KR20130056870A - 피브로넥틴 ⅲ형 도메인에 기초한 다량체 스캐폴드 - Google Patents

피브로넥틴 ⅲ형 도메인에 기초한 다량체 스캐폴드 Download PDF

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KR20130056870A
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Abstract

본 발명은 1개 이상의 특이적 표적 항원에 특이적으로 결합하는 피브로넥틴 III형(Fn3)에 기초한 다량체 스캐폴드(scaffold)를 제공한다. 추가로, 본 발명은 2개 이상의 표적 항원에 동시적으로 결합하는 이중특이적 Fn3 유래의 결합 분자, 융합체, 접합체, 및 Fn3에 기초한 결합 분자의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 나아가, 본 발명은 Fn3에 기초한 다량체 스캐폴드를 함유하는 예방제, 치료제 또는 진단제에 관한 것이다.

Description

피브로넥틴 Ⅲ형 도메인에 기초한 다량체 스캐폴드{FIBRONECTIN TYPE III DOMAIN-BASED MULTIMERIC SCAFFOLDS}
서열목록에 대한 참조
본원은 2011년 4월 12일자로 생성되고 크기가 221 킬로바이트인 텍스트 파일(파일명: "2943.011PC01_sequence_listing.txt")로서 EFS-웹을 통해 본원과 함께 제출된 서열목록을 참고로 포함한다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 항체 모방체(mimetics)의 분야, 구체적으로 예를 들면, 신규 결합 특성을 갖는 생성물의 발생에 유용한 피브로넥틴 III형(Fn3) 도메인에 기초한 다량체 스캐폴드(scaffold)에 관한 것이다.
원하는 표적 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 생체분자는 치료, 연구 및 의학적 진단 수단으로서 매우 중요하다. 이러한 부류의 분자의 잘 공지된 일례는 항체이다. 거의 모든 구조 에피토프에 특이적 및 친화적으로 결합하는 항체가 선택될 수 있다. 그러나, 고전적인 항체는 단순한 진핵 시스템에서 발현시키기 어려운 구조적으로 복잡한 이종사량체 분자이다. 그 결과, 대부분의 항체를 복잡하고 값비싼 포유동물 세포 발현 시스템을 사용하여 생성한다.
통상적으로 단백질 스캐폴드로서 지칭되는, 상대적으로 정의된 3차원적 구조를 갖는 단백질은 조작된 생성물의 디자인을 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 이들 스캐폴드는 전형적으로 특이적 또는 무작위적 서열 변이가 잘 일어날 수 있는 1개 이상의 영역을 함유하고, 종종 이러한 서열 무작위화를 수행하여 단백질의 라이브러리(이로부터 원하는 생성물이 선택될 수 있음)를 생성한다.
이러한 스캐폴드가 유용한 한 구체적인 분야는 항체 모방체 디자인 분야이다. 항체 모방체, 즉 작은 비항체 단백질 치료제는 단점들 중 일부, 예컨대, 항체 단편이 응집되어 전장 IgG보다 덜 안정한 상태가 되는 경향을 피하면서 항체 및 항체 단편의 이점, 예컨대, 표적의 높은 친화성(affinity) 결합, 및 낮은 면역원성 및 독성을 이용한다.
이들 단점은 항체 천연 폴드(fold)의 일부의 제거에 의해 생성된 항체 단편의 사용에 의해 해결될 수 있다. 그러나, 이것은 통상적으로 소수성 환경, 예컨대, 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 계면에 묻힐 아미노산 잔기가 용매에 노출되게 되는 경우 종종 응집을 야기한다.
스캐폴드에 기초한 항체 모방체의 일례는 종족 및 단백질 부류에 걸쳐 넓게 발견되는, 예컨대, 포유동물 혈액 및 구조 단백질에서 발견되는 도메인인 III형의 피브로넥틴 모듈(FnIII)의 구조에 기초한다. FnIII 도메인은 피브로넥틴, 테나신(tenascin), 세포내 세포골격 단백질, 사이토킨 수용체 및 원핵 효소를 포함하는 다양한 단백질에서 종종 발견된다(Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8990-8894, 1992; Bork et al., Nature Biotechnol. 15:553-557, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659-15665, 1990). 국제특허공보 제WO2009/058379호는 FnIII 도메인, 구체적으로 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인에 기초한 스캐폴드를 기술한다. FnIII 도메인은 N 말단부터 C 말단까지 A, B, C, D, E, F 및 G 가닥으로 명명된 7개의 베타 가닥(각각의 가닥은 루프 영역에 의해 분리되고, 이때 상기 루프 영역은 N 말단부터 C 말단까지 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프로 명명됨)을 포함한다. FnIII 도메인은 면역글로불린이 아니지만, 인간 테나신 C 도메인의 제3 FnIII 도메인의 전체 폴드는 가장 작은 기능성 항체 단편, 즉 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 유닛(unit)을 포함하는 중쇄의 가변 영역의 전체 폴드와 밀접하게 관련되어 있다. 이것은 3개의 피브로넥틴 루프를 FnIII 도메인의 각각의 반대면 상에 표시하는 것, 예를 들면, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인을 천연 항체 내의 CDR의 배향과 유사한 상대적 배향으로 표시하는 것을 가능하게 한다.
다양한 치료적 및 진단적 적용을 위한, 증가된 특이성, 친화성, 친화력(avidity) 및 안정성을 나타내는 개선된 안정한 인공 항체 유사 분자뿐만 아니라 이러한 분자를 확인하는 스크리닝 방법을 개발할 필요성이 있다.
본원에서 참고문헌의 인용 또는 논의는 이러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라는 것을 인정하는 취지로서 간주되어서는 안 된다.
본 발명의 요약
본 발명은 1개 이상의 관심있는 FnIII 도메인(FOI)으로부터 유래된 2개의 피브로넥틴 III형(FnIII) 단량체 스캐폴드를 포함하는 재조합 다량체 스캐폴드로서, 이때 (a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드가 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고, (b) 상기 FnIII 단량체 스캐폴드가 직렬(tandem)로 연결되어 있고, 이때 상기 단량체들 중 1개 이상의 단량체가 비천연(non-naturally occurring) 분자내 이황화 결합을 포함하고, (c) 상기 재조합 다량체 스캐폴드가 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고, (d) 상기 표적에 대한 작용이 동족(cognate) FnIII 단량체 스캐폴드의 작용에 비해 개선되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드를 제공한다.
또한, 본 발명은 1개 이상의 관심있는 FnIII 도메인(FOI)으로부터 유래된 3개의 피브로넥틴 III형(FnIII) 단량체 스캐폴드를 포함하는 재조합 다량체 스캐폴드로서, 이때 (a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드가 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고, (b) 상기 재조합 다량체 FnIII 스캐폴드가 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고, (c) 상기 표적에 대한 작용이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 작용에 비해 개선되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드 내의 모든 FnIII 단량체 스캐폴드는 직렬로 존재한다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 몇몇 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 표적에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 직접적으로, 링커(linker)에 의해, 또는 이종 모이어티(moiety)에 의해 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 다른 FnIII 단량체 스캐폴드에 연결되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하고, 몇몇 실시양태에서 이들 FnIII 단량체 스캐폴드는 모두 직렬로 존재할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 링커에 의해 연결되어 있다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 상기 FnIII 단량체 스캐폴드 사이에 개재된 링커 없이 직접적으로 연결되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에서 복수의 베타 가닥은 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에서 복수의 루프 영역은 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 동족 FnIII 단량체 스캐폴드에 비해 결합 면에서 개선되어 있고, 이때 상기 개선은 결합 친화성에서의 개선 및/또는 친화력에서의 개선이다.
몇몇 실시양태에서, 표적에 대한 결합 친화성 및 단백질 안정성은 동족 FnIII 단량체 스캐폴드에 비해 상기 다량체 스캐폴드에서 개선되어 있다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드의 표적에 대한 결합 친화력 및 단백질 안정성은 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 표적에 대한 결합 친화력 및 단백질 안정성에 비해 개선된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 2개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드는 펩티드 링커를 포함한다. 상기 펩티드 링커는 유연성 펩티드 링커일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 링커는 몇몇 경우 면역글로불린 또는 이의 단편일 수 있는 기능성 모이어티를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 이종 모이어티, 예컨대, 단백질, 펩티드, 단백질 도메인, 링커, 약물, 독소, 세포독성제, 조영제, 방사성핵종, 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 바이오틴, 인간 혈청 알부민(HSA), HSA FcRn 결합 부분, 항체, 항체의 도메인, 항체 단편, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨, 또는 상기 모이어티들 중 2 이상의 조합에 융합되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 2개 초과의 FnIII 단량체 스캐폴드는 링커에 의해 연결되어 있고, 1개 이상의 링커가 다른 링커와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상이하다. 다른 실시양태에서, 다량체 FnIII 스캐폴드 내의 FnIII 단량체 스캐폴드는 분지된 포맷(format)으로 연결되어 있다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 몇몇 FnIII 단량체 스캐폴드는 선형 직렬 포맷으로 연결되어 있고, 몇몇 FnIII 단량체 스캐폴드는 분지된 포맷으로 연결되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 동일한 반면, 몇몇 다른 실시양태에서 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 상이하다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드는 수용체 작용제(agonist)이다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드는 수용체 길항제이다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 동일한 에피토프에서 동일한 표적에 결합한다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 상이한 에피토프에서 동일한 표적에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 상이한 에피토프는 비중복(non-overlapping) 에피토프인 반면, 다른 실시양태에서 상기 상이한 에피토프는 중복(overlapping) 에피토프이다.
몇몇 실시양태에서, 1개 이상의 FOI는 동물 FnIII 도메인, 세균 FnIII 도메인, 고세균 FnIII 도메인 및 바이러스 FnIII 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 1개 이상의 FOI는 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 59 및 서열번호 69 중 임의의 한 서열, 및 도 16에 제시된 서열들 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 1개 이상의 FOI는 고호열성(hyperthermophilic) 고세균으로부터의 FnIII 도메인이다.
몇몇 실시양태에서, FOI는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FOI는 인간 피브로넥틴의 제14 FnIII 도메인(서열번호 69) 또는 이의 기능적 단편, 또는 인간 피브로넥틴의 제10 FnIII 도메인(서열번호 54) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 FnIII 단량체 각각의 FOI는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 기능적 단편은 N 말단 절두된 형태(서열번호 14)이다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드의 베타 가닥은 서열번호 4의 동족 베타 가닥에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에서 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 44 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 48을 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에서 AB 루프는 서열번호 35를 포함하고, CD 루프는 서열번호 37을 포함하고, EF 루프는 서열번호 39를 포함한다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에서 BC 루프는 서열번호 36을 포함하고, DE 루프는 서열번호 38을 포함하고, FG 루프는 서열번호 40을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에서 AB 루프는 서열번호 35를 포함하고, BC 루프는 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100 또는 서열번호 101을 포함하고, CD 루프는 서열번호 37을 포함하고, DE 루프는 서열번호 38, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104 또는 서열번호 105를 포함하고, EF 루프는 서열번호 39를 포함하고, FG 루프는 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110 또는 서열번호 111을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에서 A 베타 가닥은 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 44, 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49, 서열번호 50 또는 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52 또는 서열번호 53을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드의 FOI는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nIELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYCVSLIS(XFG)nKECFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYCVSLIC(XFG)nKECFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 서열번호 35를 포함하는 AB 루프, 서열번호 37을 포함하는 CD 루프 및 서열번호 39를 포함하는 EF 루프를 포함한다. 다른 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 서열번호 36을 포함하는 BC 루프, 서열번호 38을 포함하는 DE 루프 및 서열번호 40을 포함하는 FG 루프를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 1개 이상의 BC 루프, DE 루프 또는 FG 루프 변이체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, BC 루프 변이체는 서열번호 97, 서열번호 98 또는 서열번호 168을 포함한다. 다른 실시양태에서, DE 루프 변이체는 서열번호 102 또는 서열번호 103을 포함한다. 몇몇 다른 실시양태에서, FG 루프 변이체는 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 169 또는 서열번호 170을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, BC 루프, DE 루프 또는 FG 루프 변이체는 각각 BC 루프, DE 루프 또는 FG 루프의 아미노산 서열로서 서열번호 178, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197, 서열번호 198, 서열번호 199, 서열번호 200, 서열번호 205, 서열번호 206, 서열번호 207 또는 서열번호 208을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드의 증가된 단백질 안정성은 시차 주사 열량측정법(DSC), 원이색법(CD), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 단백질분해효소 내성, 등온 열량측정법(ITC), 핵 자기 공명(NMR), 우레아 변성 또는 구아니딘 변성에 의해 측정된다.
몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드는 친화 성숙된다.
또한, 본 발명은 1개 이상의 관심있는 야생형 피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인(FOI)으로부터 유래된 2개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 발현시키거나, 융합시키거나 접합시키는 단계를 포함하는, 재조합 다량체 스캐폴드를 수득하는 방법으로서, 이때 (a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드가 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고, (b) 상기 FnIII 단량체 스캐폴드가 직렬로 연결되어 있고, 이때 1개 이상의 상기 FnIII 단량체 스캐폴드가 1개의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, (c) 상기 재조합 다량체 스캐폴드가 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고, (d) 상기 표적에 대한 결합이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 결합에 비해 개선되어 있는 것인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1개 이상의 관심있는 야생형 피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인(FOI)으로부터 유래된 3개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드를 발현시키거나, 융합시키거나 접합시키는 단계를 포함하는, 재조합 다량체 스캐폴드를 수득하는 방법으로서, 이때 (a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드가 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고, (b) 상기 재조합 다량체 FnIII 스캐폴드가 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고, (c) 상기 표적에 대한 결합이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 표적에 대한 결합에 비해 개선되어 있는 것인 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 전술된 방법에서 사용된 FOI들 중 1개 이상의 FOI는 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54 및 서열번호 69 중 임의의 한 서열 및 도 16에 제시된 서열들 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 전술된 다량체 스캐폴드들 중 임의의 다량체 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 벡터가 상기 핵산에 작동가능하게 연결되어 있다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포가 상기 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자에 의해 코딩된 다량체 스캐폴드가 발현되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 다량체 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합되어 약학 조성물을 생성한다.
또한, 본 발명은 암, 자가면역 장애, 염증성 장애 또는 감염의 치료가 필요한 환자에서 암, 자가면역 장애, 염증성 장애 또는 감염을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 샘플 중의 단백질을 검출하는 방법으로서, 본 발명의 다량체 FnIII 스캐폴드 또는 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 접합체를 표지하는 단계, 표지된 다량체 FnIII 스캐폴드 또는 접합체를 샘플과 접촉시키는 단계, 및 상기 다량체 FnIII 스캐폴드 또는 접합체와 상기 단백질 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명을 설명하기 위한 목적으로, 본 발명의 일부 실시양태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 한정되지 않는다.
도 1은 다가(multivalent) Tn3 스캐폴드의 선형 포맷, 항체 유사 포맷 및 융합체 포맷을 보여준다. 다가 Tn3 스캐폴드는 흑색 팔각형 블록으로 표시된 스페이서(spacer)에 의해 부착된 2개 이상의 Tn3 모듈(module)을 함유하고, 이때 상기 스페이서는 예를 들면, 링커일 수 있다.
도 2는 2 내지 8의 원자가(Tn3 모듈의 수)를 갖는, 도 1에 나타낸 3종의 상이한 분자 포맷에 따라 발생된 TRAIL R2 특이적 다가 Tn3 스캐폴드(A2 내지 A9로 명명됨)를 보여준다.
도 3은 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된, 1 내지 8의 원자가를 갖는 선형 직렬 구축물(A1 내지 A5로 명명됨)에 상응하는 미정제 세균 배지(우측 겔) 및 친화 정제된 샘플(좌측 겔)의 비환원 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
도 4는 1가(A1) Tn3 스캐폴드 및 다가(A2 및 A3) Tn3 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합을 측정하는 경쟁 ELISA를 보여준다.
도 5는 H2122 세포에 결합하는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드 A9의 유세포분류(flow cytometry) 막대그래프를 TRAIL R2에 결합하지 않는 동족 대조군 스캐폴드(B9)와 비교하여 보여준다.
도 6a는 다가 스캐폴드에 의한 TRAIL R2 발현 세포주의 특이적 사멸에 대한 원자가의 효과를 보여준다.
도 6b는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드에 의한 H2122 종양 세포 사멸의 특이성을 보여준다.
도 7a는 4개의 Tn3 모듈을 포함하는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드에 의한 H2122 세포의 사멸에 대한 분자 포맷의 효과를 보여준다.
도 7b는 8개의 Tn3 모듈을 포함하는 TRAIL R2 특이적 다가 스캐폴드에 의한 H2122 세포의 사멸에 대한 분자 포맷의 효과를 보여준다.
도 8a는 선형으로 융합된 4가(A3) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드 및 8가(A5) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드에 의한, TRAIL R2를 발현하는 대장 선암종 세포주 콜로205(Colo205) 세포의 특이적 사멸을 보여준다.
도 8b는 선형으로 융합된 4가(A3) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드 및 8가(A5) TRAIL R2 특이적 Tn3 스캐폴드에 의한, TRAIL R2를 발현하는 백혈병 세포주 주르카트(Jurkat) 세포의 특이적 사멸을 보여준다.
도 9a는 뮤린(murine) CD40L 특이적 직렬 2가 Tn3 스캐폴드(M13 구축물)의 디자인을 보여준다.
도 9b는 정제된 1가 M13 구축물(CD40L 특이적 Tn3 구축물), 또는 2개의 M13 모듈을 연결하는 1개, 3개, 5개 또는 7개의 Gly4Ser 유닛(GS로 표시됨)을 함유하는 링커를 갖는 직렬 2가 스캐폴드의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 1가 M13 구축물은 레인 2에서 런닝되었고, 구축물 C1은 레인 3 및 7에서 런닝되었고, 구축물 C2는 레인 4 및 8에서 런닝되었고, 구축물 C3은 레인 5 및 9에서 런닝되었고, 구축물 C4는 레인 6 및 10에서 런닝되었다. 샘플은 비환원 조건(레인 2 내지 6) 또는 환원 조건(레인 7 내지 10) 하에서 런닝되었다.
도 9c는 MuCD40L 특이적 1가(M13) 또는 2가 직렬 스캐폴드에 의한, 바이오센서 칩 상에 고정된 뮤린 CD40 수용체와 MuCD40L의 결합의 경쟁 억제를 보여준다. 다양한 구축물들에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50)가 표시되어 있다.
도 9d는 MuCD40L에 의해 유도된 B 세포 상의 CD86 발현에 대한 MuCD40L 특이적 1가(M13) Tn3, 2가 직렬 스캐폴드 또는 항체 MR1(항-MuCD40L 항체)의 억제 효과를 보여준다.
도 10은 세균 배양 배지의 SDS-PAGE에 의해 분석된, 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현된 가용성 1가 Tn3 스캐폴드 및 TRAIL R2/CD40L 이중특이적 직렬 2가 Tn3 스캐폴드의 발현도를 보여준다. 1가 스캐폴드인 A1 및 79는 각각 레인 2 및 3에 나타나 있다. 증가하는 길이의 Gly4Ser 아미노산 링커에 의해 직렬로 연결된, A1 및 79를 포함하는 직렬 스캐폴드 구축물(동족체 내지 구축물 C5, C6, C7 및 C8)은 레인 4 내지 7에 나타나 있다. 발현된 구축물은 염색된 겔 상에서 별표에 의해 표시되어 있다.
도 11a는 포획 ELISA를 이용하여 분석한 이중특이적 Tn3 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합을 보여준다.
도 11b는 포획 ELISA를 이용하여 분석한 이중특이적 Tn3 스캐폴드와 인간 CD40L의 결합을 보여준다.
도 12는 알파스크린(AlphaScreen)™ 분석을 이용하여 분석한 이중특이적 직렬 Tn3 스캐폴드 C5, C6, C7 및 C8과 TRAIL R2 및 CD40L의 동시적인 결합을 보여준다.
도 13은 구아니딘-HCl의 존재 하에서 Tn3 스캐폴드의 안정성을 보여준다. 각각의 시험된 스캐폴드에 대한 Cm(중간 값)이 표시되어 있다.
도 14는 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 분석된, 상이한 루프 서열을 갖되 동일한 길이의 FG 루프(9개의 아미노산)를 갖는 3개의 상이한 Tn3 스캐폴드의 열안정성을 보다 긴 FG 루프를 갖는 모 Tn3 스캐폴드와 비교하여 보여준다.
도 15는 9개 아미노산 길이의 FG 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드(P1C01, A6 및 71)의 안정성이 구아니딘-HCl의 존재 하에서 모(WT) Tn3 스캐폴드에 비해 증가한다는 것을 보여준다.
도 16은 구조 분석에 기초한 103개의 상이한 FnIII 스캐폴드의 다중 서열 정렬을 보여준다. 각각의 FnIII 서열은 그의 각각의 단백질 데이터 은행(PDB) 구조 및 쇄에 따라 확인된 상이한 FnIII 3차원적 구조에 상응한다(예를 들면, 1V5J_A는 1V5J PDB 구조에서 쇄 A의 서열에 상응함). 각각의 FnIII 서열에 대한 전체 서열은 A 가닥으로 시작되어 G 가닥으로 종결되는 4개의 연속적 패널에 걸쳐 나타나 있다. 루프 영역은 정렬의 상부에서 직선에 의해 표시되어 있다. 도 16a, 16e, 16i 및 16m에 표시된 각각의 군의 AB 루프를 갖는 서열들이 군으로 표시되어 있고, 각각의 군의 BC 및 CD 루프는 도 16b, 16f, 16j 및 16n에 표시되어 있고, DE 및 EF 루프는 도 16c, 16g, 16k 및 16o에 표시되어 있고, FG 루프는 도 16d, 16h, 16l 및 16p에 표시되어 있다.
도 17a는 삼중특이적/4가 Tn3 스캐폴드의 개략적인 표현 및 발현을 보여준다. D1-1E11-79 스캐폴드는 시나기스(Synagis)®-결합 도메인(D1)에 이어서 TRAIL R2-Fc 결합 도메인(1E11) 및 인간 CD40L에 특이적인 C 말단 Tn3 도메인(79)을 함유한다. 유연성 (Gly4Ser)3 링커는 각각의 도메인을 분리한다.
도 17b는 발현되고 정제된 D1-1E11-79 스캐폴드의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스-트리스(Bis-Tris)) 겔을 보여준다. 이 구축물의 예측된 분자량은 약 34,081 달톤이다.
도 18a는 알파스크린 결합 분석을 이용하여 분석한 삼중특이적/3가 Tn3 스캐폴드 D1-1E11-79와 huCD40L 및 TRAIL R2-Fc의 동시적인 결합을 보여준다. 알파스크린 신호(ASS)는 TRAIL R2-Fc 농도의 함수로서 표시된다.
도 18b는 알파스크린 결합 분석을 이용하여 분석한 삼중특이적/3가 Tn3 스캐폴드 D1-1E11-79와 huCD40L 및 시나기스®의 동시적인 결합을 보여준다. 알파스크린 신호(ASS)는 시나기스® 농도의 함수로서 표시된다.
도 19는 ELISA를 이용하여 분석한 삼중특이적/3가 Tn3 스캐폴드 D1-1E11-79와 TRAIL R2-Fc 및 시나기스®의 동시적인 결합을 보여준다.
도 20은 모 TRAIL R2 결합 클론 1C12 및 그의 친화 성숙된 유도체의 서열 정렬을 보여준다. 조작된 이황화 결합의 위치는 강조표시되어 있고, 화살표는 하나의 골격 돌연변이의 위치를 표시하고, 친화 성숙 동안 발생하는 루프 내의 변화는 강조표시된 블록 A, B, C 및 D에 나타나 있다.
도 21은 1C12 클론 및 이의 친화 성숙된 유도체의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 세포 생존력 분석을 보여준다.
도 22는 마우스 혈청 중의 G6 직렬체의 농도를 시간의 함수로서 보여준다.
도 23a는 클론 F4에 대한 사이노몰구스(cyno) 교차반응성의 조작된(engineered) 향상에 상응하는 서열 정렬을 보여준다. 모든 이들 클론 사이의 공통된 특징은 2개의 아미노산을 사이에 두고 DE 루프 앞에 존재하는, D로부터 G로의 돌연변이이다.
도 23b는 F4 또는 F4mod1 단량체에 의한, 인간 또는 시이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 F4mod1 코팅된 플레이트의 결합의 억제에 대한 ELISA 측정치를 보여준다.
도 24a는 클론 F4mod1의 생식세포주화(germlining)에 상응하는 서열 정렬, 구체적으로 F4, F4mod1 및 F4mod12와 TN3 생식세포주의 비교를 보여준다.
도 24b는 F4, F4mod1 또는 F4mod12 단량체에 의한, 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 F4mod1 코팅된 플레이트의 결합의 억제에 대한 ELISA 측정치를 보여준다.
도 24c는 G6 직렬체 6을 F4mod12 직렬체 6과 비교하는 콜로205 세포 사멸 분석을 보여준다.
도 24d는 G6 직렬체 8을 F4mod12 직렬체 8과 비교하는 콜로205 세포 사멸 분석을 보여준다.
도 25는 TRAIL 내성 세포주 HT29에서 G6 직렬체 8의 활성을 F4mod12 직렬체 8의 활성과 비교하는 HT29 세포 사멸 분석을 보여준다.
도 26은 안티토프(Antitope) 에피스크린(EpiScreen) 면역원성 분석에서 시험된 클론에 상응하는 서열 정렬을 보여준다. 클론 F4mod12에 대한 차이는 강조표시되어 있다.
도 27a는 비-SEC에 의해 정제된 G6 직렬체 8의 SEC 기록을 보여준다.
도 27b는 SEC에 의해 정제된 G6 직렬체 8의 SEC 기록을 보여준다.
도 28은 상이한 투여량의 Tn3 TRAIL R2 작용제 G6 직렬체 6 및 G6 직렬체 8에 반응하여 발생된, 콜로205 대장암 이종이식편 모델에서의 종양 부피 변화를 보여준다.
도 29는 상이한 투여량의 Tn3 TRAIL R2 작용제 G6 직렬체 6 및 G6 직렬체 8에 반응하여 발생된, 콜로205 대장암 이종이식편 모델에서의 체중 변화를 보여준다.
정의
본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 공정 단계로 한정되지 않는다는 것(상기 조성물 또는 공정 단계가 변경될 수 있기 때문임)을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 명확히 달리 명시하지 않은 한, 단수형은 복수형의 언급을 포함한다는 것을 인식해야 한다. 용어 "하나"(또는 "한")와 용어 "1개 이상" 및 "적어도 1개"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
나아가, 본원에서 사용된 "및/또는"은 다른 특징 또는 성분과 함께 또는 다른 특징 또는 성분 없이 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기 실시양태 각각을 포괄하기 위한 것이다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들면, 문헌(the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press); 문헌(The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press); 및 문헌(the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press)은 본 발명에서 사용된 용어들 대부분의 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 부호는 그들의 국제단위계(SI)에 의해 인정된 형태로 표시된다. 수치범위는 범위를 한정하는 수치를 포함한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 아미노산 서열은 아미노 배향으로부터 카르복시 배향으로 좌측부터 우측으로 기재된다. 본원에서 제공된 제목은 본 명세서를 전체적으로 참조함으로써 이해될 수 있는 본 발명의 다양한 양태 또는 실시양태의 한정이 아니다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참조함으로써 보다 완전히 정의된다.
본원의 어디에서나 실시양태가 용어 "포함하는"으로 기재되어 있지만, "구성된" 및/또는 "본질적으로 구성된"의 관점에서 기재된 다른 유사한 실시양태도 제공된다는 것이 이해된다.
아미노산은 그들의 통상적으로 공지된 3 문자 부호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 협회에 의해 권장된 1 문자 부호에 의해 본원에서 언급되어 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그들의 통상적으로 승인된 1 문자 코드에 의해 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 본 발명의 스캐폴드에 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고 통상적으로 특이적인 3차원적 구조 특성뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체구조 에피토프 및 비입체구조 에피토프는 상기 입체구조 에피토프와의 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 상기 비입체구조 에피토프와의 결합은 그러하지 않다는 점에서 구별된다.
용어 "피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인" 및 "FnIII 도메인"은 스스로 서로 팩킹되어 단백질의 코어를 형성하는 2개의 베타 시트(sheet) 사이에 분포된 7개 이상의 베타 가닥을 갖고 상기 베타 가닥을 서로 연결하는 용매 노출된 루프를 추가로 함유하는 인간 피브로넥틴 III형 도메인에 대한 상동성을 나타내는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에는 3개 이상의 이러한 루프가 존재하고, 이때 상기 가장자리는 상기 베타 가닥의 방향과 직각을 이루는 단백질의 경계이다. 일부 실시양태에서, FnIII 도메인은 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역에 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하고, 이때 루프 영역은 각각의 베타 가닥을 연결한다. 도 16은 FnIII 도메인의 3차원적 구조의 분석에 기초한, 다수의 FnIII 도메인에 대한 베타 가닥 및 루프에 대한 일차 서열 위치를 제공한다. 이들 영역의 대안적 정의가 당업계에서 공지되어 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 이들 FnIII 도메인의 경우, A 가닥의 N 말단 및/또는 G 가닥의 C 말단이 절두될 수 있다는 것이 이해될 것이라는 점을 제외하고, 문맥이 달리 명확히 명시하지 않은 한, 도 16의 정의가 본원에서 사용될 것이다. 용어 "피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인" 및 "FnIII 도메인"은 인터프로스캔(InterProScan) 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 인터프로 IPR008957 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정되거나, Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 FnIII 도메인을 기술하는 히든 마르코브(Hidden Markov) 모델과 비교할 수 있는 (당업계에서 공지되어 있는) 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 단백질 도메인도 포함한다. 추가로, 상기 용어들은 기능성 단편 및 조작된 FnIII 도메인, 예를 들면, 코어 조작된 FnIII 도메인을 포함한다(예를 들면, 문헌(Ng et al., Nanotechnology 19: 384023, 2008) 참조).
용어 "피브로넥틴 III형(FnIII) 스캐폴드" 또는 "FnIII 스캐폴드"는 FnIII 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편을 지칭하고, 이때 1개 이상의 루프는 관심있는 FnIII 도메인/스캐폴드의 비천연 변이체이고, 상기 FnIII 스캐폴드 또는 이의 기능성 단편은 표적에 결합할 수 있고, 이때 본원에서 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비천연 변이체"는 천연 FnIII 도메인 서열 또는 이전에 확인된 FnIII 스캐폴드 서열일 수 있는 출발 단백질 서열(예를 들면, 관심있는 FnIII 도메인/스캐폴드) 내의 동족 서열로부터 1개 이상의 아미노산이 결실되거나, 치환되거나 부가됨으로써 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, A 베타 가닥은 절두된다(예를 들면, A 베타 가닥의 1개 이상의 N 말단 잔기가 부재할 수 있음). 일부 실시양태에서, G 베타 가닥은 절두된다(예를 들면, G 베타 가닥의 1개 이상의 C 말단 잔기가 부재할 수 있음). 일부 실시양태에서, FnIII 스캐폴드는 1개 이상의 베타 가닥의 비천연 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54 및 서열번호 69 중 임의의 한 서열의 동족 베타 가닥의 일차 서열; 도 16에 나타낸 FnIII 도메인들 중 임의의 FnIII 도메인의 베타 가닥의 일차 서열; 또는 인터프로스캔 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 인터프로 IPR008957 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정되거나, Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 히든 마르코브 모델과 비교할 수 있는 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 단백질 도메인의 베타 가닥에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타낸다.
용어 "DNA"는 2개 이상의 공유결합된 천연 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 서열을 지칭한다.
용어 "융합 단백질"은 (ii) 상이한 제2 단백질(즉, "이종" 단백질)에 연결된 (i) 1개 이상의 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 단백질을 지칭한다.
용어 "이종 모이어티"는 본 발명의 스캐폴드에의 성분의 부가를 표시하기 위해 본원에서 사용되고, 이때 상기 성분은 정상적으로 FnIII 도메인의 일부가 아니다. 예시적인 이종 모이어티는 단백질, 펩티드, 단백질 도메인, 링커, 약물, 독소, 조영제, 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 및 FnIII 도메인 자체에 내재하지 않는 활성을 제공할 임의의 다른 성분(폴리에틸렌 글리콜(PEG), 세포독성제, 방사성핵종, 조영제, 바이오틴, 이량체화 도메인(예를 들면, 류신 지퍼 도메인), 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 이의 FcRn 결합 부분, 항체의 도메인 또는 단편(예를 들면, 항체 가변 도메인, CH1 도메인, C카파 도메인, C람다 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인), 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, IgG 분자, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개 이상의 스캐폴드를 이어주거나 연결하는 임의의 분자 조립체를 지칭한다. 링커는 스캐폴드 내의 모듈 사이의 "스페이서"로서 작용하는 기능을 갖는 분자일 수 있거나, 추가 기능을 갖는 분자(즉, "기능성 모이어티")일 수도 있다. "이종 모이어티"의 정의에 포함되는 분자는 링커로서 작용할 수도 있다.
용어 "연결된" 및 "융합된"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어들은 2개 이상의 스캐폴드, 이종 모이어티 또는 링커가 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 임의의 수단에 의해 서로 연결되어 있는 것을 지칭한다.
용어 "다량체", "다량체 스캐폴드" 및 "다가 스캐폴드"는 연결된 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 분자를 지칭한다. 다량체 스캐폴드를 형성하는 스캐폴드는 각각의 스캐폴드가 독립적으로 기능하게 하는 링커를 통해 연결될 수 있다. "다량체" 및 "다가"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 다가 스캐폴드는 단일특이적일 수 있거나 이중특이적일 수 있다.
용어 "도메인" 또는 "단백질 도메인"은 종종 단백질의 나머지 영역과 무관하게 안정한 3차원적 구조로 폴딩될 있고 특정 기능을 부여받을 수 있는 단백질의 영역을 지칭한다. 이 구조는 원래의 단백질 내의 도메인 기능과 관련된 특정 기능, 예를 들면, 효소 활성, 또 다른 분자에 대한 인식 모티프의 생성, 또는 단백질이 단백질의 특정 환경 하에서 존재하기 위해 필요한 구조 성분을 제공하는 기능을 유지한다. 단백질 과(family) 내에서 및 관련 단백질 상과(superfamily) 내에서, 단백질 도메인은 진화적으로 보존된 영역일 수 있다. 다량체 스캐폴드의 성분을 기술할 때, 용어 "도메인", "단량체 스캐폴드" 및 "모듈"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. "천연 FnIII 도메인"은 살아있는 유기체에 의해 코딩되는 임의의 비재조합 FnIII 도메인을 의미한다.
단백질 서열과 관련하여 용어 "서열 상동성"은 2개 이상의 단백질 서열 사이의 유사성, 즉 동일한 또는 보존적 아미노산 치환인 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "퍼센트(%) 서열 유사성" 및 퍼센트(%) 상동성"은 동등한 것으로서 간주되고, 아미노산 서열을 정렬하고 필요하다면 갭(gap)을 후보 및/또는 선택된 서열 내에 도입하여 최대 퍼센트 서열 유사성을 달성한 후, 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일하거나 이 아미노산 잔기의 보존적 치환인, 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
본원에서 "퍼센트(%) 동일성"은 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 후보 및/또는 선택된 서열 내에 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 치환시키는 것을 의미한다. 보존적 치환의 예로는 1개의 소수성 아미노산 잔기, 예컨대, 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르류신 또는 메티오닌을 또 다른 소수성 아미노산 잔기로 치환시키는 것, 또는 1개의 극성 잔기를 또 다른 극성 잔기로 치환시키는 것, 예컨대, 아르기닌을 라이신으로 치환시키는 것 및 라이신을 아르기닌으로 치환시키는 것, 글루탐산을 아스파르트산으로 치환시키는 것 및 아스파르트산을 글루탐산으로 치환시키는 것, 글루타민을 아스파라긴으로 치환시키는 것 및 아스파라긴을 글루타민으로 치환시키는 것 등을 포함한다. 1개의 또 다른 중성 친수성 아미노산을 치환시킬 수 있는 중성 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 쓰레오닌을 포함한다. 용어 "보존적 치환"은, 펩티드의 생물학적 활성이 유지되는 한, 비치환된 모 아미노산 대신에 치환된 아미노산을 사용하는 것도 포함한다. 아미노산 잔기 사이의 생물학적 유사성은 성질(예컨대, 소수성, 돌연변이 빈도, 전하, 측쇄 길이, 측쇄 부피, pKa, 극성, 방향성, 가용성, 표면 면적, 펩티드 결합 기하구조, 이차 구조 성향, 평균 용매 접근성 등(그러나 이들로 한정되지 않음)) 사이의 유사성을 지칭한다.
퍼센트 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 퍼센트 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식에 의해, 예를 들면, 공유 또는 사유 알고리즘을 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 서열 유사성은 쌍별 정렬 방법, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 ALIGN-2, 또는 다중 서열 정렬 방법, 예컨대, 메그얼라인(Megalign)(디엔에이스타(DNASTAR)), 클루스탈더블유(ClustalW) 또는 티-커피(T-Coffee) 소프트웨어를 이용함으로써 측정될 수 있다. 당업자는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 최적 정렬 질을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 적절한 스코어링 함수, 예를 들면, 정렬 측정을 위한 갭 벌점 또는 스코어링 매트릭스를 결정할 수 있다. 나아가, 당업자는 일부 폴드, 예를 들면, FnIII 폴드를 갖는 단백질을 확인하고 이러한 단백질의 아미노산 서열을 정렬하는 방법이 서열-서열 방법, 서열-프로필 방법 및 프로필-프로필 방법을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 서열 정렬은 구조 정렬 방법(예를 들면, 이차 또는 삼차 구조 정보를 이용하여 2개 이상의 서열을 정렬하는 방법), 또는 서열 정보, 구조 정보 및 계통발생 정보를 조합하여 후보 단백질 서열을 확인하고 최적으로 정렬하는 하이브리드 방법을 이용함으로써 달성될 수 있다.
"단백질 서열" 또는 "아미노산 서열"은 폴리펩티드 내의 아미노산 성분이 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 선형으로 표시되어 있는 것을 의미하고, 이때 상기 표시에서 서로 인접해 있는 잔기들은 상기 폴리펩티드의 일차 구조에서 인접하여 존재한다.
용어 "핵산"은 임의의 2개 이상의 공유결합된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 DNA, RNA 및 PNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포괄하기 위한 것이고 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 용어 "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 제거되어 있는 핵산 분자인 DNA 또는 RNA를 지칭하기 위한 것이다. 예를 들면, 벡터 내에 함유된 본 발명의 스캐폴드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예로는 이종 숙주 세포 내에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드가 있다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 유의하게 불리한 의학적 결과를 초래하지 않으면서 동물(예를 들면, 포유동물)에게 투여될 수 있는 화합물 또는 단백질을 지칭한다.
용어 "생리학적으로 허용가능한 담체"는 치료받는 숙주에 대한 유의한 유해 효과를 미치지 않고 그 자신과 함께 투여되는 화합물의 치료 성질을 유지하는 담체를 지칭한다. 한 예시적인 생리학적으로 허용가능한 담체는 생리식염수이다. 다른 생리학적으로 허용가능한 담체들 및 이들의 제제는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.]에 기재되어 있다.
"폴리펩티드"는 길이, 번역 후 변형 또는 기능과 관계없이 아미드 결합(펩티드 결합)에 의해 선형으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 서열을 의미한다. "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드 또는 올리고펩티드는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어들 중 임의의 용어 대신에 사용될 수 있거나 이들 용어들 중 임의의 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있으나, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식에 의해 발생될 수 있다.
상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합도 본 발명의 폴리펩티드로서 포함된다. 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나 비천연적으로 발생할 수 있다. 비천연 변이체는 당업계에서 공지되어 있는 돌연변이유발 기법을 이용함으로써 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 20개의 표준 아미노산의 1개 이상의 천연 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드도 "유도체"로서 포함된다.
용어 "[예를 들면, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드]로부터 유래된"은 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 기준 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 관련되어 있다는 것을 의미한다. 상기 관련은 예를 들면, 서열 유사성 및 구조 유사성 중 하나일 수 있다. 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 돌연변이(예를 들면, 결실 또는 치환), 화학적 조작(예를 들면, 스캐폴드와 PEG 또는 또 다른 단백질의 화학적 접합), 유전적 융합(예를 들면, 2개 이상의 스캐폴드와 링커, 이종 모이어티 또는 이들의 조합의 유전적 융합), 서열 또는 구조 유사성에 기초한 드 노보(de novo) 합성, 및 이종 유기체 내에서의 재조합 제조 중 1종 이상의 방법을 통해 기준 단백질 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유도될 수 있다.
"무작위화된" 또는 "돌연변이된"은 주형 서열에 대한 1개 이상의 아미노산 변경(결실, 치환 또는 부가를 포함함)을 포함하는 것을 의미한다. "무작위화하는" 또는 "돌연변이를 유발하는"은 이러한 아미노산 변경을 서열 내로 도입하는 과정을 의미한다. 무작위화 또는 돌연변이는 일반적으로 핵산 코딩 서열의 의도적, 비의도적 또는 자연발생적 서열 변이를 통해 달성될 수 있고 임의의 기법, 예를 들면, PCR, 오류 유발(error-prone) PCR 또는 화학적 DNA 합성에 의해 일어날 수 있다. 용어 "무작위화하는", "무작위화된", "돌연변이를 유발하는", "돌연변이된" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"동족체" 또는 "동족체 비돌연변이된 단백질"은 무작위화된 또는 돌연변이된 변이체 단백질 내로 도입된 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 면에서 변이체 단백질과 동일한 단백질을 의미한다.
"RNA"는 2개 이상의 공유결합된 천연 또는 변형된 리보뉴클레오티드로 구성된 서열을 의미한다. 이 용어 내에 포함되는 변형된 RNA의 일례는 포스포로티오에이트 RNA이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 스캐폴드" 또는 "본 발명의 스캐폴드들"은 다량체 스캐폴드 및 단량체 FnIII 스캐폴드를 지칭한다. 용어 "표적"은 본 발명의 특이적 스캐폴드에 의해 인식되는 화합물을 지칭한다. 전형적인 표적은 단백질, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 소분자를 포함한다. 용어 "표적" 및 "항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서, 예를 들면, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이성"은 본 발명의 스캐폴드가 1개 이상의 항원 결합 도메인을 통해 1개 이상의 항원에 결합하기 위해 요구되는 상대적 친화성을 지칭하고, 상기 결합은 1개 이상의 항원 결합 도메인과 1개 이상의 항원 사이의 약간의 상보성을 필요로 한다. 이 정의에 따르면, 본 발명의 스캐폴드는 무작위적 비관련 에피토프에 결합하는 경우보다 더 용이하게 에피토프에 결합하는 경우 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 기재된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 본 발명의 일부 스캐폴드와 개별 에피토프의 결합 강도의 척도를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화력"은 본 발명의 스캐폴드의 집단과 특정 에피토프 사이에 형성된 복합체의 전체 안정성, 즉 복수의 스캐폴드와 항원의 결합의 기능적으로 조합된 강도를 지칭한다. 친화력은 개별 항원 결합 도메인과 특이적 에피토프의 친화성 및 본 발명의 스캐폴드의 원자가 둘다와 관련되어 있다.
용어 "표적에 대한 작용"은 본 발명의 다량체 스캐폴드와 1개 이상의 표적의 결합, 및 이러한 결합으로부터 비롯된 생물학적 효과를 지칭한다. 이와 관련하여, 다량체 스캐폴드 내의 다수의 항원 결합 유닛은 다양한 표적 및/또는 에피토프와 상호작용할 수 있고, 예를 들면, 2개의 표적을 물리적으로 더 가깝게 위치시킬 수 있고 상이한 표적들과의 상호작용을 통해 대사 캐스케이드(metabolic cascades)를 유발할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "원자가"는 잠재적 항원 결합 모듈의 수, 예를 들면, 본 발명의 스캐폴드 내의 FnIII 모듈의 수를 지칭한다. 본 발명의 스캐폴드가 1개 초과의 항원 결합 모듈을 포함하는 경우, 각각의 결합 모듈은 예를 들면, 동일한 표적 또는 상이한 표적 내의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 함께 이황화 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Tn3 모듈" 및 "Tn3 스캐폴드"는 FnIII 스캐폴드를 지칭하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, 이때 1개 이상의 루프는 "야생형 Tn3 스캐폴드" 내의 루프의 비천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, Tn3 모듈의 1개 이상의 베타 가닥은 C 베타 가닥 내의 시스테인 잔기(예를 들면, 서열번호 45 또는 서열번호 131 내의 시스테인) 및 F 베타 가닥(서열번호 49)이 치환되지 않는다는 점을 제외하고 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형 Tn3 스캐폴드"는 서열번호 1을 포함하는 FnIII 스캐폴드, 즉 인간 테나신 C의 제3 FnIII으로부터 유래된 조작된 FnIII 스캐폴드를 지칭한다.
용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 폴리펩티드의 다양한 넓은 부류를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류된다는 것을 인식할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로서 결정하는 것은 상기 쇄의 성질이다. 이들 클래스 각각의 변형된 버전은 당업자에게 용이하게 인식될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체, 변형된 항체, 항체 VL 또는 VL 도메인, CH1 도메인, C카파 도메인, C람다 도메인, Fc 도메인(상기 참조), CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 항체"는 비천연 항체가 되도록 변경된 합성 항체 형태, 예를 들면, 2개 이상의 중쇄 부분을 포함하나 2개의 완전한 중쇄를 포함하지 않는 항체(예를 들면, 도메인이 결실된 항체 또는 미니바디(minibody)); 및 2개 이상의 항원 또는 단일 항원의 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 다중특이적 항체 형태(예를 들면, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체 등)를 포함한다. 또한, 용어 "변형된 항체"는 다가 항체 형태(예를 들면, 동일한 항원의 3개 이상의 카피에 결합하는 3가 항체, 4가 항체 등)를 포함한다. (예를 들면, 문헌(Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, eds., 2010 Springer Protocols, Springer)을 참조한다).
용어 "TRAIL R2" 또는 "TRAIL R2 수용체"는 전장 TRAIL 수용체 서열, 및 하기 문헌에 기재된 가용성 세포외 도메인 형태의 상기 수용체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다: 문헌(Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)); 문헌(Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)); 미국 특허 제6,072,047호 및 제6,342,369호; 국제특허공보 제WO98/51793호, 제WO98/41629호, 제WO98/35986호, 제WO99/02653호, 제WO99/09165호, 제WO98/46643호 및 제WO99/11791호; 문헌(Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)); 문헌(Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)); 및 문헌(Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)). 대표적인 전장 TRAIL 수용체 서열은 유전자은행(GenBank) 수납번호 제AAC51778.1호 및 제O14763.2호에서 입수가능하다.
"TRAIL" 또는 "TRAIL 폴리펩티드"는 TRAIL R2 및 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는, 1개 이상의 TRAIL 수용체에 결합하는 리간드를 지칭한다. 대표적인 TRAIL 서열은 유전자은행 수납번호 제AAH32722.1호 및 제P50591.1호에서 입수가능하다.
용어 "CD40L"은 CD154, gp39 또는 TBAM으로도 공지되어 있는 CD40 리간드 단백질을 지칭한다. CD40L은 33 kDa의 II형 막 당단백질이다. 추가로, 보다 짧은 18 kDa의 CD154 가용성 형태(sCD40L로도 공지되어 있음)도 존재한다. 대표적인 인간 CD40L 서열은 유전자은행 수납번호 제AAA35662.1호 및 유니프롯(UniProt) 수납번호 제P29965호에서 입수가능하다. 대표적인 뮤린 CD40L 서열은 유전자은행 수납번호 제AAI19226.1호 및 유니프롯 수납번호 제 P27548호에서 입수가능하다.
용어 "생체내 반감기"는 그의 일반적인 의미(즉, 폴리펩티드의 생물학적 활성의 50%가 체내/표적 기간에 여전히 존재하는 시간, 또는 상기 폴리펩티드의 상기 활성이 그의 초기 값의 50%인 시간)으로 사용된다. 기능성 생체내 반감기를 측정하는 대안으로서, "혈청 반감기", 즉 폴리펩티드 분자의 50%가 제거되기 전에 혈장 또는 혈류에서 순환하는 시간이 측정될 수 있다. 혈청 반감기의 측정은 종종 기능성 생체내 반감기의 측정보다 더 단순하고, 혈청 반감기의 크기는 통상적으로 기능성 생체내 반감기의 크기의 우수한 표시이다. 혈청 반감기에 대한 대안적 용어는 혈장 반감기, 순환 반감기, 순환적 반감기, 혈청 제거율, 혈장 제거율 및 제거 반감기를 포함한다. 보유될 기능은 통상적으로 응혈촉진 활성, 단백질분해 활성, 보조인자 결합 활성, 수용체 결합 활성, 및 특정 단백질과 관련된 다른 종류의 생물학적 활성으로부터 선택된다.
기능성 생체내 반감기 또는 혈장 반감기와 관련된 용어 "증가된"은 폴리펩티드의 관련 반감기가 비교가능한 조건 하에서 측정될 때 기준 분자(예를 들면, 비변형된 폴리펩티드)의 관련 반감기에 비해 통계적으로 유의하게 증가된다는 것을 표시하기 위해 사용된다. 예를 들면, 관련 반감기는 비변형된 기준 분자에 비해 약 25% 이상, 예컨대, 약 50% 이상, 예를 들면, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상, 약 250% 이상 또는 약 500% 이상까지 증가될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 반감기는 비변형된 기준 분자에 비해 약 1배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상 또는 50배 이상까지 증가될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 유전자가 생화학적 물질, 예를 들면, 본 발명의 스캐폴드 또는 이의 단편을 생성하는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자 넉다운(knockdown)뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정적 발현 둘다를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 세포 내의 기능성 유전자의 존재의 임의의 현시(顯示)를 포함한다. 상기 과정은 유전자를 1개 이상의 mRNA로 전사하는 단계, 및 이러한 mRNA를 1개 이상의 폴리펩티드로 번역하는 단계를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 원하는 최종 생성물이 생화학적 물질인 경우, 발현은 상기 생화학적 물질 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다.
"발현 생성물"은 핵산, 예를 들면, 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 발현 생성물은 전사 후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화를 갖는 핵산, 또는 번역 후 변형, 예를 들면, 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 결합, 단백질분해성 절단 등을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포 내로 도입되어 원하는 발현 생성물을 발현하는 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 상용가능한 벡터는 선택 마커, 원하는 핵산의 클로닝을 촉진하기 위한 적절한 제한 부위, 및 진핵세포 또는 원핵세포 내로 들어가고/가거나 진핵세포 또는 원핵세포에서 복제하는 능력을 포함할 것이다.
용어 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법의 이용에 의해 구축되고 1개 이상의 발현 생성물을 코딩하는 벡터를 보유하는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 발현 생성물을 단리하는 과정의 설명에 있어서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은, 명확히 달리 특정되어 있지 않은 한, 발현 생성물의 공급원을 표시하기 위해 상호교환적으로 사용된다(즉, "세포"로부터의 발현 생성물의 회수는 원심분리된 전체 세포로부터의 회수, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미한다).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘다를 지칭하기 위해 사용되고, 이때 목적은 대상체 내에서 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대, 염증성 질환 또는 병태의 진행을 방지하거나 늦추는(줄이는) 것이다. 유리한 또는 원하는 임상적 결과는 검출가능하든 아니면 검출불가능하든 관계없이 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 (부분적 또는 전체적) 감퇴를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
또한, 용어 "치료"는 치료를 제공받지 않은 경우 예측된 생존에 비해 생존을 연장시키는 것을 의미한다. 치료가 필요한 대상체는 병태 또는 장애를 이미 앓고 있는 대상체뿐만 아니라 병태 또는 장애를 앓기 쉬운 대상체 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체도 포함한다.
용어 "대상체", "개체", "동물", "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료를 원하는 임의의 개체, 환자 또는 동물, 구체적으로 포유동물 대상체를 지칭한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다.
도입
인간 체액 단백질에서 발견되는 전체 안정한 가용성 구조 모듈로부터 유래되거나, 호열성 세균 및 고세균을 포함하나 이들로 한정되지 않는 천연 상태의 다른 공급원으로부터 유래된 FnIII 스캐폴드는 항체로부터 유래된 단편 및 비항체 골격보다 더 우수하도록 조작되었다. 스캐폴드 조작의 한 구체적인 예는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 FnIII 스캐폴드 내에 도입하는 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 이들 FnIII 스캐폴드의 직렬 반복체(repeat)를 포함하고, 이때 1개 이상의 FnIII 스캐폴드는 1개의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 직렬 스캐폴드는 펩티드 링커에 의해 융합되어 단일 구축물로서 발현될 수 있다.
다량체 스캐폴드를 구성하는 FnIII 스캐폴드는 서로 독립적으로 정확하게 폴딩되고 그들의 결합 특이성 및 친화성을 보유하고, 각각의 스캐폴드 도메인은 그의 기능성을 보유한다. 다량체 스캐폴드를 구성하는 FnIII 스캐폴드가 고 원자가 다량체 스캐폴드, 예를 들면, 6가 또는 8가 스캐폴드로 조립되는 경우, 상기 스캐폴드는 서로 독립적으로 정확하게 폴딩되고 그들의 결합 특이성 및 친화성을 보유하고, 각각의 스캐폴드 도메인은 그의 기능성을 보유한다.
고 원자가 스캐폴드(예를 들면, 6가 또는 8가 스캐폴드)를 포함하는 다량체 스캐폴드는 구축물의 위상기하학이 선형이 아닌 경우, 예를 들면, 단량체 FnIII 또는 다량체 FnIII 스캐폴드가 복잡한 분지된 구조(예를 들면, Fc 융합 구축물 또는 항체 유사 구축물)로 조립되는 경우조차도 정확하게 폴딩된다.
천연 FnIII 도메인, 예컨대, 인간 피브로넥틴의 제10 FnIII 도메인(10FnIII) 및 대부분의 천연 FnIII 도메인은 이황화 결합 또는 자유 시스테인을 함유하지 않는다. 다중도메인 단백질이 다수의 시스테인의 도입에 의해 조작되는 경우, 단백질 발현의 결여, 생성된 단백질의 침전 또는 비기능성 단백질의 생성이 통상적으로 일어난다. 이들 유해한 효과는 부정확한 단백질 폴딩을 초래하는, 분자내, 도메인내 및/또는 도메인간 이황화 결합의 부정확한 형성, 및/또는 분자간 이황화 결합의 부정확한 형성에 기인한다. 이들 효과는 일반적으로 시스테인 및/또는 단백질 도메인의 수가 증가된 경우 강화된다.
예를 들면, 8개의 야생형 Tn3 스캐폴드(서열번호 1)를 포함하는 선형 FnIII 스캐폴드는 단일 폴리펩티드 아미노산 서열을 따라 16개의 시스테인을 함유할 것이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 4개의 Tn3 모듈(이때, 2개의 Tn3 모듈은 IgG 중쇄에 연결되어 있고, 2개의 Tn3 모듈은 IgG 경쇄에 연결됨)을 포함하는 항체 유사 구축물은 4개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 따라 분포된 32개의 시스테인을 포함할 것이다. 따라서, 이러한 수의 시스테인 및 이러한 구조 복잡성을 포함하는 다량체 FnIII 스캐폴드가 정확하게 폴딩되고 그들의 각각의 FnIII 단량체 도메인에 비해 개선된 안정성 및 표적 결합 성질을 나타낼 것이라는 것은 매우 예측되기 어렵다.
1개 이상의 조작된 이황화 가교를 포함하는 FnIII 스캐폴드가 고 원자가 다량체 포맷으로 조립되는 경우, 각각의 개별 단량체 스캐폴드는 그의 결합 특이성 및 친화성뿐만 아니라 그의 기능성을 유지하면서 정확하게 폴딩된다. 또한, 상기 단량체 스캐폴드는 정확하게 폴딩된 안정한 기능성 다량체 스캐폴드를 형성할 수 있다.
본 발명의 다량체 스캐폴드의 이점은 다수의 에피토프에 결합하여 친화력을 증가시키는 능력, 예를 들면, (i) 단일 표적 내의 다수의 에피토프에 결합하는 능력, (ii) 다수의 표적 내의 단일 에피토프에 결합하는 능력, (iii) 한 표적의 상이한 서브유닛 상에 위치한 다수의 에피토프에 결합하는 능력, 또는 (iv) 다수의 표적 상의 다수의 에피토프에 결합하는 능력이다.
또한, 다량체 스캐폴드의 유연성 및 링커를 통한 다수의 FnIII 모듈 사이의 거리 변화 가능성으로 인해, 상기 다량체 스캐폴드는 표면(동일한 세포/표면 또는 상이한 세포/표면) 상의 다수의 표적 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 다량체 스캐폴드는 1개 초과의 표적에 동시적으로 결합하는 그의 능력의 결과로서 다수의 경로를 조절하고/하거나, 세포 표면 상의 수용체를 교차결합시키고/시키거나, 분리된 세포 상의 세포 표면 수용체를 결합시키고/시키거나, 표적 분자 또는 세포를 기질에 결합시키는 데에 사용될 수 있다.
FnIII 도메인의 선행 서열 분석으로부터, 큰 변이가 BC 루프 및 FG 루프에서 관찰되었는데, 이것은 이들 루프가 안정성에 중요하지 않다는 것을 암시한다(예를 들면, 국제특허공보 제WO2009/058379호 참조). 본 발명은 아미노산 서열에서의 변이를 갖되 관심있는 FnIII 도메인/스캐폴드의 길이보다 더 짧은 길이를 갖는 FG 루프를 포함하는, 개선된 안정성을 나타내는 FnIII 스캐폴드를 제공한다. FnIII 도메인의 아미노산 서열이 낮은 서열 유사성을 보이는 경향을 나타내지만, 그들의 전체 3차원적 구조는 유사하다. 따라서, 전체 서열 유사성이 낮은 경우조차도 상이한 종 및 상이한 단백질로부터 유래된 FnIII 스캐폴드의 FG 루프의 특정 위치를, 공지된 기법, 예컨대, 서열 분석 및 삼차 구조 중첩을 이용하여 확인할 수 있고 돌연변이를 유발시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조작된 FG 루프는 출발 FG 루프의 길이보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 아미노산 서열 길이를 갖는다. FG 루프의 단축은 증가된 안정성을 나타내는 돌연변이된 FnIII 스캐폴드를 발생시킨다는 것이 관찰되었다. 그 결과, 본 발명의 또 다른 양태는 증가된 단백질 안정성을 나타내는 FnIII 변이체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 10개 아미노산의 FG 루프 길이를 갖는 인간 테나신 C의 천연 제3 FnIII 도메인을 포함하는 스캐폴드에 비해 9개의 아미노산 및 증가된 안정성을 갖는 FG 루프를 포함한다. 추가로, 본 발명은 관심있는 FnIII 도메인/스캐폴드에 비해 증가된 안정성을 나타내는 FnIII 스캐폴드의 단리에 유용한 특정된 FG 루프 길이를 갖는 다양한 FnIII 스캐폴드의 라이브러리를 제공한다.
추가로, 본 발명은 2개 이상의 상이한 표적에 결합할 수 있는 다중특이적 스캐폴드, 특정 표적에 대한 스캐폴드의 친화성이 돌연변이를 통해 조절된 친화 성숙된 스캐폴드, 및 돌연변이를 통해 조절된 동물 종 사이의 면역원성 및/또는 교차반응성을 보이는 스캐폴드를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 제조하는 방법뿐만 아니라 원하는 생리화학적, 약리학적 또는 면역학적 성질을 갖도록 스캐폴드를 조작하는 방법도 제공한다. 나아가, 본 발명은 치료적, 예방적 및 진단적 사용을 위한 이러한 스캐폴드 및 방법의 용도를 제공한다.
FnIII 구조 모티프
본 발명의 스캐폴드는 생명체 및 바이러스의 모든 3개의 도메인 및 다수의 단백질 부류에 걸쳐 넓게 발견되는 도메인인 피브로넥틴 III형 모듈(FnIII)의 구조에 기초한다. FnIII 도메인은 혈장에서 가용성 형태로 발견되고 느슨한 결합 조직 및 기저 단백질에서 불용성 형태로 발견되는 다중도메인 단백질인 피브로넥틴에서 발견된다. 이 도메인은 현재까지 서열결정된 다수의 단백질에서 발견된다. FnIII 도메인 상과는 45개 이상의 상이한 단백질 과를 대표하고, 이들 중 대부분은 몇몇 방식으로 세포 표면 결합에 관여하거나 수용체로서 작용한다. FnIII 도메인을 함유하는 단백질의 구체적인 예로는 피브로넥틴, 테나신, 세포내 세포골격 단백질, 사이토킨 수용체, 수용체 단백질 티로신 인산화효소(kinase) 및 원핵 효소가 있다(Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8990-8894, 1992; Bork et al., Nature Biotechnol. 15:553-557, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659-15665, 1990).
FnIII 도메인을 포함하는 천연 단백질 서열은 피브로넥틴, 테나신 C, 성장호르몬 수용체, β-공통 수용체, IL-5R, 테나신 XB 및 콜라겐 타입 XIV를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 도메인이 천연 상태에서 넓게 분포되어 있는 듯하지만, 고도로 분기된 FnIII 도메인의 아미노산 서열 사이의 아미노산 서열 유사성의 백분율은 매우 낮을 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4)으로부터 유래된다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함한다. 이 도메인의 전체 3차원적 폴드는 가장 작은 항체 단편, 즉 낙타 및 낙타과(예를 들면, 라마)의 단일 도메인 항체 내의 전체 항원 인식 유닛을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)의 전체 3차원적 폴드와 밀접하게 관련되어 있다.
본 발명의 FnIII 스캐폴드 및 천연 FnIII 도메인은 동일한 3차원적 구조, 즉 한 면 상에서 3개의 베타 가닥(A, B 및 E)을 갖고 다른 한 면 상에서 4개의 베타 가닥(C, D, F 및 G)을 갖는 베타 샌드위치 구조(상기 베타 가닥들은 6개의 루프 영역들에 의해 연결되어 있음)를 특징으로 한다. 이들 루프 영역은 각각의 루프의 N 말단 및 C 말단에 연결된 베타 가닥들에 따라 명명된다. 따라서, AB 루프는 베타 가닥 A와 B 사이에 위치하고, BC 루프는 베타 가닥 B와 C 사이에 위치하고, CD 루프는 베타 가닥 C와 D 사이에 위치하고, DE 루프는 베타 가닥 D와 E 사이에 위치하고, EF 루프는 베타 가닥 E와 F 사이에 위치하고, FG 루프는 베타 가닥 F와 G 사이에 위치한다. FnIII 도메인은 높은 친화성으로 특정 표적에 결합할 수 있는 단백질 스캐폴드의 다양한 풀(pool)의 발생을 촉진하는 무작위화에 대한 내성을 나타내는 용매 노출된 루프를 보유한다.
도 16에 나타낸 다중 서열 정렬은 다수의 천연 FnIII 도메인에 대한 베타 가닥 및 루프의 위치를 그들의 3차원적 구조 및 아미노산 서열의 분석에 기초하여 확인시켜준다. 이들 FnIII 도메인은 사실상 임의의 표적 화합물, 예를 들면, 관심있는 임의의 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 디자인하는 데에 사용될 수 있다. 당업자는 도 16에 나타낸 정렬이 예시적이고 비한정적이라는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 도 16의 정렬은 인터프로스캔 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 인터프로 IPR008957 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정되거나, Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 히든 마르코브 모델과 비교할 수 있는 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 단백질 도메인을 도입함으로써 확장될 수 있다.
따라서, 단백질 스캐폴드 조작 및 디자인은 예를 들면, 하기 서열에 기초할 수 있다:
(i) 도 16에 나타낸 정렬된 서열 셋,
(ii) 도 16으로부터 유도된 정렬된 서열의 서브셋,
(iii) 실험적으로(예를 들면, X-선 회절 결정학 또는 NMR의 이용을 통해) 확인된 3차원적 구조를 갖는 FnIII 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 상이한 정렬된 셋, 및/또는
(iv) 아직 입수가능하지 않지만, 인터프로스캔 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 인터프로 IPR008957 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정되거나, Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 히든 마르코브 모델과 비교할 수 있는 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 3차원적 구조를 갖는 FnIII 도메인의 아미노산 서열.
본 발명의 한 양태에서, FnIII 도메인은 항체 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)과 유사한 1개 이상의 루프를 무작위화하도록 디자인된 유도 진화(directed evolution)를 받는 스캐폴드로서 사용된다. 이러한 유도 진화 방법은 관심있는 표적에 대한 높은 친화성을 나타내는 항체 유사 분자를 생성한다. 또한, 몇몇 실시양태에서, 이러한 도입된 루프에 결합하는 분자의 진화를 유도하기 위해 본원에 기재된 스캐폴드를 사용하여 정의된 노출된 루프(예를 들면, 표적 결합에 기초하여 미리 무작위화되고 선택된 루프)를 표시할 수 있다. 이러한 종류의 선택을 수행하여 임의의 개별 CDR 유사 루프에 대한 인식 분자, 또는 대안적으로 비선형 에피토프 결합 모이어티로 조합된 2개 또는 3개의 CDR 유사 루프에 대한 인식 분자를 확인할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 국제특허공보 제WO2009/058379호에 기재된 인간 테나신 C 구조 모티프의 제3 FnIII 도메인에 기초한 분자이다. 특이적 표적 결합을 부여할 수 있는 3개 루프(BC, DE 및 FG로 명명됨)의 셋은 각각 B 가닥과 C 가닥 사이, D 가닥과 E 가닥 사이, 및 F 베타 가닥과 G 베타 가닥 사이에서 존재한다. 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프는 각각 9개 아미노산 잔기, 6개 아미노산 잔기 및 10개 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 이들 루프의 길이는 항체 중쇄에서 발견되는 동족 항원 인식 루프의 좁은 범위, 즉 각각 7 내지 10개 아미노산 길이, 4 내지 8개 아미노산 길이 및 4 내지 28개 아미노산 길이 내에 포함된다. 유사하게, 루프의 제2 셋, 즉 AB 루프, CD 루프 및 EF 루프(각각 7개 아미노산 길이, 7개 아미노산 길이 및 8개 아미노산 길이)는 각각 A 베타 가닥과 B 베타 가닥 사이, C 베타 가닥과 D 베타 가닥 사이, 및 E 베타 가닥과 F 베타 가닥 사이에서 존재한다.
다른 실시양태에서, 인간 피브로넥틴로부터 유래된 제10 FnIII("10FnIII") 도메인(서열번호 54)에 기초한 분자는 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 도 16에서 정의된 바와 같이, 인간 피브로넥틴의 제10 FnIII 도메인에서, AB 루프는 서열번호 55에 상응하고, BC 루프는 서열번호 56에 상응하고, CD 루프는 서열번호 57에 상응하고, DE 루프는 서열번호 58에 상응하고, EF 루프는 서열번호 59에 상응하고, FG 루프는 서열번호 60에 상응한다. 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는, 이들 영역에 대한 대안적 정의는 당업계에서 공지되어 있다는 것을 이해할 것이다(예를 들면, 문헌(Xu et al. Chemistry & Biology 9:933-942, 2002) 참조).
다른 실시양태에서, 인간 피브로넥틴으로부터 유래된 제14 FnIII("14FnIII") 도메인(서열번호 69)에 기초한 분자는 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 도 16에서 정의된 바와 같이, 14FnIII의 AB 루프는 서열번호 70에 상응하고, BC 루프는 서열번호 71에 상응하고, CD 루프는 서열번호 72에 상응하고, DE 루프는 서열번호 73에 상응하고, EF 루프는 서열번호 74에 상응하고, FG 루프는 서열번호 75에 상응한다. 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는, 이들 영역에 대한 대안적 정의는 당업계에서 공지되어 있다는 것을 이해할 것이다(예를 들면, 미국 특허공보 제2009/0176654호(Cappuccilli et al.) 참조).
다른 실시양태에서, 테나신의 FnIII 도메인의 서열로부터 유래된 컨센서스 서열(서열번호 256)에 기초한 분자는 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 테나신 컨센서스 FnIII의 루프는 표 1에서 정의되어 있고, AB 루프는 서열번호 257에 상응하고, BC 루프는 서열번호 258에 상응하고, CD 루프는 서열번호 259에 상응하고, DE 루프는 서열번호 260에 상응하고, EF 루프는 서열번호 261에 상응하고, FG 루프는 서열번호 262에 상응한다. 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는, 이들 영역에 대한 대안적 정의는 당업계에서 공지되어 있다는 것을 이해할 것이다(예를 들면, 국제특허공보 제WO2010/093627호(Jacobs et al.) 참조).
일단 무작위화되고 표적과의 높은 친화성 결합에 대해 선택되면, FnIII 도메인 내의 루프는 항체 내의 동족 CDR 루프의 접촉과 동등한 표적과의 접촉을 만들 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프는 단독으로 또는 조합으로 무작위화되고 1개 이상의 표적과의 높은 친화성 결합에 대해 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 이 무작위화 및 선택 과정은 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의 루프의 무작위화와 동시에 수행될 수 있는 반면, 다른 실시양태에서 이 무작위화 및 선택 과정은 연속적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 단량체 스캐폴드
본 발명은 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥 도메인을 포함하는 재조합 비천연 FnIII 스캐폴드로서, 이때 상기 루프 영역들 중 1개 이상의 루프 영역이 관심있는 FnIII 도메인/스캐폴드(본원에서 "FOI"로서 지칭됨) 내의 동족 루프로부터의 1개 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 변이되고, 상기 FnIII 스캐폴드의 베타 가닥이 FOI의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타내는 것인 재조합 비천연 FnIII 스캐폴드를 제공한다.
FOI는 서열, 생리화학적 및/또는 발생계통학적 특성을 비교하는 데에 사용되는 기준물질이다. 본 발명의 스캐폴드의 서열을 FOI의 서열과 비교하는 경우, 베타 가닥 및 루프의 동일한 정의가 이용된다 것을 이해할 것이다. FOI는 천연 FnIII 도메인, 천연 FnIII 도메인을 포함하는 스캐폴드 또는 비천연 FnIII 스캐폴드일 수 있다. 일부 실시양태에서, FOI는 1개 이상의 비천연 루프를 포함한다. 일부 실시양태에서, FOI는 1개 이상의 비천연 베타 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, FOI는 1개 이상의 비천연 루프 및 1개 이상의 비천연 베타 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, FOI는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, FOI는 조작된 분자내 이황화 결합을 함유하는 인간 테나신의 제3 FnIII 도메인으로부터 유래된 스캐폴드인 야생형 Tn3 스캐폴드(서열번호 1)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역에 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하고, 이때 1개 이상의 루프는 FOI 내의 동족 루프의 비천연 변이체이고, 상기 베타 가닥은 FOI의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역에 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하고, 이때 1개 이상의 루프는 FOI 내의 동족 루프의 비천연 변이체이고, 상기 베타 가닥은 FOI의 동족 도메인에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 나타낸다.
특정 실시양태에서, FOI는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타내는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nIELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIS(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
한 실시양태에서, XAB는 서열번호 35로 구성된다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36으로 구성된다. 한 실시양태에서, XCD는 서열번호 37로 구성된다. 한 실시양태에서, XDE는 서열번호 38로 구성된다. 한 실시양태에서, XEF는 서열번호 39로 구성된다. 한 실시양태에서, XFG는 서열번호 40으로 구성된다.
한 실시양태에서, XAB는 서열번호 35를 포함한다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36을 포함한다. 한 실시양태에서, XCD는 서열번호 37을 포함한다. 한 실시양태에서, XDE는 서열번호 38을 포함한다. 한 실시양태에서, XEF는 서열번호 39를 포함한다. 한 실시양태에서, XFG는 서열번호 40을 포함한다.
일부 실시양태에서, XAB는 서열번호 35로 구성되고, XCD는 서열번호 37로 구성되고, XEF는 서열번호 39로 구성된다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36으로 구성되고, XDE는 서열번호 38로 구성되고, XFG는 서열번호 40으로 구성된다.
일부 실시양태에서, XAB는 서열번호 35를 포함하고, XCD는 서열번호 37을 포함하고, XEF는 서열번호 39를 포함한다. 한 실시양태에서, XBC는 서열번호 36을 포함하고, XDE는 서열번호 38을 포함하고, XFG는 서열번호 40을 포함한다.
특정 실시양태에서, FOI는 인간 피브로넥틴 스캐폴드의 야생형 제10 피브로넥틴 III형 도메인(10FnIII)(서열번호 54)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 야생형 10FnIII(서열번호 54)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 유사성을 나타내는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 야생형 10FnIII(서열번호 54)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
LEV(XAB)nLLISW(XBC)nYRITYGE(XCD)nQEFTV(XDE)nATI(XEF)nYTITVYA(XFG)nSINYRT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
한 실시양태에서, XAB는 10FnIII의 AB 루프의 아미노산 서열(서열번호 55)이다. 한 실시양태에서, XBC는 야생형 10FnIII의 BC 루프의 아미노산 서열(서열번호 56)이다. 한 실시양태에서, XCD는 야생형 10FnIII의 CD 루프의 아미노산 서열(서열번호 57)이다. 한 실시양태에서, XDE는 야생형 10FnIII의 DE 루프의 아미노산 서열(서열번호 58)이다. 한 실시양태에서, XEF는 야생형 10FnIII의 EF 루프의 아미노산 서열(서열번호 59)이다. 한 실시양태에서, XFG는 야생형 10FnIII의 FG 루프의 아미노산 서열(서열번호 60)이다.
일부 실시양태에서, XAB는 야생형 10FnIII의 AB 루프의 아미노산 서열(서열번호 55)이고, XCD는 야생형 10FnIII의 CD 루프의 아미노산 서열(서열번호 57)이고, XEF는 야생형 10FnIII의 EF 루프의 아미노산 서열(서열번호 59)이다.
한 실시양태에서, XBC는 야생형 10FnIII의 BC 루프의 아미노산 서열(서열번호 56)이고, XDE는 야생형 10FnIII의 DE 루프의 아미노산 서열(서열번호 58)이고, XFG는 야생형 10FnIII의 FG 루프의 아미노산 서열(서열번호 60)이다.
특정 실시양태에서, FOI는 인간 피브로넥틴 스캐폴드의 야생형 제14 피브로넥틴 III형 도메인(14FnIII)(서열번호 69)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 야생형 14FnIII(서열번호 69)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 유사성을 나타내는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 야생형 14FnIII(서열번호 69)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
ARV(XAB)nITISW(XBC)nFQVDAVP(XCD)nIQRTI(XDE)nYTI(XEF)nYKIYLYT(XFG)nVIDAST
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
한 실시양태에서, XAB는 야생형 14FnIII의 AB 루프의 아미노산 서열(서열번호 70)이다. 한 실시양태에서, XBC는 야생형 14FnIII의 BC 루프의 아미노산 서열(서열번호 71)이다. 한 실시양태에서, XCD는 야생형 14FnIII의 CD 루프의 아미노산 서열(서열번호 72)이다. 한 실시양태에서, XDE는 야생형 14FnIII의 DE 루프의 아미노산 서열(서열번호 73)이다. 한 실시양태에서, XEF는 야생형 14FnIII의 EF 루프의 아미노산 서열(서열번호 74)이다. 한 실시양태에서, XFG는 야생형 14FnIII의 FG 루프의 아미노산 서열(서열번호 75)이다.
일부 실시양태에서, XAB는 야생형 14FnIII의 AB 루프의 아미노산 서열(서열번호 70)이고, XCD는 야생형 14FnIII의 CD 루프의 아미노산 서열(서열번호 72)이고, XEF는 야생형 14FnIII의 EF 루프의 아미노산 서열(서열번호 74)이다. 한 실시양태에서, XBC는 야생형 14FnIII의 BC 루프의 아미노산 서열(서열번호 71)이고, XDE는 야생형 14FnIII의 DE 루프의 아미노산 서열(서열번호 73)이고, XFG는 야생형 14FnIII의 FG 루프의 아미노산 서열(서열번호 75)이다.
특정 실시양태에서, FOI는 테나신 컨센서스 FnIII(서열번호 256)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 테나신 컨센서스 FnIII(서열번호 256)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 유사성을 나타내는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 테나신 컨센서스 FnIII(서열번호 256)에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
LVV(XAB)nLRLSW(XBC)nFLIQYQE(XCD)nINLTV(XDE)nYDL(XEF)nYTVSIYG(XFG)nSAEFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
한 실시양태에서, XAB는 테나신 컨센서스 FnIII의 AB 루프의 아미노산 서열(서열번호 257)이다. 한 실시양태에서, XBC는 테나신 컨센서스 FnIII의 BC 루프의 아미노산 서열(서열번호 258)이다. 한 실시양태에서, XCD는 테나신 컨센서스 FnIII의 CD 루프의 아미노산 서열(서열번호 259)이다. 한 실시양태에서, XDE는 테나신 컨센서스 FnIII의 DE 루프의 아미노산 서열(서열번호 260)이다. 한 실시양태에서, XEF는 테나신 컨센서스 FnIII의 EF 루프의 아미노산 서열(서열번호 261)이다. 한 실시양태에서, XFG는 테나신 컨센서스 FnIII의 FG 루프의 아미노산 서열(서열번호 262)이다.
일부 실시양태에서, XAB는 테나신 컨센서스 FnIII의 AB 루프의 아미노산 서열(서열번호 257)이고, XCD는 테나신 컨센서스 FnIII의 CD 루프의 아미노산 서열(서열번호 259)이고, XEF는 테나신 컨센서스 FnIII의 EF 루프의 아미노산 서열(서열번호 261)이다. 한 실시양태에서, XBC는 테나신 컨센서스 FnIII의 BC 루프의 아미노산 서열(서열번호 258)이고, XDE는 테나신 컨센서스 FnIII의 DE 루프의 아미노산 서열(서열번호 260)이고, XFG는 테나신 컨센서스 FnIII의 FG 루프의 아미노산 서열(서열번호 262)이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nIELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIS(XFG)nKETFTT,
LEV(XAB)nLLISW(XBC)nYRITYGE(XCD)nQEFTV(XDE)nATI(XEF)nYTITVYA(XFG)nSINYRT,
ARV(XAB)nITISW(XBC)nFQVDAVP(XCD)nIQRTI(XDE)nYTI(XEF)nYKIYLYT(XFG)nVIDAST, 및
LVV(XAB)nLRLSW(XBC)nFLIQYQE(XCD)nINLTV(XDE)nYDL(XEF)nYTVSIYG(XFG)nSAEFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이고, 이때 XAB는 서열번호 35, 서열번호 55, 서열번호 70 및 서열번호 257로 구성된 군으로부터 선택되고, XCD는 서열번호 37, 서열번호 57, 서열번호 72 및 서열번호 259로 구성된 군으로부터 선택되고, XEF는 서열번호 39, 서열번호 59, 서열번호 74 및 서열번호 261로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 하기 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nIELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIS(XFG)nKETFTT,
LEV(XAB)nLLISW(XBC)nYRITYGE(XCD)nQEFTV(XDE)nATI(XEF)nYTITVYA(XFG)nSINYRT,
ARV(XAB)nITISW(XBC)nFQVDAVP(XCD)nIQRTI(XDE)nYTI(XEF)nYKIYLYT(XFG)nVIDAST, 및
LVV(XAB)nLRLSW(XBC)nFLIQYQE(XCD)nINLTV(XDE)nYDL(XEF)nYTVSIYG(XFG)nSAEFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이고, 이때 XBC는 서열번호 36, 서열번호 56, 서열번호 71 및 서열번호 258로 구성된 군으로부터 선택되고, XDE는 서열번호 38, 서열번호 58, 서열번호 73 및 서열번호 260으로 구성된 군으로부터 선택되고, XFG는 서열번호 40, 서열번호 60, 서열번호 75 및 서열번호 262로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 Tn3 모듈(서열번호 1)을 포함하고, 이때 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 베타 가닥 C(서열번호 44)가 N 말단 시스테인을 포함하는 변이체 베타 가닥 C(서열번호 45 또는 서열번호 131)로 치환되고, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 베타 가닥 F(서열번호 48)가 C 말단 시스테인을 포함하는 변이체 베타 가닥 F(서열번호 49)로 치환된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함하고, 이때 베타 가닥 C 및 F(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 1개 이상의 베타 가닥이 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 10FnIII 모듈의 변이체를 포함하고, 이때 1개 이상의 베타 가닥이 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 14FnIII 모듈의 변이체를 포함하고, 이때 1개 이상의 베타 가닥이 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 테나신 컨센서스 FnIII 모듈의 변이체를 포함하고, 이때 1개 이상의 베타 가닥이 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 천연 서열은 인간 테나신 C로부터의 추가 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 다른 실시양태에서, 천연 서열은 인간 테나신 XB로부터의 제29 FnIII 도메인(서열번호 11), 인간 테나신 XB로부터의 제31 FnIII 도메인(서열번호 12) 또는 인간 테나신 XB로부터의 제32 FnIII 도메인(서열번호 13)을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 또 다른 테나신 단백질로부터의 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 다른 실시양태에서, 천연 서열은 또 다른 유기체(예컨대, 뮤린, 돼지, 소 또는 말 테나신을 포함하나 이들로 한정되지 않음)로부터의 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용되는 FnIII 도메인은 예를 들면, 동물, 식물, 세균, 고세균 또는 바이러스로부터의 관련 FnIII 도메인을 포함한다. 상이한 유기체 및 모 단백질로부터의 상이한 FnIII 도메인은 상이한 적용에 가장 적합할 수 있고, 예를 들면, 낮은 pH에서 안정한 스캐폴드를 디자인함에 있어서, 낮은 pH에서 최적으로 성장하는 유기체(예컨대, 설폴로버스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii)(그러나, 이로 한정되지 않음)로부터 상기 단백질을 발생시키는 것이 가장 바람직할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관련 FnIII 도메인은 호열성 유기체 및 고호열성 유기체(예를 들면, 고호열성 세균 또는 고호열성 고세균)로부터 확인되고 이용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용되는 FnIII 도메인은 고호열성 고세균, 예컨대, 70℃ 초과의 온도에서 최적 성장을 나타내는 아키오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus) 및 스타필로써머스 마리너스(Staphylothermus marinus)(그러나, 이들로 한정되지 않음)로부터의 FnIII 도메인이다. 다른 실시양태에서, 천연 서열은 호열성 유기체, 예를 들면, 아키오글로버스 풀기더스, 스타필로써머스 마리너스, 설폴로버스 액시도칼다리어스, 설폴로버스 솔파타리커스 및 설폴로버스 토코다이이(그러나, 이들로 한정되지 않음)로부터의 예측된 FnIII 도메인에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 전술된 호열성 유기체로부터의 FnIII 도메인 또는 예측된 FnIII 도메인에 상응하는 서열로부터의 서열들 중 임의의 서열에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(서열 유사성)을 나타내는 단백질 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 호열성 유기체로부터의 FnIII 도메인은 서열번호 20 내지 서열번호 33의 아미노산 서열로부터 선택된다.
본 발명의 스캐폴드의 다양한 베타 가닥을 연결하는 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된 1개 이상의 루프를 갖는다. 한 실시양태에서, 스캐폴드의 1개 이상의, 2개 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의, 5개 이상의 또는 모든 6개의 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드의 1개 이상의 루프가 불변 상태로 유지되고, 1개 이상의 추가 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 불변 상태로 유지되고, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 길이 또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 무작위화되고, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의 또는 모든 3개의 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프, EF 루프, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의, 2개 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의, 5개 이상의 또는 모든 6개의 루프가 길이 또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다.
몇몇 실시양태에서, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 불변 상태로 유지되고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 몇몇 실시양태에서, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 예정되고 제한된 수의 상이한 아미노산으로 유지되고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 따라서, 본 발명의 스캐폴드는 축퇴 컨센서스 서열 및/또는 1개 이상의 불변 아미노산 잔기를 갖는 1개 이상의 루프를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 AB 루프를 포함한다: K-X-X-X-X-X-a(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 AB 루프를 포함한다: K-X-X-X-X-X-X-X-a(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타냄).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 포함한다: S-X-a-X-b-X-X-X-G(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 프롤린 또는 알라닌을 나타내고, b는 알라닌 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 포함한다: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, c는 프롤린, 세린 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 포함한다: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, d는 프롤린, 글루타메이트 또는 라이신을 나타내고, e는 아스파라긴 또는 글리신을 나타내고, f는 세린 또는 글리신을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 CD 루프를 포함한다: Xn(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, n은 6, 7, 8, 9 또는 10임). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 CD 루프를 포함한다: Xn(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, n은 7, 8 또는 9임).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 DE 루프를 포함한다: X-X-X-X-X-X(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 EF 루프를 포함한다: X-b-L-X-P-X-c-X(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, b는 아스파라긴, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신을 나타내고, c는 이소류신, 쓰레오닌, 세린, 발린, 알라닌 또는 글리신을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-a-X-X-G-X-X-X-b(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 알라닌을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-X-X-X-X-X-X-X-X(X9)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 글리신을 나타냄). 추가 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 포함한다: X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타냄).
일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 FOI의 동족 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산 잔기만큼 더 짧은 상태로 유지되고 1개 이상의 위치에서 추가로 무작위화된 FG 루프를 포함한다. 예를 들면, 도 16에서 정의된 바와 같이, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 천연 FG 루프는 10개의 아미노산 잔기를 포함하므로, 상기 FG 루프는 9개 이하의 아미노산 잔기로 유지될 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 복수의 FOI로부터 선택된 상동성 베타 가닥으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 1개 이상의 베타 가닥을 포함하는 키메라 스캐폴드이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의 루프가 무작위화되어 있는 키메라 스캐폴드이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상의 루프가 무작위화되어 있는 키메라 스캐폴드이다.
특정 실시양태에서, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상의 루프가 무작위화되어 있고, 이때 A 베타 가닥이 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 248 또는 서열번호 249를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43, 서열번호 63, 서열번호 78 또는 서열번호 250을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 64, 서열번호 79, 서열번호 131 또는 서열번호 251을 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46, 서열번호 65, 서열번호 80 또는 서열번호 252를 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47, 서열번호 66, 서열번호 81 또는 서열번호 253을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 67, 서열번호 82 또는 서열번호 254를 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 68, 서열번호 83 또는 서열번호 255를 포함하고, AB 루프가 서열번호 35, 서열번호 55, 서열번호 70 또는 서열번호 242를 포함하고, CD 루프가 서열번호 37, 서열번호 57, 서열번호 72 또는 서열번호 244를 포함하고, EF 루프가 서열번호 39, 서열번호 59, 서열번호 74 또는 서열번호 246을 포함한다,
다른 특정 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상의 루프가 무작위화되어 있고, 이때 A 베타 가닥이 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 248 또는 서열번호 249를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43, 서열번호 63, 서열번호 78 또는 서열번호 250을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 64, 서열번호 79, 서열번호 131 또는 서열번호 251을 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46, 서열번호 65, 서열번호 80 또는 서열번호 252를 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47, 서열번호 66, 서열번호 81 또는 서열번호 253을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 67, 서열번호 82 또는 서열번호 254를 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 68, 서열번호 83 또는 서열번호 255를 포함하고, BC 루프가 서열번호 36, 서열번호 56, 서열번호 71 또는 서열번호 243을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38, 서열번호 58, 서열번호 73 또는 서열번호 245를 포함하고, FG 루프가 서열번호 40, 서열번호 60, 서열번호 75 또는 서열번호 247을 포함한다,
향상된 스캐폴드 안정성
비천연 이황화 결합
본 발명의 스캐폴드의 안정성은 많은 상이한 방법들에 의해 증가될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역의 연장에 의해 안정화될 수 있다. N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산, 또는 10개 초과의 아미노산에 의해 연장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 본원에 기재된 바와 같이 혈청 반감기를 증가시키는 변경의 도입에 의해 안정화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 상기 스캐폴드의 소수성 코어를 안정화시키기 위한 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다.
본 발명의 스캐폴드는 비천연 이황화 결합의 조작에 의해서도 효과적으로 안정화될 수 있다. 이러한 조작된 스캐폴드는 다량체 스캐폴드의 일부로서 효율적으로 발현될 수 있다. 이황화 결합의 정확한 형성 및 조작된 스캐폴드의 정확한 폴딩은 상기 스캐폴드의 생물학적 활성의 보존에 의해 입증된다. 비천연 이황화 결합을 포함하는 조작된 스캐폴드가 2개 이상의 표적(예를 들면, 실시예 8 참조) 또는 3개 이상의 표적(예를 들면, 실시예 12 참조)에 동시적으로 결합할 수 있다는 사실은 상기 스캐폴드의 3차원적 구조가 조작된 이황화 결합에 의해 유의하게 변경되지 않고 표적 결합 루프의 상대적 위치가 보존된다는 것을 입증하는 증거를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 국제특허공보 제WO2009/058379호에 기재된 바와 같이 비천연 이황화 결합을 포함한다. 생체정보학적 방법을 이용하여 이황화 결합의 조작에 적합한 후보 위치를 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단량체 스캐폴드는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 2개, 3개, 4개 또는 이보다 많은 수의 조작된 분자내 이황화 결합을 포함하는 FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 스캐폴드를 수득하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 상기 1개 이상의 비천연 이황화 결합은 단량체 스캐폴드를 안정화시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 동일한 단량체 스캐폴드 내의 2개의 베타 가닥 사이에 위치하는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 예를 들면, 단량체 스캐폴드 내의 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합은 A 가닥과 B 가닥 사이, D 가닥과 E 가닥 사이, F 가닥과 G 가닥 사이, 또는 C 가닥과 F 가닥 사이에서 결합을 형성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 비천연 이황화 결합은 단일 단랑체 스캐폴드 내의 F 가닥과 G 가닥 사이에서 제1 결합을 형성하고 단일 단랑체 스캐폴드 내의 C 가닥과 F 가닥 사이에서 제2 결합을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 동일한 단량체 스캐폴드 내의 2개의 루프 사이에 위치하는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 동일한 단량체 스캐폴드의 루프와 베타 가닥 사이에 위치하는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 단량체 스캐폴드 내의 동일한 베타 가닥 내에 위치하는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 단량체 스캐폴드 내의 동일한 루프 내에 위치하는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함하고, 이때 상기 결합은 다량체 스캐폴드 내의 2개의 상이한 단량체 스캐폴드 사이에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함하고, 이때 상기 결합은 2개의 상이한 다량체 스캐폴드 사이에 위치한다(즉, 상기 이황화 결합은 분자간 이황화 결합이다). 예를 들면, 이황화 결합은 상이한 스캐폴드(예를 들면, 2개의 단리된 단량체 스캐폴드, 단리된 단량체 스캐폴드와 다량체 스캐폴드, 또는 2개의 다량체 스캐폴드)를 연결할 수 있거나, 스캐폴드와 링커를 연결할 수 있거나, 스캐폴드와 Fn 도메인을 연결할 수 있거나, 스캐폴드와 항체 또는 이의 단편을 연결할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 스캐폴드와 단리된 이종 모이어티를 연결하거나, 스캐폴드와 동일한 스캐폴드에 융합되거나 접합된 이종 모이어티를 연결하거나, 스캐폴드와 상이한 스캐폴드에 융합되거나 접합된 이종 모이어티를 연결하는 1개 이상의 비천연 분자간 이황화 결합을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 스캐폴드로 구성된 다량체 스캐폴드를 형성하는 이황화 결합을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역의 연장을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 본원에 기재된 바와 같이 혈청 반감기를 증가시키기 위한 변경을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 상기 스캐폴드의 소수성 코어를 안정화시키기 위한 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 본 발명의 스캐폴드의 베타 가닥은 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 서열번호 256 중 임의의 한 서열의 동족 베타 가닥; 도 16에 나타낸 FnIII 도메인들 중 임의의 FnIII 도메인의 베타 가닥; 또는 인터프로스캔 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 인터프로 IPR008957 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정되거나, Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 히든 마르코브 모델과 비교할 수 있는 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 단백질 도메인의 베타 가닥에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 44를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 50을 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 53을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 53을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합으로 구성되고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 44로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 50으로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 53으로 구성된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합으로 구성되고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 51로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 53으로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 본질적으로 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합으로 구성되고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 44로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 50으로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 53으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 본질적으로 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합으로 구성되고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 51로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 53으로 구성된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, AB 루프는 서열번호 35를 포함하고, CD 루프는 서열번호 37을 포함하고, EF 루프는 서열번호 39를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 서열번호 39로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 본질적으로 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 본질적으로 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 본질적으로 서열번호 39로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, BC 루프는 서열번호 36을 포함하고, DE 루프는 서열번호 38을 포함하고, FG 루프는 서열번호 40을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 서열번호 40으로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 본질적으로 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 본질적으로 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 본질적으로 서열번호 40으로 구성된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, AB 루프는 서열번호 35를 포함하고, CD 루프는 서열번호 37을 포함하고, EF 루프는 서열번호 39를 포함하고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 서열번호 39로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 본질적으로 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 본질적으로 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 본질적으로 서열번호 39로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, BC 루프는 서열번호 36을 포함하고, DE 루프는 서열번호 38을 포함하고, FG 루프는 서열번호 40을 포함하고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 서열번호 40으로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 본질적으로 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 본질적으로 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 본질적으로 서열번호 40으로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 및 F 베타 가닥(각각 서열번호 45 및 서열번호 49) 내의 시스테인 잔기가 치환될 수 없다는 점을 제외하고 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
향상된 스캐폴드 안정성: FG 루프 길이
본 발명자들은 FG 루프의 길이가 FnIII 스캐폴드의 안정성에 있어서 일정한 역할을 수행한다는 것을 발견하였다. 구체적으로, FOI의 FG 루프에서 발견되는 길이보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 비천연 변이체 FG 루프를 포함하는 FnIII 스캐폴드는 향상된 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 FOI의 변이체를 조작하는 단계를 포함하는, FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 피브로넥틴 III형(FnIII) 스캐폴드 변이체를 수득하는 방법으로서, 이때 상기 변이체의 FG 루프가 1개 이상의 아미노산의 결실을 포함하고, 상기 변이체가 상기 FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 FOI의 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 비천연 변이체 FG 루프를 포함한다. 예를 들면, 본원에서 정의된 바와 같이, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 천연 FG 루프는 10개의 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인을 FOI로서 사용하여 개선된 안정성을 나타내는 FnIII 스캐폴드를 확인하기 위해, FG 루프의 길이를 9개 이하의 아미노산 잔기까지 감소시켜야 할 것이다.
FnIII 도메인의 아미노산 서열 사이의 서열 유사성은 일반적으로 낮지만, 전체 3차원적 구조는 유사하다. 따라서, 공지된 기법, 예컨대, 서열 분석 및 구조 중첩을 이용하여, 다수의 FOI로부터의 FnIII 도메인(예를 들면, 상이한 종, 상이한 단백질 및 표적에 결합하는 상이한 FnIII 스캐폴드로부터의 FnIII 도메인)의 FG 루프를 확인할 수 있다(예를 들면, 도 16 참조). 그 다음, 이들 루프에서 돌연변이를 유발하여 FOI로부터의 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 FG 루프를 생성할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 FG 루프의 어떤 특정 정의가 사용되는지와 관계없이 FOI의 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 비천연 변이체 FG 루프를 포함하는 FnIII 스캐폴드를 포괄한다.
특정 실시양태에서, FOI의 안정성은 FOI의 FG 루프에서 1개 이상의 아미노산이 결실됨으로써 향상된다. 또 다른 실시양태에서, FOI의 안정성은 상기 FG 루프에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산이 결실됨으로써 향상된다. 구체적으로, 안정화된 FOI는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함할 수 있을 것으로 예측된다. 일부 실시양태에서, FOI는 안정화되기 전에 비천연 분자내 이황화 결합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 안정화된 FOI는 1개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 도입하도록 추가로 조작된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 FOI의 변이체를 조작하는 단계를 포함하는, FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 FnIII 스캐폴드 변이체를 수득하는 방법으로서, 이때 상기 변이체의 FG 루프가 이 FG 루프에서의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산의 결실을 포함하고, 이때 상기 변이체가 상기 FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, FnIII 스캐폴드 변이체는 길이 및/또는 서열에 대해 무작위화된 1개 이상의 루프(즉, AB, BC, CD, DE, EF 및/또는 FG)도 포함한다. 구체적으로, FnIII 스캐폴드 변이체는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 포함할 수 있을 것으로 예측된다. 일부 실시양태에서, FOI는 비천연 이황화 결합을 포함한다. 다른 실시양태에서, FnIII 변이체는 1개 이상의 비천연 이황화 결합을 도입하도록 추가로 조작된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 FnIII 스캐폴드 변이체(즉, 안정화된 FOI)이고, 이때 상기 FnIII 스캐폴드 변이체는 상기 FOI의 FG 루프보다 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기만큼 더 짧은 FG 루프를 포함하고, 상기 FnIII 스캐폴드 변이체는 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
안정성 측정
단리된 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드, 또는 다량체 스캐폴드의 일부로서의 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드의 안정성의 증가는 당업계에서 잘 공지되어 있는 기법, 예컨대, 열적(Tm) 변성 및 카오트로픽(chaotropic) 변성(예를 들면, 우레아 또는 구아니딘 염을 사용한 처리), 단백질분해효소 처리(예컨대, 써모라이신(thermolysin)을 사용한 처리), 또는 단백질 안정성을 측정하는, 당분야에서 승인된 또 다른 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 단백질 안정성의 측정을 위해 이용되는 기법의 포괄적인 검토는 예를 들면, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology" and "Current Protocols in Protein Science" by John Wiley and Sons. 2007)에서 발견될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드는 내열성, 카오트로픽 변성에 대한 내성, 단백질분해효소 처리 또는 당업계에서 잘 공지되어 있는 또 다른 안정성 파라미터에 의해 측정되었을 때 조작 전의 동일한 FnIII 스캐폴드(즉, FOI)에 비해 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 안정성 증가를 나타낸다.
단백질의 안정성은 다양한 조건 하에서 단백질에 의해 나타나는 형광도에 의해 측정될 수 있다. 단백질의 상대적인 언폴딩도(unfoldedness)와, 단백질이 스트레스 하에서 나타내는 내부 형광도의 변화 사이에 양의 상관관계가 존재한다. 열적 언폴딩 특성을 측정하기에 적합한 단백질 안정성 분석은 시차 주사 열량측정법(DSC) 및 원이색법(CD)을 포함한다. 단백질이 DSC 또는 CD에 의해 측정된 파라미터에서 상당한 크기의 변동을 나타내는 경우, 상기 변동은 언폴딩된 구조와 상관관계를 갖는다. 이 변동이 발생하는 온도는 용융 온도 또는 Tm으로 지칭된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 스캐폴드는 유사한 조건 하에서 FOI에 비해 1℃ 이상, 2℃ 이상, 3℃ 이상, 4℃ 이상, 5℃ 이상, 10℃ 이상, 15℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 71℃ 이상, 72℃ 이상, 73℃ 이상, 74℃ 이상, 75℃ 이상, 76℃ 이상, 77℃ 이상, 78℃ 이상, 79℃ 이상, 80℃ 이상, 81℃ 이상, 82℃ 이상, 83℃ 이상, 84℃ 이상, 85℃ 이상, 86℃ 이상, 87℃ 이상, 88℃ 이상, 89℃ 이상, 90℃ 이상, 91℃ 이상, 92℃ 이상, 93℃ 이상, 94℃ 이상, 95℃ 이상, 96℃ 이상, 97℃ 이상, 98℃ 이상, 100℃ 이상, 105℃ 이상, 110℃ 이상 또는 120℃ 이상의 증가된 용융 온도(Tm)를 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드는 유사한 조건 하에서 FOI에 비해 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 증가된 용융 온도(Tm)를 나타낸다.
단백질 안정성에 대한 또 다른 분석은 단백질 내에서의 상호작용을 불안정화시키는 작용을 하는 카오트로픽제, 예컨대, 우레아 또는 구아니딘(예를 들면, 구아니딘-HCl 또는 구아니딘 이소티오시아테이트)에 단백질을 노출시키는 단계를 포함한다. 단백질이 증가하는 수준의 우레아 또는 구아니딘에 노출되었을 때, 단백질 분자의 50%가 언폴딩되는 값을 평가하기 위해 상대적인 고유 형광도를 측정한다. 이 값은 Cm 값으로 지칭되고, 단백질 안정성에 대한 기준 값을 나타낸다. Cm 값이 높을수록 단백질의 안정성은 높아진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드는 유사한 조건 하에서 우레아 변성 실험에서 측정되었을 때 FOI에 비해 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 증가된 Cm을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드는 유사한 조건 하에서 구아니딘-HCl 변성 실험에서 측정되었을 때 FOI에 비해 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 증가된 Cm을 나타낸다.
단백질 안정성의 분석을 위해 이용되는 또 다른 분석은 단백질분해효소 내성 분석이다. 이 분석에서, 단백질 안정성의 상대적인 수준은 시간의 경과에 따른 단백질분해효소에 의한 분해에 대한 내성과 상관관계를 갖는다. 단백질분해효소 처리에 대한 내성이 높을수록 단백질의 안정성은 높아진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 FnIII 스캐폴드는 유사한 조건 하에서 FOI에 비해 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상까지 증가된 안정성을 나타낸다.
다량체 스캐폴드
본 발명의 한 양태는 직렬로 연결된 2개 이상의 본 발명의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드를 제공한다. 이러한 다량체 스캐폴드는 다수의 포맷으로 조립될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 단량체 스캐폴드는 선형 포맷으로 조립되는 반면, 다른 실시양태에서, 상기 스캐폴드는 분지된 포맷으로 조립된다(예를 들면, 도 1 참조). 특정 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 다량체 스캐폴드를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드 내의 각각의 FnIII 스캐폴드는 상이한 표적에 결합하여 다수의 기능을 나타내고/내거나, 동일한 표적에 결합하여 원자가 및/또는 표적 결합의 친화력을 증가시킨다. 몇몇 실시양태에서, 원자가 및/또는 표적 결합의 친화력의 증가는 다수의 스캐폴드가 동일한 표적에 결합할 때 달성된다. 몇몇 실시양태에서, 원자가의 증가는 표적에 대한 특정 작용을 개선시킨다(예컨대, 표적 단백질의 이량체화를 증가시킴).
특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 직렬로 연결된 2개 이상의 본 발명의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 스캐폴드는 1개 이상의 표적에 결합하고, 각각의 FnIII 스캐폴드는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고, 1개 이상의 루프는 FOI 내의 동족 루프의 비천연 변이체이고, FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 FOI의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 각각의 FnIII 스캐폴드는 동일한 FOI의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 각각의 FnIII 스캐폴드는 야생형 Tn3 스캐폴드의 동족 베타 가닥(서열번호 1)에 대해 50% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다. 구체적으로, 각각의 FnIII 스캐폴드는 상이한 FOI에 대해 50% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낼 수 있을 것으로 예측된다. 예를 들면, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 제1 FnIII 스캐폴드 및 제2 FnIII 스캐폴드를 포함할 수 있고, 이때 상기 제1 FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 피브로넥틴의 제14 FnIII 도메인의 동족 베타 가닥(서열번호 69)에 대해 50% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타내고, 제2 FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 야생형 Tn3 스캐폴드의 동족 베타 가닥(서열번호 1)에 대해 50% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 야생형 Tn3 스캐폴드이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 인간 테나신 C로부터의 추가 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 또 다른 테나신 단백질 또는 대안적으로 또 다른 유기체로부터의 테나신 단백질(예컨대, 뮤린, 돼지, 소 또는 말 테나신(그러나, 이들로 한정되지 않음))로부터의 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 하기 FnIII 도메인들 중 임의의 FnIII 도메인 내의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다: 인간 테나신 XB로부터의 제29 FnIII 도메인(서열번호 11), 인간 테나신 XB로부터의 제31 FnIII 도메인(서열번호 12), 인간 테나신 XB로부터의 제32 FnIII 도메인(서열번호 13), 인간 피브로넥틴의 제3 FnIII 도메인(서열번호 6), 인간 피브로넥틴의 제6 FnIII 도메인(서열번호 7), 인간 피브로넥틴의 제10 FnIII 도메인(예를 들면, 서열번호 5 및 서열번호 54), 인간 피브로넥틴의 제14 FnIII 도메인(예를 들면, 서열번호 69 및 서열번호 34), 인간 성장호르몬 수용체로부터의 FnIII 도메인(예를 들면, 서열번호 8 및 서열번호 15), 베타 공통 수용체로부터의 FnIII 도메인(예를 들면, 서열번호 9), IL-5 수용체로부터의 FnIII(예를 들면, 서열번호 10), PTPR-F로부터의 FnIII(예를 들면, 서열번호 16 및 서열번호 17), 및 콜라겐 XIV형으로부터의 FnIII 도메인(예를 들면, 서열번호 18).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 임의의 유기체로부터의 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 천연 서열은 호열성 또는 고호열성 유기체, 예를 들면, 아키오글로버스 풀기더스, 스타필로써머스 마리너스, 설폴로버스 액시도칼다리어스, 설폴로버스 솔파타리커스 및 설폴로버스 토코다이이(그러나, 이들로 한정되지 않음)로부터의 예측된 FnIII 도메인에 상응한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 도 16에 제시된 FnIII 도메인들 중 임의의 한 FnIII 도메인 내의 동족 베타 가닥, 또는 인터프로스캔 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 인터프로 IPR008957 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정되거나, Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 히든 마르코브 모델과 비교할 수 있는 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 단백질 도메인에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다.
다량체 직렬 스캐폴드
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 8개 또는 이보다 많은 수의 본 발명의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FnIII 단량체 스캐폴드들 중 몇몇은 직렬로 연결되어 있다. 또 다른 실시양태에서, FnIII 단량체 스캐폴드들 중 몇몇은 직렬로 연결되어 있고, FnIII 단량체 스캐폴드들 중 몇몇은 직렬로 연결되어 있지 않다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 직렬로 연결된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이보다 많은 수의 스캐폴드를 포함한다(예를 들면, 도 1 및 2 참조).
한 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드는 예를 들면, FnIII 스캐폴드의 직접적인 연결, 또는 링커, 예를 들면, 펩티드 링커의 포함에 의해 FnIII 단량체 스캐폴드 사이의 공유결합을 통해 발생된다. 구체적인 예에서, 공유결합된 스캐폴드는 단량체 FnIII 스캐폴드를 코딩하는 융합 유전자를 구축함으로써, 또는 대안적으로 시스테인 잔기에 대한 코돈을 단량체 FnIII 스캐폴드 내로 도입하는 조작을 수행한 후 발현 생성물 사이에 이황화 결합 형성이 일어나게 함으로써 발생된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 임의의 추가 개재 아미노산 없이 서로 직접적으로 연결되어 있는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 링커, 예를 들면, 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 펩티드 링커는 1 내지 약 1,000개, 1 내지 약 500개, 1 내지 약 250개, 1 내지 약 100개, 1 내지 약 50개 또는 1 내지 약 25개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 펩티드 링커는 1 내지 약 20개, 1 내지 약 15개, 1 내지 약 10개 또는 1 내지 약 5개의 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 링커, 예를 들면, 펩티드 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 링커는 기능성 모이어티이다. 상기 기능성 모이어티는 상기 다량체 스캐폴드의 원하는 기능 및/또는 특성에 기초하여 선택될 것이다. 예를 들면, 정제에 유용한 기능성 모이어티(예를 들면, 히스티딘 태그)가 링커로서 사용될 수 있다. 링커로서 유용한 기능성 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 세포독성제, 방사성핵종, 조영제, 바이오틴, 이량체화 도메인(예를 들면, 류신 지퍼 도메인), 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 이의 FcRn 결합 부분, 항체의 도메인 또는 단편(예를 들면, 항체 가변 도메인, CH1 도메인, C카파 도메인, C람다 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인), 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, IgG 분자, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 링커로서 사용될 수 있는 특정 펩티드 링커 및 기능성 모이어티는 하기 개시되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 1개 이상의 링커를 통해 연결되어 있는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 FnIII 스캐폴드 사이에 개재된 상기 링커는 동일한 링커 또는 상이한 링커일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 동일한 링커 또는 상이한 링커일 수 있는 다수의 링커를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 복수의 링커가 연쇄적으로 연결되어 있는 경우, 몇몇 또는 모든 링커는 기능성 모이어티일 수 있다.
다량체 스캐폴드 결합 화학양론
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 동일한 에피토프에 대해 특이적인 스캐폴드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 동일한 또는 상이한 표적 상의 상이한 에피토프일 수 있는 상이한 에피토프에 대해 특이적인 스캐폴드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드의 스캐폴드는 동일한 표적 분자 상의 2개 이상의 상이한 에피토프(예를 들면, 비중복 에피토프)에 결합한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드의 스캐폴드는 상이한 표적 분자 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드의 스캐폴드는 동일한 표적 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합하고 추가로 1개 이상의 상이한 표적 분자 상의 1개 이상의 에피토프에 결합한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드의 스캐폴드는 다량체 표적 분자 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드의 스캐폴드는 인접 표적 분자 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드의 스캐폴드는 인접 세포 표면 상의 표적 분자의 2개 이상의 카피 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 다량체 스캐폴드의 스캐폴드는 동일한 또는 상이한 결합 친화성 및/또는 친화력으로 동일한 표적 또는 상이한 표적 상의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드 내의 단량체 스캐폴드는 원하는 효과를 달성하거나 (예를 들면, 상승작용적으로) 향상시키도록 디자인된 특정 결합 패턴에 따라 특정 표적에 결합할 수 있다. 예를 들면, 선형 다량체 스캐폴드 내의 FnIII 스캐폴드는 일정한 패턴에 따라 단일 표적 또는 다수의 표적에 결합할 수 있고, 예를 들면, 6 모듈 선형 다가 스캐폴드 내의 FnIII 스캐폴드는 AAABBB 패턴, AABBAA 패턴, ABABAB 패턴, AAAABB 패턴 등에 따라 2개의 표적 A 및 B에 결합할 수 있고, AABBCC 패턴, ABCABC 패턴, ABCCBA 패턴 등에 따라 3개의 표적에 결합할 수 있고, ABCDDA 패턴, ABCADA 패턴 등에 따라 4개의 표적에 결합할 수 있다. 추가로, 본 발명의 다량체 스캐폴드가 복수의 조작된(예를 들면, 이황화 조작된, 루프 조작된, 또는 이황화 및 루프 조작된) 스캐폴드 및 비조작된 스캐폴드를 포함하는 경우, 이러한 단량체 스캐폴드는 일정한 생물학적 효과를 달성하거나 향상시키기 위해 일정한 패턴에 따라 정렬될 수 있다. 단량체 스캐폴드의 이러한 조합은 조합적으로 조립될 수 있고, 추후 당업계에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 평가될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 분지된 구축물 형태의 다량체 스캐폴드, 예를 들면, Fc 융합체 또는 항체 유사 포맷의 다량체 스캐폴드는 일정한 패턴에 따라 단일 표적 또는 다수의 표적에 결합할 수도 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, IgG 중쇄에 융합된 선형 포맷 스캐폴드(항체 유사 포맷 스캐폴드)는 제1 표적에 결합할 수 있는 반면, IgG 경쇄에 융합된 다가 선형 구축물(항체 유사 포맷 스캐폴드)은 제2 표적에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, IgG 중쇄에 융합된 선형 포맷 스캐폴드(항체 유사 포맷 스캐폴드)는 일정한 친화성으로 표적에 결합할 수 있는 반면, IgG 경쇄에 융합된 선형 포맷 스캐폴드(항체 유사 포맷 스캐폴드)는 상이한 친화성으로 동일한 표적에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 "Y"의 좌측 아암(arm)의 쇄에 융합된 스캐폴드는 제1 표적에 결합할 수 있는 반면, 항체의 "Y"의 우측 아암의 쇄에 융합된 스캐폴드는 제2 표적에 결합할 수 있다.
융합
본 발명은 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드로서, 이때 1개 이상의 단량체 스캐폴드가 이종 모이어티에 융합될 수 있는 것인 다량체 스캐폴드를 추가로 제공한다. 이 문맥에서, 상기 이종 모이어티는 상기 스캐폴드를 연결하는 데 있어서 스페이서로서 사용되지 않으나 본 발명의 다량체 스캐폴드에 추가 기능성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 세포의 표면 상의 표적에 결합하는 다량체 스캐폴드는 표적 특이적 세포 사멸을 촉진하기 위해 세포독성제에 융합될 수 있다. 추가 융합은 하기 개시되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 이종 모이어티는 링커로서 작용할 수 있다.
본 발명은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방체 물질, 합성 약물, 무기 분자 및 유기 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 1개 이상의 이종 모이어티에 접합되거나 융합된 본 발명의 스캐폴드의 용도를 포괄한다. 본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합된 스캐폴드의 용도를 포괄한다. 접합은 공유접합 및 비공유접합 둘다를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 500개 이상 또는 1,000개 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드에 융합되거나 화학적으로 접합되어 융합 단백질을 발생시킬 수 있다.
스캐폴드와 1개 이상의 이종 모이어티의 융합 또는 접합은 스캐폴드와 이종 모이어티 사이에 개재된 링커 없이 직접적으로 달성될 수 있거나, 본원에 기재된 1개 이상의 링커 서열을 통해 달성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 스캐폴드를 표적 세포의 특정 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항체에 융합시키거나 접합시킴으로써 시험관 내에서 또는 생체 내에서 상기 스캐폴드를 사용하여 이종 폴리펩티드를 특정 종류의 세포에 표적화시킬 수 있다. 이종 폴리펩티드에 융합되거나 접합된 스캐폴드는 당업계에서 공지되어 있는 방법을 이용하는 시험관내 면역분석 및 정제 방법에서 사용될 수도 있다. 예를 들면, 온전히 그대로 참고로 도입되는 국제특허공보 제WO93/21232호, 유럽 특허 제EP 439,095호, 문헌(Naramura et al. Immunol. Lett. 39:91-99, 1994), 미국 특허 제5,474,981호, 문헌(Gillies et al., PNAS 89:1428-1432, 1992) 및 문헌(Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452, 1991)을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 예를 들면, N 말단 또는 C 말단을 통해 스캐폴드를 면역글로불린 또는 이의 도메인(IgG의 불변 영역(Fc)을 포함하나 이로 한정되지 않음)에 융합시키거나 접합시킴으로써 상기 스캐폴드를 인간 면역 반응과 통합시킬 수 있다. Fc 융합 분자는 면역 반응의 보체 성분을 활성화시키고 단백질 스캐폴드의 치료 가치를 증가시킨다. 유사하게, 스캐폴드와 보체 단백질, 예컨대, CIq 사이의 융합을 이용하여 세포를 표적화시킬 수 있다. 스캐폴드와 독소 사이의 융합을 이용하여 본원에 기재된 바와 같이 특정 항원을 보유하는 세포를 특이적으로 파괴할 수 있다.
다양한 공개문헌이 FcRn 결합 폴리펩티드를 생리학적 활성 분자 내로 도입함으로써(예를 들면, 국제특허공보 제WO97/43316호, 미국 특허 제5,869,046호, 미국 특허 제5,747,035호, 국제특허공보 제WO96/32478호 및 국제특허공보 제WO91/14438호 참조), 상기 분자를 FcRn 결합 친화성이 보존되어 있으나 다른 Fc 수용체에 대한 친화성이 크게 감소되어 있는 항체와 융합시킴으로써(예를 들면, 국제특허공보 제WO99/43713호 참조), 상기 분자를 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시킴으로써(예를 들면, 국제특허공보 제WO00/09560호 및 미국 특허 제4,703,039호 참조) 변경된 반감기를 갖는 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법을 기술한다. 생리학적 활성 분자의 반감기를 증가시키는 구체적인 기법 및 방법은 미국 특허 제7,083,784호에서도 발견될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 스캐폴드는 IgG의 Fc 영역에 융합될 수 있을 것으로 예측되고, 이때 상기 Fc 영역은 아미노산 잔기 돌연변이 M252Y/S254T/T256E 또는 H433K/N434F/Y436H(이때, 아미노산 위치는 카바트(Kabat) 넘버링 방식에 따라 표시됨)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드의 반감기는 상기 다량체 스캐폴드를 본질적으로 비구조화된 재조합 폴리펩티드(예를 들면, XTEN™ 폴리펩티드)와 유전적으로 융합시키거나 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 접합시킴으로써 증가된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 생체내 또는 혈청 반감기를 증가시키거나 연장시키는 분자와 융합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 이의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 다당류, 면역글로불린 분자(IgG) 또는 이의 단편, 보체, 헤모글로빈, 결합 펩티드, 지단백질 또는 다른 인자와 융합되거나 접합되어 혈류 중의 그의 반감기 및/또는 그의 조직 침투를 증가시킨다. 이들 융합체들 중 임의의 융합체는 표준 기법, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 유전자 서열을 사용하여 구축한 재조합 융합 유전자로부터의 융합 단백질의 발현에 의해 발생될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 스캐폴드는 정제를 촉진하기 위해 마커 서열, 예컨대, 펩티드와 융합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 폴리히스티딘 펩티드(His-태그), 예를 들면, 옥타히스티딘 태그(His-8-태그) 또는 헥사히스티딘 태그(His-6-태그), 예컨대, 다른 벡터 중에서 pQE 발현 벡터(퀴아젠 인코포레이티드(QIAGEN, Inc.), 미국 캘리포니아주 91311 채츠워쓰 이톤 애비뉴 9259 소재) 내에 제공된 태그이다(이들 태그들 중 대부분은 상업적으로 입수가능함). 문헌(Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989)에 기재된 바와 같이, 예를들면, 폴리히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌("HA") 태그, FLAG 태그, Strep 태그, myc 태그, V5 태그, GFP 태그, AU1 태그, AU5 태그, ECS 태그, GST 태그 및 OLLAS 태그를 포함하나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Wilson et al., Cell 37:767, 1984) 참조)
본 발명의 스캐폴드를 포함하는 추가 융합 단백질은 유전자 셔플링(shuffling), 모티프 셔플링, 엑손 셔플링 및/또는 코돈 셔플링("DNA 셔플링"으로서 총칭됨) 기법을 통해 발생될 수 있다. DNA 셔플링을 이용하여 본 발명의 스캐폴드의 활성을 변경시킬 수 있다(예를 들면, 보다 높은 친화성 및 보다 낮은 해리속도를 갖는 스캐폴드를 발생시킬 수 있음). 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호 및 제5,837,458호; 문헌(Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33, 1997); 문헌(Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82, 1998); 문헌(Hansson, et al., J. Mol. Biol. 287:265-76, 1999); 및 문헌(Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313)(각각의 이들 특허 및 공개문헌은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)을 참조한다. 스캐폴드 또는 이의 코딩된 스캐폴드는 재조합 전에 오류 유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발을 일으킴으로써 변경될 수 있다. 특정 표적에 결합하는 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 부분은 1개 이상의 이종 분자의 1개 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
항체 유사 다량체 스캐폴드
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 2개 이상의 FnIII을 포함하고, 이때 1개 이상의 스캐폴드는 온전한 항체, 항체 가변 도메인, CH1 도메인, C카파 도메인, C람다 도메인, Fc 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항체(예를 들면, IgG)의 도메인 또는 단편에 융합되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편에 융합될 수 있다. 항체의 도메인 또는 단편은 하기 기재된 Fc 도메인과 유사하게 본 발명의 다량체 스캐폴드의 형성을 촉진하는 이량체화 또는 다량체화 도메인을 제공함으로써 상기 다량체 스캐폴드의 친화력 및/또는 친화성을 추가로 향상시킨다.
몇몇 실시양태에서, 2개의 FnIII 도메인을 포함하는 1개의 다량체 직렬 스캐폴드만이 항체의 도메인 또는 단편에 접합되어 있거나 융합되어 있다. 예를 들면, 단일 다량체 직렬 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편(예를 들면, 항체의 중쇄 또는 경쇄)의 폴리펩티드의 N 말단에 융합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 다량체 스캐폴드는 1개 이상의 FnIII 스캐폴드를 항체의 도메인 또는 단편(예를 들면, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄)의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합시키거나 접합시킴으로써 생성된다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 몇몇 또는 모든 스캐폴드가 동일하다. 몇몇 다른 실시양태에서, 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 몇몇 또는 모든 스캐폴드가 상이하다.
몇몇 실시양태에서, 항체 유사 다가 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용된 본 발명의 스캐폴드는 동일한 수의 FnIII 모듈을 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체 유사 다가 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용된 본 발명의 스캐폴드는 상이한 수의 FnIII 모듈을 함유할 수 있다. 예를 들면, 4가 FnIII 스캐폴드는 예를 들면, 선형 포맷 4가 FnIII 스캐폴드를 단일 위치에 융합시키거나, 1개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 한 위치에 융합시키고 삼량체 선형 포맷 FnIII 스캐폴드를 또 다른 위치에 융합시키거나, 2개의 이량체 FnIII 선형 포맷 스캐폴드를 2개의 상이한 위치에 융합시키거나, 4개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 각각 하나씩 단일 위치에 융합시킴으로써 형성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 FnIII 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 4개의 다량체 선형 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 다량체 선형 스캐폴드는 링커를 통해 직렬로 연결되어 있는 2개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함한다(도 1 참조). 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 FnIII 스캐폴드는 항체의 도메인 또는 단편에 융합된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 본 발명의 단량체 또는 다량체 FnIII 스캐폴드를 포함한다.
한 특정 실시양태에서, 4가 FnIII 스캐폴드는 1개의 스캐폴드를 항체의 도메인 또는 단편의 경쇄 및 중쇄 각각의 N 말단에 융합시킴으로써 발생될 수 있다(예를 들면, 도 2에서 A9 구축물 참조).
항체 유사 포맷 다가 FnIII 스캐폴드는 본 발명의 스캐폴드의 임의의 조합을 항체 또는 변형된 항체의 도메인 또는 단편에 융합시킴으로써 발생될 수 있다. 변형된 항체의 예로는 도메인 결실된 항체, 미니바디(예를 들면, 미국 특허 제5,837,821호 참조), 4가 미니바디, 4가 항체(예를 들면, 문헌(Coloma & Morrison, Nature Biotechnol. 15:159-163, 1997) 및 국제특허공보 제WO95/09917호 참조), 열적으로 안정화된 항체, 인간화된 항체 등이 있다.
도 1에 따른 항체 유사 다가 스캐폴드를 발생시키는 데에 사용된 본 발명의 선형 스캐폴드 각각은 동일한 링커 및 링커 분포, 또는 상이한 링커 및 상이한 링커 분포를 함유할 수 있다.
Fc 융합 다량체 스캐폴드
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 Fc 도메인에 연결된 복수의 단량체 또는 다량체 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 다량체 스캐폴드와, Fc 도메인을 포함하는 항체 단편의 융합은 다량체 FnIII 스캐폴드의 이량체의 형성을 촉진하는 이량체화 도메인을 제공함으로써 상기 다량체 FnIII 스캐폴드의 친화력 및/또는 활성을 추가로 향상시킨다.
몇몇 실시양태에서, 1개의 다량체 FnIII 스캐폴드만이 Fc 도메인에 융합되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합된 2개의 다량체 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 다량체 FnIII 스캐폴드는 1개 이상의 링커를 통해 연결되어 있는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함한다(도 1). 한 특정 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 다량체 FnIII 스캐폴드는 선형 포맷 스캐폴드이다.
한 특정 실시양태에서, 2개의 FnIII 도메인을 직렬로 포함하는 2개의 선형 포맷 FnIII 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합되어 원자가 4의 다량체 스캐폴드를 생성한다(예를 들면, 도 2에서 A7 구축물 참조). 또 다른 특정 실시양태에서, 4개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 각각 포함하는 2개의 선형 포맷 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합되어 원자가 8의 FnIII 다량체 스캐폴드를 생성한다(예를 들면, 도 2에서 A8 구축물 참조).
몇몇 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 FnIII 스캐폴드는 동일한 수의 FnIII 모듈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 FnIII 스캐폴드는 상이한 수의 FnIII 모듈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 FnIII 스캐폴드는 동일한 링커를 포함한다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인에 융합된 FnIII 스캐폴드는 상이한 링커를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 상이한 다량체 FnIII 스캐폴드는 이종이량체의 형성에 유리한 Fc 도메인 돌연변이의 사용에 의해 이량체화될 수 있다. 예를 들면, 제1 Fc 도메인의 계면으로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환되는 방법을 기술하는 국제특허공보 제WO96/27011호를 참조한다. 상기 큰 측쇄(들)와 동일한 또는 유사한 크기의 상쇄 "공동(cavities)"은 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 쓰레오닌)로 치환시킴으로써 제2 Fc 도메인의 계면 상에서 생성된다. 이것은 다른 원하지 않는 최종 생성물, 예컨대, 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 기작을 제공한다.
Fc 영역의 변이체(예를 들면, 아미노산 치환 및/또는 부가 및/또는 결실)는 항체의 이펙터 기능을 향상시키거나 감소시키고(예를 들면, 미국 특허 제5,624,821호, 제5,885,573호, 제6,538,124호, 제7,317,091호, 제5,648,260호 및 제6,538,124호; 국제특허공보 제WO03/074679호, 제WO04/029207호, 제WO04/099249호 및 제WO99/58572호; 미국 특허공보 제2006/0134105호, 제2004/0132101호 및 제2006/0008883호 참조) 항체의 약동학적 성질(예를 들면, 반감기)을 변경시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,277,375호 및 제7,083,784호 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 FnIII 스캐폴드는 변경된 Fc 영역을 포함하는 Fc 도메인(들)을 포함하고, 이때 다량체 FnIII 스캐폴드의 기능성 및/또는 약동학적 성질을 변화시키기 위해 1개 이상의 변경이 상기 Fc 영역 내에서 만들어져 있다.
Fc 영역의 글리코실화는 이펙터 기능 및/또는 소염 활성을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다는 것도 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Umana et al., Nat. Biotechnol. 17:176-180, 1999); 문헌(Davies et al. Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001); 문헌(Shields et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002); 문헌(Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003); 미국 특허 제6,602,684호, 제6,946,292호, 제7,064,191호, 제7,214,775호, 제7,393,683호, 제7,425,446호 및 제7,504,256호; 미국 특허공보 제2003/0157108호, 제2003/0003097호 및 제2009/0010921호; 포틸리전트(Potillegent)™ 기술(바이오와 인코포레이티드(Biowa, Inc.), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재); 글리코(Glyco)MAb™ 글리코실화 조작 기술(글리카트 바이오테크놀로지 아게(GLYCART biotechnology AG), 스위스 취리히 소재); 문헌(Keneko et al., Science 313:670-673, 2006); 및 문헌(Scallon et al., Mol. Immuno. 44(7):1524-34, 2007) 참조). 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 FnIII 스캐폴드의 Fc 영역은 상기 다량체 스캐폴드의 세포독성 및/또는 소염 성질을 변화시키기 위해 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화를 포함한다.
다량체 스캐폴드 위상기하학
당업자는 상기에서, 도 1 및 2에서, 및 본 명세서 전체에서 논의된 다량체 스캐폴드가 단지 설명을 위한 예일 뿐이라는 것을 인식할 것이다. 도 1 및 2에 나타낸 구축물 위상기하학 또는 포맷은 몇몇 실시양태에서 본 발명의 스캐폴드가 Fc 도메인 및 항체의 성분 폴리펩티드의 N 말단에 융합되어 있는 것을 보여준다. 본 발명의 스캐폴드는 임의의 적합한 공간적 배열로 Fc 도메인, 항체 경쇄 및 항체 중쇄의 C 말단에 융합될 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 4가 스캐폴드는 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 중쇄 각각의 N 말단에 융합시키고 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 경쇄 각각의 C 말단 도메인에 융합시킴으로써, FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 경쇄 각각의 N 말단에 융합시키고 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 중쇄 각각의 C 말단에 융합시킴으로써, 또는 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 중쇄 각각의 N 말단에 융합시키고 FnIII 단량체 스캐폴드를 항체의 경쇄 각각의 N 말단에 융합시킴으로써 생성될 수 있다. 단량체 및/또는 다량체 FnIII 스캐폴드는 가변 영역 및 불변 영역 둘다를 포함하는 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 융합될 수 있다. 대안적으로, 단량체 및/또는 다량체 FnIII 스캐폴드는 (예를 들면, 도 2에 나타낸 A9 구축물에서와 같이) 불변 영역만을 포함하는 절두된 중쇄 및/또는 경쇄에 융합될 수 있다.
다량체 스캐폴드는 도 1에 나타낸 포맷을 구축 블록으로서 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 항체 유사 포맷 및 Fc 융합체 포맷은 보다 단순한 선형 포맷 모듈을 포함하는 조합이다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 보다 복잡한 다량체 스캐폴드 포맷은 도 1에 나타낸 구축 블록을 조합함으로써 생성될 수 있다.
도 1 및 2는 몇몇 실시양태에서 본 발명의 다량체 스캐폴드가 선형 또는 분지된 포맷일 수 있고 상이한 분지도를 나타낼 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들면, Fc 포맷은 일차 분지된 포맷의 예를 제공하는 반면, 항체 유사 포맷은 이차 분지된 포맷의 예를 제공한다. 고차 분지된 구축물은 항체 유사 포맷 또는 Fc 융합체 포맷 내의 선형 포맷 구축 블록을 Fc 융합체 포맷 구축 블록 또는 항체 유사 구축 블록으로 치환시키고 이들을 Fc 또는 항체의 성분 폴리펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 연결함으로써 수득될 수 있다.
도 1 및 2, 및 표 1은 몇몇 실시양태에서 다량체 스캐폴드 내의 링커가 구조적으로 및 기능적으로 다양할 수 있고 복수의 부착점을 제공할 수 있다는 사실을 보여준다. 예를 들면, (Gly4-Ser)2-Gly-Thr-Gly-Ser-Ala-Met-Ala-Ser-(Gly4-Ser)1-Ala 링커에 의해 연결된 제4 FnIII 모듈 및 제5 FnIII 모듈을 제외하고 A4 구축물 및 A5 구축물 내의 모든 FnIII 모듈이 (Gly4-Ser)3Ala 링커에 의해 연결되어 있다. 예를 들면, A7 구축물에서, 제1 FnIII 도메인 및 제2 FnIII 도메인과 제3 FnIII 도메인 및 제4 FnIII 도메인은 (Gly4-Ser)3Ala 링커에 의해 연결되어 있는 반면, 제2 FnIII 도메인과 제3 FnIII 도메인은 기능성 모이어티 링커로서 Fc 도메인에 의해 연결되어 있다.
도 1에 나타낸 Fc 융합체는 몇몇 실시양태에서 단량체 또는 다량체 FnIII 스캐폴드가 기능성 모이어티 링커의 폴리펩티드의 N 말단에 융합될 수 있다는 것을 예시한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단량체 또는 다량체 FnIII 스캐폴드는 Fc 융합체 포맷 구축물 내의 Fc 도메인의 C 말단에 용이하게 융합될 수 있다.
유사하게, 항체 유사 포맷 구축물 내의 항체 또는 변형된 항체도 기능성 모이어티 링커이다. 이 경우, (Gly4-Ser)3Ala 또는 (Gly4-Ser)2Gly-Thr-Gly-Ser-Ala-Met-Ala-Ser-(Gly4-Ser)1-Ala 내의 2개의 부착점, 또는 Fc 도메인의 경우에서와 같은 4개의 가능한 부착점 대신에, 도 1의 항체 유사 예에서 나타낸 항체는 6개의 가능한 부착점을 제공한다. 도 1에 나타낸 항체 유사 포맷은 몇몇 실시양태에서 기능성 모이어티 링커 내의 N 말단 부착점만이 본 발명의 FnIII 도메인에 의해 점유되어 있다는 것을 예시한다. 항체 유사 포맷 구축물에서, 본 발명의 몇몇 또는 모든 스캐폴드는 항체 또는 변형된 항체 도메인의 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 용이하게 융합될 수 있다. 다른 융합 화학양론이 적용될 수 있다(즉, 본 발명의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 이보다 많은 수의 스캐폴드가 항체 또는 변형된 항체에 융합될 수 있다).
또한, 도 1 및 2는 몇몇 실시양태에서 다량체 FnIII 스캐폴드가 다른 FnIII 다량체 스캐폴드를 조합함으로써 발생될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들면, 도 2의 Fc 포맷 A6 스캐폴드, A7 스캐폴드 및 A8 스캐폴드는 동종이량체 FnIII 스캐폴드이고, 이때 다량체 스캐폴드는 Fc 도메인에 융합된 선형 포맷 FnIII 스캐폴드를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드 쇄(분자간 이황화 결합을 통해 연결됨)에 의해 형성된다. 도 1 및 2의 항체 유사 포맷 스캐폴드는 이종이량체 FnIII 스캐폴드를 예시하고, 이때 2종의 상이한 스캐폴드(FnIII 단량체 스캐폴드를 IgG 경쇄 불변 영역에 융합시킴으로써 형성된 2개의 FnIII 스캐폴드, 및 FnIII 단량체 스캐폴드를 IgG의 CH1-힌지 영역-Fc 영역에 융합시킴으로써 형성된 2개의 FnIII 스캐폴드)에 상응하는 4개의 폴리펩티드가 분자간 이황화 결합을 통해 연결되어 있다.
본 발명의 스캐폴드의 발생
본원에 기재된 FnIII 스캐폴드는 신규 또는 개선된 표적 결합 단백질을 발생시키기 위한 임의의 기법에서 사용될 수 있다. 한 구체적인 예에서, 상기 표적은 고체 지지체, 예컨대, 컬럼 수지 또는 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 고정되고, 상기 표적은 후보 스캐폴드에 기초한 결합 단백질의 라이브러리와 접촉한다. 이러한 라이브러리는 CDR 유사 루프의 서열 및/또는 길이의 무작위화를 통해 (Tn3 모듈을 포함하나 이로 한정되지 않는) FnIII 도메인으로부터 구축된 클론들로 구성될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 라이브러리는 파지, 파지미드, 바이러스, 세균, 효모 또는 포유동물 세포 표시 또는 리보좀 표시 라이브러리일 수 있다. 원하는 경우, 이 라이브러리는 예를 들면, 미국 특허 제6,258,558호, 제6,261,804호, 제5,643,768호 및 제5,658,754호(Szostak et al.)에 기재된 기법에 의해 발생된 RNA-단백질 융합체 라이브러리일 수 있다. 대안적으로, 상기 라이브러리는 (예를 들면, 국제특허공보 제WO2000/032823호에 기재된 바와 같은) DNA-단백질 라이브러리일 수 있다.
이와 관련하여, 박테리오파지(파지) 표시는 큰 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 라이브러리의 구성원(들)을 확인할 수 있게 하는 잘 공지된 한 기법이다. 파지 표시는 변이체 폴리펩티드를 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질과의 융합 단백질로서 표시하는 기법이다(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). 파지 표시의 유용성은 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체들(또는 무작위적으로 클로닝된 cDNA들)의 큰 라이브러리가 높은 친화성으로 표적 분자에 결합하는 서열들에 대해 신속하게 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상에서의 펩티드(Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) 또는 단백질(Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) 라이브러리의 표시는 수백만개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하여 특이적 결합 성질을 갖는 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 확인하는 데에 이용되어 왔다(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리의 분류는 많은 수의 변이체를 구축하고 증식시키는 방법, 표적 수용체를 사용하여 친화 정제를 수행하는 절차, 및 결합 강화의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다(예를 들면, 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,689호 및 제5,663,143호 참조).
대부분의 파지 표시 방법이 사상 파지를 사용하지만, 람도이드(lambdoid) 파지 표시 시스템(국제특허공보 제WO95/34683호 및 미국 특허 제5,627,024호), T4 파지 표시 시스템(Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) 및 T7 파지 표시 시스템(Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); 미국 특허 제5,766,905호)도 공지되어 있다.
기본 파지 표시 개념의 많은 다른 개선 및 변경이 현재 개발되고 있다. 이들 개선은 선택된 표적 분자와의 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하고 원하는 성질에 대해 기능성 단백질을 스크리닝할 잠재력을 가지면서 이들 기능성 단백질을 표시하는 표시 시스템의 능력을 향상시킨다. 파지 표시 반응에 대한 조합 반응 장치가 개발되었고(국제특허공보 제WO98/14277호), 파지 표시 라이브러리가 생체분자 상호작용(국제특허공보 제WO98/20169호 및 제WO98/20159호) 및 구속된 나선형 펩티드의 성질(국제특허공보 제WO98/20036호)을 분석하고 조절하는 데에 사용되고 있다. 국제특허공보 제WO97/35196호는 파지 표시 라이브러리를 제1 용액(이 용액 중의 리간드는 표적 분자에 결합할 것임), 및 제2 용액(이 용액 중의 친화성 리간드는 표적 분자에 결합하지 않을 것임)과 접촉시켜 결합 리간드를 선택적으로 단리하는 친화성 리간드의 단리 방법을 기술한다. 국제특허공보 제WO97/46251호는 무작위 파지 표시 라이브러리를 친화 정제된 항체로 바이오패닝(biopanning)한 후 결합 파지를 단리한 다음, 마이크로플레이트 웰을 사용하는 마이크로패닝 공정을 수행하여 고 친화성 결합 파지를 단리하는 방법을 기술한다. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A를 친화성 태그로서 사용하는 것도 보고되어 있다(Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). 국제특허공보 제WO97/47314호는 파지 표시 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하기 위한 기질 공제(subtraction) 라이브러리의 사용을 기술한다. 파지 표시를 사용하여 세제에서 사용되기에 적합한 효소를 선택하는 방법은 국제특허공보 제WO97/09446호에 기재되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선택하는 추가 방법은 미국 특허 제5,498,538호 및 제5,432,018호, 및 국제특허공보 제WO98/15833호에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리를 발생시키고 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법도 미국 특허 제5,723,286호, 제5,432,018호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,498,530호, 제5,770,434호, 제5,734,018호, 제5,698,426호, 제5,763,192호 및 제5,723,323호에 개시되어 있다.
생체정보학적 방법을 이용하여 천연 FnIII 도메인의 루프 길이 및 서열 다양성 선호도를 확인할 수 있다. 이 분석을 이용하여, 루프 길이 및 서열 다양성에 대한 선호도(preferences)를 이용하여 "제한된 무작위화" 방법을 개발할 수 있다. 이 제한된 무작위화에서, 상대적인 루프 길이 및 서열 선호도는 라이브러리 기법의 개발에 도입된다. 루프 길이 및 서열 다양성 분석을 라이브러리 개발에 도입하는 것은 제한된 무작위화를 일으킨다(즉, 아미노산이 존재할 수 있는 위치가 무작위화된 루프 내의 일부 위치들로 한정된다).
또한, 본 발명은 본 발명의 비천연 FnIII 스캐폴드의 다양한 집단을 포함하는 재조합 라이브러리(이하, "본 발명의 라이브러리"로서 지칭됨)를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥 도메인을 포함하는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 루프들 중 1개 이상의 루프는 FOI 내의 동족 루프로부터의 1개 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 변이되고, 상기 FnIII 스캐폴드의 베타 가닥은 FOI의 동족 베타 가닥 서열에 대해 50% 이상의 상동성(즉, 서열 유사성)을 나타낸다. 재조합 라이브러리의 발생에 유용한 FOI 서열의 비한정적인 예는 표 1 및 도 16에 제공되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 인간 피브로넥틴의 제10 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 인간 피브로넥틴의 제14 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 야생형 Tn3 스캐폴드이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 인간 테나신 C로부터의 추가 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 또 다른 테나신 단백질 또는 대안적으로 또 다른 유기체로부터의 테나신 단백질(예컨대, 뮤린, 돼지, 소 또는 말 테나신(그러나, 이들로 한정되지 않음))로부터의 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FOI는 임의의 유기체로부터의 FnIII 도메인에 상응하는 단백질 서열이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 비천연 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 천연 서열은 호열성 또는 고호열성 유기체로부터의 예측된 FnIII 도메인에 상응한다. 예를 들면, 고호열성 유기체는 고호열성 고세균, 예컨대, 아키오글로버스 풀기더스, 스타필로써머스 마리너스, 설폴로버스 액시도칼다리어스, 설폴로버스 솔파타리커스 및 설폴로버스 토코다이이일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 도 16에 제시된 서열들 중 임의의 서열의 동족 베타 가닥 도메인; 또는 Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 히든 마르코브 모델과 비교할 수 있는 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 도메인의 베타 가닥에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(서열 유사성)을 나타낸다.
상기 상술되어 있는 바와 같이, 스캐폴드의 다양한 베타 가닥을 연결하는 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된 1개 이상의 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다. 한 실시양태에서, FnIII 스캐폴드의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 루프가 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 루프가 불변 상태로 유지되는 반면, 1개 이상의 추가 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두가 불변 상태로 유지되는 반면, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두는 길이 또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 또 다른 실시양태에서, AB 루프, CD 루프 및 EF 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두가 무작위화되는 반면, BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다.
상기 상술되어 있는 바와 같이, 놀랍게도 FOI의 FG 루프에서 발견되는 길이보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 길이를 갖는 FG 루프가 향상된 안정성을 나타내는 것으로 보인다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 FnIII 스캐폴드를 포함하는 본 발명의 라이브러리를 제공하고, 이때 FG 루프의 길이가 FOI의 동족 FG 루프의 길이보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧게 유지된다는 점을 제외하고 1개 이상의 루프는 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화되어 있다. 예를 들면, 도 16에서 정의된 바와 같이, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 천연 FG 루프가 10개의 아미노산 잔기를 포함하므로, 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인이 FOI인 경우, 상기 FG 루프의 서열이 무작위화될 수 있을지라도 상기 FG 루프의 길이는 9개 이하의 아미노산 잔기로 유지될 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 스캐폴드는 6개의 루프 영역에 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하고, 이때 루프 영역은 각각의 베타 가닥을 연결하고 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명되고, 1개 이상의 루프는 FOI 루프의 비천연 변이체이고, FG 루프는 상기 FOI 내의 동족 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧다.
한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 FG 루프의 길이가 FOI의 동족 FG 루프보다 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기만큼 더 짧은 상태로 유지된다는 점을 제외하고 1개 이상의 루프(즉, AB, BC, CD, DE, EF, FG)의 아미노산 서열은 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 각각의 베타 가닥은 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54 및 서열번호 69 중 임의의 한 서열의 동족 베타 가닥; 도 16에 나타낸 FnIII 도메인들 중 임의의 FnIII 도메인의 베타 가닥; 또는 Pfam_scan, HMMER, 또는 단백질 서열을 히든 마르코브 모델과 비교할 수 있는 임의의 다른 프로그램을 이용하여 확인하였을 때 Pfam PF00041 피브로넥틴 III형 도메인 특징을 함유하는 것으로 인정된 도메인의 베타 가닥에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 상동성(서열 유사성)을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 44를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 50을 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 53을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 53을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 44로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 50으로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 53으로 구성된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 51로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 53으로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 44로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 50으로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 53으로 구성된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 51로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 53으로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, AB 루프는 서열번호 35를 포함하고, CD 루프는 서열번호 37을 포함하고, EF 루프는 서열번호 39를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 서열번호 39로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 본질적으로 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 본질적으로 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 본질적으로 서열번호 39로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45를 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, BC 루프는 서열번호 36을 포함하고, DE 루프는 서열번호 38을 포함하고, FG 루프는 서열번호 40을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 서열번호 40으로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 본질적으로 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 본질적으로 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 본질적으로 서열번호 40으로 구성된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, AB 루프는 서열번호 35를 포함하고, CD 루프는 서열번호 37을 포함하고, EF 루프는 서열번호 39를 포함하고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 서열번호 39로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, AB 루프는 본질적으로 서열번호 35로 구성되고, CD 루프는 본질적으로 서열번호 37로 구성되고, EF 루프는 본질적으로 서열번호 39로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥은 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥은 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥은 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥은 서열번호 49를 포함하고, G 베타 가닥은 서열번호 52를 포함하고, BC 루프는 서열번호 36을 포함하고, DE 루프는 서열번호 38을 포함하고, FG 루프는 서열번호 40을 포함하고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 서열번호 40으로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 A 베타 가닥 도메인은 본질적으로 서열번호 42로 구성되고, B 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 43으로 구성되고, C 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 45 또는 서열번호 131로 구성되고, D 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 46으로 구성되고, E 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 47로 구성되고, F 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 49로 구성되고, G 베타 가닥은 본질적으로 서열번호 52로 구성되고, BC 루프는 본질적으로 서열번호 36으로 구성되고, DE 루프는 본질적으로 서열번호 38로 구성되고, FG 루프는 본질적으로 서열번호 40으로 구성되고, 이때 C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
상기 상술되어 있는 바와 같이, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 불변 상태로 유지될 수 있고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 임의적으로 또는 대안적으로, 루프 내의 1개 이상의 잔기가 예정되고 제한된 수의 상이한 아미노산으로 유지될 수 있고, 다른 잔기들이 길이 및/또는 서열 다양성에 대해 무작위화된다. 따라서, 본 발명의 라이브러리는 축퇴 컨센서스 서열 및/또는 1개 이상의 불변 아미노산 잔기를 갖는 1개 이상의 루프를 포함할 수 있는 FnIII 스캐폴드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 AB 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: K-X-X-X-X-X-a(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 AB 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: K-X-X-X-X-X-X-X-a(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타냄).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: S-X-a-X-b-X-X-X-G(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 프롤린 또는 알라닌을 나타내고, b는 알라닌 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, c는 프롤린, 세린 또는 글리신을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 BC 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, d는 프롤린, 글루타메이트 또는 라이신을 나타내고, e는 아스파라긴 또는 글리신을 나타내고, f는 세린 또는 글리신을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 CD 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: Xn(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, n은 6, 7, 8, 9 또는 10임). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 CD 루프를 포함한다: Xn(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, n은 7, 8 또는 9임).
한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 DE 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: X-X-X-X-X-X(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 EF 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: X-b-L-X-P-X-c-X(이때, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, b는 아스파라긴, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신을 나타내고, c는 이소류신, 쓰레오닌, 세린, 발린, 알라닌 또는 글리신을 나타냄).
한 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: X-a-X-X-G-X-X-X-b(이때, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 알라닌을 나타냄). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 하기 컨센서스 서열을 갖는 무작위화된 FG 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함한다: X-X-X-X-X-X-X-X-X(X9)(이때, X는 임의의 아미노산을 나타냄).
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 FnIII 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 FnIII 스캐폴드는 Tn3 모듈을 포함하고, C 베타 가닥 내의 시스테인 및 F 베타 가닥 내의 시스테인(각각 서열번호 45 또는 서열번호 131 및 서열번호 49)이 치환될 수 없다는 점을 제외하고 상기 Tn3 모듈의 베타 가닥들 중 1개 이상의 베타 가닥은 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리는 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 상기 스캐폴드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이고, m은 1 내지 9이다.
본 발명은 본 발명의 라이브러리, 특히 FnIII 스캐폴드를 포함하는 라이브러리(이때, FG 루프는 FOI의 동족 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 상태로 유지됨)를 스크리닝함으로써 표적에 결합하고 FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 재조합 FnIII 스캐폴드를 확인하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, FOI에 비해 증가된 단백질 안정성을 나타내고 표적에 특이적으로 결합하는 재조합 FnIII 스캐폴드를 확인하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 스캐폴드:표적 리간드 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 상기 표적 리간드를 본 발명의 라이브러리와 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 라이브러리가 FOI의 동족 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 상태로 유지되는 FG 루프를 갖는 FnIII 스캐폴드를 포함하는 것인 단계;
(b) 상기 복합체로부터 상기 표적 리간드에 결합하는 스캐폴드를 수득하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 수득된 스캐폴드의 안정성이 FOI의 안정성보다 더 높은지를 확인하는 단계.
한 실시양태에서, 단계 (a)에서 본 발명의 스캐폴드 라이브러리를 고정된 표적과 함께 항온처리한다. 한 실시양태에서, 단계 (b)에서 스캐폴드:표적 리간드 복합체를 세척하여 비특이적 결합제를 제거하고, 가장 강한 결합제를 매우 엄격한 조건 하에서 용출하고 PCR로 분석하여 서열 정보를 회수한다. 단계 (c)에서 안정성의 측정에 유용한 방법은 전술되어 있다. 구체적으로, 단계 (b)에서 수득된 결합제 및/또는 서열 정보는 본원에 개시되어 있거나 당업자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 신규 라이브러리를 생성하는 데에 사용될 수 있고, 상기 신규 라이브러리는 서열의 추가 돌연변이유발과 함께 또는 서열의 추가 돌연변이유발 없이 선택 과정을 반복하는 데에 사용될 수 있을 것으로 예측된다. 몇몇 실시양태에서, 항원에 대한 충분한 친화성을 나타내는 결합제가 수득될 때까지 다수의 라운드의 선택을 수행할 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태는 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 전술된 바와 같은 라이브러리를 코딩하는 단리된 핵산 분자의 집합물이다.
본 발명의 스캐폴드는 국제특허공보 제WO2009/058379호에 기재된 NHT 코돈 방식에 의해 코딩된 코돈을 포함할 수 있거나, 대안적으로 NNK 혼합된 코돈 방식에 의해 코딩된 코돈을 포함할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 친화 성숙될 수 있다. 이 분야에서 인정된 방법에서, 특이적 결합 단백질은 특이적 표적에 대한 증가된 친화성에 대해 선택하는 방식으로 처리된다(예를 들면, 문헌(Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95(11):6037-42) 참조). 생성된 본 발명의 스캐폴드는 친화 성숙 전의 스캐폴드에 비해 적어도 높은 결합 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 표적에 결합하여 스캐폴드:표적 복합체를 형성할 수 있는 단백질 스캐폴드의 아미노산 서열을 확인하는 방법도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 본 발명의 라이브러리를 고정된 또는 분리가능한 표적과 접촉시키는 단계; (b) 스캐폴드:표적 복합체를 자유 스캐폴드로부터 분리하는 단계; (c) 다양성을 낮추고 표적에 결합할 수 있는 표시된 스캐폴드를 풍부하게 함으로써 상기 단계 (a)의 라이브러리로부터 구별되는 신규 폴리펩티드 표시 라이브러리를 발생시키기 위해 단계 (b)의 분리된 스캐폴드의 복제를 야기하는 단계; (d) 임의적으로 단계 (c)의 신규 라이브러리를 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계; 및 (e) 단계 (d)로부터 한 종의 표시된 스캐폴드를 코딩하는 영역의 핵산 서열을 확인하여 상기 표적에 결합할 수 있는 펩티드 서열을 유추하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 라이브러리 스크리닝으로부터의 확인 후 추가로 무작위화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 방법을 이용하여 라이브러리로부터 확인된 스캐폴드의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 루프를 추가로 무작위화하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 추가로 무작위화된 스캐폴드는 표적에 결합할 수 있는 스캐폴드를 확인하는 후속 방법으로 처리된다. 이 방법은 (a) 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드를 고정된 또는 분리가능한 표적과 접촉시키는 단계, (b) 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드:표적 복합체를 자유 스캐폴드로부터 분리하는 단계, (c) 단계 (b)의 분리된 스캐폴드의 복제를 야기하고 임의적으로 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 단계, 및 (d) 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드를 코딩하는 영역의 핵산 서열을 확인하여 상기 표적에 결합할 수 있는 펩티드 서열을 유추하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드는 제1 라이브러리에서 미리 무작위화된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 무작위화된 루프를 포함한다. 대안적 추가 실시양태에서, 상기 추가로 무작위화된 스캐폴드는 제1 라이브러리에서 미리 무작위화되지 않은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 무작위화된 루프를 포함한다.
또한, 본 발명은 1개 이상의 표적에 결합하는 2개 이상의 FnIII 스캐폴드를 수득하는 방법을 제공한다. 이 방법은 특정 반응을 이끌어내기 위해 협력적으로 작용하는 물질들의 스크리닝을 가능하게 한다. 1개 초과의 스캐폴드의 협력을 요구하는 작용제 활성(예를 들면, TNF 수용체 과에 속하는 수용체의 작용활성(agonism)(그러나, 이로 한정되지 않음))이 요구되는 경우 이러한 스크리닝을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 이 방법은 라이브러리의 리포맷팅(reformatting) 없이 다량체 복합체를 형성하는 협력 물질들의 스크리닝을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 스캐폴드:표적 리간드 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 표적 리간드를 본 발명의 라이브러리와 접촉시키는 단계; 상기 스캐폴드를 가교결합제(2개 이상의 동일한 또는 상이한 스캐폴드를 서로 가까이 인접하게 위치시키는 물질로서 정의됨)와 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 스캐폴드의 가교결합이 검출가능한 반응을 이끌어내는 것인 단계; 및 상기 복합체로부터 상기 표적에 결합하는 상기 스캐폴드를 수득하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 가교결합제는 스캐폴드 특이적 항체 또는 이의 단편, 에피토프 태그 특이적 항체 또는 이의 단편, 이량체화 도메인, 예컨대, Fc 영역, 코일드 코일(coiled coil) 모티프(예를 들면, 류신 지퍼(그러나, 이로 한정되지 않음)), 화학적 가교결합제, 또는 당업계에서 공지되어 있는 또 다른 이량체화 도메인이다.
본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 화합물을 검출하는 방법도 제공한다. 라이브러리 스크리닝에 의해 수득된 스캐폴드의 결합 특이성에 기초하여, 샘플 중의 특정 표적을 검출하기 위한 분석, 예컨대, 진단 방법에서 이러한 스캐폴드를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물을 검출하는 방법은 화합물:스캐폴드 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 샘플 중의 상기 화합물을 본 발명의 스캐폴드와 접촉시키는 단계, 및 상기 스캐폴드를 검출하여 샘플 중의 상기 화합물을 검출하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 스캐폴드를 표지하여(즉, 방사선표지, 형광 표지, 효소에 연결된 표지 또는 비색 표지) 화합물의 검출을 촉진한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 화합물을 포획하는 방법을 제공한다. 라이브러리 스크리닝에 의해 수득된 스캐폴드의 결합 특이성에 기초하여, 샘플 중의 특정 표적을 포획하기 위한 분석, 예컨대, 정제 방법에서 이러한 스캐폴드를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플 중의 화합물을 포획하는 방법은 화합물:스캐폴드 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 샘플 중의 상기 화합물을 본 발명의 스캐폴드와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플로부터 상기 복합체를 제거하여 상기 샘플 중의 상기 화합물을 포획하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 스캐폴드를 고정시켜 화합물:스캐폴드 복합체의 제거를 촉진한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리로부터 단리된 스캐폴드는 1개 이상, 2개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 무작위화된 루프를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단리된 스캐폴드 루프 서열은 공여자 스캐폴드로부터 수용자 스캐폴드 내의 임의의 루프로 전달될 수 있다(예를 들면, 공여자 스캐폴드로부터의 FG 루프 서열은 수용자 스캐폴드 내의 임의의 루프로 전달될 수 있음). 특정 실시양태에서, 단리된 루프 서열은 수용자 스캐폴드 내의 동족 루프로 전달될 수 있다(예를 들면, 공여자 스캐폴드로부터의 FG 루프 서열은 FG 루프 위치에서 수용자 스캐폴드로 전달될 수 있음). 몇몇 실시양태에서, 단리된 루프 서열은 다양한 수용자 스캐폴드와 무작위적으로 "혼합되고 일치될" 수 있다.
다른 실시양태에서, 단리된 스캐폴드 서열은 루프 서열에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 라이브러리를 사용하여 특정 표적에 대해 걸러내어 특이적 결합제의 집합물을 단리한다. 무작위화된 루프 서열은 스캐폴드 배경(즉, 서열번호 X의 FG 루프 서열을 포함하는, 표적 X에 결합하는 스캐폴드)과 무관하게 특이적 서열로서 특징지워질 수 있다. 스캐폴드가 표적 X에 결합하는 2개의 루프 서열을 나타내는 대안적인 실시양태에서, 상기 루프 서열은 스캐폴드 서열의 부재 하에서 표적 X에 결합하는 것으로서 특징지워질 수 있다. 즉, 특정 표적에 결합하는, 라이브러리로부터 단리된 스캐폴드는 스캐폴드 골격과 무관하게 상기 표적에 결합하는 가변 루프 서열로서 발현될 수 있을 것으로 예측된다. 이 과정은 항체의 가변 영역 내의 CDR의 개념과 유사할 것이다.
직렬 반복체의 발생
직렬 구축물의 연결은 II형 제한효소 및 IIS형 제한효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당업계에서 공지된 제한효소를 사용하여 제한 부위에서 올리고뉴클레오티드를 라이게이션(ligation)시킴으로써 발생될 수 있다. II형 제한효소는 그의 인식 서열 내에서 절단하는 반면, IIS형 제한효소는 한쪽으로 그의 인식 서열 외부에서 절단한다. 직렬 반복체의 발생에 대한 한 실시양태에서, IIS형 효소는 그를 사용한 절단이 그의 인식 부위를 잘라내고 2개의 서브유닛의 연접부에서 인식 부위를 발생시키지 않으면서 서로 연결될 수 있는 말단을 남기도록 배향된다. 라이게이션 후, II형 부위 및 IIS형 부위가 말단에서 유지된다. IIS형 제한효소를 다시 사용하여 절단하고 라이게이션시킴으로써 추가 서브유닛을 첨가할 수 있다. 대안적으로, 클론을 II형 제한효소로 절단하여 벡터 내로 라이게이션시킬 수 있다.
본 발명의 다량체 스캐폴드는 본원에 기재된 바와 같이 C 말단 및/또는 N-말단에서 및/또는 도메인 사이에서 링커를 포함할 수 있다. 추가로, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상의 폴리펩티드 스캐폴드를 포함하는 본 발명의 스캐폴드는 하기 (i) 내지 (xiii)로부터 선택된 항체 부분을 포함하나 이들로 한정되지 않는 이량체화 도메인에 융합될 수 있거나 접합될 수 있다:
(i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편;
(ii) CH1 도메인의 C 말단에서 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편;
(iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편;
(iv) VH 및 CH1 도메인을 갖고 CH1 도메인의 C 말단에서 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편;
(v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편;
(vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989));
(vii) 단리된 CDR 영역;
(viii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편;
(ix) 단일쇄 항체 분자(예를 들면, 단일쇄 Fv; scFv)(Bird et al., Science 242:423-426 (1988); and Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988));
(x) 동일한 폴리펩티드 쇄 내의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디(diabody)"(예를 들면, 유럽 특허공보 제404,097호, 국제특허공보 제WO93/11161호 및 문헌(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)) 참조);
(xi) 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체"(문헌(Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)), 및 미국 특허 제5,641,870호);
(xii) 전장 항체; 및
(xiii) 힌지 영역의 전부 또는 일부 및/또는 CH1 영역을 추가로 포함할 수 있는, CH2-CH3을 포함하는 Fc 영역. 다양한 원자가, 친화성 및 공간적 배향 방식은 하기 실시예에 예시되어 있다.
스캐폴드 제조
본 발명의 스캐폴드의 재조합 발현은 상기 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 요구한다. 일단 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 스캐폴드의 제조를 위한 벡터는 당업계에서 잘 공지되어 있는 기법을 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 스캐폴드 코딩 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 스캐폴드 폴리펩티드 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 예를 들면, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전적 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 스캐폴드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.
발현 벡터를 통상적인 기법으로 숙주 세포로 전달한 후, 형질감염된 세포를 통상적인 기법으로 배양하여 본 발명의 스캐폴드를 제조한다. 따라서, 본 발명은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 적합한 숙주 세포는 미생물, 예컨대, 세균(예를 들면, 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis))을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 스캐폴드를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 제조된 후 정제될 수 있는 비히클을 의미할 뿐만 아니라 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열에 의해 형질전환되거나 형질감염된 경우 제자리에서 본 발명의 스캐폴드를 발현할 수 있는 세포도 의미한다. 이들은 스캐폴드 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된 미생물, 예컨대, 세균(예를 들면, 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스); 스캐폴드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모(예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 스캐폴드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 바큘로바이러스)에 감염된 곤충 세포 시스템; 스캐폴드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 감염되어 있거나 스캐폴드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)에 의해 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들면, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들면, COS, CHO, BHK, 293, NSO 및 3T3 세포)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 스캐폴드를 코딩하는 유전자의 삽입체를 함유하는 발현 벡터는 3가지 일반적인 방법에 의해 확인될 수 있다: (a) 핵산 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 제1 방법에서, 발현 벡터 내의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 융합 단백질 코딩 유전자의 존재는 각각 상기 펩티드, 상기 폴리펩티드, 상기 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 삽입된 유전자에 대해 상동성을 나타내는 서열을 포함하는 프로브를 사용하는 핵산 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 제2 방법에서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 항체 또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 벡터 내에 삽입함으로써 야기되는 일부 "마커" 유전자 기능(예를 들면, 티미딘 인산화효소 활성, 항생제에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스 내에서의 포매체(occlusion body) 형성 등)의 존재 또는 부재에 기초하여 확인되고 선택될 수 있다. 예를 들면, 스캐폴드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 벡터의 마커 유전자 서열 내에 삽입되는 경우, 스캐폴드 삽입체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 제3 방법에서, 재조합 발현 벡터는 재조합체에 의해 발현된 유전자 생성물(예를 들면, 스캐폴드 또는 이의 다량체)의 분석에 의해 확인될 수 있다. 이러한 분석은 예를 들면, 시험관내 분석 시스템에서의 단백질의 물리적 또는 기능적 성질, 예를 들면, 상기 스캐폴드의 결합, 작용제 또는 길항제 성질에 기초할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 제조에 유용한 방법은 예를 들면, 국제특허공보 제WO2009/058379호에 개시되어 있다.
스캐폴드 정제
일단 본 발명의 스캐폴드가 재조합 발현에 의해 제조되면, 상기 스캐폴드는 당업계에서 공지되어 있는 임의의 단백질 정제 방법, 예를 들면, 크로마토그래피(예를 들면, 금속-킬레이트 크로마토그래피, 이온 교환, 친화성 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 가용성, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 높은 안정성은 정제 방식에 대한 변경을 가능하게 한다. 예를 들면, 본 발명의 스캐폴드가 나타내는 열안정성은 상기 스캐폴드를 포함하는 미정제 용해물을 가열하여 대부분의 숙주 세포 단백질을 변성으로 제거할 수 있게 한다. 본 발명의 스캐폴드가 나타내는 높은 단백질분해효소 내성은 임의의 정제 단계 전에 미정제 용해물 중의 숙주 세포 단백질을 신속히 분해할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 몇몇 스캐폴드가 나타내는 pH 내성은 임의의 정제 단계 전에 pH를 하강시키거나 상승시킴으로써 미정제 용해물 중의 숙주 세포 단백질을 선택적으로 침전시킬 수 있게 한다. 상기 성질들 중 임의의 성질의 조합은 미정제 용해물로부터 대부분의 숙주 세포 단백질을 제거하기 위한 시도에서 이용될 수 있다.
미국 특허공보 제2010/0298541 A1호에 기재된 바와 같이, 연구실에서의 본 발명의 스캐폴드의 제조 규모를 확대하여 분석 규모 반응기 또는 제조 규모 반응기 내에서 스캐폴드를 제조할 수 있다.
분비된 스캐폴드의 규모 확대가능한 제조
본 발명의 스캐폴드는 세포 내에서 제조될 수 있거나 분비된 형태로서 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 분비된 스캐폴드는 적절하게 폴딩되고 완전한 기능성을 나타낸다. 분비된 스캐폴드의 제조는 Ptac 프로모터 및 oppA 신호의 사용을 포함한다. 원핵 숙주 세포 내에서 발현된 스캐폴드는 상기 원핵 숙주 세포의 원형질막주위 공간 또는 배지 내로 분비된다. 본 발명의 스캐폴드는 원핵 세포의 세포 배양 배지 또는 원형질막주위 공간 내로의 펩티드 및/또는 단백질의 분비를 위한 담체 분자로서 작용할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드를 대량으로 수득하기 위한 시도에서 상기 스캐폴드는 규모 확대가능한 공정(이하, "본 발명의 규모 확대가능한 공정"으로 지칭됨)에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 스캐폴드는 분석 규모 생체반응기(예를 들면, 5 ℓ, 10 ℓ, 15 ℓ, 30 ℓ 또는 50 ℓ 생체반응기를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 내에서 본 발명의 스캐폴드를 제조하도록 규모 확대될 수 있는, 연구실 내의 본 발명의 규모 확대가능한 공정에 의해 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 제조 규모 생체반응기(예를 들면, 75 ℓ, 100 ℓ, 150 ℓ, 300 ℓ 또는 500 ℓ를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 내에서 본 발명의 스캐폴드를 제조하도록 규모 확대될 수 있는, 연구실 내의 본 발명의 규모 확대가능한 공정에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 규모 확대가능한 공정은 연구실 내에서 수행된 제조 공정에 비해 제조 효율을 거의 또는 전혀 감소시키지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 규모 확대가능한 공정은 약 10 ㎎/ℓ, 약 20 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ, 약 75 ㎎/ℓ, 약 100 ㎎/ℓ, 약 125 ㎎/ℓ, 약 150 ㎎/ℓ, 약 175 ㎎/ℓ, 약 200 ㎎/ℓ, 약 250 ㎎/ℓ, 약 300 ㎎/ℓ 또는 이보다 높은 제조 효율로 다량체 스캐폴드를 제조한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 규모 확대가능한 공정은 약 10 ㎎/ℓ 이상, 약 20 ㎎/ℓ 이상, 약 30 ㎎/ℓ 이상, 약 50 ㎎/ℓ 이상, 약 75 ㎎/ℓ 이상, 약 100 ㎎/ℓ 이상, 약 125 ㎎/ℓ 이상, 약 150 ㎎/ℓ 이상, 약 175 ㎎/ℓ 이상, 약 200 ㎎/ℓ 이상, 약 250 ㎎/ℓ 이상 또는 약 300 ㎎/ℓ 이상의 제조 효율로 다량체 스캐폴드를 제조한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 규모 확대가능한 공정은 약 10 ㎎/ℓ 내지 약 300 ㎎/ℓ, 약 10 ㎎/ℓ 내지 약 250 ㎎/ℓ, 약 10 ㎎/ℓ 내지 약 200 ㎎/ℓ, 약 10 ㎎/ℓ 내지 약 175 ㎎/ℓ, 약 10 ㎎/ℓ 내지 약 150 ㎎/ℓ, 약 10 ㎎/ℓ 내지 약 100 ㎎/ℓ, 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 300 ㎎/ℓ, 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 250 ㎎/ℓ, 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 200 ㎎/ℓ, 20 ㎎/ℓ 내지 약 175 ㎎/ℓ, 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 150 ㎎/ℓ, 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 125 ㎎/ℓ, 약 20 ㎎/ℓ 내지 약 100 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ 내지 약 300 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ 내지 약 250 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ 내지 약 200 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ 내지 약 175 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ 내지 약 150 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ 내지 약 125 ㎎/ℓ, 약 30 ㎎/ℓ 내지 약 100 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ 내지 약 300 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ 내지 약 250 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ 내지 약 200 ㎎/ℓ, 50 ㎎/ℓ 내지 약 175 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ 내지 약 150 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ 내지 약 125 ㎎/ℓ 또는 약 50 ㎎/ℓ 내지 약 100 ㎎/ℓ의 제조 효율로 다량체 스캐폴드를 제조한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 규모 확대가능한 공정은 약 1 g/ℓ, 약 2 g/ℓ, 약 3 g/ℓ, 약 5 g/ℓ, 약 7.5 g/ℓ, 약 10 g/ℓ, 약 12.5 g/ℓ, 약 15.0 g/ℓ, 약 17.5 g/ℓ, 약 20 g/ℓ, 약 25 g/ℓ, 약 30 g/ℓ 또는 이보다 높은 제조 효율로 스캐폴드를 제조한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 규모 확대가능한 공정은 약 1 g/ℓ 이상, 약 2 g/ℓ 이상, 약 3 g/ℓ 이상, 약 5 g/ℓ 이상, 약 7.5 g/ℓ 이상, 약 10 g/ℓ 이상, 약 12.5 g/ℓ 이상, 약 15.0 g/ℓ 이상, 약 17.5 g/ℓ 이상, 약 20 g/ℓ 이상, 약 25 g/ℓ 이상 또는 약 30 g/ℓ 이상의 제조 효율로 스캐폴드를 제조한다.
링커
본 발명의 스캐폴드는 단백질 링커 및/또는 비단백질 링커에 의해 연결되어 있고, 이때 각각의 링커는 2개 이상의 본 발명의 스캐폴드에 융합되어 있다. 2개 이상의 본 발명의 스캐폴드가 연결되어야 하는 특정한 경우에 적합한 링커의 선택은 예를 들면, FnIII 단량체 도메인의 성질, 단백질분해 및 산화에 대한 펩티드 링커의 안정성, 다량체 폴딩을 유도하는 입체구조적 구속, 및/또는 상기 스캐폴드의 원하는 생물학적 활성과 관련된 입체구조적 구속을 포함하는 다양한 파라미터에 의존한다.
적합한 링커는 단백질 링커, 비단백질 링커 및 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 링커의 조합은 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 FnIII 스캐폴드는 복수의 본 발명의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 모든 링커가 동일하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 FnIII 스캐폴드는 복수의 본 발명의 FnIII 스캐폴드를 포함하고, 이때 1개 이상의 링커가 나머지 링커와 기능적으로 또는 구조적으로 상이하다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 표적과의 결합에 직접적으로 참여함으로써 다량체 FnIII 스캐폴드의 활성에 스스로 기여할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 단백질 링커는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 Gly, Ser, Ala 및 Thr으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 주로 포함한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gly, Ser, Ala 및 Thr으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 (펩티드 링커에 존재하는 아미노산 잔기의 총수를 기준으로 계산된) 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상으로 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gly, Ser, Ala 및/또는 Thr 잔기로만 구성된다.
링커 폴리펩티드는 2개 이상의 본 발명의 단량체 스캐폴드 또는 2개 이상의 본 발명의 다량체 스캐폴드가 원하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 상대적으로 정확한 입체구조를 취하는 방식으로 상기 2개 이상의 본 발명의 단량체 스캐폴드 또는 2개 이상의 본 발명의 다량체 스캐폴드를 연결하는 데에 적합한 길이를 가져야 한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 1 내지 약 1,000개의 아미노산 잔기, 1 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 1 내지 25개의 아미노산 잔기, 1 내지 20개의 아미노산 잔기, 1 내지 15개의 아미노산 잔기, 1 내지 10개의 아미노산 잔기, 1 내지 5개의 아미노산 잔기 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명은 폴리펩티드 링커 서열을 코딩하는 핵산, 예컨대, DNA, RNA 또는 이들의 조합을 추가로 제공한다. 폴리펩티드 링커에 포함될 선택된 아미노산 잔기는 본 발명의 다량체 스캐폴드의 활성 또는 기능을 유의하게 방해하지 않는 성질을 나타내어야 한다. 따라서, 폴리펩티드 링커는 본 발명의 다량체 스캐폴드의 활성 또는 기능과 불일치할 전하, 내부 폴딩을 방해할 전하, 또는 1개 이상의 FnIII 단량체 도메인 내의 아미노산 잔기와 함께 본 발명의 다량체 스캐폴드와 특이적 표적의 결합을 심각하게 방해할 결합 또는 다른 상호작용을 형성할 전하를 전체적으로 나타내지 않아야 한다.
몇몇 실시양태에서, 무작위화를 이용하여 다량체 스캐폴드의 최대 안정성 및/또는 활성을 부여하는 링커를 수득한다. 이 공정에서 입체구조적으로 유연한 링커를 먼저 이용하여 본 발명의 스캐폴드의 적합한 조합을 찾은 후, 생성된 다량체 스캐폴드를 폴리펩티드 링커 내의 아미노산 잔기를 무작위화함으로써 최적화한다.
폴리펩티드를 연결하여 신규 연결된 융합 폴리펩티드를 형성하기 위한 천연 펩티드 링커 및 인공 펩티드 링커의 사용은 문헌(Hallewell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268), 문헌(Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731), 문헌(Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116), 문헌(Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-3219), 문헌(Fares et al. (1998), Endocrinology 139, 2459-2464), 문헌(Smallshaw et al. (1999), Protein Eng. 12, 623-630) 및 미국 특허 제5,856,456호에서 잘 공지되어 있다.
따라서, 2개 이상의 본 발명의 스캐폴드를 융합시키는 링커는 천연 링커(예를 들면, 문헌(George & Heringa, Protein Eng. 11:871-879, 2002) 참조), 인공 링커 또는 이들의 조합이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 동일하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다량체 스캐폴드에 존재하는 2개 이상의 펩티드 링커의 아미노산 서열은 상이하다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 입체구조적 유연성을 보유한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 1 내지 25개의 글리신 잔기, 5 내지 20개의 글리신 잔기, 5 내지 15개의 글리신 잔기 또는 8 내지 12개의 글리신 잔기를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 50% 이상의 글리신 잔기, 75% 이상의 글리신 잔기, 80% 이상의 글리신 잔기 또는 85% 이상의 글리신 잔기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 글리신 잔기만을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 (G-G-G-G-S)x 아미노산 서열을 포함하고, 이때 x는 양의 정수이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 (G-A)x 서열을 포함하고, 이때 x는 양의 정수이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 (G-G-G-T-P-T)x 서열을 포함하고, 이때 x는 양의 정수이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 (G-G-G-G-S-G-T-G-S-A-M-A-S)x 서열을 포함하고, 이때 x는 양의 정수이다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 본질적으로 비구조화된 천연 또는 인공 폴리펩티드이다(예를 들면, 문헌(Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27:1186-1190, 2009) 및 문헌(Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35:D786-93, 2007) 참조).
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 링커의 입체구조적 유연성은 1개 이상의 프롤린 아미노산 잔기가 상기 폴리펩티드 링커의 아미노산 서열 내에 포함됨으로써 제한된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 이 폴리펩티드 링커의 아미노산 서열 내에 1개 이상의 프롤린 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 링커는 아미노산 잔기의 25% 이상, 50% 이상 또는 75% 이상이 프롤린 잔기인 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 프롤린 잔기만을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 알파 나선 형성 링커, 예를 들면, Ala-(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)n-Ala 선형 링커(n = 2 내지 5)(예를 들면, 문헌(Arai et al., Protein Eng. 14:529-532, 2001) 참조) 또는 알파 나선 다발 링커(예를 들면, 문헌(Maeda et al., Anal. Biochem. 249:147-152, 1997) 참조)가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, Ser 풍부 링커, 예를 들면, (Ser4-Gly)n(이때, n은 1을 초과함) 또는 (X4-Gly)n(이때, 2개 이하의 X'는 Thr이고, 나머지 X'는 Ser이고, n은 1을 초과함)가 사용될 수 있다(미국 특허 제5,525,491호 참조). 다른 실시양태에서, (Gly-Ser)n, (Gly-Gly-Ser-Gly)n 또는 Gly-Ser-Ala-Thr 링커가 사용된다.
펩티드 링커는 비폴리펩티드 모이어티에 대한 부착 기를 포함하는 아미노산 잔기가 도입되는 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기의 예는 시스테인 잔기(추후에 이 잔기에 비폴리펩티드 모이어티가 부착됨)일 수 있거나, 아미노산 서열은 생체내 N 글리코실화 부위를 포함할 수 있다(이로써, (생체 내에서) 당 모이어티를 펩티드 링커에 부착시킴). 추가 방법은 진화된 tRNA 및 tRNA 합성효소(예를 들면, 미국 특허공보 제2003/0082575호 참조)를 사용하여 비천연 아미노산을 단량체 도메인 또는 링커 내로 유전적으로 도입하는 것이다. 예를 들면, 케토 티로신의 삽입은 발현된 단량체 도메인 또는 다량체와의 부위 특이적 커플링을 가능하게 한다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 다량체에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 동일하다. 대안적으로, 폴리펩티드 다량체에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 상이할 수 있다.
스캐폴드의 표지 또는 접합
본 발명의 스캐폴드를 비접합된 형태로 사용하거나 다양한 이종 모이어티들 중 1개 이상의 이종 모이어티에 접합된 상태로 사용하여 표적 검출, 또는 영상화 또는 치료를 촉진할 수 있다. 정제가 수행되는 경우, 본 발명의 스캐폴드를 정제 전 또는 후에 표지하거나 접합시킬 수 있다.
많은 이종 모이어티가 본 발명의 스캐폴드에 연결될 수 있는 적합한 작용기를 결여하고 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 이펙터 분자는 접합을 위한 반응성 기를 함유하는 링커를 통해 스캐폴드에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드에 접합된 이종 모이어티는 링커로서 작용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 모이어티는 절단가능한 또는 절단불가능한 링커를 통해 스캐폴드에 접합된다. 한 실시양태에서, 절단가능한 연결 분자는 산화환원 절단가능한 연결 분자이므로, 상기 연결 분자는 보다 낮은 산화환원 전위를 갖는 환경, 예컨대, 세포질, 및 자유 설프하이드릴 기를 갖는 분자를 고농도로 함유하는 다른 영역 내에서 절단될 수 있다. 산화환원 전위에서의 변화로 인해 절단될 수 있는 연결 분자의 예로는 이황화 결합을 함유하는 분자가 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 접합을 위한 반응성 기를 제공하도록 조작된다. 이러한 스캐폴드에서, N 말단 및/또는 C 말단도 접합을 위한 반응성 기를 제공하는 데에 기여할 수 있다. 다른 실시양태에서, N 말단은 1개의 모이어티(예컨대, PEG(그러나, 이로 한정되지 않음))에 접합될 수 있는 반면, C 말단은 또 다른 모이어티(예컨대, 바이오틴(그러나, 이로 한정되지 않음))에 접합되거나, 또는 그 반대의 경우도 가능하다.
용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제, 커플링 모이어티 또는 활성화 모이어티(예를 들면, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, N-하이드록시석신이미드 또는 말레이미드 모이어티)를 갖거나 갖지 않는 폴리에틸렌 글리콜 화합물 또는 이의 유도체를 의미한다. 용어 "PEG"는 분자량이 500 내지 150,000 Da인 폴리에틸렌 글리콜(이의 유사체, 예를 들면, 말단 OH 기가 메톡시 기로 치환되어 있는 유사체(mPEG로서 지칭됨)를 포함함)을 표시하기 위한 것이다.
본 발명의 스캐폴드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 의해 유도체화될 수 있다. PEG는 2개의 말단 하이드록실 기를 갖는 산화에틸렌 반복 유닛으로 구성된 선형 수용성 중합체이다. PEG는 전형적으로 약 500 내지 약 40,000 달톤의 범위 내에 있는 그의 분자량에 의해 분류된다. 특정 실시양태에서, 사용되는 PEG의 분자량은 5,000 내지 약 20,000 달톤이다. 본 발명의 스캐폴드에 커플링되는 PEG는 분지된 또는 비분지된 PEG일 수 있다(예를 들면, 문헌(Monfardini, C. et al., 1995 Bioconjugate Chem 6:62-69) 참조). PEG는 넥타 인코포레이티드(Nektar Inc.), 시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Co.) 및 다른 회사로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 이러한 PEG는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 석시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES) 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐(MePEG-IM)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
요약하건대, 사용되는 친수성 중합체, 예를 들면, PEG는 한 말단에서 비반응성 기, 예컨대, 메톡시 또는 에톡시 기에 의해 캡핑된다. 그 후, 상기 중합체는 다른 말단에서 적합한 활성화제, 예컨대, 시아누르산 할로겐화물(예를 들면, 시아누르산 염화물, 브롬화물 또는 불소화물), 카르보닐디이미다졸, 무수물 시약(예를 들면, 디할로 석신산 무수물, 예컨대, 디브로모석신산 무수물), 아실 아지드, p-디아조늄벤질 에테르, 3-(p-디아조늄페녹시)-2-하이드록시프로필에테르) 등과의 반응에 의해 활성화된다. 그 후, 활성화된 중합체는 전술된 바와 같이 폴리펩티드와 반응하여 중합체에 의해 유도체화된 폴리펩티드를 생성한다. 대안적으로, 상기 중합체와의 반응을 위해 본 발명의 스캐폴드 내의 작용기를 활성화시킬 수 있거나, 공지되어 있는 커플링 방법을 이용하여 2개의 상기 기를 조화된 커플링 반응에서 연결할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 이용되는 많은 다른 반응식을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 PEG로 유도체화할 수 있다는 것이 용이하게 인식될 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드, 이의 유사체 또는 유도체는 진단제 또는 검출가능한 물질에 접합될 수 있다. 이러한 스캐폴드는 임상 시험 절차의 부분으로서 질환의 발달 또는 진행을 모니터링하거나 예후하는 데, 예컨대, 특정 요법의 효능을 확인하는 데에 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 다양한 효소, 예컨대, 호스라디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(phosphatase), 베타 갈락토스가수분해효소(beta-galactosidase) 또는 아세틸콜린에스테르가수분해효소(acetylcholinesterase)(그러나, 이들로 한정되지 않음); 보결분자단, 예컨대, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴(그러나, 이들로 한정되지 않음); 형광 물질, 예컨대, 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 염화단실 또는 피코에리쓰린(그러나, 이들로 한정되지 않음); 발광 물질, 예컨대, 루미놀(그러나, 이로 한정되지 않음); 생체발광 물질, 예컨대, 루시퍼라제(luciferase), 루시페린(luciferin) 및 애쿠오린(aequorin)(그러나, 이들로 한정되지 않음); 방사성 물질, 예컨대, 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브데늄(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 사마륨(153Sm), 루테튬(177Lu), 가돌리늄(159Gd, 153Gd), 프로메튬(149Pm), 란타늄(140La), 이테르븀(175Yb, 169Yb), 홀뮴(166Ho), 이트륨(90Y), 스칸듐(47Sc), 레늄(186Re, 188Re), 프라세오디뮴(142Pr), 로듐(105Rh), 루테늄(97Ru), 게르마늄(68Ge), 코발트(57Co), 아연(65Zn), 스트론튬(85Sr), 인(32P), 크로뮴(51Cr), 망간(54Mn), 셀레늄(75Se), 주석(113Sn) 및 인듐(117In); 다양한 양전자 방출 단층 촬영술에서 사용되는 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온; 및 특정 방사성동위원소에 방사성표지되거나 접합되는 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 검출가능한 물질에 스캐폴드를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
추가로, 본 발명은 치료 모이어티에 접합된 스캐폴드의 사용을 포괄한다. 스캐폴드는 치료 모이어티, 예컨대, 세포독소, 예를 들면, 세포정지제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예컨대, 알파 방출제에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 물질을 포함한다. 치료 모이어티는 하기 물질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 항대사물질(예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캡토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진); 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BCNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스프아미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴); 안쓰라시클린(예를 들면, 다우노루비신(이전 명칭: 다우노마이신) 및 독소루비신); 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(이전 명칭: 악티노마이신), 블레오마이신, 미쓰라마이신 및 안쓰라마이신(AMC)); 아우리스타틴 분자[예를 들면, 아우리스타틴 PHE, 브리오스타틴 1 및 솔라스타틴 10; 문헌(Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)), 문헌(Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)), 문헌(Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)), 문헌(Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)) 및 문헌(Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)) 참조(이들 문헌 모두 본원에 참고로 도입됨)]; 호르몬(예를 들면, 글루코코르티코이드, 프로게스틴, 안드로겐 및 에스트로겐); DNA 복구 효소 억제제(예를 들면, 에토포사이드 또는 테포테칸); 인산화효소 억제제(예를 들면, 화합물 ST1571, 이마티니브 메실레이트(Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002)); 세포독성제(예를 들면, 파클리탁셀, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안쓰라신디온, 미톡산트론, 미쓰라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 및 이들의 유사체 또는 상동체), 및 미국 특허 제6,245,759호, 제6,399,633호, 제6,383,790호, 제6,335,156호, 제6,271,242호, 제6,242,196호, 제6,218,410호, 제6,218,372호, 제6,057,300호, 제6,034,053호, 제5,985,877호, 제5,958,769호, 제5,925,376호, 제5,922,844호, 제5,911,995호, 제5,872,223호, 제5,863,904호, 제5,840,745호, 제5,728,868호, 제5,648,239호 및 제5,587,459호에 개시된 화합물; 파르네실 전이효소(farnesyl transferase) 억제제(예를 들면, RI 15777, BMS-214662, 및 예를 들면, 미국 특허 제6,458,935호, 제6,451,812호, 제6,440,974호, 제6,436,960호, 제6,432,959호, 제6,420,387호, 제6,414,145호, 제6,410,541호, 제6,410,539호, 제6,403,581호, 제6,399,615호, 제6,387,905호, 제6,372,747호, 제6,369,034호, 제6,362,188호, 제6,342,765호, 제6,342,487호, 제6,300,501호, 제6,268,363호, 제6,265,422호, 제6,248,756호, 제6,239,140호, 제6,232,338호, 제6,228,865호, 제6,228,856호, 제6,225,322호, 제6,218,406호, 제6,211,193호, 제6,187,786호, 제6,169,096호, 제6,159,984호, 제6,143,766호, 제6,133,303호, 제6,127,366호, 제6,124,465호, 제6,124,295호, 제6,103,723호, 제6,093,737호, 제6,090,948호, 제6,080,870호, 제6,077,853호, 제6,071,935호, 제6,066,738호, 제6,063,930호, 제6,054,466호, 제6,051,582호, 제6,051,574호 및 제6,040,305호에 개시된 화합물); 국소이성질체화효소(topoisomerase) 억제제(예를 들면, 캄프토테신, 이리노테칸, SN-38, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, GG-211(GI 147211), DX-8951f, IST-622, 루비테칸, 피라졸로아크리딘, XR-5000, 사인토핀(saintopin), UCE6, UCE1022, TAN-1518A, TAN-1518B, KT6006, KT6528, ED-110, NB-506, ED-110, NB-506, 및 레베카마이신); 불가레인(bulgarein); DNA 작은 홈(minor groove) 결합제, 예컨대, 훽스트 염료 33342 및 훽스트 염료 33258; 니티딘(nitidine); 파가로닌(fagaronine); 에피버버린(epiberberine); 코랄린(coralyne); 베타-라파콘(beta-lapachone); BC-4-1; 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 포접 화합물 및 전구약물(예를 들면, 문헌(Rothenberg, M. L., Annals of Oncology 8:837-855 (1997)) 및 문헌(Moreau, P., et al., J. Med. Chem. 41 :1631-1640 (1998)) 참조); 비스포스포네이트(예를 들면, 알렌드로네이트, 시마드로네이트, 클로드로네이트, 틸루드로네이트, 에티드로네이트, 이반드로네이트, 네리드로네이트, 올판드로네이트, 리세드로네이트, 피리드로네이트, 파미드로네이트, 졸렌드로네이트); HMG-CoA 환원효소 억제제; 스타틴(예를 들면, 로바스타틴, 심바스타틴, 아토르바스타틴(리피토르(Lipitor)™), 프라바스타틴, 플루바스타틴(레스콜(Lescol)™), 세리바스타틴 및 로수바스타틴); 안티센스 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 미국 특허 제6,277,832호, 제5,998,596호, 제5,885,834호, 제5,734,033호 및 제5,618,709호에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드); 면역조절제(예를 들면, 항체 및 사이토킨); 및 아데노신 탈아미노효소(deaminase) 억제제(예를 들면, 플루다라빈 포스페이트 및 2-클로로데옥시아데노신).
추가로, 스캐폴드는 소정의 생물학적 반응을 변경시키는 치료 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료 모이어티 또는 약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료제로 한정되는 것으로서 간주되어서는 안 된다. 예를 들면, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들면, 효소, 항체, 독소(예를 들면, 애브린, 리신 A, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대, 종양 괴사 인자(예를 들면, TNF 알파, TNF 베타), 인터페론(예를 들면, α-인터페론, β-인터페론), 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제(예를 들면, TNF 알파, TNF 베타, AIM I(국제특허공보 제WO97/33899호 참조), AIM II(국제특허공보 제WO97/34911호 참조), 파스(Fas) 리간드(Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574) 및 VEGI(국제특허공보 제WO99/23105호 참조), 혈전제 또는 항혈관신생제(예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴 또는 응고 경로의 성분(예를 들면, 조직 인자)); 또는 생물학적 반응 변경제, 예를 들면, 림포카인(예를 들면, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF") 및 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF")), 성장인자(예를 들면, 성장호르몬("GH")), 또는 응고제(예를 들면, 칼슘, 비타민 K, 조직 인자, 예컨대, 해게만(Hageman) 인자(인자 XII)(그러나, 이로 한정되지 않음), 고분자량 키니노겐(HMWK), 프레칼리크레인(PK), 응고 단백질 인자 II(프로쓰롬빈), 인자 V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa 및 X, 인지질, 피브리노겐의 α 쇄 및 β 쇄로부터의 피브리노펩티드 A 및 B, 피브린 단량체)를 포함할 수 있다.
더욱이, 스캐폴드는 치료 모이어티, 예컨대, 방사성 금속 이온, 예컨대, 알파 방출제, 예컨대, 213Bi; 또는 131In, 131Lu, 131Y, 131Ho 및 131Sm을 포함하나 이들로 한정되지 않는 방사성 금속 이온을 폴리펩티드에 접합시키는 데에 유용한 대환식 킬레이터(macrocyclic chelator)에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대환식 킬레이터는 링커 분자를 통해 스캐폴드에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에서 통상적으로 공지되어 있고 문헌(Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90), 문헌(Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7) 및 문헌(Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50)(이들 각각은 온전히 그대로 도입됨)에 기재되어 있다.
치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기법은 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56. (Alan R. Liss, Inc. 1985)); 문헌(Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)); 문헌(Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)); 문헌("Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)); 및 문헌(Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58) 참조). 유사한 방법이 본 발명의 스캐폴드와 함께 사용되도록 개조될 수 있다.
본 발명의 스캐폴드에 접합된 치료 모이어티 또는 약물은 대상체에서 특정 장애의 원하는 예방 또는 치료 효과(들)를 달성하도록 선택되어야 한다. 의사 또는 다른 의료인은 어떤 치료 모이어티 또는 약물을 스캐폴드에 접합시킬지를 결정할 때 하기 사항을 고려해야 한다: 질환의 성질, 질환의 심각도 및 대상체의 상태.
스캐폴드의 분석
본 발명의 스캐폴드는 당업계에서 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 표적과의 특이적 결합에 대해 분석될 수 있다. 이용될 수 있는 대표적인 분석은 예를 들면, 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA(효소 연결된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전 반응, 겔 확산 침전소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정화 분석, 면역방사측정 분석, 형광 면역분석과 같은 기법을 이용하는 경쟁 분석 시스템 및 비경쟁 분석 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 분석은 관용적인 분석이고 당업계에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York) 참조).
항원에 대한 스캐폴드의 결합 친화성 및 다른 결합 성질은 예를 들면, 평형화 방법(예를 들면, 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA; 또는 방사면역분석(RIA)), 또는 반응속도 분석(예를 들면, 비아코어(BIACORE)® 분석), 및 다른 방법, 예컨대, 간접적 결합 분석, 경쟁 결합 분석, 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들면, 겔 여과)를 포함하는, 당업계에서 공지되어 있는 다양한 시험관내 분석 방법에 의해 측정될 수 있다. 이들 방법 및 다른 방법은 조사될 1개 이상의 성분 상의 표지를 사용할 수 있고/있거나, 발색 표지, 형광 표지, 발광 표지 또는 동위원소 표지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 검출 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화성 및 반응속도에 대한 상세한 설명은 문헌(Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999))에서 찾을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 특정 반응속도로 표적에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 1x10-2 M, 1x10-3 M, 1x10-4 M, 1x10-5 M, 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 1x10-14 M 또는 1x10-15 M 미만의 해리상수 또는 Kd(koff/kon)를 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 비아코어® 분석 또는 당업계에서 공지되어 있는 다른 분석에 의해 측정되었을 때 500 μM, 100 μM, 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM 또는 100 pM 이하의 Kd를 나타낸다.
대안적 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드의 친화성은 비 kon/koff로서 계산되는, 1x102 M-1, 1x103 M-1, 1x104 M-1, 1x105 M-1, 1x106 M-1, 1x107 M-1, 1x108 M-1, 1x109 M-1, 1x1010 M-1, 1x1011 M-1, 1x1012 M-1, 1x1013 M-1, 1x1014 M-1, 1x1015 M-1 또는 5xl015 M-1 이상의 결합상수(Ka)의 관점에서 기재된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드가 표적 에피토프로부터 해리되는 속도는 Kd 또는 Ka의 값보다 더 유의할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 10-3 s-1 미만, 5x10-3 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 5x10-4 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5x10-5 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5x10-6 s-1 미만, 10-7 s-1 미만, 5x10-7 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5x10-8 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5x10-9 s-1 미만 또는 10-10 s-1 미만의 koff를 나타낸다.
일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드가 표적 에피토프와 결합하는 속도는 Kd 또는 Ka의 값보다 더 유의할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 스캐폴드는 105 M-1s-1 이상, 5x105 M-1s-1 이상, 106 M-1s-1 이상, 5x106 M-1s-1 이상, 107 M-1s-1 이상, 5x107 M-1s-1 이상, 108 M-1s-1 이상 또는 109 M-1s-1 이상의 kon 속도로 표적에 결합한다.
본 발명의 스캐폴드는 면역분석 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수도 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
가용성 분비된 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석
특정 실시양태에서, 본 발명은 배양 배지에서 분비된 가용성 재조합 폴리펩티드를 검출하는 개선된 ELISA 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 재조합 FnIII 변이체이다. 한 실시양태에서, 가용성 재조합 피브로넥틴 III형 변이체를 검출하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 발현된 폴리펩티드를 함유하는 배양 배지를 상기 폴리펩티드에 결합하는 고정된 항체와 반응시키는 단계;
(b) 상기 폴리펩티드를 결합에 적합한 조건 하에서 효소에 접합된 표적과 반응시키는 단계;
(c) 결합된 접합체 표적을 기질과 반응시키는 단계로서, 이때 신호가 발생되는 것인 단계; 및
(d) 상기 신호의 강도를 측정하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 발현된 변이체를 함유하는 배양 배지를 상기 변이체에 결합하는 항체와 반응시키는 단계로서, 이때 상기 항체가 고체 지지체에 고정된 것인 단계;
(b) 고정된 지지체를 완충제 용액으로 세척하는 단계;
(c) 상기 변이체를 결합 쌍의 제1 구성원에 접합된 표적과 반응시키는 단계;
(d) 고정된 지지체를 완충제 용액으로 세척하는 단계;
(e) 상기 제1 구성원을 결합 쌍의 제2 구성원과 반응시키는 단계로서, 이때 상기 제2 구성원이 효소에 접합된 것인 단계;
(f) 상기 효소를 기질과 반응시키는 단계로서, 이때 신호가 발생되는 것인 단계; 및
(g) 상기 신호의 강도를 측정하는 단계로서, 이때 신호 강도가 결합 친화성과 상관관계를 갖는 것인 단계. 한 실시양태에서, 상기 방법은 미정제 배양 배지 중의 분비된 폴리펩티드 또는 분비된 변이체를 검출하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 미정제 배양 배지 중의 분비된 폴리펩티드 또는 분비된 변이체를 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 신호 강도는 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 19% 미만까지 변경된다.
한 실시양태에서, ELISA 방법은 96개 이상의 웰을 갖는 분석 플레이트를 이용하는 고효율 또는 초고효율 포맷으로 수행된다. 특정 실시양태에서, 384 웰 분석 플레이트 또는 1536 웰 분석 플레이트가 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 폴리(히스) 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, FLAG 태그, Strep 태그, myc 태그 또는 V5 태그를 포함하나 이들로 한정되지 않는 이종 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 검출한다.
또 다른 실시양태에서, 결합 쌍의 제1 구성원은 바이오틴이고, 결합 쌍의 제2 구성원은 스트렙타비딘 또는 아비딘이다.
약학 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화된 본 발명의 스캐폴드들 또는 다량체 스캐폴드들 중 하나 또는 이들의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물(그러나, 이로 한정되지 않음)을 제공한다. 이러한 조성물은 예를 들면, 2개 이상의 상이한 본 발명의 스캐폴드들 중 하나 또는 이들의 조합(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 상보적 활성을 나타내는 스캐폴드의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 본 발명의 다량체 스캐폴드를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 조합 요법으로, 예컨대, 다른 약제와 조합되어 투여될 수도 있다. 예를 들면, 조합 요법은 1종 이상의 다른 요법과 조합된 본 발명의 스캐폴드를 포함할 수 있고, 이때 상기 다른 요법은 면역요법, 화학요법, 방사선 치료 또는 약물요법일 수 있다.
본 발명의 약학 화합물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 이러한 염의 예로는 산 부가 염 및 염기 부가 염이 있다. 산 부가 염은 무독성 무기산, 예컨대, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유도된 염뿐만 아니라, 무독성 유기산, 예컨대, 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐 치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 설폰산 및 방향족 설폰산 등으로부터 유도된 염도 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 염뿐만 아니라, 무독성 유기 아민, 예컨대, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유도된 염도 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 산화방지제도 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산화방지제의 예로는 (1) 수용성 산화방지제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 산화방지제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시애니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파 토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 주석산, 인산 등이 있다.
본 발명의 약학 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 담체 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트가 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅재, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 보조제, 예컨대, 보존제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 멸균 절차 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 상기 조성물 내에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 추가로, 주사가능한 약학 제형의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 달성될 수 있다.
약학 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균된 안정한 상태이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 미세유화액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 조직화된 구조체로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅재, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 상기 조성물 내에 포함시키는 것이 적합할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 상기 조성물 내에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 도입한 후, 요구되는 경우 멸균 미세여과를 수행함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 상기 나열된 성분들 중 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가 원하는 성분으로 구성된 분말을 이의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 생성하는 진공건조 및 냉동건조(동결건조)이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물(예를 들면, 액체 제제)은 내독소 및/또는 관련 발열원성 물질을 실질적으로 함유하지 않는 발열원 부재 제제이다. 내독소는 미생물 내부에 국한되어 있고 미생물이 파괴되거나 사멸하는 경우 방출되는 독소를 포함한다. 발열원성 물질은 세균 및 다른 미생물의 외막으로부터의 발열 유도 열안정성 물질(당단백질)도 포함한다. 이들 물질들 둘다가 인간에게 투여되는 경우 발열, 저혈압 및 쇼크를 야기할 수 있다. 잠재적인 유해 효과로 인해, 정맥내로 투여되는 약물 용액으로부터 소량의 내독소조차도 제거하는 것이 유리하다. 식품의약안전청("FDA")은 정맥내 약물 적용의 경우 1시간의 단일 기간 내에 체중 ㎏당 투여량당 5 내독소 유닛(EU)의 상한을 설정하였다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 치료 단백질이 체중 ㎏당 수백 또는 수천 ㎎의 양으로 투여되는 경우, 미량의 내독소조차도 제거하는 것이 유리하다. 한 실시양태에서, 상기 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10 EU/㎎ 미만, 5 EU/㎎ 미만, 1 EU/㎎ 미만, 0.1 EU/㎎ 미만, 0.01 EU/㎎ 미만 또는 0.001 EU/㎎ 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 약 10 EU/㎎ 미만, 약 5 EU/㎎ 미만, 약 1 EU/㎎ 미만, 약 0.1 EU/㎎ 미만, 약 0.01 EU/㎎ 미만 또는 약 0.001 EU/㎎ 미만이다.
약학적 투약 및 투여
본 발명의 스캐폴드를 포함하는 약학 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 스캐폴드를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합한다. 치료제 및 진단제의 제제는 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 예를 들면, 동결건조된 분말, 슬러리, 수용액, 로션 또는 현탁액의 형태로 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌(Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.); 문헌(Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.); 문헌(Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY); 문헌(Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY); 문헌(Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY); 및 문헌(Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.) 참조).
치료제에 대한 투여 섭생법의 선택은 물질의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 정도, 물질의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스 내의 표적 세포의 접근성을 포함하는 여러 요인에 의존한다. 일부 실시양태에서, 투여 섭생법은 부작용의 허용가능한 수준과 일치하는, 환자에게 전달된 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물학적 물질의 양은 구체적인 물질 및 치료될 병태의 심각도에 부분적으로 의존한다. 항체, 사이토킨 및 소분자의 적절한 투여량을 선택함에 있어서 지침이 이용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK); 문헌(Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N. Y.); 문헌(Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.); 문헌(Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608); 문헌(Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973); 문헌(Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792); 문헌(Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619); 문헌(Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32); 및 문헌(Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602) 참조).
의사는 예를 들면, 당업계에서 치료에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있거나 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 파라미터 또는 요인을 이용하여 적절한 투여량을 결정한다. 일반적으로, 투여량은 최적 투여량보다 약간 적은 양으로 시작되고, 그 후 임의의 불리한 부작용에 비해 상대적으로 원하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지 작은 증가에 의해 증가된다. 중요한 진단 척도는 예를 들면, 염증의 증상 또는 생성된 염증성 사이토킨의 수준을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 상기 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 의학 분야에서 잘 공지되어 있는 다른 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인들에 의존할 것이다.
본 발명의 스캐폴드는 연속 관주에 의해 제공될 수 있거나, 예를 들면, 1일 또는 1주의 간격을 두고 투약하거나 주당 1 내지 7회 투약함으로써 제공될 수 있다. 투여량은 정맥내, 피하, 국소, 경구, 비강, 직장, 근육내, 뇌내, 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 구체적인 투약 프로토콜은 유의한 원하지 않는 부작용을 피하는 최대 투여량 또는 투약 빈도를 포함하는 프로토콜이다. 주당 총 투여량은 체중 ㎏당 0.05 ㎍ 이상, 0.2 ㎍ 이상, 0.5 ㎍ 이상, 1 ㎍ 이상, 10 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 0.2 ㎎ 이상, 1.0 ㎎ 이상, 2.0 ㎎ 이상, 10 ㎎ 이상, 25 ㎎ 이상 또는 50 ㎎ 이상일 수 있다(예를 들면, 문헌(Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434); 문헌(Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698); 문헌(Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456); 및 문헌(Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144) 참조). 소분자 치료제, 예를 들면, 펩티드 모방체, 단백질 스캐폴드, 천연 생성물 또는 유기 화학물질의 바람직한 투여량은 체중 ㎏당 몰을 기준으로 항체 또는 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여량과 거의 동일하다.
소분자 또는 스캐폴드 치료제의 바람직한 혈장 농도는 체중 ㎏당 몰을 기준으로 항체에 대한 바람직한 혈장 농도와 거의 동일하다. 상기 투여량은 15 ㎍ 이상, 20 ㎍ 이상, 25 ㎍ 이상, 30 ㎍ 이상, 35 ㎍ 이상, 40 ㎍ 이상, 45 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 55 ㎍ 이상, 60 ㎍ 이상, 65 ㎍ 이상, 70 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 80 ㎍ 이상, 85 ㎍ 이상, 90 ㎍ 이상, 95 ㎍ 이상 또는 100 ㎍ 이상일 수 있다. 대상체에게 투여되는 투약 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12회, 또는 그 이상일 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중 ㎏당 0.0001 내지 100 ㎎일 수 있다. 상기 투여량은 환자의 체중 ㎏당 0.0001 내지 20 ㎎, 0.0001 내지 10 ㎎, 0.0001 내지 5 ㎎, 0.0001 내지 2 ㎎, 0.0001 내지 1 ㎎, 0.0001 내지 0.75 ㎎, 0.0001 내지 0.5 ㎎, 0.0001 내지 0.25 ㎎, 0.0001 내지 0.15 ㎎, 0.0001 내지 0.10 ㎎, 0.001 내지 0.5 ㎎, 0.01 내지 0.25 ㎎ 또는 0.01 내지 0.10 ㎎일 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 투여량은 환자의 체중(㎏)을 투여될 투여량(㎎/㎏)과 곱함으로써 계산될 수 있다. 본 발명의 스캐폴드의 투여량은 환자의 체중 ㎏당 150 ㎍ 이하, 125 ㎍ 이하, 100 ㎍ 이하, 95 ㎍ 이하, 90 ㎍ 이하, 85 ㎍ 이하, 80 ㎍ 이하, 75 ㎍ 이하, 70 ㎍ 이하, 65 ㎍ 이하, 60 ㎍ 이하, 55 ㎍ 이하, 50 ㎍ 이하, 45 ㎍ 이하, 40 ㎍ 이하, 35 ㎍ 이하, 30 ㎍ 이하, 25 ㎍ 이하, 20 ㎍ 이하, 15 ㎍ 이하, 10 ㎍ 이하, 5 ㎍ 이하, 2.5 ㎍ 이하, 2 ㎍ 이하, 1.5 ㎍ 이하, 1 ㎍ 이하, 0.5 ㎍ 이하 또는 0.5 ㎍ 이하일 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 유닛 투여량은 0.1 내지 20 ㎎, 0.1 내지 15 ㎎, 0.1 내지 12 ㎎, 0.1 내지 10 ㎎, 0.1 내지 8 ㎎, 0.1 내지 7 ㎎, 0.1 내지 5 ㎎, 0.1 내지 2.5 ㎎, 0.25 내지 20 ㎎, 0.25 내지 15 ㎎, 0.25 내지 12 ㎎, 0.25 내지 10 ㎎, 0.25 내지 8 ㎎, 0.25 내지 7 ㎎, 0.25 내지 5 ㎎, 0.5 내지 2.5 ㎎, 1 내지 20 ㎎, 1 내지 15 ㎎, 1 내지 12 ㎎, 1 내지 10 ㎎, 1 내지 8 ㎎, 1 내지 7 ㎎, 1 내지 5 ㎎ 또는 1 내지 2.5 ㎎일 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 투여량은 대상체에서 0.1 ㎍/㎖ 이상, 0.5 ㎍/㎖ 이상, 1 ㎍/㎖ 이상, 2 ㎍/㎖ 이상, 5 ㎍/㎖ 이상, 6 ㎍/㎖ 이상, 10 ㎍/㎖ 이상, 15 ㎍/㎖ 이상, 20 ㎍/㎖ 이상, 25 ㎍/㎖ 이상, 50 ㎍/㎖ 이상, 100 ㎍/㎖ 이상, 125 ㎍/㎖ 이상, 150 ㎍/㎖ 이상, 175 ㎍/㎖ 이상, 200 ㎍/㎖ 이상, 225 ㎍/㎖ 이상, 250 ㎍/㎖ 이상, 275 ㎍/㎖ 이상, 300 ㎍/㎖ 이상, 325 ㎍/㎖ 이상, 350 ㎍/㎖ 이상, 375 ㎍/㎖ 이상 또는 400 ㎍/㎖ 이상의 혈청 역가를 달성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 스캐폴드의 투여량은 대상체에서 0.1 ㎍/㎖ 이상, 0.5 ㎍/㎖ 이상, 1 ㎍/㎖ 이상, 2 ㎍/㎖ 이상, 5 ㎍/㎖ 이상, 6 ㎍/㎖ 이상, 10 ㎍/㎖ 이상, 15 ㎍/㎖ 이상, 20 ㎍/㎖ 이상, 25 ㎍/㎖ 이상, 50 ㎍/㎖ 이상, 100 ㎍/㎖ 이상, 125 ㎍/㎖ 이상, 150 ㎍/㎖ 이상, 175 ㎍/㎖ 이상, 200 ㎍/㎖ 이상, 225 ㎍/㎖ 이상, 250 ㎍/㎖ 이상, 275 ㎍/㎖ 이상, 300 ㎍/㎖ 이상, 325 ㎍/㎖ 이상, 350 ㎍/㎖ 이상, 375 ㎍/㎖ 이상 또는 400 ㎍/㎖ 이상의 혈청 역가를 달성할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 투약은 반복될 수 있고, 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월 또는 6개월 이상의 기간에 의해 분리될 수 있다.
특정 환자에 대한 유효량은 치료되는 병태, 상기 환자의 전체적인 건강, 투여의 방법, 경로 및 투여량, 및 부작용의 심각도와 같은 요인들에 따라 변경될 수 있다(예를 들면, 문헌(Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK) 참조).
본 발명의 조성물은 당업계에서 공지되어 있는 다양한 방법들 중 1종 이상의 방법을 이용함으로써 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수도 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 변경될 것이다. 본 발명의 스캐폴드에 대한 선택된 투여 경로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 뇌내, 안구내, 뇌척수내, 병소내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 관주, 또는 지속 방출 시스템 또는 이식편에 의한 투여를 포함하나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547-556); 문헌(Langer, et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277); 문헌(Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105); 문헌(Epstein, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692); 문헌(Hwang, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034); 및 미국 특허 제6,350,466호 및 제6,316,024호 참조). 대안적으로, 본 발명의 조성물은 비경구 경로, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들면, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여될 수 있다. 필요한 경우, 상기 조성물은 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 가용화제 및 국소 마취제, 예컨대, 리도카인도 포함할 수 있다. 추가로, 예를 들면, 흡입기 또는 분무기의 사용 및 에어로졸화제를 사용한 제제화에 의해 폐 투여도 이용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호 및 제4,880,078호; 및 국제특허공보 제WO92/19244호, 제WO97/32572호, 제WO97/44013호, 제WO98/31346호 및 제WO99/66903호(이들 각각은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)를 참조한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체, 조합 요법 또는 조성물은 알커메스 에어(Alkermes AIR)™ 폐 약물 전달 기술(알커메스 인코포레이티드(Alkermes, Inc.), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)의 이용을 통해 투여된다.
본 발명의 스캐폴드가 조절 방출 또는 지속 방출 시스템으로 투여되는 경우, 펌프를 이용하여 조절 방출 또는 지속 방출을 달성할 수 있다(문헌(Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982); 문헌(Seflon, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201); 문헌(Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507); 및 문헌(Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:51 A) 참조). 중합체 물질을 사용하여 본 발명의 요법의 조절 방출 또는 지속 방출을 달성할 수 있다(예를 들면, 문헌(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974)); 문헌(Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)); 문헌(Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol Sd. Rev. Macromol. Chem. 23:61); 문헌(Levy et al., 1985, Science 228:190); 문헌(During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351); 문헌(Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105); 미국 특허 제5,679,377호; 미국 특허 제5,916,597호; 미국 특허 제5,912,015호; 미국 특허 제5,989,463호; 미국 특허 제5,128,326호; 국제특허공보 제WO99/15154호; 및 국제특허공보 제WO99/20253호 참조).
지속 방출 제제에서 사용되는 중합체의 예로는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜라이드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 지속 방출 제제에서 사용되는 중합체는 불활성을 나타내고 여과가능한 불순물을 함유하지 않고 저장 시 안정하고 멸균 상태이며 생체분해가능하다. 조절 또는 지속 방출 시스템은 예방 또는 치료 표적과 인접하여 위치할 수 있으므로 전신 투여량의 단지 일부분만을 요구한다(예를 들면, 문헌(Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)) 참조).
조절 방출 시스템은 랑거(Langer)의 평론(1990, Science 249:1527-1533)에서 논의되어 있다. 당업자에게 공지되어 있는 임의의 기법을 이용하여 1개 이상의 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 지속 방출 제제를 생성할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,526,938호, 국제특허공보 제WO91/05548호, 국제특허공보 제WO96/20698호, 문헌(Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39: 179-189), 문헌(Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397), 문헌(Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854) 및 문헌(Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760)(이들 각각은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)을 참조한다.
본 발명의 스캐폴드는 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 겔, 샴푸, 분무제, 에어로졸, 용액, 유화액, 또는 당업자에게 잘 공지되어 있는 다른 형태의 제형으로 국소 투여되도록 제제화될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995))을 참조한다. 분무불가능한 국소 투약 제형의 경우, 국소 적용과 상용가능하고 몇몇 경우 물보다 높은 동적 점도를 나타내는 담체 또는 1종 이상의 부형제를 포함하는 점성 내지 반고체 또는 고체 제형이 전형적으로 사용된다. 적합한 제제는 원하는 경우 멸균되어 있거나 다양한 성질, 예컨대, 삼투압에 영향을 미치기 위한 보조제(예를 들면, 보존제, 안정화제, 습윤화제, 완충제 또는 염)와 혼합되어 있는 용액, 현탁액, 유화액, 크림, 연고, 분말, 도찰제, 고약 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 적합한 국소 투약 제형은 분무가능한 에어로졸 제제를 포함하고, 이때 활성 성분은 몇몇 경우 고체 또는 액체 불활성 담체와 함께 가압된 휘발성 물질(예를 들면, 기체성 추진제, 예컨대, 프레온)과의 혼합물로 포장되거나 스퀴즈병(squeeze bottle) 내에 포장된다. 원하는 경우, 보습제 또는 습윤제도 원하는 경우 약학 조성물 및 투약 제형에 첨가될 수 있다. 이러한 추가 성분의 예는 당업계에서 잘 공지되어 있다.
본 발명의 스캐폴드가 비강내로 투여되는 경우, 상기 스캐폴드는 에어로졸 형태, 분무제, 운무 또는 적제의 형태로 제제화된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 사용을 위한 예방제 또는 치료제는 적합한 추진제(예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체)의 사용에 의해 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제시의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 유닛은 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물과 적합한 분말 기제, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에서 사용될 캡슐 및 카트리지(예를 들면, 젤라틴으로 구성됨)가 제제화될 수 있다.
제2 치료제, 예를 들면, 사이토킨, 스테로이드, 화학요법제, 항생제 또는 방사선을 사용하는 공투여(co-administration) 또는 치료 방법은 당업계에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, N. Y.); 문헌(Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.); 및 문헌(Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.) 참조).
치료제의 유효량은 증상을 10% 이상, 20% 이상, 약 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상까지 감소시킬 수 있다.
본 발명의 스캐폴드와 함께 투여될 수 있는 추가 요법들(예를 들면, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 동시에 투여될 수 있다. 용어 "동시에"는 정확히 동일한 시간에서의 요법(예를 들면, 예방제 또는 치료제)의 투여로 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 스캐폴드가 다른 요법 또는 요법들과 함께 작용하여 그들이 달리 투여된 경우보다 증가된 이점을 제공할 수 있도록 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 약학 조성물이 일정한 시간 간격 이내에 순차적으로 대상체에게 투여된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 각각의 요법은 동일한 시간에 대상체에게 투여될 수 있거나 상이한 시점에서 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있으나, 동일한 시간에 투여되지 않는 경우, 이들은 원하는 치료 또는 예방 효과를 제공하도록 충분히 가까운 시점에서 투여되어야 한다. 각각의 요법은 임의의 적절한 형태로 임의의 적합한 경로에 의해 별도로 대상체에게 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법(예를 들면, 예방제 또는 치료제)은 15분 미만, 30분 미만, 1시간 미만, 약 1시간, 약 1 내지 약 2시간, 약 2 내지 약 3시간, 약 3 내지 약 4시간, 약 4 내지 약 5시간, 약 5 내지 약 6시간, 약 6 내지 약 7시간, 약 7 내지 약 8시간, 약 8 내지 약 9시간, 약 9 내지 약 10시간, 약 10 내지 약 11시간, 약 11 내지 약 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 또는 1주의 간격을 두고 대상체에게 투여된다. 2종 이상의 요법이 한 동일한 환자 방문 이내에 투여될 수 있다.
본 발명의 스캐폴드 및 다른 요법들은 주기적으로 투여될 수 있다. 주기적 요법은 일정한 시간 동안 제1 요법(예를 들면, 제1 예방제 또는 치료제)을 투여하는 단계, 이어서 일정한 시간 동안 제2 요법(예를 들면, 제2 예방제 또는 치료제)을 투여하는 단계, 이어서 임의적으로 일정한 시간 동안 제3 요법(예를 들면, 예방제 또는 치료제)을 투여하는 단계 등, 및 요법들 중 한 요법의 부작용을 피하거나 감소시키고/시키거나 요법의 효과를 개선하기 위해 이 순차적 투여를 반복하는 단계, 즉 요법들 중 한 요법에 대한 내성의 발달을 감소시키기 위한 주기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 생체 내에서의 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들면, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 많은 고도 친수성 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우) BBB를 횡단하는 것을 보장하기 위해, 상기 화합물은 예를 들면, 리포좀으로 제제화될 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는 예를 들면, 미국 특허 제4,522,811호, 제5,374,548호 및 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 향상시키는 1개 이상의 모이어티를 포함할 수 있다(예를 들면, 문헌(V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685) 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 바이오틴(예를 들면, 미국 특허 제5,416,016호(Low et al) 참조); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); 및 pl20(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다(문헌(K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123) 및 문헌(JJ. Killion; IJ. Fidler (1994); Immunomethods 4:273) 또한 참조).
조합 요법의 예방제 또는 치료제는 동일한 약학 조성물로서 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 별도의 약학 조성물로서 대상체에게 동시에 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
스캐폴드를 사용하는 방법
본 발명의 스캐폴드는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들면, 이들 분자는 다양한 장애를 치료하거나, 예방하거나 진단하기 위해, 배양물 중의 세포, 예를 들면, 시험관내 또는 생체외 세포, 또는 대상체 내의 세포, 예를 들면, 생체내 세포에게 투여될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 사용하는 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 암, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 감염성 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 질환 또는 장애와 관련된 1종 이상의 증상의 예방, 진단, 관리, 치료 또는 호전을 위해 본 발명의 스캐폴드를 단독으로 또는 다른 요법과 함께 사용하는 것을 포괄한다. 또한, 본 발명은 암, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 감염성 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 질환, 장애 또는 감염과 관련된 1종 이상의 증상의 예방, 관리, 치료 또는 호전을 위해 모이어티(예를 들면, 치료제 또는 약물)에 접합되거나 융합된 본 발명의 스캐폴드를 단독으로 또는 다른 요법과 함께 사용하는 것을 포괄한다.
또한, 많은 세포 표면 수용체가 서브유닛의 가교결합의 결과로서 활성화시키거나 탈활성화시킨다. 본 발명의 단백질을 사용하여 세포 표면 수용체의 가교결합에 의한 표적 세포 내의 반응을 자극하거나 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 다수의 세포 표면 수용체와 항원의 상호작용을 차단할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 다수의 세포 표면 수용체와 항원의 상호작용을 강화시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 동일한 항원에 대한 특이성을 공유하거나 2종의 상이한 항원에 결합하는 결합 도메인을 함유하는 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 세포 표면 수용체의 동종이량체 또는 이종이량체를 가교결합시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단백질을 사용하여 리간드 또는 리간드 유사체를 특정 세포 표면 수용체에 전달할 수 있다.
또한, 본 발명은 전통적인 항체에 의해 용이하게 달성되지 않는 에피토프의 표적화 방법을 제공한다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 인접 항원을 먼저 표적화시킬 수 있고, 결합하는 동안 또 다른 결합 도메인이 숨은 항원과 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 스캐폴드를 사용하여 상이한 종류의 세포를 함께 회합시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 한 결합 도메인으로 표적 세포에 결합할 수 있고 또 다른 결합 도메인을 통해 또 다른 세포를 동원할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 세포는 암세포일 수 있고, 제2 세포는 면역 이펙터 세포, 예컨대, NK 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 2종의 상이한 세포들, 예컨대, 항원 제시 세포와 T 세포 사이의 상호작용을 강화시켜 가능하게는 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 스캐폴드를 사용하여 암 또는 이의 증상을 호전시키거나, 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 머리, 목, 눈, 입, 인후, 식도, 흉부, 피부, 골, 폐, 결장, 직장, ,대장, 위, 비장, 신장, 골격근, 피하 조직, 전이성 흑색종, 자궁내막, 전립선, 유방, 난소, 정소, 갑상선, 혈액, 림프절, 신장, 간, 췌장, 뇌 또는 중추신경계의 암의 치료에 유용하다.
또한, 본 발명은 스캐폴드를 사용하여 세포 집단을 고갈시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기 종류의 세포의 고갈에 유용하다: 호산구, 호염기구, 호중구, T 세포, B 세포, 비만 세포, 단핵구 및 종양 세포.
또한, 본 발명은 스캐폴드를 사용하여 사이토킨을 불활성화시키거나, 억제하거나 고갈시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기 사이토킨들 중 1개 이상의 사이토킨의 불활성화, 억제 또는 고갈에 유용하다: TNF-α, TGF-β, C5a, fMLP, 인터페론 알파(하위유형 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 및 21을 포함함), 인터페론 베타, 인터페론 오메가, 인터페론 감마, 인터루킨 IL-1-33, CCLl-28, CXCL 1-17 및 CX3CL1.
또한, 본 발명은 스캐폴드를 사용하여 다양한 감염 물질, 예컨대, 바이러스, 진균, 진핵 미생물 및 세균을 불활성화시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 RSV, hMPV, PIV 또는 인플루엔자 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 진균성 병원체, 예컨대, 내글레리아(Naegleria), 아스퍼길러스(Aspergillus), 블라스토마이세스(Blastomyces), 히스토플라스마(Histoplasma), 캔디다(Candida) 또는 티니아(Tinea) 속의 구성원들(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 불활성화시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 진핵 미생물, 예컨대, 기아르디아(Giardia), 톡소플라스마(Toxoplasma), 플라스모듐(Plasmodium), 트립파노소마(Trypanosoma) 및 엔타모에바(Entamoeba) 속의 구성원들(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 불활성화시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 세균성 병원체, 예컨대, 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스, 클로스트리듐(Clostridium), 보렐리아(Borrelia), 비브리오(Vibrio) 및 네이세리아(Neisseria) 속의 구성원들(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 불활성화시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 스캐폴드 단백질을 진단 시약으로서 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 단백질은 상이한 항원이 효율적으로 동시에 포획될 필요가 있는 경우 키트 또는 시약에서 유용할 수 있다.
본 발명의 단백질 및 이를 포함하는 조성물은 많은 목적을 위해, 예를 들면, 암을 포함하나 이로 한정되지 않는 광범위한 만성 및 급성 질환 및 장애에 대한 치료제로서 유용하다. 본 발명의 방법에 따라 예방될 수 있거나, 관리될 수 있거나, 치료될 수 있거나 호전될 수 있는 암의 예로는 머리, 목, 눈, 입, 인후, 식도, 흉부, 골, 폐, 결장, 직장, 위, 전립선, 유방, 난소, 신장, 간, 췌장 및 뇌의 암을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 암은 하기 암을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 백혈병, 예컨대, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 예컨대, 골수모세포, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 적백혈병성 백혈병 및 골수형성이상 증후군, 만성 백혈병, 예컨대, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모발상세포 백혈병(그러나, 이들로 한정되지 않음); 진성적혈구증가증; 림프종, 예컨대, 호지킨병, 비호지킨병(그러나, 이들로 한정되지 않음); 다발성 골수종, 예컨대, 무증상 다발성 골수종, 비분비성 골수종, 골경화성 골수종, 형질세포 백혈병, 고립 형질세포종 및 골수외 형질세포종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 의미 미확정 단일클론 감마글로불린병증; 양성 단일클론 감마글로불린병증; 중쇄 질환; 골암 및 결합 조직 육종, 예컨대, 골육종, 골수종 골질환, 다발성 골수종, 진주종에 의해 유도된 골의 골육종, 골의 파게트병, 골육종, 연골육종, 유윙(Ewing's) 육종, 악성 거대세포 종양, 골의 섬유육종, 척삭종, 골막 육종, 연조직 육종, 혈관육종(맥관육종), 섬유육종, 카포시(Kaposi's) 육종, 평활근육종, 지질육종, 림프관육종, 신경집종, 횡문근육종 및 윤활막육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 뇌종양, 예컨대, 신경아교종, 성상세포종, 뇌간신경아교종, 뇌실막종, 희소돌기아교세포종, 비신경아교 종양, 청신경집종, 두개인두종, 수모세포종, 수막종, 송과체, 송과체모세포종 및 일차 뇌 림프종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 선암종, 소엽(소세포)암종, 관내암종, 수질 유방암, 점액 유방암, 관상 유방암, 유두 유방암, 파게트병(청소년 파게트병을 포함함) 및 염증성 유방암을 포함하나 이들로 한정되지 않는 유방암; 부신암, 예컨대, 크롬친화세포종 및 부신피질암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 갑상선암, 예컨대, 유두 또는 소포 갑상선암, 수질 갑상선암 및 역형성 갑상선암(그러나, 이들로 한정되지 않음); 췌장암, 예컨대, 인슐린종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포종(vipoma), 소마토스타틴 분비 종양 및 카르시노이드(carcinoid) 또는 췌도세포 종양(그러나, 이들로 한정되지 않음); 뇌하수체암, 예컨대, 쿠싱병(Cushing's disease), 프로락틴(prolactin) 분비 종양, 말단거대증 및 요붕증(그러나, 이들로 한정되지 않음); 안암, 예컨대, 안구 흑색종, 예컨대, 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종, 모양체 흑색종 및 망막모세포종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 질암, 예컨대, 평편세포암종, 선암종 및 흑색종; 음문암, 예컨대, 평편세포암종, 흑색종, 선암종, 기저세포암종, 육종 및 파게트병; 자궁경부암, 예컨대, 평편세포암종 및 선암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 자궁암, 예컨대, 자궁내막암종 및 자궁육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 난소암, 예컨대, 난소 상피암종, 경계성 종양, 생식세포 종양 및 간질 종양(그러나, 이들로 한정되지 않음); 식도암, 예컨대, 평편암, 선암종, 선낭암종, 점액표피양암종, 선편평암종, 육종, 흑색종, 형질세포종, 우상암종 및 귀리세포(소세포)암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 위암, 예컨대, 돌출형(폴립형), 궤양성, 표재 전파성 또는 확산 전파성 선암종, 악성 림프종, 지질육종, 섬유육종 및 암육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 결장암; 직장암; 간암, 예컨대, 간세포암종 및 간모세포종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 담낭암, 예컨대, 선암종; 담관암종, 예컨대, 유두, 결절 및 확산성 담관암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 폐암, 예컨대, 비소세포폐암, 평편세포암종(표피모양암종), 선암종, 대세포암종 및 소세포폐암; 정소암, 예컨대, 생식세포 종양, 역형성, 고전적(전형적) 또는 정모세포성 고환종, 비고환종, 배아암종, 기형종암종, 융모막암종(난황막종양)(그러나, 이들로 한정되지 않음); 전립선암, 예컨대, 선암종, 평활근육종 및 횡문근육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 음경암; 구강암, 예컨대, 평편세포암종(그러나, 이로 한정되지 않음); 기저암; 타액선암, 예컨대, 선암종, 점액표피양암종 및 선낭암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 인두암, 예컨대, 평편세포암 및 우상암(그러나, 이들로 한정되지 않음); 피부암, 예컨대, 기저세포암종, 평편세포암종 및 흑색종, 표재 전파성 흑색종, 결절 흑색종, 흑색점 악성 흑색종, 말단 흑자 흑색종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 신장암, 예컨대, 신장세포암, 선암종, 팥세포암종, 섬유육종, 전이세포암(신우 및/또는 요관)(그러나, 이들로 한정되지 않음); 윌름(Wilms') 종양; 방광암, 예컨대, 전이세포암종, 평편세포암, 선암종 및 암육종(그러나, 이들로 한정되지 않음). 추가로, 암은 점액육종, 골원성 육종, 내피육종, 림프관내피육종, 중피종, 윤활막종, 혈관모세포종, 상피암종, 낭선암종, 기관지원성암종, 땀선암종, 피지선암종, 유두암종 및 유두 선암종을 포함한다(이러한 질환의 평론에 대해서는 문헌(Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia) 및 문헌(Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., inc., United States of America) 참조).
또한, 아폽토시스에서의 이상에 의해 야기된 암도 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있을 것으로 예측된다. 이러한 암은 소엽 림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 유방, 전립선 및 난소의 호르몬 의존성 종양, 및 전암성 병변, 예컨대, 가족성 선종성 용종증 및 골수형성이상 증후군을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 단백질 및 이를 포함하는 조성물은 많은 목적을 위해, 예를 들면, 자가면역 및/또는 염증성 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 광범위한 만성 및 급성 질환 및 장애에 대한 치료제로서 유용하다. 본원에 기재된 본 발명의 조성물 및 방법은 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 예방 또는 치료에 유용하다. 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 예로는 항인지질 증후군, 관절염, 죽상동맥경화증, 아나필락시스 쇼크, 자가면역 애디슨병(Addison's disease), 원형탈모, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병(Behcet's disease), 수포성 유천포창, 심근병증, 비열대스프루 피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증, 만성 염증, 처크-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 흉터성 유천포창, 저온응집병, 각막 및 다른 조직 이식, 크레스트(CREST) 증후군, 크론병(Crohn's disease), 낭성섬유증, 당뇨병성 망막병증, 원반모양루푸스, 심내막염, 내독소 쇼크, 본태성 혼합 한랭글로블린혈증, 섬유근육통 섬유근육염, 사구체신염, 그레이브스병(Graves' disease), 귈랑-바레(Guillain-Barre), 하시모토(Hashimoto's) 갑상선염, 혈관종, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소자반증, IgA 신경병증, 청소년 관절염, 편평태선, 홍반루푸스, 메니에르병(Meniere's disease), 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역 매개 진성 당뇨병, 중증 근육무력증, 신생혈관녹내장, 기관 허혈증, 심상성천포창, 복막염, 악성 빈혈, 결절다발동맥염, 다발연골염, 다분비선 증후군, 류마티스성 다발근육통, 다발근육염 및 피부근육염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담관간경화증, 건선, 건선 관절염, 레이노 현상(Raynauld's phenomenon), 레이터(Reiter's) 증후군, 재관류 손상, 수정체후부 섬유증식증, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 부패증, 패혈증, 쇼그렌(Sjogren's) 증후군, 척수 손상, 강직 증후군, 전신홍반루프스, 타카야수(takayasu) 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 갑상선 과다형성, 궤양성 결장염, 포도막염, 혈관염, 예컨대, 포진피부염 동맥염, 백반증, 및 베게너(Wegener's) 육아종증이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
염증성 장애의 예로는 천식, 뇌염, 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 알레르기성 장애, 패혈증 쇼크, 폐 섬유증, 미분화된 척추관절병증, 미분화된 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 및 세균 감염으로부터 비롯된 만성 염증이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법은 상기 질환을 예방하거나, 관리하거나 치료하는 데에 사용되는 1종 이상의 보편적인 요법들과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질 및 이를 포함하는 조성물은 많은 목적을 위해, 예를 들면, 바이러스, 세균 및 진균 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 광범위한 만성 및 급성 질환 및 장애에 대한 치료제로서 유용하다.
바이러스 병원체의 예로는 하기 바이러스 병원체가 있으나 이들로 한정되지 않는다: 아데노비리대(adenoviridae)(예를 들면, 매스트아데노바이러스(mastadenovirus) 및 아비아데노바이러스(aviadenovirus)), 헤르페스비리대(herpesviridae)(예를 들면, 단순포진 바이러스 1, 단순포진 바이러스 2, 단순포진 바이러스 5, 및 단순포진 바이러스 6), 레비비리대(leviviridae)(예를 들면, 레비바이러스(levivirus), 장내세균 MS2 기, 알롤레바이러스(allolevirus)), 폭스비리대(poxviridae)(예를 들면, 초르도폭스비리내(chordopoxvirinae), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus), 레포리이폭스바이러스(leporiipoxvirus), 수이폭스바이러스(suipoxvirus), 몰루스시폭스바이러스(molluscipoxvirus) 및 엔토모폭스비리내(entomopoxvirinae)), 파포바비리대(papovaviridae)(예를 들면, 폴리오마바이러스(polyomavirus) 및 파필로마바이러스(papillomavirus)), 파라믹소비리대(paramyxoviridae)(예를 들면, 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스 1, 모빌리바이러스(mobillivirus)(예를 들면, 홍역 바이러스), 루불라바이러스(rubulavirus)(예를 들면, 볼거리 바이러스), 뉴모노비리내(pneumonovirinae)(예를 들면, 뉴모바이러스(pneumovirus), 인간 호흡기 세포융합 바이러스) 및 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)(예를 들면, 조류 뉴모바이러스 및 인간 메타뉴모바이러스)), 피코르나비리대(picornaviridae)(예를 들면, 엔테로바이러스(enterovirus), 리노(rhino) 바이러스, 헤파토(hepato) 바이러스(예를 들면, 인간 A형 간염 바이러스), 카르디오바이러스(cardiovirus) 및 앱쏘바이러스(apthovirus)), 레오비리대(reoviridae)(예를 들면, 오르토레오바이러스(orthoreovirus), 오르비바이러스(orbivirus), 로타바이러스(rotavirus), 사이포바이러스(cypovirus), 피지바이러스(fijivirus), 파이토레오(phytoreo) 바이러스 및 오리자바이러스(oryzavirus)), 레트로비리대(retroviridae)(예를 들면, 포유동물 B형 레트로바이러스(retrovirus), 포유동물 C형 레트로바이러스, 조류 C형 레트로바이러스, D형 레트로바이러스 군, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스(lentivirus)(예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스 1 및 인간 면역결핍 바이러스 2), 스푸마바이러스(spumavirus)), 플라비비리대(flaviviridae)(예를 들면, C형 간염 바이러스), 헤파드나비리대(hepadnaviridae)(예를 들면, B형 간염 바이러스), 토가비리대(togaviridae)(예를 들면, 알파바이러스(alphavirus)(예를 들면, 신드비스(sindbis) 바이러스) 및 루비바이러스(rubivirus)(예를 들면, 풍진 바이러스)), 라브도비리대(rhabdoviridae)(예를 들면, 베지큘로바이러스(vesiculovirus), 리사바이러스(lyssavirus), 에페메로바이러스(ephemerovirus), 사이토라브도(cytorhabdo) 바이러스 및 네클레오라브도(necleorhabdo) 바이러스), 아레나비리대(arenaviridae)(예를 들면, 아레나바이러스(arenavirus), 림프구성 맥락수막염 바이러스, 이피(Ippy) 바이러스 및 라사(lassa) 바이러스), 및 코로나비리대(coronaviridae)(예를 들면, 코로나바이러스(coronavirus) 및 토로바이러스(torovirus)).
세균 병원체의 예로는 하기 세균 병원체가 있으나 이들로 한정되지 않는다: 아쿠아스피릴룸(Aquaspirillum) 과, 아조스피릴룸(Azospirillum) 과, 아조토박테라세애(Azotobacteraceae) 과, 박테로이다세애(Bacteroidaceae) 과, 바르토넬라(Bartonella) 종, 브델로비브리오(Bdellovibrio) 과, 캄필로박터(Campylobacter) 종, 클라미디아(Chlamydi) 종(예를 들면, 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)), 클로스트리듐(Clostridium), 장내세균 과(예를 들면, 시트로박터(Citrobacter) 종, 에드워드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes), 에르위니아(Erwinia) 종, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 하프니아(Hafnia) 종, 크레브시엘라(Klebsiella) 종, 모르가넬라(Morganella) 종, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella) 종, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)), 가르디넬라(Gardinella) 과, 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 할로박테리아세애(Halobacteriaceae) 과, 헬리코박터(Helicobacter) 과, 레기오날라세애(Legionallaceae) 과, 리스테리아(Listeria) 종, 메틸로코카세애(Methylococcaceae) 과, 마이코박테리아(예를 들면, 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 네이세리아세애(Neisseriaceae) 과, 오세아노스피릴룸(Oceanospirillum) 과, 파스테우렐라세애(Pasteurellaceae) 과, 뉴모코커스(Pneumococcus) 종, 슈도모나스 종, 리조비아세애(Rhizobiaceae) 과, 스피릴룸(Spirillum) 과, 스피로소마세애(Spirosomaceae) 과, 스타필로코커스(예를 들면, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스타필로코커스 피로게네스(Staphylococcus pyrogenes)), 스트렙토코커스(예를 들면, 스트렙토코커스 엔테리티디스( Streptococcus enteritidis), 스트렙토코커스 파스시애(Streptococcus fasciae) 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)), 밤피로비브리오(Vampirovibrio), 헬리코박터(Helicobacter) 과, 및 밤피로비브리오 과.
진균 병원체의 예로는 하기 진균 병원체가 있으나 이들로 한정되지 않는다: 애브시디아(Absidia) 종(예를 들면, 애브시디아 코림비페라(Absidia corymbifera) 및 애브시디아 라모사(Absidia ramosa)), 아스퍼길러스(Aspergillus) 종(예를 들면, 아스퍼길러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼길러스 푸미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길러스 니게르(Aspergillus niger) 및 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus)), 바시디오볼러스 라나룸(Basidiobolus ranarum), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 캔디다 종(예를 들면, 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 글라브라타(Candida glabrata), 캔디다 케르(Candida kerr), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 캔디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 캔디다 퀼레르몬디이(Candida quillermondii), 캔디다 루고사(Candida rugosa), 캔디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea) 및 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 코니디오볼러스(Conidiobolus) 종, 크립토코커스 네오포름스(Cryptococcus neoforms), 컨닝해멜라(Cunninghamella) 종, 데르마토파이테스(Dermatophytes), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 마이크로스포룸 깁세움(Microsporum gypseum), 뮤코르 푸실러스(Mucor pusillus), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 슈달레스케리아 보이디이(Pseudallescheria boydii), 리노스포리디움 시이베리(Rhinosporidium seeberi), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 리조퍼스(Rhizopus) 종(예를 들면, 리조퍼스 아르히저스(Rhizopus arrhizus), 리조퍼스 오리자(Rhizopus oryzae) 및 리조퍼스 마이크로스포러스(Rhizopus microsporus)), 사카로마이세스 종, 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii), 및 자이고마이세테스(Zygomycetes), 아스코마이세테스(Ascomycetes), 바시디오마이세테스(Basidiomycetes), 듀테로마이세테스(Deuteromycetes) 및 오오마이세테스(Oomycetes)와 같은 강.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환, 또는 이의 1종 이상의 증상을 예방하거나, 관리하거나, 치료하거나 호전시키는 방법으로서, 예방적 또는 치료적 유효량의 1개 이상의 본 발명의 스캐폴드를 수술과 함께, 단독으로, 또는 표준 또는 실험적 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법/면역요법 및/또는 방사선요법의 투여와 함께 상기 예방, 관리, 치료 또는 호전이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이들 실시양태에 따라, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환, 또는 이의 1종 이상의 증상의 예방, 관리, 치료 또는 호전을 위해 사용되는 본 발명의 스캐폴드는 모이어티(예를 들면, 치료제 또는 약물)에 접합되거나 융합될 수 있거나, 접합되거나 융합되지 않을 수 있다.
본 발명은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환, 또는 이의 1종 이상의 증상을 예방하거나, 관리하거나, 치료하거나 호전시키는 방법으로서, 1개 이상의 본 발명의 스캐폴드를 암 치료제가 아닌 1개 이상의 치료제(비-암요법으로도 공지되어 있음)와 함께 상기 예방, 관리, 치료 또는 호전이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 치료제의 예로는 진토제, 항진균제, 항균제, 예컨대, 항생제, 소염제 및 항바이러스제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 진토제의 비한정적인 예로는 메토피마진 및 메토클로프라미드가 있다. 항진균제의 비한정적인 예로는 아졸 약물, 이미다졸, 트리아졸, 폴리엔(polyene), 암포테리신(amphotericin) 및 리리미딘(ryrimidine)이 있다. 항균제의 비한정적인 예로는 닥티노마이신, 블레오마이신, 에리쓰로마이신, 페니실린, 미쓰라마이신, 세팔로스포린, 이미페넴(imipenem), 액스트레오남(axtreonam), 반코마이신, 사이클로세린, 바시트라신(bacitracin), 클로람페니콜, 클린다마이신, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 젠타미신(gentamicin), 아미카신(amikacin), 가나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신, 트리메소프림(trimethoprim), 노르플록사신(norfloxacin), 레팜핀(refampin), 폴리믹신(polymyxin), 암포테리신 B, 나이스타틴(nystatin), 케토카나졸(ketocanazole), 이소니아지드(isoniazid), 메트로니다졸(metronidazole) 및 펜타미딘(pentamidine)이 있다. 항바이러스제의 비한정적인 예로는 뉴클레오시드 유사체(예를 들면, 지도부딘(zidovudine), 아시클리비르(acyclivir), 강시클리비르(gangcyclivir), 비다르빈(vidarbine), 이독수리딘(idoxuridine), 트리플루리딘(trifluridine) 및 리바비린(ribavirin)), 포스카렛(foscaret), 아만타딘(amantadine), 리만타딘(rimantadine), 사퀴나비르(saquinavir), 인디나비르(indinavir), 리토나비르(ritonavir), 인터페론("IFN")-α, β 또는 γ 및 AZT가 있다. 소염제의 비한정적인 예로는 비스테로이드성 소염 약물("NSAID"), 스테로이드성 소염 약물, 베타 작용제, 항콜린제 및 메틸잔틴이 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 암세포 표현형을 억제할 수 있는 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 암세포 표현형은 세포 성장, 세포 부착, 세포 부착의 상실, 감소된 수용체 발현(예를 들면, Eph 수용체(그러나, 이로 한정되지 않음)), 증가된 수용체 발현(예를 들면, Eph 수용체(그러나, 이로 한정되지 않음)), 전이력, 세포 주기 억제, 수용체 티로신 인산화효소 활성화/억제 등이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 만성 염증을 치료할 수 있는 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 파괴 또는 불활성화를 위한 면역 세포의 표적화에서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 활성화된 T 세포, 휴면기 T 세포, B 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포 또는 수지상 세포의 표적화에 유용하다. 상기 조성물은 면역 세포 기능을 감소시키거나 제거할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생을 억제하거나 감소시킬 수 있는 조성물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혈관신생은 종양 성장, 류마티스 관절염, SLE, 쇼그렌 증후군 등과 관련되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 위장관 질환의 치료에 유용한 조성물을 포함한다. 본 발명의 스캐폴드는 낮은 pH 조건 하에서 높은 수준의 안정성을 나타낸다. 낮은 pH에서의 안정성은 상기 조성물이 다양한 위장관 장애, 예컨대, 자극성 장 증후군, 위식도 역류, 장 가성폐쇄, 덤핑 증후군, 난치성 구역, 소화 궤양, 충수염, 허혈성 결장염, 궤양성 결장염, 위염, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 질환, 크론병, 휘플병(Whipple's disease), 비열대스프루, 곁주머니염, 곁주머니증, 삼킴곤란, 열공헤르니아, 감염 식도 장애, 딸꾹질, 반추 등의 치료를 위한 경구 투여에 적합할 것이라는 것을 암시한다.
본 발명은 조합 조성물, 및 질환 또는 이의 증상의 예방, 치료, 감소 또는 호전에 있어서 이러한 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 스캐폴드는 질환 또는 이의 증상의 예방, 치료, 감소 또는 호전에 적합한 통상적인 요법과 조합될 수 있다. 예시적인 통상적인 요법은 문헌(Physician's Desk Reference (56th ed., 2002 and 57th ed., 2003))에서 찾을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 화학요법, 방사선요법, 수술, 생물학적 물질(항체 또는 펩티드) 또는 소분자를 사용한 면역요법, 또는 당업계에서 공지되어 있는 또 다른 요법과 조합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조합 요법은 함께 투여된다. 다른 실시양태에서, 조합 요법은 별도로 투여된다.
또한, 본 발명은 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 질환과 관련된 특정 표적에 결합하는 본 발명의 스캐폴드는 상기 질환의 진단을 위해 이용되는 방법에서 활용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계, 표적:스캐폴드 상호작용이 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 표적을 상기 샘플 중의 스캐폴드와 접촉시키는 단계, 상기 표적:스캐폴드 복합체를 확인하여 상기 샘플 중의 상기 표적을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 진단하는 방법에서 사용된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 표적은 질환과 관련된 항원이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 표적인 사이토카인, 염증 매개자, 및 세포내 항원, 자가 항원, 비자가 항원, 핵내 항원, 세포 표면 항원, 세균 항원, 바이러스 항원 또는 진균 항원이다. 다른 실시양태에서, 진단될 질환은 본원에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 특정 표적을 영상화하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 조영제, 예컨대, 녹색 형광 단백질, 다른 형광 태그(Cy3, Cy5, 로다민 등), 바이오틴 또는 방사성핵종에 접합된 본 발명의 스캐폴드는 특정 표적의 존재, 위치 또는 진행을 영상화하는 방법에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 표적을 영상화하는 방법은 시험관 내에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 표적을 영상화하는 방법은 생체 내에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 표적을 영상화하는 방법은 MRI, PET 스캐닝, X-선, 형광 검출 또는 당업계에서 공지되어 있는 다른 검출 방법에 의해 수행된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 질환 진행, 재발, 치료 또는 호전을 모니터링하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 질환 진행, 재발, 치료 또는 호전을 모니터링하는 방법은 본원에 제시된 바와 같은 본 발명의 스캐폴드를 사용하여 화합물/표적을 영상화하거나 진단하는 방법, 또는 화합물/표적을 본 발명의 스캐폴드와 접촉시키는 방법에 의해 달성된다.
키트
본 발명의 조성물(예를 들면, 스캐폴드) 및 사용 설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 키트는 1개 이상의 추가 시약 또는 1개 이상의 본 발명의 추가 스캐폴드를 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 상기 키트의 내용물의 의도된 용도를 표시하는 표지를 포함한다. 용어 "표지"는 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나 다른 방식으로 상기 키트에 동반되는 임의의 문구 또는 기록된 자료를 포함한다.
등가물
당업자는 과도하지 않은 관용적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 의해 포괄된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 본원에 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 기재되어 있는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 도입된다. 본원은 2010년 4월 13일자로 출원된 미국 가출원 제61/323,708호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 도입됨)에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 추가로, 2008년 10월 10일자로 출원되어 국제특허공보 제WO2009/058379호로서 공개된 PCT 특허출원 제PCT/US2008/012398호는 모든 목적을 위해 온전히 그대로 본원에 참고로 도입된다.
예시적인 실시양태
1. 직렬로 연결된 2개 이상의 피브로넥틴 III형(FnIII) 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드로서, 이때 각각의 FnIII 스캐폴드가 표적에 결합하고, 각각의 FnIII 스캐폴드가 6개의 루프 영역에 연결된, A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥 도메인을 포함하고, 이때 루프 영역이 각각의 베타 가닥을 연결하고 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명되고, 각각의 베타 가닥이 관심있는 FnIII 도메인(FOI)의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상의 상동성을 나타내고, 1개 이상의 루프가 상기 FOI 내의 동족 루프의 비천연 변이체이고, 상기 다량체 스캐폴드의 상기 표적에 대한 결합 친화성 및/또는 친화력, 및/또는 생물학적 활성이 상응하는 단량체 FnIII 스캐폴드에 비해 개선되어 있는 것인 다량체 스캐폴드.
2. 실시양태 1에 있어서, 상기 표적에 대한 결합 친화성 및/또는 친화력이 개선되어 있는 것인 다량체 스캐폴드.
3. 실시양태 1에 있어서, 상기 다량체 스캐폴드의 상기 표적에 대한 결합 친화성 및/또는 친화력, 및 생물학적 활성이 개선되어 있는 것인 다량체 스캐폴드.
4. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 50% 이상의 상동성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
5. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 60% 이상의 상동성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
6. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 70% 이상의 상동성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
7. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 80% 이상의 상동성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
8. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 90% 이상의 상동성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
9. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 95% 이상의 상동성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
10. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 15, 서열번호 30 내지 서열번호 48 및 서열번호 63 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 98% 이상의 상동성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
11. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 60% 이상의 동일성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
12. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 70% 이상의 동일성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
13. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 80% 이상의 동일성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
14. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 90% 이상의 동일성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
15. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 95% 이상의 동일성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
16. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열 내의 동족 베타 가닥 도메인에 대해 98% 이상의 동일성을 나타내는 것인 다량체 스캐폴드.
17. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드에 대하여 A 베타 가닥 도메인이 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 76 또는 서열번호 77을 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43, 서열번호 63 또는 서열번호 78을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44, 서열번호 64 또는 서열번호 79를 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46, 서열번호 65 또는 서열번호 80을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47, 서열번호 66 또는 서열번호 81을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48, 서열번호 67 또는 서열번호 82를 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52, 서열번호 68 또는 서열번호 83을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
18. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드에 대하여 A 베타 가닥이 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 76 또는 서열번호 77을 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43, 서열번호 63 또는 서열번호 78을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44, 서열번호 64 또는 서열번호 79를 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46, 서열번호 65 또는 서열번호 80을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47, 서열번호 66 또는 서열번호 81을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48, 서열번호 67 또는 서열번호 82를 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52, 서열번호 68 또는 서열번호 83을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
19. 실시양태 17 또는 18에 있어서, AB 루프가 서열번호 35, 서열번호 55 또는 서열번호 70을 포함하고, CD 루프가 서열번호 37, 서열번호 57 또는 서열번호 72를 포함하고, EF 루프가 서열번호 39, 서열번호 59 또는 서열번호 74를 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
20. 실시양태 17 또는 18에 있어서, BC 루프가 서열번호 36, 서열번호 56 또는 서열번호 71을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38, 서열번호 58 또는 서열번호 73을 포함하고, FG 루프가 서열번호 39, 서열번호 59 또는 서열번호 73을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
21. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드에 대하여 A 베타 가닥 도메인이 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 49 또는 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52 또는 서열번호 53을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
22. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드에 대하여 A 베타 가닥이 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 49 또는 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52 또는 서열번호 53을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
23. 실시양태 1 내지 16, 21 및 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
24. 실시양태 1 내지 16, 21, 22 및 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 2 내지 26이다.
25. 실시양태 21 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, AB 루프가 서열번호 35를 포함하고, CD 루프가 서열번호 37을 포함하고, EF 루프가 서열번호 39를 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
26. 실시양태 21 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, BC 루프가 서열번호 36을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38을 포함하고, FG 루프가 서열번호 40을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
27. 실시양태 21 내지 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, (XFG)n의 경우 n이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9인 다량체 스캐폴드.
28. 실시양태 1 내지 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 BC 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
S-X-a-X-b-X-X-X-G
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 프롤린 또는 알라닌을 나타내고, b는 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
29. 실시양태 1 내지 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 BC 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, c는 프롤린, 세린 또는 글리신을 나타낸다.
30. 실시양태 1 내지 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 BC 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, d는 프롤린, 글루타메이트 또는 라이신을 나타내고, e는 아스파라긴 또는 글리신을 나타내고, f는 세린 또는 글리신을 나타낸다.
31. 실시양태 1 내지 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 28 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 FG 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
X-a-X-X-G-X-X-X-b
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 알라닌을 나타낸다.
32. 실시양태 1 내지 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 28 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 FG 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
X-a-X-X-X-X-b-N-P-A
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 글리신을 나타낸다.
33. 실시양태 1 내지 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 28 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 FG 루프가 하기 서열을 갖는 11개의 아미노산을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타낸다.
34. 실시양태 1 내지 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 27 내지 33 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 DE 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
X-X-X-X-X-X
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다.
35. 실시양태 1 내지 18, 20, 21, 22, 23, 24 및 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 AB 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
K-X-X-X-X-X-a
상기 서열에서, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
36. 실시양태 1 내지 18, 20, 21, 22, 23, 24 및 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 AB 루프가 하기 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
K-X-X-X-X-X-X-X-a
상기 서열에서, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
37. 실시양태 1 내지 18, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 35 및 36 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 CD 루프가 7개, 8개 또는 9개의 잔기를 포함하고, 이때 상기 CD 루프 내의 각각의 잔기가 무작위화되어 있고, 각각의 잔기가 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린일 수 있는 것인 다량체 스캐폴드.
38. 실시양태 1 내지 18, 20, 21, 22, 23, 24, 26 및 35 내지 37 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드의 EF 루프가 하기 서열을 갖는 8개의 잔기를 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
X-b-L-X-P-X-c-X
상기 서열에서, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, b는 아스파라긴, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신을 나타내고, c는 이소류신, 쓰레오닌, 세린, 발린, 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
39. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드.
40. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 4개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드.
41. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 5개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드.
42. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 6개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드.
43. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 7개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드.
44. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 8개 이상의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드.
45. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 8개 초과의 FnIII 스캐폴드를 포함하는 다량체 스캐폴드.
46. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드가 이종 모이어티(moiety)에 융합되어 있는 것인 다량체 스캐폴드.
47. 실시양태 46에 있어서, 이종 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 세포독성제, 방사성핵종, 조영제, 바이오틴, 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 이의 FcRn 결합 부분, 항체의 Fc 영역, 항체의 경쇄 불변 영역, 알부민 결합 도메인, IgG 분자, 트랜스페린, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 핵산, 재조합 폴리펩티드 중합체 및 사이토킨으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 다량체 스캐폴드.
48. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 표적이 세포 표면 항원, 가용성 항원, 고정된 항원, 면역침묵(immunosilent) 항원, 세포내 항원, 핵내 항원, 자가 항원, 비자가 항원, 암 항원, 세균 항원 또는 바이러스 항원인 다량체 스캐폴드.
49. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 수용체 작용제인 다량체 스캐폴드.
50. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 500 μM 미만의 KD로 표적에 결합하는 다량체 스캐폴드.
51. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 100 μM 미만의 KD로 표적에 결합하는 다량체 스캐폴드.
52. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 동일한 에피토프에서 동일한 항원에 결합하는 것인 다량체 스캐폴드.
53. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 동일한 것인 다량체 스캐폴드.
54. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 동일하지 않은 것인 다량체 스캐폴드.
55. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 동일한 표적 상의 2개 이상의 상이한 비중복 에피토프에 결합하는 다량체 스캐폴드.
56. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 비중복 에피토프에서 동일한 표적에 결합하는 것인 다량체 스캐폴드.
57. 실시양태 1 내지 52 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드가 세포 표면 상의 표적 분자의 2개 이상의 카피 상의 동일한 에피토프에 결합하는 것인 다량체 스캐폴드.
58. 실시양태 1 내지 51 및 54 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 상이한 표적에 결합하는 것인 다량체 스캐폴드.
59. 실시양태 1 내지 51 및 54 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 상이한 표적에 결합하는 다량체 스캐폴드.
60. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 FnIII 스캐폴드가 펩티드 링커에 의해 직렬로 연결되어 있는 것인 다량체 스캐폴드.
61. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 1 내지 약 1,000개의 아미노산을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
62. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 1 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
63. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 1 내지 25개의 아미노산을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
64. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 1 내지 15개의 아미노산을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
65. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 1 내지 5개의 아미노산을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드.
66. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 50% 이상의 글리신 잔기를 포함하는 유연성 펩티드 링커인 다량체 스캐폴드.
67. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커 서열이 하기 서열로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열을 포함하는 것인 다량체 스캐폴드:
(G-G-G-S)x, (G-G-G-G-S)x, (G-G-G-G-S-A)x, (G-A)x, (G-G-G-T-P-T)x, 및 (G-G-G-G-S-G-T-G-S-A-M-A-S)x
상기 서열에서, x는 양의 정수이다.
68. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 기능성 모이어티인 다량체 스캐폴드.
69. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 1개 이상의 FnIII 스캐폴드가 IgG 도메인, 또는 전장 IgG 경쇄 또는 중쇄에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 다량체 스캐폴드.
70. 실시양태 69에 있어서, IgG 도메인이 하기 영역들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 다량체 스캐폴드:
I. Fc 영역;
II. CH1 영역;
III. CH2 영역;
IV. CH3 영역;
V. 힌지 영역;
VI. C카파 영역;
VII. C람다 영역;
VIII. CH1-힌지-CH2-CH3 영역; 및
IX. 가변 영역.
71. 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 다량체 스캐폴드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
72. 실시양태 71의 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 벡터.
73. 실시양태 72의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
74. 상기 핵산 분자에 의해 코딩된 다량체 스캐폴드가 발현되는 조건 하에서 실시양태 73의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 다량체 스캐폴드를 제조하는 방법.
75. 실시양태 74에 있어서, 발현된 다량체 스캐폴드가 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
76. 실시양태 75에 있어서, 배양 배지로부터 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
77. 약학적으로 허용가능한 부형제 중에 실시양태 1 내지 70 중 어느 한 실시양태의 다량체 스캐폴드를 포함하는 조성물.
78. 유효량의 실시양태 77의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암의 성장을 치료하거나 억제하는 방법.
79. 실시양태 78에 있어서, 암이 평편세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종, 모세포종, 위장암, 신암, 난소암, 간암, 위암, 방광암, 간세포종, 유방암, 결장암, 대장암, 췌장암, 자궁내막암종, 타액선암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암종, 두경부암, 폐암, 선암종, 신세포암종 및 간세포암종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
80. 유효량의 실시양태 77의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 자가면역 장애, 염증성 장애 또는 호흡기 감염을 치료하는 방법.
81. 실시양태 80에 있어서, 호흡기 감염이 바이러스 또는 세균에 의해 야기되는 것인 방법.
82. 실시양태 81에 있어서, 바이러스가 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 또는 인간 메타뉴모바이러스인 방법.
83. 실시양태 80에 있어서, 염증성 장애가 천식, 만성 바이러스 또는 세균 감염으로부터 비롯된 만성 염증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 뇌염, 염증성 장 질환, 염증성 골용해, 폐 섬유증, 패혈증 쇼크, 미분화된 관절병증 또는 미분화된 척추관절병증인 방법.
84. 실시양태 80에 있어서, 자가면역 장애가 연령 관련 황반 변성, 동종이식편 거부, 강직 척추염, 항인지질 증후군, 관절염, 죽상동맥경화증, 아나필락시스 쇼크, 자가면역 애디슨병, 원형탈모, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 비열대스프루 피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증, 만성 염증, 처크-스트라우스 증후군, 흉터성 유천포창, 저온응집병, 각막 및 다른 조직 이식, 크레스트 증후군, 크론병, 낭성섬유증, 당뇨병성 망막병증, 원반모양루푸스, 심내막염, 내독소 쇼크, 본태성 혼합 한랭글로블린혈증, 섬유근육통 섬유근육염, 사구체신염, 그레이브스병, 귈랑-바레, 하시모토 갑상선염, 혈관종, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소자반증, IgA 신경병증, 청소년 관절염, 편평태선, 홍반루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역 매개 진성 당뇨병, 중증 근육무력증, 신생혈관녹내장, 기관 허혈증, 심상성천포창, 복막염, 악성 빈혈, 결절다발동맥염, 다발연골염, 다분비선 증후군, 류마티스성 다발근육통, 다발근육염 및 피부근육염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담관간경화증, 건선, 건선 관절염, 레이노 현상, 레이터 증후군, 재관류 손상, 수정체후부 섬유증식증, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 부패증, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 척수 손상, 강직 증후군, 전신홍반루프스, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 갑상선 과다형성, 궤양성 결장염, 포도막염, 혈관염, 예컨대, 포진피부염 동맥염, 백반증, 및 베게너 육아종증인 방법.
85. 6개의 루프 영역에 연결된, A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥 도메인을 포함하는 다양한 피브로넥틴 III형(FnIII) 스캐폴드의 라이브러리로서, 이때 루프 영역이 각각의 베타 가닥을 연결하고 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명되고, 각각의 베타 가닥이 관심있는 FnIII 도메인(FOI)의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상의 상동성을 나타내고, 1개 이상의 루프가 상기 FOI 내의 동족 루프의 비천연 변이체이고, FG 루프가 상기 FOI 내의 동족 FG 루프보다 1개 이상의 아미노산만큼 더 짧은 것인 라이브러리.
86. 6개의 루프 영역에 연결된, A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥 도메인을 포함하는 다양한 피브로넥틴 III형(FnIII) 스캐폴드의 라이브러리로서, 이때 루프 영역이 각각의 베타 가닥을 연결하고 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명되고, 각각의 베타 가닥 도메인이 관심있는 FnIII 도메인(FOI)의 동족 베타 가닥에 대해 50% 이상의 상동성을 나타내고, 1개 이상의 루프가 상기 FOI 내의 동족 루프의 비천연 변이체이고, FG 루프가 9개 이하의 아미노산으로 구성된 것인 라이브러리.
87. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 또는 표 16(도 16)에 제시된 서열에 대해 50% 이상의 상동성을 나타내는 것인 라이브러리.
88. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 34, 서열번호 54, 서열번호 69 또는 표 16(도 16)에 제시된 서열에 대해 60% 이상의 상동성을 나타내는 것인 라이브러리.
89. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 70% 이상의 상동성을 나타내는 것인 라이브러리.
90. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 80% 이상의 상동성을 나타내는 것인 라이브러리.
91. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 90% 이상의 상동성을 나타내는 것인 라이브러리.
92. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 천연 FnIII 도메인의 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 95% 이상의 상동성을 나타내는 것인 라이브러리.
93. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 98% 이상의 상동성을 나타내는 것인 라이브러리.
94. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 60% 이상의 동일성을 나타내는 것인 라이브러리.
95. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 나타내는 것인 라이브러리.
96. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 나타내는 것인 라이브러리.
97. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 나타내는 것인 라이브러리.
98. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 95% 이상의 동일성을 나타내는 것인 라이브러리.
99. 실시양태 85 또는 86에 있어서, 각각의 베타 가닥이 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열에 대해 98% 이상의 동일성을 나타내는 것인 라이브러리.
100. 실시양태 85 또는 86에 있어서, A 베타 가닥 도메인이 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 76 또는 서열번호 77을 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43, 서열번호 63 또는 서열번호 78을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44, 서열번호 64 또는 서열번호 79를 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46, 서열번호 65 또는 서열번호 80을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47, 서열번호 66 또는 서열번호 81을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48, 서열번호 67 또는 서열번호 82를 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52, 서열번호 68 또는 서열번호 83을 포함하는 것인 라이브러리.
101. 실시양태 100에 있어서, AB 루프가 서열번호 35, 서열번호 55 또는 서열번호 70을 포함하고, CD 루프가 서열번호 37, 서열번호 57 또는 서열번호 72를 포함하고, EF 루프가 서열번호 39, 서열번호 59 또는 서열번호 74를 포함하는 것인 라이브러리.
102. 실시양태 100에 있어서, BC 루프가 서열번호 36, 서열번호 56 또는 서열번호 71을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38, 서열번호 58 또는 서열번호 73을 포함하고, FG 루프가 서열번호 40, 서열번호 60 또는 서열번호 75를 포함하는 것인 라이브러리
103. 실시양태 85 또는 86에 있어서, A 베타 가닥 도메인이 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 49 또는 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52 또는 서열번호 53을 포함하는 것인 라이브러리[이 실시양태는 Tn3 베타 가닥에 대한 서열번호를 나열함].
104. 실시양태 85 또는 86에 있어서, FnIII 스캐폴드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, n은 3 내지 26이고, m은 1 내지 9이다.
105. 실시양태 103 또는 104에 있어서, AB 루프가 서열번호 35를 포함하고, CD 루프가 서열번호 37을 포함하고, EF 루프가 서열번호 39를 포함하는 것인 라이브러리.
106. 실시양태 103 또는 104에 있어서, BC 루프가 서열번호 36을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38을 포함하고, FG 루프가 서열번호 40을 포함하는 것인 라이브러리.
107. 실시양태 85, 86, 100, 101, 103 및 105 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 BC 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
S-X-a-X-b-X-X-X-G
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 프롤린 또는 알라닌을 나타내고, b는 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
108. 실시양태 85, 86, 100, 101, 103 및 105 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 BC 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, c는 프롤린, 세린 또는 글리신을 나타낸다.
109. 실시양태 85, 86, 100, 101, 103 및 105 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 BC 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, d는 프롤린, 글루타메이트 또는 라이신을 나타내고, e는 아스파라긴 또는 글리신을 나타내고, f는 세린 또는 글리신을 나타낸다.
110. 실시양태 85, 86, 100, 101, 103 및 105 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 FG 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
X-X-X-X-X-X-X-X-X
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다.
111. 실시양태 85, 86, 100, 101, 103 및 105 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 FG 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
X-a-X-X-G-X-X-X-b
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, a는 아스파라긴, 쓰레오닌 또는 라이신을 나타내고, b는 세린 또는 알라닌을 나타낸다.
112. 실시양태 85, 86, 100, 101, 103 및 105 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 DE 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
X-X-X-X-X-X
상기 서열에서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다.
113. 실시양태 85, 86, 100, 100, 103 및 106 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 상기 AB 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
K-X-X-X-X-X-a
상기 서열에서, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
114. 실시양태 85, 86, 100, 100, 103 및 106 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 상기 AB 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
K-X-X-X-X-X-X-X-a
상기 서열에서, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, a는 세린, 쓰레오닌, 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
115. 실시양태 85, 86, 100, 100, 103 및 106 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 CD 루프의 아미노산 서열이 7개, 8개 또는 9개의 잔기를 포함하고, 이때 상기 CD 루프 내의 각각의 잔기가 무작위화되어 있고, 각각의 잔기가 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린일 수 있는 것인 라이브러리.
116. 실시양태 85, 86, 100, 100, 103 및 106 중 어느 한 실시양태에 있어서, FnIII 스캐폴드의 EF 루프의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하는 것인 라이브러리:
X-b-L-X-P-X-c-X
상기 서열에서, X는 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 티로신, 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린 또는 세린을 나타내고, b는 아스파라긴, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신을 나타내고, c는 이소류신, 쓰레오닌, 세린, 발린, 알라닌 또는 글리신을 나타낸다.
117. 실시양태 85 내지 116 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리보좀, 박테리오파지, 바이러스, 세균, 효모 또는 포유동물 세포의 표면 상에서 표시되는 라이브러리.
118. 하기 단계를 포함하는, 실시양태 85 내지 117 중 어느 한 실시양태의 라이브러리로부터 피브로넥틴 III형(FnIII) 스캐폴드를 확인하는 방법으로서, 이때 상기 FnIII 스캐폴드가 FOI에 비해 증가된 단백질 안정성을 나타내고 표적에 결합하는 것인 방법:
I. 스캐폴드:표적 리간드 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 표적 리간드를 실시양태 85 내지 117 중 어느 한 실시양태의 라이브러리와 접촉시키는 단계;
II. 상기 표적 리간드에 결합하는 스캐폴드를 상기 복합체로부터 수득하는 단계; 및
III. 단계 II에서 수득된 스캐폴드의 안정성이 FOI의 안정성보다 높은지를 확인하는 단계.
119. 실시양태 118에 있어서, 단계 II에서 수득된 스캐폴드의 1개 이상의 루프를 무작위화시키는 단계, 및 추가로 무작위화된 스캐폴드를 사용하여 단계 I 및 II를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
120. 관심있는 피브로넥틴 III형(FnIII) 스캐폴드(FOI)의 변이체를 조작하는 단계를 포함하는, 상기 FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 FnIII 스캐폴드 변이체를 수득하는 방법으로서, 이때 상기 변이체의 FG 루프가 1개 이상의 아미노산의 결실을 포함하고, 상기 변이체가 상기 FOI에 비해 증가된 안정성을 나타내는 것인 방법.
121. 실시양태 120에 있어서, FG 루프의 길이 및 서열이 FOI의 아미노산 서열을 1개 이상의 천연 FnIII 도메인의 아미노산 서열과 정렬시킴으로써 조작 전에 확인되는 것인 방법.
122. 실시양태 120에 있어서, FG 루프의 길이 및 서열이 FOI의 아미노산 서열 상의 1개 이상의 천연 FnIII 도메인의 3차원적 구조를 모델링함으로써 조작 전에 확인되는 것인 방법.
123. 실시양태 118 내지 122 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단백질 안정성이 용융 온도, 시차 주사 열량측정법(DSC), 원이색법(CD), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 단백질분해효소 내성, 등온 열량측정법(ITC), 핵 자기 공명(NMR), 내부 형광도 및/또는 생물학적 활성에 의해 측정되는 것인 방법.
124. 실시양태 118 내지 123 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안정성이 FOI에 비해 Cm에서 10% 이상까지 증가되는 것인 방법.
125. 실시양태 118 내지 124 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안정성이 FOI에 비해 Cm에서 20% 이상까지 증가되는 것인 방법.
126. 실시양태 118 내지 125 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안정성이 우레아 변성에 의해 측정되는 것인 방법.
127. 실시양태 118 내지 125 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안정성이 구아니딘 변성에 의해 측정되는 것인 방법.
128. 실시양태 118 내지 127 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스캐폴드가 FOI에 비해 단백질분해효소 민감성에서 10% 이상의 감소를 나타내는 것인 방법.
129. 실시양태 118 내지 128 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스캐폴드가 FOI에 비해 증가된 용융 온도를 나타내는 것인 방법.
130. 실시양태 118 내지 129 중 어느 한 실시양태에 있어서, 용융 온도가 FOI에 비해 2℃ 이상까지 증가되는 것인 방법.
131. 실시양태 118 내지 130 중 어느 한 실시양태에 있어서, FOI가 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54, 서열번호 69 및 표 16(도 16)에 제시된 서열들 중 임의의 서열을 포함하는 것인 라이브러리.
132. 실시양태 118 내지 131 중 어느 한 실시양태에 있어서, FOI가 서열번호 1을 포함하는 것인 방법.
133. 실시양태 118 내지 131 중 어느 한 실시양태에 있어서, FOI가 서열번호 54 또는 서열번호 69를 포함하는 것인 방법.
134. 실시양태 118 내지 133 중 어느 한 실시양태의 방법에 의해 제조된, 증가된 단백질 안정성을 나타내는 피브로넥틴 III형 스캐폴드로서, FOI에 비해 (a) 우레아 변성 실험에서 측정된 Cm에서 10% 이상의 증가된 안정성; (b) 구아니딘 변성 실험에서 측정된 Cm에서 10% 이상의 증가된 안정성; (c) 단백질분해효소 민감성에서 10% 이상의 증가된 안정성; 또는 (d) 증가된 용융 온도를 나타내는 피브로넥틴 II형 스캐폴드.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예
본 발명은 지금부터 하기 실시예를 참조하면서 기재된다. 이들 실시예는 설명을 위한 것이고, 본 발명은 결코 이들 실시예로 한정되는 것으로 간주되어서는 안 되고, 본원에서 제공된 교시의 결과로서 자명해질 임의의 모든 변경을 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1
다양한 다가 Tn3 포맷의 디자인
Tn3 스캐폴드의 다가 포맷을 디자인하였다. 그들 자신에 융합되거나, 올리고머화될 수 있는 다른 단백질 모티프에 융합되거나, 그들 자신 및 올리고머화될 수 있는 다른 단백질 모티프에 융합된 1개 이상의 Tn3 모듈을 함유하는 다가 포맷이 도 1에 제시되어 있다. 각각의 경우, 생성된 분자 물질은 2개 이상의 Tn3 모듈을 함유한다. Tn3 모듈을 서로 연결하거나 다른 단백질 모티프에 연결하는 폴리펩티드 링커는 구조화될 수 있거나 비구조화될 수 있고 기능을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 다가 Tn3 스캐폴드 단백질의 3가지 예시적인 부류가 구체적으로 제공된다: (i) 폴리펩티드 링커를 통해 서로 융합된 Tn3 모듈을 함유하는 선형(L) 다가 단백질; (ii) 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 항체 단편에 융합된 1개 이상의 선형으로 융합된 Tn3 모듈을 함유하는 항체 유사(Ig) 다가 단백질; 및 (iii) 항체 Fc 영역에 융합된 1개 이상의 선형으로 융합된 Tn3 모듈을 함유하는 Fc 함유 다가 단백질(도 1).
실시예 2
다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 함유 단백질의 발현 및 정제
인간 TRAIL R2에 대한 결합 특이성을 나타내는 일련의 8개 다가 Tn3 모듈 함유 스캐폴드 단백질("Tn3 단백질" 또는 "Tn3 스캐폴드"로도 지칭됨)을 제조하였다. 실시예 1에 기재된 3가지 다가 포맷 각각에 대한 예시적인 단백질을 제조하였고, 이들 단백질 모두가 2개 이상의 TRAIL R2 결합 Tn3 모듈 A1을 제공하였다(클론 1E11, G6 또는 1C12). 여러 TRAIL R2 특이적 다가 Tn3 단백질에 대하여, TRAIL R2에 결합하지 않고 성분 Tn3 모듈의 서열 및 결합 특이성 면에서만 상이한 상응하는 대조군 Tn3 단백질(클론 D1, 시나기스(Synagis)® 항체에 특이적인 Tn3 도메인)도 발생시켰다. Tn3 클론 D1은 1E11 클론의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프가 각각 서열번호 99, 서열번호 38 및 서열번호 107에 상응하는 서열을 갖는 대안적 루프로 치환되어 있는 Tn3 단백질이다(표 4 참조). 발현된 다가 Tn3 단백질 구축물의 서열 확인 번호는 표 2에 제시되어 있고, 모든 가능한 구축물이 표 3 및 도 2에 개략적으로 나타나 있다. 클론에 대한 루프 서열은 표 4에 제공되어 있다.
발현된 Tn3 함유 단백질의 명칭, 포맷, 원자가 및 특이성
명칭(클론) 포맷 유형 서열번호 Tn3 모듈의 수 특이성
A1(1E11) 단량체 134 1 TRAIL R2
A2(1E11) L 139 2 TRAIL R2
A3(1E11) L 140 4 TRAIL R2
A4(1E11) L 141 6 TRAIL R2
A5(1E11) L 142 8 TRAIL R2
A5(G6) L 145 8 TRAIL R2
A6(1E11) Fc 151 2 TRAIL R2
A7(1E11) Fc 164 4 TRAIL R2
A8(1E11) Fc 165 8 TRAIL R2
A9(1C12) Ig 154(HC), 154(LC) 4 TRAIL R2
A9(1E11) Ig 158(HC), 159(LC) 4 TRAIL R2
B1(D1) 단량체 180 1 A1의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B2(D1) L 발현되지 않음 2 A2의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B3(D1) L 146 4 A3의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B4(D1) L 147 6 A4의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B5(D1) L 148 8 A5의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B6(D1) Fc 181 2 A6의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B7(D1) Fc 발현되지 않음 4 A7의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B8(D1) Fc 발현되지 않음 8 A8의 비-TRAIL R2 결합 대조군
B9(D1) Ig 182(HC), 183(LC) 4 A9의 비-TRAIL R2 결합 대조군
L = 선형 Tn3 융합체, Fc = Fc-Tn3 융합체, Ig = 항체 유사 Tn3 융합체
Tn3 스캐폴드 구축물의 개략적인 표시
구축물 성분


Tn3 모듈(Tn3)		 IEV ( X AB ) n ALITW (X BC ) n CELX 1 YGI ( X CD ) n TTIDL ( X DE ) n YSI ( X EF ) n YEVSLIC ( X FG ) n KETFTT
XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, n은 2 내지 26이고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타낸다.
Gly-Ser 링커 모듈, (G 4 S) n (이때, n=1-7) GGGGS
n이 1인 (G4S)n 모듈이 상기 제시되어 있다.
폴리-히스티딘 태그 ( H 8 ) HHHHHHHH
하기 상세히 기재된 구축물의 임의적 성분 - 정제에 유용하다.
명칭 구축물 개요
A1 또는 B1 A( Tn3 )GGGTLGH 8
A2 또는 B2 S(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTLGH 8
A3 또는 B3 S(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTLGH 8

A4 또는 B4 		S(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTGSAMAS(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTLGH 8

A5 또는 B5 		S(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTGSAMAS(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTLGH 8

A6 또는 B6 		( Tn3 )GAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

A7 또는B7		 AMAS(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTGAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

A8 또는 B8 		AMAS(G4S)1A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)3A( Tn3 )(G4S)2GTGAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK


A9 또는 B9 중쇄 불변 영역 융합체
 SQ( Tn3 )GGGTPTSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
A9 또는 B9 경쇄 불변 영역 융합체 SQ( Tn3 )GGGTPTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
M13 또는 79 A( Tn3 )GGGTLGH 8
C1 A( Tn3 )A(G4S)1RLDAPGQ( Tn3 )GGGTLGH 8
C2 A( Tn3 )(G4S)3RLDAPGQ( Tn3 )GGGTLGH 8
C3 A( Tn3 )(G4S)5RLDAPGQ( Tn3 )GGGTLGH 8
C4 A( Tn3 )(G4S)7RLDAPGQ( Tn3 )GGGTLGH 8
C5 A( Tn3 )TRLDAPGQ(Tn3)GGGTLGH 8
C6 A( Tn3 )(G4S)1RLDAPGQ( Tn3 )GGGTLGH 8
C7 A( Tn3 )(G4S)2RLDAPGQ( Tn3 )GGGTLGH 8
C8 A( Tn3 )(G4S)3RLDAPGQ( Tn3 )GGGTLGH 8
이들 연구에서 사용된 Tn3 클론의 루프 서열
클론 AB 루프
(서열번호) 		BC 루프
(서열번호) 		CD 루프
(서열번호) 		DE 루프
(S서열번호) 		EF 루프
(서열번호) 		FG 루프
(서열번호)
1E11† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGAKSNPA
(번호 106)
D1 KDVTDTT
(번호 35)		 SPGERIWMFTG
(번호 99)		 KDVPGDR
(번호 37)		 TEDENQ
(번호 38)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 PNYERISNPA
(번호 107)
G6† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGMRSKPA
(번호 108)
1C12† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPEKWDGSIYG
(번호 98)		 KDVPGDR
(번호 37)		 NSRHTA
(번호 103)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FTPYGAKSNPA
(번호 109)
M13 KDVTDTT
(번호 35)		 HDAFGYDFG
(번호 100)		 KDVPGDR
(번호 37)		 PDHFHN
(번호 104)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 ANDHGFDSNPA
(번호 110)
79 KDVTDTT
(번호 35)		 IPPHNADSSIIG
(번호 101)		 KDVPGDR
(번호 37)		 YDVAFD
(번호 105)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 DTFYGFDSNPA
(번호 111)
G3† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPEKWDGPPLW
(번호 168)		 KDVPGDR
(번호 37)		 NSRHTA
(번호 103)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FTPYGAKSNPA
(번호 109)
C4† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYNKRNVPA
(번호 169)
F4† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGLKSRPA
(번호 170)
F4mod1† KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHTA
(번호 102)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGLKSRPA
(번호 170)
F4mod12 KDVTDTT
(번호 35)		 AKPWVDPPPLWG
(번호 97)		 KDVPGDR
(번호 37)		 QQKHNQ
(번호 179)		 GNLKPDTE
(번호 39)		 FDPYGLKSRPA
(번호 170)
†서열 CELAYGI(서열번호 131)을 갖는 C 베타 가닥을 포함하는 클론, 모든 다른 클론들은 서열 CELTYGI(서열번호 45)을 갖는 C 베타 가닥을 포함한다.
발현 구축물의 제조: 사용된 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(미국 매사추세츠주 입스위치 소재)로부터 구입되었고, DNA 정제 키트는 퀴아젠(Qiagen)(미국 매릴랜드주 저만타운 소재)으로부터 구입되었고, DNA 프라이머는 아이디티(IDT)(미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 구입되었다. 2개 이상의 선형으로 융합된 Tn3 모듈을 코딩하는 발현 구축물의 제조는 다음과 같았다. TRAIL R2 특이적 Tn3 모듈을 코딩하는 DNA(예를 들면, 1E11, 서열번호 134; G6, 서열번호 138 등)를 "Tn3 gly4ser1 모듈 정방향" 프라이머(서열번호 112) 및 "Tn3 gly4ser2 모듈 역방향" 프라이머(서열번호 113)(표 5)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
PCR 생성물의 정화 후, 증폭된 DNA를 2개로 나누고, 절반을 BpmI으로 분해하고, 나머지 절반을 AcuI으로 분해하였다. 분해된 샘플을 PCR 정화 키트를 사용하여 정제하고 T4 DNA 리가제(ligase)로 라이게이션시켜 2개의 Tn3 모듈을 코딩하는 DNA 생성물(A2)을 제조하였다. 이 물질을 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고 다시 2개로 분할하였다. NcoI 및 KpnI으로 분해한 후, NcoI/KpnI에 의해 분해된 pSec-oppA(L25M)(국제특허공보 제WO2009/058379 A2호의 실시예 18에 기재됨) 내로 라이게이션시켜 단백질 A2에 대한 세균 발현 구축물을 생성하였다. 비분해된 생성물을 pCR 2.1-TOPO 벡터(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 내로 라이게이션시켜 고차 융합체의 발생을 위한 유전 물질을 제공하였다. 4개의 Tn3 모듈(A3)을 코딩하는 DNA 단편을 제조하기 위해, TOPO 클로닝된 A2 DNA를 "모듈 amp 정방향" 프라이머(서열번호 114) 및 "모듈 amp 역방향" 프라이머(서열번호 115)(표 5)를 사용하여 PCR로 증폭시키고, 정제하고, AcuI 또는 BpmI를 사용한 분해를 위해 2개로 분할하였다. A3 발현 구축물을 제조하는 방법의 나머지 절차는 A2 구축물의 제조를 위해 이용된 절차와 동일하였고, 이때 A3을 코딩하는 DNA는 A2 구축 블록으로부터 조립되었다. 다시, 조립된 A3 DNA를 pCR 2.1-TOPO 내로 동시에 클로닝하여 고차 융합체의 발생을 위한 유전 물질을 제공하였다.
A4 세균 발현 구축물 및 A5 세균 발현 구축물의 제조를 위해, 어댑터(adapter) 모듈을 A3 발현 구축물 내의 다중 Tn3 코딩 서열의 3' 말단에 도입하였다. 이를 수행하기 위해, A3 발현 벡터를 먼저 KpnI 및 EcoRI으로 분해하고, 절단된 단편을 "pSec 내의 삽입체 BamHI 정방향" 올리고뉴클레오티드(서열번호 116) 및 "pSec 내의 삽입체 BamHI 역방향" 올리고뉴클레오티드(서열번호 117)(표 5)를 함유하는 이중 카세트로 치환시켰다. 상응하는 pCR 2.1 TOPO 구축물로부터의 A2 서열 및 A3 서열의 PCR 증폭을 "모듈 삽입체 BamHI 정방향" 프라이머(서열번호 118) 및 "모듈 amp 역방향" 프라이머(서열번호 115)(표 5)를 사용하여 수행하였다. 증폭된 생성물을 BamHI/KpnI으로 이중 분해하고, 유사하게 분해된 A3 발현 구축물 내로 클로닝하였다.
단백질 A6 내지 A9를 국제특허공보 제WO2009/058379 A2호의 실시예 16에 기재된 바와 같이 293F 세포의 일시적 형질감염으로 발현시켰다. 요약하건대, Tn3 모듈(또는 모듈들)을 세균 발현 구축물로부터 PCR로 증폭시키고 Fc 융합체 또는 항체 단백질의 발현을 위해 Fc 영역, 카파 경쇄 불변 영역 및/또는 CH1-힌지-CH2-CH3 중쇄 불변 영역을 코딩하는 하우스 벡터 내로 상기 모듈을 클로닝하여 발현 벡터를 발생시켰다. 단백질 A9의 경우, Tn3 모듈은 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 내의 항체 가변 영역을 치환시킨다. 직렬 구축물의 Fc 융합체를 제조하기 위해 상용가능한 NheI 및 KasI 부위를 부가하는 프라이머는 표 5에 제시되어 있다.
다가 Tn3 단백질의 구축에서 사용되는 프라이머 서열
서열 명칭 서열 서열번호
Tn3 gly4ser1 모듈
정방향		 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGAGTGCGGCCATGGCCAGCGGGGGCGGAGGGAGTGCCATTGAAGTGAAAGATGTGACCGATACC 112
Tn3 gly4ser2 모듈
역방향		 CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCTACGCAGGTACCGCTACCGCCACCTCCGCTCCCACCGCCACCGGTGGTAAAGGTTTC 113
모듈 amp 정방향 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGAGTGCGG 114
모듈 amp 역방향 CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCTACGCAGG 115
pSec 내의 모듈 삽입체 BamHI 정방향 GGGATCCGCTACGGGCCACTCGATCGAGGTCCGTGCTGATCGAGCGATCGGTACCCTGGGCCATCATCATCATCATCACCACCACTGAG 116
pSec 내의 모듈 삽입체 BamHI 역방향 AATTCTCAGTGGTGGTGATGATGATGATGATGGCCCAGGGTACCGATCGCTCGATCAGCACGGACCTCGATCGAGTGGCCCGTAGCGGATCCCGTAC 117
모듈 삽입체 BamHI 정방향 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGGGATCCGCCATGGCCAGC 118
모듈 삽입체 NheI 정방향 GGCGCTAGGCTGAGTAGGTCCTGGCTAGCTGCCATGGCCAGC 119
모듈 삽입체 KasI 역방향 CCTCAGCCGATCACCACCTGAAGGCGGCGCCGGTACC 120
단백질의 발현 및 정제: 1가 또는 선형 Tn3 단백질을 BL21(DE3) 이. 콜라이(이엠디(EMD)/노바겐(Novagen), 미국 뉴저지주 깁스타운 소재) 내에서 발현시키고, His 태그 부착된 단백질을 Ni NTA 수퍼플로우(Superflow) 수지(퀴아젠)를 사용하여 배양 배지로부터 정제하였다. 놀랍게도, 분자량의 큰 차이에도 불구하고, 모든 이들 구축물이 이. 콜라이 내에서 고수준으로 배지에서 발현되었고 배지 내로 효율적으로 분비되었다(표 6 및 도 3).
Fc 융합 단백질 및 항체 유사 단백질(A6 내지 A9)을 발현시키기 위해, 293F 세포를 적절한 발현 구축물로 일시적으로 형질감염시켰다. 상청액의 회수를 6일째 날 및 10일째 날에 수행하였고, 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
모든 정제된 단백질을, 환원제를 사용하지 않으면서 MES 완충제 중의 누페이지 노벡스(NuPage Novex) 4 내지 12% 비스 트리스 겔 상에서 SDS-PAGE로 분석하고, 심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue SafeStain)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 가시화하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제된 단백질을 분석하였고, 필요한 경우, 응집된 물질을 수퍼덱스(Superdex) 75 10/300GL 또는 수퍼덱스 200 10/300GL 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서 총 단백질의 10% 미만의 최종 수준까지 제거하였다. 무스탕(Mustang) E 막(팔 코포레이션(Pall Corporation), 미국 뉴욕주 포트 워싱톤 소재)을 갖는 아크로디스크(Acrodisc) 유닛을 제조자에 의해 지시된 바와 같이 사용하여 세균에 의해 발현된 단백질 제제로부터 내독소를 제거하였다.
대표적인 다가 Tn3 단백질 포맷의 정제 후 수율
단백질(클론) 수율( mg /ℓ)
A1(1E11) 400
A2(1E11) 300
A3(1E11) 135
A4(1E11) 90
A5(1E11) 40
실시예 3
1가 Tn3 단백질 및 다가 Tn3 단백질에 대한 TRAIL R2 결합 친화성
일련의 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질에 대하여 결합 친화성에 대한 Tn3 원자가의 효과를 측정하기 위해, 경쟁 ELISA 실험을 수행하였다. 96 웰 넌크 맥시소르프(NUNC MaxiSorp) 플레이트(써모 피셔(Thermo Fisher), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)를 4℃에서 2 ㎍/㎖의 농도로 PBS 중의 A9(1C12)(서열번호 154 + 서열번호 145)(항체 유사 포맷의 TRAIL R2 특이적 스캐폴드)로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 0.1% 트윈 20 + 10 ㎎/㎖ BSA로 차단하였다. A1(1E11 단량체) 및 선형 포맷 A2(1E11 2가) 또는 A3(1E11 4가) 다량체 스캐폴드의 희석물을 실온에서 상기 코팅된 플레이트 상에서 PBS 0.1% 트윈 20 + 1 ㎎/㎖ BSA 중의 0.75 nM 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc와 함께 2시간 동안 항온처리하고 세척하였다. 결합된 바이오티닐화된 TRAIL R2 Fc를 스트렙타비딘 HRP 및 TMB로 검출하고, 산으로 중화시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 데이터는 도 4에 제시되어 있다. 결합 친화성(IC50)은 표 7에 제시되어 있고 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc의 최대 결합을 50%까지 감소시키는 데에 요구되는 경쟁 단백질의 농도로서 계산되었다.
A2 및 A3에 대한 IC50 값은 단량체 A1에 대한 IC50 값보다 30배 이상 더 낮았고 이 분석의 한계 수준이다(즉, 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc의 농도와 거의 동등함). 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc와 고정된 TRAIL R2 특이적 Tn3의 결합은 TRAIL R2 결합 구축물에 의해 제거되었다.
단량체 A1 단백질에 비해 상대적으로, 2가 A2 단백질 및 A3 단백질, 및 4가 A2 단백질 및 A3 단백질은 30 내지 40배 더 높은 친화성으로 TRAIL R2-Fc에 결합하였는데, 이것은 다수의 Tn3 모듈이 그들의 결합 활성을 보유하고 친화력 효과를 통해 보다 높은 친화성에 기여한다는 표시이다. 1가 Tn3 단백질과 2가 또는 4가 Tn3 단백질 사이의 친화성의 실제 차이는 A2 및 A3에 대한 IC50 값이 본 분석에서 사용된 바이오티닐화된 TRAIL R2-Fc의 농도(0.75 nM)와 거의 동등하였다는 점을 고려할 때 30 내지 40배를 초과할 수 있다.
TRAIL R2-Fc와 고정된 TRAIL R2 결합 A9(1C12) Tn3 단백질의 결합의 억제에 대한 IC50 값
클론 원자가 IC50(nM)
A1(1E11) 1 16
A2(1E11) 2 0.5
A3(1E11) 4 0.4
실시예 4
세포 결합의 확인을 위한 유세포분류
유세포분류를 이용하여 다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질과 H2122 세포의 세포 표면 상에서 발현된 내인성 TRAIL R2의 결합 특이성을 확인하였다. 아큐타제(Accutase)(이노베이티브 셀 테크놀로지스(Innovative Cell Technologies), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 사용하여 부착된 H2122 세포(비소세포폐암 선암종 세포주)를 조직 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 세포를 완전 배지(10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지)로 세정하고 약 2x106개 세포/㎖의 밀도로 PBS/2% FBS에 재현탁시켰다. Tn3 단백질 A9(1E11)(서열번호 158 + 서열번호 159)(4가 항체 유사 포맷의 다량체 스캐폴드) 또는 포맷 일치된 대조군 Tn3 단백질 B9(클론 D1)를 PBS/2% FBS 중에서 40 nM 농도로 제조하였다.
세포를 웰당 75 ㎕씩 96 웰 U 바닥 플레이트 상에 플레이팅하고, 단백질 샘플을 웰당 25 ㎕씩 (10 nM의 최종 농도까지) 첨가하였다. 상기 플레이트를 4℃에서 약 1시간 동안 항온처리한 후 PBS/2% FBS로 3회 세척하였다. 항-인간 IgG 알렉사 플루오르 488에 접합된 이차 항체를 첨가하고(웰당 100 ㎕), 상기 플레이트를 4℃에서 약 30분 동안 항온처리하고 전술된 바와 같이 세척하였다. 세포를 100 ㎕의 PBS/2% FBS에 재현탁시키고, BD LSR II 세포분류기(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 이용하여 유세포분류 분석을 수행하였다. TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질과 함께 항온처리된 경우 대조군에 비해 상대적인 형광 표지된 H2122 세포의 변동(증가)은 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질이 세포내 TRAIL R2에 결합할 수 있었다는 것을 확인시켜주었다(도 5).
실시예 5
TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질에 의한 H2122 세포의 아폽토시스에 대한 원자가 및 포맷의 효과
아폽토시스성 세포 사멸은 세포 표면 TRAIL R2의 교차결합에 의해 암세포주에서 유도될 수 있다. 이 효과는 생존 세포의 수를 측정하는 세포 분석에서 측정될 수 있다. 이를 위해, 75 ㎕의 완전 배지(10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지) 중의 폐암종 세포주 H2122 세포를 10,000개 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트 내에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 배지를 TRAIL R2 특이적(클론 1E11) Tn3 단백질 또는 음성 대조군(클론 D1) Tn3 단백질의 연속 희석물이 함유된 25 ㎕의 추가 배지로 보충하였다. 모든 처리를 이중 웰에서 수행하였다. 상업적으로 입수가능한 TRAIL 리간드(케미콘(Chemicon)/밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 TRAIL 수용체에 의해 유도된 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 72시간 후, 배양물 중의 생존 세포의 수의 척도인 ATP 수준을 분석하기 위해 프로메가(Promega)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 키트를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 분석 발광을 엔비전(Envision) 플레이트 판독기(퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재) 상에서 측정하였다. 처리된 세포에 대한 발광 값을 비처리된 생존 세포에 대한 평균 발광으로 나눔으로써 세포 생존력의 억제를 측정하였다. 억제 대 화합물 농도의 투여량 반응 곡선을 작도하고, 세포 사멸 효능(EC50)을 세포 생존력의 50%를 억제하는 데에 요구되는 단백질의 농도로서 측정하였다.
다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질의 전구아폽토시스(proapoptotic) 활성에 대한 원자가의 효과를 시험하기 위해, H2122 세포를 1가 Tn3 단백질 A1(클론 1E11) 및 일련의 선형으로 융합된 (2개, 4개, 6개 또는 8개의 Tn3 모듈을 함유하는) Tn3 단백질 A2 내지 A5(각각 클론 1E11)로 처리하였다. 1가 Tn3 단백질 및 2가 Tn3 단백질은 사멸 활성을 전혀 보이지 않거나 무시할만한 수준의 사멸 활성을 보이는 반면, 4개, 6개 또는 8개의 Tn3 모듈을 함유하는 단백질은 H2122 세포 생존력을 강력하게 억제하였고, 이때 효능은 원자가의 함수로서 증가하였다(도 6a; 표 8). 단백질 A3(4가)은 TRAIL, 즉 천연 TRAIL R2 리간드와 유사한 효능을 보였으나, 단백질 A4(6가) 및 A5(8가)는 1 내지 2 로그 더 강력하였다. 주어진 분자 포맷의 경우 세포 사멸은 원자가가 높아짐에 따라 상기 분석이 더 이상 식별할 수 없는 수준까지 개선된다는 것이 이 분석으로부터 명확하다.
다가 구축물에 의한 H2122의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A3(1E11) 0.013 91
A4(1E11) 0.0009 97
A5(1E11) 0.0006 97
인간 TRAIL 0.027 98
세포 생존력의 억제가 TRAIL R2 결합에 의존한다는 것을 입증하기 위해, 100 pM의 단백질 5(클론 G6)(즉, 167xEC50)를 가용성 TRAIL R2-Fc 단백질의 존재 하에서 H2122 세포와 함께 항온처리하였다. 가용성 TRAIL R2-Fc에 의한 세포 사멸의 투여량 의존성 억제는 세포 사멸이 세포 표면 TRAIL R2에 결합하는 단백질 A5에 의존한다는 것을 암시한다(도 6b). 유사한 결과가 클론 1E11 루프를 포함하는 단백질 A5를 사용한 경우 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
결합 모듈의 수 이외에, 다가 Tn3 단백질의 활성은 개별 결합 유닛을 제시하는 데에 사용되는 분자 포맷에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 활성에 대한 분자 포맷의 효과를 시험하기 위해, H2122 세포를 동일한 수의 Tn3 결합 모듈을 제시하는 상이한 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질로 처리하였다. H2122 세포의 사멸을 유도하는 4가 단백질 A3, A7 및 A9(각각 클론 1E11)의 능력을 세포 생존력 분석에서 시험하였고, 한 쌍의 8가 Tn3 단백질 A5 및 A8(각각 클론 1E11)도 마찬가지로 시험하였다. 불활성 1가 단백질 및 2가 단백질을 음성 대조군으로서 포함시켰고, TRAIL을 양성 대조군으로서 포함시켰다(도 7; 표 9 및 표 10). 도 7a에서, 4의 원자가를 갖는 시험된 3개의 구축물의 경우, A3(선형 포맷) 및 A7(Fc 융합체 포맷)은 그들의 세포 사멸 활성에 있어서 유사하였고 H2122 세포 사멸에 있어서 A9(항체 유사 융합체 포맷)보다 더 강력하였다. 이것은 Tn3 모듈의 공간적 배향이 생체활성에 대한 유의한 효과를 나타낼 수 있고, 이때 A3이 H2122 세포 생존력의 억제에 있어서 A9 단백질보다 대략 150배 더 강력하다는 것을 보여준다(표 9). 도 7b는 8가 TRAIL R2 결합 Tn3 단백질의 두 포맷인 A5(선형) 및 A8(Fc 융합체)이 H2122 세포 생존력의 억제에 있어서 유사한 효능을 나타낸다는 것을 보여준다. 이들 구축물에 대한 EC50 데이터는 표 9에 제시되어 있다. 친화성, 원자가 및 공간적 배향을 미세하게 조정하는 능력은 원하는 치료 결과를 정확히 조작하는 능력 면에서 큰 유연성을 부여한다.
4의 원자가를 갖는 다가 구축물에 의한 H2122의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A9(1E11) 1.98 80
A7(1E11) 0.02 88
A3(1E11) 0.013 91
인간 TRAIL 0.027 98
8의 원자가를 갖는 다가 구축물에 의한 H2122의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A5(1E11) 0.0006 97
A8(1E11) 0.0002 98
인간 TRAIL 0.027 98
실시예 6
세포주 콜로205 및 주르카트(Jurkat)에서의 투여량 의존성 세포 사멸
다가 TRAIL R2 특이적 Tn3 단백질이 H2122 이외의 암세포주를 사멸시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해, 다른 TRAIL R2 발현 세포주도 시험하였다. 대장 선암종 세포주 콜로205(도 8a) 및 주르카트 T 세포 백혈병 세포주(도 8b)를 단백질 A3(4가, 선형 포맷)(서열번호 143) 및 A5(8가, 선형 포맷)(서열번호 145)(각각 클론 G6)에 의해 사멸되는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 각각의 세포주를 A3, A5, 양성 대조군 TRAIL, 또는 TRAIL R2에 결합하지 않는 음성 대조군 단백질 B5(서열번호 148)와 함께 항온처리하고, 세포 생존력 분석을 H2122에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 이들 세포주에서, A5는 세포 생존력의 매우 강력한 억제를 보였다. 원자가가 보다 낮은 A3 단백질도 A5보다 낮은 효능에도 불구하고 세포 사멸을 유도하였다. 따라서, 원자가가 보다 높은 구축물은 보다 높은 활성을 보였다. 예측된 바와 같이, TRAIL도 세포 생존력을 억제할 수 있었지만, TRAIL R2에 결합하지 않는 8가 음성 대조군 단백질 B5는 세포 생존력을 억제할 수 없었다.
선형 직렬 구축물에 의한 콜로205의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A3(G6) 0.04 97
A5(G6) 0.0005 100
인간 TRAIL 0.08 100
선형 직렬 구축물에 의한 주르카트 세포의 사멸에 대한 EC50 값
클론 EC50(nM) 최대 억제 %
A3(G6) 0.05 83
A5(G6) 0.0001 100
인간 TRAIL 0.009 99
세포는 실시예 5에서와 같이 셀타이터-글로 분석에 의해 분석되었다.
실시예 7
마우스 CD40L 특이적 2가 직렬 스캐폴드의 디자인, 발현 및 활성
한 쌍의 동일한 Tn3 모듈을 융합시켜 2가 뮤린 CD40L 특이적 Tn3 단백질(표 13)을 제조하였다. M13은 뮤린 CD40L에 특이적으로 결합하는 Tn3 단백질이다. M13 서열은 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프의 서열이 각각 서열번호 100, 서열번호 104 및 서열번호 110에 상응하는 서열을 갖는 대안적 루프로 치환되어 있는 Tn3의 서열에 상응한다(표 4 참조). Gly4Ser(GS) 유닛의 1개 카피(구축물 C1(M13)), 3개 카피(구축물 C2(M13)), 5개 카피(구축물 C3(M13)) 또는 7개 카피(구축물 C4(M13))를 함유하는 링커를 사용하여 13 내지 43개 아미노산의 총 링커 길이를 발생시켰다(도 9a 및 표 3 참조).
발현된 Tn3 함유 단백질의 명칭, 원자가 및 특이성
명칭
(클론)		 Tn3 모듈의 수 링커 길이 특이성
M13(M13) 1 N/A 뮤린 CD40L
C1(M13) 2 13 뮤린 CD40L
C2(M13) 2 23 뮤린 CD40L
C3(M13) 2 33 뮤린 CD40L
C4(M13) 2 43 뮤린 CD40L
요약하건대, 발현 구축물을 다음과 같이 발생시켰다: Tn3 유전자의 업스트림에서 pSec 벡터에 특이적인 프라이머 및 "1-3 GS 링커 역방향" 프라이머(서열번호 123)를 사용하여 실시예 1에 기재된 pSec-oppA(L25M) 벡터 내에 클로닝된 뮤린 CD40L 결합제 pSec-M13을 PCR로 증폭시킴으로써 단편 A를 발생시켰다(사용된 Tn3 특이적 프라이머의 서열에 대해서는 표 14 참조). 각각 "1 GS 링커" 프라이머(서열번호 121) 또는 "3 GS 링커" 프라이머(서열번호 122), 및 Tn3 유전자의 다운스트림에서 pSec 벡터에 특이적인 프라이머를 사용하여 동일한 주형을 PCR로 증폭시킴으로써 단편 B1GS 및 B3GS를 발생시켰다. 상기 단편의 겔 정제 시, 단편 A와 B1GS 또는 단편 A와 B3GS를 혼합하고, 상기 2개의 pSec 벡터 특이적 프라이머를 사용한 PCR 반응에서 중복 PCR로 직렬 구축물을 발생시켰다. 생성물을 NcoI 및 KpnI으로 분해하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 pSec-oppA(L25M) 벡터 내로 다시 클로닝하여 2개의 구축물, 즉 C1(M13) 및 C2(M13)를 발생시켰다. 5 GS 링커 구축물 및 7 GS 링커 구축물을 발생시키기 위해, "GS L Amp 정방향" 프라이머(서열번호 126) 및 "GS L Amp 역방향" 프라이머(서열번호 127)를 사용하여 각각 올리고뉴클레오티드 "5 GS 링커"(서열번호 124) 및 "7 GS 링커"(서열번호 125)를 PCR로 증폭시킴으로써 발생시킨 링커 삽입체를 PstI 및 XmaI으로 분해하고 PstI 및 XmaI에 의한 pSecM13-1GS-M13의 절단에 의해 발생된 벡터 단편 내로 클로닝하여 구축물 C3(M13) 및 C4(M13)를 발생시켰다.
직렬 2가 MuCD40L 특이적 구축물의 구축에서 사용된 프라이머 서열
서열 명칭 서열 서열번호
1 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 121
3 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 122
1-3 GS 링커 역방향 CTGCAGTGGTAAAGGTTTCTTTCG 123
5 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCCGCTTGGATGCCCCCGGGCA 124
7 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGGGGTAGCCGCTTGGATGCCCCCGGGCA 125
GS L Amp 정방향 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGT 126
GS L Amp 역방향 TTCAATCTGCCCGGGGGCATCCAA 127
동일한 Tn3 스캐폴드를 포함하는 1가 직렬 구축물 및 2가 직렬 구축물을 실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이로부터 재조합적으로 발현시키고 정제하였다. 도 9b는 환원 조건 및 비환원 조건 하에서 수행된, 정제된 단백질 제제의 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
2가 직렬 M13-M13 구축물들의 결합 효율을 시험하고 이들을 1가 M13 스캐폴드와 비교하기 위해, 바이오센서 칩 상에 고정된 뮤린 CD40 수용체와 뮤린 CD40L의 결합의 경쟁 억제에 대해 이들 구축물을 시험하였다.
요약하건대, IgG1의 Fc 영역을 갖는 키메라 융합체 형태의 뮤린 CD40 수용체의 단편을 약 3,000 반응 유닛의 밀도로 GLC 칩(바이오-라드) 상에 고정시켰다. 경쟁 결합 분석을 위해, 상이한 링커 길이를 갖는 1가 M13 구축물 또는 M13 직렬 2가 구축물의 3배 연속 희석물을, 0.1%(부피/부피) 트윈-20 및 0.5 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 PBS 중의 고정된 농도의 재조합 뮤린 CD40L(0.5 ㎍/㎖)(이. 콜라이에서 생성됨)과 함께 20분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 이들 샘플을 300초 동안 30 ㎕/분의 유속으로 GLC 칩 상에 주입하고, 결합된 CD40L의 수준을 센서그램(sensorgram) 내에서 고정된 시점에서 기록하고 임의의 경쟁자의 부재 하에서 결합된 단백질의 상응하는 수준과 비교하였다. 각각의 결합 측정 후, 10 mM 글리신-HCl(pH 2.0)을 주입하여 잔류 CD40L을 상기 칩 표면으로부터 탈착시켰다. 상기 칩의 인터스폿(interspots)으로부터 센서그램을 차감함으로써 비특이적 결합 효과를 보정하였다. 뮤린 CD40L의 50%를 대체하는 데에 요구되는 Tn3 구축물의 농도에 상응하는 IC50 값을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 계산하였다.
도 9c에 나타낸 바와 같이, M13 단량체에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50)는 71 nM인 반면, 2가 직렬 구축물 C1(M13)에 대한 IC50은 29 nM이었다. 보다 긴 링커를 함유하는 2가 구축물(각각 구축물 C2(M13), C3(M13) 및 C4(M13))에 대해 5 또는 6 nM의 유사한 IC50 값이 수득되었다. 이것은 본 분석에서 사용된 CD40L의 농도로 인해 본 분석에서 관찰될 수 있는 IC50의 하한이다. 모든 2가 구축물이 1가 구축물에 비해 보다 낮은 IC50 값을 나타내었는데, 이것은 2가 직렬 구축물의 결합 활성이 단일 M13 Tn3 모듈에 비해 향상되었음을 암시한다. 이들 2가 구축물에서 링커 길이는 분석 효능에 대한 약간의 효과를 나타내는데, 이때 링커 길이가 가장 짧은 구축물은 중간 효능을 나타내는 반면, 23개 이상의 아미노산으로 구성된 링커를 갖는 구축물은 본 분석에서 동등하다.
세포에 기초한 활성 분석에서 2가 직렬 Tn3 구축물의 활성을 시험하고 이들을 1가 M13 스캐폴드와 비교하기 위해, 뮤린 CD40L에 의해 유도된 B 세포 상의 CD86 발현의 억제를 시험하였다. 대조군으로서, 상업적으로 입수가능한 항-뮤린 CD40L 특이적 항체(MR1)를 동시에 시험하였다.
본 분석은 건강한 지원자들로부터의 혈액으로부터 제조된 PBMC를 사용하였다. 요약하건대, 새로 채혈된 혈액을 헤파린이 함유된 비디 배큐테이너(BD Vacutainer)® CPT™ 세포 준비 튜브 내에 모았다. 원심분리 후, PBMC를 함유하는 세포층을 모아 PBS로 2회 세척하고 RPMI 1640 배지로 1회 세척하였다. 세포를 5x106개 세포/㎖의 농도로 완전 RPMI 1640 배지(10% 열 불활성화된 태아소 혈청 및 1% P/S로 보충됨)에 재현탁시켰다.
뮤린 CD40L 발현 Th2 세포주 D10.G4.1을 세척하고 1x106개 세포/㎖의 농도로 완전 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다.
M13, M13-M13 직렬 2가 구축물 C1 내지 C4, 또는 MR1 항체(바이오레전드(BioLegend), 카달로그 번호: 106508)를 완전 RPMI 1640 배지로 연속적으로 희석하였다(1:3). 각각의 희석물의 50 ㎕ 샘플을 96 웰 U 바닥 조직 배양 플레이트 내의 웰에 첨가하였다. 그 다음, 50 ㎕의 D10.G4.1 세포(5x104)를 각각의 웰에 첨가하고 혼합한 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 100 ㎕의 재현탁된 PBMC(5x105개 세포)를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 20 내지 24시간 동안 항온처리하였다.
PBMC를 모으고 4℃의 암실 내에서 FACS 완충제(PBS pH 7.4, 1% BSA, 0.1% 아지드화나트륨) 중의 APC-항-인간 CD86(비디 바이오사이언스, 카달로그 번호: 555660) 및 FITC-항-인간 CD19(비디 바이오사이언스, 카달로그 번호: 555412)로 30분 동안 염색하였다. FACS 완충제로 2회 세척한 후, 샘플을 FACS LSRII(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))로 분석하였다. CD19에 의해 게이팅된(gated) B 세포 상의 CD86 발현을 평가하였다. 시험 단백질의 함수로서의 CD86 발현의 분석을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
도 9d에 나타낸 바와 같이, 2가 M13-M13 직렬 구축물 모두가 MR1 항체의 IC50(100 pM)에 필적할만하고 M13 1가 스캐폴드 자체보다 약 3 로그 더 강력한 수준인 100 내지 200 pM의 IC50으로 CD86 발현을 억제하였다. 생화학적 분석과 대조적으로, 링커 길이의 효과는 이 세포에 기초한 분석에서 관찰되지 않았고, 길이가 13 내지 43개 아미노산 범위 내에 있는 링커를 갖는 2가 구축물 모두가 1가 단백질에 비해 상대적으로 향상된 효능을 나타내는 동등한 능력을 보였다.
실시예 8
이중특이적 직렬 스캐폴드의 발현
TRAIL R2 및 인간 CD40L(HuCD40L)에 대한 특이성을 나타내는 이중특이적 Tn3 구축물을 발생시키기 위해, 2개의 Tn3 모듈(하나는 TRAIL R2에 대한 특이성을 나타내고(클론 1E11), 나머지 하나는 인간 CD40L에 대한 특이성을 나타냄(클론 79))을 이들 2개의 모듈을 분리시키는 다양한 길이의 링커들과 함께 융합시켰다(표 3 및 표 15). 클론 79 단백질(서열번호 184)의 서열은 BC 루프, DE 루프 및 EF 루프가 각각 서열번호 101, 105 및 111에 상응하는 대안적 루프로 치환되어 있는 Tn3 모듈의 서열에 상응한다. 1개의 Gly4Ser(GS) 반복체를 갖는 링커 및 3개의 Gly4Ser(GS) 반복체를 갖는 링커를 함유하는 직렬 이중특이적 스캐폴드에 대한 발현 구축물(각각 구축물 C6 및 C8)을, Tn3 변이체 A1 및 79를 보유하는 플라스미드가 PCR 주형으로서 먼저 사용되었다는 점을 제외하고 실시예 7에 기재된 바와 같이 발생시켰다. 구축물 C5(스캐폴드 결합을 위해서는 요구되지 않지만 제3 FnIII 도메인의 A 베타 가닥의 일부로서 간주될 수 있는, 인간 테나신 C 내의 제2 FnIII 도메인 및 제3 FnIII 도메인을 연결하는 천연 서열로부터 유래된 짧은 링커를 함유함) 및 구축물 C7을, C5의 경우 "O GS 링커 역방향"이 "1-3 GS 링커 역방향" 대신에 사용되었다는 점을 제외하고 표 17에 나열된 추가 프라이머를 사용하여 C6 및 C8과 유사한 방식으로 발생시켰다.
발현된 Tn3 함유 단백질의 명칭, 원자가 및 특이성
명칭 Tn3 모듈의 수 링커 길이 특이성
A1(1E11) 1 N/A TRAIL R2
79(79) 1 N/A HuCD40L
C5(1E11 & 79) 2 8 TRAIL R2 + HuCD40L
C6(1E11 & 79) 2 13 TRAIL R2 + HuCD40L
C7(1E11 & 79) 2 18 TRAIL R2 + HuCD40L
C8(1E11 & 79) 2 23 TRAIL R2 + HuCD40L
이중특이적 직렬 구축물의 구축에서 사용된 추가 프라이머 서열
서열 명칭 서열 서열번호
0 GS 링커 AAAGAAACCTTTACCACCACGCGTTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 128
0 GS 링커 역방향 CGTGGTGGTAAAGGTTTCTTTCG 129

2 GS 링커		 AAAGAAACCTTTACCACTGCAGGTGGCGGAGGTTCAGGTGGCGGAGGTTCACGCTTGGATGCCCCCGGGCAGATTGAAGTGAAAGATGTGACCGAT 130
1가 Tn3 스캐폴드 및 직렬 이중특이적 Tn3 스캐폴드를 실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 배지에서 재조합적으로 발현시켰다. 가용성 구축물의 발현 수준을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 도 10은 시험된 구축물에 대한 허용가능한 발현 수준을 입증한다.
실시예 9
이중특이적 직렬 스캐폴드의 특이적 결합
이중특이적 Tn3 구축물과 CD40L 및 TRAIL R2의 결합을 측정하기 위해 포획 ELISA 분석을 이용하였다. 요약하건대, 8X His 태그 부착된 단백질 구축물인 A1, 79, C5, C6, C7 또는 C8(세부사항에 대해 표 15 참조)을 다음과 같이 이. 콜라이 배지로부터 항-His 항체 코팅된 웰 상으로 포획하였다. 96 웰 맥시소르브 플레이트를 2 ㎍/㎖의 퀴아젠 항-His 항체로 밤새 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 0.1%(부피/부피) 트윈-20 및 4%(중량/부피) 탈지유 분말(PBST 4% 우유)이 함유된 PBS로 1.5시간 동안 차단하였다. 코팅된 플레이트를 PBST로 세척하고, 발현된 가용성 단백질을 함유하는 희석된 세균 배지(30배 희석됨)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. PBST로 세척한 후, 포획된 구축물을 함유하는 웰을 다양한 농도의 바이오티닐화된 TRAIL R2(도 11a), 또는 이. 콜라이에서 생성된 His 태그 부착된 HuCD40L과 바이오티닐화된 항-His 항체의 예비항온처리에 의해 발생된 복합체와 함께 1.5시간 동안 항온처리하였다(도 11b). PBST로 세척한 후, 결합된 TRAIL R2 또는 HuCD40L/항-His 항체 복합체를 스트렙타비딘-호스라디쉬 과산화효소(RPN1231V; 지이 헬쓰케어; 1000x 작업 희석물)로 20분 동안 검출하고, PBST로 세척하고, TMB 기질(피어스(Pierce))을 첨가하여 비색적으로 검출하였다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
이중특이적 직렬 TRAIL R2-HuCD40L 특이적 스캐폴드와 TRAIL R2의 결합, 및 이중특이적 직렬 TRAIL R2-HuCD40L 특이적 스캐폴드와 HuCD40L의 결합은 각각 도 11a 및 도 11b에 도시되어 있다. HuCD40L 특이적 Tn3 도메인에 융합된 TRAIL R2 특이적 Tn3 도메인을 포함하는 이중특이적 직렬 스캐폴드(C5 내지 C8로 명명됨)는 TRAIL R2 및 HuCD40L에 결합하였으나, 단량체/단일특이적 Tn3 구축물 A1 및 79는 그들의 공지된 특이성에 따라 TRAIL R2 또는 HuCD40L에 결합하였으나 상기 표적 둘다에는 결합하지 못하였다.
직렬 TRAIL R2-HuCD40L 특이적 구축물과 TRAIL R2 및 HuCD40L의 동시적인 결합을 알파스크린™ 분석을 이용하여 측정하였다. 단백질 A1, 79, C5, C6, C7 및 C8을 함유하는 이. 콜라이 배지의 희석물을 PBS + 0.01% 트윈 + 0.1% BSA 중의 10 nM TRAIL R2-Fc 융합 단백질, 50 nM 바이오티닐화된 HuCD40L(이. 콜라이에서 생성됨), 스트렙타비딘 알파스크린 공여자 비드(0.02 ㎎/㎖) 및 단백질 A 알파스크린 수용자 비드(0.02 ㎎/㎖)와 함께 항온처리하였다. 샘플을 퍼킨엘머 엔비전 판독기에서 판독하기 전에 암실 내에서 1시간 동안 항온처리하였다. 공여자 비드 집단을 단일항 산소의 방출을 야기하는 680 nm에서 레이저로 여기시켰다. 단일항 산소는 기저 상태로 다시 떨어지기 전에 확산에 의해 200 nm까지 이동하게 하는 제한된 수명을 갖는다. 단일항 산소는 엔비전 판독기에 의해 측정되는 520 내지 620 nm의 발광을 야기하는 수용자 비드를 여기시킨다. 공여자 비드와 수용자 비드가 인접하게 위치하는 경우에만 신호가 발생된다. 따라서, 상기 2종의 비드가 2개의 표적과 동시적으로 상호작용하는 분자에 의해 함께 존재하는 경우 신호의 증가가 관찰된다. 표적과의 결합의 부재 하에서 신호는 검출되지 않아야 한다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 직렬 이중특이적 구축물은 TRAIL R2 및 HuCD40L에 동시적으로 결합하여 강력한 알파스크린 신호를 발생시켰으나, 1가 Tn3 스캐폴드인 A1 및 79는 신호를 발생시키지 않았는데, 이것은 이들 스캐폴드가 상기 표적 둘다에 동시적으로 결합함으로써 공여자 비드와 수용자 비드를 인접하게 위치시킬 수 없었다는 것을 암시한다.
실시예 10
9개 아미노산 길이의 FG 루프를 갖는 Tn3 스캐폴드의 증가된 안정성
Tn3 안정성에 대한 FG 루프 길이의 효과를 측정하기 위해, pH 7.0에서 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl)에 의한 6개의 HuCD40L 특이적 Tn3 스캐폴드의 언풀딩을 고유 트립토판 형광도로 평가하였다. 이들 Tn3 단량체 스캐폴드는 9개, 10개 또는 11개 아미노산의 FG 루프 길이를 함유하였다. 상이한 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 0.05 ㎎/㎖ Tn3 스캐폴드의 샘플을 50 mM 인산나트륨(pH 7.0)에서 제조하였다. 형광 방출 스펙트럼을 280 nm의 여기 파장에서 호리바 플루오로맥스-4(Horiba Fluoromax-4) 분광형광계 상에서 획득하였다. 360 nm에서의 상대적인 형광 방출 강도를 각각의 단백질에 대해 GuHCl 농도의 함수로서 작도하였다. 각각의 스캐폴드는 독특한 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 서열을 함유하였다. 클론 A3(서열번호 185; 본 실시예에서 A3 단량체 스캐폴드는 표 3에서 제공된 A3으로 명명된 구축물과 상이하다는 것을 주목해야 함), 71(서열번호 186), 79(서열번호 184), 127(서열번호 187), 252(서열번호 188) 및 230(서열번호 189)은 모 Tn3의 50% 언폴딩을 수행하는 데에 요구되는 GuHCl 농도(Cm)인 3.0 M GuHCl(pH 7.0)에서 50% 초과의 수준으로 언폴딩되었다. 클론 A3, 79, 127, 252 및 230에 대한 Cm 값은 각각 2.2 M, 2.7 M, 2.4 M, 2.7 M 및 2.4 M이었다. 이들 클론에 대한 FG 루프 길이는 각각 11개, 11개, 11개, 10개 및 11개 아미노산인 반면, 모 Tn3에 대한 FG 루프 길이는 10개 아미노산이다. 놀랍게도, 9개 아미노산의 FG 루프 길이를 갖는 유일한 변이체인 클론 71은 모 Tn3 스캐폴드 또는 시험된 다른 5개의 변이체보다 유의하게 더 높은 안정성, 즉 4.2 M의 Cm을 나타내었다. 결과는 도 13에 제시되어 있다.
Tn3 클론 71의 향상된 안정성이 그의 서열에 내재된 성질인지 아니면 짧아진 FG 루프 길이의 결과인지를 확인하기 위해, 이 클론, 및 9개 아미노산의 FG 루프 길이를 갖는(그러나, 상이한 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 서열을 갖는) 2개의 추가 단량체 Tn3 스캐폴드 단백질(A6(서열번호 190; 본 실시예에서 A6 단량체 스캐폴드는 표 3에서 제공된 A6으로 명명된 구축물과 상이하다는 것을 주목해야 함) 및 P1C01(서열번호 191))을 시차 주사 열량측정법(DSC)으로 분석하고 10개 아미노산 길이를 갖는 FG 루프를 함유하는 모 Tn3 스캐폴드와 비교하였다. PBS(pH 7.2) 중의 1 ㎎/㎖의 Tn3 단백질 샘플을 분석하였다. 모든 경우, 9개 잔기 FG 루프를 갖는 클론에 대한 열적 언폴딩의 중간점은 10개 잔기 FG 루프를 갖는 모(WT) Tn3에 비해 더 높았다. 열적 언폴딩은 동일한 샘플이 냉각되고 재가열된 경우 중첩가능한 온도기록도(thermograms)에 의해 입증된 바와 같이 가역적 또는 부분적으로 가역적(클론 A6)이었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 모 Tn3에 대한 용융 온도(Tm)는 72.1℃이었고, P1C01에 대한 Tm은 75.2℃이었고 A6에 대한 Tm은 77.5℃이었고, 71에 대한 Tm은 74.4℃이었다.
이들 발견은 구아니딘 하이드로클로라이드 안정성 실험에서 동일한 Tn3 단백질 변이체를 시험함으로써 확증되었다. pH 7.0에서 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl)에 의한 모(WT) Tn3, P1C01, A6 및 71의 언폴딩을 전술된 바와 같이 고유 트립토판 형광도로 평가하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 도 14의 DSC 데이터와 일치하여, Tn3 클론 A6, 71 및 P1C01 모두가 모(WT) Tn3 스캐폴드보다 유의하게 더 높은 GuHCl 농도에서 언폴딩의 중간점을 가졌는데, 이것은 9개 아미노산 길이, 즉 모 Tn3 스캐폴드의 길이보다 더 짧은 길이의 FG 루프를 갖는 Tn3 단백질의 안정성이 향상된다는 것을 암시한다.
실시예 11
FG 루프 길이의 안정성 분석
전술된 바와 같이, 예비 분석은 9개 잔기의 FG 루프 길이를 갖는 Tn3 분자가 보다 긴 FG 루프를 갖는 Tn3 분자보다 유의하게 더 안정하다는 것을 암시하였다. 이들 연구에서, 본 발명자들은 열안정성에 대한 FG 루프 길이의 효과를 평가하기 위해 일군의 무작위 Tn3에 대한 안정성 분석을 수행하였다.
Tn3 라이브러리를 pSEC 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 이 라이브러리는 다양한 서열뿐만 아니라 다양하지만 정해진 길이를 갖는 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프를 갖는 Tn3을 코딩한다. 이들 연구의 초점인 FG 루프는 9개, 10개 또는 11개 잔기의 길이를 가질 수 있다. BC 루프는 9개, 11개 또는 12개 잔기의 길이를 가질 수 있다. 이 라이브러리에서 DE 루프는 6개 잔기의 고정된 길이를 갖는다. 서브클로닝된 라이브러리를 사용하여 DH5α 형질전환능(competent) 세포를 형질전환시키고, 이 세포로부터 플라스미드 풀을 정제하고 사용하여 BL21(DE3) 세포를 형질전환시켰다. BL21 콜로니를 서열분석하여 전장 Tn3을 코딩하는 96개의 클론을 확인하였다. 최종 96개의 클론을 표준 매직 메디아(Magic Media) 발현(접종 후 24시간 동안 37℃ 진탕)을 이용하여 500 ㎕ 규모로 96 딥 웰 플레이트 내에서 성장시키고 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 중간 내지 높은 발현도를 나타내는 29개의 무작위 클론을 50 ㎖ 규모 발현까지 규모 확대시키고 표준 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 모든 단백질의 본질을 질량 분광계로 확인하였다.
무작위 클론을 DSC로 안정성에 대해 분석하였다. 요약하건대, VP-캐필러리(Capillary) DSC(마이크로칼(MicroCal)) 상에서 DSC 측정을 수행하였다. 광범위한 투석을 통해 단백질을 PBS(pH 7.2) 내로 교환하고 DSC 분석을 위해 0.25 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 조절하였다. 스캔을 반복하지 않으면서 샘플을 시간당 90℃의 스캔 속도로 20℃ 내지 95℃에서 스캐닝하였다. 결과는 표 18에 제시되어 있다.
FG9를 갖는 Tn3 대 FG10/11을 갖는 Tn3의 Tm 값의 비교
FG9 T m (℃) FG10 /11 T m (℃)
A1 64.8 E12(FG10) 65.0
A3 71.8 F5(FG10) 60.0
B2 70.0 G1(FG11) 64.3
B4 69.4 G4(FG11) 67.6
C5 66.6 G8(FG11) 64.2
C7 66.0 H6(FG11) 70.3
C8 64.1 H7(FG11) 71.7
C11 59.5 H8(FG10) 61.9
D1 73.7 H9(FG10) 59.5
D8 72.1 H10(FG11) 67.6
D10 65.6 H11(FG11) 63.7
D11 65.6 H12(FG11) 65.6
D12 66.4
E1 75.0
E3 66.0
E9 75.3
E11 61.9
n=17 n=12
평균 67.9 평균 65.1
본 연구에서, 루프 길이 FG9 또는 FG10 및 FG11을 갖는 Tn3의 열안정성을 비교하였다. 길이 9의 FG 루프를 갖는 Tn3 도메인이 루프 길이 FG10 또는 FG11을 갖는 Tn3 도메인보다 더 열적으로 안정한 경향이 보였다. 대조군인 야생형 Tn3 도메인(10개 잔기의 FG 루프를 가짐)은 상기 샘플들과 동시에 시험되었을 때 72℃의 Tm을 나타내었다. 각각의 루프 길이에서 관찰된 Tm 값의 범위는 다른 요인들도 Tn3 도메인 열안정성의 결정에 있어서 일정한 역할을 수행한다는 것을 암시한다.
실시예 12
삼중특이적 Tn3의 발생 및 특징규명
이들 실험에서, 3종의 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 Tn3 분자를 발생시키고 특징규명하였다. 시나기스® 항체에 대해 특이적인 Tn3 도메인인 D1을 각각 TRAIL 수용체 2에 대해 특이적인 Tn3 도메인인 1E11 및 CD40L에 특이적인 Tn3 도메인인 79에 연결하였다(도 17a). 구축물을 BL21(DE3) 이. 콜라이 세포에서 발현시키고 표준 방법을 이용하여 정제하였다(도 17b 참조).
삼중특이적 구축물이 모든 3개 쌍의 표적에 동시적으로 결합할 수 있었는지를 확인하기 위해, 알파스크린 및 ELISA 실험 둘다를 수행하였다. 알파스크린 실험의 경우, 삼중특이적 Tn3, 총 3개의 표적 분자들 중 2개의 표적 분자의 서브셋(바이오티닐화된 한 표적 분자, 및 항체 Fc 영역을 함유하는 나머지 표적 분자), 단백질 A 공여자 비드 및 스트렙타비딘 수용자 비드를 전술된 바와 같이 384 웰 백색 옵티플레이트(Optiplate) 내에서 조합하였다. 알파스크린 신호는 스트렙타비딘 공여자 비드 및 단백질 A 수용자 비드가 서로 인접하게 위치하는 경우(서로 200 nm 이내에 위치하는 경우)에만 관찰될 수 있고, 이것은 본 분석에서 상기 삼중특이적 분자에 의한 가교형성을 통해 달성된다. huCD40L 및 TRAIL R2-Fc에 동시적으로 결합하는 D1-1E11-79의 능력(도 18a), 및 huCD40L 및 시나기스®에 동시적으로 결합하는 능력(도 18b)을 다음과 같이 알파스크린으로 확인하였다: 384 웰 백색 옵티플레이트 내에서 하기 성분들을 총 30 ㎕의 부피로 조합하였다: 20 mM의 정제된 D1-1E11-79, 50 mM의 바이오티닐화된 huCD40L, (0, 1, 2.5, 5, 10 또는 42 nM) TRAIL R2-Fc(도 18a) 또는 (0, 1, 2.5, 5, 10 또는 42 nM) 시나기스®(도 18b), 및 각각 5 ㎕의 알파스크린 단백질 A 수용자 비드 및 스트렙타비딘 공여자 비드의 1/50 희석물. 암실에서 1시간 동안 항온처리한 후, 상기 플레이트를 알파스크린 모드로 엔비전 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
시나기스® 및 TRAIL R2-Fc 둘다 Fc 도메인을 함유하기 때문에, 알파스크린 분석을 이용하여 이들 분자와 삼중특이적 구축물의 동시적인 결합을 입증할 수 없었다. 이를 대신하여, ELISA 실험을 수행하였다. 맥시소르프 플레이트를 TRAIL R2-Fc(1 ㎍/㎖ 농도의 100 ㎕)로 코팅하고 4% 우유로 차단한 후 다양한 농도의 삼중특이적 구축물을 첨가하였다. 제2 표적 리간드인 바이오티닐화된 시나기스®를 첨가하고, HRP-스트렙타비딘을 첨가하여 검출하였다(도 19). 도 19의 ELISA 결과에 의해 암시되는 바와 같이 D1-1E11-79도 TRAIL R2-Fc 및 시나기스® 둘다에 동시적으로 결합할 수 있는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명자들은 이 구축물이 모든 3개 쌍의 그의 표적들에 동시적으로 결합할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 13
선도(lead) 단리
작용제 Tn3의 개발에 있어서 제1 단계는 TRAIL R2에 결합할 수 있고 다가 포맷으로 연결된 경우 아폽토시스 경로를 이용하는 방식으로 2개 이상의 TRAIL R2 세포외 도메인에 결합할 수 있는 Tn3 단량체를 단리하는 것이다. 모든 결합제가 작용제로서 작용할 수 없기 때문에, 본 발명자들은 이차적 시험관내 세포 사멸 분석에서 결합제의 패널을 먼저 단리한 후 작용활성에 대해 스크리닝하기로 결심하였다. 본 발명자들은 결합제의 초기 패널을 단리하기 위해 재조합 TRAIL R2-Fc 상의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프에서의 변이를 갖는 Tn3의 큰 파지 표시 라이브러리를 먼저 패닝하였다. 이 라이브러리를 위한 기초로서 선택된 Tn3 스캐폴드는 테나신 C로부터의 천연 제3 FnIII 도메인이 아니었으나 안정성을 개선시키기 위해 조작된 이황화 결합을 갖는 버전이었다. BC 루프, DE 루프 및 FG 루프에서의 무작위화를 함유하는 사내 제조된(in house) Tn3/유전자 3 융합 파지 표시 라이브러리를 구축하였다. TRAIL R2가 플레이트 상에 직접적으로 코팅되어 있는 파지 ELISA에 의해 다수의 결합제가 발견되었고, PBS + 0.1% 트윈 20(PBST) + 1% 우유 중의 1:3 희석된 파지의 결합을 항-M13-과산화효소 접합된 항체(지이 헬쓰케어 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로 검출하였다. 대부분의 결합제가 루프들 중 하나에서 바람직하지 않은 자유 시스테인을 가졌고 추가 연구를 위해 선택되지 않았다. 짝을 이루지 않은 시스테인을 결여하는 클론의 서브셋을 발현 벡터 내로 클로닝하여 Fc 융합체 또는 항체 유사 구축물을 발생시켰고(도 1) 세포 사멸에 대해 종양 세포주 H2122에서 시험하였다(데이터는 나타내지 않음). Fc 융합체 포맷이 그의 융합된 Tn3과 관계없이 세포를 사멸시키지 못하였지만, 항체 유사 포맷은 1개 초과의 결합제에 대한 반응을 유발하였다.
실시예 14
친화 성숙
클론 1C12(서열번호 132)(도 20 참조)는 초기 스크리닝 분석에서 가장 우수한 세포 사멸을 보였으므로 친화 성숙을 위해 선택되었다. 친화 성숙은 쿤켈 돌연변이유발 또는 무작위화를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR을 이용하는 루프의 부분의 포화 돌연변이유발, 조립 및 파지 표시 벡터 내로의 라이게이션에 의해 수행되었다. 라운드 1 및 라운드 3은 BC 루프 및 FG 루프 각각의 부분의 포화 돌연변이유발로 구성되었고, 라운드 2는 모든 3개의 루프의 부분의 개별적인 포화 돌연변이유발, 패닝, 유전자 셔플링, 및 이어서 최대 친화성을 나타내는 최종 클론을 수득하기 위한 셔플링된 돌연변이체의 패닝을 조합하였다. 패닝 후, 친화 성숙된 클론의 풀을, 파지로부터 직접적으로 PCR로 회수하거나 퀴아젠 키트(퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)에 이어서 PCR을 이용하여 단일 가닥 DNA를 준비함으로써 회수하였다. PCR 생성물을 NcoI 및 KpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)으로 분해하고 본 발명자들의 사내 제조된 발현 벡터 pSEC 내로 클로닝하였다. 클론을 매직메디아(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 발현시키고 겔 상에서 런닝하여 발현이 클론 사이에서 크게 상이하지 않다는 것을 입증하였다. 플레이트가 4가 항체 유사 1C12(서열번호 154 및 서열번호 155)로 코팅되어 있는 경쟁 ELISA를 이용하여 개선된 클론을 확인하고, 매직메디아 중의 Tn3의 희석물의 존재 하에서 0.75 nM TRAIL R2 바이오틴의 결합의 억제를 스트렙타비딘-호스라디쉬 과산화효소(지이 헬쓰케어 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 측정하였다. TMB(KPL, 미국 매릴랜드주 게이터스버그 소재)를 첨가하고 산으로 중화시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
친화성 측정을 25℃에서 GLC 센서 칩을 사용하여 프로테온(ProteOn) XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템(바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재) 상에서 수행하였다. 0.005% 트윈 20을 함유하는 프로테온 인산염 완충 식염수(pH 7.4)(PBS/트윈)를 런닝 완충제로서 사용하였다. TRAIL R2를 상기 칩 상에 고정시키고, Tn3 결합제(1C12(서열번호 132), 1E11(서열번호 134), G3(서열번호 133), C4(서열번호 135) 및 G6(서열번호 138))의 2배 12점 연속 희석물을 36 μM 내지 700 nM의 출발 농도에서 PBS/트윈/0.5 ㎎/㎖ BSA(pH 7.4)로 제조하였다. 각각의 농도의 샘플을 30 ㎕/분의 유속으로 6개의 분석물 채널 내로 300초 동안 주입하였다. 프로테온 소프트웨어 내의 평형화 분석 셋팅을 이용하여 Kd를 측정하였다. 각각의 라운드로부터 수득된 가장 우수한 클론의 서열이 도 20에 제시되어 있다. 3개 라운드의 친화 성숙 후 친화성의 총 개선은 40 내지 50 nM 범위 내의 친화성을 나타내는 가장 우수한 클론의 경우 거의 두 자릿수 크기이었다(표 19).
표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되었을 때 선두 클론 1C12의 친화 성숙으로부터 수득된 가장 우수한 단량체 클론의 평형화 결합 상수
라운드 클론 K d (nM) 개선 배수
선도 단리 1C12 4130 ± 281
친화 성숙 1 G3 422 ± 45 10
친화 성숙 2 1E11 103 ± 9 40
친화 성숙 3 C4 50 ± 2 83
친화 성숙 3 G6 43 ± 2 96
실시예 15
항체 유사 포맷에서 효능에 대한 Tn3 친화성의 효과
효능에 대한 개별 Tn3 서브유닛의 친화성의 효과를 평가하기 위해, 표 19의 모든 클론을 도 1에 도시된 항체 유사 구축물로 리포맷팅하였다. 항체 유사 단백질을 발현시키기 위해, 293F 세포를 적절한 발현 구축물로 일시적으로 형질감염시켰다. 상청액의 회수를 6일째 날 및 10일째 날에 수행하고, 단백질을 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 모든 정제된 단백질을, 환원제를 사용하지 않으면서 MES 완충제 중의 누페이지 노벡스 4 내지 12% 비스 트리스 겔 상에서 SDS-PAGE로 분석하고 심플리블루 세이프스테인(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 가시화하였다.
또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제된 단백질을 분석하였고, 필요한 경우, 응집된 물질을 수퍼덱스 75 10/300GL 또는 수퍼덱스 200 10/300GL 컬럼(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서 총 단백질의 10% 미만의 최종 수준까지 제거하였다. 무스탕 E 막(팔 코포레이션, 미국 뉴욕주 포트 워싱톤 소재)을 갖는 아크로디스크 유닛을 제조자에 의해 지시된 바와 같이 사용하여 세균에 의해 발현된 단백질 제제로부터 내독소를 제거하였다.
그 다음, 셀타이터-글로 세포 생존력 분석을 이용하여 작용제성 항체 유사 구축물에 대한 민감성에 대해 H2122 세포를 시험하였다. 본 분석에서, 발광은 96 웰 플레이트의 주어진 웰 내의 ATP의 수준에 정비례하고, 상기 ATP 수준은 대사적 활성 생존 세포의 양에 정비례한다. H2122 세포주의 경우, 75 ㎕의 완전 배지(10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지) 중의 세포를 10,000개 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트 내에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 배지를 TRAIL R2 특이적 단백질 또는 음성 대조군 단백질의 연속 희석물이 함유된 25 ㎕의 추가 배지로 보충하였다. 모든 처리를 이중 웰에서 수행하였다. 상업적으로 입수가능한 TRAIL 리간드(케미콘/밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 TRAIL 수용체에 의해 유도된 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
72시간 후, 셀타이터-글로 키트를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 분석 발광을 엔비전 플레이트 판독기(퍼킨엘머, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재) 상에서 측정하였다. 처리된 세포에 대한 발광 값을 비처리된 생존 세포에 대한 평균 발광으로 나눔으로써 세포 생존력의 억제를 측정하였다.
2개의 변수가 효능을 결정한다: 구축물이 세포의 생존력을 50%까지 억제하는 농도(EC50), 및 세포 생존력의 최대 억제. 도 21은 G6이 1E11보다 낮은 EC50을 나타내고 1E11이 1C12보다 낮은 EC50을 나타내기 때문에 일반적으로 Tn3 단량체의 보다 높은 친화성이 항체 유사 구축물의 보다 낮은 EC50을 초래하는 경향이 있다는 것을 보여준다.
실시예 16
선형 Tn3의 약동학
선형 Tn3 직렬체의 반감기를 직렬체당 Tn3 모듈의 수의 함수로서 측정하기 위해, G6 단량체(서열번호 138), G6 직렬체 4(서열번호 143), G6 직렬체 6(서열번호 192) 및 G6 직렬체 8(서열번호 145)을 마누스 내로 주입하고, Tn3의 혈청 농도를 ELISA로 모니터링하였다. 투여 경로는 복강내(IP) 주입이었다. 실험 디자인은 표 20에 제시되어 있다. 마우스를 시점당 150 ㎕씩 채혈하였다. 사내 제조된 TRAIL R2로 코팅된 플레이트를 PBST 1% 우유에 희석된 혈청과 함께 항온처리하는 ELISA를 이용하여 혈청에서 Tn3을 검출하였다. 신호가 본 분석의 동적 범위 내에 있도록 하기 위해 초기 ELISA를 수행하여 주어진 시점에 대한 보정 희석 범위를 측정하였다. PBST 1% 우유 중의 토끼 다중클론 항-Tn3 혈청(코반스(Covance), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재)의 1/1,000 희석물을 사용한 후 PBST 1% 우유 중의 당나귀 항-토끼 HRP(잭슨 이뮤노리서치(ImmunoResearch), 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재)의 1/10,000 희석물을 사용하여 결합된 Tn3을 검출하였다. 각각의 구축물에 대해 표준 곡선을 작도하였다. 사내 통계학적 프로그램을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
용어 "최대 혈장 농도"("Cmax")는 시험 물질을 환자에게 투여한 후 혈장 중의 직렬 Tn3의 최대 관찰된 농도를 지칭한다.
용어 "Tmax"는 최대 혈장 농도 Cmax에 도달하는 데에 소요되는 시간을 지칭한다.
용어 "곡선 하의 면적"("AUC")은 혈장 중의 직렬 Tn3의 농도를 시간에 대하여 작도한 곡선에서 곡선 하의 면적이다. AUC는 시간 간격 동안 순간적인 혈장 농도(Cp)의 적분의 측정치일 수 있고 질량*시간/부피의 유닛을 갖는다. 그러나, AUC는 통상적으로 시간 간격 0 내지 무한대에 대해 제공된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "AUCinf"는 무한한 시간 전체로부터의 AUC를 지칭한다.
용어 "생물학적 반감기"("T1 /2")는 직렬 Tn3의 혈장 농도가 그의 원래의 값의 절반에 도달하는 데에 소요되는 시간으로서 정의된다.
용어 "CL/F"는 투여량/AUCinf로서 계산된 겉보기 전신 제거율을 지칭한다.
Tn3 생물학적 반감기(T1 /2)는 선형 분자당 직렬 Tn3의 수가 증가함에 따라 증가한다. 단량체로부터 직렬체 8을 제조하기 위한 7개의 Tn3의 첨가는 상기 반감기를 거의 50%까지 증가시켰다. 원자가의 증가는 Tmax에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 1부터 8까지 원자가의 증가는 Cmax 및 AUCinf를 각각 대략 10배 및 7배 증가시켰다. 나아가, 원자가가 1부터 8까지 증가하는 경우, 제거율(CL/F)의 대략 7배 감소가 관찰되었다.
항-TRAIL R2 선형 직렬체 약동학적 분석의 실험 디자인
군 # 시험 투여량 경로 부피 시점 # 마우스
1 G6 단량체 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
2 G6 직렬체 4 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
3 G6 직렬체 6 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
4 G6 직렬체 8 10 ㎎/㎏ IP 10 ㎖/㎏ (15분, 1시간, 16시간), (30분, 4시간, 24시간) (2시간, 6시간, 48시간) (3) (3) (3)
합계 36
직렬 Tn3의 약동학적 성질

시험 물질		 약동학적 파라미터
Cmax Tmax AUCinf T1/2 CL/F
(㎍/㎖) (시간(hr)) (시간(hr)·㎍/㎖) (시간(hr)) (㎖/시간(hr)/kg)
G6 단량체 3.65 1 9.31 1.22 1070
G6 직렬체 4 8.07 1 23.2 1.46 431
G6 직렬체 6 24.6 1 36.5 1.69 274
G6 직렬체 8 38.6 1 64.2 1.76 156
실시예 17
사이노몰구스 교차반응성의 조작된 향상
사이노몰구스 원숭이(필리핀 원숭이)에서의 임상전 독성 시험을 위해, 사이노몰구스 TRAIL R2(사이노 TRAIL R2)와 교차반응하는 항-TRAIL R2-Tn3을 개발하는 것이 바람직하다. 본 발명자들의 초기 친화 성숙된 선도 클론은 인간 TRAIL R2에 대한 상동성이 88%일지라도 사이노몰구스 TRAIL R2와의 낮은 교차반응성을 나타내었다. 친화 성숙으로부터 발생된 클론들 중에서 가장 우수한 사이노몰구스 교차반응성을 나타내는 클론인 클론 F4(서열번호 137)에 기초하여 라이브러리를 제조함으로써 교차반응성을 향상시켰다.
포화 돌연변이유발을 이용하여 2개의 라이브러리를 제조하였다: FG 루프에서만 다양성을 나타내는 라이브러리, 및 BC 루프 및 FG 루프에서 다양성을 나타내는 라이브러리. 또한, 오류율이 낮은 돌연변이유발성 PCR을 이용하여, 향상된 사이노몰구스 TRAIL R2 결합에 유리할 수 있는 돌연변이가 상기 루프 외부에서 일어나게 하였다. 사내 제조된 사이노몰구스 TRAIL R2에 대해 4개 라운드의 파지 패닝을 수행하였고, 결과물을 pSEC 발현 벡터 내로 클로닝하였다. ELISA 포맷으로 초기 히트(hits)를 스크리닝하기 위해, Tn3을 매직메디아(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 내로 분비시키고 항-his 태그 항체(알 앤드 디 시스템스(R and D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 상청액으로부터 포획하였다.
용액 중의 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 포획된 Tn3의 결합을 항-인간-Fc-HRP로 검출하였다. 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와의 유의한 결합을 갖고 인간 TRAIL R2-Fc와의 결합을 상실한 것으로 보이지 않는 클론을 후속 스크리닝 ELISA(이때, 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc는 플레이트 상에 코팅되어 있음)를 위해 선택하였고, Tn3 상청액을 적정한 후 항-his 태그 HRP로 검출하였다. 클론들 사이의 발현도에서의 변화도가 낮고 용액 중의 2가 TRAIL R2-Fc의 존재로부터 비롯된 친화력이 Tn3 친화성에서의 차이를 상쇄할 수 없었기 때문에, 이 ELISA는 친화 식별을 가능하게 하였다. 1개의 돌연변이, 즉 2개의 아미노산을 사이에 두고 DE 루프 앞에 존재하는, D로부터 G로의 돌연변이가 모든 조작된 사이노몰구스 교차반응성 클론들에 존재한다는 것이 발견되었다(도 23a). 이 D로부터 G로의 돌연변이를 원래의 F4 내로 도입하여 F4mod1(서열번호 193)로 명명된 클론을 제조하였고, 인간 TRAIL R2와의 결합을 상실하지 않으면서 사이노몰구스에 대한 교차반응성을 크게 개선시켰다(도 23b). 이 ELISA에서, 정제된 F4 또는 F4mod1에 의한 0.75 nM 인간 또는 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc와 F4mod1 코팅된 플레이트의 결합의 억제를 측정하였다.
사이노몰구스 교차반응성이 향상된 클론과 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc의 결합은 상기 클론과 인간 TRAIL R2-Fc의 결합의 10배 이내에 있는 것이 바람직하다. 또한, 사이노몰구스 교차반응성이 향상된 클론과 사이노몰구스 TRAIL R2-Fc의 결합은 F4와 인간 TRAIL R2-Fc의 결합의 10배 이내에 있는 것이 바람직하다. F4mod1과 사이노몰구스 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50은 F4mod1과 인간 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50과 3배 미만만큼 상이하다. 또한, F4mod1과 인간 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50은 F4와 인간 TRAIL R2의 결합에 대한 IC50보다 6배 더 강하다. 따라서, F4mod1은 의도된 교차반응성 요건을 충족시킨다.
실시예 18
향상된 사이노몰구스 교차반응성 클론의 생식세포주 조작
가능한 면역원성 위험을 감소시키기 위해 생식세포주로부터 비필수 돌연변이를 제거하도록 클론 F4mod1을 추가로 조작하였다. 인간 TRAIL R2 및 사이노몰구스 TRAIL R2 둘다와의 결합에 대한 주어진 돌연변이로부터의 효과가 있는지를 확인하기 위해 12개의 상이한 변형의 패널을 제조하였다. 도 24a는 결합에 영향을 미치지 않는 모든 시험된 생식세포주 돌연변이가 도입된 최종 클론 F4mod12(서열번호 194)를 다른 구축물, 즉 Tn3 생식세포주, 원래의 F4 모 클론 및 클론 F4mod1(조작된 초기 향상된 사이노몰구스 교차반응성)과 비교하여 보여준다.
F4mod12의 아미노산 서열은 천연 Tn3 서열 SQ로 시작되고 L로 종결되고, A로부터 T로의 골격 2 돌연변이의 복귀를 갖고, TA로부터 NQ로의 DE 루프의 최종 2개 아미노산의 복귀를 갖는다. 도 24b는 F4, F4mod1 및 F4mod12 모두가 이들과 인간 TRAIL R2의 결합에 있어서 서로 6배 이내에 있음을 보여준다. 또한, 상기 도면은 F4mod1 및 F4mod12가 이들과 사이노몰구스 TRAIL R2의 결합에 있어서 서로 2배 이내에 있음을 보여준다.
F4mod12를 직렬체 6(서열번호 167) 구축물 및 직렬체 8(서열번호 166) 구축물로 리포맷팅하였고 G6 직렬체 6(서열번호 144) 및 직렬체 8(서열번호 145)에 비해 상대적으로 효능의 상실이 없는지를 확인하기 위해 시험하였다. 도 24c 및 도 24d는 생식세포주 조작된 향상된 사이노몰구스 교차반응성 F4mod12 직렬체의 경우 콜로205 세포주에서 G6 직렬체에 비해 효능의 상실이 없다는 것을 보여준다.
실시예 19
TRAIL 내성 세포주에서 G6 직렬체 8의 활성
다수의 세포주가 TRAIL에 의한 사멸에 대한 내성을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 TRAIL 민감성 세포주에서 TRAIL에 비해 상대적으로 향상된 G6 직렬체 8 구축물의 효능이 TRAIL 내성 세포주에서 G6 직렬체 8의 효능으로 해석될 것인지를 평가하였다. 여러 암세포주에서 Apo2L/TRAIL에 대한 민감성을 셀타이터-글로 발광 세포 생존력 분석(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)으로 측정하였다. 요약하건대, 세포를 96 웰 플레이트 내에 플레이팅하고 밤새 부착시킨 후, 10% FBS를 함유하는 배지 중의 다양한 농도의 재조합 인간 Apo2L/TRAIL 및 TRAIL 모방체 G6 직렬체 8로 처리하였다. 48 내지 72시간 후, 세포 생존력을 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 도 25는 TRAIL 내성 세포주 HT29의 경우 G6 직렬체 8이 강력한 세포 사멸 활성을 보이는 반면, TRAIL은 그러하지 않다는 것을 보여주다. 표 22는 G6 직렬체 8이 모든 시험된 TRAIL 내성 세포주에서 세포 사멸 활성을 나타내는 것은 아니지만 대부분의 시험된 TRAIL 내성 세포주에서 세포 사멸 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.
TRAIL 내성 세포주에서 G6 직렬체 8 및 TRAIL의 활성
TRAIL
IC50[nM]		 G6 직렬체 8
IC50[nM]		 TRAIL
% 최대 사멸		 G6 직렬체 8
% 최대 사멸
TRAIL에 대해서는 내성을 나타내지만 TRAIL 모방체에 대해서는 민감성을 나타냄 T84 >8.3 0.247 14.44 71.53
LoVo >8.3 0.005 45.99 74.22
CaCo-2 >8.3 0.044 18.23 54.84
HT29 >8.3 0.01 28.00 85.40
HPAF-II >8.3 0.06 45.33 91.33
Hep3B >8.3 0.23 13.35 70.15
SKHEP-1 >8.3 0.055 19.48 80.19
HepG2 >8.3 0.040 33.31 84.00
TRAIL 및 TRAIL 모방체에 대해 내성을 나타냄 SW620 >8.3 >10 -5.71 4.65
SW837 >8.3 >10 19.98 25.32
Hs766T >8.3 >10 20.99 47.86
NCI-H522 >8.3 >10 32.69 31.38
NCI-H23 >8.3 >10 22.08 39.59
BT-549 >8.3 >10 4.49 27.99
SNB-75 >8.3 >10 8.9 4.7
786-O >8.3 >10 -0.12 7.19
SNU-387 >8.3 >10 -0.63 33.1
SNU-475 >8.3 >10 0.49 20.88
SNU-398 >8.3 >10 1.50 0.46
실시예 20
TRAIL R2 결합 단량체의 면역원성 연구
면역원성은 인간으로부터 유래된 것일지라도 임의의 치료 단백질에 있어서 잠재적인 문제이다. 면역원성 반응은 염증을 초래할 수 있는 중화 항체를 통해 효능을 제한할 수 있다. 면역 반응의 발달에 있어서 가장 중요한 요인들 중 하나는 CD4+ T 세포 증식을 자극할 수 있는 에피토프의 존재이다. 에피스크린(EpiScreen) 시험(안티토프(Antitope), 영국 캠브리지 소재)에서, CD8+ T 세포 고갈된 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 시험 단백질과 함께 항온처리하고, CD4+ T 세포 증식 및 IL-2 분비를 모니터링한다(문헌(Baker & Jones, Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 10:219-227, 2007); 문헌(Jaber & Baker, J. Pharma. Biomed. Anal. 43:1256-1261, 2007); 문헌(Jones et al., J. Thrombosis and Haemostasis 3:991-1000, 2005); 및 문헌(Jones et al., J. Interferon Cytokine Res. 24:560-72, 2004) 참조). 전세계 인구에서 발현되는 HLA-DR 동종이형을 대표하는 공여자 풀로부터 PBMC를 단리한다.
도 26에 나타낸 Tn3 단량체를 (GGGGHHHHHHHH 링커-His 태그를 갖도록) 발현시키고 정제하고 SEC로 단량체임을 입증하고, 전술된 바와 같이 내독소 제거를 위해 여과하였다. 시험된 모든 비야생형 클론은 사이노몰구스 교차반응성을 향상시키기 위한 조작 라운드로부터 수득되었다(도 23a). 그러나, 이들 클론은 F4mod1 배경(background)에서 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀진 생식세포주에 대한 돌연변이를 가졌다. 생식세포 돌연변이가 결합에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하기 위해 이들 클론을 ELISA에서 시험하였다. T 세포 증식 분석 및 IL-2 분비 분석 둘다에서, 2 초과의 자극 지수(SI)는 주어진 공여자에 대한 양성 반응으로서 이미 확립되어 있었다. 평균 SI 또는 양성 반응 집단의 SI의 평균은 반응의 강도를 표시한다. 강한 반응을 유도하는 것으로 공지된 대조군 단백질인 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 두 분석에 포함시켰다.
표 23은 KLH에 대한 평균 SI보다 유의하게 더 낮고 양성 평균 SI에 대한 2의 컷오프보다 훨씬 더 높지 않은, 모든 시험 단백질에 대한 평균 SI를 보여준다. 추가로, 시험 단백질에 대한 반응 빈도는 매우 낮았다(90% 초과의 반응을 나타내는 대조군을 제외한 모든 시험된 단백질에 대해 10% 이하). 안티토프에 의한 선행 연구는 10% 미만의 에피스크린 반응이 낮은 임상적 면역원성 위험을 표시한다는 것을 보여주었다. 따라서, 시험된 모든 Tn3이 10% 이하의 반응 빈도를 나타낸다는 본 발명자들의 관찰은 임상적 면역원성의 낮은 위험을 표시한다.
안티토프 에피스크린 면역원성 분석의 결과. 시험된 Tn3은 1(가장 높은 면역원성) 내지 4(가장 낮은 면역원성)로 등급이 매겨진다.
평균 SI 반응의 빈도(%)
샘플 증식 IL-2 증식 IL-2 등급
F4mod12 2.82 2.30 4 4 4=
00322S-A07 2.91 2.06 8 8 2
00322S-G09 2.88 2.26 10 10 1
00322V-A10 2.67 2.33 8 6 3=
00322V-F11 3.14 2.37 6 6 3=
야생형 2.05 2.00 6 4 4=
KLH 6.51 3.98 96 92 N/A
실시예 21
비정제된 G6 직렬체 8 Tn3 및 정제된 G6 직렬체 8 Tn3의 응집 상태
다수의 시스테인을 함유하는 단백질, 예를 들면, 내부 이황화 결합을 함유하는 직렬 반복체로 구성된 단백질은 종종 적절한 이황화 결합 쌍 형성을 나타내지 않는다. 이황화 결합의 뒤섞임(Scrambling)은 배지 내로의 발현을 감소시키거나 제거할 수 있다. 상기 단백질은 배지 내로 발현되는 경우, 응집을 초래하는 분자간 이황화 결합 쌍 및 불일치된 분자내 이황화 결합 쌍을 갖는 부적절하게 폴딩된 단백질의 혼합물일 수 있다. 본 발명자들의 SEC 데이터는 세균 발현 배지 중의 대부분의 직렬 단백질이 적절하게 폴딩된 단량체 상태로 존재한다는 것을 보여주었다. Hi 태그 부착된 G6 직렬체 8 단백질의 Ni-NTA 정제 후, 대략 15%의 단백질이 응집되었다. 관찰된 응집은 2 mM DTT를 사용한 환원에 의해 4%까지 감소되었는데(도 27a), 이것은 대부분의 응집이 이황화 결합에 의해 매개되었다는 것을 암시한다. 대부분의 응집체를 전술된 바와 같이 SEC 정제로 제거하였다(도 27b).
실시예 22
콜로205 대장암 이종이식편 모델에서 TRAIL 모방체, G6TN6 및 G6TN8에 의한 종양 성장 억제의 측정
TRAIL Tn3 모방체, G6 직렬체 6(G6TN6)(서열번호 144) 및 G6 직렬체 8(G6TN8)(서열번호 145)의 항종양 활성을 인간 대장암종 이종이식편 모델인 콜로205에서 평가하였다. 콜로205 세포를 37℃에서 5% CO2 하에서 10% 태아소 혈청(FBS) 함유 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지에서 반부착성 단일층 배양물로서 유지하였다. 트립신처리에 의해 회수된 세포를 3x107개 세포/㎖의 최종 농도로 행크의 균형잡힌 염 용액(HBSS)에 재현탁시켰다. 3x106개 콜로205 세포를 무흉선 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리에 각각 피하 주사하였다(SC). 종양의 크기가 평균 약 177 ㎣에 도달하였을 때 연구를 개시하였다. 연구 디자인은 표 24에 요약되어 있다. 20 mM Tris-HCl 및 300 mM 아르기닌-HCl(pH 7)을 함유하는 저장 용액으로부터 TRAIL을 희석하고, 체중(10 ㎖/㎏)에 따라 총 5회 투약을 위해 표 24에 기재된 투여량으로 매일 정맥내 투여하였다(IV). PBS를 함유하는 저장 용액으로부터 G6 직렬체 6(G6TN6) 및 G6 직렬체 8(G6TN8)을 각각 희석하고, 체중(10 ㎖/㎏)에 따라 총 5회 투약을 위해 표 24에 기재된 투여량으로 매일 정맥내 투여하였다(IV). 종양 부피 및 체중 측정을 기록하였다. 전기 칼리퍼(caliper)를 이용하여 종양 측정을 수행하였고, 하기 식을 이용하여 종양 부피(㎣)를 계산하였다: 종양 부피 = [길이(㎜) x 폭(㎜)2]/2. 하기 식을 이용하여 종양 성장 억제(TGI)를 퍼센트 TGI로서 계산하였다: 퍼센트 TGI = (1 - T/C) x 100(이때, T는 마지막 투약 후 처리된 군으로부터의 최종 종양 부피이고, C는 마지막 투약 후 대조군으로부터의 최종 종양 부피임).
투약 주기(DP) 동안(도 28), 3 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏의 G6TN6은 각각 92%(p<0.0001) 및 93%(p<0.0001)의 유의한 TGI를 달성하였다(표 25). 유사하게, 최종 농도에 대한 등몰 조절 후, 2.25 ㎎/㎏ 및 25.5 ㎎/㎏의 G6TN8은 각각 93%(p<0.0001) 및 94%(p<0.0001)의 유의한 TGI를 달성하였다(표 25). 30 ㎎/㎏의 TRAIL은 60%(p<0.001)의 TGI를 달성하였다(표 25).
재성장 주기(RP)의 34일째 날까지(도 28), 3 ㎎/㎏의 G6TN6은 임의의 CR(완전한 퇴행)을 달성하지 못하였지만, 2.25 ㎎/㎏의 G6TN8은 90% CR을 달성하였다. 보다 높은 투여량인 30 ㎎/㎏의 G6TN6에서 50% CR이 달성되었다. 다른 한편으로, 25.5 ㎎/㎏의 G6TN8은 100%의 CR을 달성하였다(표 26). 상기 두 투여량으로부터의 결과는 G6TN8이 G6TN6에 비해 더 높은 효능을 달성하였다는 것을 암시한다. 그러나, 이들 둘다가 일정 투여량에서 효능을 보였다. 보다 중요하게는, 상기 구축물 둘다가 임의의 PR 또는 CR을 달성하지 못하는 TRAIL을 유의하게 능가하였다.
도 29에 나타낸 바와 같이, 연구의 투약 주기 및 재성장 주기 동안 모든 투여량에서 G6TN6 및 G6TN8 둘다에 대해 체중 감소가 관찰되지 않았다.
콜로205 종양 이종이식편 모델에서 TRAIL 및 TRAIL 모방체(G6TN6 및 G6TN8)에 대한 연구 디자인
군 시험 물질 투여량
(㎎/㎏) 		투약 부피
(㎖/㎏) 		경로 투약 스케쥴
1 비처리됨 NA NA NA NA
2 PBS NA 10 IV QDX5
3 TRAIL 30 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
4 G6TN6 30 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
5 G6TN6 3 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
6 G6TN8 25.5 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
7 G6TN8 2.25 ㎎/㎏ 10 IV QDX5
연구의 투약 주기 동안 TGI에 대한 TRAIL 및 TRAIL 모방체(G6TN6 및 G6TN8)의 효과
처리군 % TGI P 값( 비처리된 대조군과 비교됨)
TRAIL 30 ㎎/㎏ 60 P<0.001
G6TN6 30 ㎎/㎏ 93 P<0.0001
G6TN6 3 ㎎/㎏ 92 P<0.0001
G6TN8 25.5 ㎎/㎏ 94 P<0.0001
G6TN8 2.25 ㎎/㎏g 93 P<0.0001
연구의 34일째 날까지 재성장 주기 동안 TGI에 대한 TRAIL 및 TRAIL 모방체(G6TN6 및 G6TN8)의 효과
처리군 PR a (%) CR b (%)
TRAIL - -
G6TN6 30 ㎎/㎏ 50 50
G6TN6 3 ㎎/㎏ 100 -
G6TN8 25.5 ㎎/㎏ - 100
G6TN8 2.25 ㎎/㎏ 10 90
a퍼센트 부분적 퇴행(PR; 종양 부피가 2회 연속 측정 동안 단계 개시 시점에서의 부피의 50% 미만인 군 내의 마우스의 백분율)
b퍼센트 완전한 퇴행(CR; 2회 연속 측정 동안 검출가능한 감지될 수 있는 종양이 없는 군 내의 마우스의 백분율)
실시예 23
추가 표적과의 결합
특정 표적에 결합하는 FnIII 스캐폴드는 본원에 기재되어 있고/있거나 당업계에서 공지되어 있는(예를 들면, 국제특허공보 제WO2009/058379호 참조) 방법에 의해 발생될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 스캐폴드는 공지된 결합 특이성을 나타내는 스캐폴드의 루프 서열이 원하는 스캐폴드의 베타 가닥 서열(예를 들면, Tn3 스캐폴드의 베타 가닥 서열 또는 도 16에 제시된 서열)에 이식되는 "루프 이식"으로 처리될 수 있다. 표 27은 원하는 베타 가닥, 예를 들면, 표 1에 제공된 베타 가닥에 이식될 루프 서열의 비한정적인 예를 제공한다.
Figure pct00007
Figure pct00008

상기 실시예는 본 발명의 다양한 양태 및 본 발명의 방법의 실시를 예시한다. 상기 실시예는 본 발명의 많은 상이한 실시양태의 완전한 설명을 제공하기 위한 것이 아니다. 따라서, 상기 본 발명이 명확한 이해를 목적으로 예증 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있다 하더라도, 당업계에서 통상의 기술을 가진 자는 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 많은 변화 및 변형을 달성할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 본원에 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 기재되어 있는 것과 동일한 정도로 본 명세서 내로 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mediummune <120> FIBRONECTIN TYPE III DOMAIN-BASED MULTIMERIC SCAFFOLDS <130> 2943.011PC01 <150> 61/323,708 <151> 2010-04-13 <160> 270 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Disulfide-bonded variant <400> 1 Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe 1 5 10 15 Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys 20 25 30 Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn 35 40 45 Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser 50 55 60 Leu Ile Cys Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Thr <210> 2 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Disulfide-bonded variant <400> 2 Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe 1 5 10 15 Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys 20 25 30 Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn 35 40 45 Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro 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Pro Gly Ala Phe Asp Ser Phe Leu Leu Arg Phe Gly Val Pro 20 25 30 Ser Pro Ser Thr Leu Glu Pro His Pro Arg Pro Leu Leu Gln Arg Glu 35 40 45 Leu Met Val Pro Gly Thr Arg His Ser Ala Val Leu Arg Asp Leu Arg 50 55 60 Ser Gly Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Leu Tyr Gly Leu Arg Gly Pro His 65 70 75 80 Lys Ala Asp Ser Ile Gln Gly Thr Ala Arg Thr 85 90 <210> 12 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Arg Ala Leu Asn Leu Thr Glu Gly Phe Ala Val Leu His Trp Lys 1 5 10 15 Pro Pro Gln Asn Pro Val Asp Thr Tyr Asp Ile Gln Val Thr Ala Pro 20 25 30 Gly Ala Pro Pro Leu Gln Ala Glu Thr Pro Gly Ser Ala Val Asp Tyr 35 40 45 Pro Leu His Asp Leu Val Leu His Thr Asn Tyr Thr Ala Thr Val Arg 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ile Thr Phe Thr 65 70 75 80 Thr <210> 13 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Glu Ala Lys Glu Val Thr Pro Arg Thr Ala Leu Leu Thr Trp Thr 1 5 10 15 Glu Pro Pro Val Arg Pro Ala Gly Tyr Leu Leu Ser Phe His Thr Pro 20 25 30 Gly Gly Gln Thr Gln Glu Ile Leu 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Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr 65 70 75 80 Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val 85 90 <210> 16 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Pro Ser Gly Phe Pro Gln Asn Leu His Val Thr Gly Leu Thr Thr Ser 1 5 10 15 Thr Thr Glu Leu Ala Trp Asp Pro Pro Val Leu Ala Glu Arg Asn Gly 20 25 30 Arg Ile Ile Ser Tyr Thr Val Val Phe Arg Asp Ile Asn Ser Gln Gln 35 40 45 Glu Leu Gln Asn Ile Thr Thr Asp Thr Arg Phe Thr Leu Thr Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Asp Thr Thr Tyr Asp Ile Lys Val Arg Ala Trp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Gly Ser Gly Pro Leu Ser Pro Ser Ile Gln Ser Arg Thr Met Pro Val 85 90 95 Glu <210> 17 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Pro Lys Pro Pro Ile Asp Leu Val Val Thr Glu Thr Thr Ala Thr Ser 1 5 10 15 Val Thr Leu Thr Trp Asp Ser Gly Asn Ser Glu Pro Val Thr Tyr Tyr 20 25 30 Gly Ile Gln Tyr Arg Ala Ala Gly Thr Glu Gly Pro Phe Gln Glu Val 35 40 45 Asp Gly Val Ala Thr Thr Arg Tyr Ser Ile Gly Gly Leu Ser Pro Phe 50 55 60 Ser Glu Tyr Ala Phe Arg Val Leu Ala 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85 90 <210> 22 <211> 89 <212> PRT <213> Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 <400> 22 Pro Pro Pro Lys Pro Val Ile Arg Phe Ala Gln Ala Gly Asn Asn Ser 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ser Trp Tyr Asp Thr Asn Thr Ser Gly Tyr Tyr Ile Gln 20 25 30 Trp Trp Ser Ser Ile Asp Asn Asn Lys Ser Thr Ile Asn Val Gly Asn 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Phe Ile Asn Leu Thr Asn Gly Val Thr Tyr Tyr 50 55 60 Phe Arg Ile Ile Pro Tyr Asn Gln Ala Gly Asn Gly Thr Ser Ser Asp 65 70 75 80 Ile Ile Ser Leu Thr Pro Gly Ala Val 85 <210> 23 <211> 89 <212> PRT <213> Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 <400> 23 Pro Asp Ser Pro Ser Val Lys Val Ile Val Gly Asp Arg Asn Ala Thr 1 5 10 15 Val Ile Trp Ser Lys Pro Tyr Asn Gly Gly Phe Pro Ile Leu Gly Tyr 20 25 30 Tyr Leu Thr Val Lys Thr Asp Asn Ser Ser Tyr Thr Ile Asn Val Gly 35 40 45 Asn Val Ser Lys Tyr Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Glu Val Leu Tyr 50 55 60 Glu Val Met Val Val Ala Tyr Asn Lys Leu Gly Asn Ser Ser Pro Gly 65 70 75 80 Ile Val Asn Phe Val Ala Leu Thr Thr 85 <210> 24 <211> 87 <212> PRT <213> Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 <400> 24 Leu Thr Thr Ala Ser Ile Ser Val Ser Val Tyr Lys Lys Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Leu Ile Ser Trp Asn Lys Thr Glu Asn Thr Thr Tyr Asn Leu Leu 20 25 30 Ile Ser Asp Lys Lys Gly Lys Ile Ile Val Asn Ile Thr Thr Thr Asn 35 40 45 Thr Ser Tyr Phe Ala Tyr Ile Pro Tyr Gly Ile Tyr Asn Val Thr Ile 50 55 60 Arg Ala Thr Asn Gln Val Gly Thr Asn Ser Thr Ser Phe Pro Ile Val 65 70 75 80 Phe Tyr Ile Pro Pro Phe Ile 85 <210> 25 <211> 84 <212> PRT <213> Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 <400> 25 Pro Leu Val Lys Phe Ser Ile Gly Asn Asn Ser Ile Leu Asn Leu Lys 1 5 10 15 Trp Asn Asn Val Thr Gly Ala Thr Phe Tyr Leu Val Tyr Val Asn Thr 20 25 30 Thr Leu Ile Ala Asn Val Thr Thr Asp Ser Tyr Ser Leu Asn Leu Thr 35 40 45 Pro Gly Phe His Val Ile Arg Val Val Ala Ala Asn Pro Ile Tyr Asn 50 55 60 Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gly Ile Leu Ile Gln Gln His Ser Val Thr 65 70 75 80 Ser Ser Ile Thr <210> 26 <211> 88 <212> PRT <213> Sulfolobus solfataricus P2 <400> 26 Pro Leu Pro Pro 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aaggctacgc agg 33 <210> 116 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 116 gggatccgct acgggccact cgatcgaggt ccgtgctgat cgagcgatcg gtaccctggg 60 ccatcatcat catcatcacc accactgag 89 <210> 117 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 117 aattctcagt ggtggtgatg atgatgatga tggcccaggg taccgatcgc tcgatcagca 60 cggacctcga tcgagtggcc cgtagcggat cccgtac 97 <210> 118 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 118 ggcgctaggc tgagtaggtc ctggggatcc gccatggcca gc 42 <210> 119 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 119 ggcgctaggc tgagtaggtc ctggctagct gccatggcca gc 42 <210> 120 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 120 cctcagccga tcaccacctg aaggcggcgc cggtacc 37 <210> 121 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 121 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcgga ggttcacgct tggatgcccc cgggcagatt 60 gaagtgaaag atgtgaccga t 81 <210> 122 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 122 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcgga ggttcaggtg gcggaggttc aggtggcgga 60 ggttcacgct tggatgcccc cgggcagatt gaagtgaaag atgtgaccga t 111 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 123 ctgcagtggt aaaggtttct ttcg 24 <210> 124 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 124 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcggg ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg 60 ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg ggtagccgct tggatgcccc cgggca 116 <210> 125 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 125 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcggg ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg 60 ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg ggtagcggtg gcggaggttc tggtggcggg 120 ggtagccgct tggatgcccc cgggca 146 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 126 aaagaaacct ttaccactgc aggt 24 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 127 ttcaatctgc ccgggggcat ccaa 24 <210> 128 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 128 aaagaaacct ttaccaccac gcgtttggat gcccccgggc agattgaagt gaaagatgtg 60 accgat 66 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 129 cgtggtggta aaggtttctt tcg 23 <210> 130 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 130 aaagaaacct ttaccactgc aggtggcgga ggttcaggtg gcggaggttc acgcttggat 60 gcccccgggc agattgaagt gaaagatgtg accgat 96 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Cys Glu Leu Ala Tyr Gly Ile 1 5 <210> 132 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Ala Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Glu Lys Trp Asp Gly Ser Ile Tyr Gly Cys Glu Leu Ala 20 25 30 Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Asn 35 40 45 Ser Arg His Thr Ala Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu 50 55 60 Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Thr Pro Tyr Gly Ala Lys Ser Asn 65 70 75 80 Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 133 <211> 102 <212> PRT 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Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Met Lys Ser 65 70 75 80 Lys Pro Ser Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu 85 90 <210> 209 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr 1 5 10 15 Trp Ala Lys Pro Trp Val Asp Pro Pro Pro Leu Trp Gly Cys Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gln Gln Lys His Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Phe Asp Pro Tyr Gly Leu Lys Ser 65 70 75 80 Arg Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 210 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Val Thr Leu Arg Gly Asp Trp Ser Glu Asp Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 211 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Val Thr Val Arg Gly Asp Trp Tyr Glu Tyr Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 212 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Val Thr Gly Arg Gly Asp Trp Thr Glu His Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 213 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Val Thr Ala Arg Gly Asp Trp Val Glu Gly Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 214 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Val Thr Pro Arg Gly Asp Trp Thr Glu Gly Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 215 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Val Thr Pro Arg Gly Asp Trp Ile Glu Phe Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 216 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Val Thr Gly Arg Gly Asp Trp Asn Glu Gly Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 217 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Val Thr Phe Arg Gly Asp Trp Ile Glu Leu Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 218 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Val Ala Ala Thr Pro Trp Thr Trp Val Leu Arg Glu Thr Ser 1 5 10 <210> 219 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Val Ala Ala Thr Pro Trp Val Leu Ile Thr Arg Ser Thr Ser 1 5 10 <210> 220 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Asp Ala Pro Trp Tyr Gln Gly Arg Tyr 1 5 <210> 221 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Val Thr Gly Arg Leu Arg Ala Gln Leu Val Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 222 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Asp Ala Pro Pro Arg Thr Lys Gln Tyr 1 5 <210> 223 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Val Thr Gly Arg Leu Arg Asp Leu Leu Gln Ser Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 224 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Val Thr Gly Leu Val Arg Phe Arg Val Val Asn Ser Ser Leu Cys Met 1 5 10 15 Trp Ala Arg Ser Lys Pro Ile 20 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr 1 5 <210> 226 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Pro Leu Gln Pro Pro Leu 1 5 <210> 227 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Val Thr Lys Glu Arg Asn Gly Arg Glu Leu Phe Thr Pro Ile 1 5 10 <210> 228 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Pro Leu Gln Pro Pro Thr 1 5 <210> 229 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser Ile Pro Ile 1 5 10 <210> 230 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Val Thr Met Gly Leu Tyr Gly His Glu Leu Leu Thr Pro Pro Ile 1 5 10 15 <210> 231 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Val Thr Asp Gly Glu Asn Gly Gln Phe Leu Leu Val Pro Ile 1 5 10 <210> 232 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 His Glu Arg Asp Gly Ser Arg Gln Tyr 1 5 <210> 233 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Pro Gly Gly Val Arg Thr 1 5 <210> 234 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Val Thr Asp Tyr Phe Asn Pro Thr Thr His Glu Tyr Ile Tyr Gln Thr 1 5 10 15 Thr Pro Ile <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 Trp Ala Pro Val Asp Arg Tyr Gln Tyr 1 5 <210> 236 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Pro Arg Asp Val Tyr Thr 1 5 <210> 237 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Val Thr Asp Tyr Lys Pro His Ala Asp Gly Pro His Thr Tyr His Glu 1 5 10 15 Ser Pro Ile <210> 238 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 238 Thr Gln Gly Ser Thr His Tyr Gln Tyr 1 5 <210> 239 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Pro Gly Met Val Tyr Thr 1 5 <210> 240 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 240 Val Thr Asp Tyr Phe Asp Arg Ser Thr His Glu Tyr Lys Tyr Arg Thr 1 5 10 15 Thr Pro Ile <210> 241 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 241 Tyr Trp Glu Gly Leu Pro Tyr Gln Tyr 1 5 <210> 242 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 242 Pro Arg Asp Val Asn Thr 1 5 <210> 243 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 243 Val Thr Asp Trp Tyr Asn Pro Asp Thr His Glu Tyr Ile Tyr His Thr 1 5 10 15 Ile Pro Ile <210> 244 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 244 Ser Pro Tyr Leu Arg Val Ala Arg Tyr 1 5 <210> 245 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 Pro Ser Ser Ala Arg Thr 1 5 <210> 246 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 246 Val Thr Pro Ser Asn Ile Ile Gly Arg His Tyr Gly Pro Ile 1 5 10 <210> 247 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Val Asn Asp Pro Gln Arg Asn Arg Tyr 1 5 <210> 248 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Pro Ala Tyr Tyr Pro Thr 1 5 <210> 249 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Val Thr Tyr Ser His Ile Lys Tyr Leu Tyr His Lys Pro Ile 1 5 10 <210> 250 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Ser Asp Ser Leu Lys Val Ser Arg Tyr 1 5 <210> 251 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Pro Lys Gln Tyr His Thr 1 5 <210> 252 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Val Thr Pro Ser Asn Ile Ile Gly Arg His Tyr Gly Pro Ile 1 5 10 <210> 253 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Ser Ala Pro Leu Lys Val Ala Arg Tyr 1 5 <210> 254 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Pro Lys Asn Val Tyr Thr 1 5 <210> 255 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Val Thr Lys Met Arg Asp Tyr Arg Pro Ile 1 5 10 <210> 256 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 257 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 <210> 258 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 258 Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser 1 5 <210> 259 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala 1 5 <210> 260 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 260 Pro Gly Ser Glu Arg Ser 1 5 <210> 261 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 261 Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu 1 5 <210> 262 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Val Lys Gly Gly His Arg Ser Asn Pro Leu 1 5 10 <210> 263 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val 1 5 <210> 264 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 264 Leu Val Val 1 <210> 265 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 265 Leu Arg Leu Ser Trp 1 5 <210> 266 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 266 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu 1 5 <210> 267 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 267 Ile Asn Leu Thr Val 1 5 <210> 268 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 268 Tyr Asp Leu 1 <210> 269 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 269 Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly 1 5 <210> 270 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 270 Ser Ala Glu Phe Thr Thr 1 5

Claims (76)

1개 이상의 관심있는 피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인(FOI)으로부터 유래된 2개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하는 재조합 다량체 스캐폴드로서,
(a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고,
(b) 상기 FnIII 단량체 스캐폴드는 직렬(tandem)로 연결되어 있고, 이때 1개 이상의 단량체가 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고,
(c) 상기 재조합 다량체 스캐폴드는 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고,
(d) 상기 표적에 대한 작용이 동족(cognate) FnIII 단량체 스캐폴드의 작용에 비해 개선되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항에 있어서, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하는 재조합 다량체 스캐폴드.
제2항에 있어서, 모든 FnIII 단량체 스캐폴드가 선형 직렬 포맷(format)으로 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 표적에 결합하는 재조합 다량체 스캐폴드.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 직접적으로, 링커에 의해, 또는 이종 모이어티(moiety)에 의해 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 다른 FnIII 단량체 스캐폴드에 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제6항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 링커에 의해 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 이들 FnIII 단량체 스캐폴드 사이에 개재된 링커 없이 직접적으로 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
1개 이상의 관심있는 피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인(FOI)으로부터 유래된 3개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하는 재조합 다량체 스캐폴드로서,
(a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고,
(b) 상기 재조합 다량체 FnIII 스캐폴드는 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고,
(c) 상기 표적에 대한 작용이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 작용에 비해 개선되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제9항에 있어서, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 포함하는 재조합 다량체 스캐폴드.
제10항에 있어서, 모든 FnIII 단량체 스캐폴드가 선형 직렬 포맷으로 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 표적에 결합하는 재조합 다량체 스캐폴드.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 직접적으로, 링커에 의해, 또는 이종 모이어티에 의해 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 다른 FnIII 단량체 스캐폴드에 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 링커에 의해 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 이들 FnIII 단량체 스캐폴드 사이에 개재된 링커 없이 직접적으로 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드 내의 복수의 베타 가닥이 A, B, C, D, E, F 및 G로 명명된 7개의 베타 가닥을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드 내의 복수의 루프 영역이 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로 명명된 6개의 루프 영역을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드의 결합이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 결합에 비해 개선되어 있고, 이때 상기 개선이 결합 친화성(affinity)에서의 개선 및/또는 결합 친화력(avidity)에서의 개선인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제19항에 있어서, 표적에 대한 결합 친화성 및 단백질 안정성이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 표적에 대한 결합 친화성 및 단백질 안정성에 비해 개선되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제19항에 있어서, 표적에 대한 결합 친화력 및 단백질 안정성이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 표적에 대한 결합 친화력 및 단백질 안정성에 비해 개선되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 2개 이상의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제6항, 제7항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제23항에 있어서, 펩티드 링커가 유연성 펩티드 링커인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제6항 또는 제14항에 있어서, 링커가 기능성 모이어티를 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제25항에 있어서, 기능성 모이어티가 면역글로불린 또는 이의 단편인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 이종 모이어티에 융합되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제6항, 제7항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 초과의 FnIII 단량체 스캐폴드가 링커에 의해 연결되고, 이때 1개 이상의 링커가 다른 링커와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상이한 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제2항, 제4항 내지 제8항, 제10항 및 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, FnIII 단량체 스캐폴드가 분지된 포맷으로 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제2항, 제4항 내지 제8항, 제10항 및 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 몇몇 FnIII 단량체 스캐폴드가 선형 직렬 포맷으로 연결되어 있고, 몇몇 FnIII 단량체 스캐폴드가 분지된 포맷으로 연결되어 있는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 동일한 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 상이한 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 작용제(agonist)인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 길항제인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 동일한 에피토프에서 동일한 표적에 결합하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 상이한 에피토프에서 동일한 표적에 결합하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제36항에 있어서, 상이한 에피토프가 비중복(non-overlapping) 에피토프인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제36항에 있어서, 상이한 에피토프가 중복(overlapping) 에피토프인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FOI가 동물 FnIII 도메인, 세균 FnIII 도메인, 고세균 FnIII 도메인 및 바이러스 FnIII 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제39항에 있어서, 1개 이상의 FOI가 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 59 및 서열번호 69 중 임의의 한 서열, 및 도 16에 제시된 서열들 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제39항에 있어서, 1개 이상의 FOI가 고호열성(hyperthermophilic) 고세균으로부터의 FnIII 도메인인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제39항에 있어서, 동물 FnIII 도메인이 인간 테나신(tenascin) C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4) 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제39항에 있어서, 동물 FnIII 도메인이 인간 피브로넥틴의 제14 FnIII 도메인(서열번호 69) 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제39항에 있어서, 동물 FnIII 도메인이 인간 피브로넥틴의 제10 FnIII 도메인(서열번호 64) 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제39항에 있어서, 각각의 FnIII 단량체에 대한 FOI가 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인(서열번호 4) 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제42항 또는 제45항에 있어서, 기능성 단편이 인간 테나신 C의 제3 FnIII 도메인의 N 말단 절두된 형태(서열번호 14)인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제17항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드의 베타 가닥이 서열번호 4 내의 동족 베타 가닥에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제17항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에 대하여 A 베타 가닥 도메인이 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 44 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 48을 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52를 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제18항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에 대하여 AB 루프가 서열번호 35를 포함하고, CD 루프가 서열번호 37을 포함하고, EF 루프가 서열번호 39를 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제18항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에 대하여 BC 루프가 서열번호 36을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38을 포함하고, FG 루프가 서열번호 39를 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제18항에 있어서, AB 루프가 서열번호 35를 포함하고, BC 루프가 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100 또는 서열번호 101을 포함하고, CD 루프가 서열번호 37을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104 또는 서열번호 105를 포함하고, EF 루프가 서열번호 39를 포함하고, FG 루프가 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110 또는 서열번호 111을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제17항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드에 대하여 A 베타 가닥이 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함하고, B 베타 가닥이 서열번호 43을 포함하고, C 베타 가닥이 서열번호 45 또는 서열번호 131을 포함하고, D 베타 가닥이 서열번호 46을 포함하고, E 베타 가닥이 서열번호 47을 포함하고, F 베타 가닥이 서열번호 49, 서열번호 50 또는 서열번호 51을 포함하고, G 베타 가닥이 서열번호 52 또는 서열번호 53을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제52항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드의 FOI가 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제17항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이다.
제17항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nIELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYCVSLIS(XFG)nKECFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이다.
제17항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYCVSLIC(XFG)nKECFTT
상기 서열에서, XAB, XBC, XCD, XDE, XEF 및 XFG는 각각 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, X1은 아미노산 잔기 A 또는 T를 나타내고, 루프의 길이 n은 2 내지 26의 정수이다.
제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, AB 루프가 서열번호 35를 포함하고, CD 루프가 서열번호 37을 포함하고, EF 루프가 서열번호 39를 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, BC 루프가 서열번호 36을 포함하고, DE 루프가 서열번호 38을 포함하고, FG 루프가 서열번호 40을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 BC 루프, DE 루프 또는 FG 루프가 루프 변이체인 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제59항에 있어서, BC 루프가 서열번호 97, 서열번호 98 또는 서열번호 168을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제59항에 있어서, DE 루프가 서열번호 102 또는 서열번호 103을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제59항에 있어서, FG 루프가 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 169 또는 서열번호 170을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제20항 또는 제21항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드의 증가된 단백질 안정성이 시차 주사 열량측정법(DSC), 원이색법(CD), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 단백질분해효소 내성, 등온 열량측정법(ITC), 핵 자기 공명(NMR), 우레아 변성 또는 구아니딘 변성에 의해 측정되는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 친화 성숙되어 있는(affinity matured) 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
1개 이상의 관심있는 야생형 피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인(FOI)으로부터 유래된 2개의 FnIII 단량체 스캐폴드를 발현시키거나, 융합시키거나 접합시키는 단계를 포함하는, 재조합 다량체 스캐폴드를 수득하는 방법으로서,
(a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고,
(b) FnIII 단량체 스캐폴드는 직렬로 연결되어 있고, 이때 1개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드가 1개의 비천연 분자내 이황화 결합을 포함하고,
(c) 상기 재조합 다량체 스캐폴드가 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고,
(d) 상기 표적에 대한 작용이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 작용에 비해 개선되어 있는 것인 방법.
1개 이상의 관심있는 야생형 피브로넥틴 III형(FnIII) 도메인(FOI)으로부터 유래된 3개 이상의 FnIII 단량체 스캐폴드를 발현시키거나, 융합시키거나 접합시키는 단계를 포함하는, 재조합 다량체 스캐폴드를 수득하는 방법으로서,
(a) 각각의 FnIII 단량체 스캐폴드는 복수의 루프 영역에 연결된 복수의 베타 가닥을 포함하고,
(b) 상기 재조합 다량체 FnIII 스캐폴드는 1개 이상의 표적에 특이적으로 결합하고,
(c) 상기 표적에 대한 작용이 동족 FnIII 단량체 스캐폴드의 작용에 비해 개선되어 있는 것인 방법.
제65항 또는 제66항에 있어서, FOI가 서열번호 1 내지 서열번호 34, 서열번호 54 및 서열번호 69 중 임의의 한 서열, 및 도 16에 제시된 서열들 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 방법.
제65항 또는 제66항의 방법에 의해 제조된 재조합 다량체 스캐폴드.
제1항 내지 제64항 및 제68항 중 어느 한 항의 재조합 다량체 스캐폴드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
제69항의 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 벡터.
제70항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
핵산 분자에 의해 코딩된 재조합 다량체 스캐폴드가 발현되는 조건 하에서 제71항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 다량체 스캐폴드를 제조하는 방법.
약학적으로 허용가능한 부형제 중에 제1항 내지 제64항 및 제68항 중 어느 한 항의 재조합 다량체 스캐폴드를 포함하는 조성물.
암, 자가면역 장애, 염증성 장애 또는 감염의 치료가 필요한 환자에서 암, 자가면역 장애, 염증성 장애 또는 감염을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제73항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
샘플 중의 단백질을 검출하는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 및 제68항 중 어느 한 항의 다량체 FnIII 스캐폴드 또는 접합체를 표지하는 단계, 표지된 다량체 FnIII 스캐폴드 또는 접합체를 샘플과 접촉시키는 단계, 및 상기 다량체 FnIII 스캐폴드 또는 접합체와 상기 단백질 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 이종 모이어티가 단백질, 펩티드, 단백질 도메인, 링커, 약물, 독소, 세포독성제, 조영제, 방사성핵종, 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 바이오틴, 인간 혈청 알부민(HSA), HSA FcRn 결합 부분, 항체, 항체의 도메인, 항체 단편, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 알부민 결합 도메인, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩티드, 비-FnIII 스캐폴드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩티드 중합체, 사이토킨, 및 상기 모이어티들 중 2 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 포함하는 것인 재조합 다량체 스캐폴드.
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