KR101747991B1 - Ｔｒａｉｌ ｒ2 특이적 다량체 스캐폴드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아폽토시스에 관여하는 세포막 수용체인 TRAIL 수용체 2(TRAIL R2)에 특이적으로 결합하는, 테나신(tenascin)-3 FnIII 도메인에 기초한 다량체 스캐폴드를 제공한다. 본 발명은 표적에 대한 증가된 친화성, 증가된 안정성 및 감소된 면역원성을 나타내는 조작된 변이체를 추가로 제공한다. 나아가, 본 발명은 예방제, 진단제 또는 치료제로서의 조작된 다가 스캐폴드, 및 TRAIL R2를 발현하는 세포에 의해 야기되는 질환에 대한 상기 스캐폴드의 용도, 특히 암에 대한 치료 용도에 관한 것이다.

Description

ＴＲＡＩＬ Ｒ2 특이적 다량체 스캐폴드{TRAIL R2-SPECIFIC MULTIMERIC SCAFFOLDS}
서열목록에 대한 참조
본원은 2015년 4월 13일자로 생성되고 크기가 390,000 바이트인 텍스트 파일(파일명: "TN3TR-100US1 SL.txt")로서 EFS-웹을 통해 본원과 함께 제출된 서열목록을 참고로 포함한다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 항체 모방체(mimetics)의 분야, 구체적으로 예를 들면, 신규 결합 특성을 갖는 생성물의 발생에 유용한 피브로넥틴 III형(Fn3) 도메인에 기초한 다량체 스캐폴드(scaffold)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 테나신(tenascin) C의 제3 FnIII 도메인으로부터 유래된 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드, 및 TRAIL R2 매개된 기능의 TRAIL R2 수용체 검출 및 조절, 예컨대, 암 및 다른 장애의 치료를 위한 상기 다량체 스캐폴드의 용도에 관한 것이다.
원하는 표적 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 생체분자는 치료, 연구 및 의학적 진단 수단으로서 매우 중요하다. 이러한 부류의 분자의 잘 공지된 일례는 항체이다. 거의 모든 구조 에피토프에 특이적 및 친화적으로 결합하는 항체가 선택될 수 있다. 그러나, 고전적인 항체는 단순한 진핵 시스템에서 발현시키기 어려운 구조적으로 복잡한 이종사량체 분자이다. 그 결과, 대부분의 항체를 복잡하고 값비싼 포유동물 세포 발현 시스템을 사용하여 생성한다.
통상적으로 단백질 스캐폴드로서 지칭되는, 상대적으로 정의된 3차원적 구조를 갖는 단백질은 조작된 생성물의 디자인을 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 이러한 스캐폴드가 유용한 한 구체적인 분야는 항체 모방체 디자인 분야이다. 항체 모방체, 즉 작은 비항체 단백질 치료제는 단점들 중 일부, 예컨대, 항체 단편이 응집되어 전장 IgG보다 덜 안정한 상태가 되는 경향을 피하면서 항체 및 항체 단편의 이점, 예컨대, 표적의 높은 친화성(affinity) 결합, 및 낮은 면역원성 및 독성을 이용한다.
이들 단점은 항체 천연 폴드(fold)의 일부의 제거에 의해 생성된 항체 단편의 사용에 의해 해결될 수 있다. 그러나, 이것은 통상적으로 소수성 환경, 예컨대, 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 계면에 묻힐 아미노산 잔기가 용매에 노출되게 되는 경우 종종 응집을 야기한다. 스캐폴드에 기초한 항체 모방체의 일례는 종족 및 단백질 부류에 걸쳐 넓게 발견되는, 예컨대, 포유동물 혈액 및 구조 단백질에서 발견되는 도메인인 III형의 피브로넥틴 모듈(FnIII)의 구조에 기초한다.
TRAIL(문헌에서 Apo2L 및 TNFSF10으로도 지칭되는 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드)은 종양 괴사 인자(TNF) 상과(superfamily)에 속하고 종양 세포에서 프로그래밍된 세포 사멸 또는 아폽토시스의 활성화제로서 확인되었다. TRAIL의 막 결합된 형태 및 가용성 형태 둘다가 표적 세포 상에 위치하는 TRAIL 수용체와의 상호작용을 통해 아폽토시스를 유발할 수 있다. 인간에서, 5종의 수용체가 TRAIL에 대한 결합 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. TRAIL과 TRAIL R1 또는 TRAIL R2의 결합 시, 캐스파제(caspase) 관련 세포 사멸이 유발된다. 이 세포 사멸 활성을 고려하여, TRAIL에 기초한 치료 방법이 개발되고 있다. TRAIL 또는 TRAIL R1 또는 R2 인간 작용제성 항체에 기초한 여러 치료 방법이 개발되어 있으나, TRAIL은 매우 짧은 수명을 갖고 유인(decoy) 수용체에 결합하고, 큰 크기의 항체가 그들의 종양 침투를 제한할 수 있다. 따라서, TRAIL 수용체에 결합할 수 있는 신규 분자, 이 분자를 포함하는 약학 조성물, 이러한 분자를 스크리닝하는 방법, 및 매우 다양한 암의 치유적 치료에 있어서 이러한 분자를 사용하는 방법이 필요하다.
본원에서 참고문헌의 인용 또는 논의는 이러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라는 것을 인정하는 취지로서 간주되어서는 안 된다.
본 발명의 요약
본 발명은 2개의 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함하는 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드로서, 이때 (a) 각각의 Tn3 단량체 스캐폴드가 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥, 및 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역을 포함하고, (b) 상기 Tn3 단량체 스캐폴드가 직렬로(in tandem) 연결되어 있고, (c) 상기 재조합 다량체 스캐폴드가 TRAIL R2에 특이적으로 결합하는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함한다. 몇몇 다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 모든 Tn3 단량체 스캐폴드가 직렬로 존재한다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드의 1개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 직접적으로, 링커에 의해, 또는 이종 모이어티(moiety)에 의해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 다른 Tn3 단량체 스캐폴드에 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 상기 Tn3 단량체 스캐폴드들 사이에 개재된 링커 없이 직접적으로 연결되어 있다. 몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 링커에 의해 연결되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 펩티드 링커는 유연성 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GxS)y 서열을 포함하고, 이때 x 및 y는 정수이고, x는 1, 2, 3 또는 4이고, y는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7(서열번호 212)이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합은 TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드의 결합에 비해 개선되어 있다. 몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합은 TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드의 결합에 비해 표적에 대한 작용을 개선시킨다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드의 결합에 비해 본 발명의 TRAIL R2 특이적 스캐폴드의 결합에서의 개선은 결합 친화성에서의 개선 및/또는 결합 친화력(avidity)에서의 개선이다. 다른 실시양태에서, TRAIL R2에 대한 결합 친화성 및 단백질 안정성은 TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드의 결합 친화성 및 단백질 안정성에 비해 개선되어 있다. 몇몇 실시양태에서, TRAIL R2에 대한 결합 친화력 및 단백질 안정성은 TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드의 결합 친화력 및 단백질 안정성에 비해 개선되어 있다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 기능성 모이어티를 포함하는 링커를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 기능성 모이어티는 면역글로불린 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 또는 이의 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, Fd 단편, Fd' 단편, Fv 단편, dAb 단편, F(ab')2 단편, scFv, 디아바디(diabody), 선형 항체, 전장 항체, Fc 영역 및 상기 모이어티들 중 2 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 또는 이의 단편은 IgG의 Fc 도메인 또는 힌지 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 또는 이의 단편은 CH1 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 면역글로불린 또는 이의 단편은 IgG의 C카파 도메인 또는 C람다 도메인을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드의 1개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 이종 모이어티에 융합되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 이종 모이어티는 단백질, 펩티드, 단백질 도메인, 링커, 약물, 독소, 세포독성제, 조영제, 방사성핵종, 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 바이오틴, 인간 혈청 알부민(HSA), HSA FcRn 결합 부분, 항체, 항체의 도메인, 항체 단편, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨, 및 상기 모이어티들 중 2 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 성분(composition)을 포함한다.
몇몇 특정 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 PEG에 접합되어 있다. 다른 실시양태에서, 2개 초과의 Tn3 단량체 스캐폴드는 링커에 의해 연결되어 있고, 이때 1개 이상의 링커가 다른 링커와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상이하다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 Tn3 단량체 스캐폴드는 분지된 포맷(format)으로 연결되어 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 몇몇 Tn3 단량체 스캐폴드는 선형 직렬 포맷으로 연결되어 있고, 몇몇 Tn3 단량체 스캐폴드는 분지된 포맷으로 연결되어 있다. 몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 동일하다. 다른 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 상이하다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 T 세포 항원일 수 있는 1개 이상의 부가적인 표적에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 이 T 세포 항원은 CD40L이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 수용체 작용제(agonist)이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 TRAIL R2 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 TRAIL R2 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 상이한 TRAIL R2 에피토프는 비중복(non-overlapping) 에피토프이다. 다른 실시양태에서, 상이한 TRAIL R2 에피토프는 중복(overlapping) 에피토프이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드의 베타 가닥은 서열번호 1의 베타 가닥에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열(서열번호 213)을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIX2L(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKX3TFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, X2는 아미노산 잔기 D 또는 G를 나타내고, X3은 아미노산 E 또는 G를 나타내고, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이다. 몇몇 실시양태에서, AB 루프는 서열번호 35를 포함하고, CD 루프는 서열번호 37을 포함하고, EF 루프는 서열번호 39를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, BC 루프는 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 168로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, DE 루프는 서열번호 102, 서열번호 103 및 서열번호 179로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FG 루프는 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 169 및 서열번호 170으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, BC 루프는 서열번호 97을 포함하고, DE 루프는 서열번호 179를 포함하고, FG 루프는 서열번호 170을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 서열번호 209 또는 서열번호 204를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 1 μΜ 이하의 친화성(Kd)으로 TRAIL R2 수용체에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 500 nM 이하의 친화성(Kd)으로 TRAIL R2 수용체에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 100 nM 이하의 친화성(Kd)으로 TRAIL R2 수용체에 결합한다.
또한, 본 발명은 전술된 다량체 스캐폴드들 중 임의의 다량체 스캐폴드를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 발현 벡터가 상기 핵산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포가 상기 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자에 의해 코딩된 다량체 스캐폴드가 발현되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제 중에 본 발명의 재조합 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드를 포함하는 유효량의 조성물을 투여함으로써 암의 예방, 치료, 호전 또는 관리가 필요한 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나, 호전시키거나 관리하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 암은 폐암, 비호지킨 림프종, 난소암, 결장암, 대장암, 췌장암 및 다발성 골수종으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드를 포함하는 조성물을 사용하여 환자에서 질환을 진단하거나 조영하는 방법을 제공한다. TRAIL R2를 발현하는 세포를 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포에서 아폽토시스를 유도하는 방법도 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 암의 예방, 치료, 호전 또는 관리가 필요한 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나, 호전시키거나 관리하는 방법은 부가적인 요법을 추가로 포함하고, 상기 요법은 면역요법, 생물학적 요법, 화학요법, 방사선요법 또는 소분자 약물요법이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 인간 TRAIL R2에 특이적으로 결합한다. 몇몇 특정 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드는 TRAIL R2에 결합하고, (a) TRAIL R2 수용체를 작동(agonize)시키거나, (b) TRAIL과 TRAIL R2 수용체의 결합을 모방하거나, (c) TRAIL R2 수용체 이량체화 또는 올리고머화를 촉진하거나, (d) 아폽토시스를 유도하거나, (e) 세포 생존력을 감소시키거나 억제하거나, (f) 상기 (a), (b), (c), (d) 및 (e) 활성의 조합을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 TRAIL R2 발현 세포를 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드와 접촉시키는 단계를 포함하는, TRAIL R2 발현 세포에서 활성을 변경시키는 방법으로서, 이때 상기 다량체 스캐폴드가 TRAIL R2에 결합하고, (a) TRAIL R2 수용체를 작용시키거나, (b) TRAIL과 TRAIL R2 수용체의 결합을 모방하거나, (c) TRAIL R2 수용체 이량체화 또는 올리고머화를 촉진하거나, (d) 아폽토시스를 유도하거나, (e) 세포 생존력을 감소시키거나 억제하거나, (f) 상기 (a), (b), (c), (d) 및 (e) 활성의 조합을 나타내는 것인 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, PEG가 N 말단 또는 C 말단에서 본 발명의 TRAIL R2 특이적 다량체 스캐폴드에 접합되어 있다.
본 발명을 설명하기 위한 목적으로, 본 발명의 일부 실시양태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 한정되지 않는다.
도 1은 다가(multivalent) Tn3 스캐폴드의 선형 포맷, 항체 유사 포맷 및 융합체 포맷을 보여준다. 다가 Tn3 스캐폴드는 흑색 팔각형 블록으로 표시된 스페이서(spacer)에 의해 부착된 2개 이상의 Tn3 모듈(module)을 함유하고, 이때 상기 스페이서는 예를 들면, 링커일 수 있다.
도 2는 2 내지 8의 원자가(Tn3 모듈의 수)를 갖는, 도 1에 나타낸 3종의 상이한 분자 포맷에 따라 발생된 TRAIL R2 특이적 다가 Tn3 스캐폴드(A2 내지 A9로 명명됨)를 보여준다.
도 3은 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된, 1 내지 8의 원자가를 갖는 선형 직렬 구축물(A1 내지 A5로 명명됨)에 상응하는 미정제 세균 배지(우측 겔) 및 친화 정제된 샘플(좌측 겔)의 비환원 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
도 4는 1가(A1) Tn3 스캐폴드 및 다가(A2 및 A3) Tn3 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합을 측정하는 경쟁 ELISA를 보여준다.
도 5는 H2122 세포에 결합하는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드 A9의 유세포분류(flow cytometric) 막대그래프를 TRAIL R2에 결합하지 않는 동족 대조군 스캐폴드(B9)와 비교하여 보여준다.
도 6a는 다가 스캐폴드에 의한 TRAIL R2 발현 세포주의 특이적 사멸에 대한 원자가의 효과를 보여준다.
도 6b는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드에 의한 H2122 종양 세포 사멸의 특이성을 보여준다.
도 7a는 4개의 Tn3 모듈을 포함하는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드에 의한 H2122 세포의 사멸에 대한 분자 포맷의 효과를 보여준다.
도 7b는 8개의 Tn3 모듈을 포함하는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드에 의한 H2122 세포의 사멸에 대한 분자 포맷의 효과를 보여준다.
도 8a는 선형으로 융합된 4가(A3) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드 및 8가(A5) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드에 의한, TRAIL R2를 발현하는 대장 선암종 세포주 콜로205(Colo205) 세포의 특이적 사멸을 보여준다.
도 8b는 선형으로 융합된 4가(A3) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드 및 8가(A5) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드에 의한, TRAIL R2를 발현하는 백혈병 세포주 주르카트(Jurkat) 세포의 특이적 사멸을 보여준다.
도 9a는 뮤린(murine) CD40L 특이적 직렬 2가 Tn3 스캐폴드(M13 구축물)의 디자인을 보여준다.
도 9b는 정제된 1가 M13 구축물(CD40L 특이적 Tn3 구축물), 또는 2개의 M13 모듈을 연결하는 1개, 3개, 5개 또는 7개의 Gly4Ser 유닛(GS로 표시됨)을 함유하는 링커를 갖는 직렬 2가 스캐폴드의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 1가 M13 구축물은 레인 2에서 런닝되었고, 구축물 C1은 레인 3 및 7에서 런닝되었고, 구축물 C2는 레인 4 및 8에서 런닝되었고, 구축물 C3은 레인 5 및 9에서 런닝되었고, 구축물 C4는 레인 6 및 10에서 런닝되었다. 샘플은 비환원 조건(레인 2 내지 6) 또는 환원 조건(레인 7 내지 10) 하에서 런닝되었다.
도 9c는 MuCD40L 특이적 1가(M13) 또는 2가 직렬 스캐폴드에 의한, 바이오센서 칩 상에 고정된 뮤린 CD40 수용체와 MuCD40L의 결합의 경쟁 억제를 보여준다. 다양한 구축물들에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50)가 표시되어 있다.
도 9d는 MuCD40L에 의해 유도된 B 세포 상의 CD86 발현에 대한 MuCD40L 특이적 1가(M13) Tn3, 2가 직렬 스캐폴드 또는 항체 MR1(항-MuCD40L 항체)의 억제 효과를 보여준다.
도 10은 세균 배양 배지의 SDS-PAGE에 의해 분석된, 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현된 가용성 1가 Tn3 스캐폴드 및 TRAIL R2/CD40L 이중특이적 직렬 2가 Tn3 스캐폴드의 발현도를 보여준다. 1가 스캐폴드인 A1 및 79는 각각 레인 2 및 3에 나타나 있다. 증가하는 길이의 Gly4Ser 아미노산 링커에 의해 직렬로 연결된, A1 및 79를 포함하는 직렬 스캐폴드 구축물(동족체 내지 구축물 C5, C6, C7 및 C8)은 레인 4 내지 7에 나타나 있다. 발현된 구축물은 염색된 겔 상에서 별표에 의해 표시되어 있다.
도 11a는 포획 ELISA를 이용하여 분석한 이중특이적 Tn3 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합을 보여준다.
도 11b는 포획 ELISA를 이용하여 분석한 이중특이적 Tn3 스캐폴드와 인간 CD40L의 결합을 보여준다.
도 12는 알파스크린(AlphaScreen)™ 분석을 이용하여 분석한 이중특이적 직렬 Tn3 스캐폴드 C5, C6, C7 및 C8과 TRAIL R2 및 CD40L의 동시적인 결합을 보여준다.
도 13은 구아니딘-HCl의 존재 하에서 Tn3 스캐폴드의 안정성을 보여준다. 각각의 시험된 스캐폴드에 대한 Cm(중간 값)이 표시되어 있다.
도 14는 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 분석된, 상이한 루프 서열을 갖되 동일한 길이의 FG 루프(9개의 아미노산)를 갖는 3개의 상이한 Tn3 스캐폴드의 열안정성을 보다 긴 FG 루프를 갖는 모 Tn3 스캐폴드와 비교하여 보여준다.
도 15는 9개 아미노산 길이의 FG 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드(P1C01, A6 및 71)의 안정성이 구아니딘-HCl의 존재 하에서 모(WT) Tn3 스캐폴드에 비해 증가한다는 것을 보여준다.
도 16a는 삼중특이적/4가 Tn3 스캐폴드의 개략적인 표현 및 발현을 보여준다. D1-1E11-79 스캐폴드는 시나기스(Synagis)?-결합 도메인(D1)에 이어서 TRAIL R2-Fc 결합 도메인(1E11) 및 인간 CD40L에 특이적인 C 말단 Tn3 도메인(79)을 함유한다. 유연성 (Gly4Ser)3 링커(서열번호 214)는 각각의 도메인을 분리한다.
도 16b는 발현되고 정제된 D1-1E11-79 스캐폴드의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스-트리스(Bis-Tris)) 겔을 보여준다. 이 구축물의 예측된 분자량은 약 34,081 달톤이다.
도 17a는 알파스크린 결합 분석을 이용하여 분석한 삼중특이적/3가 Tn3 스캐폴드 D1-1E11-79와 huCD40L 및 TRAIL R2-Fc의 동시적인 결합을 보여준다. 알파스크린 신호(ASS)는 TRAIL R2-Fc 농도의 함수로서 표시된다.
도 17b는 알파스크린 결합 분석을 이용하여 분석한 삼중특이적/3가 Tn3 스캐폴드 D1-1E11-79와 huCD40L 및 시나기스?의 동시적인 결합을 보여준다. 알파스크린 신호(ASS)는 시나기스? 농도의 함수로서 표시된다.
도 18은 ELISA를 이용하여 분석한 삼중특이적/3가 Tn3 스캐폴드 D1-1E11-79와 TRAIL R2-Fc 및 시나기스?의 동시적인 결합을 보여준다.
도 19는 모 TRAIL R2 결합 클론 1C12 및 그의 친화 성숙된 유도체의 서열 정렬을 보여준다. 조작된 이황화 결합의 위치는 강조표시되어 있고, 화살표는 하나의 골격 돌연변이의 위치를 표시하고, 친화 성숙 동안 발생하는 루프 내의 변화는 강조표시된 블록 A, B, C 및 D에 나타나 있다.
도 20은 1C12 클론 및 이의 친화 성숙된 유도체의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 세포 생존력 분석을 보여준다.
도 21은 마우스 혈청 중의 G6 직렬체의 농도를 시간의 함수로서 보여준다.
도 22a는 클론 F4에 대한 사이노몰구스(cyno) 교차반응성의 조작된(engineered) 향상에 상응하는 서열 정렬을 보여준다. 모든 이들 클론 사이의 공통된 특징은 2개의 아미노산을 사이에 두고 DE 루프 앞에 존재하는, D로부터 G로의 돌연변이이다.
도 22b는 F4 또는 F4mod1 단량체에 의한, 인간 또는 시이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 F4mod1 코팅된 플레이트의 결합의 억제에 대한 ELISA 측정치를 보여준다.
도 23a는 클론 F4mod1의 생식세포주화(germlining)에 상응하는 서열 정렬, 구체적으로 F4, F4mod1 및 F4mod12와 TN3 생식세포주의 비교를 보여준다.
도 23b는 F4, F4mod1 또는 F4mod12 단량체에 의한, 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 F4mod1 코팅된 플레이트의 결합의 억제에 대한 ELISA 측정치를 보여준다.
도 23c는 G6 직렬체 6을 F4mod12 직렬체 6과 비교하는 콜로205 세포 사멸 분석을 보여준다.
도 23d는 G6 직렬체 8을 F4mod12 직렬체 8과 비교하는 콜로205 세포 사멸 분석을 보여준다.
도 24는 TRAIL 내성 세포주 HT29에서 G6 직렬체 8의 활성을 F4mod12 직렬체 8의 활성과 비교하는 HT29 세포 사멸 분석을 보여준다.
도 25는 안티토프(Antitope) 에피스크린(EpiScreen) 면역원성 분석에서 시험된 클론에 상응하는 서열 정렬을 보여준다. 클론 F4mod12에 대한 차이는 강조표시되어 있다.
도 26a는 비-SEC에 의해 정제된 G6 직렬체 8의 SEC 기록을 보여준다.
도 26b는 SEC에 의해 정제된 G6 직렬체 8의 SEC 기록을 보여준다.
도 27은 상이한 투여량의 Tn3 TRAIL R2 작용제 G6 직렬체 6 및 G6 직렬체 8에 반응하여 발생된, 콜로205 대장암 이종이식편 모델에서의 종양 부피 변화를 보여준다.
도 28은 상이한 투여량의 Tn3 TRAIL R2 작용제 G6 직렬체 6 및 G6 직렬체 8에 반응하여 발생된, 콜로205 대장암 이종이식편 모델에서의 체중 변화를 보여준다.
정의
본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 공정 단계로 한정되지 않는다는 것(상기 조성물 또는 공정 단계가 변경될 수 있기 때문임)을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 명확히 달리 명시하지 않은 한, 단수형은 복수형의 언급을 포함한다는 것을 인식해야 한다. 용어 "하나"(또는 "한")와 용어 "1개 이상" 및 "적어도 1개"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
나아가, 본원에서 사용된 "및/또는"은 다른 특징 또는 성분과 함께 또는 다른 특징 또는 성분 없이 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기 실시양태 각각을 포괄하기 위한 것이다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들면, 문헌(the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press); 문헌(The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press); 및 문헌(the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press)은 본 발명에서 사용된 용어들 대부분의 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 부호는 그들의 국제단위계(SI)에 의해 인정된 형태로 표시된다. 수치범위는 범위를 한정하는 수치를 포함한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 아미노산 서열은 아미노 배향으로부터 카르복시 배향으로 좌측부터 우측으로 기재된다. 본원에서 제공된 제목은 본 명세서를 전체적으로 참조함으로써 이해될 수 있는 본 발명의 다양한 양태 또는 실시양태의 한정이 아니다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참조함으로써 보다 완전히 정의된다.
본원의 어디에서나 실시양태가 용어 "포함하는"으로 기재되어 있지만, "구성된" 및/또는 "본질적으로 구성된"의 관점에서 기재된 다른 유사한 실시양태도 제공된다는 것이 이해된다.
아미노산은 그들의 통상적으로 공지된 3 문자 부호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 협회에 의해 권장된 1 문자 부호에 의해 본원에서 언급되어 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그들의 통상적으로 승인된 1 문자 코드에 의해 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 본 발명의 스캐폴드에 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고 통상적으로 특이적인 3차원적 구조 특성뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체구조 에피토프 및 비입체구조 에피토프는 상기 입체구조 에피토프와의 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 상기 비입체구조 에피토프와의 결합은 그러하지 않다는 점에서 구별된다.
용어 "피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인" 및 "FnIII 도메인"은 스스로 서로 팩킹되어 단백질의 코어를 형성하는 2개의 베타 시트(sheet) 사이에 분포된 7개 이상의 베타 가닥을 갖고 상기 베타 가닥을 서로 연결하는 용매 노출된 루프를 추가로 함유하는 인간 피브로넥틴 III형 도메인에 대한 상동성을 나타내는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에는 3개 이상의 이러한 루프가 존재하고, 이때 상기 가장자리는 상기 베타 가닥의 방향과 직각을 이루는 단백질의 경계이다. 일부 실시양태에서, FnIII 도메인은 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역에 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하고, 이때 루프 영역은 각각의 베타 가닥을 연결한다.
용어 “DNA"는 2개 이상의 공유결합된 천연 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 서열을 지칭한다.
용어 "융합 단백질"은 (ii) 상이한 제2 단백질(즉, "이종" 단백질)에 연결된 (i) 1개 이상의 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 단백질을 지칭한다.
용어 "이종 모이어티"는 본 발명의 스캐폴드에의 성분의 부가를 표시하기 위해 본원에서 사용되고, 이때 상기 성분은 정상적으로 FnIII 도메인의 일부가 아니다. 예시적인 이종 모이어티는 단백질, 펩티드, 단백질 도메인, 링커, 약물, 독소, 조영제, 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 및 FnIII 도메인 자체에 내재하지 않는 활성을 제공할 임의의 다른 성분(폴리에틸렌 글리콜(PEG), 세포독성제, 방사성핵종, 조영제, 바이오틴, 이량체화 도메인(예를 들면, 류신 지퍼 도메인), 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 이의 FcRn 결합 부분, 항체의 도메인 또는 단편(예를 들면, 항체 가변 도메인, CH1 도메인, C카파 도메인, C람다 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인), 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, IgG 분자, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개 이상의 스캐폴드를 이어주거나 연결하는 임의의 분자 조립체를 지칭한다. 링커는 스캐폴드 내의 모듈 사이의 "스페이서"로서 작용하는 기능을 갖는 분자일 수 있거나, 추가 기능을 갖는 분자(즉, "기능성 모이어티")일 수도 있다. "이종 모이어티"의 정의에 포함되는 분자는 링커로서 작용할 수도 있다.
용어 "연결된" 및 "융합된"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어들은 2개 이상의 스캐폴드, 이종 모이어티 또는 링커가 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 임의의 수단에 의해 서로 연결되어 있는 것을 지칭한다.
용어 "다량체", "다량체 스캐폴드" 및 "다가 스캐폴드"는 연결된 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 분자를 지칭한다. 다량체 스캐폴드를 형성하는 스캐폴드는 각각의 스캐폴드가 독립적으로 기능하게 하는 링커를 통해 연결될 수 있다. "다량체" 및 "다가"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 다가 스캐폴드는 단일특이적일 수 있거나 이중특이적일 수 있다.
용어 "도메인" 또는 "단백질 도메인"은 종종 단백질의 나머지 영역과 무관하게 안정한 3차원적 구조로 폴딩될 있고 특정 기능을 부여받을 수 있는 단백질의 영역을 지칭한다. 이 구조는 원래의 단백질 내의 도메인 기능과 관련된 특정 기능, 예를 들면, 효소 활성, 또 다른 분자에 대한 인식 모티프의 생성, 또는 단백질이 단백질의 특정 환경 하에서 존재하기 위해 필요한 구조 성분을 제공하는 기능을 유지한다. 단백질 과(family) 내에서 및 관련 단백질 상과(superfamily) 내에서, 단백질 도메인은 진화적으로 보존된 영역일 수 있다. 다량체 스캐폴드의 성분을 기술할 때, 용어 "도메인", "단량체 스캐폴드" 및 "모듈"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. "천연 FnIII 도메인"은 살아있는 유기체에 의해 코딩되는 임의의 비재조합 FnIII 도메인을 의미한다.
"단백질 서열" 또는 "아미노산 서열"은 폴리펩티드 내의 아미노산 성분이 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 선형으로 표시되어 있는 것을 의미하고, 이때 상기 표시에서 서로 인접해 있는 잔기들은 상기 폴리펩티드의 일차 구조에서 인접하여 존재한다.
용어 "핵산"은 임의의 2개 이상의 공유결합된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 DNA, RNA 및 PNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포괄하기 위한 것이고 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 용어 "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 제거되어 있는 핵산 분자인 DNA 또는 RNA를 지칭하기 위한 것이다. 예를 들면, 벡터 내에 함유된 본 발명의 스캐폴드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예로는 이종 숙주 세포 내에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드가 있다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 유의하게 불리한 의학적 결과를 초래하지 않으면서 동물(예를 들면, 포유동물)에게 투여될 수 있는 화합물 또는 단백질을 지칭한다.
용어 "생리학적으로 허용가능한 담체"는 치료받는 숙주에 대한 유의한 유해 효과를 미치지 않고 그 자신과 함께 투여되는 화합물의 치료 성질을 유지하는 담체를 지칭한다. 한 예시적인 생리학적으로 허용가능한 담체는 생리식염수이다. 다른 생리학적으로 허용가능한 담체들 및 이들의 제제는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.]에 기재되어 있다.
"폴리펩티드"는 길이, 번역 후 변형 또는 기능과 관계없이 아미드 결합(펩티드 결합)에 의해 선형으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 서열을 의미한다. "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드 또는 올리고펩티드는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어들 중 임의의 용어 대신에 사용될 수 있거나 이들 용어들 중 임의의 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있으나, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식에 의해 발생될 수 있다.
상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합도 본 발명의 폴리펩티드로서 포함된다. 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나 비천연적으로 발생할 수 있다. 비천연 변이체는 당업계에서 공지되어 있는 돌연변이유발 기법을 이용함으로써 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 20개의 표준 아미노산의 1개 이상의 천연 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드도 "유도체"로서 포함된다.
"무작위화된" 또는 "돌연변이된"은 주형 서열에 대한 1개 이상의 아미노산 변경(결실, 치환 또는 부가를 포함함)을 포함하는 것을 의미한다. "무작위화하는" 또는 "돌연변이를 유발하는"은 이러한 아미노산 변경을 서열 내로 도입하는 과정을 의미한다. 무작위화 또는 돌연변이는 일반적으로 핵산 코딩 서열의 의도적, 비의도적 또는 자연발생적 서열 변이를 통해 달성될 수 있고 임의의 기법, 예를 들면, PCR, 오류 유발(error-prone) PCR 또는 화학적 DNA 합성에 의해 일어날 수 있다. 용어 "무작위화하는", "무작위화된", "돌연변이를 유발하는", "돌연변이된" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"동족체" 또는 "동족체 비돌연변이된 단백질"은 무작위화된 또는 돌연변이된 변이체 단백질 내로 도입된 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 면에서 변이체 단백질과 동일한 단백질을 의미한다.
"RNA"는 2개 이상의 공유결합된 천연 또는 변형된 리보뉴클레오티드로 구성된 서열을 의미한다. 이 용어 내에 포함되는 변형된 RNA의 일례는 포스포로티오에이트 RNA이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 스캐폴드" 또는 "본 발명의 스캐폴드들"은 다량체 스캐폴드 및 단량체 FnIII 스캐폴드를 지칭한다. 용어 "표적"은 본 발명의 특이적 스캐폴드에 의해 인식되는 화합물을 지칭한다. 전형적인 표적은 단백질, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 소분자를 포함한다. 용어 "표적" 및 "항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서, 예를 들면, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이성"은 본 발명의 스캐폴드가 1개 이상의 항원 결합 도메인을 통해 1개 이상의 항원에 결합하기 위해 요구되는 상대적 친화성을 지칭하고, 상기 결합은 1개 이상의 항원 결합 도메인과 1개 이상의 항원 사이의 약간의 상보성을 필요로 한다. 이 정의에 따르면, 본 발명의 스캐폴드는 무작위적 비관련 에피토프에 결합하는 경우보다 더 용이하게 에피토프에 결합하는 경우 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 기재된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 본 발명의 일부 스캐폴드와 개별 에피토프의 결합 강도의 척도를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화력"은 본 발명의 스캐폴드의 집단과 특정 에피토프 사이에 형성된 복합체의 전체 안정성, 즉 복수의 스캐폴드와 항원의 결합의 기능적으로 조합된 강도를 지칭한다. 친화력은 개별 항원 결합 도메인과 특이적 에피토프의 친화성 및 본 발명의 스캐폴드의 원자가 둘다와 관련되어 있다.
용어 "표적에 대한 작용"은 본 발명의 다량체 스캐폴드와 1개 이상의 표적의 결합, 및 이러한 결합으로부터 비롯된 생물학적 효과를 지칭한다. 이와 관련하여, 다량체 스캐폴드 내의 다수의 항원 결합 유닛은 다양한 표적 및/또는 에피토프와 상호작용할 수 있고, 예를 들면, 2개의 표적을 물리적으로 더 가깝게 위치시킬 수 있고 상이한 표적들과의 상호작용을 통해 대사 캐스케이드(metabolic cascades)를 유발할 수 있다. TRAIL R2와 관련하여, "표적에 대한 작용"은 예를 들면, TRAIL R2의 1종 이상의 생물학적 활성의 향상, 자극 또는 활성화에 의해 달성된 효과를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "원자가"는 잠재적 항원 결합 모듈의 수, 예를 들면, 본 발명의 스캐폴드 내의 FnIII 모듈의 수를 지칭한다. 본 발명의 스캐폴드가 1개 초과의 항원 결합 모듈을 포함하는 경우, 각각의 결합 모듈은 예를 들면, 동일한 표적 또는 상이한 표적 내의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 함께 이황화 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Tn3 모듈" 및 "Tn3 스캐폴드"는 FnIII 스캐폴드를 지칭하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, 이때 1개 이상의 루프는 "야생형 Tn3 스캐폴드" 내의 루프의 비천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, Tn3 모듈의 1개 이상의 베타 가닥은 C 베타 가닥 내의 시스테인 잔기(예를 들면, 서열번호 45 또는 서열번호 131 내의 시스테인) 및 F 베타 가닥(서열번호 49)이 치환되지 않는다는 점을 제외하고 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형 Tn3 스캐폴드"는 서열번호 1을 포함하는 FnIII 스캐폴드, 즉 인간 테나신 C의 제3 FnIII으로부터 유래된 조작된 FnIII 스캐폴드를 지칭한다.
용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 폴리펩티드의 다양한 넓은 부류를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류된다는 것을 인식할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로서 결정하는 것은 상기 쇄의 성질이다. 이들 클래스 각각의 변형된 버전은 당업자에게 용이하게 인식될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체, 변형된 항체, 항체 VL 또는 VL 도메인, CH1 도메인, C카파 도메인, C람다 도메인, Fc 도메인(상기 참조), CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 항체"는 비천연 항체가 되도록 변경된 합성 항체 형태, 예를 들면, 2개 이상의 중쇄 부분을 포함하나 2개의 완전한 중쇄를 포함하지 않는 항체(예를 들면, 도메인이 결실된 항체 또는 미니바디(minibody)); 및 2개 이상의 항원 또는 단일 항원의 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 다중특이적 항체 형태(예를 들면, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체 등)를 포함한다. 또한, 용어 "변형된 항체"는 다가 항체 형태(예를 들면, 동일한 항원의 3개 이상의 카피에 결합하는 3가 항체, 4가 항체 등)를 포함한다. (예를 들면, 문헌(Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, eds., 2010, Springer Protocols, Springer)을 참조한다).
용어 "생체내 반감기"는 그의 일반적인 의미(즉, 폴리펩티드의 생물학적 활성의 50%가 체내/표적 기간에 여전히 존재하는 시간, 또는 상기 폴리펩티드의 상기 활성이 그의 초기 값의 50%인 시간)으로 사용된다. 기능성 생체내 반감기를 측정하는 대안으로서, "혈청 반감기", 즉 폴리펩티드 분자의 50%가 제거되기 전에 혈장 또는 혈류에서 순환하는 시간이 측정될 수 있다. 혈청 반감기의 측정은 종종 기능성 생체내 반감기의 측정보다 더 단순하고, 혈청 반감기의 크기는 통상적으로 기능성 생체내 반감기의 크기의 우수한 표시이다. 혈청 반감기에 대한 대안적 용어는 혈장 반감기, 순환 반감기, 순환적 반감기, 혈청 제거율, 혈장 제거율 및 제거 반감기를 포함한다. 보유될 기능은 통상적으로 응혈촉진 활성, 단백질분해 활성, 보조인자 결합 활성, 수용체 결합 활성, 및 특정 단백질과 관련된 다른 종류의 생물학적 활성으로부터 선택된다.
기능성 생체내 반감기 또는 혈장 반감기와 관련된 용어 "증가된"은 폴리펩티드의 관련 반감기가 비교가능한 조건 하에서 측정될 때 기준 분자(예를 들면, 비변형된 폴리펩티드)의 관련 반감기에 비해 통계적으로 유의하게 증가된다는 것을 표시하기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 유전자가 생화학적 물질, 예를 들면, 본 발명의 스캐폴드 또는 이의 단편을 생성하는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자 넉다운(knockdown)뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정적 발현 둘다를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 세포 내의 기능성 유전자의 존재의 임의의 현시(顯示)를 포함한다. 상기 과정은 유전자를 1개 이상의 mRNA로 전사하는 단계, 및 이러한 mRNA를 1개 이상의 폴리펩티드로 번역하는 단계를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 원하는 최종 생성물이 생화학적 물질인 경우, 발현은 상기 생화학적 물질 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다.
"발현 생성물"은 핵산, 예를 들면, 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 발현 생성물은 전사 후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화를 갖는 핵산, 또는 번역 후 변형, 예를 들면, 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 결합, 단백질분해성 절단 등을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포 내로 도입되어 원하는 발현 생성물을 발현하는 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 상용가능한 벡터는 선택 마커, 원하는 핵산의 클로닝을 촉진하기 위한 적절한 제한 부위, 및 진핵세포 또는 원핵세포 내로 들어가고/가거나 진핵세포 또는 원핵세포에서 복제하는 능력을 포함할 것이다.
용어 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법의 이용에 의해 구축되고 1개 이상의 발현 생성물을 코딩하는 벡터를 보유하는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 발현 생성물을 단리하는 과정의 설명에 있어서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은, 명확히 달리 특정되어 있지 않은 한, 발현 생성물의 공급원을 표시하기 위해 상호교환적으로 사용된다(즉, "세포"로부터의 발현 생성물의 회수는 원심분리된 전체 세포로부터의 회수, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미한다).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘다를 지칭하기 위해 사용되고, 이때 목적은 대상체 내에서 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대, 염증성 질환 또는 병태의 진행을 방지하거나 늦추는(줄이는) 것이다. 유리한 또는 원하는 임상적 결과는 검출가능하든 아니면 검출불가능하든 관계없이 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 (부분적 또는 전체적) 감퇴를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
또한, 용어 "치료"는 치료를 제공받지 않은 경우 예측된 생존에 비해 생존을 연장시키는 것을 의미한다. 치료가 필요한 대상체는 병태 또는 장애를 이미 앓고 있는 대상체뿐만 아니라 병태 또는 장애를 앓기 쉬운 대상체 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체도 포함한다.
용어 "대상체", "개체", "동물", "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료를 원하는 임의의 개체, 환자 또는 동물, 구체적으로 포유동물 대상체를 지칭한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “TRAIL 수용체”는 TRAIL에 결합하고 TRAIL에 결합하였을 때 종양 세포에서 프로그래밍된 세포 사멸(아폽토시스)을 활성화시키는 단백질을 지칭한다. TRAIL 수용체의 비한정적인 예로는 TRAIL R2 수용체가 있다.
용어 “TRAIL R2" 또는 ”TRAIL R2 수용체“는 전장 TRAIL 수용체 서열, 및 문헌(Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)); 문헌(Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)); 미국 특허 제6,072,047호 및 제6,342,369호: 국제특허공보 제W098/51793호, 제W098/41629호, 제W098/35986호, 제WO99/02653호, 제WO99/09165호, 제W098/46643호 및 제W099/11791호; 문헌(Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)); 문헌(Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)); 및 문헌(Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997))에 기재된 상기 수용체의 가용성 세포외 도메인 형태를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 대표적인 전장 TRAIL 수용체 서열은 유전자은행(GenBank) 수납번호 제AAC51778.1호 및 제O14763.2호에서 입수될 수 있다.
용어 “TRAIL 수용체 작용제” 또는 “작용제”는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관 내에서, 제자리에서 또는 생체 내에서 TRAIL R2의 1종 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상시키거나, 자극하거나 활성화시키는 임의의 분자 또는 이의 생물학적 활성 변이체를 포함한다. 이러한 생물학적 활성의 예로는 아폽토시스 및 문헌에서 추가로 보고된 생물학적 활성이 있다. 작용제는 직접적인 또는 간접적인 방식으로 작용할 수 있다. 예를 들면, TRAIL 수용체 작용제는 그 자신과 TRAIL R2의 결합의 결과(수용체 활성화 또는 신호 전달도입을 야기함)로서 생체 내에서, 시험관 내에서 또는 제자리에서 1개 이상의 TRAIL R2 수용체, 또는 1개 이상의 TRAIL R2 수용체 및 다른 표적의 1종 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상시키거나, 자극하거나 활성화시키도록 작용할 수 있다.
“TRAIL” 또는 “TRAIL 폴리펩티드”는 TRAIL R2를 비롯한 1개 이상의 TRAIL 수용체 및 이의 생물학적 활성 단편에 결합하는 리간드를 지칭한다. 대표적인 TRAIL 서열은 유전자은행 수납번호 제AAH32722.1호 및 제P50591.1호에서 입수될 수 있다. 단편은 TRAIL 폴리펩티드 서열의 약 5개 내지 약 50개 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 25개 아미노산 잔기, 약 10개 내지 20개 아미노산 잔기 또는 약 12개 내지 약 20개 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 임의적으로, TRAIL 펩티드는 25개 이하의 아미노산 잔기(예를 들면, 25개, 23개, 21개, 19개, 17개, 15개 또는 그 미만의 아미노산 잔기)로 구성된다.
용어 “아폽토시스” 및 “아폽토시스 활성”은 넓은 의미로 사용되고, 전형적으로 세포질의 응축, 원형질막 미세융모의 상실, 핵의 분절화, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는, 1종 이상의 특징적인 세포 변화를 동반하는, 포유동물 내에서의 정돈된 또는 조절된 형태의 세포 사멸을 지칭한다. 이 활성은 당업계에서 잘 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 세포 생존력 분석, FACS 분석 또는 DNA 전기영동, 아넥신(annexin) V와의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화 및/또는 막 소포(아폽토시스체(apoptotic body))의 형성에 의해 확인되고 측정될 수 있다.
도입
TRAIL R2 단백질은 TNF 수용체 상과 유전자의 한 구성원에 의해 코딩되고, 세포내 사멸 도메인을 함유한다. 몇몇 경우, 상기 단백질은 TNFRSF10B, CD262, DR5, KILLER, KILLER/DR5, TRAILR2, TRICK2, TRICK2A, TRICK2B, TRICKB 또는 ZTNFR9로도 공지되어 있을 수 있다. 이 수용체는 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(TNFSF 10/TRAIL/APO-2L)에 의해 활성화될 수 있고 아폽토시스 신호를 변환시킨다. 또한, TRAIL R2에 의해 유도된 아폽토시스는 캐스파제 및 세포내 어댑터 분자 FADD/MORT1을 수반한다(Walczak et al., EMBOJ, (1997), 16, 5386-97).
여러 종류의 정상 세포가 TRAIL R2를 발현하지만, 이 수용체를 통한 아폽토시스 신호전달은 발암유전자, 예컨대, Myc 또는 Ras에 의한 형질전환과 관련하여 사멸 수용체 매개 아폽토시스에 보다 더 민감하게 되는 종양 세포에 주로 국한되어 있는 듯하다(Wang et al., Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterov et al., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). TRAIL-R2는 종종 인간 암세포주 및 일차 종양에 의해 발현된다.
본 발명은 TRAIL R2에 결합할 수 있는 재조합 비천연 단백질 스캐폴드 과(family)를 제공한다. 구체적으로, 본원에 기재된 단백질은 항체 가변 영역의 상보성 결정 영역("CDR")과 유사한 정의된 루프를 표시하는 데에 사용될 수 있다. 이들 루프에 대해 무작위화 또는 제한된 진화를 수행하여 다수의 표적 화합물에 결합할 수 있는 다양성을 발생시킬 수 있다. 상기 단백질은 TRAIL R2 및 상이한 표적에 결합할 수 있는 다중특이적 스캐폴드로 조립될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 질환, 예컨대, 암(그러나, 이로 한정되지 않음)의 예방, 호전, 검출, 진단 또는 모니터링에 유용한 TRAIL R2 특이적 결합제를 제공한다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 결합 스캐폴드는 암세포가 TRAIL R2를 발현하는 암의 치료에 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 암은 폐암, 비호지킨 림프종, 난소암, 결장암, 대장암, 췌장암 및 다발성 골수종을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명은 세포 집단을 고갈시키기 위해 상기 스캐폴드를 사용하는 방법도 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기 종류의 세포의 고갈에 유용하다: 호산구, 호염기구, 호중구, T 세포, B 세포, 비만 세포, 단핵구 및 종양 세포.
본 발명의 스캐폴드는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인으로부터 유래된 단량체 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드이고, 이때 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합이 조작되어 있다. 본 발명의 다량체 스캐폴드를 구성하는 Tn3 스캐폴드는 서로 독립적으로 정확하게 폴딩되고 그들의 결합 특이성 및 친화성을 보유하고, 각각의 단량체 스캐폴드는 그의 기능성을 보유한다. 본 발명의 다량체 스캐폴드를 구성하는 Tn3 스캐폴드가 고 원자가 다량체 스캐폴드, 예를 들면, 6가 또는 8가 스캐폴드로 조립되는 경우, 상기 단량체 스캐폴드는 서로 독립적으로 정확하게 폴딩되고 그들의 결합 특이성 및 친화성을 보유하고, 각각의 단량체 스캐폴드는 그의 기능성을 보유한다.
고 원자가 스캐폴드(예를 들면, 6가 또는 8가 스캐폴드)를 포함하는 다량체 Tn3 스캐폴드는 구축물의 위상기하학이 선형이 아닌 경우, 예를 들면, 단량체 Tn3 또는 다량체 Tn3 스캐폴드가 복잡한 분지된 구조(예를 들면, Fc 융합 구축물 또는 항체 유사 구축물)로 조립되는 경우조차도 정확하게 폴딩된다.
천연 FnIII 도메인, 예컨대, 인간 피브로넥틴의 제10 FnIII 도메인(10FnIII) 및 대부분의 천연 FnIII 도메인은 이황화 결합 또는 자유 시스테인을 함유하지 않는다. 다중도메인 단백질이 다수의 시스테인의 도입에 의해 조작되는 경우, 단백질 발현의 결여, 생성된 단백질의 침전 또는 비기능성 단백질의 생성이 통상적으로 일어난다. 이들 유해한 효과는 부정확한 단백질 폴딩을 초래하는, 분자내, 도메인내 및/또는 도메인간 이황화 결합의 부정확한 형성, 및/또는 분자간 이황화 결합의 부정확한 형성에 기인한다. 이들 효과는 일반적으로 시스테인 및/또는 단백질 도메인의 수가 증가된 경우 강화된다.
예를 들면, 8개의 야생형 Tn3 스캐폴드(서열번호 1)를 포함하는 선형 다량체 스캐폴드는 단일 폴리펩티드 아미노산 서열을 따라 16개의 시스테인을 함유할 것이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 4개의 Tn3 모듈(이때, 2개의 Tn3 모듈은 IgG 중쇄에 연결되어 있고, 2개의 Tn3 모듈은 IgG 경쇄에 연결됨)을 포함하는 항체 유사 구축물은 4개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 따라 분포된 8개의 시스테인을 포함할 것이다. 이러한 수의 시스테인 및 이러한 구조 복잡성을 포함하는 본 발명의 다량체 스캐폴드, 예컨대, 4, 6 또는 8개의 선형 Tn3 모듈을 함유하는 다량체 스캐폴드는 정확하게 폴딩되고 그들의 각각의 단량체에 비해 개선된 안정성 및 표적 결합 성질을 나타낸다.
1개 이상의 조작된 이황화 가교를 포함하는 Tn3 스캐폴드가 고 원자가 다량체 포맷으로 조립되는 경우, 각각의 개별 단량체 스캐폴드는 그의 결합 특이성 및 친화성뿐만 아니라 그의 기능성을 유지하면서 정확하게 폴딩된다. 또한, 상기 단량체 스캐폴드는 정확하게 폴딩된 안정한 기능성 다량체 스캐폴드를 형성할 수 있다.
본 발명의 다량체 스캐폴드의 이점은 다수의 에피토프에 결합하여 친화력을 증가시키는 능력, 예를 들면, (i) 단일 표적 내의 다수의 에피토프에 결합하는 능력, (ii) 다수의 표적 내의 단일 에피토프에 결합하는 능력, (iii) 한 표적의 상이한 서브유닛 상에 위치한 다수의 에피토프에 결합하는 능력, 또는 (iv) 다수의 표적 상의 다수의 에피토프에 결합하는 능력이다.
또한, 다량체 스캐폴드의 유연성 및 링커를 통한 다수의 Tn3 단량체 사이의 거리 변화 가능성으로 인해, 상기 다량체 Tn3 스캐폴드는 표면(동일한 세포/표면 또는 상이한 세포/표면) 상의 다수의 표적 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 다량체 스캐폴드는 1개 초과의 표적에 동시적으로 결합하는 그의 능력의 결과로서 다수의 경로를 조절하고/하거나, 세포 표면 상의 수용체를 교차결합시키고/시키거나, 분리된 세포 상의 세포 표면 수용체를 결합시키고/시키거나, 표적 분자 또는 세포를 기질에 결합시키는 데에 사용될 수 있다.
FnIII 도메인의 선행 서열 분석으로부터, 큰 변이가 BC 루프 및 FG 루프에서 관찰되었는데, 이것은 이들 루프가 안정성에 중요하지 않다는 것을 암시한다(예를 들면, 국제특허공보 제WO2009/058379호 참조). 본 발명은 아미노산 서열에서의 변이를 갖되 인간 테나신 C의 제3 FnIII의 상응하는 FG 루프의 길이보다 더 짧은 길이를 갖는 FG 루프를 포함하는, 개선된 안정성을 나타내는 Tn3 스캐폴드를 제공한다. FG 루프의 단축은 증가된 안정성을 나타내는 돌연변이된 Tn3 스캐폴드를 발생시킨다는 것이 관찰되었다. 그 결과, 본 발명의 또 다른 양태는 증가된 단백질 안정성을 나타내는 야생형 Tn3 스캐폴드(서열번호 1)의 변이체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 단량체 스캐폴드는 10개 아미노산의 FG 루프 길이를 갖는 인간 테나신 C의 천연 제3 FnIII 도메인을 포함하는 스캐폴드에 비해 9개의 아미노산 및 증가된 안정성을 갖는 FG 루프를 포함한다. 추가로, 본 발명은 증가된 안정성을 나타내는 Tn3 스캐폴드의 단리에 유용한 특정된 FG 루프 길이를 갖는 다양한 Tn3 스캐폴드의 라이브러리를 제공한다.
추가로, 본 발명은 TRAIL R2 및 1개 이상의 부가적인 표적에 결합할 수 있는 다중특이적 스캐폴드, 특정 표적에 대한 스캐폴드의 친화성이 돌연변이를 통해 조절된 친화 성숙된 스캐폴드, 및 돌연변이를 통해 조절된 동물 종 사이의 면역원성 및/또는 교차반응성을 보이는 스캐폴드를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 제조하는 방법뿐만 아니라 원하는 생리화학적, 약리학적 또는 면역학적 성질을 갖도록 스캐폴드를 조작하는 방법도 제공한다. 나아가, 본 발명은 치료적, 예방적 및 진단적 사용을 위한 이러한 스캐폴드 및 방법의 용도를 제공한다.
FnIII 구조 모티프
본 발명의 Tn3 스캐폴드는 생명체 및 바이러스의 모든 3개의 도메인 및 다수의 단백질 부류에 걸쳐 넓게 발견되는 도메인인 피브로넥틴 III형 모듈(FnIII)의 구조에 기초한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4)으로부터 유래된다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함한다. 이 도메인의 전체 3차원적 폴드는 가장 작은 항체 단편, 즉 낙타 및 낙타과(예를 들면, 라마)의 단일 도메인 항체 내의 전체 항원 인식 유닛을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)의 전체 3차원적 폴드와 밀접하게 관련되어 있다.
본 발명의 Tn3 단량체 스캐폴드 및 테나신 C로부터의 천연 FnIII 도메인은 동일한 3차원적 구조, 즉 한 면 상에서 3개의 베타 가닥(A, B 및 E)을 갖고 다른 한 면 상에서 4개의 베타 가닥(C, D, F 및 G)을 갖는 베타 샌드위치 구조(상기 베타 가닥들은 6개의 루프 영역들에 의해 연결되어 있음)를 특징으로 한다. 이들 루프 영역은 각각의 루프의 N 말단 및 C 말단에 연결된 베타 가닥들에 따라 명명된다. 따라서, AB 루프는 베타 가닥 A와 B 사이에 위치하고, BC 루프는 베타 가닥 B와 C 사이에 위치하고, CD 루프는 베타 가닥 C와 D 사이에 위치하고, DE 루프는 베타 가닥 D와 E 사이에 위치하고, EF 루프는 베타 가닥 E와 F 사이에 위치하고, FG 루프는 베타 가닥 F와 G 사이에 위치한다. FnIII 도메인은 높은 친화성으로 특정 표적에 결합할 수 있는 단백질 스캐폴드의 다양한 풀(pool)의 발생을 촉진하는 무작위화에 대한 내성을 나타내는 용매 노출된 루프를 보유한다.
본 발명의 한 양태에서, Tn3 도메인은 항체 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)과 유사한 1개 이상의 루프를 무작위화하도록 디자인된 유도 진화(directed evolution)를 받는 스캐폴드로서 사용된다. 이러한 유도 진화 방법은 관심있는 표적, 예를 들면, TRAIL R2에 대한 높은 친화성을 나타내는 항체 유사 분자를 생성한다. 또한, 몇몇 실시양태에서, 이러한 도입된 루프에 결합하는 분자의 진화를 유도하기 위해 본원에 기재된 스캐폴드를 사용하여 정의된 노출된 루프(예를 들면, 표적 결합에 기초하여 미리 무작위화되고 선택된 루프)를 표시할 수 있다. 이러한 종류의 선택을 수행하여 임의의 개별 CDR 유사 루프에 대한 인식 분자, 또는 대안적으로 비선형 에피토프 결합 모이어티로 조합된 2개 또는 3개의 CDR 유사 루프에 대한 인식 분자를 확인할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 국제특허공보 제WO2009/058379호에 기재된 인간 테나신 C 구조 모티프의 제3 FnIII 도메인에 기초한 분자이다. 특이적 표적 결합을 부여할 수 있는 3개 루프(BC, DE 및 FG로 명명됨)의 셋은 각각 B 가닥과 C 가닥 사이, D 가닥과 E 가닥 사이, 및 F 베타 가닥과 G 베타 가닥 사이에서 존재한다. 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프는 각각 9개 아미노산 잔기, 6개 아미노산 잔기 및 10개 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 이들 루프의 길이는 항체 중쇄에서 발견되는 동족 항원 인식 루프의 좁은 범위, 즉 각각 7 내지 10개 아미노산 길이, 4 내지 8개 아미노산 길이 및 4 내지 28개 아미노산 길이 내에 포함된다. 유사하게, 루프의 제2 셋, 즉 AB 루프, CD 루프 및 EF 루프(각각 7개 아미노산 길이, 7개 아미노산 길이 및 8개 아미노산 길이)는 각각 A 베타 가닥과 B 베타 가닥 사이, C 베타 가닥과 D 베타 가닥 사이, 및 E 베타 가닥과 F 베타 가닥 사이에서 존재한다.
일단 무작위화되고 표적과의 높은 친화성 결합에 대해 선택되면, Tn3 도메인 내의 루프는 항체 내의 동족 CDR 루프의 접촉과 동등한 표적과의 접촉을 만들 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프는 무작위화되고 1개 이상의 표적, 예를 들면, TRAIL R2와의 높은 친화성 결합에 대해 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 이 무작위화 및 선택 과정은 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프의 무작위화와 동시에 수행될 수 있는 반면, 다른 실시양태에서 이 무작위화 및 선택 과정은 연속적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 단량체 스캐폴드
본 발명은 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥 도메인을 포함하는 재조합 비천연 FnIII 스캐폴드로서, 이때 상기 루프 영역들 중 1개 이상의 루프 영역이 야생형 Tn3(서열번호 1) 내의 동족 루프로부터의 1개 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 변이되어 있는 것인 재조합 비천연 FnIII 스캐폴드를 제공한다.
신규 결합 특성을 갖는 개선된 Tn3 모듈을 발생시키기 위해, 야생형 Tn3에서 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 유발한다. 개선된 스캐폴드의 서열을 Tn3의 서열과 비교하는 경우, 베타 가닥 및 루프의 동일한 정의가 이용된다 것을 이해할 것이다. 개선된 Tn3 스캐폴드를 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인, 야생형 Tn3 스캐폴드, 또는 이전에 개선된 Tn3 스캐폴드를 사용하여 발생시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열(서열번호 215)을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
한 실시양태에서, XAB는 서열번호 35로 구성된다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36으로 구성된다. 한 실시양태에서, XCD는 서열번호 37로 구성된다. 한 실시양태에서, XDE는 서열번호 38로 구성된다. 한 실시양태에서, XEF는 서열번호 39로 구성된다. 한 실시양태에서, XFG는 서열번호 40으로 구성된다.
한 실시양태에서, XAB는 서열번호 35를 포함한다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36을 포함한다. 한 실시양태에서, XCD는 서열번호 37을 포함한다. 한 실시양태에서, XDE는 서열번호 38을 포함한다. 한 실시양태에서, XEF는 서열번호 39를 포함한다. 한 실시양태에서, XFG는 서열번호 40을 포함한다.
일부 실시양태에서, XAB는 서열번호 35로 구성되고, XCD는 서열번호 37로 구성되고, XEF는 서열번호 39로 구성된다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36으로 구성되고, XDE는 서열번호 38로 구성되고, XFG는 서열번호 40으로 구성된다.
일부 실시양태에서, XAB는 서열번호 35를 포함하고, XCD는 서열번호 37을 포함하고, XEF는 서열번호 39를 포함한다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36을 포함하고, XDE는 서열번호 38을 포함하고, XFG는 서열번호 40을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 Tn3 모듈(서열번호 1)을 포함하고, 이때 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 베타 가닥 C(서열번호 4)가 N 말단 시스테인을 포함하는 변이체 베타 가닥 C(서열번호 45 또는 서열번호 131)로 치환되고, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 베타 가닥 F(서열번호 48)가 C 말단 시스테인을 포함하는 변이체 베타 가닥 F(서열번호 49)로 치환된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함하고, 이때 베타 가닥 C 및 F(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 1개 이상의 베타 가닥이 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 스캐폴드의 다양한 베타 가닥을 연결하는 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된 1개 이상의 루프를 갖는다. 한 실시양태에서, 스캐폴드의 1개 이상의, 2개 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의, 5개 이상의 또는 모든 6개의 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드의 1개 이상의 루프가 불변 상태로 유지되고, 1개 이상의 추가 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 불변 상태로 유지되고, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 길이 또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 무작위화되고, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프, EF 루프, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의, 5개 이상의 또는 모든 6개의 루프가 길이 또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다.
몇몇 실시양태에서, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 불변 상태로 유지되고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 몇몇 실시양태에서, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 예정되고 제한된 수의 상이한 아미노산으로 유지되고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 따라서, 본 발명의 스캐폴드는 축퇴 컨센서스 서열 및/또는 1개 이상의 불변 아미노산 잔기를 갖는 1개 이상의 루프를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 AB 루프를 포함한다: K-X-X-X-X-X-a(서열번호 216)(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 AB 루프를 포함한다: K-X-X-X-X-X-X-X-a(서열번호 217) (이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타냄).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 포함한다: S-X-a-X-b-X-X-X-G(서열번호 218)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 프롤린 또는 알라닌을 나타내고, b는 알라닌 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 포함한다: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(서열번호 219)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, c는 프롤린, 세린 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 포함한다: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(서열번호 220)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, d는 프롤린, 글루타메이트 또는 라이신을 나타내고, e는 아스파라긴 또는 글리신을 나타내고, f는 세린 또는 글리신을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 CD 루프를 포함한다: Xn(서열번호 221)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, n은 6, 7, 8, 9 또는 10임). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 CD 루프를 포함한다: Xn(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, n은 7, 8 또는 9임).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 DE 루프를 포함한다: X-X-X-X-X-X(서열번호 222)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 EF 루프를 포함한다: X-b-L-X-P-X-c-X(서열번호 223)(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, b는 아스파라긴, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신을 나타내고, c는 이소류신, 쓰레오닌, 세린, 발린, 알라닌 또는 글리신을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-a-X-X-G-X-X-X-b(서열번호 224)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 알라닌을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-X-X-X-X-X-X-X-X(X9)(서열번호 225)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(서열번호 226)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 글리신을 나타냄). 추가 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(서열번호 227)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타냄).
일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 동족 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산 잔기만큼 더 짧은 상태로 유지되고 1개 이상의 위치에서 추가로 무작위화된 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의 루프가 무작위화되어 있고, 이때 A 베타 가닥이 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44를 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50 또는 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52 또는 서열번호 53을 포함하고, AB 루프가 서열번호 35를 포함하고, CD 루프가 서열번호 37을 포함하고, EF 루프가 서열번호 39를 포함한다,
다른 특정 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상의 루프가 무작위화되어 있고, 이때 A 베타 가닥이 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44 또는 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50 또는 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52 또는 서열번호 53을 포함하고, BC 루프가 서열번호 36을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38을 포함하고, FG 루프가 서열번호 40을 포함한다,
향상된 스캐폴드 안정성
비천연 이황화 결합
본 발명의 Tn3 스캐폴드의 안정성은 많은 상이한 방법들에 의해 증가될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역의 연장에 의해 안정화될 수 있다. N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산, 또는 10개 초과의 아미노산에 의해 연장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 본원에 기재된 바와 같이 혈청 반감기를 증가시키는 변경의 도입에 의해 안정화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 상기 스캐폴드의 소수성 코어를 안정화시키기 위한 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다.
본 발명의 Tn3 스캐폴드는 비천연 이황화 결합의 조작에 의해 효과적으로 안정화될 수 있다. 이러한 조작된 스캐폴드는 다량체 스캐폴드의 일부로서 효율적으로 발현될 수 있다. 이황화 결합의 정확한 형성 및 조작된 스캐폴드의 정확한 폴딩은 상기 스캐폴드의 생물학적 활성의 보존에 의해 입증된다. 비천연 이황화 결합을 포함하는 조작된 스캐폴드가 2개 이상의 표적(예를 들면, 실시예 8 참조) 또는 3개 이상의 표적(예를 들면, 실시예 12 참조)에 동시적으로 결합할 수 있다는 사실은 상기 스캐폴드의 3차원적 구조가 조작된 이황화 결합에 의해 유의하게 변경되지 않고 표적 결합 루프의 상대적 위치가 보존된다는 것을 입증하는 증거를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 국제특허공보 제WO2009/058379호에 기재된 바와 같이 비천연 이황화 결합을 포함한다. 생체정보학적 방법을 이용하여 이황화 결합의 조작에 적합한 후보 위치를 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 단량체 스캐폴드는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 2개, 3개, 4개 또는 이보다 많은 수의 조작된 분자내 이황화 결합을 포함하는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인에 비해 증가된 안정성을 나타내는 Tn3 스캐폴드를 수득하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 단량체 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 상기 1개 이상의 비천연 이황화 결합은 단량체 스캐폴드를 안정화시킨다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함하고, 이때 상기 결합은 동일한 다량체 스캐폴드 내의 2개의 상이한 단량체 스캐폴드 사이에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함하고, 이때 상기 결합은 2개의 상이한 다량체 스캐폴드 사이에 위치한다(즉, 상기 이황화 결합은 분자간 이황화 결합이다). 예를 들면, 이황화 결합은 상이한 스캐폴드(예를 들면, 2개의 단리된 Tn3 단량체 스캐폴드, 단리된 Tn3 단량체 스캐폴드와 다량체 스캐폴드, 또는 2개의 다량체 스캐폴드)를 연결할 수 있거나, Tn3 스캐폴드와 링커를 연결할 수 있거나, Tn3 스캐폴드와 Fn 도메인을 연결할 수 있거나, Tn3 스캐폴드와 항체 또는 이의 단편을 연결할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 스캐폴드와 단리된 이종 모이어티를 연결하거나, 스캐폴드와 동일한 스캐폴드에 융합되거나 접합된 이종 모이어티를 연결하거나, 스캐폴드와 상이한 스캐폴드에 융합되거나 접합된 이종 모이어티를 연결하는 1개 이상의 비천연 분자간 이황화 결합을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 스캐폴드로 구성된 다량체 스캐폴드를 형성하는 이황화 결합을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역의 연장을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 본원에 기재된 바와 같이 혈청 반감기를 증가시키기 위한 변경을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 상기 스캐폴드의 소수성 코어를 안정화시키기 위한 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성된다.
향상된 스캐폴드 안정성: FG 루프 길이
본 발명자들은 FG 루프의 길이가 Tn3 스캐폴드의 안정성에 있어서 일정한 역할을 수행한다는 것을 발견하였다. 구체적으로, FOI의 FG 루프에서 발견되는 길이보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 비천연 변이체 FG 루프를 포함하는 Tn3 스캐폴드는 향상된 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산 잔기만큼 더 짧은 비천연 변이체 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, Tn3 스캐폴드의 안정성은 FG 루프에서의 1개 이상의 아미노산의 결실에 의해 향상된다. 또 다른 실시양태에서, Tn3 스캐폴드의 안정성은 상기 FG 루프에서의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산의 결실에 의해 향상될 수 있다. 구체적으로, 안정화된 Tn3 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함할 수 있을 것으로 예측된다.
일부 실시양태에서, Tn3 스캐폴드 변이체는 길이 및/또는 서열에 대해 무작위화된 1개 이상의 루프(즉, AB, BC, CD, DE, EF 및/또는 FG)도 포함한다. 구체적으로, Tn3 스캐폴드 변이체는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함할 수 있을 것으로 예측된다.
일부 실시양태에서, Tn3 스캐폴드 변이체는 야생형 Tn3 스캐폴드의 FG 루프보다 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기만큼 더 짧은 FG 루프를 포함하고, 이때 상기 Tn3 스캐폴드 변이체는 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
안정성 측정
단리된 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드, 또는 다량체 스캐폴드의 일부로서의 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드의 안정성의 증가는 당업계에서 잘 공지되어 있는 기법, 예컨대, 열적(Tm) 변성 및 카오트로픽(chaotropic) 변성(예를 들면, 우레아 또는 구아니딘 염을 사용한 처리), 단백질분해효소 처리(예컨대, 써모라이신(thermolysin)을 사용한 처리), 또는 단백질 안정성을 측정하는, 당분야에서 승인된 또 다른 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 단백질 안정성의 측정을 위해 이용되는 기법의 포괄적인 검토는 예를 들면, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology" and "Current Protocols in Protein Science" by John Wiley and Sons. 2007)에서 발견될 수 있다.
다량체 스캐폴드
본 발명의 한 양태는 직렬로 연결된 2개 이상의 본 발명의 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드를 제공한다. 이러한 다량체 스캐폴드는 다수의 포맷으로 조립될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 Tn3 단량체 스캐폴드는 선형 포맷으로 조립되는 반면, 다른 실시양태에서, 상기 스캐폴드는 분지된 포맷으로 조립된다(예를 들면, 도 1 참조). 특정 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 Tn3 스캐폴드가 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 다량체 스캐폴드를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드 내의 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2에 결합하는 반면, 제2 Tn3 스캐폴드는 상이한 표적에 결합하여 다수의 기능을 나타내고/내거나, 동일한 표적에 결합하여 원자가 및/또는 표적 결합의 친화력, 또는 표적(들)의 다른 작용을 증가시킨다. 몇몇 실시양태에서, 원자가 및/또는 표적 결합의 친화력의 증가는 다수의 스캐폴드가 동일한 표적에 결합할 때 달성된다. 몇몇 실시양태에서, 원자가의 증가는 표적에 대한 특정 작용을 개선시킨다(예컨대, 표적 단백질의 이량체화를 증가시킴).
특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 직렬로 연결된 2개 이상의 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 Tn3 스캐폴드는 1개 이상의 표적에 결합하고, 각각의 Tn3 스캐폴드는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고, 1개 이상의 루프는 야생형 Tn3 도메인 내의 동족 루프의 비천연 변이체이다.
다량체 직렬 스캐폴드
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 8개 또는 이보다 많은 수의 본 발명의 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Tn3 단량체 스캐폴드들 중 몇몇은 직렬로 연결되어 있다. 또 다른 실시양태에서, Tn3 단량체 스캐폴드들 중 몇몇은 직렬로 연결되어 있고, Tn3 단량체 스캐폴드들 중 몇몇은 직렬로 연결되어 있지 않다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 직렬로 연결된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이보다 많은 수의 스캐폴드를 포함한다(예를 들면, 도 1 및 2 참조).
한 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드는 예를 들면, Tn3 스캐폴드의 직접적인 연결, 또는 링커, 예를 들면, 펩티드 링커의 포함에 의해 Tn3 단량체 스캐폴드 사이의 공유결합을 통해 발생된다. 구체적인 예에서, 공유결합된 스캐폴드는 단량체 Tn3 스캐폴드를 코딩하는 융합 유전자를 구축함으로써, 또는 대안적으로 시스테인 잔기에 대한 코돈을 단량체 Tn3 스캐폴드 내로 도입하는 조작을 수행한 후 발현 생성물 사이에 이황화 결합 형성이 일어나게 함으로써 발생된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 임의의 추가 개재 아미노산 없이 서로 직접적으로 연결되어 있는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 링커, 예를 들면, 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 펩티드 링커는 1 내지 약 1,000개, 1 내지 약 500개, 1 내지 약 250개, 1 내지 약 100개, 1 내지 약 50개 또는 1 내지 약 25개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 펩티드 링커는 1 내지 약 20개, 1 내지 약 15개, 1 내지 약 10개 또는 1 내지 약 5개의 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 링커, 예를 들면, 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 링커는 기능성 모이어티이다. 상기 기능성 모이어티는 상기 다량체 스캐폴드의 원하는 기능 및/또는 특성에 기초하여 선택될 것이다. 예를 들면, 정제에 유용한 기능성 모이어티(예를 들면, 히스티딘 태그)가 링커로서 사용될 수 있다. 링커로서 유용한 기능성 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 세포독성제, 방사성핵종, 조영제, 바이오틴, 이량체화 도메인, 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 이의 FcRn 결합 부분, 항체의 도메인 또는 단편, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, IgG 분자, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-Tn3 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 링커로서 사용될 수 있는 특정 펩티드 링커 및 기능성 모이어티는 하기 개시되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 1개 이상의 링커를 통해 연결되어 있는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 Tn3 스캐폴드 사이에 개재된 상기 링커는 동일한 링커 또는 상이한 링커일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 동일한 링커 또는 상이한 링커일 수 있는 다수의 링커를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 복수의 링커가 연쇄적으로 연결되어 있는 경우, 몇몇 또는 모든 링커는 기능성 모이어티일 수 있다.
다량체 스캐폴드 결합 화학양론
몇몇 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2에 대해 특이적인 스캐폴드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 TRAIL R2 또는 상이한 표적 상의 상이한 에피토프일 수 있는 상이한 에피토프에 대해 특이적인 스캐폴드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 동일한 TRAIL R2 분자 상의 2개 이상의 상이한 에피토프(예를 들면, 비중복 에피토프)에 결합할 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고 추가로 1개 이상의 상이한 표적 분자 상의 1개 이상의 에피토프에 결합할 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2 이량체 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 2개 이상의 TRAIL R2 분자 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 인접 세포 표면 상의 TRAIL R2 분자의 2개 이상의 카피 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 동일한 또는 상이한 결합 친화성 및/또는 친화력으로 TRAIL R2 또는 상이한 표적 상의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드 내의 단량체 스캐폴드는 표적에 대한 원하는 작용, 예를 들면, 표적 이량체화를 달성하거나 (예를 들면, 상승작용적으로) 향상시키도록 디자인된 특정 결합 패턴에 따라 TRAIL R2의 1개 이상의 카피 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들면, 선형 다량체 스캐폴드 내의 Tn3 스캐폴드는 일정한 패턴에 따라 단일 TRAIL R2 또는 다수의 TRAIL R2에 결합할 수 있고, 예를 들면, 6 모듈 선형 다가 스캐폴드 내의 Tn3 스캐폴드는 AAABBB 패턴, AABBAA 패턴, ABABAB 패턴, AAAABB 패턴 등에 따라 2개의 TRAIL R2 표적 A 및 B에 결합할 수 있고, AABBCC 패턴, ABCABC 패턴, ABCCBA 패턴 등에 따라 3개의 표적에 결합할 수 있고, ABCDDA 패턴, ABCADA 패턴 등에 따라 4개의 표적에 결합할 수 있다. 추가로, 본 발명의 다량체 스캐폴드가 복수의 조작된(예를 들면, 이황화 조작된, 루프 조작된, 또는 이황화 및 루프 조작된) 스캐폴드 및 비조작된 스캐폴드를 포함하는 경우, 이러한 단량체 스캐폴드는 일정한 생물학적 효과를 달성하거나 향상시키기 위해 일정한 패턴에 따라 정렬될 수 있다. 단량체 Tn3 스캐폴드의 이러한 조합은 조합적으로 조립될 수 있고, 추후 당업계에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 평가될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 분지된 구축물 형태의 다량체 Tn3 스캐폴드, 예를 들면, Fc 융합체 또는 항체 유사 포맷의 다량체 스캐폴드는 일정한 패턴에 따라 단일 TRAIL R2 또는 다수의 TRAIL R2 표적에 결합할 수도 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, IgG 중쇄에 융합된 선형 포맷 Tn3 스캐폴드(항체 유사 포맷 Tn3 다량체 스캐폴드)는 제1 표적에 결합할 수 있는 반면, IgG 경쇄에 융합된 다가 Tn3 선형 스캐폴드(항체 유사 포맷 Tn3 스캐폴드)은 제2 표적에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, IgG 중쇄에 융합된 선형 포맷 Tn3 스캐폴드(항체 유사 포맷 Tn3 스캐폴드)는 일정한 친화성으로 표적에 결합할 수 있는 반면, IgG 경쇄에 융합된 선형 포맷 스캐폴드(항체 유사 포맷 스캐폴드)는 상이한 친화성으로 동일한 표적에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 "Y"의 좌측 아암(arm)의 쇄에 융합된 Tn3 스캐폴드는 제1 표적에 결합할 수 있는 반면, 항체의 "Y"의 우측 아암의 쇄에 융합된 Tn3 스캐폴드는 제2 표적에 결합할 수 있다.
융합
본 발명은 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함하는 다량체 Tn3 스캐폴드로서, 이때 1개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드가 이종 모이어티에 융합될 수 있는 것인 다량체 스캐폴드를 추가로 제공한다. 이 문맥에서, 상기 이종 모이어티는 상기 스캐폴드를 연결하는 데 있어서 스페이서로서 사용되지 않으나 다량체 Tn3 스캐폴드에 추가 기능성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, TRAIL R2에 결합하는 다량체 Tn3 스캐폴드는 표적 특이적 세포 사멸을 촉진하기 위해 세포독성제에 융합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이종 모이어티는 링커로서 작용할 수 있다.
본 발명은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방체 물질, 합성 약물, 무기 분자 및 유기 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 1개 이상의 이종 모이어티에 접합되거나 융합된 다량체 Tn3 스캐폴드의 용도를 포괄한다. 본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합된 다량체 Tn3 스캐폴드의 용도를 포괄한다. 접합은 공유접합 및 비공유접합 둘다를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 500개 이상 또는 1,000개 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드에 융합되거나 화학적으로 접합되어 융합 단백질을 발생시킬 수 있다.
다량체 Tn3 스캐폴드와 1개 이상의 이종 모이어티의 융합 또는 접합은 Tn3 스캐폴드와 이종 모이어티 사이에 개재된 링커 없이 직접적으로 달성될 수 있거나, 본원에 기재된 1개 이상의 링커 서열을 통해 달성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Tn3 스캐폴드를 표적 세포의 특정 세포 표면 수용체, 예컨대, TRAIL R2에 대해 특이적인 항체에 융합시키거나 접합시킴으로써 시험관 내에서 또는 생체 내에서 상기 스캐폴드를 사용하여 이종 폴리펩티드를 특정 종류의 세포에 표적화시킬 수 있다. 이종 폴리펩티드에 융합되거나 접합된 다량체 Tn3 스캐폴드는 당업계에서 공지되어 있는 방법을 이용하는 시험관내 면역분석 및 정제 방법에서 사용될 수도 있다. 예를 들면, 온전히 그대로 참고로 도입되는 국제특허공보 제WO93/21232호, 유럽 특허 제EP 439,095호, 문헌(Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99, 1994), 미국 특허 제5,474,981호, 문헌(Gillies et al., PNAS 89:1428-1432, 1992) 및 문헌(Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452, 1991)을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 예를 들면, N 말단 또는 C 말단을 통해 스캐폴드를 면역글로불린 또는 이의 도메인(IgG의 불변 영역(Fc)을 포함하나 이로 한정되지 않음)에 융합시키거나 접합시킴으로써 다량체 Tn3 스캐폴드를 인간 면역 반응과 통합시킬 수 있다. 유사하게, 스캐폴드와 보체 단백질, 예컨대, CIq 사이의 융합을 이용하여 세포를 표적화시킬 수 있다. 다량체 Tn3 스캐폴드와 독소 사이의 융합을 이용하여 본원에 기재된 바와 같이 특정 항원을 보유하는 세포를 특이적으로 파괴할 수 있다.
다양한 공개문헌이 FcRn 결합 폴리펩티드를 생리학적 활성 분자 내로 도입함으로써(예를 들면, 국제특허공보 제WO97/43316호, 미국 특허 제5,869,046호, 미국 특허 제5,747,035호, 국제특허공보 제WO96/32478호 및 국제특허공보 제WO91/14438호 참조), 상기 분자를 FcRn 결합 친화성이 보존되어 있으나 다른 Fc 수용체에 대한 친화성이 크게 감소되어 있는 항체와 융합시킴으로써(예를 들면, 국제특허공보 제WO99/43713호 참조), 상기 분자를 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시킴으로써(예를 들면, 국제특허공보 제WO00/09560호 및 미국 특허 제4,703,039호 참조) 변경된 반감기를 갖는 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법을 기술한다. 생리학적 활성 분자의 반감기를 증가시키는 구체적인 기법 및 방법은 미국 특허 제7,083,784호에서도 발견될 수 있다. 구체적으로, 다량체 Tn3 스캐폴드는 IgG의 Fc 영역에 융합될 수 있을 것으로 예측되고, 이때 상기 Fc 영역은 아미노산 잔기 돌연변이 M252Y/S254T/T256E 또는 H433K/N434F/Y436H(이때, 아미노산 위치는 카바트(Kabat) 넘버링 방식에 따라 표시됨)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드의 반감기는 다가 Tn3 스캐폴드를 본질적으로 비구조화된 재조합 폴리펩티드(예를 들면, XTEN™ 폴리펩티드)와 유전적으로 융합시키거나 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 접합시킴으로써 증가될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 생체내 또는 혈청 반감기를 증가시키거나 연장시키는 분자와 융합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 스캐폴드는 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 이의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편, PEG, 다당류, 항체, 보체, 헤모글로빈, 결합 펩티드, 지단백질 또는 다른 인자와 융합되거나 접합되어 혈류 중의 그의 반감기 및/또는 그의 조직 침투를 증가시킬 수 있다. 이들 융합체들 중 임의의 융합체는 표준 기법, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 유전자 서열을 사용하여 구축한 재조합 융합 유전자로부터의 융합 단백질의 발현에 의해 발생될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 스캐폴드는 정제를 촉진하기 위해 마커 서열, 예컨대, 펩티드와 융합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 폴리히스티딘 펩티드(His-태그), 예를 들면, 옥타히스티딘 태그(His-8-태그)(서열번호 211) 또는 헥사히스티딘 태그(His-6-태그)(서열번호 228), 예컨대, 다른 벡터 중에서 pQE 발현 벡터(퀴아젠 인코포레이티드(QIAGEN, Inc.), 미국 캘리포니아주 91311 채츠워쓰 이톤 애비뉴 9259 소재) 내에 제공된 태그이다(이들 태그들 중 대부분은 상업적으로 입수가능함). 문헌(Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989)에 기재된 바와 같이, 예를들면, 폴리히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌("HA") 태그, FLAG 태그, Strep 태그, myc 태그, V5 태그, GFP 태그, AU1 태그, AU5 태그, ECS 태그, GST 태그 및 OLLAS 태그를 포함하나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Wilson et al., Cell 37:767, 1984) 참조)
본 발명의 스캐폴드를 포함하는 추가 융합 단백질은 유전자 셔플링(shuffling), 모티프 셔플링, 엑손 셔플링 및/또는 코돈 셔플링("DNA 셔플링"으로서 총칭됨) 기법을 통해 발생될 수 있다.
DNA 셔플링을 이용하여 표적에 대한 Tn3 스캐폴드의 작용을 변경시킬 수 있다(예를 들면, 보다 높은 친화성 및 보다 낮은 해리속도를 갖는 스캐폴드, 또는 TRAIL R2를 이량체화시키는 능력이 증가되어 있는 스캐폴드를 발생시킬 수 있음). Tn3 스캐폴드는 재조합 전에 오류 유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 의해 변경될 수 있다. 특정 표적에 결합하는 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 부분은 1개 이상의 이종 분자의 1개 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
항체 유사 다량체 스캐폴드
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 1개 이상의 Tn3 스캐폴드는 온전한 항체, 항체 가변 도메인, CH1 도메인, C카파 도메인, C람다 도메인, Fc 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항체(예를 들면, IgG)의 도메인 또는 단편에 융합되어 있다.
몇몇 실시양태에서, Tn3 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편에 융합될 수 있다. 항체의 도메인 또는 단편은 하기 기재된 Fc 도메인과 유사하게 본 발명의 다량체 스캐폴드의 형성을 촉진하는 이량체화 또는 다량체화 도메인을 제공함으로써 상기 다량체 스캐폴드의 친화력 및/또는 친화성을 추가로 향상시킬 수 있다. 나아가, 상기 항체의 도메인 또는 단편은 표적에 대한 스캐폴드의 작용을 추가로 향상시킬 수 있다(예를 들면, 표적의 이량체화 또는 다량체화를 보다 효율적으로 향상시킬 수 있다).
몇몇 실시양태에서, 2개의 Tn3 도메인을 포함하는 1개의 다량체 직렬 Tn3 스캐폴드만이 항체의 도메인 또는 단편에 접합되어 있거나 융합되어 있다. 예를 들면, 단일 다량체 직렬 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편(예를 들면, 항체의 중쇄 또는 경쇄)의 폴리펩티드의 N 말단에 융합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 1개 이상의 Tn3 스캐폴드를 항체의 도메인 또는 단편(예를 들면, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄)의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합시키거나 접합시킴으로써 생성된다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 몇몇 또는 모든 Tn3 스캐폴드가 동일하다. 몇몇 다른 실시양태에서, 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 몇몇 또는 모든 Tn3 스캐폴드가 상이하다.
몇몇 실시양태에서, 항체 유사 다가 Tn3 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용된 직렬 Tn3 스캐폴드는 동일한 수의 Tn3 모듈을 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체 유사 다가 Tn3 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용된 직렬 Tn3 스캐폴드는 상이한 수의 Tn3 모듈을 함유할 수 있다. 예를 들면, 4가 Tn3 스캐폴드는 예를 들면, 선형 포맷 4가 Tn3 스캐폴드를 단일 위치에 융합시키거나, 1개의 Tn3 단량체 스캐폴드를 한 위치에 융합시키고 삼량체 선형 포맷 Tn3 스캐폴드를 또 다른 위치에 융합시키거나, 2개의 이량체 Tn3 선형 포맷 스캐폴드를 2개의 상이한 위치에 융합시키거나, 4개의 Tn3 단량체 스캐폴드를 각각 하나씩 단일 위치에 융합시킴으로써 형성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 4개의 다량체 선형 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 다량체 선형 Tn3 스캐폴드는 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개의 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함한다(도 1 참조). 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 본 발명의 단량체 또는 다량체 Tn3 스캐폴드를 포함한다.
한 특정 실시양태에서, 4가 Tn3 스캐폴드는 1개의 Tn3 스캐폴드를 항체의 도메인 또는 단편의 경쇄 및 중쇄 각각의 N 말단에 융합시킴으로써 발생될 수 있다(예를 들면, 도 2에서 A9 구축물 참조).
항체 유사 포맷 다가 Tn3 스캐폴드는 Tn3 스캐폴드의 임의의 조합을 항체 또는 변형된 항체의 도메인 또는 단편에 융합시킴으로써 발생될 수 있다. 변형된 항체의 예로는 도메인 결실된 항체, 미니바디(예를 들면, 미국 특허 제5,837,821호 참조), 4가 미니바디, 4가 항체(예를 들면, 문헌(Coloma & Morrison, Nature Biotechnol. 15:159-163, 1997) 및 국제특허공보 제WO95/09917호 참조), 열적으로 안정화된 항체, 인간화된 항체 등이 있다.
도 1에 따른 항체 유사 다가 Tn3 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용된 본 발명의 선형 Tn3 스캐폴드 각각은 동일한 링커 및 링커 분포, 또는 상이한 링커 및 상이한 링커 분포를 함유할 수 있다.
Fc 융합 다량체 스캐폴드
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드는 Fc 도메인에 연결된 복수의 단량체 또는 다량체 Tn3 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드와, Fc 도메인을 포함하는 항체 단편의 융합은 다량체 Tn3 스캐폴드의 이량체의 형성을 촉진하는 이량체화 도메인을 제공함으로써 상기 다량체 FnIII 스캐폴드의 친화력 및/또는 활성을 추가로 향상시킨다.
몇몇 실시양태에서, 1개의 다량체 Tn3 스캐폴드만이 Fc 도메인에 융합되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합된 2개의 다량체 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 다량체 Tn3 스캐폴드는 1개 이상의 링커를 통해 연결되어 있는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 포함한다(도 1). 한 특정 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 다량체 Tn3 스캐폴드는 선형 포맷 스캐폴드이다.
한 특정 실시양태에서, 2개의 Tn3 도메인을 직렬로 포함하는 2개의 선형 포맷 Tn3 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합되어 원자가 4의 다량체 Tn3 스캐폴드를 생성한다(예를 들면, 도 2에서 A7 구축물 참조). 또 다른 특정 실시양태에서, 4개의 Tn3 단량체 스캐폴드를 각각 포함하는 2개의 선형 포맷 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합되어 원자가 8의 다량체 Tn3 스캐폴드를 생성한다(예를 들면, 도 2에서 A8 구축물 참조).
몇몇 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 Tn3 스캐폴드는 동일한 수의 Tn3 모듈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 Tn3 스캐폴드는 상이한 수의 Tn3 모듈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 Tn3 스캐폴드는 동일한 링커를 포함한다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 Tn3 스캐폴드는 상이한 링커를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 상이한 다량체 Tn3 스캐폴드는 이종이량체의 형성에 유리한 Fc 도메인 돌연변이의 사용에 의해 이량체화될 수 있다. Fc 영역의 변이체(예를 들면, 아미노산 치환 및/또는 부가 및/또는 결실)는 항체의 이펙터 기능을 향상시키거나 감소시키고 항체의 약동학적 성질(예를 들면, 반감기)을 변경시킬 수 있는 것으로 당업계에서 공지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 Tn3 스캐폴드는 변경된 Fc 영역을 포함하는 Fc 도메인(들)을 포함하고, 이때 다량체 Tn3 스캐폴드의 기능성 및/또는 약동학적 성질을 변화시키기 위해 1개 이상의 변경이 상기 Fc 영역 내에서 만들어져 있다.
Fc 영역의 글리코실화는 이펙터 기능 및/또는 소염 활성을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다는 것도 공지되어 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 FnIII 스캐폴드의 Fc 영역은 상기 다량체 스캐폴드의 세포독성 및/또는 소염 성질을 변화시키기 위해 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화를 포함한다.
다량체 스캐폴드 위상기하학
당업자는 상기에서, 도 1 및 2에서, 및 본 명세서 전체에서 논의된 다량체 스캐폴드가 단지 설명을 위한 예일 뿐이라는 것을 인식할 것이다. 도 1 및 2에 나타낸 구축물 위상기하학 또는 포맷은 몇몇 실시양태에서 본 발명의 스캐폴드가 Fc 도메인 및 항체의 성분 폴리펩티드의 N 말단에 융합되어 있는 것을 보여준다. 본 발명의 스캐폴드는 임의의 적합한 공간적 배열로 Fc 도메인, 항체 경쇄 및 항체 중쇄의 C 말단에 융합될 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 4가 스캐폴드는 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 중쇄 각각의 N 말단에 융합시키고 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 경쇄 각각의 C 말단 도메인에 융합시킴으로써, FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 경쇄 각각의 N 말단에 융합시키고 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 중쇄 각각의 C 말단에 융합시킴으로써, 또는 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 중쇄 각각의 N 말단에 융합시키고 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 경쇄 각각의 N 말단에 융합시킴으로써 생성될 수 있다. 단량체 및/또는 다량체 FnIII 스캐폴드는 가변 영역 및 불변 영역 둘다를 포함하는 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 융합될 수 있다. 대안적으로, FnIII 단량체 및/또는 다량체 스캐폴드는 (예를 들면, 도 2에 나타낸 A9 구축물에서와 같이) 불변 영역만을 포함하는 절두된 중쇄 및/또는 경쇄에 융합될 수 있다.
다량체 Tn3 스캐폴드는 도 1에 나타낸 포맷을 구축 블록으로서 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 항체 유사 포맷 및 Fc 융합체 포맷은 보다 단순한 선형 포맷 Tn3 모듈을 포함하는 조합물이다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 보다 복잡한 다량체 Tn3 스캐폴드 포맷은 도 1에 나타낸 구축 블록을 조합함으로써 생성될 수 있다.
도 1 및 2는 몇몇 실시양태에서 다량체 Tn3 스캐폴드가 선형 또는 분지된 포맷일 수 있고 상이한 분지도를 나타낼 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들면, Fc 포맷은 일차 분지된 포맷의 예를 제공하는 반면, 항체 유사 포맷은 이차 분지된 포맷의 예를 제공한다. 고차 분지된 구축물은 항체 유사 포맷 또는 Fc 융합체 포맷 내의 선형 포맷 구축 블록을 Fc 융합체 포맷 구축 블록 또는 항체 유사 구축 블록으로 치환시키고 이들을 Fc 또는 항체의 성분 폴리펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 연결함으로써 수득될 수 있다.
도 1 및 2, 및 표 1은 몇몇 실시양태에서 다량체 Tn3 스캐폴드 내의 링커가 구조적으로 및 기능적으로 다양할 수 있고 복수의 부착점을 제공할 수 있다는 사실을 보여준다. 예를 들면, (Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer(Gly4Ser)1Ala 링커(서열번호 89)에 의해 연결된 제4 Tn3 모듈 및 제5 Tn3 모듈을 제외하고 A4 구축물 및 A5 구축물 내의 모든 Tn3 모듈이 (Gly4Ser)3Ala 링커(서열번호 88)에 의해 연결되어 있다. 예를 들면, A7 구축물에서, 제1 Tn3 도메인 및 제2 Tn3 도메인과 제3 Tn3 도메인 및 제4 Tn3 도메인은 (Gly4Ser)3Ala 링커(서열번호 88)에 의해 연결되어 있는 반면, 제2 Tn3 도메인과 제3 Tn3 도메인은 기능성 모이어티 링커로서 Fc 도메인에 의해 연결되어 있다.
도 1에 나타낸 Fc 융합체는 몇몇 실시양태에서 단량체 또는 다량체 Tn3 스캐폴드가 기능성 모이어티 링커의 폴리펩티드의 N 말단에 융합될 수 있다는 것을 예시한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단량체 또는 다량체 Tn3 스캐폴드는 Fc 융합체 포맷 구축물 내의 Fc 도메인의 C 말단에 용이하게 융합될 수 있다.
유사하게, 항체 유사 포맷 구축물 내의 항체 또는 변형된 항체도 기능성 모이어티 링커이다. 이 경우, (Gly4Ser)3Ala(서열번호 88) 또는 (Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer(Gly4Ser)1Ala 링커(서열번호 89) 내의 2개의 부착점, 또는 Fc 도메인의 경우에서와 같은 4개의 가능한 부착점 대신에, 도 1의 항체 유사 예에서 나타낸 항체는 6개의 가능한 부착점을 제공한다. 도 1에 나타낸 항체 유사 포맷은 몇몇 실시양태에서 기능성 모이어티 링커 내의 N 말단 부착점만이 Tn3 스캐폴드에 의해 점유되어 있다는 것을 예시한다. 항체 유사 포맷 구축물에서, 본 발명의 몇몇 또는 모든 Tn3 스캐폴드는 항체 또는 변형된 항체 도메인의 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 용이하게 융합될 수 있다. 다른 융합 화학양론이 적용될 수 있다(즉, 본 발명의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 이보다 많은 수의 Tn3 스캐폴드가 항체 또는 변형된 항체에 융합될 수 있다).
또한, 도 1 및 2는 몇몇 실시양태에서 다량체 Tn3 스캐폴드가 다른 Tn3 다량체 스캐폴드를 조합함으로써 발생될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들면, 도 2의 Fc 포맷 A6 스캐폴드, A7 스캐폴드 및 A8 스캐폴드는 동종이량체 Tn3 스캐폴드이고, 이때 다량체 Tn3 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합된 선형 포맷 Tn3 스캐폴드를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드 쇄(분자간 이황화 결합을 통해 연결됨)에 의해 형성된다. 도 1 및 2의 항체 유사 스캐폴드는 이종이량체 Tn3 스캐폴드를 예시하고, 이때 2종의 상이한 스캐폴드(Tn3 단량체 스캐폴드를 IgG 경쇄 불변 영역에 융합시킴으로써 형성된 2개의 Tn3 스캐폴드, 및 Tn3 단량체 스캐폴드를 IgG의 CH1-힌지 영역-Fc 영역에 융합시킴으로써 형성된 2개의 Tn3 스캐폴드)에 상응하는 4개의 폴리펩티드가 분자간 이황화 결합을 통해 연결되어 있다.
본 발명의 스캐폴드의 발생
본원에 기재된 Tn3 스캐폴드는 신규 또는 개선된 표적 결합 단백질을 발생시키기 위한 임의의 기법에서 사용될 수 있다. 한 구체적인 예에서, 상기 표적은 고체 지지체, 예컨대, 컬럼 수지 또는 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 고정되고, 상기 표적은 후보 스캐폴드에 기초한 결합 단백질의 라이브러리와 접촉한다. 이러한 라이브러리는 CDR 유사 루프의 서열 및/또는 길이의 무작위화를 통해 Tn3 스캐폴드로부터 구축된 클론들로 구성될 수 있다.
이와 관련하여, 박테리오파지(파지) 표시는 큰 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 라이브러리의 구성원(들)을 확인할 수 있게 하는 잘 공지된 한 기법이다. 파지 표시는 변이체 폴리펩티드를 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질과의 융합 단백질로서 표시하는 기법이다(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). 생체정보학적 방법을 이용하여 천연 FnIII 도메인의 루프 길이 및 서열 다양성 선호도를 확인할 수 있다. 이 분석을 이용하여, 루프 길이 및 서열 다양성에 대한 선호도(preferences)를 이용하여 "제한된 무작위화" 방법을 개발할 수 있다. 이 제한된 무작위화에서, 상대적인 루프 길이 및 서열 선호도는 라이브러리 기법의 개발에 도입된다. 루프 길이 및 서열 다양성 분석을 라이브러리 개발에 도입하는 것은 제한된 무작위화를 일으킨다(즉, 아미노산이 존재할 수 있는 위치가 무작위화된 루프 내의 일부 위치들로 한정된다).
또한, 본 발명은 비천연 Tn3 스캐폴드의 다양한 집단을 포함하는 재조합 라이브러리를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 라이브러리는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥 도메인을 포함하는 비천연 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 루프들 중 1개 이상의 루프는 1개 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 변이된다. 특정 실시양태에서, 상기 라이브러리는 야생형 Tn3 스캐폴드로부터 유래된 Tn3 스캐폴드를 포함한다.
상기 상술되어 있는 바와 같이, 스캐폴드의 다양한 베타 가닥을 연결하는 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된 1개 이상의 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드를 포함한다. 한 실시양태에서, Tn3 스캐폴드의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 루프가 불변 상태로 유지되는 반면, 1개 이상의 추가 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두가 불변 상태로 유지되는 반면, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두는 길이 또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두가 무작위화되는 반면, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다.
본 발명자들은 FOI의 FG 루프에서 발견되는 길이보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 길이를 갖는 FG 루프가 향상된 안정성을 보인다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 Tn3 스캐폴드를 포함하는 라이브러리를 제공하고, 이때 FG 루프의 길이가 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 동족 FG 루프의 길이보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧게 유지된다는 점을 제외하고 1개 이상의 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 스캐폴드는 6개의 루프 영역에 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하고, 이때 루프 영역은 각각의 베타 가닥을 연결하고 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명되고, 1개 이상의 루프는 야생형 Tn3 스캐폴드 루프의 비천연 변이체이고, FG 루프는 야생형 Tn3 스캐폴드 내의 동족 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성된다.
상기 상술되어 있는 바와 같이, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 불변 상태로 유지될 수 있고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 임의적으로 또는 대안적으로, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 예정되고 제한된 수의 상이한 아미노산으로 유지될 수 있고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 따라서, 본 발명의 라이브러리는 축퇴 컨센서스 서열 및/또는 1개 이상의 불변 아미노산 잔기를 갖는 1개 이상의 루프를 포함할 수 있는 Tn3 스캐폴드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드를 포함한다: S-X-a-X-b-X-X-X-G(서열번호 218)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 프롤린 또는 알라닌을 나타내고, b는 알라닌 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드를 포함한다: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(서열번호 219)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, c는 프롤린, 세린 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드를 포함한다: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(서열번호 220)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, d는 프롤린, 글루타메이트 또는 라이신을 나타내고, e는 아스파라긴 또는 글리신을 나타내고, f는 세린 또는 글리신을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 DE 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드를 포함한다: X-X-X-X-X-X(서열번호 221)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드를 포함한다: X-a-X-X-G-X-X-X-b(서열번호 222)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 알라닌을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: X-X-X-X-X-X-X-X-X(X9)(서열번호 223)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄).
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 아미노산 서열(서열번호 229)을 포함하는 스캐폴드를 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이고, m은 1 내지 9이다.
본 발명은 본 발명의 라이브러리를 스크리닝함으로써 표적, 예를 들면, TRAIL R2에 결합하고 야생형 Tn3 스캐폴드에 비해 증가된 안정성 및 표적, 예를 들면, TRAIL R2에 대한 개선된 작용을 나타내는 재조합 Tn3 스캐폴드를 확인하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 야생형 Tn3 스캐폴드에 비해 증가된 단백질 안정성을 나타내고 표적에 특이적으로 결합하는 재조합 Tn3 스캐폴드를 확인하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 스캐폴드:표적 리간드 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 상기 표적 리간드를 본 발명의 라이브러리와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 복합체로부터 상기 표적 리간드에 결합하는 스캐폴드를 수득하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 수득된 스캐폴드의 안정성이 야생형 Tn3 스캐폴드의 안정성보다 더 높은지를 확인하는 단계.
상기 방법을 이용하여 표적에 대한 개선된 결합 친화성, 친화력 등을 나타내는 재조합 Tn3 스캐폴드를 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, 단계 (a)에서 본 발명의 스캐폴드 라이브러리를 고정된 표적과 함께 항온처리한다. 한 실시양태에서, 단계 (b)에서 스캐폴드:표적 리간드 복합체를 세척하여 비특이적 결합제를 제거하고, 가장 강한 결합제를 매우 엄격한 조건 하에서 용출하고 PCR로 분석하여 서열 정보를 회수한다. 구체적으로, 단계 (b)에서 수득된 결합제 및/또는 서열 정보는 본원에 개시되어 있거나 당업자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 신규 라이브러리를 생성하는 데에 사용될 수 있고, 상기 신규 라이브러리는 서열의 추가 돌연변이유발과 함께 또는 서열의 추가 돌연변이유발 없이 선택 과정을 반복하는 데에 사용될 수 있을 것으로 예측된다. 몇몇 실시양태에서, 항원에 대한 충분한 친화성을 나타내는 결합제가 수득될 때까지 다수의 라운드의 선택을 수행할 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태는 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 전술된 바와 같은 라이브러리를 코딩하는 단리된 핵산 분자의 집합물이다.
본 발명의 스캐폴드는 친화 성숙될 수 있다. 이 분야에서 인정된 방법에서, 특이적 결합 단백질은 특이적 표적에 대한 증가된 친화성에 대해 선택하는 방식으로 처리된다(예를 들면, 문헌(Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(11):6037-42) 참조). 생성된 본 발명의 스캐폴드는 친화 성숙 전의 스캐폴드에 비해 적어도 높은 결합 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 표적에 결합하여 스캐폴드:표적 복합체를 형성할 수 있는 단백질 스캐폴드의 아미노산 서열을 확인하는 방법도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 본 발명의 라이브러리를 고정된 또는 분리가능한 표적과 접촉시키는 단계; (b) 스캐폴드:표적 복합체를 자유 스캐폴드로부터 분리하는 단계; (c) 다양성을 낮추고 표적에 결합할 수 있는 표시된 스캐폴드를 풍부하게 함으로써 상기 단계 (a)의 라이브러리로부터 구별되는 신규 폴리펩티드 표시 라이브러리를 발생시키기 위해 단계 (b)의 분리된 스캐폴드의 복제를 야기하는 단계; (d) 임의적으로 단계 (c)의 신규 라이브러리를 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계; 및 (e) 단계 (d)로부터 한 종의 표시된 스캐폴드를 코딩하는 영역의 핵산 서열을 확인하여 상기 표적에 결합할 수 있는 펩티드 서열을 유추하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 라이브러리 스크리닝으로부터의 확인 후 추가로 무작위화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 방법을 이용하여 라이브러리로부터 확인된 스캐폴드의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 루프를 추가로 무작위화하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 추가로 무작위화된 스캐폴드는 표적에 결합할 수 있는 스캐폴드를 확인하는 후속 방법으로 처리된다. 이 방법은 (a) 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드를 고정된 또는 분리가능한 표적과 접촉시키는 단계, (b) 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드:표적 복합체를 자유 스캐폴드로부터 분리하는 단계, (c) 단계 (b)의 분리된 스캐폴드의 복제를 야기하고 임의적으로 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 단계, 및 (d) 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드를 코딩하는 영역의 핵산 서열을 확인하여 상기 표적에 결합할 수 있는 펩티드 서열을 유추하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드는 제1 라이브러리에서 미리 무작위화된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 무작위화된 루프를 포함한다. 대안적 추가 실시양태에서, 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드는 제1 라이브러리에서 미리 무작위화되지 않은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 무작위화된 루프를 포함한다.
또한, 본 발명은 1개 이상의 표적에 결합하는 2개 이상의 Tn3 스캐폴드를 수득하는 방법을 제공한다. 이 방법은 특정 반응을 이끌어내기 위해 협력적으로 작용하는 물질들의 스크리닝을 가능하게 한다. 1개 초과의 스캐폴드의 협력을 요구하는 작용제 활성(예를 들면, TNF 수용체 과에 속하는 수용체의 작용활성(agonism)(그러나, 이로 한정되지 않음))이 요구되는 경우 이러한 스크리닝을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 이 방법은 라이브러리의 리포맷팅(reformatting) 없이 다량체 복합체를 형성하는 협력 물질들의 스크리닝을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 스캐폴드:표적 리간드 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 표적 리간드를 본 발명의 라이브러리와 접촉시키는 단계; 상기 스캐폴드를 가교결합제(2개 이상의 동일한 또는 상이한 스캐폴드를 서로 가까이 인접하게 위치시키는 물질로서 정의됨)와 접촉시키는 단계로서, 상기 스캐폴드의 가교결합이 검출가능한 반응을 이끌어내는 것인 단계; 및 상기 복합체로부터 상기 표적에 결합하는 상기 스캐폴드를 수득하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 가교결합제는 스캐폴드 특이적 항체 또는 이의 단편, 에피토프 태그 특이적 항체 또는 이의 단편, 이량체화 도메인, 예컨대, Fc 영역, 코일드 코일(coiled coil) 모티프(예를 들면, 류신 지퍼(그러나, 이로 한정되지 않음)), 화학적 가교결합제, 또는 당업계에서 공지되어 있는 또 다른 이량체화 도메인이다.
본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 화합물을 검출하는 방법도 제공한다. 라이브러리 스크리닝에 의해 수득된 스캐폴드의 결합 특이성에 기초하여, 샘플 중의 특정 표적을 검출하기 위한 분석, 예컨대, 진단 방법에서 이러한 스캐폴드를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물을 검출하는 방법은 화합물:스캐폴드 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 샘플 중의 상기 화합물을 본 발명의 스캐폴드와 접촉시키는 단계, 및 상기 스캐폴드를 검출하여 샘플 중의 상기 화합물을 검출하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 스캐폴드를 표지하여(즉, 방사선표지, 형광 표지, 효소에 연결된 표지 또는 비색 표지) 화합물의 검출을 촉진한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 화합물을 포획하는 방법을 제공한다. 라이브러리 스크리닝에 의해 수득된 스캐폴드의 결합 특이성에 기초하여, 샘플 중의 특정 표적을 포획하기 위한 분석, 예컨대, 정제 방법에서 이러한 스캐폴드를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플 중의 화합물을 포획하는 방법은 화합물:스캐폴드 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 샘플 중의 상기 화합물을 본 발명의 스캐폴드와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플로부터 상기 복합체를 제거하여 상기 샘플 중의 상기 화합물을 포획하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 스캐폴드를 고정시켜 화합물:스캐폴드 복합체의 제거를 촉진한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리로부터 단리된 스캐폴드는 1개 이상, 2개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 무작위화된 루프를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단리된 스캐폴드 루프 서열은 공여자 스캐폴드로부터 수용자 스캐폴드 내의 임의의 루프로 전달될 수 있다(예를 들면, 공여자 스캐폴드로부터의 FG 루프 서열은 수용자 스캐폴드 내의 임의의 루프로 전달될 수 있음). 특정 실시양태에서, 단리된 루프 서열은 수용자 스캐폴드 내의 동족 루프로 전달될 수 있다(예를 들면, 공여자 스캐폴드로부터의 FG 루프 서열은 FG 루프 위치에서 수용자 스캐폴드로 전달될 수 있음). 몇몇 실시양태에서, 단리된 루프 서열은 다양한 수용자 스캐폴드와 무작위적으로 "혼합되고 일치될" 수 있다.
다른 실시양태에서, 단리된 스캐폴드 서열은 루프 서열에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 라이브러리를 사용하여 특정 표적에 대해 걸러내어 특이적 결합제의 집합물을 단리한다. 무작위화된 루프 서열은 스캐폴드 배경(즉, 서열번호 X의 FG 루프 서열을 포함하는, 표적 X에 결합하는 스캐폴드)과 무관하게 특이적 서열로서 특징지워질 수 있다. 스캐폴드가 표적 X에 결합하는 2개의 루프 서열을 나타내는 대안적인 실시양태에서, 상기 루프 서열은 스캐폴드 서열의 부재 하에서 표적 X에 결합하는 것으로서 특징지워질 수 있다. 즉, 특정 표적에 결합하는, 라이브러리로부터 단리된 스캐폴드는 스캐폴드 골격과 무관하게 상기 표적에 결합하는 가변 루프 서열로서 발현될 수 있을 것으로 예측된다. 이 과정은 항체의 가변 영역 내의 CDR의 개념과 유사할 것이다.
친화 성숙
TRAIL R2 Tn3 스캐폴드의 개발은 1개 이상의 시험관내 또는 생체내 친화 성숙 단계를 수반할 수 있다. Tn3 스캐폴드와 원하는 항원의 결합을 개선시키는 아미노산 변화를 Tn3 도메인 또는 Tn3 도메인 루프 내에서 발생시키는 임의의 친화 성숙 방법이 이용될 수 있다.
이들 아미노산 변화는 예를 들면, 무작위 돌연변이유발, "워크 쓰로우(walk through)" 돌연변이유발 및 "룩 쓰로우(look through)" 돌연변이유발을 통해 달성될 수 있다. 이러한 돌연변이유발은 예를 들면, 오류 유발 PCR, 효모 또는 세균의 "돌연변이유발자" 균주, 또는 FnIII에 기초한 결합 분자의 전부 또는 일부의 초기 합성 동안 무작위 또는 정의된 핵산 변화의 도입을 이용함으로써 달성될 수 있다. 친화 성숙 및/또는 돌연변이유발을 수행하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제7,195,880호, 제6,951,725호, 제7,078,197호, 제7,022,479호, 제5,922,545호, 제5,830,721호, 제5,605,793호, 제5,830,650호, 제6,194,550호, 제6,699,658호, 제7,063,943호 및 제5,866,344호; 및 국제특허공보 제WO06023144호에 기재되어 있다.
이러한 친화 성숙은 항원 결합 스크리닝 분석의 엄격도가 항원에 대한 개선된 친화성을 나타내는 Tn3 스캐폴드를 선택하도록 증가될 것을 추가로 요구할 수 있다. 단백질-단백질 상호작용 분석의 엄격도를 증가시키는, 당업계에서 인식된 방법이 여기서 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 원하는 항원에 대한 Tn3 스캐폴드의 친화성을 감소시키기 위해 1종 이상의 분석 조건(예를 들면, 분석 완충제의 염 농도)을 변경한다. 또 다른 실시양태에서, Tn3 스캐폴드가 원하는 항원에 결합하는 데에 허용된 시간이 감소된다.
또 다른 실시양태에서, 경쟁 결합 단계가 단백질-단백질 상호작용 분석에 부가될 수 있다. 예를 들면, Tn3 스캐폴드가 먼저 원하는 고정된 항원에 결합되도록 허용될 수 있다. 그 다음, 항원에 대한 최저 친화성을 나타내는 Tn3 스캐폴드가 고정된 항원으로부터 용출되어 개선된 항원 결합 친화성을 나타내는 Tn3 스캐폴드가 선택될 수 있도록 고정된 항원과의 결합에 대해 경쟁하는 데에 기여하는 특정 농도의 비고정된 항원이 첨가된다. 분석 조건의 엄격도는 분석에 첨가되는 비고정된 항원의 농도를 증가시킴으로써 추가로 증가될 수 있다.
또한, 스크리닝 방법은 개선된 항원 결합을 갖는 1개 이상의 Tn3 스캐폴드를 풍부하게 하기 위한 다중 라운드의 선택을 요구할 수 있다. 한 실시양태에서, 선택의 각각의 라운드에서 추가 아미노산 돌연변이가 Tn3 스캐폴드 내로 도입된다. 또 다른 실시양태에서, 선택의 각각의 라운드에서, 항원에 대한 증가된 친화성을 나타내는 Tn3 스캐폴드가 선택되도록 원하는 항원과의 결합의 엄격도가 증가된다.
몇몇 실시양태에서, 친화 성숙은 Tn3의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프의 부분의 포화 돌연변이유발에 의해 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 포화 돌연변이유발을 쿤켈 돌연변이유발을 이용하여 수행한다. 다른 실시양태에서, 포화 돌연변이유발을 PCR을 이용하여 수행한다.
몇몇 실시양태에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 5개 초과의 라운드의 친화 성숙이 적용된다. 몇몇 실시양태에서, 포화 돌연변이유발은 1개의 루프에만 적용되는 반면, 몇몇 다른 실시양태에서, 1개 라운드의 친화 성숙 동안 1개의 루프 또는 루프의 부분만이 돌연변이된다. 몇몇 실시양태에서, 동일한 라운드의 친화 성숙 동안 1개 초과의 루프 또는 1개 이상의 루프의 부분이 돌연변이된다.
다른 실시양태에서, 동일한 라운드의 친화 성숙 동안 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프가 동시적으로 돌연변이된다.
Tn3 스캐폴드가 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 다량체 스캐폴드로 조립되는 경우 또는 이중특이적 Tn3 스캐폴드의 경우, 각각의 결합 특이성을 독립적으로 스크리닝할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 제1 표적, 예를 들면, TRAIL R2에 결합하는 개별 Tn3 결합 분자를 확인하기 위한 제1 스크리닝을 Tn3 스캐폴드의 제1 라이브러리를 사용하여 수행하고, 이때 1개 이상의 루프 내의 1개 이상의 아미노산이 변경된다. 몇몇 실시양태에서, 상이한 표적에 결합하거나 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 개별 Tn3 분자를 확인하기 위한 추가 스크리닝을 수행할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 루프를 파지 표시 라이브러리를 사용하여 무작위화시킨다. 몇몇 실시양태에서, Tn3 스캐폴드와 원하는 표적의 결합을 당업계에서 인식된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 스크리닝에서 확인된 Tn3 스캐폴드의 아미노산 서열을 당업계에서 인식된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단량체 친화 성숙된 스캐폴드는 표면 플라스몬 공명 또는 당업계에서 공지되어 있는 다른 분석에 의해 측정되었을 때 친화 성숙 전의 동일한 Tn3 스캐폴드에 비해 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 40배 이상, 60배 이상, 80배 이상 또는 100배 이상 증가된 TRAIL R2에 대한 친화성을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단량체 친화 성숙된 스캐폴드는 표면 플라스몬 공명 또는 당업계에서 공지되어 있는 다른 분석에 의해 측정되었을 때 5 μM 미만, 1 μM 미만, 500 μM 미만, 250 μM 미만, 100 μM 미만 또는 50 μM 미만의 해리 상수(Kd)를 나타낸다.
이들 친화 성숙 방법을 적용하여 바람직한 개선된 결합 성질, 예컨대, 증가된 친화성 또는 다른 바람직한 특성, 예컨대, 유리한 약동학적 성질, 높은 효능, 낮은 면역원성, 다른 유기체로부터의 TRAIL R2 수용체와의 증가된 또는 감소된 교차반응성 등을 나타내는 Tn3 스캐폴드를 개발할 수 있다.
직렬 반복체( repeat) 의 발생
직렬 구축물의 연결은 II형 제한효소 및 IIS형 제한효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당업계에서 공지된 제한효소를 사용하여 제한 부위에서 올리고뉴클레오티드를 라이게이션(ligation)시킴으로써 발생될 수 있다.
본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드는 본원에 기재된 바와 같이 C 말단 및/또는 N-말단에서 및/또는 도메인 사이에서 링커를 포함할 수 있다. 추가로, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 폴리펩티드 스캐폴드를 포함하는 본 발명의 스캐폴드는 하기 (i) 내지 (xiii)로부터 선택된 항체 부분을 포함하나 이들로 한정되지 않는 이량체화 도메인에 융합될 수 있거나 접합될 수 있다:
(i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편;
(ii) CH1 도메인의 C 말단에서 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편;
(iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편;
(iv) VH 및 CH1 도메인을 갖고 CH1 도메인의 C 말단에서 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편;
(v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편;
(vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편;
(vii) 단리된 CDR 영역;
(viii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편;
(ix) 단일쇄 항체 분자(예를 들면, 단일쇄 Fv; scFv);
(x) 동일한 폴리펩티드 쇄 내의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디(diabody)";
(xi) 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체";
(xii) 전장 항체; 및
(xiii) 힌지 영역의 전부 또는 일부 및/또는 CH1 영역을 추가로 포함할 수 있는, CH2-CH3을 포함하는 Fc 영역. 다양한 원자가, 친화성 및 공간적 배향 방식은 하기 실시예에 예시되어 있다.
스캐폴드 제조
본 발명의 스캐폴드의 재조합 발현은 상기 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 요구한다. 일단 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 스캐폴드의 제조를 위한 벡터는 당업계에서 잘 공지되어 있는 기법을 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 스캐폴드 코딩 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 스캐폴드 폴리펩티드 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 예를 들면, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전적 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 스캐폴드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.
발현 벡터를 통상적인 기법으로 숙주 세포로 전달한 후, 형질감염된 세포를 통상적인 기법으로 배양하여 본 발명의 스캐폴드를 제조한다. 따라서, 본 발명은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 적합한 숙주 세포는 미생물, 예컨대, 세균(예를 들면, 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis))을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 스캐폴드를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 제조된 후 정제될 수 있는 비히클을 의미할 뿐만 아니라 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열에 의해 형질전환되거나 형질감염된 경우 제자리에서 본 발명의 스캐폴드를 발현할 수 있는 세포도 의미한다. 이들은 스캐폴드 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된 미생물, 예컨대, 세균(예를 들면, 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스); 또는 포유동물 세포 시스템(예를 들면, COS, CHO, BHK, 293, NSO 및 3T3 세포)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 스캐폴드의 제조에 유용한 방법은 예를 들면, 국제특허공보 제WO2009/058379호에 개시되어 있다. 일단 본 발명의 스캐폴드가 재조합 발현에 의해 제조되면, 상기 스캐폴드는 당업계에서 공지되어 있는 임의의 단백질 정제 방법에 의해 정제될 수 있다.
미국 특허공보 제2010-0298541 A1호에 기재된 바와 같이, 연구실에서의 본 발명의 스캐폴드의 제조 규모를 확대하여 분석 규모 반응기 또는 제조 규모 반응기 내에서 스캐폴드를 제조할 수 있다.
분비된 스캐폴드의 규모 확대가능한 제조
본 발명의 Tn3 스캐폴드는 세포 내에서 제조될 수 있거나 분비된 형태로서 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 분비된 스캐폴드는 적절하게 폴딩되고 완전한 기능성을 나타낸다. 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 규모 확대가능한 공정에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 스캐폴드는 분석 규모 생체반응기(예를 들면, 5 ℓ, 10 ℓ, 15 ℓ, 30 ℓ 또는 50 ℓ 생체반응기를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 내에서 본 발명의 스캐폴드를 제조하도록 규모 확대될 수 있는, 연구실 내의 본 발명의 규모 확대가능한 공정에 의해 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, Tn3 스캐폴드는 제조 규모 생체반응기(예를 들면, 75 ℓ, 100 ℓ, 150 ℓ, 300 ℓ 또는 500 ℓ를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 내에서 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 제조하도록 규모 확대될 수 있는, 연구실 내의 본 발명의 규모 확대가능한 공정에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 규모 확대가능한 공정은 연구실 내에서 수행된 제조 공정에 비해 제조 효율을 거의 또는 전혀 감소시키지 않는다.
링커
다량체 스캐폴드 내의 Tn3 스캐폴드는 단백질 링커 및/또는 비단백질 링커에 의해 연결될 수 있고, 이때 각각의 링커는 2개 이상의 본 발명의 Tn3 스캐폴드에 융합되어 있다. 적합한 링커는 단백질 링커, 비단백질 링커 및 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 링커의 조합은 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드는 복수의 단량체 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 모든 링커가 동일하다. 다른 실시양태에서, 다량체 Tn3 스캐폴드는 복수의 단량체 Tn3 스캐폴드를 포함하고, 이때 1개 이상의 링커가 나머지 링커와 기능적으로 또는 구조적으로 상이하다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 표적과의 결합에 직접적으로 또는 간접적으로 참여함으로써 다량체 FnIII 스캐폴드의 활성에 스스로 기여할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 단백질 링커는 폴리펩티드이다. 링커 폴리펩티드는 2개 이상의 본 발명의 단량체 스캐폴드 또는 2개 이상의 본 발명의 다량체 스캐폴드가 원하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 상대적으로 정확한 입체구조를 취하는 방식으로 상기 2개 이상의 본 발명의 단량체 스캐폴드 또는 2개 이상의 본 발명의 다량체 스캐폴드를 연결하는 데에 적합한 길이를 가져야 한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 1개 내지 약 1,000개의 아미노산 잔기, 1개 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 1개 내지 25개의 아미노산 잔기, 1개 내지 20개의 아미노산 잔기, 1개 내지 15개의 아미노산 잔기, 1개 내지 10개의 아미노산 잔기, 1개 내지 5개의 아미노산 잔기 또는 1개 내지 3개의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명은 폴리펩티드 링커 서열을 코딩하는 핵산, 예컨대, DNA, RNA 또는 이들의 조합을 추가로 제공한다. 폴리펩티드 링커에 포함될 선택된 아미노산 잔기는 본 발명의 다량체 Tn3 스캐폴드의 활성 또는 기능을 유의하게 방해하지 않는 성질을 나타내어야 한다. 따라서, 폴리펩티드 링커는 본 발명의 다량체 스캐폴드의 활성 또는 기능과 불일치할 전하, 내부 폴딩을 방해할 전하, 또는 1개 이상의 Tn3 단량체 도메인 내의 아미노산 잔기와 함께 본 발명의 다량체 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합을 심각하게 방해할 결합 또는 다른 상호작용을 형성할 전하를 전체적으로 나타내지 않아야 한다.
폴리펩티드를 연결하여 신규 연결된 융합 폴리펩티드를 형성하기 위한 천연 펩티드 링커 및 인공 펩티드 링커의 사용은 문헌에서 잘 공지되어 있다. 따라서, 2개 이상의 본 발명의 스캐폴드를 융합시키는 링커는 천연 링커, 인공 링커 또는 이들의 조합이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 동일하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드에 존재하는 2개 이상의 펩티드 링커의 아미노산 서열은 상이하다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 입체구조적 유연성을 보유한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 (G-G-G-G-S)x (서열번호 210) 아미노산 서열을 포함하고, 이때 x는 양의 정수이다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 본질적으로 비구조화된 천연 또는 인공 폴리펩티드이다(예를 들면, 문헌(Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27:1186-1190, 2009) 및 문헌(Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35:D786-93, 2007) 참조).
펩티드 링커는 비폴리펩티드 모이어티에 대한 부착 기를 포함하는 아미노산 잔기가 도입되는 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기의 예는 시스테인 잔기(추후에 이 잔기에 비폴리펩티드 모이어티가 부착됨)일 수 있거나, 아미노산 서열은 생체내 N 글리코실화 부위를 포함할 수 있다(이로써, (생체 내에서) 당 모이어티를 펩티드 링커에 부착시킴).
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 다량체에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 동일하다. 대안적으로, 폴리펩티드 다량체에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 상이할 수 있다.
스캐폴드의 표지 또는 접합
본 발명의 스캐폴드를 비접합된 형태로 사용하거나 다양한 이종 모이어티들 중 1개 이상의 이종 모이어티에 접합된 상태로 사용하여 표적 검출, 또는 영상화 또는 치료를 촉진할 수 있다. 정제가 수행되는 경우, 본 발명의 스캐폴드를 정제 전 또는 후에 표지하거나 접합시킬 수 있다.
많은 이종 모이어티가 본 발명의 스캐폴드에 연결될 수 있는 적합한 작용기를 결여하고 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 이펙터 분자는 접합을 위한 반응성 기를 함유하는 링커를 통해 스캐폴드에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드에 접합된 이종 모이어티는 링커로서 작용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 모이어티는 절단가능한 또는 절단불가능한 링커를 통해 스캐폴드에 접합된다. 한 실시양태에서, 절단가능한 연결 분자는 산화환원 절단가능한 연결 분자이므로, 상기 연결 분자는 보다 낮은 산화환원 전위를 갖는 환경, 예컨대, 세포질, 및 자유 설프하이드릴 기를 갖는 분자를 고농도로 함유하는 다른 영역 내에서 절단될 수 있다. 산화환원 전위에서의 변화로 인해 절단될 수 있는 연결 분자의 예로는 이황화 결합을 함유하는 분자가 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 접합을 위한 반응성 기를 제공하도록 조작된다. 이러한 스캐폴드에서, N 말단 및/또는 C 말단도 접합을 위한 반응성 기를 제공하는 데에 기여할 수 있다. 다른 실시양태에서, N 말단은 1개의 모이어티(예컨대, PEG(그러나, 이로 한정되지 않음))에 접합될 수 있는 반면, C 말단은 또 다른 모이어티(예컨대, 바이오틴(그러나, 이로 한정되지 않음))에 접합되거나, 또는 그 반대의 경우도 가능하다.
용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제, 커플링 모이어티 또는 활성화 모이어티(예를 들면, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, N-하이드록시석신이미드 또는 말레이미드 모이어티)를 갖거나 갖지 않는 폴리에틸렌 글리콜 화합물 또는 이의 유도체를 의미한다. 용어 "PEG"는 분자량이 500 내지 150,000 Da인 폴리에틸렌 글리콜(이의 유사체, 예를 들면, 말단 OH 기가 메톡시 기로 치환되어 있는 유사체(mPEG로서 지칭됨)를 포함함)을 표시하기 위한 것이다.
본 발명의 스캐폴드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 의해 유도체화될 수 있다. PEG는 2개의 말단 하이드록실 기를 갖는 산화에틸렌 반복 유닛으로 구성된 선형 수용성 중합체이다. PEG는 전형적으로 약 500 내지 약 40,000 달톤의 범위 내에 있는 그의 분자량에 의해 분류된다. 특정 실시양태에서, 사용되는 PEG의 분자량은 5,000 내지 약 20,000 달톤이다. 본 발명의 스캐폴드에 커플링되는 PEG는 분지된 또는 비분지된 PEG일 수 있다. 예를 들면, 문헌(Monfardini, C. et al., 1995 Bioconjugate Chem 6:62-69)을 참조한다. PEG는 넥타 인코포레이티드(Nektar Inc.), 시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Co.) 및 다른 회사로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 이러한 PEG는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 석시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES) 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐(MePEG-IM)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
요약하건대, 사용되는 친수성 중합체, 예를 들면, PEG는 한 말단에서 비반응성 기, 예컨대, 메톡시 또는 에톡시 기에 의해 캡핑된다. 그 후, 상기 중합체는 다른 말단에서 적합한 활성화제, 예컨대, 시아누르산 할로겐화물(예를 들면, 시아누르산 염화물, 브롬화물 또는 불소화물), 카르보닐디이미다졸, 무수물 시약(예를 들면, 디할로 석신산 무수물, 예컨대, 디브로모석신산 무수물), 아실 아지드, p-디아조늄벤질 에테르, 3-(p-디아조늄페녹시)-2-하이드록시프로필에테르) 등과의 반응에 의해 활성화된다. 그 후, 활성화된 중합체는 전술된 바와 같이 폴리펩티드와 반응하여 중합체에 의해 유도체화된 폴리펩티드를 생성한다. 대안적으로, 상기 중합체와의 반응을 위해 본 발명의 스캐폴드 내의 작용기를 활성화시킬 수 있거나, 공지되어 있는 커플링 방법을 이용하여 2개의 상기 기를 조화된 커플링 반응에서 연결할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 이용되는 많은 다른 반응식을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 PEG로 유도체화할 수 있다는 것이 용이하게 인식될 것이다. PEG는 스캐폴드의 한 말단 또는 상기 스캐폴드 내에 존재하는 1개 이상의 작용기에서 본 발명의 스캐폴드에 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG는 N 말단 또는 C 말단에 커플링된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드, 이의 유사체 또는 유도체는 진단제 또는 검출가능한 물질에 접합될 수 있다. 이러한 스캐폴드는 임상 시험 절차의 부분으로서 질환의 발달 또는 진행을 모니터링하거나 예후하는 데, 예컨대, 특정 요법의 효능을 확인하는 데에 유용할 수 있다.
추가로, 본 발명은 치료 모이어티에 접합된 스캐폴드의 사용을 포괄한다. 스캐폴드는 치료 모이어티, 예컨대, 세포독소, 예를 들면, 세포정지제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예컨대, 알파 방출제에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 물질을 포함한다.
스캐폴드의 분석
항원에 대한 스캐폴드의 결합 친화성 및 다른 결합 성질은 예를 들면, 평형화 방법(예를 들면, 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA), 또는 반응속도 분석(예를 들면, 비아코어(BIACORE)? 분석), 및 다른 방법, 예컨대, 간접적 결합 분석, 경쟁 결합 분석, 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들면, 겔 여과)를 포함하는, 당업계에서 공지되어 있는 다양한 시험관내 분석 방법에 의해 측정될 수 있다. 이들 방법 및 다른 방법은 조사될 1개 이상의 성분 상의 표지를 사용할 수 있고/있거나, 발색 표지, 형광 표지, 발광 표지 또는 동위원소 표지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 검출 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화성 및 반응속도에 대한 상세한 설명은 문헌(Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999))에서 찾을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 특정 반응속도로 표적에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1x10-2 M, 1x10-3 M, 1x10-4 M, 1x10-5 M, 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 1x10-14 M 또는 1x10-15 M 미만의 해리상수 또는 Kd(koff/kon)를 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 비아코어? 분석 또는 당업계에서 공지되어 있는 다른 분석에 의해 측정되었을 때 500 μM, 100 μM, 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM 또는 100 pM 이하의 Kd를 나타낸다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드의 친화성은 비 kon/koff로서 계산되는, 1x102 M-1, 1x103 M-1, 1x104 M-1, 1x105 M-1, 1x106 M-1, 1x107 M-1, 1x108 M-1, 1x109 M-1, 1x1010 M-1, 1x1011 M-1, 1x1012 M-1, 1x1013 M-1, 1x1014 M-1, 1x1015 M-1 또는 5xl015 M-1 이상의 결합상수(Ka)의 관점에서 기재된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드가 표적 에피토프로부터 해리되는 속도는 Kd 또는 Ka의 값보다 더 유의할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 10-3 s-1 미만, 5x10-3 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 5x10-4 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5x10-5 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5x10-6 s-1 미만, 10-7 s-1 미만, 5x10-7 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5x10-8 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5x10-9 s-1 미만 또는 10-10 s-1 미만의 koff를 나타낸다. 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드가 표적 에피토프와 결합하는 속도는 Kd 또는 Ka의 값보다 더 유의할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 스캐폴드는 105 M-1s-1 이상, 5x105 M-1s-1 이상, 106 M-1s-1 이상, 5x106 M-1s-1 이상, 107 M-1s-1 이상, 5x107 M-1s-1 이상, 108 M-1s-1 이상 또는 109 M-1s-1 이상의 kon 속도로 표적에 결합한다.
본 발명의 스캐폴드는 면역분석 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수도 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드
TRAIL R2 단백질은 TNF 수용체 상과 유전자의 한 구성원에 의해 코딩되고 세포내 사멸 도메인을 함유한다. 몇몇 경우, 상기 단백질은 TNFRSF10B, CD262, DR5, KILLER, KILLER/DR5, TRAILR2, TRICK2, TRICK2A, TRICK2B, TRICKB 또는 ZTNFR9로도 공지되어 있을 수 있다. 이 수용체는 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(TNFSF 10/TRAIL/APO-2L)에 의해 활성화될 수 있고 아폽토시스 신호를 변환시킨다. 또한, TRAIL R2에 의해 유도된 아폽토시스는 캐스파제 및 세포내 어댑터 분자 FADD/MORT1을 수반한다(Walczak et al., EMBOJ, (1997), 16, 5386-97).
본 발명은 TRAIL R2에 특이적으로 결합하는 Tn3 스캐폴드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 인간 TRAIL R2에 특이적으로 결합한다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 마우스, 닭, 붉은털원숭이, 사이노몰구스, 래트 또는 토끼로부터의 TRAIL R2 상동체에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2의 노출된 에피토프에 결합한다. 이러한 실시양태는 세포, 및/또는 상기 수용체를 이소적으로 발현하도록 형질감염된 세포 상에서 내재적으로 발현된 TRAIL R2를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 단량체 TRAIL R2 상에 표시된 에피토프를 인식한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 동종이량체 형태의 TRAIL R2 상에서 표시된 에피토프를 인식한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 단량체 TRAIL R2에 결합하고 2개 이상의 TRAIL R2 분자의 이량체화 또는 올리고머화(예를 들면, 다량체 스캐폴드(그러나, 이로 한정되지 않음))를 촉진한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 TRAIL R2와 TRAIL 리간드의 상호작용을 감소시키거나 억제한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 TRAIL 리간드와 TRAIL R2의 상호작용을 모방한다. 추가 실시양태에서, 추가 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2에 의한 세포 신호전달을 작동시킨다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 Tn3 스캐폴드를 사용하여 TRAIL R2 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 TRAIL R2를 발현하는 세포를 TRAIL R2 특이적 스캐폴드와 접촉시키는 단계, 및 TRAIL 리간드와의 상호작용을 차단하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 TRAIL R2를 발현하는 세포를 TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드와 접촉시키는 단계, 및 TRAIL 리간드와 TRAIL R2의 상호작용을 모방하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드와 접촉시킴으로써 TRAIL R2를 작동시키는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세포 상에서 발현된 TRAIL R2의 단량체를 TRAIL R2 특이적 스캐폴드와 접촉시키고 이량체화 또는 올리고머화를 촉진함으로써 TRAIL R2를 이량체화하거나 올리고머화하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, TRAIL R2의 이량체화는 예를 들면, TRAIL R2 이량체를 모방하거나, TRAIL R2 이량체 형성을 안정화시키거나, TRAIL R2 단량체를 불안정화시키거나 세포 상에서 표시된 TRAIL R2 이량체만을 인식하는 다량체 Tn3 스캐폴드(그러나, 이로 한정되지 않음)의 사용을 통해 달성될 수 있다.
다른 실시양태에서, TRAIL R2의 이량체화 또는 올리고머화는 스캐폴드 이량체화제 또는 올리고머화제와 커플링된 단량체 Tn3 스캐폴드의 사용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 스캐폴드 이량체화제 또는 올리고머화제는 예를 들면, 항-스캐폴드 항체; 에피토프 태그에 대한 항체와 커플링된, 에피토프 태그를 갖는 스캐폴드의 사용; 또는 본원에 기재되어 있고 당업계에서 공지되어 있는 다양한 단백질 이량체화 또는 올리고머화 모티프의 도입을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 실시양태에서, TRAIL R2 이량체 또는 올리고머는 단량체 스캐폴드의 투여 후 스캐폴드 이량체화제 또는 올리고머화제의 투여에 의해 유도될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 당업계에서 공지되어 있는 관용적인 분석에 의해 측정된 세포 생존력을 감소시키는 TRAIL R2 특이적 스캐폴드의 투여를 포함한다. 추가 실시양태에서, 세포 생존력의 감소는 당업계에서 공지되어 있는 분석에 의해 측정된 아폽토시스의 활성화이다. 다른 실시양태에서, 세포 생존력의 감소는 당업계에서 인정된 방법에 의해 측정된 세포 분열의 감소이다. 몇몇 실시양태에서, 세포 생존력은 치료의 부재 하에서의 세포 생존력에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상까지 감소된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 결합 Tn3 스캐폴드는 TRAIL로서 공지되어 있는, TRAIL R2에 대한 리간드와 유사한 활성으로 TRAIL R2를 작동시킨다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 결합 Tn3 스캐폴드는 TRAIL R2를 충분히 활성화시켜 캐스파제 3, 캐스파제 8, 캐스파제 10 또는 FADD의 활성화를 포함하는 1개 이상의 세포내 신호전달 경로의 활성화를 일으킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 결합 Tn3 스캐폴드는 1종 이상의 암세포에서 아폽토시스를 활성화시킨다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 결합 Tn3 스캐폴드는 TRAIL에 비해 1종 이상의 세포에서 아폽토시스의 향상된 활성화를 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 결합 Tn3 스캐폴드는 TRAIL(리간드)이 결합하는 TRAIL R2 상의 에피토프와 동일한 TRAIL R2 상의 에피토프에 결합할 수 있거나 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 이러한 실시양태에서, TRAIL R2 결합 스캐폴드는 TRAIL R2와 TRAIL의 상호작용의 억제를 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상까지 차단할 수 있고, 이러한 차단은 가용성 TRAIL 리간드(예컨대, TRAIL 리간드의 114-281 단편)를 사용하는 시험관내 경쟁 분석, 결정학적 연구 또는 다른 공지된 생체내 또는 시험관내 연구에서 측정될 수 있다.
요법에서 Tn3 TRAIL R2 특이적 스캐폴드를 사용하는 방법
TRAIL R2는 아폽토시스 신호전달을 매개하는 것으로 공지되어 있다. 여러 종류의 정상 세포가 TRAIL R2를 발현하지만, 이 수용체를 통한 아폽토시스 신호전달은 발암유전자, 예컨대, Myc 또는 Ras에 의한 형질전환과 관련하여 사멸 수용체 매개 아폽토시스에 보다 더 민감하게 되는 종양 세포에 주로 국한되어 있는 듯하다(Wang et al., Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterov et al., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). TRAIL-R2는 종종 인간 암세포주 및 일차 종양에 의해 발현된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 스캐폴드는 치료가 필요한 대상체(즉, 암 환자)에게 투여된다. 이러한 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 스캐폴드를 포함하는 멸균 발열원 무함유 조성물이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 당업계에서 잘 공지되어 있는 다양한 시험관내 분석 및 생체내 분석, 예컨대, 아폽토시스 활성, 아넥신 V 결합의 캐스파제 활성화의 이용 및 종양 크기 또는 부피의 감소(그러나, 이들로 한정되지 않음)를 이용하여 치료의 효율을 측정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 스캐폴드는 암 또는 다른 TRAIL R2 관련 질환의 진단 및 검출에 유용하다. 이러한 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 스캐폴드는 검출제, 예컨대, 방사성동위원소, 형광 표지 또는 화학발광 표지(그러나, 이들로 한정되지 않음)에 연결되어 있다. 이러한 연결된 결합제는 대상체 또는 상기 대상체로부터 채취된 샘플에서 암 또는 TRAIL R2 관련 질환을 검출하거나 진단하는 방법에서 유용하다. 추가로, TRAIL R2 특이적 스캐폴드는 다른 TRAIL R2 관련 병리학적 상태, 예컨대, 사람을 포함하는 포유동물의 면역 관련 질환의 진단 및 치료에 유용하다.
특이적 TRAIL R2 결합 서열
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드는 TRAIL R2에 결합하는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 루프 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드는 1C12(서열번호 132), G3(서열번호 133), 1E11(서열번호 134), C4(서열번호 135), C11(서열번호 136), F4(서열번호 137) 및 G6(서열번호 138)으로부터 선택된 TRAIL R2 결합 단량체 스캐폴드 클론의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 루프 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드는 표 4에 나열된 루프 서열들로부터 선택된 1개 이상의 루프 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 단량체 스캐폴드는 표 4에 나열된 BC 루프 서열들로부터 선택된 1개 이상의 BC 루프 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 단량체 스캐폴드는 표 4에 나열된 DE 루프 서열들로부터 선택된 1개 이상의 DE 루프 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 단량체 스캐폴드는 표 4에 나열된 FG 루프 서열들로부터 선택된 1개 이상의 FG 루프 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드는 표 4에 나열된 BC 루프 서열들로부터 선택된 BC 루프 서열; 및 표 4에 나열된 DE 루프 서열들로부터 선택된 DE 루프 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 단량체 스캐폴드는 표 4에 나열된 BC 루프 서열들로부터 선택된 BC 루프 서열; 및 표 4에 나열된 FG 루프 서열들로부터 선택된 FG 루프 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 스캐폴드는 표 4에 나열된 DE 루프 서열들로부터 선택된 DE 루프 서열; 및 표 4에 나열된 FG 루프 서열들로부터 선택된 FG 루프 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드는 1개, 2개 또는 3개의 상이한 Tn3 클론으로부터의 루프 서열에 상응하는 루프 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 다량체 스캐폴드는 선형 다량체, 예를 들면, 이량체, 예컨대, 서열번호 139의 1E11 직렬체 2 스캐폴드, 사량체, 예컨대, 서열번호 140의 1E11 직렬체 4 스캐폴드 또는 서열번호 143의 G6 직렬체 4 스캐폴드, 육량체, 예컨대, 서열번호 141의 1E11 직렬체 6 스캐폴드, 서열번호 144의 G6 직렬체 6 스캐폴드 또는 서열번호 167의 F4mod12 직렬체 6, 또는 팔량체, 예컨대, 서열번호 142의 1E11 직렬체 8 스캐폴드, 서열번호 145의 G6 직렬체 8 스캐폴드 또는 서열번호 166의 F4mod12 직렬체 8 스캐폴드이다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 다량체 스캐폴드는 Fc 융합체, 예를 들면, 서열번호 149의 1C12 Fc 융합체, 서열번호 150의 G3 Fc 융합체, 서열번호 151의 1E11 Fc 융합체, 서열번호 152의 C4 Fc 융합체 또는 서열번호 153의 G6 Fc 융합체이다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 다량체 스캐폴드는 항체 유사 융합체, 예를 들면, 서열번호 154의 1C12 IgG1 중쇄 불변 영역 스캐폴드와 서열번호 155의 1C12 카파 경쇄 스캐폴드의 연결로부터 발생된 스캐폴드, 서열번호 156의 G3 IgG1 중쇄 스캐폴드와 서열번호 157의 G3 카파 경쇄 스캐폴드의 연결로부터 발생된 스캐폴드, 서열번호 158의 1E11 IgG1 중쇄 스캐폴드와 서열번호 159의 1E11 카파 경쇄 스캐폴드의 연결로부터 발생된 스캐폴드, 서열번호 160의 C4 IgG1 중쇄 스캐폴드와 서열번호 161의 C4 카파 경쇄 스캐폴드의 연결로부터 발생된 스캐폴드, 또는 서열번호 162의 G6 IgG1 중쇄 스캐폴드와 서열번호 163의 G6 카파 경쇄 스캐폴드의 연결로부터 발생된 스캐폴드이다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 다량체 스캐폴드는 Fc 융합체 포맷과 선형 포맷을 겸비한다(예를 들면, 서열번호 164의 1E11 직렬체 2 Fc 융합체, 또는 서열번호 165의 1E11 직렬체 4 Fc 융합체).
일부 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 다량체 스캐폴드 서열이 이 서열의 C 말단에서 링커 및/또는 히스티딘 태그를 함유하는 경우, 이 C 말단 링커 및/또는 히스티딘 태그는 제거될 수 있고, 따라서 상응하는 아미노산 서열은 C 말단 링커 및 His 태그 서열의 결실을 함유한다.
몇몇 실시양태에서, TRAIL R2 특이적 Tn3 다량체 스캐폴드는 PEG에 접합되어 있다. 특정 실시양태에서, F4mod12 직렬체 6(서열번호 167) 또는 F4mod12 직렬체 8(서열번호 166) 스캐폴드가 PEG에 접합되어 있다. 추가 실시양태에서, PEG는 상기 다량체 스캐폴드 분자의 N 말단 또는 C 말단에 접합되어 있다.
약학 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화된 본 발명의 스캐폴드들 또는 다량체 스캐폴드들 중 하나 또는 이들의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물(그러나, 이로 한정되지 않음)을 제공한다. 이러한 조성물은 예를 들면, 2개 이상의 상이한 본 발명의 스캐폴드들 중 하나 또는 이들의 조합(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 상보적 활성을 나타내는 스캐폴드의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 본 발명의 다량체 스캐폴드를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 조합 요법으로, 예컨대, 다른 약제와 조합되어 투여될 수도 있다. 예를 들면, 조합 요법은 1종 이상의 다른 요법과 조합된 본 발명의 스캐폴드를 포함할 수 있고, 이때 상기 다른 요법은 면역요법, 화학요법, 방사선 치료 또는 약물요법일 수 있다. 본 발명의 약학 화합물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
약학적 투약 및 투여
본 발명의 Tn3 스캐폴드를 포함하는 약학 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 스캐폴드를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합한다. 치료제에 대한 투여 섭생법의 선택은 물질의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 정도, 물질의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스 내의 표적 세포의 접근성을 포함하는 여러 요인에 의존한다. 일부 실시양태에서, 투여 섭생법은 부작용의 허용가능한 수준과 일치하는, 환자에게 전달된 치료제의 양을 최대화한다. 본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 상기 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 의학 분야에서 잘 공지되어 있는 다른 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인들에 의존할 것이다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 공지되어 있는 다양한 방법들 중 1종 이상의 방법을 이용함으로써 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 적절한 생체내 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다.
스캐폴드를 사용하는 방법
본 발명의 Tn3 스캐폴드는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들면, 이들 분자는 다양한 장애를 치료하거나, 예방하거나 진단하기 위해, 배양물 중의 세포, 예를 들면, 시험관내 또는 생체외 세포, 또는 대상체 내의 세포, 예를 들면, 생체내 세포에게 투여될 수 있다.
또한, 많은 세포 표면 수용체가 서브유닛의 가교결합의 결과로서 활성화시키거나 탈활성화시킨다. 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하여 세포 표면 수용체, 예컨대, TRAIL R2의 가교결합에 의한 표적 세포 내의 반응을 자극하거나 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 다수의 세포 표면 수용체와 항원의 상호작용을 차단할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하여 다수의 세포 표면 수용체와 항원의 상호작용을 강화시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 동일한 항원에 대한 특이성을 공유하거나 2종의 상이한 항원에 결합하는 결합 도메인을 함유하는 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하여 세포 표면 수용체의 동종이량체 또는 이종이량체를 가교결합시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하여 리간드 또는 리간드 유사체를 특정 세포 표면 수용체에 전달할 수 있다.
또한, 본 발명은 전통적인 항체에 의해 용이하게 달성되지 않는 에피토프의 표적화 방법을 제공한다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하여 인접 항원을 먼저 표적화시킬 수 있고, 결합하는 동안 또 다른 결합 도메인이 숨은 항원과 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하여 상이한 종류의 세포를 함께 회합시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 한 결합 도메인으로 표적 세포에 결합할 수 있고 또 다른 결합 도메인을 통해 또 다른 세포를 동원할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 세포는 암세포일 수 있고, 제2 세포는 면역 이펙터 세포, 예컨대, NK 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하여 2종의 상이한 세포들, 예컨대, 항원 제시 세포와 T 세포 사이의 상호작용을 강화시켜 가능하게는 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 암 또는 이의 증상을 호전시키거나, 치료하거나 예방하기 위해 상기 Tn3 스캐폴드를 사용하는 방법도 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 TRAIL 내성 세포 집단을 고갈시키기 위해 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 사용하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 몇몇 종류의 요법 내성 암을 치료하는 데에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 집단을 고갈시키기 위해 Tn3 스캐폴드를 사용하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기 종류의 세포의 고갈에 유용하다: 호산구, 호염기구, 호중구, T 세포, B 세포, 비만 세포, 단핵구 및 종양 세포. 또한, 본 발명은 사이토킨을 불활성화시키거나, 억제하거나 고갈시키기 위해 스캐폴드를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 Tn3 스캐폴드 단백질을 진단 시약으로서 사용하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 Tn3 스캐폴드와 TRAIL R2 수용체의 결합은 TRAIL R2를 발현하는 세포의 검출을 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, TRAIL에 대해서는 내성을 나타내지만 TRAIL 모방체에 대해서는 민감성을 나타내는 세포 집단과, TRAIL에 대해 내성을 나타내고 TRAIL 모방체에 대해서도 내성을 나타내는 세포 집단을 구별하는 본 발명의 Tn3 스캐폴드의 능력(예를 들면, 실시예 19 참조)이 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 상이한 항원이 효율적으로 동시에 포획될 필요가 있는 경우 키트 또는 시약에서 유용할 수 있다. 또한, 아폽토시스에서의 이상에 의해 야기된 암도 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있을 것으로 예측된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 암을 예방하거나, 관리하거나, 치료하거나 호전시키는 방법을 제공한다. TRAIL R2 특이적 다량체 Tn3 스캐폴드는 암, 예를 들면, 폐암, 비호지킨 림프종, 난소암, 결장암, 대장암, 췌장암 및 다발성 골수종의 치료를 위해 사용될 수 있다. TRAIL R2 특이적 다량체 Tn3을 사용한 암의 치료는 부가적인 요법, 예컨대, 면역요법, 생물학적 요법, 화학요법, 방사선요법 또는 소분자 약물요법을 추가로 포함할 수 있다.
암을 치료하는 방법은 예방적 또는 치료적 유효량의 1개 이상의 본 발명의 Tn3 스캐폴드를 수술과 함께, 단독으로, 또는 표준 또는 실험적 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법/면역요법 및/또는 방사선요법의 투여와 함께 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 실시양태에 따라, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환, 또는 이의 1종 이상의 증상의 예방, 관리, 치료 또는 호전을 위해 사용되는 본 발명의 Tn3 스캐폴드는 모이어티(예를 들면, 치료제 또는 약물)에 접합되거나 융합될 수 있거나, 접합되거나 융합되지 않을 수 있다.
등가물
당업자는 과도하지 않은 관용적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 의해 포괄된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 본원에 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 기재되어 있는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 도입된다. 본원은 2010년 4월 13일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/323,708호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 도입됨)에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 추가로, 2008년 10월 10일자로 출원되어 국제특허공보 제WO2009/058379 A2호로서 공개된 PCT 특허출원 제PCT/US2008/012398호는 모든 목적을 위해 온전히 그대로 본원에 참고로 도입된다.
Figure 112012091800803-pct00001
Figure 112012091800803-pct00002
Figure 112012091800803-pct00003
Figure 112016035152210-pct00047
Figure 112016035152210-pct00048
실시예
본 발명은 지금부터 하기 실시예를 참조하면서 기재된다. 이들 실시예는 설명을 위한 것이고, 본 발명은 결코 이들 실시예로 한정되는 것으로 간주되어서는 안 되고, 본원에서 제공된 교시의 결과로서 자명해질 임의의 모든 변경을 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1
다양한 다가 Tn3 포맷의 디자인
Tn3 스캐폴드의 다가 포맷을 디자인하였다. 그들 자신에 융합되거나, 올리고머화될 수 있는 다른 단백질 모티프에 융합되거나, 그들 자신 및 올리고머화될 수 있는 다른 단백질 모티프에 융합된 1개 이상의 Tn3 모듈을 함유하는 다가 포맷이 도 1에 제시되어 있다. 각각의 경우, 생성된 분자 물질은 2개 이상의 Tn3 모듈을 함유한다. Tn3 모듈을 서로 연결하거나 다른 단백질 모티프에 연결하는 폴리펩티드 링커는 구조화될 수 있거나 비구조화될 수 있고 기능을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 다가 Tn3 스캐폴드 단백질의 3가지 예시적인 부류가 구체적으로 제공된다: (i) 폴리펩티드 링커를 통해 서로 융합된 Tn3 모듈을 함유하는 선형(L) 다가 단백질; (ii) 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 항체 단편에 융합된 1개 이상의 선형으로 융합된 Tn3 모듈을 함유하는 항체 유사(Ig) 다가 단백질; 및 (iii) 항체 Fc 영역에 융합된 1개 이상의 선형으로 융합된 Tn3 모듈을 함유하는 Fc 함유 다가 단백질(도 1).
실시예 2
다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 함유 단백질의 발현 및 정제
인간 TRAIL R2에 대한 결합 특이성을 나타내는 일련의 8개 다가 Tn3 모듈 함유 스캐폴드 단백질("Tn3 단백질" 또는 "Tn3 스캐폴드"로도 지칭됨)을 제조하였다. 실시예 1에 기재된 3가지 다가 포맷 각각에 대한 예시적인 단백질을 제조하였고, 이들 단백질 모두가 2개 이상의 TRAIL R2 결합 Tn3 모듈 A1을 제공하였다(클론 1E11, G6 또는 1C12). 여러 TRAIL R2 특이적 다가 Tn3 단백질에 대하여, TRAIL R2에 결합하지 않고 성분 Tn3 모듈의 서열 및 결합 특이성 면에서만 상이한 상응하는 대조군 Tn3 단백질(클론 D1, 시나기스(Synagis)? 항체에 특이적인 Tn3 도메인)도 발생시켰다. Tn3 클론 D1은 1E11 클론의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프가 각각 서열번호 99, 서열번호 38 및 서열번호 107에 상응하는 서열을 갖는 대안적 루프로 치환되어 있는 Tn3 단백질이다(표 4 참조). 발현된 다가 Tn3 단백질 구축물의 서열 확인 번호는 표 2에 제시되어 있고, 모든 가능한 구축물이 표 3 및 도 2에 개략적으로 나타나 있다. 클론에 대한 루프 서열은 표 4에 제공되어 있다.
발현된 Tn3 함유 단백질의 명칭, 포맷, 원자가 및 특이성
명칭(클론) 포맷 유형 서열번호 Tn3 모듈의 수 특이성
A1(1E11) 단량체 134 1 TRAIL R2
A2(1E11) L 139 2 TRAIL R2
A3(1E11) L 140 4 TRAIL R2
A4(1E11) L 141 6 TRAIL R2
A5(1E11) L 142 8 TRAIL R2
A5(G6) L 145 8 TRAIL R2
A6(1E11) Fc 151 2 TRAIL R2
A7(1E11) Fc 164 4 TRAIL R2
A8(1E11) Fc 165 8 TRAIL R2
A9(1C12) Ig 154(HC), 154(LC) 4 TRAIL R2
A9(1E11) Ig 158(HC), 159(LC) 4 TRAIL R2
B1(D1) 단량체 180 1 A1의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B2(D1) L 발현되지 않음 2 A2의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B3(D1) L 146 4 A3의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B4(D1) L 147 6 A4의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B5(D1) L 148 8 A5의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B6(D1) Fc 181 2 A6의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B7(D1) Fc 발현되지 않음 4 A7의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B8(D1) Fc 발현되지 않음 8 A8의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B9(D1) Ig 182(HC), 183(LC) 4 A9의 비-TRAIL R2 결합 대조군
L = 선형 Tn3 융합체, Fc = Fc-Tn3 융합체, Ig = 항체 유사 Tn3 융합체
Tn3 스캐폴드 구축물의 개략적인 표시
구축물 성분


Tn3 모듈(Tn3)		 IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT (서열번호 215)
XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, n은 2 내지 26이고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타낸다.
Gly-Ser 링커 모듈, (G4S)n (이때, n=1-7) (서열번호 231) GGGGS (서열번호 210)
n이 1인 (G4S)n 모듈이 상기 제시되어 있다.
폴리-히스티딘 태그 (H8) (서열번호 211) HHHHHHHH (서열번호 211)
하기 상세히 기재된 구축물의 임의적 성분 - 정제에 유용하다.
명칭 구축물 개요
A1 또는 B1 A(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 232)
A2 또는 B2 S(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTLGH8 (서열번호 233)
A3 또는 B3 S(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTLGH8 (서열번호 234)

A4 또는 B4 		S(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTGSAMAS(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTLGH8 (서열번호 235)

A5 또는 B5 		S(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTGSAMAS(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTLGH8 (서열번호 236)

A6 또는 B6 		(Tn3)GAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 237)

A7 또는B7		 AMAS(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTGAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 238)

A8 또는 B8 		AMAS(G4S)1A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)3A(Tn3)(G4S)2GTGAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 239)


A9 또는 B9 중쇄 불변 영역 융합체
 SQ(Tn3)GGGTPTSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 240)
A9 또는 B9 경쇄 불변 영역 융합체 SQ(Tn3)GGGTPTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 241)
M13 또는 79 A(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 242)
C1 A(Tn3)A(G4S)1RLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 243)
C2 A(Tn3)(G4S)3RLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 244)
C3 A(Tn3)(G4S)5RLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 245)
C4 A(Tn3)(G4S)7RLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 246)
C5 A(Tn3)TRLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 247)
C6 A(Tn3)(G4S)1RLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 248)
C7 A(Tn3)(G4S)2RLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 249)
C8 A(Tn3)(G4S)3RLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH8 (서열번호 250)
이들 연구에서 사용된 Tn3 클론의 루프 서열
클론 AB 루프
(서열번호) 		BC 루프
(서열번호) 		CD 루프
(서열번호) 		DE 루프
(S서열번호) 		EF 루프
(서열번호) 		FG 루프
(서열번호)
1E11† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGAKSNPA
(번호 106)
D1 KDVTDTT
(번호 35)		 SPGERIWMFTG
(번호 99)		 KDVPGDR
(번호 37)		 TEDENQ
(번호 38)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 PNYERISNPA
(번호 107)
G6† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGMRSKPA
(번호 108)
1C12† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPEKWDGSIYG
(번호 98)		 KDVPGDR
(번호 37)		 NSRHTA
(번호 103)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FTPYGAKSNPA
(번호 109)
M13 KDVTDTT
(번호 35)		 HDAFGYDFG
(번호 100)		 KDVPGDR
(번호 37)		 PDHFHN
(번호 104)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 ANDHGFDSNPA
(번호 110)
79 KDVTDTT
(번호 35)		 IPPHNADSSIIG
(번호 101)		 KDVPGDR
(번호 37)		 YDVAFD
(번호 105)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 DTFYGFDSNPA
(번호 111)
G3† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPEKWDGPPLW
(번호 168)		 KDVPGDR
(번호 37)		 NSRHTA
(번호 103)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FTPYGAKSNPA
(번호 109)
C4† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYNKRNVPA
(번호 169)
F4† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGLKSRPA
(번호 170)
F4mod1† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGLKSRPA
(번호 170)
F4mod12 KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHNQ
(번호 179)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGLKSRPA
(번호 170)
†서열 CELAYGI(서열번호 131)을 갖는 C 베타 가닥을 포함하는 클론, 모든 다른 클론들은 서열 CELTYGI(서열번호 45)을 갖는 C 베타 가닥을 포함한다.
발현 구축물의 제조: 사용된 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(미국 매사추세츠주 입스위치 소재)로부터 구입되었고, DNA 정제 키트는 퀴아젠(Qiagen)(미국 매릴랜드주 저만타운 소재)으로부터 구입되었고, DNA 프라이머는 아이디티(IDT)(미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 구입되었다. 2개 이상의 선형으로 융합된 Tn3 모듈을 코딩하는 발현 구축물의 제조는 다음과 같았다. TRAIL R2 특이적 Tn3 모듈을 코딩하는 DNA(예를 들면, 1E11; 서열번호 134; G6, 서열번호 138 등)를 "Tn3 gly4ser1 모듈 정방향" 프라이머(서열번호 112) 및 "Tn3 gly4ser2 모듈 역방향" 프라이머(서열번호 113)(표 5)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
PCR 생성물의 정화 후, 증폭된 DNA를 2개로 나누고, 절반을 BpmI으로 분해하고, 나머지 절반을 AcuI으로 분해하였다. 분해된 샘플을 PCR 정화 키트를 사용하여 정제하고 T4 DNA 리가제(ligase)로 라이게이션시켜 2개의 Tn3 모듈을 코딩하는 DNA 생성물(A2)을 제조하였다. 이 물질을 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고 다시 2개로 분할하였다. NcoI 및 KpnI으로 분해한 후, NcoI/KpnI에 의해 분해된 pSec-oppA(L25M)(국제특허공보 제WO2009/058379 A2호의 실시예 18에 기재됨) 내로 라이게이션시켜 단백질 A2에 대한 세균 발현 구축물을 생성하였다. 비분해된 생성물을 pCR 2.1-TOPO 벡터(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 내로 라이게이션시켜 고차 융합체의 발생을 위한 유전 물질을 제공하였다. 4개의 Tn3 모듈(A3)을 코딩하는 DNA 단편을 제조하기 위해, TOPO 클로닝된 A2 DNA를 "모듈 amp 정방향" 프라이머(서열번호 114) 및 "모듈 amp 역방향" 프라이머(서열번호 115)(표 5)를 사용하여 PCR로 증폭시키고, 정제하고, AcuI 또는 BpmI를 사용한 분해를 위해 2개로 분할하였다. A3 발현 구축물을 제조하는 방법의 나머지 절차는 A2 구축물의 제조를 위해 이용된 절차와 동일하였고, 이때 A3을 코딩하는 DNA는 A2 구축 블록으로부터 조립되었다. 다시, 조립된 A3 DNA를 pCR 2.1-TOPO 내로 동시에 클로닝하여 고차 융합체의 발생을 위한 유전 물질을 제공하였다.
A4 세균 발현 구축물 및 A5 세균 발현 구축물의 제조를 위해, 어댑터(adapter) 모듈을 A3 발현 구축물 내의 다중 Tn3 코딩 서열의 3' 말단에 도입하였다. 이를 수행하기 위해, A3 발현 벡터를 먼저 KpnI 및 EcoRI으로 분해하고, 절단된 단편을 "pSec 내의 삽입체 BamHI 정방향" 올리고뉴클레오티드(서열번호 116) 및 "pSec 내의 삽입체 BamHI 역방향" 올리고뉴클레오티드(서열번호 117)(표 5)를 함유하는 이중 카세트로 치환시켰다. 상응하는 pCR 2.1 TOPO 구축물로부터의 A2 서열 및 A3 서열의 PCR 증폭을 "모듈 삽입체 BamHI 정방향" 프라이머(서열번호 118) 및 "모듈 amp 역방향" 프라이머(서열번호 115)(표 5)를 사용하여 수행하였다. 증폭된 생성물을 BamHI/KpnI으로 이중 분해하고, 유사하게 분해된 A3 발현 구축물 내로 클로닝하였다.
단백질 A6 내지 A9를 국제특허공보 제WO2009/058379 A2호의 실시예 16에 기재된 바와 같이 293F 세포의 일시적 형질감염으로 발현시켰다. 요약하건대, Tn3 모듈(또는 모듈들)을 세균 발현 구축물로부터 PCR로 증폭시키고 Fc 융합체 또는 항체 단백질의 발현을 위해 Fc 영역, 카파 경쇄 불변 영역 및/또는 CH1-힌지-CH2-CH3 중쇄 불변 영역을 코딩하는 하우스 벡터 내로 상기 모듈을 클로닝하여 발현 벡터를 발생시켰다. 단백질 A9의 경우, Tn3 모듈은 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 내의 항체 가변 영역을 치환시킨다. 직렬 구축물의 Fc 융합체를 제조하기 위해 상용가능한 NheI 및 KasI 부위를 부가하는 프라이머는 표 5에 제시되어 있다.
다가 Tn3 단백질의 구축에서 사용되는 프라이머 서열
서열 명칭 서열 서열번호
Tn3 gly4ser1 모듈
정방향		 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGAGTGCGGCCATGGCCAGCGGGGGCGGAGGGAGTGCCATTGAAGTGAAAGATGTGACCGATACC 112
Tn3 gly4ser2 모듈
역방향		 CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCTACGCAGGTACCGCTACCGCCACCTCCGCTCCCACCGCCACCGGTGGTAAAGGTTTC 113
모듈 amp 정방향 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGAGTGCGG 114
모듈 amp 역방향 CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCTACGCAGG 115
pSec 내의 모듈 삽입체 BamHI 정방향 GGGATCCGCTACGGGCCACTCGATCGAGGTCCGTGCTGATCGAGCGATCGGTACCCTGGGCCATCATCATCATCATCACCACCACTGAG 116
pSec 내의 모듈 삽입체 BamHI 역방향 AATTCTCAGTGGTGGTGATGATGATGATGATGGCCCAGGGTACCGATCGCTCGATCAGCACGGACCTCGATCGAGTGGCCCGTAGCGGATCCCGTAC 117
모듈 삽입체 BamHI 정방향 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGGGATCCGCCATGGCCAGC 118
모듈 삽입체 NheI 정방향 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGCTAGCTGCCATGGCCAGC 119
모듈 삽입체 KasI 역방향 CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCGGCGCCGGTACC 120
단백질의 발현 및 정제: 1가 또는 선형 Tn3 단백질을 BL21(DE3) 이. 콜라이(이엠디(EMD)/노바겐(Novagen), 미국 뉴저지주 깁스타운 소재) 내에서 발현시키고, His 태그 부착된 단백질을 Ni NTA 수퍼플로우(Superflow) 수지(퀴아젠)를 사용하여 배양 배지로부터 정제하였다. 놀랍게도, 분자량의 큰 차이에도 불구하고, 모든 이들 구축물이 이. 콜라이 내에서 고수준으로 배지에서 발현되었고 배지 내로 효율적으로 분비되었다(표 6 및 도 3).
Fc 융합 단백질 및 항체 유사 단백질(A6 내지 A9)을 발현시키기 위해, 293F 세포를 적절한 발현 구축물로 일시적으로 형질감염시켰다. 상청액의 회수를 6일째 날 및 10일째 날에 수행하였고, 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
모든 정제된 단백질을, 환원제를 사용하지 않으면서 MES 완충제 중의 누페이지 노벡스(NuPage Novex) 4 내지 12% 비스 트리스 겔 상에서 SDS-PAGE로 분석하고, 심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue SafeStain)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 가시화하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제된 단백질을 분석하였고, 필요한 경우, 응집된 물질을 수퍼덱스(Superdex) 75 10/300GL 또는 수퍼덱스 200 10/300GL 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서 총 단백질의 10% 미만의 최종 수준까지 제거하였다. 무스탕(Mustang) E 막(팔 코포레이션(Pall Corporation), 미국 뉴욕주 포트 워싱톤 소재)을 갖는 아크로디스크(Acrodisc) 유닛을 제조자에 의해 지시된 바와 같이 사용하여 세균에 의해 발현된 단백질 제제로부터 내독소를 제거하였다.
대표적인 다가 Tn3 단백질 포맷의 정제 후 수율
단백질(클론) 수율( mg /ℓ)
A1(1E11) 400
A2(1E11) 300
A3(1E11) 135
A4(1E11) 90
A5(1E11) 40
실시예 3
1가 Tn3 단백질 및 다가 Tn3 단백질에 대한 TRAIL R2 결합 친화성
일련의 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질에 대하여 결합 친화성에 대한 Tn3 원자가의 효과를 측정하기 위해, 경쟁 ELISA 실험을 수행하였다. 96 웰 넌크 맥시소르프(NUNC MaxiSorp) 플레이트(써모 피셔(Thermo Fisher), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)를 4℃에서 2 ㎍/㎖의 농도로 PBS 중의 A9(1C12)(서열번호 154 + 서열번호 145)(항체 유사 포맷의 TRAIL R2 특이적 스캐폴드)로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 0.1% 트윈 20 + 10 ㎎/㎖ BSA로 차단하였다. A1(1E11 단량체) 및 선형 포맷 A2(1E11 2가) 또는 A3(1E11 4가) 다량체 스캐폴드의 희석물을 실온에서 상기 코팅된 플레이트 상에서 PBS 0.1% 트윈 20 + 1 ㎎/㎖ BSA 중의 0.75 nM 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc와 함께 2시간 동안 항온처리하고 세척하였다. 결합된 바이오티닐화된 TRAIL R2 Fc를 스트렙타비딘 HRP 및 TMB로 검출하고, 산으로 중화시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 데이터는 도 4에 제시되어 있다. 결합 친화성(IC50)은 표 7에 제시되어 있고 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc의 최대 결합을 50%까지 감소시키는 데에 요구되는 경쟁 단백질의 농도로서 계산되었다.
A2 및 A3에 대한 IC50 값은 단량체 A1에 대한 IC50 값보다 30배 이상 더 낮았고 이 분석의 한계 수준이다(즉, 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc의 농도와 거의 동등함). 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc와 고정된 TRAIL R2 특이적 Tn3의 결합은 TRAIL R2 결합 구축물에 의해 제거되었다.
단량체 A1 단백질에 비해 상대적으로, 2가 A2 단백질 및 A3 단백질, 및 4가 A2 단백질 및 A3 단백질은 30 내지 40배 더 높은 친화성으로 TRAIL R2-Fc에 결합하였는데, 이것은 다수의 Tn3 모듈이 그들의 결합 활성을 보유하고 친화력 효과를 통해 보다 높은 친화성에 기여한다는 표시이다. 1가 Tn3 단백질과 2가 또는 4가 Tn3 단백질 사이의 친화성의 실제 차이는 A2 및 A3에 대한 IC50 값이 본 분석에서 사용된 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc의 농도(0.75 nM)와 거의 동등하였다는 점을 고려할 때 30 내지 40배를 초과할 수 있다.
TRAIL R2-Fc와 고정된 TRAIL R2 결합 A9(1C12) Tn3 단백질의 결합의 억제에 대한 IC50 값
클론 원자가 IC50(nM)
A1(1E11) 1 16
A2(1E11) 2 0.5
A3(1E11) 4 0.4
실시예 4
세포 결합의 확인을 위한 유세포분류
유세포분류를 이용하여 다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질과 H2122 세포의 세포 표면 상에서 발현된 내인성 TRAIL R2의 결합 특이성을 확인하였다. 아큐타제(Accutase)(이노베이티브 셀 테크놀로지스(Innovative Cell Technologies), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 사용하여 부착된 H2122 세포(비소세포폐암 선암종 세포주)를 조직 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 세포를 완전 배지(10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지)로 세정하고 약 2x106개 세포/㎖의 밀도로 PBS/2% FBS에 재현탁시켰다. Tn3 단백질 A9(1E11)(서열번호 158 + 서열번호 159)(4가 항체 유사 포맷의 다량체 스캐폴드) 또는 포맷 일치된 대조군 Tn3 단백질 B9(클론 D1)를 PBS/2% FBS 중에서 40 nM 농도로 제조하였다.
세포를 웰당 75 ㎕씩 96 웰 U 바닥 플레이트 상에 플레이팅하고, 단백질 샘플을 웰당 25 ㎕씩 (10 nM의 최종 농도까지) 첨가하였다. 상기 플레이트를 4℃에서 약 1시간 동안 항온처리한 후 PBS/2% FBS로 3회 세척하였다. 항-인간 IgG 알렉사 플루오르 488에 접합된 이차 항체를 첨가하고(웰당 100 ㎕), 상기 플레이트를 4℃에서 약 30분 동안 항온처리하고 전술된 바와 같이 세척하였다. 세포를 100 ㎕의 PBS/2% FBS에 재현탁시키고, BD LSR II 세포분류기(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 이용하여 유세포분류 분석을 수행하였다. TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질과 함께 항온처리된 경우 대조군에 비해 상대적인 형광 표지된 H2122 세포의 변동(증가)은 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질이 세포내 TRAIL R2에 결합할 수 있었다는 것을 확인시켜주었다(도 5).
실시예 5
TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질에 의한 H2122 세포의 아폽토시스에 대한 원자가 및 포맷의 효과
아폽토시스성 세포 사멸은 세포 표면 TRAIL R2의 교차결합에 의해 암세포주에서 유도될 수 있다. 이 효과는 생존 세포의 수를 측정하는 세포 분석에서 측정될 수 있다. 이를 위해, 75 ㎕의 완전 배지(10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지) 중의 폐암종 세포주 H2122 세포를 10,000개 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트 내에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 배지를 TRAIL R2 특이적(클론 1E11) Tn3 단백질 또는 음성 대조군(클론 D1) Tn3 단백질의 연속 희석물이 함유된 25 ㎕의 추가 배지로 보충하였다. 모든 처리를 이중 웰에서 수행하였다. 상업적으로 입수가능한 TRAIL 리간드(케미콘(Chemicon)/밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 TRAIL 수용체에 의해 유도된 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 72시간 후, 배양물 중의 생존 세포의 수의 척도인 ATP 수준을 분석하기 위해 프로메가(Promega)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 키트를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 분석 발광을 엔비전(Envision) 플레이트 판독기(퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재) 상에서 측정하였다. 처리된 세포에 대한 발광 값을 비처리된 생존 세포에 대한 평균 발광으로 나눔으로써 세포 생존력의 억제를 측정하였다. 억제 대 화합물 농도의 투여량 반응 곡선을 작도하고, 세포 사멸 효능(EC50)을 세포 생존력의 50%를 억제하는 데에 요구되는 단백질의 농도로서 측정하였다.
다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질의 전구아폽토시스(proapoptotic) 활성에 대한 원자가의 효과를 시험하기 위해, H2122 세포를 1가 Tn3 단백질 A1(클론 1E11) 및 일련의 선형으로 융합된 (2개, 4개, 6개 또는 8개의 Tn3 모듈을 함유하는) Tn3 단백질 A2 내지 A5(각각 클론 1E11)로 처리하였다. 1가 Tn3 단백질 및 2가 Tn3 단백질은 사멸 활성을 전혀 보이지 않거나 무시할만한 수준의 사멸 활성을 보이는 반면, 4개, 6개 또는 8개의 Tn3 모듈을 함유하는 단백질은 H2122 세포 생존력을 강력하게 억제하였고, 이때 효능은 원자가의 함수로서 증가하였다(도 6a; 표 8). 단백질 A3(4가)은 TRAIL, 즉 천연 TRAIL R2 리간드와 유사한 효능을 보였으나, 단백질 A4(6가) 및 A5(8가)는 1 내지 2 로그 더 강력하였다. 주어진 분자 포맷의 경우 세포 사멸은 원자가가 높아짐에 따라 상기 분석이 더 이상 식별할 수 없는 수준까지 개선된다는 것이 이 분석으로부터 명확하다.
다가 구축물에 의한 H2122의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A3(1E11) 0.013 91
A4(1E11) 0.0009 97
A5(1E11) 0.0006 97
인간 TRAIL 0.027 98
세포 생존력의 억제가 TRAIL R2 결합에 의존한다는 것을 입증하기 위해, 100 pM의 단백질 5(클론 G6)(즉, 167xEC50)를 가용성 TRAIL R2-Fc 단백질의 존재 하에서 H2122 세포와 함께 항온처리하였다. 가용성 TRAIL R2-Fc에 의한 세포 사멸의 투여량 의존성 억제는 세포 사멸이 세포 표면 TRAIL R2에 결합하는 단백질 A5에 의존한다는 것을 암시한다(도 6b). 유사한 결과가 클론 1E11 루프를 포함하는 단백질 A5를 사용한 경우 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
결합 모듈의 수 이외에, 다가 Tn3 단백질의 활성은 개별 결합 유닛을 제시하는 데에 사용되는 분자 포맷에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 활성에 대한 분자 포맷의 효과를 시험하기 위해, H2122 세포를 동일한 수의 Tn3 결합 모듈을 제시하는 상이한 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질로 처리하였다. H2122 세포의 사멸을 유도하는 4가 단백질 A3, A7 및 A9(각각 클론 1E11)의 능력을 세포 생존력 분석에서 시험하였고, 한 쌍의 8가 Tn3 단백질 A5 및 A8(각각 클론 1E11)도 마찬가지로 시험하였다. 불활성 1가 단백질 및 2가 단백질을 음성 대조군으로서 포함시켰고, TRAIL을 양성 대조군으로서 포함시켰다(도 7; 표 9 및 표 10). 도 7a에서, 4의 원자가를 갖는 시험된 3개의 구축물의 경우, A3(선형 포맷) 및 A7(Fc 융합체 포맷)은 그들의 세포 사멸 활성에 있어서 유사하였고 H2122 세포 사멸에 있어서 A9(항체 유사 융합체 포맷)보다 더 강력하였다. 이것은 Tn3 모듈의 공간적 배향이 생체활성에 대한 유의한 효과를 나타낼 수 있고, 이때 A3이 H2122 세포 생존력의 억제에 있어서 A9 단백질보다 대략 150배 더 강력하다는 것을 보여준다(표 9). 도 7b는 8가 TRAIL R2 결합 Tn3 단백질의 두 포맷인 A5(선형) 및 A8(Fc 융합체)이 H2122 세포 생존력의 억제에 있어서 유사한 효능을 나타낸다는 것을 보여준다. 이들 구축물에 대한 EC50 데이터는 표 9에 제시되어 있다. 친화성, 원자가 및 공간적 배향을 미세하게 조정하는 능력은 원하는 치료 결과를 정확히 조작하는 능력 면에서 큰 유연성을 부여한다.
4의 원자가를 갖는 다가 구축물에 의한 H2122의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A9(1E11) 1.98 80
A7(1E11) 0.02 88
A3(1E11) 0.013 91
인간 TRAIL 0.027 98
8의 원자가를 갖는 다가 구축물에 의한 H2122의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A5(1E11) 0.0006 97
A8(1E11) 0.0002 98
인간 TRAIL 0.027 98
실시예 6
세포주 콜로205 및 주르카트(Jurkat)에서의 투여량 의존성 세포 사멸
다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질이 H2122 이외의 암세포주를 사멸시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해, 다른 TRAIL R2 발현 세포주도 시험하였다. 대장 선암종 세포주 콜로205(도 8a) 및 주르카트 T 세포 백혈병 세포주(도 8b)를 단백질 A3(4가, 선형 포맷)(서열번호 143) 및 A5(8가, 선형 포맷)(서열번호 145)(각각 클론 G6)에 의해 사멸되는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 각각의 세포주를 A3, A5, 양성 대조군 TRAIL, 또는 TRAIL R2에 결합하지 않는 음성 대조군 단백질 B5(서열번호 148)와 함께 항온처리하고, 세포 생존력 분석을 H2122에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 이들 세포주에서, A5는 세포 생존력의 매우 강력한 억제를 보였다. 원자가가 보다 낮은 A3 단백질도 A5보다 낮은 효능에도 불구하고 세포 사멸을 유도하였다. 따라서, 원자가가 보다 높은 구축물은 보다 높은 활성을 보였다. 예측된 바와 같이, TRAIL도 세포 생존력을 억제할 수 있었지만, TRAIL R2에 결합하지 않는 8가 음성 대조군 단백질 B5는 세포 생존력을 억제할 수 없었다.
선형 직렬 구축물에 의한 콜로205의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A3(G6) 0.04 97
A5(G6) 0.0005 100
인간 TRAIL 0.08 100
선형 직렬 구축물에 의한 주르카트 세포의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A3(G6) 0.05 83
A5(G6) 0.0001 100
인간 TRAIL 0.009 99
세포는 실시예 5에서와 같이 셀타이터-글로 분석에 의해 분석되었다.
실시예 7
마우스 CD40L 특이적 2가 직렬 스캐폴드의 디자인, 발현 및 활성
한 쌍의 동일한 Tn3 모듈을 융합시켜 2가 뮤린 CD40L 특이적 Tn3 단백질(표 13)을 제조하였다. M13은 뮤린 CD40L에 특이적으로 결합하는 Tn3 단백질이다. M13 서열은 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프의 서열이 각각 서열번호 100, 서열번호 104 및 서열번호 110에 상응하는 서열을 갖는 대안적 루프로 치환되어 있는 Tn3의 서열에 상응한다(표 4 참조). Gly4Ser(서열번호 210)(GS) 유닛의 1개 카피(구축물 C1(M13)), 3개 카피(구축물 C2(M13)), 5개 카피(구축물 C3(M13)) 또는 7개 카피(구축물 C4(M13))를 함유하는 링커를 사용하여 13 내지 43개 아미노산의 총 링커 길이를 발생시켰다(도 9a 및 표 3 참조).
발현된 Tn3 함유 단백질의 명칭, 원자가 및 특이성
명칭
(클론)		 Tn3 모듈의 수 링커 길이 특이성
M13(M13) 1 N/A 뮤린 CD40L
C1(M13) 2 13 뮤린 CD40L
C2(M13) 2 23 뮤린 CD40L
C3(M13) 2 33 뮤린 CD40L
C4(M13) 2 43 뮤린 CD40L
요약하건대, 발현 구축물을 다음과 같이 발생시켰다: Tn3 유전자의 업스트림에서 pSec 벡터에 특이적인 프라이머 및 "1-3 GS 링커 역방향" 프라이머(서열번호 123)를 사용하여 실시예 1에 기재된 pSec-oppA(L25M) 벡터 내에 클로닝된 뮤린 CD40L 결합제 pSec-M13을 PCR로 증폭시킴으로써 단편 A를 발생시켰다(사용된 Tn3 특이적 프라이머의 서열에 대해서는 표 14 참조). 각각 "1 GS 링커" 프라이머(서열번호 121) 또는 "3 GS 링커" 프라이머(서열번호 122), 및 Tn3 유전자의 다운스트림에서 pSec 벡터에 특이적인 프라이머를 사용하여 동일한 주형을 PCR로 증폭시킴으로써 단편 B1GS 및 B3GS를 발생시켰다. 상기 단편의 겔 정제 시, 단편 A와 B1GS 또는 단편 A와 B3GS를 혼합하고, 상기 2개의 pSec 벡터 특이적 프라이머를 사용한 PCR 반응에서 중복 PCR로 직렬 구축물을 발생시켰다. 생성물을 NcoI 및 KpnI으로 분해하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 pSec-oppA(L25M) 벡터 내로 다시 클로닝하여 2개의 구축물, 즉 C1(M13) 및 C2(M13)를 발생시켰다. 5 GS 링커 구축물 및 7 GS 링커 구축물을 발생시키기 위해, "GS L Amp 정방향" 프라이머(서열번호 126) 및 "GS L Amp 역방향" 프라이머(서열번호 127)를 사용하여 각각 올리고뉴클레오티드 "5 GS 링커"(서열번호 124) 및 "7 GS 링커"(서열번호 125)를 PCR로 증폭시킴으로써 발생시킨 링커 삽입체를 PstI 및 XmaI으로 분해하고 PstI 및 XmaI에 의한 pSecM13-1GS-M13의 절단에 의해 발생된 벡터 단편 내로 클로닝하여 구축물 C3(M13) 및 C4(M13)를 발생시켰다.
직렬 2가 MuCD40L 특이적 구축물의 구축에서 사용된 프라이머 서열
서열 명칭 서열 서열번호
1 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 121
3 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 122
1-3 GS 링커 역방향 CTGCAGTGGTAAAGGTTTCTTTCG 123
5 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCCGCTTGGATGCCCCCGGGCA 124
7 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCCGCTTGGATGCCCCCGGGCA 125
GS L Amp 정방향 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGT 126
GS L Amp 역방향 TTCAATCTGCCCGGGGGCATCCAA 127
동일한 Tn3 스캐폴드를 포함하는 1가 직렬 구축물 및 2가 직렬 구축물을 실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이로부터 재조합적으로 발현시키고 정제하였다. 도 9b는 환원 조건 및 비환원 조건 하에서 수행된, 정제된 단백질 제제의 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
2가 직렬 M13-M13 구축물들의 결합 효율을 시험하고 이들을 1가 M13 스캐폴드와 비교하기 위해, 바이오센서 칩 상에 고정된 뮤린 CD40 수용체와 뮤린 CD40L의 결합의 경쟁 억제에 대해 이들 구축물을 시험하였다.
요약하건대, IgG1의 Fc 영역을 갖는 키메라 융합체 형태의 뮤린 CD40 수용체의 단편을 약 3,000 반응 유닛의 밀도로 GLC 칩(바이오-라드) 상에 고정시켰다. 경쟁 결합 분석을 위해, 상이한 링커 길이를 갖는 1가 M13 구축물 또는 M13 직렬 2가 구축물의 3배 연속 희석물을, 0.1%(부피/부피) 트윈-20 및 0.5 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 PBS 중의 고정된 농도의 재조합 뮤린 CD40L(0.5 ㎍/㎖)(이. 콜라이에서 생성됨)과 함께 20분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 이들 샘플을 300초 동안 30 ㎕/분의 유속으로 GLC 칩 상에 주입하고, 결합된 CD40L의 수준을 센서그램(sensorgram) 내에서 고정된 시점에서 기록하고 임의의 경쟁자의 부재 하에서 결합된 단백질의 상응하는 수준과 비교하였다. 각각의 결합 측정 후, 10 mM 글리신-HCl(pH 2.0)을 주입하여 잔류 CD40L을 상기 칩 표면으로부터 탈착시켰다. 상기 칩의 인터스폿(interspots)으로부터 센서그램을 차감함으로써 비특이적 결합 효과를 보정하였다. 뮤린 CD40L의 50%를 대체하는 데에 요구되는 Tn3 구축물의 농도에 상응하는 IC50 값을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 계산하였다.
도 9c에 나타낸 바와 같이, M13 단량체에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50)는 71 nM인 반면, 2가 직렬 구축물 C1(M13)에 대한 IC50은 29 nM이었다. 보다 긴 링커를 함유하는 2가 구축물(각각 구축물 C2(M13), C3(M13) 및 C4(M13))에 대해 5 또는 6 nM의 유사한 IC50 값이 수득되었다. 이것은 본 분석에서 사용된 CD40L의 농도로 인해 본 분석에서 관찰될 수 있는 IC50의 하한이다. 모든 2가 구축물이 1가 구축물에 비해 보다 낮은 IC50 값을 나타내었는데, 이것은 2가 직렬 구축물의 결합 활성이 단일 M13 Tn3 모듈에 비해 향상되었음을 암시한다. 이들 2가 구축물에서 링커 길이는 분석 효능에 대한 약간의 효과를 나타내는데, 이때 링커 길이가 가장 짧은 구축물은 중간 효능을 나타내는 반면, 23개 이상의 아미노산으로 구성된 링커를 갖는 구축물은 본 분석에서 동등하다.
세포에 기초한 활성 분석에서 2가 직렬 Tn3 구축물의 활성을 시험하고 이들을 1가 M13 스캐폴드와 비교하기 위해, 뮤린 CD40L에 의해 유도된 B 세포 상의 CD86 발현의 억제를 시험하였다. 대조군으로서, 상업적으로 입수가능한 항-뮤린 CD40L 특이적 항체(MR1)를 동시에 시험하였다.
본 분석은 건강한 지원자들로부터의 혈액으로부터 제조된 PBMC를 사용하였다. 요약하건대, 새로 채혈된 혈액을 헤파린이 함유된 비디 배큐테이너(BD Vacutainer)? CPT™ 세포 준비 튜브 내에 모았다. 원심분리 후, PBMC를 함유하는 세포층을 모아 PBS로 2회 세척하고 RPMI 1640 배지로 1회 세척하였다. 세포를 5x106개 세포/㎖의 농도로 완전 RPMI 1640 배지(10% 열 불활성화된 태아소 혈청 및 1% P/S로 보충됨)에 재현탁시켰다.
뮤린 CD40L 발현 Th2 세포주 D10.G4.1을 세척하고 1x106개 세포/㎖의 농도로 완전 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다.
M13, M13-M13 직렬 2가 구축물 C1 내지 C4, 또는 MR1 항체(바이오레전드(BioLegend), 카달로그 번호: 106508)를 완전 RPMI 1640 배지로 연속적으로 희석하였다(1:3). 각각의 희석물의 50 ㎕ 샘플을 96 웰 U 바닥 조직 배양 플레이트 내의 웰에 첨가하였다. 그 다음, 50 ㎕의 D10.G4.1 세포(5x104)를 각각의 웰에 첨가하고 혼합한 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 100 ㎕의 재현탁된 PBMC(5x105개 세포)를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 20 내지 24시간 동안 항온처리하였다.
PBMC를 모으고 4℃의 암실 내에서 FACS 완충제(PBS pH 7.4, 1% BSA, 0.1% 아지드화나트륨) 중의 APC-항-인간 CD86(비디 바이오사이언스, 카달로그 번호: 555660) 및 FITC-항-인간 CD19(비디 바이오사이언스, 카달로그 번호: 555412)로 30분 동안 염색하였다. FACS 완충제로 2회 세척한 후, 샘플을 FACS LSRII(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))로 분석하였다. CD19에 의해 게이팅된(gated) B 세포 상의 CD86 발현을 평가하였다. 시험 단백질의 함수로서의 CD86 발현의 분석을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
도 9d에 나타낸 바와 같이, 2가 M13-M13 직렬 구축물 모두가 MR1 항체의 IC50(100 pM)에 필적할만하고 M13 1가 스캐폴드 자체보다 약 3 로그 더 강력한 수준인 100 내지 200 pM의 IC50으로 CD86 발현을 억제하였다. 생화학적 분석과 대조적으로, 링커 길이의 효과는 이 세포에 기초한 분석에서 관찰되지 않았고, 길이가 13 내지 43개 아미노산 범위 내에 있는 링커를 갖는 2가 구축물 모두가 1가 단백질에 비해 상대적으로 향상된 효능을 나타내는 동등한 능력을 보였다.
실시예 8
이중특이적 직렬 스캐폴드의 발현
TRAIL R2 및 인간 CD40L(HuCD40L)에 대한 특이성을 나타내는 이중특이적 Tn3 구축물을 발생시키기 위해, 2개의 Tn3 모듈(하나는 TRAIL R2에 대한 특이성을 나타내고(클론 1E11), 나머지 하나는 인간 CD40L에 대한 특이성을 나타냄(클론 79))을 이들 2개의 모듈을 분리시키는 다양한 길이의 링커들과 함께 융합시켰다(표 3 및 표 15). 클론 79 단백질(서열번호 184)의 서열은 BC 루프, DE 루프 및 EF 루프가 각각 서열번호 101, 105 및 111에 상응하는 대안적 루프로 치환되어 있는 Tn3 모듈의 서열에 상응한다. 1개의 Gly4Ser(GS) 반복체를 갖는 링커 및 3개의 Gly4Ser(GS) 반복체를 갖는 링커를 함유하는 직렬 이중특이적 스캐폴드에 대한 발현 구축물(각각 구축물 C6 및 C8)을, Tn3 변이체 A1 및 79를 보유하는 플라스미드가 PCR 주형으로서 먼저 사용되었다는 점을 제외하고 실시예 7에 기재된 바와 같이 발생시켰다. 구축물 C5(스캐폴드 결합을 위해서는 요구되지 않지만 제3 FnIII 도메인의 A 베타 가닥의 일부로서 간주될 수 있는, 인간 테나신 C 내의 제2 FnIII 도메인 및 제3 FnIII 도메인을 연결하는 천연 서열로부터 유래된 짧은 링커를 함유함) 및 구축물 C7을, C5의 경우 "O GS 링커 역방향"이 "1-3 GS 링커 역방향" 대신에 사용되었다는 점을 제외하고 표 16에 나열된 추가 프라이머를 사용하여 C6 및 C8과 유사한 방식으로 발생시켰다.
발현된 Tn3 함유 단백질의 명칭, 원자가 및 특이성
명칭 Tn3 모듈의 수 링커 길이 특이성
A1(1E11) 1 N/A TRAIL R2
79(79) 1 N/A HuCD40L
C5(1E11 & 79) 2 8 TRAIL R2 + HuCD40L
C6(1E11 & 79) 2 13 TRAIL R2 + HuCD40L
C7(1E11 & 79) 2 18 TRAIL R2 + HuCD40L
C8(1E11 & 79) 2 23 TRAIL R2 + HuCD40L
이중특이적 직렬 구축물의 구축에서 사용된 추가 프라이머 서열
서열 명칭 서열 서열번호
0 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACCACGCGTTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 128
0 GS 링커 역방향 CGTGGTGGTAAAGGTTTCTTTCG 129

2 GS 링커		 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 130
1가 Tn3 스캐폴드 및 직렬 이중특이적 Tn3 스캐폴드를 실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 배지에서 재조합적으로 발현시켰다. 가용성 구축물의 발현 수준을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 도 10은 시험된 구축물에 대한 허용가능한 발현 수준을 입증한다.
실시예 9
이중특이적 직렬 스캐폴드의 특이적 결합
이중특이적 Tn3 구축물과 CD40L 및 TRAIL R2의 결합을 측정하기 위해 포획 ELISA 분석을 이용하였다. 요약하건대, 8X His 태그 부착된 단백질 구축물(서열번호 211에 개시된 "8X His")인 A1, 79, C5, C6, C7 또는 C8(세부사항에 대해 표 15 참조)을 다음과 같이 이. 콜라이 배지로부터 항-His 항체 코팅된 웰 상으로 포획하였다. 96 웰 맥시소르브 플레이트를 2 ㎍/㎖의 퀴아젠 항-His 항체로 밤새 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 0.1%(부피/부피) 트윈-20 및 4%(중량/부피) 탈지유 분말(PBST 4% 우유)이 함유된 PBS로 1.5시간 동안 차단하였다. 코팅된 플레이트를 PBST로 세척하고, 발현된 가용성 단백질을 함유하는 희석된 세균 배지(30배 희석됨)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. PBST로 세척한 후, 포획된 구축물을 함유하는 웰을 다양한 농도의 바이오티닐화된 TRAIL R2(도 11a), 또는 이. 콜라이에서 생성된 His 태그 부착된 HuCD40L과 바이오티닐화된 항-His 항체의 예비항온처리에 의해 발생된 복합체와 함께 1.5시간 동안 항온처리하였다(도 11b). PBST로 세척한 후, 결합된 TRAIL R2 또는 HuCD40L/항-His 항체 복합체를 스트렙타비딘-호스라디쉬 과산화효소(RPN1231V; 지이 헬쓰케어; 1000x 작업 희석물)로 20분 동안 검출하고, PBST로 세척하고, TMB 기질(피어스(Pierce))을 첨가하여 비색적으로 검출하였다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
이중특이적 직렬 TRAIL R2-HuCD40L 특이적 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합, 및 이중특이적 직렬 TRAIL R2-HuCD40L 특이적 스캐폴드와 HuCD40L의 결합은 각각 도 11a 및 도 11b에 도시되어 있다. HuCD40L 특이적 Tn3 도메인에 융합된 TRAIL R2 특이적 Tn3 도메인을 포함하는 이중특이적 직렬 스캐폴드(C5 내지 C8로 명명됨)는 TRAIL R2 및 HuCD40L에 결합하였으나, 단량체/단일특이적 Tn3 구축물 A1 및 79는 그들의 공지된 특이성에 따라 TRAIL R2 또는 HuCD40L에 결합하였으나 상기 표적 둘다에는 결합하지 못하였다.
직렬 TRAIL R2-HuCD40L 특이적 구축물과 TRAIL R2 및 HuCD40L의 동시적인 결합을 알파스크린™ 분석을 이용하여 측정하였다. 단백질 A1, 79, C5, C6, C7 및 C8을 함유하는 이. 콜라이 배지의 희석물을 PBS + 0.01% 트윈 + 0.1% BSA 중의 10 nM TRAIL R2-Fc 융합 단백질, 50 nM 바이오티닐화된 HuCD40L(이. 콜라이에서 생성됨), 스트렙타비딘 알파스크린 공여자 비드(0.02 ㎎/㎖) 및 단백질 A 알파스크린 수용자 비드(0.02 ㎎/㎖)와 함께 항온처리하였다. 샘플을 퍼킨엘머 엔비전 판독기에서 판독하기 전에 암실 내에서 1시간 동안 항온처리하였다. 공여자 비드 집단을 단일항 산소의 방출을 야기하는 680 nm에서 레이저로 여기시켰다. 단일항 산소는 기저 상태로 다시 떨어지기 전에 확산에 의해 200 nm까지 이동하게 하는 제한된 수명을 갖는다. 단일항 산소는 엔비전 판독기에 의해 측정되는 520 내지 620 nm의 발광을 야기하는 수용자 비드를 여기시킨다. 공여자 비드와 수용자 비드가 인접하게 위치하는 경우에만 신호가 발생된다. 따라서, 상기 2종의 비드가 2개의 표적과 동시적으로 상호작용하는 분자에 의해 함께 존재하는 경우 신호의 증가가 관찰된다. 표적과의 결합의 부재 하에서 신호는 검출되지 않아야 한다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 직렬 이중특이적 구축물은 TRAIL R2 및 HuCD40L에 동시적으로 결합하여 강력한 알파스크린 신호를 발생시켰으나, 1가 Tn3 스캐폴드인 A1 및 79는 신호를 발생시키지 않았는데, 이것은 이들 스캐폴드가 상기 표적 둘다에 동시적으로 결합함으로써 공여자 비드와 수용자 비드를 인접하게 위치시킬 수 없었다는 것을 암시한다.
실시예 10
9개 아미노산 길이의 FG 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드의 증가된 안정성
Tn3 안정성에 대한 FG 루프 길이의 효과를 측정하기 위해, pH 7.0에서 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl)에 의한 6개의 HuCD40L 특이적 Tn3 스캐폴드의 언풀딩을 고유 트립토판 형광도로 평가하였다. 이들 Tn3 단량체 스캐폴드는 9개, 10개 또는 11개 아미노산의 FG 루프 길이를 함유하였다. 상이한 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 0.05 ㎎/㎖ Tn3 스캐폴드의 샘플을 50 mM 인산나트륨(pH 7.0)에서 제조하였다. 형광 방출 스펙트럼을 280 nm의 여기 파장에서 호리바 플루오로맥스-4(Horiba Fluoromax-4) 분광형광계 상에서 획득하였다. 360 nm에서의 상대적인 형광 방출 강도를 각각의 단백질에 대해 GuHCl 농도의 함수로서 작도하였다. 각각의 스캐폴드는 독특한 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 서열을 함유하였다. 클론 A3(서열번호 185; 본 실시예에서 A3 단량체 스캐폴드는 표 3에서 제공된 A3으로 명명된 구축물과 상이하다는 것을 주목해야 함), 71(서열번호 186), 79(서열번호 184), 127(서열번호 187), 252(서열번호 188) 및 230(서열번호 189)은 모 Tn3의 50% 언폴딩을 수행하는 데에 요구되는 GuHCl 농도(Cm)인 3.0 M GuHCl(pH 7.0)에서 50% 초과의 수준으로 언폴딩되었다. 클론 A3, 79, 127, 252 및 230에 대한 Cm 값은 각각 2.2 M, 2.7 M, 2.4 M, 2.7 M 및 2.4 M이었다. 이들 클론에 대한 FG 루프 길이는 각각 11개, 11개, 11개, 10개 및 11개 아미노산인 반면, 모 Tn3에 대한 FG 루프 길이는 10개 아미노산이다. 놀랍게도, 9개 아미노산의 FG 루프 길이를 갖는 유일한 변이체인 클론 71은 모 Tn3 스캐폴드 또는 시험된 다른 5개의 변이체보다 유의하게 더 높은 안정성, 즉 4.2 M의 Cm을 나타내었다. 결과는 도 13에 제시되어 있다.
Tn3 클론 71의 향상된 안정성이 그의 서열에 내재된 성질인지 아니면 짧아진 FG 루프 길이의 결과인지를 확인하기 위해, 이 클론, 및 9개 아미노산의 FG 루프 길이를 갖는(그러나, 상이한 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 서열을 갖는) 2개의 추가 단량체 Tn3 스캐폴드 단백질(A6(서열번호 190; 본 실시예에서 A6 단량체 스캐폴드는 표 3에서 제공된 A6으로 명명된 구축물과 상이하다는 것을 주목해야 함) 및 P1C01(서열번호 191))을 시차 주사 열량측정법(DSC)으로 분석하고 10개 아미노산 길이를 갖는 FG 루프를 함유하는 모 Tn3 스캐폴드와 비교하였다. PBS(pH 7.2) 중의 1 ㎎/㎖의 Tn3 단백질 샘플을 분석하였다. 모든 경우, 9개 잔기 FG 루프를 갖는 클론에 대한 열적 언폴딩의 중간점은 10개 잔기 FG 루프를 갖는 모(WT) Tn3에 비해 더 높았다. 열적 언폴딩은 동일한 샘플이 냉각되고 재가열된 경우 중첩가능한 온도기록도(thermograms)에 의해 입증된 바와 같이 가역적 또는 부분적으로 가역적(클론 A6)이었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 모 Tn3에 대한 용융 온도(Tm)는 72.1℃이었고, P1C01에 대한 Tm은 75.2℃이었고 A6에 대한 Tm은 77.5℃이었고, 71에 대한 Tm은 74.4℃이었다.
이들 발견은 구아니딘 하이드로클로라이드 안정성 실험에서 동일한 Tn3 단백질 변이체를 시험함으로써 확증되었다. pH 7.0에서 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl)에 의한 모(WT) Tn3, P1C01, A6 및 71의 언폴딩을 전술된 바와 같이 고유 트립토판 형광도로 평가하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 도 14의 DSC 데이터와 일치하여, Tn3 클론 A6, 71 및 P1C01 모두가 모(WT) Tn3 스캐폴드보다 유의하게 더 높은 GuHCl 농도에서 언폴딩의 중간점을 가졌는데, 이것은 9개 아미노산 길이, 즉 모 Tn3 스캐폴드의 길이보다 더 짧은 길이의 FG 루프를 갖는 Tn3 단백질의 안정성이 향상된다는 것을 암시한다.
실시예 11
FG 루프 길이의 안정성 분석
전술된 바와 같이, 예비 분석은 9개 잔기의 FG 루프 길이를 갖는 Tn3 분자가 보다 긴 FG 루프를 갖는 Tn3 분자보다 유의하게 더 안정하다는 것을 암시하였다. 이들 연구에서, 본 발명자들은 열안정성에 대한 FG 루프 길이의 효과를 평가하기 위해 일군의 무작위 Tn3에 대한 안정성 분석을 수행하였다.
Tn3 라이브러리를 pSEC 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 이 라이브러리는 다양한 서열뿐만 아니라 다양하지만 정해진 길이를 갖는 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프를 갖는 Tn3을 코딩한다. 이들 연구의 초점인 FG 루프는 9개, 10개 또는 11개 잔기의 길이를 가질 수 있다. BC 루프는 9개, 11개 또는 12개 잔기의 길이를 가질 수 있다. 이 라이브러리에서 DE 루프는 6개 잔기의 고정된 길이를 갖는다. 서브클로닝된 라이브러리를 사용하여 DH5α 형질전환능(competent) 세포를 형질전환시키고, 이 세포로부터 플라스미드 풀을 정제하고 사용하여 BL21(DE3) 세포를 형질전환시켰다. BL21 콜로니를 서열분석하여 전장 Tn3을 코딩하는 96개의 클론을 확인하였다. 최종 96개의 클론을 표준 매직 메디아(Magic Media) 발현(접종 후 24시간 동안 37℃ 진탕)을 이용하여 500 ㎕ 규모로 96 딥 웰 플레이트 내에서 성장시키고 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 중간 내지 높은 발현도를 나타내는 29개의 무작위 클론을 50 ㎖ 규모 발현까지 규모 확대시키고 표준 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 모든 단백질의 본질을 질량 분광계로 확인하였다.
무작위 클론을 DSC로 안정성에 대해 분석하였다. 요약하건대, VP-캐필러리(Capillary) DSC(마이크로칼(MicroCal)) 상에서 DSC 측정을 수행하였다. 광범위한 투석을 통해 단백질을 PBS(pH 7.2) 내로 교환하고 DSC 분석을 위해 0.25 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 조절하였다. 스캔을 반복하지 않으면서 샘플을 시간당 90℃의 스캔 속도로 20℃ 내지 95℃에서 스캐닝하였다. 결과는 표 17에 제시되어 있다.
FG9를 갖는 Tn3 대 FG10/11을 갖는 Tn3의 Tm 값의 비교
FG9 T m (℃) FG10 /11 T m (℃)
A1 64.8 E12(FG10) 65.0
A3 71.8 F5(FG10) 60.0
B2 70.0 G1(FG11) 64.3
B4 69.4 G4(FG11) 67.6
C5 66.6 G8(FG11) 64.2
C7 66.0 H6(FG11) 70.3
C8 64.1 H7(FG11) 71.7
C11 59.5 H8(FG10) 61.9
D1 73.7 H9(FG10) 59.5
D8 72.1 H10(FG11) 67.6
D10 65.6 H11(FG11) 63.7
D11 65.6 H12(FG11) 65.6
D12 66.4
E1 75.0
E3 66.0
E9 75.3
E11 61.9
n=17 n=12
평균 67.9 평균 65.1
본 연구에서, 루프 길이 FG9 또는 FG10 및 FG11을 갖는 Tn3의 열안정성을 비교하였다. 길이 9의 FG 루프를 갖는 Tn3 도메인이 루프 길이 FG10 또는 FG11을 갖는 Tn3 도메인보다 더 열적으로 안정한 경향이 보였다. 대조군인 야생형 Tn3 도메인(10개 잔기의 FG 루프를 가짐)은 상기 샘플들과 동시에 시험되었을 때 72℃의 Tm을 나타내었다. 각각의 루프 길이에서 관찰된 Tm 값의 범위는 다른 요인들도 Tn3 도메인 열안정성의 결정에 있어서 일정한 역할을 수행한다는 것을 암시한다.
실시예 12
삼중특이적 Tn3의 발생 및 특징규명
이들 실험에서, 3종의 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 Tn3 분자를 발생시키고 특징규명하였다. 시나기스? 항체에 대해 특이적인 Tn3 도메인인 D1을 각각 TRAIL 수용체 2에 대해 특이적인 Tn3 도메인인 1E11 및 CD40L에 특이적인 Tn3 도메인인 79에 연결하였다(도 16a). 구축물을 BL21(DE3) 이. 콜라이 세포에서 발현시키고 표준 방법을 이용하여 정제하였다(도 16b 참조).
삼중특이적 구축물이 모든 3개 쌍의 표적에 동시적으로 결합할 수 있었는지를 확인하기 위해, 알파스크린 및 ELISA 실험 둘다를 수행하였다. 알파스크린 실험의 경우, 삼중특이적 Tn3, 총 3개의 표적 분자들 중 2개의 표적 분자의 서브셋(바이오티닐화된 한 표적 분자, 및 항체 Fc 영역을 함유하는 나머지 표적 분자), 단백질 A 공여자 비드 및 스트렙타비딘 수용자 비드를 전술된 바와 같이 384 웰 백색 옵티플레이트(Optiplate) 내에서 조합하였다. 알파스크린 신호는 스트렙타비딘 공여자 비드 및 단백질 A 수용자 비드가 서로 인접하게 위치하는 경우(서로 200 nm 이내에 위치하는 경우)에만 관찰될 수 있고, 이것은 본 분석에서 상기 삼중특이적 분자에 의한 가교형성을 통해 달성된다. huCD40L 및 TRAIL R2-Fc에 동시적으로 결합하는 D1-1E11-79의 능력(도 17a), 및 huCD40L 및 시나기스?에 동시적으로 결합하는 능력(도 17b)을 다음과 같이 알파스크린으로 확인하였다: 384 웰 백색 옵티플레이트 내에서 하기 성분들을 총 30 ㎕의 부피로 조합하였다: 20 mM의 정제된 D1-1E11-79, 50 mM의 바이오티닐화된 huCD40L, (0, 1, 2.5, 5, 10 또는 42 nM) TRAIL R2-Fc(도 17a) 또는 (0, 1, 2.5, 5, 10 또는 42 nM) 시나기스?(도 17b), 및 각각 5 ㎕의 알파스크린 단백질 A 수용자 비드 및 스트렙타비딘 공여자 비드의 1/50 희석물. 암실에서 1시간 동안 항온처리한 후, 상기 플레이트를 알파스크린 모드로 엔비전 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
시나기스? 및 TRAIL R2-Fc 둘다 Fc 도메인을 함유하기 때문에, 알파스크린 분석을 이용하여 이들 분자와 삼중특이적 구축물의 동시적인 결합을 입증할 수 없었다. 이를 대신하여, ELISA 실험을 수행하였다. 맥시소르프 플레이트를 TRAIL R2-Fc(1 ㎍/㎖ 농도의 100 ㎕)로 코팅하고 4% 우유로 차단한 후 다양한 농도의 삼중특이적 구축물을 첨가하였다. 제2 표적 리간드인 바이오티닐화된 시나기스?를 첨가하고, HRP-스트렙타비딘을 첨가하여 검출하였다(도 18). 도 18의 ELISA 결과에 의해 암시되는 바와 같이 D1-1E11-79도 TRAIL R2-Fc 및 시나기스? 둘다에 동시적으로 결합할 수 있는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명자들은 이 구축물이 모든 3개 쌍의 그의 표적들에 동시적으로 결합할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 13
선도(lead) 단리
작용제 Tn3의 개발에 있어서 제1 단계는 TRAIL R2에 결합할 수 있고 다가 포맷으로 연결된 경우 아폽토시스 경로를 이용하는 방식으로 2개 이상의 TRAIL R2 세포외 도메인에 결합할 수 있는 Tn3 단량체를 단리하는 것이다. 모든 결합제가 작용제로서 작용할 수 없기 때문에, 본 발명자들은 이차적 시험관내 세포 사멸 분석에서 결합제의 패널을 먼저 단리한 후 작용활성에 대해 스크리닝하기로 결심하였다. 본 발명자들은 결합제의 초기 패널을 단리하기 위해 재조합 TRAIL R2-Fc 상의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프에서의 변이를 갖는 Tn3의 큰 파지 표시 라이브러리를 먼저 패닝하였다. 이 라이브러리를 위한 기초로서 선택된 Tn3 스캐폴드는 테나신 C로부터의 천연 제3 FnIII 도메인이 아니었으나 안정성을 개선시키기 위해 조작된 이황화 결합을 갖는 버전이었다. BC 루프, DE 루프 및 FG 루프에서의 무작위화를 함유하는 사내 제조된(in house) Tn3/유전자 3 융합 파지 표시 라이브러리를 구축하였다. TRAIL R2가 플레이트 상에 직접적으로 코팅되어 있는 파지 ELISA에 의해 다수의 결합제가 발견되었고, PBS + 0.1% 트윈 20(PBST) + 1% 우유 중의 1:3 희석된 파지의 결합을 항-M13-과산화효소 접합된 항체(지이 헬쓰케어 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로 검출하였다. 대부분의 결합제가 루프들 중 하나에서 바람직하지 않은 자유 시스테인을 가졌고 추가 연구를 위해 선택되지 않았다. 짝을 이루지 않은 시스테인을 결여하는 클론의 서브셋을 발현 벡터 내로 클로닝하여 Fc 융합체 또는 항체 유사 구축물을 발생시켰고(도 1) 세포 사멸에 대해 종양 세포주 H2122에서 시험하였다(데이터는 나타내지 않음). Fc 융합체 포맷이 그의 융합된 Tn3과 관계없이 세포를 사멸시키지 못하였지만, 항체 유사 포맷은 1개 초과의 결합제에 대한 반응을 유발하였다.
실시예 14
친화 성숙
클론 1C12(서열번호 132)(도 19 참조)는 초기 스크리닝 분석에서 가장 우수한 세포 사멸을 보였으므로 친화 성숙을 위해 선택되었다. 친화 성숙은 쿤켈 돌연변이유발 또는 무작위화를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR을 이용하는 루프의 부분의 포화 돌연변이유발, 조립 및 파지 표시 벡터 내로의 라이게이션에 의해 수행되었다. 라운드 1 및 라운드 3은 BC 루프 및 FG 루프 각각의 부분의 포화 돌연변이유발로 구성되었고, 라운드 2는 모든 3개의 루프의 부분의 개별적인 포화 돌연변이유발, 패닝, 유전자 셔플링, 및 이어서 최대 친화성을 나타내는 최종 클론을 수득하기 위한 셔플링된 돌연변이체의 패닝을 조합하였다. 패닝 후, 친화 성숙된 클론의 풀을, 파지로부터 직접적으로 PCR로 회수하거나 퀴아젠 키트(퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)에 이어서 PCR을 이용하여 단일 가닥 DNA를 준비함으로써 회수하였다. PCR 생성물을 NcoI 및 KpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)으로 분해하고 본 발명자들의 사내 제조된 발현 벡터 pSEC 내로 클로닝하였다. 클론을 매직메디아(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 발현시키고 겔 상에서 런닝하여 발현이 클론 사이에서 크게 상이하지 않다는 것을 입증하였다. 플레이트가 4가 항체 유사 1C12(서열번호 154 및 서열번호 155)로 코팅되어 있는 경쟁 ELISA를 이용하여 개선된 클론을 확인하고, 매직메디아 중의 Tn3의 희석물의 존재 하에서 0.75 nM TRAIL R2 바이오틴의 결합의 억제를 스트렙타비딘-호스라디쉬 과산화효소(지이 헬쓰케어 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 측정하였다. TMB(KPL, 미국 매릴랜드주 게이터스버그 소재)를 첨가하고 산으로 중화시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
친화성 측정을 25℃에서 GLC 센서 칩을 사용하여 프로테온(ProteOn) XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템(바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재) 상에서 수행하였다. 0.005% 트윈 20을 함유하는 프로테온 인산염 완충 식염수(pH 7.4)(PBS/트윈)를 런닝 완충제로서 사용하였다. TRAIL R2를 상기 칩 상에 고정시키고, Tn3 결합제(1C12(서열번호 132), 1E11(서열번호 134), G3(서열번호 133), C4(서열번호 135) 및 G6(서열번호 138))의 2배 12점 연속 희석물을 36 μM 내지 700 nM의 출발 농도에서 PBS/트윈/0.5 ㎎/㎖ BSA(pH 7.4)로 제조하였다. 각각의 농도의 샘플을 30 ㎕/분의 유속으로 6개의 분석물 채널 내로 300초 동안 주입하였다. 프로테온 소프트웨어 내의 평형화 분석 셋팅을 이용하여 Kd를 측정하였다. 각각의 라운드로부터 수득된 가장 우수한 클론의 서열이 도 19에 제시되어 있다. 3개 라운드의 친화 성숙 후 친화성의 총 개선은 40 내지 50 nM 범위 내의 친화성을 나타내는 가장 우수한 클론의 경우 거의 두 자릿수 크기이었다(표 18).
표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되었을 때 선두 클론 1C12의 친화 성숙으로부터 수득된 가장 우수한 단량체 클론의 평형화 결합 상수
라운드 클론 K d (nM) 개선 배수
선도 단리 1C12 4130 ± 281
친화 성숙 1 G3 422 ± 45 10
친화 성숙 2 1E11 103 ± 9 40
친화 성숙 3 C4 50 ± 2 83
친화 성숙 3 G6 43 ± 2 96
실시예 15
항체 유사 포맷에서 효능에 대한 Tn3 친화성의 효과
효능에 대한 개별 Tn3 서브유닛의 친화성의 효과를 평가하기 위해, 표 18의 모든 클론을 도 1에 도시된 항체 유사 구축물로 리포맷팅하였다. 항체 유사 단백질을 발현시키기 위해, 293F 세포를 적절한 발현 구축물로 일시적으로 형질감염시켰다. 상청액의 회수를 6일째 날 및 10일째 날에 수행하고, 단백질을 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 모든 정제된 단백질을, 환원제를 사용하지 않으면서 MES 완충제 중의 누페이지 노벡스 4 내지 12% 비스 트리스 겔 상에서 SDS-PAGE로 분석하고 심플리블루 세이프스테인(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 가시화하였다.
또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제된 단백질을 분석하였고, 필요한 경우, 응집된 물질을 수퍼덱스 75 10/300GL 또는 수퍼덱스 200 10/300GL 컬럼(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서 총 단백질의 10% 미만의 최종 수준까지 제거하였다. 무스탕 E 막(팔 코포레이션, 미국 뉴욕주 포트 워싱톤 소재)을 갖는 아크로디스크 유닛을 제조자에 의해 지시된 바와 같이 사용하여 세균에 의해 발현된 단백질 제제로부터 내독소를 제거하였다.
그 다음, 셀타이터-글로 세포 생존력 분석을 이용하여 작용제성 항체 유사 구축물에 대한 민감성에 대해 H2122 세포를 시험하였다. 본 분석에서, 발광은 96 웰 플레이트의 주어진 웰 내의 ATP의 수준에 정비례하고, 상기 ATP 수준은 대사적 활성 생존 세포의 양에 정비례한다. H2122 세포주의 경우, 75 ㎕의 완전 배지(10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지) 중의 세포를 10,000개 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트 내에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 배지를 TRAIL R2 특이적 단백질 또는 음성 대조군 단백질의 연속 희석물이 함유된 25 ㎕의 추가 배지로 보충하였다. 모든 처리를 이중 웰에서 수행하였다. 상업적으로 입수가능한 TRAIL 리간드(케미콘/밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 TRAIL 수용체에 의해 유도된 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
72시간 후, 셀타이터-글로 키트를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 분석 발광을 엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재) 상에서 측정하였다. 처리된 세포에 대한 발광 값을 비처리된 생존 세포에 대한 평균 발광으로 나눔으로써 세포 생존력의 억제를 측정하였다.
2개의 변수가 효능을 결정한다: 구축물이 세포의 생존력을 50%까지 억제하는 농도(EC50), 및 세포 생존력의 최대 억제. 도 20은 G6이 1E11보다 낮은 EC50을 나타내고 1E11이 1C12보다 낮은 EC50을 나타내기 때문에 일반적으로 Tn3 단량체의 보다 높은 친화성이 항체 유사 구축물의 보다 낮은 EC50을 초래하는 경향이 있다는 것을 보여준다.
실시예 16
선형 Tn3의 약동학
선형 Tn3 직렬체의 반감기를 직렬체당 Tn3 모듈의 수의 함수로서 측정하기 위해, G6 단량체(서열번호 138), G6 직렬체 4(서열번호 143), G6 직렬체 6(서열번호 192) 및 G6 직렬체 8(서열번호 145)을 마누스 내로 주입하고, Tn3의 혈청 농도를 ELISA로 모니터링하였다. 투여 경로는 복강내(IP) 주입이었다. 실험 디자인은 표 19에 제시되어 있다. 마우스를 시점당 150 ㎕씩 채혈하였다. 사내 제조된 TRAIL R2로 코팅된 플레이트를 PBST 1% 우유에 희석된 혈청과 함께 항온처리하는 ELISA를 이용하여 혈청에서 Tn3을 검출하였다. 신호가 본 분석의 동적 범위 내에 있도록 하기 위해 초기 ELISA를 수행하여 주어진 시점에 대한 보정 희석 범위를 측정하였다. PBST 1% 우유 중의 토끼 다중클론 항-Tn3 혈청(코반스(Covance), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재)의 1/1,000 희석물을 사용한 후 PBST 1% 우유 중의 당나귀 항-토끼 HRP(잭슨 이뮤노리서치(ImmunoResearch), 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재)의 1/10,000 희석물을 사용하여 결합된 Tn3을 검출하였다. 각각의 구축물에 대해 표준 곡선을 작도하였다. 사내 통계학적 프로그램을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
용어 "최대 혈장 농도"("Cmax")는 시험 물질을 환자에게 투여한 후 혈장 중의 직렬 Tn3의 최대 관찰된 농도를 지칭한다.
용어 "Tmax"는 최대 혈장 농도 Cmax에 도달하는 데에 소요되는 시간을 지칭한다.
용어 "곡선 하의 면적"("AUC")은 혈장 중의 직렬 Tn3의 농도를 시간에 대하여 작도한 곡선에서 곡선 하의 면적이다. AUC는 시간 간격 동안 순간적인 혈장 농도(Cp)의 적분의 측정치일 수 있고 질량*시간/부피의 유닛을 갖는다. 그러나, AUC는 통상적으로 시간 간격 0 내지 무한대에 대해 제공된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "AUCinf"는 무한한 시간 전체로부터의 AUC를 지칭한다.
용어 "생물학적 반감기"("T1 /2")는 직렬 Tn3의 혈장 농도가 그의 원래의 값의 절반에 도달하는 데에 소요되는 시간으로서 정의된다.
용어 "CL/F"는 투여량/AUCinf로서 계산된 겉보기 전신 제거율을 지칭한다.
Tn3 생물학적 반감기(T1 /2)는 선형 분자당 직렬 Tn3의 수가 증가함에 따라 증가한다. 단량체로부터 직렬체 8을 제조하기 위한 7개의 Tn3의 첨가는 상기 반감기를 거의 50%까지 증가시켰다. 원자가의 증가는 Tmax에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 1부터 8까지 원자가의 증가는 Cmax 및 AUCinf를 각각 대략 10배 및 7배 증가시켰다. 나아가, 원자가가 1부터 8까지 증가하는 경우, 제거율(CL/F)의 대략 7배 감소가 관찰되었다.
항-TRAIL R2 선형 직렬체 약동학적 분석의 실험 디자인
군 # 시험 투여량 경로 부피 시점 # 마우스
1 G6 단량체 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
2 G6 직렬체 4 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
3 G6 직렬체 6 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
4 G6 직렬체 8 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
합계 36
직렬 Tn3의 약동학적 성질

시험 물질		 약동학적 파라미터
Cmax Tmax AUCinf T1/2 CL/F
(㎍/㎖) (시간(hr)) (시간(hr)·㎍/㎖) (시간(hr)) (㎖/시간(hr)/kg)
G6 단량체 3.65 1 9.31 1.22 1070
G6 직렬체 4 8.07 1 23.2 1.46 431
G6 직렬체 6 24.6 1 36.5 1.69 274
G6 직렬체 8 38.6 1 64.2 1.76 156
실시예 17
사이노몰구스 교차반응성의 조작된 향상
사이노몰구스 원숭이(필리핀 원숭이)에서의 임상전 독성 시험을 위해, 사이노몰구스 TRAIL R2(사이노 TRAIL R2)와 교차반응하는 항-TRAIL R2-Tn3을 개발하는 것이 바람직하다. 본 발명자들의 초기 친화 성숙된 선도 클론은 인간 TRAIL R2에 대한 상동성이 88%일지라도 사이노몰구스 TRAIL R2와의 낮은 교차반응성을 나타내었다. 친화 성숙으로부터 발생된 클론들 중에서 가장 우수한 사이노몰구스 교차반응성을 나타내는 클론인 클론 F4(서열번호 137)에 기초하여 라이브러리를 제조함으로써 교차반응성을 향상시켰다.
포화 돌연변이유발을 이용하여 2개의 라이브러리를 제조하였다: FG 루프에서만 다양성을 나타내는 라이브러리, 및 BC 루프 및 FG 루프에서 다양성을 나타내는 라이브러리. 또한, 오류율이 낮은 돌연변이유발성 PCR을 이용하여, 향상된 사이노몰구스 TRAIL R2 결합에 유리할 수 있는 돌연변이가 상기 루프 외부에서 일어나게 하였다. 사내 제조된 사이노몰구스 TRAIL R2에 대해 4개 라운드의 파지 패닝을 수행하였고, 결과물을 pSEC 발현 벡터 내로 클로닝하였다. ELISA 포맷으로 초기 히트(hits)를 스크리닝하기 위해, Tn3을 매직메디아(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 내로 분비시키고 항-his 태그 항체(알 앤드 디 시스템스(R and D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 상청액으로부터 포획하였다.
용액 중의 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 포획된 Tn3의 결합을 항-인간-Fc-HRP로 검출하였다. 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와의 유의한 결합을 갖고 인간 TRAIL R2-Fc와의 결합을 상실한 것으로 보이지 않는 클론을 후속 스크리닝 ELISA(이때, 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc는 플레이트 상에 코팅되어 있음)를 위해 선택하였고, Tn3 상청액을 적정한 후 항-his 태그 HRP로 검출하였다. 클론들 사이의 발현도에서의 변화도가 낮고 용액 중의 2가 TRAIL R2-Fc의 존재로부터 비롯된 친화력이 Tn3 친화성에서의 차이를 상쇄할 수 없었기 때문에, 이 ELISA는 친화 식별을 가능하게 하였다. 1개의 돌연변이, 즉 2개의 아미노산을 사이에 두고 DE 루프 앞에 존재하는, D로부터 G로의 돌연변이가 모든 조작된 사이노몰구스 교차반응성 클론들에 존재한다는 것이 발견되었다(도 22a). 이 D로부터 G로의 돌연변이를 원래의 F4 내로 도입하여 F4mod1(서열번호 193)로 명명된 클론을 제조하였고, 인간 TRAIL R2와의 결합을 상실하지 않으면서 사이노몰구스에 대한 교차반응성을 크게 개선시켰다(도 22b). 이 ELISA에서, 정제된 F4 또는 F4mod1에 의한 0.75 nM 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 F4mod1 코팅된 플레이트의 결합의 억제를 측정하였다.
사이노몰구스 교차반응성이 향상된 클론과 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc의 결합은 상기 클론과 인간 TRAIL R2-Fc의 결합의 10배 이내에 있는 것이 바람직하다. 또한, 사이노몰구스 교차반응성이 향상된 클론과 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc의 결합은 F4와 인간 TRAIL R2-Fc의 결합의 10배 이내에 있는 것이 바람직하다. F4mod1과 사이노몰구스 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50은 F4mod1과 인간 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50과 3배 미만만큼 상이하다. 또한, F4mod1과 인간 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50은 F4와 인간 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50보다 6배 더 강하다. 따라서, F4mod1은 의도된 교차반응성 요건을 충족시킨다.
실시예 18
향상된 사이노몰구스 교차반응성 클론의 생식세포주 조작
가능한 면역원성 위험을 감소시키기 위해 생식세포주로부터 비필수 돌연변이를 제거하도록 클론 F4mod1을 추가로 조작하였다. 인간 TRAIL R2 및 사이노몰구스 TRAIL R2 둘다와의 결합에 대한 주어진 돌연변이로부터의 효과가 있는지를 확인하기 위해 12개의 상이한 변형의 패널을 제조하였다. 도 23a는 결합에 영향을 미치지 않는 모든 시험된 생식세포주 돌연변이가 도입된 최종 클론 F4mod12(서열번호 194)를 다른 구축물, 즉 Tn3 생식세포주, 원래의 F4 모 클론 및 클론 F4mod1(조작된 초기 향상된 사이노몰구스 교차반응성)과 비교하여 보여준다.
F4mod12의 아미노산 서열은 천연 Tn3 서열 SQ로 시작되고 L로 종결되고, A로부터 T로의 골격 2 돌연변이의 복귀를 갖고, TA로부터 NQ로의 DE 루프의 최종 2개 아미노산의 복귀를 갖는다. 도 23b는 F4, F4mod1 및 F4mod12 모두가 이들과 인간 TRAIL R2의 결합에 있어서 서로 6배 이내에 있음을 보여준다. 또한, 상기 도면은 F4mod1 및 F4mod12가 이들과 사이노몰구스 TRAIL R2의 결합에 있어서 서로 2배 이내에 있음을 보여준다.
F4mod12를 직렬체 6(서열번호 167) 구축물 및 직렬체 8(서열번호 166) 구축물로 리포맷팅하였고 G6 직렬체 6(서열번호 144) 및 직렬체 8(서열번호 145)에 비해 상대적으로 효능의 상실이 없는지를 확인하기 위해 시험하였다. 도 23c 및 도 23d는 생식세포주 조작된 향상된 사이노몰구스 교차반응성 F4mod12 직렬체의 경우 콜로205 세포주에서 G6 직렬체에 비해 효능의 상실이 없다는 것을 보여준다.
실시예 19
TRAIL 내성 세포주에서 G6 직렬체 8의 활성
다수의 세포주가 TRAIL에 의한 사멸에 대한 내성을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 TRAIL 민감성 세포주에서 TRAIL에 비해 상대적으로 향상된 G6 직렬체 8 구축물의 효능이 TRAIL 내성 세포주에서 G6 직렬체 8의 효능으로 해석될 것인지를 평가하였다. 여러 암세포주에서 Apo2L/TRAIL에 대한 민감성을 셀타이터-글로 발광 세포 생존력 분석(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)으로 측정하였다. 요약하건대, 세포를 96 웰 플레이트 내에 플레이팅하고 밤새 부착시킨 후, 10% FBS를 함유하는 배지 중의 다양한 농도의 재조합 인간 Apo2L/TRAIL 및 TRAIL 모방체 G6 직렬체 8로 처리하였다. 48 내지 72시간 후, 세포 생존력을 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 도 24는 TRAIL 내성 세포주 HT29의 경우 G6 직렬체 8이 강력한 세포 사멸 활성을 보이는 반면, TRAIL은 그러하지 않다는 것을 보여주다. 표 21은 G6 직렬체 8이 시험된 모든 TRAIL 내성 세포주에서 세포 사멸 활성을 나타내는 것은 아니지만 대부분의 시험된 TRAIL 내성 세포주에서 세포 사멸 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 결합 모듈의 공간적 배향도 영향을 미칠 수 있지만, 향상된 효능은 TRAIL에 비해 상대적으로 더 높은 상기 직렬체의 원자가에 기인할 수 있다.
TRAIL 내성 세포주에서 G6 직렬체 8 및 TRAIL의 활성
TRAIL
IC50[nM]		 G6 직렬체 8
IC50[nM]		 TRAIL
% 최대 사멸		 G6 직렬체 8
% 최대 사멸
TRAIL에 대해서는 내성을 나타내지만 TRAIL 모방체에 대해서는 민감성을 나타냄 T84 >8.3 0.247 14.44 71.53
LoVo >8.3 0.005 45.99 74.22
CaCo-2 >8.3 0.044 18.23 54.84
HT29 >8.3 0.01 28.00 85.40
HPAF-II >8.3 0.06 45.33 91.33
Hep3B >8.3 0.23 13.35 70.15
SKHEP-1 >8.3 0.055 19.48 80.19
HepG2 >8.3 0.040 33.31 84.00
TRAIL 및 TRAIL 모방체에 대해 내성을 나타냄 SW620 >8.3 >10 -5.71 4.65
SW837 >8.3 >10 19.98 25.32
Hs766T >8.3 >10 20.99 47.86
NCI-H522 >8.3 >10 32.69 31.38
NCI-H23 >8.3 >10 22.08 39.59
BT-549 >8.3 >10 4.49 27.99
SNB-75 >8.3 >10 8.9 4.7
786-O >8.3 >10 -0.12 7.19
SNU-387 >8.3 >10 -0.63 33.1
SNU-475 >8.3 >10 0.49 20.88
SNU-398 >8.3 >10 1.50 0.46
실시예 20
TRAIL R2 결합 단량체의 면역원성 연구
면역원성은 인간으로부터 유래된 것일지라도 임의의 치료 단백질에 있어서 잠재적인 문제이다. 면역원성 반응은 염증을 초래할 수 있는 중화 항체를 통해 효능을 한정할 수 있다. 면역 반응의 발달에 있어서 가장 중요한 요인들 중 하나는 CD4+ T 세포 증식을 자극할 수 있는 에피토프의 존재이다. 에피스크린(EpiScreen) 시험(안티토프(Antitope), 영국 캠브리지 소재)에서, CD8+ T 세포 고갈된 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 시험 단백질과 함께 항온처리하고, CD4+ T 세포 증식 및 IL-2 분비를 모니터링한다(문헌(Baker & Jones, Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 10:219-227, 2007); 문헌(Jaber & Baker, J. Pharma. Biomed. Anal. 43:1256-1261, 2007); 문헌(Jones et al., J. Thrombosis and Haemostasis 3:991-1000, 2005); 및 문헌(Jones et al., J. Interferon Cytokine Res. 24:560-72, 2004) 참조). 전세계 인구에서 발현되는 HLA-DR 동종이형을 대표하는 공여자 풀로부터 PBMC를 단리한다.
도 25에 나타낸 Tn3 단량체를 (GGGGHHHHHHHH 링커-His 태그(서열번호 251)를 갖도록) 발현시키고 정제하고 SEC로 단량체임을 입증하고, 전술된 바와 같이 내독소 제거를 위해 여과하였다. 시험된 모든 비야생형 클론은 사이노몰구스 교차반응성을 향상시키기 위한 조작 라운드로부터 수득되었다(도 22a). 그러나, 이들 클론은 F4mod1 배경(background)에서 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀진 생식세포주에 대한 돌연변이를 가졌다. 생식세포 돌연변이가 결합에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하기 위해 이들 클론을 ELISA에서 시험하였다. T 세포 증식 분석 및 IL-2 분비 분석 둘다에서, 2 초과의 자극 지수(SI)는 주어진 공여자에 대한 양성 반응으로서 이미 확립되어 있었다. 평균 SI 또는 양성 반응 집단의 SI의 평균은 반응의 강도를 표시한다. 강한 반응을 유도하는 것으로 공지된 대조군 단백질인 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 두 분석에 포함시켰다.
표 22는 KLH에 대한 평균 SI보다 유의하게 더 낮고 양성 평균 SI에 대한 2의 컷오프보다 훨씬 더 높지 않은, 모든 시험 단백질에 대한 평균 SI를 보여준다. 추가로, 시험 단백질에 대한 반응 빈도는 매우 낮았다(90% 초과의 반응을 나타내는 대조군을 제외한 모든 시험된 단백질에 대해 10% 이하). 안티토프에 의한 선행 연구는 10% 미만의 에피스크린 반응이 낮은 임상적 면역원성 위험을 표시한다는 것을 보여주었다. 따라서, 시험된 모든 Tn3이 10% 이하의 반응 빈도를 나타낸다는 본 발명자들의 관찰은 임상적 면역원성의 낮은 위험을 표시한다.
안티토프 에피스크린 면역원성 분석의 결과. 시험된 Tn3은 1(가장 높은 면역원성) 내지 4(가장 낮은 면역원성)로 등급이 매겨진다.
평균 SI 반응의 빈도(%)
샘플 증식 IL-2 증식 IL-2 등급
F4mod12 2.82 2.30 4 4 4=
00322S-A07 2.91 2.06 8 8 2
00322S-G09 2.88 2.26 10 10 1
00322V-A10 2.67 2.33 8 6 3=
00322V-F11 3.14 2.37 6 6 3=
야생형 2.05 2.00 6 4 4=
KLH 6.51 3.98 96 92 N/A
실시예 21
비정제된 G6 직렬체 8 Tn3 및 정제된 G6 직렬체 8 Tn3의 응집 상태
다수의 시스테인을 함유하는 단백질, 예를 들면, 내부 이황화 결합을 함유하는 직렬 반복체로 구성된 단백질은 종종 적절한 이황화 결합 쌍 형성을 나타내지 않는다. 이황화 결합의 뒤섞임(Scrambling)은 배지 내로의 발현을 감소시키거나 제거할 수 있다. 상기 단백질은 배지 내로 발현되는 경우, 응집을 초래하는 분자간 이황화 결합 쌍 및 불일치된 분자내 이황화 결합 쌍을 갖는 부적절하게 폴딩된 단백질의 혼합물일 수 있다. 본 발명자들의 SEC 데이터는 세균 발현 배지 중의 대부분의 직렬 단백질이 적절하게 폴딩된 단량체 상태로 존재한다는 것을 보여주었다. Hi 태그 부착된 G6 직렬체 8 단백질의 Ni-NTA 정제 후, 대략 15%의 단백질이 응집되었다. 관찰된 응집은 2 mM DTT를 사용한 환원에 의해 4%까지 감소되었는데(도 26a), 이것은 대부분의 응집이 이황화 결합에 의해 매개되었다는 것을 암시한다. 대부분의 응집체를 전술된 바와 같이 SEC 정제로 제거하였다(도 26b).
실시예 22
콜로205 대장암 이종이식편 모델에서 TRAIL 모방체, G6TN6 및 G6TN8에 의한 종양 성장 억제의 측정
TRAIL Tn3 모방체, G6 직렬체 6(G6TN6)(서열번호 144) 및 G6 직렬체 8(G6TN8)(서열번호 145)의 항종양 활성을 인간 대장암종 이종이식편 모델인 콜로205에서 평가하였다. 콜로205 세포를 37℃에서 5% CO2 하에서 10% 태아소 혈청(FBS) 함유 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지에서 반부착성 단일층 배양물로서 유지하였다. 트립신처리에 의해 회수된 세포를 3x107개 세포/㎖의 최종 농도로 행크의 균형잡힌 염 용액(HBSS)에 재현탁시켰다. 3x106개 콜로205 세포를 무흉선 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리에 각각 피하 주사하였다(SC). 종양의 크기가 평균 약 177 ㎣에 도달하였을 때 연구를 개시하였다. 연구 디자인은 표 23에 요약되어 있다. 20 mM Tris-HCl 및 300 mM 아르기닌-HCl(pH 7)을 함유하는 저장 용액으로부터 TRAIL을 희석하고, 체중(10 ㎖/㎏)에 따라 총 5회 투약을 위해 표 23에 기재된 투여량으로 매일 정맥내 투여하였다(IV). PBS를 함유하는 저장 용액으로부터 G6 직렬체 6(G6TN6) 및 G6 직렬체 8(G6TN8)을 각각 희석하고, 체중(10 ㎖/㎏)에 따라 총 5회 투약을 위해 표 23에 기재된 투여량으로 매일 정맥내 투여하였다(IV). 종양 부피 및 체중 측정을 기록하였다. 전기 칼리퍼(caliper)를 이용하여 종양 측정을 수행하였고, 하기 식을 이용하여 종양 부피(㎣)를 계산하였다: 종양 부피 = [길이(㎜) x 폭(㎜)2]/2. 하기 식을 이용하여 종양 성장 억제(TGI)를 퍼센트 TGI로서 계산하였다: 퍼센트 TGI = (1 - T/C) x 100(이때, T는 마지막 투약 후 처리된 군으로부터의 최종 종양 부피이고, C는 마지막 투약 후 대조군으로부터의 최종 종양 부피임).
투약 주기(DP) 동안(도 27), 3 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏의 G6TN6은 각각 92%(p<0.0001) 및 93%(p<0.0001)의 유의한 TGI를 달성하였다(표 24). 유사하게, 최종 농도에 대한 등몰 조절 후, 2.25 ㎎/㎏ 및 25.5 ㎎/㎏의 G6TN8은 각각 93%(p<0.0001) 및 94%(p<0.0001)의 유의한 TGI를 달성하였다(표 24). 30 ㎎/㎏의 TRAIL은 60%(p<0.001)의 TGI를 달성하였다(표 24).
재성장 주기(RP)의 34일째 날까지(도 27), 3 ㎎/㎏의 G6TN6은 임의의 CR(CR; 2회 연속 측정 동안 검출가능한 감지될 수 있는 종양이 없는 군 내의 마우스의 백분율)을 달성하지 못하였지만, 2.25 ㎎/㎏의 G6TN8은 90% CR을 달성하였다. 보다 높은 투여량인 30 ㎎/㎏의 G6TN6에서 50% CR이 달성되었다. 다른 한편으로, 25.5 ㎎/㎏의 G6TN8은 100%의 CR을 달성하였다(표 25). 상기 두 투여량으로부터의 결과는 G6TN8이 G6TN6에 비해 더 높은 효능을 달성하였다는 것을 암시한다. 그러나, G6TN6 및 G6TN8 둘다가 일정 투여량에서 효능을 보였다. 보다 중요하게는, 상기 구축물 둘다가 임의의 PR 또는 CR을 달성하지 못하는 TRAIL을 유의하게 능가하였다.
도 28에 나타낸 바와 같이, 연구의 투약 주기 및 재성장 주기 동안 모든 투여량에서 G6TN6 및 G6TN8 둘다에 대해 체중 상실이 관찰되지 않았다.
콜로205 종양 이종이식편 모델에서 TRAIL 및 TRAIL 모방체(G6TN6 및 G6TN8)에 대한 연구 디자인
군 시험 물질 투여량
(㎎/㎏) 		투약 부피
(㎖/㎏) 		경로 투약 스케쥴
1 비처리됨 NA NA NA NA
2 PBS NA 10 IV QDX5
3 TRAIL 30 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
4 G6TN6 30 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
5 G6TN6 3 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
6 G6TN8 25.5 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
7 G6TN8 2.25 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
연구의 투약 주기 동안 TGI에 대한 TRAIL 및 TRAIL 모방체(G6TN6 및 G6TN8)의 효과
처리군 % TGI P 값( 비처리된 대조군과 비교됨)
TRAIL 30 ㎎/㎏ 60 P<0.001
G6TN6 30 ㎎/㎏ 93 P<0.0001
G6TN6 3 ㎎/㎏ 92 P<0.0001
G6TN8 25.5 ㎎/㎏ 94 P<0.0001
G6TN8 2.25 ㎎/㎏g 93 P<0.0001
연구의 34일째 날까지 재성장 주기 동안 TGI에 대한 TRAIL 및 TRAIL 모방체(G6TN6 및 G6TN8)의 효과
처리군 PR a (%) CR b (%)
TRAIL - -
G6TN6 30 ㎎/㎏ 50 50
G6TN6 3 ㎎/㎏ 100 -
G6TN8 25.5 ㎎/㎏ - 100
G6TN8 2.25 ㎎/㎏ 10 90
a퍼센트 부분적 퇴행(PR; 종양 부피가 2회 연속 측정 동안 단계 개시 시점에서의 부피의 50% 미만인 군 내의 마우스의 백분율)
b퍼센트 완전한 퇴행(CR; 2회 연속 측정 동안 검출가능한 감지될 수 있는 종양이 없는 군 내의 마우스의 백분율)
상기 제시된 실시예는 본 발명의 다양한 양태 및 본 발명의 방법의 실시를 예시한다. 이들 실시예는 본 발명의 많은 상이한 실시양태의 완전한 설명을 제공하기 위한 것이 아니다. 따라서, 본 발명이 명확한 이해를 목적으로 예증 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있다 하더라도, 당업계에서 통상의 기술을 가진 자는 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 많은 변화 및 변형을 달성할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 본원에 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 기재되는 것과 동일한 정도로 본 명세서 내로 참고로 도입된다.
상기 실시예는 본 발명의 다양한 양태 및 본 발명의 방법의 실시를 예시한다. 상기 실시예는 본 발명의 많은 상이한 실시양태의 완전한 설명을 제공하기 위한 것이 아니다. 따라서, 상기 본 발명이 명확한 이해를 목적으로 예증 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있다 하더라도, 당업계에서 통상의 기술을 가진 자는 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 많은 변화 및 변형을 달성할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 본원에 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 기재되는 것과 동일한 정도로 본 명세서 내로 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> BACA, MANUEL THISTED, THOMAS SWERS, JEFFREY TICE, DAVID <120> TRAIL R2-SPECIFIC MULTIMERIC SCAFFOLDS <130> TN3TR-100US1 <140> 13/639,381 <141> 2012-12-06 <150> PCT/US11/32188 <151> 2011-04-12 <150> 61/323,708 <151> 2010-04-13 <160> 251 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Disulfide-bonded variant polypeptide <400> 1 Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe 1 5 10 15 Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys 20 25 30 Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn 35 40 45 Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser 50 55 60 Leu Ile Cys Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Thr <210> 2 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Disulfide-bonded variant polypeptide <400> 2 Ile Glu Val Lys Asp 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Ser Pro Ser 20 25 30 Val Glu Gly Ser Ser Thr Glu Leu Asn Leu Pro Glu Thr Ala Asn Ser 35 40 45 Val Thr Leu Ser Asp Leu Gln Pro Gly Val Gln Tyr Asn Ile Thr Ile 50 55 60 Tyr Ala Val Glu Glu Asn Gln Glu Ser Thr Pro Val Val Ile Gln Gln 65 70 75 80 Glu Thr <210> 7 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Pro Tyr Asn Thr Glu Val Thr Glu Thr Thr Ile Val Ile Thr Trp Thr 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ile Gly Phe Lys Leu Gly Val Arg Pro Ser Gln Gly 20 25 30 Gly Glu Ala Pro Arg Glu Val Thr Ser Asp Ser Gly Ser Ile Val Val 35 40 45 Ser Gly Leu Thr Pro Gly Val Glu Tyr Val Tyr Thr Ile Gln Val Leu 50 55 60 Arg Asp Gly Gln Glu Arg Asp Ala Pro Ile Val Asn Lys Val Val Thr 65 70 75 80 <210> 8 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val Ser Leu Thr Gly 1 5 10 15 Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro Arg Asn Ala Asp 20 25 30 Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu Gln Tyr Lys Glu 35 40 45 Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile Leu 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Val Thr Ile Leu His Lys Gly Phe Ser 50 55 60 Ala Ser Val Arg Thr Ile Leu Gln Asn Asp His Ser Leu Leu Ala Ser 65 70 75 80 Ser Trp Ala Ser Ala Glu Leu His Ala 85 <210> 11 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Ser Val Thr Asp Val Thr Thr Ser Ser Leu Arg Leu Asn Trp Glu 1 5 10 15 Ala Pro Pro Gly Ala Phe Asp Ser Phe Leu Leu Arg Phe Gly Val Pro 20 25 30 Ser Pro Ser Thr Leu Glu Pro His Pro Arg Pro Leu Leu Gln Arg Glu 35 40 45 Leu Met Val Pro Gly Thr Arg His Ser Ala Val Leu Arg Asp Leu Arg 50 55 60 Ser Gly Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Leu Tyr Gly Leu Arg Gly Pro His 65 70 75 80 Lys Ala Asp Ser Ile Gln Gly Thr Ala Arg Thr 85 90 <210> 12 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Arg Ala Leu Asn Leu Thr Glu Gly Phe Ala Val Leu His Trp Lys 1 5 10 15 Pro Pro Gln Asn Pro Val Asp Thr Tyr Asp Ile Gln Val Thr Ala Pro 20 25 30 Gly Ala Pro Pro Leu Gln Ala Glu Thr Pro Gly Ser Ala Val Asp Tyr 35 40 45 Pro Leu His Asp Leu Val Leu His Thr Asn Tyr Thr Ala Thr Val Arg 50 55 60 Gly Leu Arg Gly 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Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe 1 5 10 15 Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Gln Leu Thr Tyr Gly Ile Lys 20 25 30 Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asn Leu Thr Glu Asp Glu Asn 35 40 45 Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser 50 55 60 Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Gln Thr 65 70 75 80 Phe Thr Thr <210> 20 <211> 91 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 <400> 20 Pro Ala Ile Ser Asn Val Arg Val Ser Asp Val Thr Asn Ser Ser Ala 1 5 10 15 Thr Ile Arg Trp Asp Val Ser Leu Ala Ala Asn Asn Arg Val Leu Phe 20 25 30 Ser Thr Asn Ser Asp Leu Ser Ser Pro Gln Trp Ser Ala Trp Asp Asn 35 40 45 Ser Thr Asp Ser Pro Met Ile Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ala Gly Thr 50 55 60 Ala Tyr Tyr Phe Ser Val Tyr Ser Phe Arg Pro Asp Asn Ala Ser Leu 65 70 75 80 Tyr Ser Asn Ser Ser Ile Met Ser Phe Thr Thr 85 90 <210> 21 <211> 94 <212> PRT <213> Staphylothermus marinus F1 <400> 21 Ser Glu Pro Gln Asn Leu Lys Ala Thr Ala Gly Asn Asn Asn 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Synthetic Linker peptide <400> 88 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 <210> 89 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 89 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gly Ser Ala Met 1 5 10 15 Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 20 <210> 90 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 90 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln 1 5 10 <210> 91 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 91 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Leu Asp Ala Pro Gly Gln 20 <210> 92 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 92 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln 20 25 30 <210> 93 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 93 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln 35 40 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 94 Thr Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln 1 5 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 95 Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln 1 5 10 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Linker peptide <400> 96 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly 1 5 10 15 Gln <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 97 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly 1 5 10 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 98 Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly 1 5 10 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 99 Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly 1 5 10 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 100 His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly 1 5 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 101 Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly 1 5 10 <210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 102 Gln Gln Lys His Thr Ala 1 5 <210> 103 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 103 Asn Ser Arg His Thr Ala 1 5 <210> 104 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 104 Pro Asp His Phe His Asn 1 5 <210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 105 Tyr Asp Val Ala Phe Asp 1 5 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 106 Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 107 Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 108 Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala 1 5 10 <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 109 Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 110 Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Loop peptide <400> 111 Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 112 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 112 ggcgctaggc tgagtaggtc ctggagtgcg gccatggcca gcgggggcgg agggagtgcc 60 attgaagtga aagatgtgac cgatacc 87 <210> 113 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 113 cctcagccga tcaccacctg aaggctacgc aggtaccgct accgccacct ccgctcccac 60 cgccaccggt ggtaaaggtt tc 82 <210> 114 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 114 ggcgctaggc tgagtaggtc ctggagtgcg g 31 <210> 115 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 115 cctcagccga tcaccacctg aaggctacgc agg 33 <210> 116 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 116 gggatccgct acgggccact cgatcgaggt ccgtgctgat cgagcgatcg gtaccctggg 60 ccatcatcat catcatcacc accactgag 89 <210> 117 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 117 aattctcagt ggtggtgatg atgatgatga tggcccaggg taccgatcgc tcgatcagca 60 cggacctcga tcgagtggcc cgtagcggat cccgtac 97 <210> 118 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 118 ggcgctaggc tgagtaggtc ctggggatcc gccatggcca gc 42 <210> 119 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 119 ggcgctaggc tgagtaggtc ctggctagct gccatggcca gc 42 <210> 120 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 120 cctcagccga tcaccacctg aaggcggcgc cggtacc 37 <210> 121 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 121 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcgga ggttcacgct tggatgcccc cgggcagatt 60 gaagtgaaag atgtgaccga t 81 <210> 122 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 122 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcgga ggttcaggtg gcggaggttc aggtggcgga 60 ggttcacgct tggatgcccc cgggcagatt gaagtgaaag atgtgaccga t 111 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 123 ctgcagtggt aaaggtttct ttcg 24 <210> 124 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 124 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcggg ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg 60 ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg ggtagccgct tggatgcccc cgggca 116 <210> 125 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 125 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcggg ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg 60 ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg 120 ggtagccgct tggatgcccc cgggca 146 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 126 aaagaaacct ttaccactgc aggt 24 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 127 ttcaatctgc ccgggggcat ccaa 24 <210> 128 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 128 aaagaaacct ttaccaccac gcgtttggat gcccccgggc agattgaagt gaaagatgtg 60 accgat 66 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 129 cgtggtggta aaggtttctt tcg 23 <210> 130 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 130 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcgga ggttcaggtg gcggaggttc acgcttggat 60 gcccccgggc agattgaagt gaaagatgtg accgat 96 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Cys Glu Leu Ala Tyr Gly Ile 1 5 <210> 132 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 132 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly Cys 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 134 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn 65 70 75 80 Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 135 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 135 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 180 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly Cys Glu Leu Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu 35 40 45 Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr 50 55 60 Glu Val Ser Leu Ile Cys Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala 65 70 75 80 Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His His 85 90 95 His His His His 100 <210> 181 <211> 319 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser 1 5 10 15 Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly 20 25 30 Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp 35 40 45 Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu 50 55 60 Val Ser Leu Ile Cys Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala Lys 65 70 75 80 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp 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Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala 210 215 220 Leu Ile Thr Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly 225 230 235 240 Cys Glu Leu Ala Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr 245 250 255 Ile Asp Leu Gln Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys 260 265 270 Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly 275 280 285 Met Arg Ser Lys Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Lys 305 310 315 320 Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ala Lys Pro Trp Val 325 330 335 Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala Tyr Gly Ile Lys Asp 340 345 350 Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Gln Gln Lys His Thr Ala 355 360 365 Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu 370 375 380 Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala Lys Glu Thr 385 390 395 400 Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gly 405 410 415 Ser Ala Met Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Lys Asp 420 425 430 Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp 435 440 445 Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala Tyr Gly Ile Lys Asp Val 450 455 460 Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Gln Gln Lys His Thr Ala Tyr 465 470 475 480 Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile 485 490 495 Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala Lys Glu Thr Phe 500 505 510 Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 515 520 525 Ser Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 530 535 540 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 545 550 555 560 Ala Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu 565 570 575 Gln Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 580 585 590 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser 595 600 605 Lys Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 610 615 620 Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly His His His His His His His His 625 630 635 <210> 193 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 193 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg 65 70 75 80 Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 194 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 194 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser 65 70 75 80 Arg Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu Gly Thr Leu Gly His 85 90 95 His His His His His His His 100 <210> 195 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Arg Ser Ser Arg 65 70 75 80 Arg Ile Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 196 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Gly Gln Pro Trp Val Ser Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu His Ser Arg 65 70 75 80 Leu Thr Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 197 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Arg Lys Ser Gln 65 70 75 80 Pro Thr Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 198 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Met Lys Ser Lys 65 70 75 80 Pro Ser Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 199 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Gly Lys Ser Arg 65 70 75 80 Pro Thr Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 200 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly His Ser Thr His 65 70 75 80 Pro Val Lys Gly Thr Phe Thr Thr 85 <210> 201 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly 20 25 30 Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp 35 40 45 Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu 50 55 60 Val Ser Leu Ile Cys Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys 65 70 75 80 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu 85 <210> 202 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg 65 70 75 80 Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly 85 90 <210> 203 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu Gln 35 40 45 Gln Lys His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg 65 70 75 80 Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly 85 90 <210> 204 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser 65 70 75 80 Arg Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu 85 90 <210> 205 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Pro Trp Val Ser Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu His Ser 65 70 75 80 Arg Leu Thr Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu 85 90 <210> 206 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Arg Lys Ser 65 70 75 80 Gln Pro Thr Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu 85 90 <210> 207 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Gly Lys Ser 65 70 75 80 Arg Pro Thr Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu 85 90 <210> 208 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Met Lys Ser 65 70 75 80 Lys Pro Ser Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu 85 90 <210> 209 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser 65 70 75 80 Arg Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 210 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 210 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 211 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 8xHis tag <400> 211 His His His His His His His His 1 5 <210> 212 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> misc_feature <222> (6)..(9) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> misc_feature <222> (11)..(14) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> misc_feature <222> (16)..(19) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> misc_feature <222> (21)..(24) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> misc_feature <222> (26)..(29) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> misc_feature <222> (31)..(34) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> This sequence may encompass 1-7 "Gly-sub.x-Ser" repeating units, wherein some positions may be absent <400> 212 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 213 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(10) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(41) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> Asp or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(52) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(63) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> Glu or Gly <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 213 Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr 20 25 30 Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Xaa Leu Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 50 55 60 Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Lys Xaa Thr Phe Thr Thr 85 <210> 214 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 214 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 215 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(10) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(41) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(52) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(63) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 215 Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr 20 25 30 Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 50 55 60 Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 216 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(6) <223> Asn, Asp, His, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Ala, Pro or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser, Thr, Ala or Gly <400> 216 Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(8) <223> Asn, Asp, His, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Ala, Pro or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ser, Thr, Ala or Gly <400> 217 Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 218 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ala or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(8) <223> Any amino acid <400> 218 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 219 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro, Ser or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(9) <223> Any amino acid <400> 219 Ser Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gly 1 5 10 <210> 220 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Pro, Gln or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(6) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Asn or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <400> 220 Ala Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Gly 1 5 10 <210> 221 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(10) <223> Any amino acid and this sequence may encompass 6-10 residues, wherein some positions may be absent <400> 221 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 222 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(6) <223> Any amino acid <400> 222 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 223 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Asn, Asp, His, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Ala, Pro or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asn, Lys, Arg, Asp, Glu or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asn, Asp, His, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Ala, Pro or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Asn, Asp, His, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Ala, Pro or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ile, Thr, Ser, Val, Ala or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Asn, Asp, His, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Ala, Pro or Ser <400> 223 Xaa Xaa Leu Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asn, Thr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(8) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ser or Ala <400> 224 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(9) <223> Any amino acid <400> 225 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 226 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asn, Thr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser or Gly <400> 226 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 227 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asn, Thr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(7) <223> Any amino acid <400> 227 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Ser Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 228 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 228 His His His His His His 1 5 <210> 229 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(10) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(41) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(52) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(63) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 229 Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr 20 25 30 Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 50 55 60 Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 230 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 230 Ile Thr Ile Ser Trp 1 5 <210> 231 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> This sequence may encompass 1-7 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units, wherein some positions may be absent <400> 231 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 232 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 232 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 233 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(17) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(48) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(59) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(70) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(120) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (141)..(141) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(151) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (157)..(162) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(173) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 233 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu 100 105 110 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val 165 170 175 Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 180 185 190 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Leu Gly His His His His His His His His 210 215 <210> 234 <211> 322 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(17) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(48) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(59) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(70) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(120) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (141)..(141) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(151) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (157)..(162) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(173) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (217)..(223) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (229)..(240) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (229)..(240) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (244)..(244) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (248)..(254) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (260)..(265) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (269)..(276) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (284)..(294) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (284)..(294) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 234 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu 100 105 110 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val 165 170 175 Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 180 185 190 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 210 215 220 Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr 245 250 255 Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly His His His His His His 305 310 315 320 His His <210> 235 <211> 639 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(17) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(48) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(59) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(70) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(120) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (141)..(141) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(151) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (157)..(162) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(173) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (217)..(223) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (229)..(240) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (229)..(240) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (244)..(244) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (248)..(254) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (260)..(265) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (269)..(276) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (284)..(294) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (284)..(294) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (320)..(326) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (332)..(343) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (332)..(343) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (347)..(347) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (351)..(357) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (363)..(368) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (372)..(379) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (387)..(397) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (387)..(397) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (431)..(437) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (443)..(454) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (443)..(454) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (458)..(458) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (462)..(468) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (474)..(479) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (483)..(490) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (498)..(508) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (498)..(508) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (534)..(540) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (546)..(557) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (546)..(557) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (561)..(561) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (565)..(571) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (577)..(582) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (586)..(593) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (601)..(611) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (601)..(611) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 235 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu 100 105 110 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val 165 170 175 Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 180 185 190 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 210 215 220 Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr 245 250 255 Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 325 330 335 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu 370 375 380 Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr 385 390 395 400 Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gly 405 410 415 Ser Ala Met Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 465 470 475 480 Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile 485 490 495 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe 500 505 510 Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 515 520 525 Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr 530 535 540 Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu 545 550 555 560 Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu 565 570 575 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 580 585 590 Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 595 600 605 Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 610 615 620 Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly His His His His His His His His 625 630 635 <210> 236 <211> 845 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(17) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(34) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(48) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(59) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(70) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(88) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(120) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (141)..(141) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(151) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (157)..(162) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(173) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (217)..(223) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (229)..(240) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (229)..(240) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (244)..(244) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (248)..(254) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (260)..(265) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (269)..(276) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (284)..(294) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (284)..(294) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (320)..(326) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (332)..(343) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (332)..(343) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (347)..(347) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (351)..(357) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (363)..(368) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (372)..(379) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (387)..(397) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (387)..(397) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (431)..(437) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (443)..(454) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (443)..(454) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (458)..(458) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (462)..(468) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (474)..(479) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (483)..(490) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (498)..(508) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (498)..(508) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (534)..(540) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (546)..(557) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (546)..(557) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (561)..(561) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (565)..(571) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (577)..(582) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (586)..(593) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (601)..(611) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (601)..(611) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (637)..(643) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (649)..(660) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (649)..(660) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (664)..(664) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (668)..(674) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (680)..(685) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (689)..(696) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (704)..(714) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (704)..(714) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (740)..(746) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (752)..(763) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (752)..(763) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (767)..(767) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (771)..(777) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (783)..(788) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (792)..(799) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (807)..(817) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (807)..(817) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 236 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu 100 105 110 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val 165 170 175 Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 180 185 190 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 210 215 220 Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr 245 250 255 Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 325 330 335 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu 370 375 380 Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr 385 390 395 400 Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gly 405 410 415 Ser Ala Met Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 465 470 475 480 Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile 485 490 495 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe 500 505 510 Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 515 520 525 Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr 530 535 540 Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu 545 550 555 560 Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu 565 570 575 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 580 585 590 Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 595 600 605 Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 610 615 620 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa 625 630 635 640 Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 645 650 655 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 660 665 670 Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile 675 680 685 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa 690 695 700 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr 705 710 715 720 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 725 730 735 Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa 740 745 750 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr 755 760 765 Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa 770 775 780 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 785 790 795 800 Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 805 810 815 Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 820 825 830 Ser Gly Thr Leu Gly His His His His His His His His 835 840 845 <210> 237 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(10) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(27) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(41) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(52) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(63) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(81) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 237 Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr 20 25 30 Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 50 55 60 Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 85 90 95 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 100 105 110 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 115 120 125 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 130 135 140 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 145 150 155 160 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 165 170 175 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 180 185 190 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 195 200 205 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 210 215 220 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 225 230 235 240 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 245 250 255 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 260 265 270 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 275 280 285 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 290 295 300 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 305 310 315 320 Lys <210> 238 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(20) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(37) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(37) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(51) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(62) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(73) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(91) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(91) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (117)..(123) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (129)..(140) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (129)..(140) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (144)..(144) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (148)..(154) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (160)..(165) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (169)..(176) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (184)..(194) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (184)..(194) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 238 Ala Met Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser 50 55 60 Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr 85 90 95 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 130 135 140 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Gly Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 239 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(20) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(37) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(37) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(51) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(62) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(73) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(91) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(91) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (117)..(123) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (129)..(140) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (129)..(140) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (144)..(144) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (148)..(154) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (160)..(165) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (169)..(176) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (184)..(194) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (184)..(194) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (220)..(226) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (232)..(243) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (232)..(243) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (247)..(247) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (251)..(257) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (263)..(268) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (272)..(279) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (287)..(297) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (287)..(297) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (323)..(329) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (335)..(346) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (335)..(346) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (350)..(350) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (354)..(360) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (366)..(371) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (375)..(382) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (390)..(400) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (390)..(400) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 239 Ala Met Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser 50 55 60 Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr 85 90 95 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 130 135 140 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile 305 310 315 320 Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa 325 330 335 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly 340 345 350 Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu 370 375 380 Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 385 390 395 400 Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 405 410 415 Gly Thr Gly Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 420 425 430 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 435 440 445 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 450 455 460 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 465 470 475 480 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 485 490 495 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 500 505 510 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 515 520 525 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 530 535 540 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 545 550 555 560 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 565 570 575 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 580 585 590 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 595 600 605 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 610 615 620 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 625 630 635 640 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 645 650 <210> 240 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(12) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(29) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(29) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(43) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(54) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (58)..(65) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(83) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(83) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 240 Ser Gln Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu 20 25 30 Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ser 85 90 95 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 100 105 110 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 115 120 125 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 130 135 140 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 145 150 155 160 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 165 170 175 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 180 185 190 Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 195 200 205 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 210 215 220 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 225 230 235 240 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 245 250 255 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 260 265 270 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 275 280 285 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 290 295 300 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 305 310 315 320 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 325 330 335 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 340 345 350 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 355 360 365 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 370 375 380 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 385 390 395 400 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 405 410 415 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 <210> 241 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(12) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(29) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(29) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(43) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(54) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (58)..(65) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(83) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(83) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 241 Ser Gln Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu 20 25 30 Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Pro Thr Arg 85 90 95 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 100 105 110 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 115 120 125 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 130 135 140 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 145 150 155 160 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 165 170 175 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 180 185 190 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 195 200 <210> 242 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 242 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 243 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(111) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (117)..(128) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (117)..(128) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (132)..(132) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (136)..(142) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (148)..(153) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (157)..(164) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (172)..(182) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (172)..(182) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 243 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Ala Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu 85 90 95 Asp Ala Pro Gly Gln Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 100 105 110 Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr 130 135 140 Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr 180 185 190 Leu Gly His His His His His His His His 195 200 <210> 244 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(120) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (141)..(141) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(151) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (157)..(162) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(173) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 244 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln Ile Glu 100 105 110 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val 165 170 175 Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 180 185 190 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His His His 195 200 205 His His His 210 <210> 245 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (124)..(130) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (136)..(147) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (136)..(147) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (151)..(151) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (155)..(161) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (167)..(172) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (176)..(183) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (191)..(201) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (191)..(201) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 245 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly 195 200 205 Gly Gly Thr Leu Gly His His His His His His His His 210 215 220 <210> 246 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (134)..(140) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (146)..(157) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (146)..(157) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (161)..(161) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (165)..(171) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (177)..(182) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (186)..(193) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (201)..(211) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (201)..(211) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 246 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro 115 120 125 Gly Gln Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr 130 135 140 Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu 145 150 155 160 Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His 210 215 220 His His His His His His His 225 230 <210> 247 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (100)..(106) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (112)..(123) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (112)..(123) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (127)..(127) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (131)..(137) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (143)..(148) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (152)..(159) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (167)..(177) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (167)..(177) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 247 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Thr Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr 115 120 125 Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 145 150 155 160 Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His 180 185 190 His His His His His 195 <210> 248 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(110) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(127) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(127) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (131)..(131) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (135)..(141) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (147)..(152) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (156)..(163) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (171)..(181) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (171)..(181) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 248 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp 85 90 95 Ala Pro Gly Gln Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu 100 105 110 Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 115 120 125 Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile 130 135 140 Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu 180 185 190 Gly His His His His His His His His 195 200 <210> 249 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (109)..(115) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (121)..(132) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (121)..(132) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (136)..(136) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (140)..(146) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (152)..(157) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (161)..(168) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (176)..(186) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (176)..(186) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 249 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr 180 185 190 Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His His His His His His 195 200 205 <210> 250 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(11) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(28) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(42) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(53) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(64) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(82) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(120) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr" <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequences "Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly," "Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly," "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly," <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(137) <223> continued from above, "His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly," "Ile Pro Pro His Asn Ala Asp Ser Ser Ile Ile Gly" or "Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Pro Pro Leu Trp," wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (141)..(141) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(151) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg" <220> <221> MOD_RES <222> (157)..(162) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gln Gln Lys His Thr Ala," "Thr Glu Asp Glu Asn Gln," "Asn Ser Arg His Thr Ala," "Pro Asp His Phe His Asn," "Tyr Asp Val Ala Phe Asp" or "Gln Gln Lys His Asn Gln" <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(173) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu" <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> Any amino acid and this region may preferably comprise the sequence "Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," "Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala," "Phe Asp Pro Tyr Gly Met Arg Ser Lys Pro Ala," "Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn Pro Ala," <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(191) <223> continued from above, "Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala," "Asp Thr Phe Tyr Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala" "Phe Asp Pro Tyr Asn Lys Arg Asn Val Pro Ala" or "Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Pro Ala," wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 250 Ala Ile Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa 20 25 30 Tyr Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Gly Gln Ile Glu 100 105 110 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ile Thr Trp Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Tyr Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Val 165 170 175 Ser Leu Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 180 185 190 Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His His His 195 200 205 His His His 210 <210> 251 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 251 Gly Gly Gly Gly His His His His His His His His 1 5 10

Claims (61)

  1. 2개 이상의 TRAIL R2 특이적 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함하는 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드로서,
    (a) 각각의 Tn3 단량체 스캐폴드는 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역으로 연결되는 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하고,
    (i) AB 루프는 서열번호 35이고, BC 루프는 서열번호 97이고, CD 루프는 서열번호 37이고, DE 루프는 서열번호 179이고, EF 루프는 서열번호 39이고, FG 루프는 서열번호 170이거나,
    (ii) AB 루프는 서열번호 35이고, BC 루프는 서열번호 97이고, CD 루프는 서열번호 37이고, DE 루프는 서열번호 102이고, EF 루프는 서열번호 39이고, FG 루프는 서열번호 106이거나,
    (iii) AB 루프는 서열번호 35이고, BC 루프는 서열번호 97이고, CD 루프는 서열번호 37이고, DE 루프는 서열번호 102이고, EF 루프는 서열번호 39이고, FG 루프는 서열번호 108이거나,
    (iv) AB 루프는 서열번호 35이고, BC 루프는 서열번호 97이고, CD 루프는 서열번호 37이고, DE 루프는 서열번호 102이고, EF 루프는 서열번호 39이고, FG 루프는 서열번호 170이며,
    각각의 Tn3 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열(서열번호 213)을 포함하며,
    IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIX2L(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKX3TFTT
    상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내며, X2는 아미노산 잔기 D 또는 G를 나타내고, X3은 아미노산 E 또는 G를 나타내며, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이고,
    (b) Tn3 단량체 스캐폴드는 7개의 베타 가닥 도메인 중 임의의 2개의 베타 가닥 도메인을 연결하기 위해 하나 이상의 이황화 결합을 포함하며,
    (c) 모든 Tn3 단량체 스캐폴드는 선형의 직렬 포맷(tandem format)으로 연결되어 있으며,
    (d) 재조합 다량체 스캐폴드는 TRAIL R2에 특이적으로 결합한다.
  2. 제1항에 있어서, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 Tn3 단량체 스캐폴드를 포함하는 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  3. 제1항에 있어서, 2개 이상의 Tn3 단량체 스캐폴드가 링커에 의해 연결되어 있는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  4. 제3항에 있어서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  5. 제4항에 있어서, 펩티드 링커가 (GxS)y 서열을 포함하고, 여기서 x 및 y가 정수이며, x가 1, 2, 3 또는 4이고, y가 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7(서열번호 212)인 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  6. 제5항에 있어서, 펩티드 링커가 Gly4Ser(서열번호 210)인 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  7. 제1항에 있어서, Tn3 단량체 스캐폴드 중 하나 이상이 이종 모이어티에 융합되어 있는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  8. 제7항에 있어서, 이종 모이어티가 단백질, 펩티드, 단백질 도메인, 링커, 약물, 독소, 세포독성제, 조영제, 방사성핵종, 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 바이오틴, 인간 혈청 알부민(HSA), HSA FcRn 결합 부분, 항체, 항체의 도메인, 항체 단편, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨, 및 상기 모이어티들 중 2 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 포함하는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  9. 제8항에 있어서, 스캐폴드가 PEG에 접합되어 있는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  10. 제9항에 있어서, PEG가 N-말단 또는 C-말단에서 스캐폴드에 접합되어 있는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 작용제(agonist)인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 202, 서열번호 203, 서열번호 204, 서열번호 209 또는 서열번호 167을 포함하는 것인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TRAIL R2가 인간 TRAIL R2인 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드.
  14. 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 TRAIL R2 특이적 재조합 다량체 스캐폴드를 포함하는, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료용 또는 예방용 조성물.


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