡによって決定されるように、主により高い最大シグナルに基づいて、ＬＨ配向と比較してＨＬ配向において組換えＣＤ３（ＴＲＣＷ５、配列番号３９）に対して有意に強い結合を示した。第２に、重－軽配向の限定された復帰突然変異を含む、ＩＧＨＶ１－６９＊０２－ＩＧＨＪ１－０１重鎖生殖系列とＩＧＫＶ３－１１＊０２－ＩＧＫＪ４－０１軽鎖生殖系列とを移植した構築物は、最良の発現、結合プロファイル、及び潜在的な分化を示したので、ヒト化のために選択された（図１、表４及び５）。
Figure 2024510777000005
Figure 2024510777000006
 ＊ＨＬ－ＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＬＨ－ＶＬ－リンカー－ＶＨ
Figure 2024510777000007
ＩＧＨＶ１－６９＊０２－ＩＧＨＪ１－０１及びＩＧＫＶ３－１１＊０２－ＩＧＫＪ４－０１生殖系列におけるヒトフレームワーク最適化
ＩＧＨＶ１－６９＊０２－ＩＧＨＪ１－０１及びＩＧＫＶ３－１１＊０２－ＩＧＫＪ４－０１生殖系列移植配列（ＣＤ３Ｂ１１３０）は、上記のように、マウス親と比較して増強した結合を示し、マウス親に最も類似したヒト生殖系列を表したので、ヒトフレームワーク適応を、このＣＤＲ移植配列から出発して行った。この配列から出発して、分子の安定性に影響を及ぼし得るＶＨ中のいくつかの部位を選択し、同定し、したがってライブラリベースのマウス復帰突然変異誘発のために選択した（表６）。１つのＶＨライブラリにおいて、４つの部位（Ｍ４８Ｉ、Ａ６０Ｎ、Ｖ６７Ａ、及びＩ６９Ｌ－Ｋａｂａｔ番号付け）をバイナリーライブラリにおいて変異させ、Ｒ９４（Ｋａｂａｔ番号付け）をＳ、Ｖ、Ｌ、Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｉ、又はＹに変異させて、合計１２８個のバリアントを得た。第２のライブラリにおいて、９つの部位（Ｋ１２Ａ、Ｖ２０Ｍ、Ｒ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ａ６０Ｎ、Ｒ６６、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、及びＲ９４Ｓ－Ｋａｂａｔ番号付け）を、バイナリーライブラリにおいて変異させ、合計５１２個のバリアントを得た。これらの方法は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９，８，５５に記載されている。
Figure 2024510777000008
同様に、分子の安定性に影響し得る部位を同定することによって、ＶＬ配列について２つのライブラリを生成した。ライブラリ１では、ＬＣに変更を加えなかった。ライブラリ２では、１１個の部位を、バイナリー様式でのマウス復帰突然変異誘発（Ｌ１１Ｍ、Ｌ１３Ａ、Ａ１９Ｖ、Ｌ２１Ｍ、Ｑ４２Ｔ、Ａ４３Ｓ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ｆ７１Ｙ、及びＬ７８Ｍ）のために選択し、合計２０４８個のバリアントを得た（表７）。
Figure 2024510777000009
復帰突然変異ライブラリは、当該技術分野で既知の分子生物学技術によって作製した（Ｔｈｏｍａｓ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｐ．ｉ－ｉｉ Ｎｏｖ ２０１５）。異なるアクセプタ生殖系列を反対のマウス親鎖と対合させた。このようにすると、１つの鎖のみが、一度に可能性のある復帰突然変異で適合されたヒトフレームワークであった。
簡潔に述べると、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターに形質転換して、Ｃ末端ＨＡタグを有するｓｃＦｖ分子を生成し、細胞を、３７℃で一晩増殖させた２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ／２％グルコース上にプレーティングした。コロニーを採取し、５０μｌの一晩増殖培養物を、５００μｌの２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ／０．１％グルコースを含有する新しいプレートに移し、６～７時間増殖させ、１Ｘカルベニシリン及び１２Ｘ ＩＰＴＧを含有する５０μｌの２ｘＹＴ培地と合わせた。培養物を約６００ＲＰＭで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。ストレプトアビジンでコーティングしたプレートを、５０ｕＬのビオチン化ＴＲＣＷ５抗原（ＣＤ３δε－Ｆｃ－Ａｖｉ、配列番号３９）と、振盪しながら室温で４５分間、ＥＬＩＳＡグラフに示される濃度で（図１、図３、図４）結合させ、続いて１倍ＴＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、２００ｕｌの１Ｘ ＴＢＳＴ中３％ミルクを用いて室温で約４５分間ブロッキングし、続いて１倍ＴＢＳＴで３回洗浄した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を４℃で１０分間、３５０００ＲＰＭでの遠心分離によって回収し、５０ｕＬの上清をＣＤ３コーティングプレートに移し、続いて４Ｃで４５分間インキュベートした。プレートを１倍ＴＢＳＴで３回洗浄した。結合したｓｃＦｖをニワトリポリクローナル抗ＨＡ－ＨＲＰ（ａｂ１１９０）［１：１０００］を用いて室温で約４５分間検出し、発光を化学発光基質を用いて検出した。
ＴＲＣＷ５抗原（ＣＤ３δε－Ｆｃ－Ａｖｉ、配列番号３９）
ＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
配列決定、並びに滴定及び熱ストレスＥＬＩＳＡアッセイへの曝露のために、マウス親よりも大きい結合を示すクローンを選択した。簡潔に述べると、ｓｃＦｖを上記のように発現させ、熱ストレス（６０℃熱ショックを約１０分間）に供した後、上記のようにＥＬＩＳＡ分析を行った。簡潔に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉ上清からの結合を示したマウス復帰突然変異の異なる組み合わせを含有するクローンを配列決定して、各部位のどの残基（ヒト又はマウス生殖系列残基のいずれか）が熱安定性を維持するためにより最適であるかを決定した。各部位に各残基を保有するクローンの割合を決定した（図２Ａ及び図２Ｂ）。設計された２つの重鎖ライブラリから、８つのヒト適合重鎖配列を選択し、設計された単一軽鎖ライブラリから、８つのヒト適合軽鎖を、熱ストレス後の＞７０％結合（室温ＥＬＩＳＡ結合と比較して）の保持に基づいて選択した。熱的に安定なヒト化Ｃｒｉｓ－７ＶＨ及びＶＬの配列を以下に示す（表８）。
Figure 2024510777000010
Figure 2024510777000011
８つの新しい重鎖及び８つの新しい軽鎖（表８に示す）を再び互いにマトリックス化して、ｓｃＦｖを生成し（表９）、滴定、熱ストレス、及び細胞結合を含む追加のアッセイに更に曝露した（図３）。
Figure 2024510777000012
細胞結合を、汎Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ，Ｉｔｅｍ＃２１５－０２－１１）及びＪｕｒｋａｔ－ＣＤ３陰性細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５３（商標））に対して行って、熱ストレスを受けた場合の非特異的結合の増加を観察した。熱ストレスを受けた場合に陰性細胞株への結合の増加を示す分子は、更なる特性評価のために選択しなかった。組換えＣＤ３（ＴＲＣＷ５、配列番号３９）への結合についてのＥＬＩＳＡアッセイを上記のように実施した。細胞結合は、フローサイトメトリによって初代ヒトＴ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を使用して実施した。簡潔に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉは、室温で、又は５５℃、６０℃若しくは６５℃にて熱処理したサンプルのいずれかで、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ上清を発現した。
汎Ｔ細胞（ＣＤ３陽性）及びＪｕｒｋａｔ－ＣＤ３陰性細胞は、汎Ｔ細胞を染色しないまま、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ３陰性細胞をＣＦＳＥで染色することによって調製した。Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ３陰性細胞懸濁液を、各５０ｍＬコニカルチューブ当たり２０００万細胞で再懸濁させた。細胞を４００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＤＰＢＳ中に再懸濁させ、続いてＤＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、０．０２ｕＭ ＣＦＳＥの最終色素濃度のために１：２５，０００希釈で染色した（５０ｍＬの細胞懸濁液に対して２ｕＬの染色溶液）。細胞を室温で１０分間インキュベートし、４００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去した後、３ｍＬのＨＩ－ＦＢＳを細胞ペレットに添加し、混合し、４００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞をＢＤ染色緩衝液中に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、氷上又は４Ｃで遮光状態でインキュベートした。ヒト汎Ｔ細胞を３７℃で解凍し、１５ｍＬの温培養培地又はＲＴ培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を含有するコニカルチューブに穏やかに移した。ドナーＩＤ番号Ｍ７３４８；ロット番号ＬＳ １１ ６２９８０ＡのＴ細胞は９７．２％の生存率であった。細胞を４００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＨＩ－ＦＢＳ）に再懸濁させた。汎Ｔ細胞（染色なし）を、フロー染色緩衝液中２×１０６細胞／ｍＬで調製した。等量のＣＦＳＥ染色Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ３陰性細胞及び未染色Ｔ細胞（ＣＤ３陽性）細胞を混合し、アッセイプレートに５０μＬ／ウェルでプレーティングした。５０ｕＬ／ウェルの純粋な細菌上清サンプル及び対照サンプル（ＣＤ３Ｗ３６ ＳｃＦｖ）を各ウェルに添加し、プレートを４Ｃ又はで１時間インキュベートした。細胞を４００×ｇで４分間の遠心分離によって回収し、１５０μＬの染色緩衝液を全てのウェルに添加し、続いて４００×ｇで４分間遠心分離して、細胞をペレット化した。各ウェルに、１５０μＬの染色緩衝液を添加し、続いて４００×ｇで４分間遠心分離して、細胞をペレット化した。Ａ６４７コンジュゲート抗ＨＩＳ二次抗体を染色緩衝液中２ｕｇ／ｍＬ（ストックバイアルから１：１００希釈）で調製し、洗浄した細胞に５０ｕＬ／ウェルで添加し、続いて遮光して４Ｃで３０分間インキュベートした。次いで、１５０μＬの染色緩衝液を全てのウェルに添加し、プレートを４００×ｇで４分間回転させて、細胞をペレット化した。１５０ｕＬのＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔランニング緩衝液を全てのウェルに添加し、プレートを４００×ｇで４分間回転させて、細胞をペレット化した。細胞を、１：１０００希釈のＳｙｔｏｘ Ｂｌｕｅ死細胞株を含有する２０～３０μＬの泳動緩衝液中に再懸濁させ、プレートをｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ上で浮動させた。簡潔に述べると、細胞をＦＣＳ対ＳＣＳでゲーティングし、残骸を除去した。シングレットをＳＣＳ－Ａ対ＳＣＳ－Ｈ上でゲーティングし、分離し、細胞を最初にＣＦＳＥ染色に基づいてＢＬ１チャネル上でゲーティングし、次いで、生細胞をゲーティングするためにＳｙｔｏｘ ｂｌｕｅ生存率染色を用いて低／陰性でＶＬ１チャネル上でゲーティングした。ｓｃＦｖ分子の結合を、生細胞集団からのＲＬ１チャネル上のＧｅｏｍｅａｎｓによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてデータを解析した。最終的に、４つのヒト化マトリックス化クローンが、６５℃の熱ショック後に結合を保持する、最も望ましい特性を示し、選択された。これらのクローンを、ＣＤ３Ｂ２０２９、ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、及びＣＤ３Ｂ２０８９と記載した。
表１０、１１、及び１２は、ＣＤ３Ｂ２０２９、ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、及びＣＤ３Ｂ２０８９について、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸、ＤＮＡ、及びＣＤＲ配列を示す。
表１３は、表９からの試験された全てのクローンについての組換えＣＤ３（ＴＲＣＷ５、配列番号３９）への熱安定性ＥＬＩＳＡ結合データを示す。
表１４は、選択されたクローンについての細胞安定性ＥＬＩＳＡ結合データを示す。
Figure 2024510777000013
Figure 2024510777000014
Figure 2024510777000015
Figure 2024510777000016
Figure 2024510777000017
Figure 2024510777000018
翻訳後修飾リスクの軽減
親分子は、位置番号をＣＤ３Ｂ２０２９、ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、又はＣＤ３Ｂ２０８９配列（配列番号５５、５４、又は４８）のＶＨのＮ末端から数えた場合の位置＃１０６～１０７で、ＣＤＲＨ３中に「ＮＧ」モチーフを含有することが決定された。「ＮＧ」モチーフは、翻訳後修飾（ＰＴＭ）、特にＡｓｎ脱アミド化のリスクを潜在的に提示し、活性の喪失をもたらし得る。このＰＴＭリスクを軽減するために、選択されたヒト化バリアントＣＤ３Ｂ２０２９、ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、及びＣＤ３Ｂ２０８９を、当該技術分野で周知の分子生物学技術を使用して、それぞれＮ１０６位置で更に変異させた（表１５及び１６）。位置Ｎ１０６を、以下の残基Ａ／Ｇ／Ｓ／Ｆ／Ｅ／Ｔ／Ｒ／Ｖ／Ｉ／Ｙ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｋのうちの１つに変異させた。これらの新しいバリアントを、上記のように、滴定、熱ストレス、及び細胞結合を含む様々なアッセイに再度曝露した。ＥＬＩＳＡによって決定した、汎Ｔ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞への結合についてのＥＣ５０値を表１７に示し、一例として、組換えＣＤ３（ＴＲＣＷ５、配列番号３９）に対するＣＤ３Ｂ２０３０バリアントについての結合曲線を図４に示す。示された熱曝露後に保持された結合％を表１８に示す。これらのアッセイから、Ｎ位置に対する４つの別々のアミノ酸置換を更なる試験のために選択した。Ｎ１０６でのほとんどの突然変異は、ある程度まで結合を維持し、全てが、Ｔ細胞再指向の効率を調整する方法を提供し、Ｎ１０６での脱アミド化のリスクを首尾よく排除することができたので、価値があると考えられた。
表１５は、ＣＤ３Ｂ２０２９、ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、及びＣＤ３Ｂ２０８９配列を使用して作製されたバリアントＣＤＲ配列を示す。
表１６は、位置番号をＣＤ３Ｂ２０２９、ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、又はＣＤ３Ｂ２０８９（配列番号５５、５４、又は４８）のＶＨのＮ末端から数えた場合の、ＣＤ３Ｂ２０２９、ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、及びＣＤ３Ｂ２０８９配列を使用して作製されたＨＣＤＲ３配列における置換のリストを示す。
Figure 2024510777000019
Figure 2024510777000020
Figure 2024510777000021
Figure 2024510777000022
ＥＬＩＳＡデータに基づいて、本発明者らは、親分子に対して類似の親和性を有する２つの置換を選択した。ＮＧモチーフについて、本発明者らは、Ｎ１０６位置をＱ又はＡで置換することを選択した。更に、親和性を低下させ得る、可能性のある置換を得ることが望まれた。ＮＧモチーフについて、本発明者らは、Ｎ位置についてＧ及びＳを選択した（これは、ＥＬＩＳＡデータに基づいて、親和性を適度に低下させた）。次いで、これらのバリアントを、細胞傷害性を媒介するそれらの能力及びそれらの生物物理学的特徴についての更なる分析のためにｂｓＡｂとしてフォーマット化した。ＣＲＩＳ－７ベースのｓｃＦｖ部分は、ｂｓＡｂにおいてＬＨ配向及びＨＬ配向の両方でフォーマット化したことに留意されたい。ＬＨ配向は、ＣＤ３に対する親和性を調節し、したがってＴ細胞再指向の効率を調整する更なる能力を提供した。
表１９は、選択されたＣＤ３特異的バリアントの配列を示す。
Figure 2024510777000023
Figure 2024510777000024
エピトープ同定
水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって、ＣＤ３上のエピトープを決定した。抗体クローンＯＫＴ３をＨＤＸ実験の対照として使用し、これは、そのＣＤ３ε上のエピトープが結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＳＹ６）から分かっていたためである（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，７６７５－７６８０）。
ＨＤＸ－ＭＳのオンエクスチェンジ実験。血清アルブミンドメインに融合した２６ａａリンカー領域と融合したＣＤ３εγで構成された１０μＬの１０μＭ ＣＤ３Ｗ２２０（配列番号５）を、１．２モル過剰のリガンド及び３０μＬのＨ２Ｏ又は重水素化緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．４、９５％のＤ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．４、９５％のＤ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と混合して又は混合せずに、オンエクスチェンジ反応を開始させた。反応混合物を１５、５０、１５０、５００、又は１，５００秒間１．２℃でインキュベートした。オンエクスチェンジした溶液を、冷却した４０μＬの８Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ３．０を添加することによってクエンチし、直ちに分析した。
ＣＤ３Ｗ２２０（ＣＤ３εγ－ＨＳＡ－６ｘＨｉｓ）（配列番号９２）：
ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
ＨＤＸ－ＭＳデータ取得のための手順。自動ＨＤｘシステム（ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を用いて、ＨＤＸ－ＭＳサンプル調製を行った。カラム及びポンプは、プロテアーゼ、プロテアーゼＸＩＩＩ型（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼ、ＸＩＩＩ型）／ペプシンカラム（ｗ／ｗ、１：１、２．１×３０ｍｍ）（ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、トラップ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（２．１×５ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、分析用、Ａｃｃｕｃｏｒｅ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＬＣポンプ、ＶＨ－Ｐ１０－Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。ローディングポンプ（プロテアーゼカラムからトラップカラムへ）は、９９％の水、１％のアセトニトリル、０．１％のギ酸で６００μＬ／分に設定した。勾配ポンプ（トラップカラムから分析カラムへ）は、１００μＬ／分において２０分間で０．１％ギ酸水溶液中８％～２８％のアセトニトリルに設定した。
ＭＳデータ取得。２７５℃のキャピラリ温度、分解能１５０，０００、及び質量範囲（ｍ／ｚ）３００～１，８００で、ＬＴＱ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質量分析を実行した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ抽出。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ３．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＨＤＸ実験の前に非重水素化サンプルのペプチド同定に使用した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）を使用して、ＨＤＸ実験についてのＭＳ生データファイルから質量中心値を抽出した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ分析。抽出されたＨＤＸ－ＭＳデータをＥｘｃｅｌで更に分析した。全ての交換時点（１．２℃でｐＨ６．４又はｐＨ８．４）を、ｐＨ７．４及び２３℃における等価時点に変換した（例えば、１．２℃、ｐＨ６．４で１５秒は、２３℃、ｐＨ７．４で０．１５秒と等価である；表２０）。
Figure 2024510777000025
結果。抗体クローンＯＫＴ３をＨＤＸ実験の対照として使用し、これは、そのＣＤ３ε上のエピトープが結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＳＹ６）から分かっていたためである。ＣＤ３εに結合したＯＫＴ３の結晶構造と一致して、ＯＫＴ３のエピトープは、残基２９～３７、７９～８４、及び８７～８９にわたるペプチドからなることが見出された。Ｃｒｉｓ７ｂによって結合されたＣＤ３ε上のエピトープを決定するために、Ｆａｂ（配列番号９３及び９４）としてフォーマット化し、抗原特異性ｓｃＦｖ－Ｆｃアームと対合させたＣｒｉｓ７ｂ－Ｎ１０６Ｑを含む二重特異性タンパクを使用した。この実験は、Ｃｒｉｓ７が、ＯＫＴ３のものと部分的に重複する残基３３～３７、５３～５４、及び７９～８４にわたるペプチドからなるエピトープと相互作用するが、ＯＫＴ３と比較して独特である残基５３～５４にわたるペプチドとも相互作用することを示した。
Ｃｒｉｓ７ｂ－Ｎ１０６Ｑ ＨＣ、配列番号９３：
ＱＶＱＬＬＱＳＡＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＲＳＴＭＨＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＳＳＡＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＰＱＶＨＹＤＹＱＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ｃｒｉｓ７ｂ－Ｎ１０６Ｑ ＬＣ、配列番号９４：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＡＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＲＬＩＹＤＳＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＲＮＰＰＴＦＧＱＧＴＭＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
実施例２．二重特異性フォーマットにおける新規ＣＤ３結合剤の特性評価。
実施例１で生成した抗ＣＤ３抗体のＶＨ／ＶＬ領域及び以下に記載の抗ＢＣＭＡのＶＨ／ＶＬ領域を、二重特異性フォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた（表２１）。
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３ ｓｃＦｖの遺伝子操作。
ＣＤ３ ＶＨ／ＶＬ領域を、配列番号３のリンカーを使用して、ＶＨ－リンカー－ＶＬ（「ＨＬ」とも呼称される）又はＶＬ－リンカー－ＶＨ（「ＬＨ」とも呼称される）配向のいずれかのｓｃＦｖとして遺伝子操作した（表２２）。ＣＤ３に結合するＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのｓｃＦｖ分子を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＴ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｓｃＦｖ－Ｆｃとも呼称される）フォーマットに更に遺伝子操作した（表２３）。配列番号９５のポリペプチドを定常ドメインヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３として使用した。ｓｃＦｖフォーマット及びｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットでの抗ＣＤ３分子のＤＮＡ配列を、表２４に示す。
Figure 2024510777000026
Figure 2024510777000027
 ＨＬ－ Ｆｃに融合したＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＬＨ－ Ｆｃに融合したＶＬ－リンカー－ＶＨ
Figure 2024510777000028
Figure 2024510777000029
Figure 2024510777000030
Figure 2024510777000031
Figure 2024510777000032
Figure 2024510777000033
Figure 2024510777000034
Figure 2024510777000035
Figure 2024510777000036
Figure 2024510777000037
Figure 2024510777000038
Figure 2024510777000039
Figure 2024510777000040
Figure 2024510777000041
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Figure 2024510777000044
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Figure 2024510777000048
Figure 2024510777000049
Figure 2024510777000050
Figure 2024510777000051
Figure 2024510777000052
Figure 2024510777000053
Figure 2024510777000054
Figure 2024510777000055
Figure 2024510777000056
Figure 2024510777000057
Figure 2024510777000058
Figure 2024510777000059
Figure 2024510777000060
Figure 2024510777000061
Figure 2024510777000062
Figure 2024510777000063
Figure 2024510777000064
Figure 2024510777000065
Figure 2024510777000066
Figure 2024510777000067
Figure 2024510777000068
Figure 2024510777000069
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３ Ｆａｂの遺伝子操作
ＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む配列番号２２０のポリペプチドを使用して、ＣＤ３特異的ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を生成した（表２５）。
配列番号２２０（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）＿ＡＡＳ＿ＺＷＡ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２２１又は２２２のポリペプチドを使用して、ＣＤ３特異的ＶＬ－ＣＬを生成した（表２６）
配列番号２２１（ヒトカッパ軽鎖）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２２２（ヒトラムダ軽鎖）
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットのＨＣ及びＶＬ－ＣＬフォーマットのＬＣとしての抗ＣＤ３分子のＤＮＡ配列を表２７に示す。
Figure 2024510777000070
Figure 2024510777000071
Figure 2024510777000072
Figure 2024510777000073
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性生成のためのＢＣＭＡ Ｆａｂ－Ｆｃの遺伝子操作
ＢＣＭＡ特異性ＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作した。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗを含む配列番号２３０のポリペプチドを使用して、ＣＤ３特異的ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を生成した）。
配列番号２３０（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）＿ＡＡＳ＿ＺＷＢ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２３１又は２３２のポリペプチドを使用して、ＢＣＭＡ特異性ＶＬ－ＣＬを生成した。
配列番号２３１（ヒトカッパ軽鎖）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２３２（ヒトラムダ軽鎖）
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
ＢＣＭＡ Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を以下に示す。
ＢＣＭＡ Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖（配列番号２３３）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＥＧＹＳＳＧＨＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ＢＣＭＡ Ｆａｂ－Ｆｃ軽鎖（配列番号２３４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＳＳＦＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＧＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＹＧＳＳＰＭＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性生成のためのＢＣＭＡ ｓｃＦｖ－Ｆｃの遺伝子操作
実施例２に記載されるように、配列番号３のリンカー（表２）を使用してＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして遺伝子操作されたＢＣＭＡ ＶＨ／ＶＬ領域を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに更に遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた（表２８）。配列番号２３５のポリペプチドを定常ドメインヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｆｃ）として使用した。
配列番号２３５（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）－ヒンジ－Ｆｃ＿Ｃ２２０Ｓ＿ＡＡＳ＿ＺＷＢ）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Figure 2024510777000074
 ｂｓＡｂを、熱安定性、Ｔ細胞に結合する能力、及び細胞傷害性についてアッセイした。
熱安定性分析
熱的安定性については、熱アンフォールディング及び凝集を、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ ＰｒｏｍｅｔｈｉｕｓＮＴ．４８機器で１℃／分の勾配を使用して２０℃～９５℃で測定した。次いで、サンプルを毛細管作用によってナノＤＳＦ毛細管に移し、二連でアッセイした（表２）。全てのバリアント（ＢＣ３Ｂ１２６を除く）は、類似のＴｏｎｓｅｔ、Ｔｍ１、及びＴａｇｇを有し、これは、特定の復帰突然変異も、ＶＨ Ｎ１０６における突然変異の同一性も、熱安定性に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。平均して、ｂｓＡｂは、６１、６８、及び７７℃のＴｏｎｓｅｔ、Ｔｍ１、及びＴａｇｇを有し、ここで、Ｔｍ１は、ｓｃＦｖ部分の融点を表し、全てのＣｒｉｓ－７バリアントが治療薬開発に適し得ることを示唆した。
Figure 2024510777000075
活性分析
Ｔ細胞に結合する能力、又は各抗原を発現する細胞に対するＴ細胞ベースの細胞傷害性を誘導する能力のいずれかについて、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を試験した（表２９及び３０）。結合及び細胞傷害性アッセイを以下に記載する。
ｂｓＡｂを、Ｔ細胞に結合する能力、及びＨ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８（商標））に対するＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する能力についてアッセイした。Ｔ細胞結合のためには、簡潔に述べると、ｂｓＡｂをアッセイ培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＨＩ－ＦＢＳ）中で２倍濃度６００ｎＭで調製し、１１点滴定のために染色緩衝液中の滅菌ポリプロピレン（polypropylene、ＰＰ）ｇｒｅｉｎｅｒプレート中で３倍連続希釈で希釈した。抗体を含まない染色緩衝液を下の４ウェルに添加し、バックグラウンド対照（二次抗体単独）として割り当てた。親Ｃｒｉｓ７ｂ、ＣＤ３Ｂ６９５（二価ｍＡｂ対照）及びＣＤ３Ｂ３７５（Ｃｒｉｓ－７ｂに対して一価であったｂｓＡｂ）も完全な用量応答曲線と共に添加した。
Ｆｏｚｅｎ Ｔ細胞を３７℃の水浴中で解凍し、温かい５ｍＬの培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）／１×１０６細胞の１バイアルを含有するコニカルチューブに穏やかに移した。細胞を混合し、４００×ｇで５分間遠心分離し、続いてフロー染色緩衝液に再懸濁させ、計数し、生存率をチェックした。次いで、細胞を５０μＬ／５０，０００細胞／ウェルでアッセイプレートにプレーティングした。アッセイ陽性対照ｍＡｂを、下の４ウェルに２０ｎＭにて２倍、四連で第１のカラムに添加した。ｍＡｂを含まない染色緩衝液を上の４ウェルに添加し、バックグラウンド対照（二次抗体単独）として割り当てた。連続希釈した抗体サンプルを、添付のプレートマップに従ってＩｎｔｅｒｇｒａ Ｖｉａｆｌｏを使用して５０ｕＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、１５０μＬの染色緩衝液を全てのウェルに添加し、細胞を５００×ｇで５分間回転させて、細胞をペレット化した。次いで、細胞を洗浄した後、染色緩衝液中２ｕｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａ６４７）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的二次検出抗体を添加した。洗浄した細胞に二次検出抗体を５０ｕＬ／ウェルで添加した。プレートをホイルで覆い、氷上又は冷蔵庫中で３０分間インキュベートした。１５０μＬの染色緩衝液を全てのウェルに添加し、細胞を５００×ｇで５分間回転させて、細胞をペレット化した。細胞を、１：１０００希釈のＳＹＴＯＸ（商標）緑色死細胞染色を含有する２０ｕＬのランニング緩衝液中に再懸濁させ、ｉＱｕｅ（登録商標）Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメータ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）上でプレートを浮動させた。簡潔に述べると、細胞をＦＣＳ対ＳＣＳドットプロットでゲーティングし、残骸を除去した。シングレットをＳＣＳ－Ａ対ＳＣＳ－Ｈドットプロットでゲーティングし、シングレット母集団から、ＳＹＴＯＸ（商標）緑色生存能染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて低／陰性についてＢＬ１チャンネルを選択して生細胞をゲーティングした。対照ｍＡｂ又は試験パネル上清の細胞結合を、生存細胞集団からのＲＬ１（Ａ６４７）Ｇｅｏｍｅａｎによる陰性／アイソタイプ対照結合と比較することによって評価した。
抗体サンプル調製
ｂｓＡｂをアッセイ培地中２０ｎＭで調製し、アッセイ培地中１１点滴定のために３倍に連続希釈し、４Ｃで保存した。
標的細胞（Ｈ９２９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８（商標））を、Ｆｃブロックを５ｕＬ／１×１０６個の細胞（１千万個の細胞当たり５０ｕＬ）で添加することによって調製し、室温で２０分間、３７℃でインキュベートした。細胞をプレーティングのために４×１０５細胞／ｍｌに希釈した。対照ウェルに５０μＬの培地／ウェルを補充し、３７℃でインキュベートした。Ｔ細胞バイアルを３７℃で解凍して、室温アッセイ培地（５ｍＬ培地／１バイアルの細胞）を含有する５０ｍＬコニカルチューブに入れた。細胞を３００×ｇで５分間回転させ、１０ｍＬの新鮮な培地に再懸濁させ、計数した。５：１のＥ：Ｔ比のために、２×１０６／ｍＬのＴ細胞懸濁液を調製した。細胞を、プレートマップに従って、腫瘍標的細胞（上記の工程から）を既に含有するアッセイプレートに対して５０ｕＬ／１００ｋ／ウェルで調製した。対照ウェルに５０μＬの培地／ウェルを補充し、３７℃でインキュベートした。
抗体を１００μＬ／ウェルで添加し、混合腫瘍標的細胞及びＴ細胞を含有するアッセイプレートに１０ｎＭから開始して連続希釈した。標的細胞は２０，０００細胞／ウェルであり、汎Ｔ細胞数は１００，０００細胞／ウェルであった。総アッセイ体積は、２００μＬ／ウェルであった。プレートを加湿細胞培養インキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
１５０μＬのＢＤ染色緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、３００×ｇで５分間回転させた。
ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４（１：１００）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＦＡＢ３７９１Ａ－０２５）
ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ８（１：１００）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＦＡＢ１５０９Ａ－０２５）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）コンジュゲート抗ヒトＣＤ２５（１：５００）
１：１２５００希釈のＶｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだＢＤ染色緩衝液中の染色溶液混合物を別々に調製し、５０ｕＬ／ウェル染色溶液混合物でアッセイプレートの全てのウェルに添加した。２５ｕＬ／ウェルの希釈した鮮やかな緑色色素を、全てのアッセイプレートの１番目の対照カラムの上の２ウェルに添加し、続いて室温で２０分間インキュベートした。プレートを１５０μＬ染色緩衝液で２回洗浄し、ＳＹＴＯＸ（商標）緑色生／死染色（１：１０００）を含有する３０μＬのＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標）ランニング緩衝液に再懸濁させ、ｉＱｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ Ｓｃｒｅｅｎｅｒを使用して４時間以内に分析した。
細胞を、ＦＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ｈでゲーティングし、Ｔ細胞及び腫瘍の細胞集団を、ＡＰＣ（ＲＬ１）対ＳＳＣ－Ｈで全ての細胞からゲーティングした。生細胞及び死細胞（生／死染色）を、ＦＳＣ－Ｈ対Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ（ＢＬ２）上のそれらのそれぞれのドットプロットから腫瘍及びＴ細胞の両方についてゲーティングした。生存Ｔ細胞を使用して、活性化／ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を、ＦＳＣ－Ｈ対Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（ＶＬ１）でゲーティングした。細胞集団を以下のように決定した：
死滅腫瘍細胞＝ＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎ生－死滅染色陽性／総腫瘍細胞×１００
生存Ｔ細胞％＝Ｌ／Ｄ陰性Ｔ細胞／総Ｔ細胞×１００
活性化Ｔ細胞％＝ＣＤ２５陽性生存Ｔ細胞／生存Ｔ細胞×１００
細胞結合分析は、Ｃｒｉｓ－７バリアントがＴ細胞に対してある範囲の親和性を示すことを示し、この細胞に基づく親和性は細胞傷害性のＥＣ５０と相関した（表２９）。概して、ｓｃＦｖとして重－軽配向でフォーマット化されたＣｒｉｓ－７ ｖ領域のバリアントは、ＥＬＩＳＡデータと一致して、ＬＨ配向よりも約１０倍強固な、細胞への結合を示した。Ｎ１０６に基づく脱アミド化の危険性を排除するための変異の性質は、Ｔ細胞結合及び細胞傷害性に対して有意な効果を有した。全体として、Ｎ１０６Ｑ／Ａ／Ｇ／Ｓの突然変異と組み合わされた３つの異なる組の復帰突然変異（ＣＤ３Ｂ２０３０、ＣＤ３Ｂ２０５１、及びＣＤ３Ｂ２０８９によって定義される）は、３～約３００ｎＭの範囲のＴ細胞結合のＥＣ５０を有するＣｒｉｓ－７バリアントのパネルをもたらし、０．０１２～３．５ｎＭの細胞傷害性のＥＣ５０と相関した。Ｔ細胞再指向ｂｓＡｂ（ｂｓＴＣＥ）に関して、腫瘍標的化に対する親和性と比較してより弱い親和性のＴ細胞性再指向は、異常なＴ細胞性活性化、二次リンパ器官における蓄積、及びサイトカイン放出と関連する傷害性を最小化しながら、効力を最大化するための抗体の設計を可能にし得る。更に、「ＬＨ」配向のＣｒｉｓ－７由来ｓｃＦｖは、ＨＬ配向と比較して、Ｔ細胞への結合が弱かった。したがって、このパネルは有利であると考えられ、したがって、本発明者らは、リードｂｓＴＣＥにおいて使用するための結合親和性の範囲を示すＣｒｉｓ－７バリアントのサブセットを選択した。
Figure 2024510777000076
Figure 2024510777000077
実施例３：二重特異性ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３抗体及び三重特異性ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の発現及び精製
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体（bispecific antibody、ｂｓＡｂ）は、Ｔリンパ球上の分化抗原群（ＣＤ）３受容体複合体と、Ｂリンパ球上のＣＤ７９ｂとに、同時に又は個別に結合することができる免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１二重特異性抗体である。ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体は、Ｔリンパ球上のＣＤ３受容体複合体と、Ｂリンパ球上のＣＤ２０受容体複合体と、Ｂリンパ球上のＣＤ７９ｂ受容体複合体とに、同時に又は個別に結合することができる免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１三重特異性抗体である。抗体は、Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減する突然変異を有し、ヘテロ二量体化は、ノブインホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ）プラットフォーム突然変異を使用して増強されている。三重特異性抗体は、Ｔ細胞再指向のための二重標的化ＣＤ２０及びＣＤ７９ｂの治療可能性を評価するために開発された。例示的なＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の例解を図６に描出する。
表３１に、本明細書に記載されたいくつかのＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体の例の概要を提供する。
Figure 2024510777000078
Figure 2024510777000079
配列番号１４６３ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４６４ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４６５ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４６６ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４６８ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４６９ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４７２ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４７３ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４７６ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８０ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８１ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８４ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８５ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８６ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８７ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８８ 三重特異性Ａｂ ＣＤ３－ＣＤ２０アーム
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配列番号１４８９ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１４９０ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１４９１ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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配列番号１４９２ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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配列番号１４９３ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１４９４三重特異性／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１４９５ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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配列番号１４９６ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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配列番号１４９７ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１４９８ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１４９９ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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配列番号１５００ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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配列番号１５０１ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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配列番号１５０２ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１５０３ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＨＣ
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配列番号１４９９ 三重／二重特異性Ａｂ ＣＤ７９ｂアームＬＣ
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表３２に、本明細書に記載されたいくつかのＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体の例の概要を提供する。
Figure 2024510777000080
配列番号１５０４ 二重特異性Ａｂ ＣＤ３アーム
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配列番号１５０５ 二重特異性Ａｂ ＣＤ３アーム
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＣＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡ
配列番号１５０６ 二重特異性Ａｂ ＣＤ３アーム
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＡＳＰＧＥＲＶＴＬＳＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＲＷＩＹＤＳＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＲＤＹＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＲＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＳＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＳＳＡＹＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＱＶＨＹＤＹＧＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１５０７ 二重特異性Ａｂ ＣＤ３アーム
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＣＣＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡ
抗体を、製造業者の推奨に従って精製プラスミドＤＮＡを用いた一過性トランスフェクションによって、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号Ａ２９１２７）において発現させた。簡潔に述べると、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％ＣＯ２、及び１２５ＲＰＭに設定された軌道振盪インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１００）中に懸濁させて維持した。細胞を継代し、トランスフェクションの前に、６．０×１０６個の細胞／ｍｌに希釈し、細胞生存率を９９．０％以上で維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈された細胞１ｍｌごとに、０．５マイクログラムのＤＮＡをコードする二重特異性（ＨＣ１：ＨＣ２：ＬＣ＝１：２：２）及び０．５マイクログラムのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７１１）を使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体形成培地中に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、１：４比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）に希釈した。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサを、製造業者の標準プロトコルのとおり、細胞に添加した。細胞を軌道振盪（１２５ｒｐｍ）により、３７℃で７日間インキュベートした後、培養ブロスを採取した。一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、３０００ｒｃｆ）、続いて濾過（０．２μｍのＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）によって浄化した。
濾過した細胞培養上清を、ＡＫＴＡＸｐｒｅｓｓクロマトグラフィシステムを使用して、予め平衡化した（１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ロードした後、カラムを１０カラム体積の１×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎａ）（ｐＨ３．５）で溶出した。タンパク質画分を、２．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を溶出分画量の２０％（ｖ／ｖ）まで添加することによって完全に中和した。ピーク画分をプールし、ＣＨ１カラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）にロードした。ロードした後、カラムを１０カラム体積の１×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎａ）（ｐＨ３．５）で溶出した。タンパク質画分を、２．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２を最終体積の１５％（ｖ／ｖ）まで添加することによって部分的に中和した。高分子量種を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する分取サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）によって除去した。サンプル注入後、カラムを１×ＤＰＢＳで展開し、主要ピーク画分をプールし、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５中に透析し、濾過した（０．２μｍ）。
精製したタンパク質の濃度を、Ｄｒｏｐｓｅｎｓｅ分光光度計で２８０ｎｍにおける吸光度によって決定した。精製したタンパク質の量を、ｃＳＤＳ及び分析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステム）によって評価した。内毒素レベルを比濁ＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）－Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ；Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）を使用して測定した。
実施例４：二重特異性及び三重特異性抗体結合の特性評価
ＣＤ７９＋標的細胞への二重特異性ＣＤ７９×ＣＤ３抗体の結合
ＣＤ７９×ＣＤ３二重特異性分子のＣＤ７９ｂ結合アームの結合親和性を、表３３に示す、細胞表面上のＣＤ７９ｂの異なる内因性発現レベルを有することがフローサイトメトリによって検証された細胞株を使用して評価した。
Figure 2024510777000081
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株を、３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３試験分子７９Ｃ３Ｂ６４６、７９Ｃ３Ｂ６５１、及び７９Ｃ３Ｂ６０１（１：３連続希釈で開始濃度１ｕＭ）と共に１時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を、１：２００希釈の、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ；カタログ番号１０９－６０６－０９８）を、１：４００希釈のＡｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号３４９５７）と共に用いて、４℃で２０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｆｏｒｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均蛍光強度（mean fluorescent intensity、ＭＦＩ）を生成した。ＭＦＩをグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＥＣ５０値を生成した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
全てのＣＤ７９ｂ×ＣＤ３分子は、細胞表面に内在性ＣＤ７９ｂを発現する細胞株に対する良好な結合を示し、構築物７９Ｃ３Ｂ６５１のＣＤ７９ｂ結合アームは、試験した全ての細胞株にわたって最も高い結合親和性を示した。これを図７Ａ～図７Ｄ及び表３４に示す。
Figure 2024510777000082
ＣＤ７９ｂ＋及びＣＤ２０＋標的細胞への三重特異性ＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の結合
ＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性分子並びに対照ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３及びヌル×ＣＤ２０×ＣＤ３のＣＤ７９ｂ結合アームの結合親和性を、細胞表面上のＣＤ７９ｂ及びＣＤ２０の異なる内在性発現レベルを有することがフローサイトメトリによって検証された細胞株を使用して評価した。これを表３５に示す。
Figure 2024510777000083
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株を、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３試験分子Ｃ９２３Ｂ７４、Ｃ９２３Ｂ９９、及びＣ９２３Ｂ３８、ＣＤ７９×ＣＤ３試験分子７９Ｃ３Ｂ６４６、７９Ｃ３Ｂ６５１、及び７９Ｃ３Ｂ６０１、並びにヌル×ＣＤ２０×ＣＤ３対照分子Ｃ９２３Ｂ９８（１：３連続希釈で開始濃度１ｕＭ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、１：２００希釈の、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ；カタログ番号１０９－６０６－０９８）を、１：４００希釈のＡｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号３４９５７）と共に用いて、細胞を４℃で２０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｆｏｒｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生成した。ＭＦＩをグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＥＣ５０値を生成した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
全てのＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３分子は、細胞表面に内在性ＣＤ７９ｂ及びＣＤ２０を発現する細胞株への良好な結合を示し、いくつかの三重特異性構築物は、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３及びＣＤ２０×ＣＤ３対照分子の結合と比較した場合、細胞株にわたってより良好な結合親和性を示した。これを図８Ａ～図８Ｄ及び表Ａ１０に示す。三重特異性構築物Ｃ９２３Ｂ９９のＣＤ７９ｂ結合アームは、試験した全ての細胞株にわたって最も高い結合親和性を示した。これを図８Ａ～図８Ｄ及び表３６に示す。
Figure 2024510777000084
ＣＤ７９＋標的細胞への二重特異性ＣＤ７９×ＣＤ３抗体の動的細胞結合
ＣＤ７９×ＣＤ３二重特異性分子のＣＤ７９ｂ結合アームの結合動態を、細胞表面上のＣＤ７９ｂの異なる内因性発現レベルを有することがフローサイトメトリによって検証された細胞株を使用して、経時的に評価した。これを表３７に示す。
Figure 2024510777000085
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株を、３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３試験分子７９Ｃ３Ｂ６４６、７９Ｃ３Ｂ６５１、及び７９Ｃ３Ｂ６０１（３００ｎＭ、６０ｎＭ、１２ｎＭ）と共に１、３、２４、及び４８時間インキュベートした。各時点で、細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、１：２００希釈の、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ；カタログ番号１０９－６０６－０９８）を用いて、細胞を４℃で３０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、１：１０００希釈のＣｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ生存率色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ３４８６０）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｆｏｒｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生成した。ＭＦＩをグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＥＣ５０値を生成した。
図９Ａ～図９Ｉに示すように、全てのＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性構築物は、経時的なシグナルの損失が最小限である安定したＣＤ７９ｂ結合動態を示した。７９Ｃ３Ｂ６５１は、優れた結合動態及び経時的な最小量のシグナル損失を示した。これを図９Ａ～図９Ｉに示す。
ＣＤ７９ｂ＋及びＣＤ２０＋標的細胞への三重特異性ＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の動的細胞結合
ＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性分子のＣＤ７９ｂ及びＣＤ２０結合アームの結合動態を、細胞表面上のＣＤ７９ｂ及びＣＤ２０の異なる内因性発現レベルを有することがフローサイトメトリによって検証された細胞株を使用して、経時的に評価した。これを表３８に示す。
Figure 2024510777000086
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株を、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３試験分子Ｃ９２３Ｂ７４、Ｃ９２３Ｂ９９、及びＣ９２３Ｂ３８、ＣＤ７９×ＣＤ３試験分子７９Ｃ３Ｂ６４６、７９Ｃ３Ｂ６５１、及び７９Ｃ３Ｂ６０１、並びにヌル×ＣＤ２０×ＣＤ３対照分子Ｃ９２３Ｂ９８（３００ｎＭ、６０ｎＭ、１２ｎＭ）と共に３７℃で１、３、２４、及び４８時間インキュベートした。各時点で、細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、１：２００希釈の、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ；カタログ番号１０９－６０６－０９８）を用いて、細胞を４℃で３０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、１：１０００希釈のＣｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ生存率色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ３４８６０）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｆｏｒｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生成した。ＭＦＩをグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＥＣ５０値を生成した。
全てのＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性構築物は、経時的なシグナルの損失が最小限である安定したＣＤ７９ｂ結合動態を示した。これを図１０Ａ～図１０Ｉに示す。三重特異性構築物Ｃ９２３Ｂ９９及び二重特異性構築物７９Ｃ３Ｂ６５１は、両方とも同じＣＤ７９ｂ及びＣＤ２０結合アームを有し、優れた結合動態及び最小量の経時的シグナル損失を示した。これを図１０Ａ～図１０Ｉに示す。
汎Ｔ細胞への二重特異性ＣＤ７９×ＣＤ３抗体及び三重特異性ＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の結合
ＣＤ７９×ＣＤ３二重特異性構築物及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性構築物のＣＤ３アームの結合を、凍結保存され、陰性に選択された初代ヒトＣＤ３＋汎Ｔ細胞を使用して評価した。４人の異なるドナーからの初代ヒトＣＤ３＋汎Ｔ細胞を、３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３試験分子Ｃ９２３Ｂ７４、Ｃ９２３Ｂ９９、及びＣ９２３Ｂ３８、又はＣＤ７９×ＣＤ３試験分子７９Ｃ３Ｂ６４６、７９Ｃ３Ｂ６５１（１：３連続希釈で開始濃度１μＭ）と共に１時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、１：３００希釈のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ；カタログ番号１０９－６０６－０９８）を用いて、細胞を４℃で２０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、１：１０００希釈のＣｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ生存率色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ３４８６０）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｆｏｒｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生成した。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用して、ＭＦＩをグラフ化した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
全てのＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３及びＣＤ７９ｂｘＣＤ３分子は、細胞表面上の内因性ＣＤ３を発現する全てのドナー汎Ｔ細胞への中等度の結合を示した。これを図１１Ａ～図１１Ｄに示す。
実施例５：機能的特性評価：ＣＤ７９×ＣＤ３二重特異性抗体及びＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体のアンタゴニスト活性
ＣＤ７９Ｂ＋及びＣＤ７９Ｂ－標的細胞への二重特異性ＣＤ７９×ＣＤ３及び三重特異性ＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３媒介性細胞傷害性
ｍＫＡＴＥ２ ＤＬＢＣＬ標的細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有する完全ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１８７５０９３）１６４０培地中で維持した。アッセイの前に、抗体を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中、３倍連続希釈で、予想最終濃度の４倍で作製した。９６ウェルプレートの各ウェル中の５０μＬの体積の培地希釈ｂｓＡｂ又は三重特異性Ａｂを、標的及びエフェクター細胞懸濁液の混合物を添加することによって２００μＬに更に希釈した。標的細胞株を４００×ｇで５分間の遠心分離によって収集し、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄し、計数し、新鮮な完全フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地中に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁させた。健常ドナーＴ細胞（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供されたＣＤ３陰性選択によって単離された）を完全フェノールレッドを含まない培地（熱不活性化ウシ胎仔血清を１０％含有するＲＰＭＩ １６４０培地）中で解凍し、計数し、新鮮な完全フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地中に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁させた。標的細胞及びＴ細胞を混合して、５：１のエフェクター対標的細胞比を得た。細胞懸濁液を、プレートレイアウトに従って抗体希釈ウェルに添加した（１５０μＬ／ウェル）。
標的及びＴ細胞を、対応するｂｓＡｂ希釈物と混合した後、１００００個の標的及び５００００個のＴ細胞を含む２００μｌを含有する各ウェルからの８０μＬを、３８４ウェルプレートに２連で分注した。プレートを、Ｂｒｅａｔｈｅ－Ｅａｓｙ膜シールを使用して密封した。次に、共培養物をＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭライブコンテンツイメージングシステムに設置し、４倍対物レンズで６時間おきに３～６日間、位相及び蛍光の両チャネルで、画像を自動的に取得した（単一のウェル全体画像）。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭソフトウェアを使用して、最適化されたプロセス定義パラメータを使用して、ｍＫＡＴＥ２発現に基づき標的細胞を検出した。ウェル当たりの標的細胞の量を測定するために、総赤色領域を定量化し、未加工値をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ）でエクスポートした。経時的ながん細胞死滅を定量化するために、各複製物の平均値をＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ；バージョン７（ＰＣ用））にペーストした。Ｔｘでの値をＴ０で割ることによって、時点ごとの拡張指数（Expansion index、ＥＩ）を計算した。成長阻害（growth inhibition、ＧＩ）は、各時点をその時点での未処理ウェル平均の値に対して正規化することによって計算した。ＧＩ値から、曲線下面積（area under the curve、ＡＵＣ）値を各条件について導出した。ＡＵＣを未処置対照（エフェクターを有する標的）に対して正規化した後、抗体濃度を用量応答としてＡＵＣ値に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＥＣ５０値を生成した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。リードＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性抗体（７９Ｃ３Ｂ６４６、Ｃ９２３Ｂ７４、７９Ｃ３Ｂ６０１、Ｃ９２３Ｂ３８、７９Ｃ３Ｂ６５１、Ｃ９２３Ｂ９９、７９Ｃ３Ｂ６１３、Ｃ９２３Ｂ９８）を、ＨＢＬ１及びＯＣＩ－Ｌｙ１０細胞に対する細胞傷害性について評価した。ＩＣ５０（ｐＭ）値を、表３９、表４０、表４１、及び表４２に列挙する。
Figure 2024510777000087
Figure 2024510777000088
Figure 2024510777000089
Figure 2024510777000090
標的陽性（ＣＤ７９ｂ＋及びＣＤ２０＋）及び標的陰性（ＣＤ７９Ｂ－及びＣＤ２０－）細胞株のパネル上のＦＡＣＳ Ｔ細胞死滅データ
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性構築物及びＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性構築物の機能的活性を、細胞表面上のＣＤ７９ｂ及びＣＤ２０の異なる内因性発現レベルを有することがフローサイトメトリによって検証された細胞株を使用して、フローサイトメトリによるインビトロＴ細胞死滅アッセイにおいて７２時間の時点で評価した。これを表４３に示す。
Figure 2024510777000091
標的がん細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含有する完全ＲＰＭＩ １６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１８７５０９３）培地中で維持した。アッセイの前に、抗体を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中、３倍連続希釈で、予想最終濃度の４倍で作製した。９６ウェルプレートの各ウェル中の５０μＬの体積の培地希釈二重特異性又は三重特異性Ａｂを、標的及びエフェクター細胞懸濁液の混合物を添加することによって２００μＬに更に希釈した。標的細胞株を、４００×ｇで５分間の遠心分離によって収集し、ＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。標的がん細胞は、１／５０００に希釈したＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：Ｃ３４５５４）を用いた染色標的であった。健常ドナーＴ細胞（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供されたＣＤ３陰性選択によって単離された）を完全培地（熱不活性化ウシ胎仔血清を１０％含有するＲＰＭＩ １６４０培地）中で解凍し、計数し、新鮮な完全フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地中に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁させた。標的細胞及びＴ細胞を混合して、５：１のエフェクター対標的細胞比を得た。細胞懸濁液を、プレートレイアウトに従って抗体希釈ウェルに添加した（１５０μＬ／ウェル）。細胞を３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３又はＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０××ＣＤ３試験分子（１：３連続希釈で開始濃度１００ｎＭ）と共に７２時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を室温で１５分間、１：１０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号６５－０８６５－１４）を用いて染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を４℃で３０分間、フローパネル抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（表４４）を用いて染色し、抗体量を表に列挙したように添加した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｃ（ＢＤ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用して、がん細胞死滅の率を生成した。がん細胞死滅の率をグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＩＣ５０値を生成した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（阻害剤）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
Figure 2024510777000092
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性は、ＣＤ７９－及びＣＤ２０－標的陽性細胞株において、二重特異性構築物と比較して、より強力な細胞傷害性を媒介した。ＩＣ５０（ｐＭ）値を表４５に列挙する。標的陰性細胞株では死滅は観察されていない（図１２Ａ～図１２Ｂ）。
Figure 2024510777000093
 「＊」３人の独立したＴ細胞ドナーからのＴ細胞媒介性死滅の平均値。
「＊＊」４人の独立したＴ細胞ドナーからのＴ細胞媒介性死滅の平均値。
自己Ｂ細胞に対する二重特異性ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３媒介性細胞傷害性
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性構築物の機能活性を、インビトロ自己Ｂ細胞枯渇アッセイにおいて評価した。この機能的アッセイは、ＰＢＭＣを利用して、初代Ｂ細胞の死滅及びドナー適合初代細胞上のＴ細胞活性化に焦点を当てている。３人の異なるヒトドナーからの凍結保存されたＰＢＭＣを、３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３試験分子７９Ｃ３Ｂ６４６、７９Ｃ３Ｂ６５１、及び７９Ｃ３Ｂ６０１（１：３連続希釈で開始濃度３００ｎＭ）と共に７２時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｆｃブロッキング剤（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ；カタログ番号ＮＢ３０９）及び１：４００希釈のＮｅａｒ ＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｌ１０１１９）を含有するＢＤ染色緩衝液を用いて、室温で１０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を４℃で３０分間、１：１００希釈の、フローパネル抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（表４６）を用いて染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｆｏｒｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生成した。ＭＦＩをグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＥＣ５０値を生成した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
Figure 2024510777000094
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性構築物は、図１３Ａ～図１３Ｃに示すとおり、これらのＴ細胞サブセット上のＣＤ２５発現によって実証されるように、低レベルのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化と共に２０パーセントの最大薬物媒介性細胞傷害性を示した。表４７に示すとおり、対照分子と比較した場合、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性は、薬物媒介性細胞傷害性に対して相乗効果を有する。
Figure 2024510777000095
 ＊未確定
実施例６：生物物理学的特性評価
ＳＰＲによる結合親和性
ＳＰＲ親和性評価のための一般的プロトコル：ヒトＣＤ７９ｂに対する二重特異性及び三重特異性構築物の親和性評価を、ＨＢＳＰ＋緩衝液中２５℃でＢｉａｃｏｒｅ ８ｋ ＳＰＲシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）によって、ＣＤ７９ｂ短アイソフォーム及び長アイソフォーム（それぞれＣＤ９Ｗ７．００１及びＣＤ９Ｗ８．００１）の組換え発現細胞外ドメインを使用して測定した。同じ抗体パネルの交差反応性も、カニクイザル及びマウス抗原（それぞれ、ＣＤ９Ｗ１．００１及びＣＤ９Ｗ１０５．００１）に対して評価した。簡潔に述べると、Ｃ１センサチップを、販売業者が推奨するアミノカップリングプロトコルを使用して、抗ヒトＦｃ（標的固定化レベル＞４００ＲＵ）で固定化した。固定化抗Ｆｃを介して試験抗体を捕捉し、続いて、異なる濃度系列の異なるＣＤ７９ｂ構築物を注入した（ヒトＣＤ７９ｂ短アイソフォーム及びヒトＣＤ７９ｂ長アイソフォーム：３倍希釈で３０ｎＭ～０．３７ｎＭ；カニクイザル及びマウスＣＤ７９ｂ：３倍希釈で３０００ｎＭ～３７ｎＭ）。会合相及び解離相を、それぞれ２又は３分間、及び３０分間測定した。ＣＤ３への三重特異性抗体（Ｃ９２３Ｂ１６８及びＣ９２３Ｂ１６９）の結合を、１００ｎＭ～１．２３ｎＭのＣＤ３Ｗ２２０．００１を３倍希釈で注入することによって試験し、会合相及び解離相をそれぞれ３分間及び１５分間測定した（ＣＤ７９ｂ－００４７８）。
生の結合センサグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して二重参照によって処理し、処理したセンサグラムを交差反応性について分析し、１：１ラングミュアモデルに当てはめて、オン速度、オフ速度、及び親和性を得た。
ＳＰＲ結合結果：表４８及び表４９に示されるように、二重特異性及び三重特異性抗体は、ヒトＣＤ７９ｂ長アイソフォーム（ｈｕ ＣＤ７９ｂ長）に０．０２～０．０６ｎＭの親和性で結合し、ＣＤ７９ｂ短アイソフォーム（ｈｕ ＣＤ７９ｂ短）に０．２７～０．６４ｎＭの親和性で結合した。抗体パネルは、カニクイザルＣＤ７９ｂに対して非常に低い交差反応性を示した（ＫＤ推定＞３０００ｎＭ）か、又はマウスＣＤ７９ｂに結合しなかった。Ｃ９２３Ｂ１６８は、０．５ｎＭの親和性で組換えＣＤ３抗原に結合する。以下の要約表に示されるように、特定の抗原を使用して複雑な動態結合プロファイルを有するものについては、定量的動態／親和性は報告されなかった。
Figure 2024510777000096
 ＊ＳＰＲ結合分析のためにサンプルが提出されなかった
＊＊：Ｃｒｉｓ７ｂ由来のＣＤ３抗体について観察された複雑なＳＰＲ結合プロファイル（歴史的に観察された結果）に起因してＣＤ３に対する親和性が確定されなかった。
Figure 2024510777000097
 ＊ＳＰＲ結合分析のためにサンプルが提出されなかった
＊＊Ｃｒｉｓ７ｂ由来のＣＤ３抗体について観察された、ＣＤ２０ナノディスク又は複合体結合プロファイル（歴史的に観察された結果）を用いたＳＰＲ拘束に起因してＣＤ２０又はＣＤ３に対する親和性が確定されなかった
ＨＤＸ－ＭＳによる結合エピトープ
三重特異性分子ＣＤ９Ｂ３７４及びＣＤ９Ｂ６４３によって結合されたＣＤ７９ｂエピトープを、以下のプロトコルに従って水素重水素交換質量分析（Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry、ＨＤＸ－ＭＳ）によってマッピングした。
ＨＤＸ－ＭＳデータ取得のための全般的な手順。自動ＨＤｘシステム（ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を用いて、ＨＤＸ－ＭＳサンプル調製を行った。カラム及びポンプは、プロテアーゼ、プロテアーゼＸＩＩＩ型（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼ、ＸＩＩＩ型）／ペプシンカラム（ｗ／ｗ、１：１；２．１×３０ｍｍ）（ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、トラップ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（２．１×５ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、分析用、Ａｃｃｕｃｏｒｅ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＬＣポンプ、ＶＨ－Ｐ１０－Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。ローディングポンプ（プロテアーゼカラムからトラップカラムへ）は、０．１％のギ酸水溶液で６００μＬ／分に設定した。勾配ポンプ（トラップカラムから分析カラムへ）は、１００μＬ／分において２０分間で０．１％ギ酸水溶液中９％～３５％のアセトニトリルに設定した。
ＭＳデータ取得。２７５℃のキャピラリ温度、分解能１２０，０００、及び質量範囲（ｍ／ｚ）３００～１，８００で、ＬＴＱ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質量分析を実行した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ抽出。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ３．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＨＤＸ実験の前に非重水素化サンプルのペプチド同定に使用した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）を使用して、ＨＤＸ実験についてのＭＳ生データファイルから質量中心値を抽出した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ分析。抽出されたＨＤＸ－ＭＳデータをＥｘｃｅｌで更に分析した。全ての交換時点（３．２℃でｐＨ６．４又はｐＨ７．４）を、ｐＨ ７．４及び２３℃における同等の時点に変換した。
結果
ＣＤ９Ｂ３７４及びＣＤ９Ｂ６４３のＨＤＸ－ＭＳ分析は、残基３０～４２（ＳＥＤＲＹＲＮＰＫＧＳＡＣ；配列番号２５３）、５０～５２（ＰＲＦ）、８１～８６（ＥＭＥＮＰ；配列番号２５４）、及び１４４～１４８（ＧＦＳＴＬ；配列番号２５５）から構成されるＣＤ７９のほぼ同一の立体構造エピトープに結合することを示す。残基番号は、ＣＤ７９Ｂ＿ヒト（Ｐ４０２５９）の残基番号である。
ＤＳＣ及びＤＳＦによる三重特異性ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の熱的安定性
Ｃ９２３Ｂ１６８及びＣ９２３Ｂ１６９の熱安定性を、示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＣ）及び示差走査蛍光定量法（differential scanning fluorimetry、ＤＳＦ）によって決定した。
この特性評価では、Ｔｏｎｓｅｔ及びＴａｇｇをＤＳＦによって決定し、Ｔｍの他の熱安定性遷移をＤＳＣによって決定した。表５０に示すように、Ｃ９２３Ｂ１６８及びＣ９２３Ｂ１６９は、良好な熱安定性を有し、Ｔｏｎｓｅｔ＞６１℃及びＴｍ１＞６５℃である。
Figure 2024510777000098
実施例７：ＣＤ７９×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の機能的特性評価
汎Ｔ細胞への三重特異性ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の結合
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性構築物のＣＤ３アームの結合を、凍結保存され、陰性に選択された初代ヒトＣＤ３＋汎Ｔ細胞を使用して評価した。３人の異なるドナーからの初代ヒトＣＤ３＋汎Ｔ細胞を、３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３試験分子Ｃ９２３Ｂ１６９及びＣ９２３Ｂ１６８（１：３連続希釈で開始濃度１μＭ）と共に１時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を、１：３００希釈の、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ；カタログ番号１０９－６０６－０９８）を用いて４℃で２０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、１：１０００希釈のＣｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ生存率色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ３４８６０）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｆｏｒｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生成した。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用して、ＭＦＩをグラフ化した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
全てのＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３分子は、細胞表面上の内因性ＣＤ３を発現する全てのドナー汎Ｔ細胞への結合を示した。これを表５１に示す。
Figure 2024510777000099
 ＵＤ＊＝未確定
標的陽性（ＣＤ７９ｂ＋及びＣＤ２０＋）細胞株のパネル上のＦＡＣＳ Ｔ細胞死滅データ
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性構築物の機能的活性を、細胞表面上のＣＤ７９ｂ及びＣＤ２０の異なる内因性発現レベルを有することがフローサイトメトリによって検証された細胞株を使用して、フローサイトメトリによるインビトロＴ細胞死滅アッセイにおいて４８時間及び７２時間の時点で評価した。これを表５２に示す。
Figure 2024510777000100
標的がん細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有する完全ＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１８７５０９３）培地中で維持した。アッセイの前に、抗体を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中、３倍連続希釈で、予想最終濃度の４倍で作製した。９６ウェルプレートの各ウェル中の５０μＬの体積の培地希釈二重特異性又は三重特異性Ａｂを、標的及びエフェクター細胞懸濁液の混合物を添加することによって２００μＬに更に希釈した。標的細胞株を、４００×ｇで５分間の遠心分離によって収集し、ＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。標的がん細胞は、１／５０００に希釈したＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：Ｃ３４５５４）を用いた染色標的であった。健常ドナーＴ細胞（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供されたＣＤ３陰性選択によって単離された）を完全培地（熱不活性化ウシ胎仔血清を１０％含有するＲＰＭＩ １６４０培地）中で解凍し、計数し、新鮮な完全フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地中に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁させた。標的細胞及びＴ細胞を混合して、５：１のエフェクター対標的細胞比を得た。細胞懸濁液を、プレートレイアウトに従って抗体希釈ウェルに添加した（１５０μＬ／ウェル）。細胞を、３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０××ＣＤ３試験分子Ｃ９２３Ｂ１６９及びＣ９２３Ｂ１６８（１：３連続希釈で開始濃度１００ｎＭ）と共に４８時間及び７２時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を室温で１５分間、１：１０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号６５－０８６５－１４）を用いて染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を４℃で３０分間、フローパネル抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（表５３）を用いて染色し、抗体量を表に列挙したように添加した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｃ（ＢＤ）フローサイトメータを使用して細胞を分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用して、がん細胞死滅の率を生成した。がん細胞死滅の率をグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用してＩＣ５０値を生成した。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（阻害剤）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
Figure 2024510777000101
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３三重特異性は、強力な細胞傷害性を媒介した。ＩＣ５０（ｎＭ）値及び最大死滅値を表５４及び表５５に列挙する。
Figure 2024510777000102
Figure 2024510777000103
自己Ｂ細胞に対するＣ９２３Ｂ１６９及びＣ９２３Ｂ１６８ ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３媒介性細胞傷害性
Ｃ９２３Ｂ１６９及びＣ９２３Ｂ１６８ ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３構築物の機能的活性を、インビトロ自己Ｂ細胞枯渇アッセイにおいて評価した。この機能的アッセイは、ＰＢＭＣを利用して、初代Ｂ細胞の死滅及びドナー適合初代細胞上のＴ細胞活性化に焦点を当てている。３人の異なるヒトドナーからの凍結保存されたＰＢＭＣを、３７℃で、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３試験分子Ｃ９２３Ｂ１６９及びＣ９２３Ｂ１６８（１：３連続希釈で開始濃度３００ｎＭ）と共に７２時間インキュベートした。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｆｃブロッキング剤（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．カタログ番号ＮＢ３０９）及び１：４００希釈のＮｅａｒ ＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｌ１０１１９）を用いて、室温で１０分間染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を４℃で３０分間、１：１００希釈の、フローパネル抗体を含有するＢＤ染色緩衝液（表５６）を用いて染色した。全ての細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号５５４６５７）で洗浄し、１２００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメータを使用して細胞を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．８を使用して生成されたＥＣ５０値。式ｘ＝ｌｏｘを使用してｘ軸値を変換することにより、用量応答曲線を生成した。次いで、データを、非線形回帰曲線適合分析「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答変数勾配（４パラメータ）」を使用してグラフ化した。
Figure 2024510777000104
ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２０×ＣＤ３ Ｃ９２３Ｂ１６９及びＣ９２３Ｂ１６８構築物は、これらのＴ細胞サブセット上のＣＤ２５発現によって実証されるように、低レベルのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化と共に、６９～９５パーセントの最大薬物媒介性細胞傷害性（表５７）を示した。
Figure 2024510777000105
実施例８：二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体の生成
実施例８．１：抗ＰＳＭＡ抗体及び抗ＣＤ３抗体のＦＡＢアーム交換
二重特異性抗体の形成には、２つの親モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）が必要であり、１つは標的化アーム（例えば、ＰＳＭＡ）に特異的であり、１つはエフェクターアーム（例えばＣＤ３）に特異的である。選択された単一特異性抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３抗体を、ｃＦサイレンシングのためのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ置換（ＥＵ番号付け）を有するように遺伝子操作されたＩｇＧ１／κとして発現させた。選択された単一特異性抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ４抗体としても発現される。Ｆｃドメインの選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計された変異もまた、Ｆｃドメインにおいて遺伝子操作された。
単一特異性抗体を、上記のように、ＣＭＶプロモータ下において、ＣＨＯ細胞株中で発現させた）。１００ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ３．５の溶出緩衝液、並びに２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌの中和緩衝液を用いるプロテインＡカラムを使用して、親ＰＳＭＡ及びＣＤ３抗体を精製した。抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体を、Ｄ－ＰＢＳ、ｐＨ７．２緩衝液中に透析した。
ＤｕｏＢｏｄｙ抗体については、親単一特異性抗体の精製後、７５ｍＭシステアミン－ＨＣｌ中の還元条件下で親ＰＳＭＡ抗体を所望の親ＣＤ３抗体と混合することによって、二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を生成し、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載のように、インビトロＦａｂアーム交換のために室温で一晩インキュベートした。組換え反応は、モル濃度比に基づいており、設定量のＰＳＭＡ抗体（例えば、１０ｍｇ又は約７４．６ナノモル）をＣＤ３抗体（例えば、７０．８７ナノモル）と組み合わせ、ＰＳＭＡ抗体をＣＤ３抗体の５％過剰量で添加した。ＰＳＭＡ抗体ストックの濃度を０．８～６ｍｇ／ｍＬで変化させ、組換え反応物の量を各対について変化させた。続いて、組換え反応物をＰＢＳに対して一晩透析して、還元剤を除去した。組換え後に残存する未反応のＣＤ３親抗体の量を最小化するために、過剰なＰＳＭＡ抗体（比）を用いてＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体反応を行った。
他の二重特異性抗体を、典型的には１：１：３のＤＮＡ比のＨＣ１：ＨＣ２：ＬＣ２の共トランスフェクションを介して生成した。精製を、プロテインＡクロマトグラフィ及びＣＨ１親和性捕捉、続いてイオン交換ベースのクロマトグラフィによって行った。
例示的なＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を表５８～６３に提供する。
Figure 2024510777000106
Figure 2024510777000107
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Figure 2024510777000150
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Figure 2024510777000152
Figure 2024510777000153
Figure 2024510777000154
Figure 2024510777000155
Figure 2024510777000156
Figure 2024510777000157
実施例８．２：二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体の分析的特性評価
各精製Ａｂのタンパク質濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ１０００分光光度計又はＴｒｉｎｅａｎ ＤＲＯＰＳＥＮＳＥ９６マルチチャネル分光光度計で２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって求め、アミノ酸配列に基づいて減衰係数を使用して計算した。Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ上で１ｍＬ／分で２０分間、０．２Ｍ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ６．８において、ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｇ３ＳＷｘｌカラム上のサンプルを稼働させることによって精製された抗体のＳＥ ＨＰＬＣを行った。カラム溶出液を、２８０ｎｍにおける吸光度によってモニタした。抗ＰＳＭＡ－ＣＤ３二重特異性抗体を、インタクト質量分析によって更に分析して、ヘテロ二量体の適切な形成を決定した。
実施例９：抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体のエピトープマッピング
実施例９．１：ＨＤＸ－ＭＳエピトープマッピング
２つの抗ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体ＰＳ３Ｂ１３５２及びＰＳ３Ｂ１３５３のエピトープを、水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって決定した。図１４を参照されたい。ヒトＰＳＭＡ抗原を、エピトープマッピング実験に使用した。図１５を参照されたい。
ＨＤＸ－ＭＳのオンエクスチェンジ実験。簡潔に述べると、オンエクスチェンジ反応を、７．３μＭ抗体を含むか若しくは含まない１０μＭの６．０μＭヒトＰＳＭＡと、３０μＬのＨ２Ｏ又は重水素化緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．４）、９５％ Ｄ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、若しくは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、９５％ Ｄ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）とを混合することによって開始した。反応混合物を２３℃で１５、５０、１５０、５００、又は１，５００秒間インキュベートし、記載された異なる時点で、冷却した４０μＬの８Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ ３．０の添加によってクエンチした。クエンチした溶液を直ちに分析した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ取得のための全般的な手順。自動ＨＤｘシステム（ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を用いて、ＨＤＸ－ＭＳサンプル調製を行った。カラム及びポンプは、プロテアーゼ、プロテアーゼＸＩＩＩ型（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼ、ＸＩＩＩ型）／ペプシンカラム（ｗ／ｗ、１：１、２．１×３０ｍｍ）（ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、トラップ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（２．１×５ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、分析用、Ａｃｃｕｃｏｒｅ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＬＣポンプ、ＶＨ－Ｐ１０－Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。ローディングポンプ（プロテアーゼカラムからトラップカラムへ）は、９９％の水、１％のアセトニトリル、０．１％のギ酸で６００μＬ／分に設定した。勾配ポンプ（トラップカラムから分析カラムへ）は、１００μＬ／分において２０分間で０．１％ギ酸水溶液中８％～２８％のアセトニトリルに設定した。
ＭＳデータ取得。２７５℃のキャピラリ温度、分解能１５０，０００、及び質量範囲（ｍ／ｚ）３００～２，０００で、ＬＴＱ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質量分析を実行した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ抽出。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ２．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＨＤＸ実験の前に非重水素化サンプルのペプチド同定に使用した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）を使用して、ＨＤＸ実験についてのＭＳ生データファイルから質量中心値を抽出した。
実施例１０：二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体の特性評価
実施例１０．１：ヒトＰＳＭＡに対する二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体の結合親和性
組換えヒト、カニクイザル、又はマウスＰＳＭＡに対する抗ＰＳＭＡの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。抗体をヤギ抗Ｆｃ抗体修飾Ｃ１チップ上に捕捉し、１００ｎＭ～１１．１ｎＭの濃度にわたるＰＳＭＡ抗原の３倍連続希釈で滴定した。５０μＬ／分の流量を使用して、会合及び解離をそれぞれ３分間及び１５分間モニタした。生の結合データを、ブランクから分析物結合シグナルを差し引くことによって参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用する１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して分析して、動態を得て、これを、結合親和性を計算するために使用した。Ｋｄデータを表６４にまとめる。抗ヒトＦｃ抗体を使用して抗ＰＳＭＡを捕捉し、抗原を溶液に注入した。
Figure 2024510777000158
組換えヒトＰＳＭＡに対する抗ＰＳＭＡ抗体の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ ８Ｋ機器（ＥＬＮ ＰＳＭＡ－００７０２）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。抗体をヤギ抗Ｆｃ抗体修飾Ｃ１チップ上に捕捉し、１ｎＭ～１００ｎＭヒトＰＳＭＡの濃度にわたるＰＳＭＡ抗原の３倍連続希釈で滴定した。５０μＬ／分の流量を使用して、会合及び解離をそれぞれ３分間及び３０分間モニタした。生の結合データを、ブランクから分析物結合シグナルを差し引くことによって参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアによる１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して分析して、結合親和性を計算するために使用される動態を得た。選択された抗体の結合の動態パラメータを表６５に示す。抗ヒトＦｃ抗体を使用して抗ＰＳＭＡを捕捉し、抗原を溶液に注入した。
Figure 2024510777000159
組換えヒト又はカニクイザルＰＳＭＡに対する抗ＰＳＭＡの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器 （ＥＬＮ ＰＳＭＡ－００７２１）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。抗体をヤギ抗Ｆｃ抗体修飾Ｃ１チップ上に捕捉し、１００ｎＭ～３．７ｎＭ（ヒトＰＳＭＡ）若しくは１００ｎＭ～３．７ｎＭ、又はカニクイザルＰＳＭＡについては２２．２～６００ｎＭの濃度にわたるＰＳＭＡ抗原の３倍連続希釈物で滴定した。５０μＬ／分の流量を使用して、会合及び解離をそれぞれ３分間及び６０分間モニタした。生の結合データを、ブランクから分析物結合シグナルを差し引くことによって参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアによる１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して分析して、結合親和性を計算するために使用される動態を得た。選択された抗体の結合の動態パラメータを表６６に示す。抗ヒトＦｃ抗体を使用して抗ＰＳＭＡを捕捉し、抗原を溶液に注入した。
Figure 2024510777000160
 ＊列１のデータは平均３である。他の列のデータは平均２である。
実施例１０．２：二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体の熱安定性
抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体の熱安定性（Ｔｍ及びＴａｇｇを含む立体構造安定性情報）を、上記のようにＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器を使用するｎａｎｏＤＳＦ法によって決定した。簡潔に述べると、サンプルを３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリにロードすることによって、測定を行った。二重の実行を行った。熱走査スキャンは、１．０℃／分の加熱速度で、２０℃～９５℃にわたる。データを処理して、３３０ｎｍ、３５０ｎｍ、比３３０／３５０、並びに熱転移、アンフォールディングの開始、Ｔｍ及びＴａｇｇが得られた散乱データについて積分データ及び一次微分解析を得、表６７にまとめた。
Figure 2024510777000161
実施例１０．３：二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体のＰＳＭＡ＋細胞への結合
選択された二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を、ＰＳＭＡを発現する前立腺がん細胞株に結合するそれらの能力について評価した。
２２ＲＶ１及びＣ４－２Ｂ細胞を、Ｖ底プレート中の５０μｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ、１０％ＨＩ ＦＢＳ）中に５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。抗体の連続希釈液をアッセイ培地中で調製し、５０μｌの抗体希釈液を、細胞を含有するプレートに添加した。プレートを３７℃で６０分間インキュベートし、その時点で１００μｌの染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号５５４６５７）を各プレートの全てのウェルに添加した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、培地をウェルから除去した。各プレートの全てのウェルに、染色緩衝液を２００μｌ添加した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、培地をウェルから除去した。５０μｌの２μｇ／ｍｌ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識ヤギ抗ヒトＦｃをプレートの全てのウェルに添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。各プレートの全てのウェルに、染色緩衝液を１５０μｌ添加した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、培地をウェルから除去した。１００マイクロリットルのランニング緩衝液（染色緩衝液＋１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％プルロニック酸）をプレートの全てのウェルに添加した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、培地をウェルから除去した。３０マイクロリットルのランニング緩衝液を細胞を含む全てのウェルに添加し、プレートをＩＱＵＥ Ｐｌｕｓ機器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。簡潔に述べると、細胞をＦＣＳ対ＳＳＣゲート上でゲーティングして、細胞破片を除去し、次いで細胞集団をシングレット細胞上でゲーティングした。抗体結合を赤色レーザチャネルで評価した。シグナル（Ｍａｂ＋二次抗体）対バックグラウンド（二次抗体のみ）比を各プレートについて計算し、得られたデータを、４パラメータ曲線フィッティングを使用してＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒにおいて二重特異性抗体濃度に対してプロットして、ＥＣ５０値を生成した。これを表６８にまとめる。
Figure 2024510777000162
フローを介した汎Ｔ細胞上の抗ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性の結合。ヒト汎Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を解凍し、ＤＰＢＳを含む１５ｍＬのコニカルに移した。これらの細胞を１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳを吸引し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁させた。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザを使用して細胞を計数し、１００ｕＬのＤＰＢＳ中に１００Ｋ／ウェルでプレーティングした。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＶｉｏｌｅｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、暗所で室温で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄した。試験抗体をＦＡＣＳ染色緩衝液中で１μＭの最終出発濃度に希釈し、合計１０個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００μＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ上で泳動させ、ＦＬＯＷＪＯソフトウェアを使用して分析した。図１６は、ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体が、フローサイトメトリによって検出される示差的なＣＤ３細胞結合プロファイルを示すことを示す。
以下の表６９及び図１７に示す結合曲線は、１時間のインキュベーション後、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ培地中３７℃の前立腺細胞株Ｃ４－２Ｂに対して生成した。分子濃度は、３倍希釈で１２ポイントにわたって５００～０ｎＭの範囲であった。アイソタイプ対照を使用して、ＰＳＭＡへの選択的結合を検証した。表６９に報告する値は、ｙ－最小、ｙ－最大、ＥＣ５０、及びＨｉｌｌについての値を生成するリガンド結合についての４パラメータ関数にデータをフィッティングすることによって生成した。ＥＣ９０は、式ＥＣ９０＝（９０－（１００－９０））＾（１／Ｈｉｌｌ）＊ＥＣ５０を使用して計算した。全ての曲線は同様のＹ－最小を示し、全ての曲線について平均７．１＋／－１．３Ｅ＋４であった。表６９を参照されたい。平均値から有意に逸脱したＹ－最小値はなかった。平均適合Ｙ最大値は、１．７＋／－０．６Ｅ＋６であった。分子ＰＳＭＢ１０６９は、平均から２倍高い結合シグナルを示した。他の分子はいずれも平均からの有意差を示さなかった。これらの分子は、平均ＥＣ５０＝１７＋／－１２ｎＭを示した。
Figure 2024510777000163
フローサイトメトリを介したＴ細胞上の抗ＰＳＭＡバリアント／ＣＤ３二重特異性の結合。Ｃ４－２Ｂヒト前立腺腫瘍細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンを添加して、細胞を剥離させた。培地を添加して、トリプシンを中和し、細胞をＤＰＢＳを含む１５ｍＬのコニカルに移した。これらの細胞を１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳを吸引し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁させた。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザを使用して細胞を計数し、１００μＬのＤＰＢＳ中に１００Ｋ／ウェルでプレーティングした。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＶｉｏｌｅｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、暗所で室温で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄した。試験抗体をＦＡＣＳ染色緩衝液中で１００ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１０個の希釈点について、出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００μＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ ＣＥＬＥＳＴＡ上で泳動させ、ＦＬＯＷＪＯソフトウェアを使用して分析した。図１８は、ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体が、フローサイトメトリによって検出される同様のＰＳＭＡ細胞結合プロファイルを示すことを示す。
実施例１０．４：ＰＳＭＡの内在化
Ｃ４－２Ｂヒト前立腺腫瘍細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンを添加して、細胞を剥離させた。培地を添加して、トリプシンを中和し、細胞をＤＰＢＳを含む１５ｍＬのコニカルに移した。これらの細胞を１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳを吸引し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁させた。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザを使用して細胞を計数し、５０μＬのフェノールレッドを含まないＰＲＭＩ＋１０％ＨＩ ＦＢＳ中に４０Ｋ／ウェルでプレーティングした。ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体又は対照抗体を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ－ｆｌｕｏｒ－ｐＨ Ｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ標識色素と共に１５分間インキュベートした後、５０μＬのコンジュゲートＰＳＭＡ／ＣＤ３：Ｆａｂ－ｆｌｕｏｒ－ｐＨ Ｒｅｄ複合体を、Ｃ４－２Ｂ細胞を含むウェルに添加した。プレートを、５％のＣＯ２、３７℃でＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ）中に２４時間置いた。標的細胞によって内在化されたＡｂ：Ｆａｂ－ｆｌｕｏｒ複合体を、赤色蛍光シグナルを生じる酸性リソソームによって処理し、これをＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）によって捕捉及び分析する。図１９は、ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体が内部移行するが、トランスフェリン受容体よりも遅い速度であることを示す。
実施例１０．５：フローサイトメトリを介するＰＳＭＡ＋細胞上の二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体のＴ細胞媒介性死滅
選択された二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を、前立腺がん細胞のＴ細胞媒介性死滅を媒介する能力について評価した。
ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞媒介性死滅を、フローサイトメトリを介して細胞死滅を間接的に測定するアッセイを使用して測定した。標的細胞集団を細胞生存率試験サンプルに基づいて同定し、対照をアッセイ培地（１０％ＲＰＭＩ、１０％ＨＩ ＦＣＳ）中２０ｎＭで調製した。滅菌ポリプロピレンプレートにおける化合物の１１点滴定のための半対数連続希釈物を調製した。更なるウェルを、化合物を含まない対照、アッセイ培地中のみに細胞を含有するＴ細胞又は腫瘍細胞に使用した。Ｃ４－２Ｂ細胞を細胞培養フラスコから回収し、細胞をＰＢＳに再懸濁させた。細胞を室温で１０分間、２０ｐＭ ＣＦＳＥで染色した。２５ｍＬのＨＩ ＦＢＳを添加して、染色反応を停止させ、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離した。細胞を１×１０６／ｍｌに希釈し、次いで、５０μＬアッセイ培地中の腫瘍標的細胞として５０，０００細胞／ウェルで、Ｖ底組織培養処理ポリスチレンアッセイプレートにプレーティングした。５０μＬ／ウェルのアッセイ培地を、腫瘍細胞を投与しなかった対照ウェルに添加した。ヒト汎Ｔ細胞バイアルを３７℃に設定した水浴中で解凍し、１０ｍｌのアッセイ培地を添加し、４００×ｇで５分間遠心分離することによって２回洗浄した。Ｔ細胞をアッセイ培地中に１×１０６／ｍＬに再懸濁させ、５０，０００／ウェルを含有する５０μＬを、腫瘍標的細胞を含有するアッセイプレートに添加した。５０μＬ／ウェルのアッセイ培地を、腫瘍細胞を投与しなかった対照ウェルに添加した。１００μＬ／ウェルの連続希釈抗体を、標的細胞とエフェクター細胞との細胞混合物を含有するアッセイプレートに添加した。プレートを加湿細胞培養インキュベータ中で、３７℃、５％ＣＯ２で、７２時間インキュベートした。
インキュベーション後、アッセイプレートを５００×ｇで５分間遠心分離し、培地をウェルから除去した。１５０μＬのＤＰＢＳを各ウェルに添加し、プレートを５００×ｇで５分間遠心分離し、培地をウェルから除去した。ＩＮＴＥＬＬＩＣＹＴ ＩＱ Ｐｌｕｓ上でフローサイトメトリを使用して、近ＩＲ生／死染色を使用して生存腫瘍細胞について培養物を評価した。Ｔ細胞活性化を、ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｖｉｏｌｅｔ標識抗ＣＤ２５ ＭＡＢを使用して評価した。細胞をＦＳＣ対ＳＳＣでゲーティングして、残屑を除去した。腫瘍細胞をＣＦＳＥ陽性細胞として同定した。Ｔ細胞をＣＳＦＥ陰性細胞として同定した。腫瘍細胞生存率を、全ＣＳＦＥ細胞の割合としての生／死染色陽性腫瘍細胞の数として計算した。活性化Ｔ細胞を、生存ＣＦＳＥ陰性集団の総数の割合としてのＣＤ２５陽性細胞の数として計算した。死滅した腫瘍細胞及び活性化されたＴ細胞の率についてのデータを、ＥＣ５０値を生成するために４パラメータ曲線フィッティングを使用してＧｅｎｅ Ｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒにおいて抗体濃度に対してプロットした。表７０は、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅についてのＥＣ５０値を示す。
Figure 2024510777000164
実施例１０．６：ｉｎｃｕｃｙｔｅを介するＰＳＭＡ＋細胞上の二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体のＴ細胞媒介性死滅
選択二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ベースの細胞傷害性アッセイを介する前立腺がん細胞のＴ細胞媒介性死滅を媒介する能力について評価した。
健康なドナーＴ細胞。赤色核色素を安定的に発現するＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞を生成して、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害性アッセイで使用した。健康なドナーＴ細胞の凍結バイアル（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を３７℃の水浴中で解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、５ｍＬのフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地で１回洗浄した。ＶＩＡＣＥＬＬ ＸＲ細胞生存率アナライザを使用して細胞を計数し、Ｔ細胞を、３：１の最終エフェクターＴ細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞と組み合わせた。細胞混合物を５０ｍＬのコニカルチューブ内で合わせた。細胞混合物（１００μＬ／ウェル）を透明な９６ウェル平底プレートに添加した。次に、試験抗体を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地中で６０ｎＭの最終開始濃度に希釈し、合計１１個の希釈点について、開始濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００μＬ／ウェル）を、合わせた細胞に添加した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍ又はＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ）のいずれかの中に、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間置いた。標的細胞株は、標的細胞溶解の動態を追跡するために使用される赤色核色素を安定的に発現する。細胞成長阻害率（％）＝（初期生存標的細胞数－現時点の生存標的細胞数）／初期生存細胞数×１００％。表７１及び図２０Ａ～図２０Ｈは、漸増濃度の抗ＰＳＭＡによるＣ４－２Ｂ細胞の細胞傷害性を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＰＳＭＡ／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂ細胞と共インキュベートした。
Figure 2024510777000165
健康なＰＢＭＣ。赤色核色素を安定的に発現するＰＳＭＡ＋Ｃ４－２Ｂヒト前立腺腫瘍細胞を生成して、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害性アッセイにおいて使用した。健康なＰＢＭＣの凍結バイアル（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を３７℃の水浴中で解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、５ｍＬのフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地で１回洗浄した。ＶＩＡＣＥＬＬ ＸＲ細胞生存率アナライザを使用して細胞を計数し、ＰＢＭＣを、１：１の最終ＰＢＭＣ対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞と組み合わせた。細胞混合物を５０ｍＬのコニカルチューブ内で合わせた。細胞混合物（１００μＬ／ウェル）を透明な９６ウェル平底プレートに添加した。次に、試験抗体を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地中で３０ｎＭの最終開始濃度に希釈し、合計１１個の希釈点について、開始濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００μＬ／ウェル）を、合わせた細胞に添加した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍ又はＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ）のいずれかの中に、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間置いた。標的細胞株は、標的細胞溶解の動態を追跡するために使用される赤色核色素を安定的に発現する。細胞成長阻害率（％）＝（初期生存標的細胞数－現時点の生存標的細胞数）／初期生存細胞数×１００％。図２１は、ＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体が示差的なＣ４－２Ｂ細胞傷害性効果を誘導することを示す。
実施例１０．７：二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体によるサイトカイン誘導の評価
選択された二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を、サイトカイン放出を誘導するそれらの能力について評価した。
上記のインビトロ細胞傷害性実験から収集した上清を、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ Ｉ組織培養キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析した。上清を、湿った氷上で解凍し、４℃で５分間、１，５００ｒｐｍで回転させ、次いで氷上に置いた。ＭＵＬＴ－ＳＰＯＴアッセイプレートを製造業者のプロトコルに従って予め洗浄した。標準曲線を、ＭＳＤ希釈剤１中の提供された較正物質の連続希釈によって調製した。標準及び試験抗体サンプル（２５μＬ／ウェル）を予め洗浄したプレートに添加した。その後のインキュベート及び洗浄は、全て製造元のプロトコルに従って実施した。ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でアッセイプレートを読み取った。評価した各ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体について、ＩＦＮγ濃度を定量化した。図２２は、ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体によって活性化されたＴ細胞による機能的サイトカイン放出を示す。
実施例１０．８：ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥを介するＰＳＭＡ＋細胞上の二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体のＴ細胞媒介性死滅
選択二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を、前立腺がん細胞、Ｃ４－２ＢのＴ細胞媒介性死滅を媒介する能力について評価した。Ｃ４－２Ｂ、約１５０，０００のＰＳＭＡ／細胞を発現する前立腺がん細胞株を、３人の汎Ｔドナーを使用して、３：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で使用した。実験０日目に、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅプレートを５０μｌの増殖培地でブランクした。次いで、プレートに２０，０００ Ｃ４－２Ｂ（０．４×１０６細胞／ｍｌから５０μＬ）細胞／ウェルを播種した。次いで、プレートをｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ装置上で一晩インキュベートした。実験１日目に、３人の汎Ｔドナーを使用して、５０μＬの１．２×１０６細胞／ｍＬ（６０，０００細胞）を添加することによって、Ｅ：Ｔ比を調製した。次いで、５０μＬの適切な二重特異性抗体を各プレートの適切なウェルに添加した。対照として、ＣＤ３×ヌルを使用した。腫瘍／標的のみのウェルを、パーセント細胞溶解計算における正規化に使用するために割り当てた。最終抗体濃度は、５０ｎＭ、１０ｎＭ、２ｎＭ、０．４ｎＭ、８０ｐＭ、及び０ｎＭであった。次いで、プレートをＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ装置に入れ、インピーダンスを１５分毎に１２０時間記録した。細胞溶解パーセントを、式細胞溶解％＝［１－（ＮＣＩ）／（ＡｖｇＮＣＩＲ）］×１００（式中、ＮＣＩはウェルの平均セルインデックスであり、ＡｖｇＮＣＩＲは腫瘍のみの参照ウェルの平均セルインデックスである）を使用してＲＴＣＡソフトウェアで計算した。表７２は、各ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性分子の経時的な細胞溶解をまとめている。
Figure 2024510777000166
 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊
当業者は、上で説明される実施形態に対して、その広い発明概念から逸脱することなく変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義される本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

Claims (43)

  1. 分化抗原群３ε（ＣＤ３ε）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する前記抗原結合ドメインが、
    ａ．配列番号５５の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｂ．配列番号５５の前記ＶＨの前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８の前記ＶＬの前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３、
    ｃ．配列番号５４の前記ＶＨの前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６の前記ＶＬの前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３、又は
    ｄ．配列番号４８の前記ＶＨの前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８の前記ＶＬの前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３を含み、
    配列番号５５、５４、又は４８の位置Ｎ１０６のアミノ酸が、任意選択的に、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、及びＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されており、
    残基番号付けは、配列番号５５、５４、又は４８のＮ末端から始まる、単離タンパク質。
  2. それぞれ、配列番号７０、７１、８６、７９、８０、及び８１の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質。
  3. ａ．それぞれ、配列番号７０、７１、７２、７９、８０、及び８１、
    ｂ．それぞれ、配列番号７０、７１、８７、７９、８０、及び８１、又は
    ｃ．それぞれ、配列番号７０、７１、９０、７９、８０、及び８１の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３を含む、請求項１又は２に記載の単離タンパク質。
  4. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  5. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂである、請求項４に記載の単離タンパク質。
  6. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、前記ｓｃＦｖである、請求項４に記載の単離タンパク質。
  7. 前記ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又は前記ＶＬ、前記Ｌ１、及び前記ＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、請求項６に記載の単離タンパク質。
  8. 前記Ｌ１が、
    ａ．約５～５０個のアミノ酸、
    ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
    ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
    ｄ．約１０～２０個のアミノ酸を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
  9. 前記Ｌ１が、配列番号３～３６のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
  10. 前記Ｌ１が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離タンパク質。
  11. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号５５、５４、又は４８の前記ＶＨ及び配列番号５９、５８、又は５６の前記ＶＬを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  12. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ．配列番号５５の前記ＶＨ及び配列番号５９の前記ＶＬ、
    ｂ．配列番号５５の前記ＶＨ及び配列番号５８の前記ＶＬ、
    ｃ．配列番号５４の前記ＶＨ及び配列番号５６の前記ＶＬ、
    ｄ．配列番号４８の前記ＶＨ及び配列番号５８の前記ＶＬ、
    ｅ．配列番号８８の前記ＶＨ及び配列番号５８の前記ＶＬ、又は
    ｆ．配列番号２４２の前記ＶＨ及び配列番号５８の前記ＶＬを含む、請求項１１に記載の単離タンパク質。
  13. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  14. 前記単離タンパク質が、多重特異性タンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  15. 前記多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、請求項１４に記載の単離タンパク質。
  16. 前記多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、請求項１４に記載の単離タンパク質。
  17. 免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はその前記Ｉｇ定常領域の断片を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  18. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、Ｆｃ領域を含む、請求項１７に記載の単離タンパク質。
  19. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメインを含む、請求項１７に記載の単離タンパク質。
  20. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ３ドメインを含む、請求項１７に記載の単離タンパク質。
  21. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１７に記載の単離タンパク質。
  22. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１７に記載の単離タンパク質。
  23. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１７に記載の単離タンパク質。
  24. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端にコンジュゲートされる、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  25. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＣ末端にコンジュゲートされる、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  26. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、第２のリンカー（Ｌ２）を介して、前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片にコンジュゲートされる、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  27. 前記Ｌ２が、配列番号３～３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の単離タンパク質。
  28. 前記多重特異性タンパク質が、ＣＤ３ε以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項１４～２７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  29. 前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１４～２８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  30. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１４～２９のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  31. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  32. 前記タンパク質の前記ＦｃγＲへの低減された結合をもたらす前記少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３１に記載の単離タンパク質。
  33. 前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３１又は３２に記載の単離タンパク質。
  34. 前記タンパク質が、前記Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、請求項１４～３３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  35. 前記Ｉｇ定常領域の前記ＣＨ３ドメインにおける前記少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３４に記載の単離タンパク質。
  36. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  37. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離タンパク質コードする、ポリヌクレオチド。
  38. 請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  39. 請求項３８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  40. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離タンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質が発現する条件で請求項３９に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記タンパク質を収集することと、を含む、方法。
  41. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体。
  42. 配列番号１２７～１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  43. 配列番号２２４の抗体重鎖及び配列番号２２６の抗体軽鎖を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
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