TW201348256A - Ｃｘ３ｃｒ１－結合多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於CX3CR1-結合多肽，特定而言包含特異性免疫球蛋白結構域之多肽。本發明亦係關於編碼該等多肽之核酸；製備該等多肽之方法；表現或能夠表現該等多肽之宿主細胞；包含該等多肽之組合物；及該等多肽或該等組合物特定而言用於預防、治療及診斷目的之用途。

Description

CX3CR1-結合多肽
本發明係關於CX3CR1-結合多肽、特定而言包含特異性免疫球蛋白結構域之多肽。本發明亦係關於編碼該等多肽之核酸；製備該等多肽之方法；表現或能夠表現該等多肽之宿主細胞；包含該等多肽之組合物；及該等多肽或該等組合物特定而言用於預防、治療及診斷目的之用途。
CX3CR1係G蛋白偶合膜主體蛋白，其係趨化因子受體。其主要於與動脈粥樣硬化斑之開始及進展相關之細胞類型上表現，例如單核細胞、樹突細胞及T細胞。其在單核細胞上因經氧化脂質而上調，並介導該等細胞至斑中之遷移及於斑內之存活。其獨特配體弗萊托肯趨化因子(fractalkine，FKN)係在病灶中之血管內皮細胞及平滑肌細胞之表面上表現，在病灶中其調節白細胞黏附。弗萊托肯趨化因子亦藉由蛋白水解裂解釋放至循環中，其中其作為趨化劑起作用。
在人類中，已顯示具有降低之活性之CX3CR1變體(V249I/T280M)與心血管疾病(冠狀動脈心臟病、腦血管疾病或外周血管疾病)(McDermott,2001；Circ Res 89：401)、冠狀動脈疾病(狹窄之血管攝影證據)(McDermott,2003；J.Clin.Invest.111：1241)及頸動脈阻塞病(Ghilardi,2004；Stroke 35：1276)之風險降低相關。CX3CR1與顯示增強之免疫染色之弗萊托肯趨化因子藉由多株抗體共定位於動脈 粥樣硬化斑內(Wong,2002 Cardiovasc.Path.11：332)。在非斑動脈區域中未觀察到弗萊托肯趨化因子染色。
若干獨立小鼠遺傳研究已顯示CX3CR1缺陷對動脈粥樣硬化之有益效應。在餵養高脂肪飲食之CX3CR1-/- apoE-/-小鼠之兩個獨立衍生之品系中看到主動脈弧及胸主動脈中病灶面積減少以及斑中單核細胞/巨噬細胞累積降低(Combadière,2003；Circulation,107：1009，Lesnik,2003；J.Clin.Invest.111：333)。
此顯示，CX3CR1參與心血管疾病且其活性之調節可提供有希望的療法。因此，業內需要具有有益藥理性質之抵抗CX3CR1之拮抗劑分子，其可用作治療劑在人類中治療疾病、特定而言心血管疾病。
因此，本發明之一目標係提供抗CX3CR1拮抗劑分子、特定而言對CX3CR1具有高結合親和力之抗CX3CR1拮抗劑分子。
本發明之又一目標係提供對CX3CR1具有高特異性之抗CX3CR1拮抗劑分子。
本發明之又一目標係提供具有有效活性之抗CX3CR1拮抗劑。
本發明之又一目標係提供具有有利生體可用率及半衰期之抗CX3CR1拮抗劑。
本發明之又一目標係提供具有有利生物物理性質之抗CX3CR1拮抗劑。
本發明之其他目標包括任一上文所闡釋目標之組合。
本發明提供與人類CX3CR1結合且能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合之多肽。在一態樣中，該多肽係包含抗原結合結構域之免疫球蛋白，該抗原結合結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2及CDR3，其中該免疫球蛋白與人類CX3CR1結合且能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合。在又一態樣 中，該多肽包含一或多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域，其中該多肽能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合。
在一態樣中，本發明多肽之特徵在於一或多個以下性質：●以高親和力與人類CX3CR1結合；●阻斷可溶弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合；●抑制弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用；●抑制弗萊托肯趨化因子誘導之人類CX3CR1受體內化；●以在人類CX3CR1之結合及功能抑制之E/IC50之10倍內的E/IC50與食蟹猴CX3CR1交叉反應。
在又一態樣中，本發明多肽包含抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域且進一步包含延長半衰期之部分，例如白蛋白結合部分、聚乙二醇分子或Fc結構域。在又一態樣中，本發明多肽包含兩個或更多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域。在一態樣中，該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係藉由連接肽共價連接。在一態樣中，本發明多肽中之該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域具有相同胺基酸序列。在另一態樣中，本發明多肽中之該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域具有不同胺基酸序列。在一態樣中，本發明多肽包含兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域且進一步包含延長半衰期之部分，例如白蛋白結合部分、聚乙二醇分子或Fc結構域。
在一態樣中，本發明多肽包含藉由第一連接肽與白蛋白結合部分共價連接之第一抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域，其中該白蛋白結合部分進一步藉由第二連接肽與第二抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域共價連接。在一態樣中，本發明多肽包含藉由連接肽與Fc結構域共價連接之抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域 在一態樣中，包含藉由連接肽與Fc結構域共價連接之抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域之該多肽係以(例如)藉助雙硫橋之二聚體形式提供。
本發明多肽係用於預防、治療、緩和及/或診斷CX3CR1相關疾病、病症或病狀、特定而言心血管疾病(例如動脈粥樣硬化)。
在又一態樣中，本發明提供：
實施例1：包含抗原結合結構域之免疫球蛋白，該抗原結合結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2及CDR3，其中該免疫球蛋白與人類CX3CR1結合且能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合。
實施例2：包含一或多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域之多肽，其中該多肽能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合。
實施例3：根據實施例2之之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域基本上係由四個框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)及三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)組成。
實施例4：根據實施例3之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域具有結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
實施例5：根據實施例2至4中任一實施例之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係抗體結構域。
實施例6：根據實施例5之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係VH、VL、VHH、駱駝化VH或針對穩定性、效能、可製造性及/或與人類框架區之相似性經優化之VHH。
實施例7：根據實施例1至6中任一實施例之多肽，其中該多肽對人類CX3CR1具有如下親和力： a)EC50小於或等於10 nM、小於或等於5 nM、小於或等於 2.5 nM或小於或等於1 nM，如藉由細胞結合FACS來測定；或b)IC50小於或等於10 nM、小於或等於5 nM、小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM，如藉由競爭FACS來測定。
實施例8：根據實施例1至7中任一實施例之多肽，其中該多肽以如下之IC50阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合：小於或等於300 nM、或小於或等於100 nM、或小於或等於20 nM、或小於或等於10 nM、或小於或等於5 nM、或小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM。
實施例9：根據實施例中任一實施例1至8之多肽，其中該多肽以如以下之IC50抑制藉由人類CX3CR1介導之弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用：小於或等於500 nM、或小於或等於100 nM、或小於或等於75 nM、或小於或等於50 nM、或小於或等於10 nM或小於或等於5nM。
實施例10：根據實施例1至9中任一實施例之多肽，其中該多肽以如下之IC50抑制藉由人類CX3CR1介導之弗萊托肯趨化因子內化：小於或等於10 nM、或小於或等於5 nM或小於或等於1 nM。
實施例11：根據實施例3至10中任一實施例之多肽，其中該CDR3具有胺基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO：197)，其中：- Xaa1係Pro、Ala或Gly；- Xaa2係Asp或Asn；- Xaa3係Thr或Ser；- Xaa4係Arg、Lys、Ala或Gly；且- Xaa5係Tyr或Phe。
實施例12：根據實施例3至11中任一實施例之多肽，其中： a)- Xaa1係Pro、Ala或Gly；- Xaa2係Asp或Asn；- Xaa3係Thr；- Xaa4係Arg或Lys；且- Xaa5係Tyr，及/或b)其中該CDR3係選自SEQ ID No：186-190中之任一者。
實施例13：根據實施例3至12中任一實施例之多肽，其中該CDR3具有胺基酸序列Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr(SEQ ID NO：186)。
實施例14：根據實施例3至10中任一實施例之多肽，其中：i)該CDR1：a)具有SEQ ID NO：141之胺基酸序列；b)具有與SEQ ID NO：141之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列；c)具有與SEQ ID NO：141之胺基酸序列具有2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於2位處S已變為T或G；- 於6位處S已變為R；- 於7位處N已變為T；及/或- 於9位處M已變為K；或d)具有選自SEQ ID NO：141-145及213中之任一者之胺基酸序列；ii)該CDR2：a)具有SEQ ID NO：164之胺基酸序列； b)具有與SEQ ID NO：164之胺基酸序列具有至少70%胺基酸一致性之胺基酸序列；c)具有與SEQ ID NO：164之胺基酸序列具有4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於1位處G已變為A、L、V或S；- 於3位處N已變為D、S、Q、G或T；- 於4位處S已變為T、K、G或P；- 於5位處V已變為A；- 於6位處G已變為D；- 於7位處I已變為T或V；- 於8位處T已變為A；及/或- 於9位處K已變為R；或d)具有選自SEQ ID NO：162-175及214-221中之任一者之胺基酸序列；且iii)該CDR3：a)具有SEQ ID NO：186之胺基酸序列；b)具有與SEQ ID NO：186之胺基酸序列具有至少70%胺基酸一致性之胺基酸序列；c)具有與SEQ ID NO：186之胺基酸序列具有3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於2位處P已變為A或G；- 於7位處D已變為N；及/或- 於9位處R已變為K；或d)具有選自SEQ ID NO：186-190中之任一者之胺基酸序列。
實施例15：根據實施例3至10中任一實施例之多肽，其中 i)該CDR1具有SEQ ID NO：146之胺基酸序列；ii)該CDR2具有a)與SEQ ID NO：176之胺基酸序列具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列：或b)具有SEQ ID NO：176或177之胺基酸序列；且iii)該CDR3具有SEQ ID NO：191之胺基酸序列.
實施例16：根據實施例3至10中任一實施例之多肽，其中i)該CDR1：a)具有SEQ ID NO：147之胺基酸序列；或b)具有與SEQ ID NO：147之胺基酸序列具有6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於1位處G已變為K、R或A；- 於2位處T已變為I、P、S或L；- 於3位處I已變為V或T；- 於4位處F已變為L；- 於5位處S已變為R或D；- 於6位處N已變為S、T或D；及/或- 於7位處N已變為T或Y；或c)具有選自SEQ ID NO：147-161中之任一者之胺基酸序列；ii)該CDR2：a)具有SEQ ID NO：179之胺基酸序列；或b)具有與SEQ ID NO：179之胺基酸序列具有4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於3位處S已變為T或G；- 於4位處N已變為S或I；- 於5位處S已變為T； - 於6位處G已變為Y；及/或- 於8位處T已變為A；或c)具有選自SEQ ID NO：178-185中之任一者之胺基酸序列；且iii)該CDR3：a)具有SEQ ID NO：192之胺基酸序列；或b)具有與SEQ ID NO：192之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)具有與SEQ ID NO：192之胺基酸序列具有2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於2位處A已變為G；- 於8位處T已變為S；- 於9位處A已變為G；及/或- 於位10處Y已變為F；或d)具有選自SEQ ID NO：192-196中之任一者之胺基酸序列。
實施例17：根據實施例3之多肽，其中該CDR1、該CDR2及該CDR3之胺基酸序列闡述於以下中：- 分別如SEQ ID No：141、162及186；或- 分別如SEQ ID No：141、163及187；或- 分別如SEQ ID No：141、164及186；或- 分別如SEQ ID No：141、166及186；或- 分別如SEQ ID No：141、167及186；或- 分別如SEQ ID No：141、167及189；或- 分別如SEQ ID No：141、168及186；或- 分別如SEQ ID No：141、168及187；或 - 分別如SEQ ID No：141、169及190；或- 分別如SEQ ID No：141、170及186；或- 分別如SEQ ID No：141、171及186；或- 分別如SEQ ID No：141、174及186；或- 分別如SEQ ID No：141、175及187；或- 分別如SEQ ID No：142、165及188；或- 分別如SEQ ID No：142、173及188；或- 分別如SEQ ID No：143、164及186；或- 分別如SEQ ID No：144、172及187；或- 分別如SEQ ID No：145、172及187；或- 分別如SEQ ID No：141、214及186；或- 分別如SEQ ID No：141、215及186；或- 分別如SEQ ID No：141、216及186；或- 分別如SEQ ID No：141、217及186；或- 分別如SEQ ID No：141、218及186；或- 分別如SEQ ID No：141、219及186；或- 分別如SEQ ID No：141、220及186；或- 分別如SEQ ID No：213、221及186；或- 分別如SEQ ID No：213、214及186。
實施例18：根據實施例3之多肽，其中該CDR1、該CDR2及該CDR3之胺基酸序列闡述於以下中：- 分別如SEQ ID No：146、176及191；或- 分別如SEQ ID No：146、177及191。
實施例19：根據實施例3之多肽，其中該CDR1、該CDR2及該CDR3之胺基酸序列闡述於以下中：- 分別如SEQ ID No：147、178及192；或 - 分別如SEQ ID No：147、179及192；或- 分別如SEQ ID No：147、179及194；或- 分別如SEQ ID No：148、179及193；或- 分別如SEQ ID No：149、179及192；或- 分別如SEQ ID No：149、180及192；或- 分別如SEQ ID No：149、181及192；或- 分別如SEQ ID No：149、183及192；或- 分別如SEQ ID No：149、185及192；或- 分別如SEQ ID No：150、179及194；或- 分別如SEQ ID No：150、182及194；或- 分別如SEQ ID No：151、179及193；或- 分別如SEQ ID No：151、182及194；或- 分別如SEQ ID No：151、184及196；或- 分別如SEQ ID No：152、179及195；或- 分別如SEQ ID No：153、179及194；或- 分別如SEQ ID No：154、182及194；或- 分別如SEQ ID No：155、179及195；或- 分別如SEQ ID No：156、181及192；或- 分別如SEQ ID No：157、179及194；或- 分別如SEQ ID No：158、179及192；或- 分別如SEQ ID No：159、178及192；或- 分別如SEQ ID No：160、179及194；或- 分別如SEQ ID No：161、179及194。
實施例20：根據實施例3之多肽，其中該CDR1、該CDR2及該CDR3之胺基酸序列闡述於以下中：分別如SEQ ID NO：141、164及186，或分別如SEQ ID NO：141、162及186。
實施例21：根據實施例3之多肽，其中該CDR1、該CDR2及該CDR3之胺基酸序列闡述於以下中：分別如SEQ ID NO：213、214及186，分別如SEQ ID NO：213、221及186，或分別如SEQ ID NO：141、162及186。
實施例22：根據實施例2至10中任一實施例之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係包含如下序列之VHH結構域：a)SEQ ID NO：3之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列；c)與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列；或d)SEQ ID NO：1-48、121-140或222-224中之任一者之胺基酸序列。
實施例23：根據實施例2至10中任一實施例之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係包含如下序列之VHH結構域：a)SEQ ID NO：49之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少95%胺基酸一致性之胺基酸序列；c)與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列；或d)SEQ ID NO：49-52中之任一者之胺基酸序列。
實施例24：根據實施例2至10中任一實施例之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係包含如下序列之VHH結構 域：a)SEQ ID NO：67之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO：67之胺基酸序列具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列；c)與SEQ ID NO：67之胺基酸序列具有12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列；或d)SEQ ID NO：53-120中之任一者之胺基酸序列。
實施例25：根據實施例2之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所闡述之序列。
實施例26：根據實施例2之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：121-140或SEQ ID NO：222-224中之任一者中所闡述之序列。
實施例27：根據上文實施例中之任一實施例之多肽，其針對穩定性、效能、可製造性及/或與人類框架區之相似性經擬人化及/或優化。
實施例28：根據實施例27之多肽，其在以下位置(根據Kabat編號)中之一或多者處經擬人化及/或序列優化：1、11、14、16、74、83、108。
實施例29：根據實施例28之多肽，其包含以下突變中之一或多者：E1D、S11L、A14P、E16G、A74S、K83R、Q108L。
實施例30：根據實施例3至29中任一實施例之多肽，其中：i)FR1係選自SEQ ID NO：198-204；ii)FR2係選自SEQ ID NO：205-208；iii)FR3係選自SEQ ID NO：209-210；及/或 iv)FR4係選自SEQ ID NO：211-212。
實施例31：根據實施例3至30中任一實施例之多肽，其在以下位置(根據Kabat編號)中之一或多者處經擬人化及/或序列優化：52、53。
實施例32：根據實施例31之多肽，其包含中之一或多者以下突變：N52S、S53T。
實施例33：根據實施例3至32中任一實施例之多肽，其中CDR2係選自SEQ ID NO：214-221。
實施例34：根據實施例2至33中任一實施例之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：138-140或222-224中之任一者中所闡述之序列。
實施例35：根據實施例22至26中任一實施例之多肽，其中該VHH結構域係由該等胺基酸序列中之任一者組成。
實施例36：根據實施例2至35中任一實施例之多肽，其中該免疫球蛋白單一可變結構域交叉阻斷SEQ ID NO：1-120、121-140及222-224之免疫球蛋白單一可變結構域中之至少一者與CX3CR1之結合。
實施例37：根據實施例2至35中任一實施例之多肽，其中藉由SEQ ID NO：1-120、121-140及222-224之胺基酸序列中之至少一者交叉阻斷該免疫球蛋白單一可變結構域與CX3CR1結合。
實施例38：根據實施例2至37中任一實施例之多肽，其中該多肽進一步包含延長半衰期之部分。
實施例39：根據實施例38之多肽，其中該延長半衰期之部分與該多肽共價連接且係選自由以下組成之群：白蛋白結合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白結構域)、轉鐵蛋白結合部分(例如抗轉鐵蛋白免疫球蛋白結構域)、聚乙二醇分子、重組聚乙二醇分子、人類血清白蛋 白、人類血清白蛋白之片段、白蛋白結合肽或Fc結構域。
實施例40：根據實施例38或39之多肽，其中該延長半衰期之部分係由抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域組成。
實施例41：根據實施例40之多肽，其中該免疫球蛋白單一可變結構域係選自VHH結構域、擬人化VHH結構域、駱駝化VH結構域、結構域抗體、單一結構域抗體及/或「dAb」。
實施例42：根據實施例41之多肽，其中該抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域係選自SEQ ID NO：230-232。
實施例43：根據實施例2至39中任一實施例之多肽，其中該多肽視情況經由適宜連接體或鉸鏈區與Fc部分(例如人類Fc，例如如SEQ ID NO：252中所闡釋)連接。
實施例44：根據實施例2至39中任一實施例之多肽，其中該多肽進一步與以下部分連接：一或多個恆定結構域(例如，2個或3個可用作Fc部分之一部分/用於形成Fc部分之恆定結構域)、Fc部分及/或賦予本發明多肽一或多個效應子功能及/或可賦予視情況經由適宜連接體或鉸鏈區與一或多個Fc受體結合之能力之一或多個抗體部分、片段或結構域。
實施例45：根據實施例2至37中任一實施例之多肽，其中該多肽進一步包含第二免疫球蛋白單一可變結構域、較佳第二抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域。
實施例46：根據實施例45之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域藉由連接肽共價連接。
實施例47：根據實施例45或46之多肽，其中該等第二免疫球蛋白單一可變結構域基本上係由四個框架區(FR1至FR4)及三個互補決定區(CDR1至CDR3)組成。
實施例48：根據實施例45至47中任一實施例之多肽，其中該 第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域係抗體結構域。
實施例49：根據實施例45至48中任一實施例之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域係VH、VL、VHH、駱駝化VH或針對穩定性、效能、可製造性及/或與人類框架區之相似性經優化之VHH。
實施例50：根據實施例45至49中任一實施例之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域之該CDR1至該CDR3係闡釋於實施例11至21中之任一者中。
實施例51：根據實施例45至50中任一實施例之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含相同CDR3。
實施例52：根據實施例51之多肽，其中該CDR3係闡釋實施例11至13中之任一者中。
實施例53：根據實施例45至53中任一實施例之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含相同CDR1、CDR2及CDR3。
實施例54：根據實施例53之多肽，其中該CDR1至該CDR3係闡釋於實施例11至21中之任一者中。
實施例55：根據實施例45至54中任一實施例之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含相同VHH結構域。
實施例56：根據實施例中任一實施例45至55之多肽，其中該VHH結構域係闡釋於實施例22至37中之任一者中。
實施例57：包含第一免疫球蛋白單一可變結構域及第二免疫球蛋白單一可變結構域之多肽，該第一免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：141、164及186或SEQ ID NO：141、162及186所闡述之CDR1、CDR2及CDR3，該第二免疫球蛋白單一可變結構域係如實施例2至37中之任一者中所闡釋。
特定而言，此一多肽可係根據實施例45至56中之任一者之多肽。
實施例58：根據實施例57之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：213、214及186、SEQ ID NO：213、221及186或SEQ ID NO：141、162及186中所闡述之CDR1、CDR2及CDR3。
實施例59：根據實施例57或58之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：141、164及186或SEQ ID NO：141、162及186所闡述之CDR1、CDR2及CDR3。
實施例60：根據實施例57或58之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含如下CDR1、CDR2及CDR3：SEQ ID NO：213、214及186、SEQ ID NO：213、221及186或SEQ ID NO：141、162及186。
實施例61：包含第一免疫球蛋白單一可變結構域及根據實施例2至37中任一實施例之第二免疫球蛋白單一可變結構域之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變結構域係包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所闡述之序列之VHH結構域。
特定而言，此一多肽可係根據實施例45至60中之任一者之多肽。
實施例62：根據實施例61之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變結構域係包含SEQ ID NO：121-140或222-224中所闡釋之任一者中之序列之VHH結構域。
實施例63：根據實施例61或62之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域係包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所闡述之序列之VHH結構域。
實施例64：根據實施例63之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一 可變結構域係包含SEQ ID NO：121-140或222-224中所闡釋之任一者中之序列之VHH結構域。
實施例65：根據實施例45至64中任一實施例之多肽，其中該多肽進一步包含延長半衰期之部分。
實施例66：根據實施例65之多肽，其中該延長半衰期之部分與該多肽共價連接且係選自由以下組成之群：白蛋白結合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白結構域)、轉鐵蛋白結合部分(例如抗轉鐵蛋白免疫球蛋白結構域)、聚乙二醇分子、重組聚乙二醇分子、人類血清白蛋白、人類血清白蛋白之片段、白蛋白結合肽或Fc結構域。
實施例67：根據實施例66之多肽，其中該延長半衰期之部分係由抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域組成。
實施例68：根據實施例67之多肽，其中該免疫球蛋白單一可變結構域係選自VHH結構域、擬人化VHH結構域、駱駝化VH結構域、結構域抗體、單一結構域抗體及/或「dAb」。
實施例69：根據實施例68之多肽，其中該抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域係選自SEQ ID NO：230-232。
實施例70：根據實施例45至64中任一實施例之多肽，其中該多肽視情況經由適宜連接體或鉸鏈區與Fc部分(例如人類Fc，例如如SEQ ID NO：252中所闡釋)連接。
實施例71：根據實施例45至66中任一實施例之多肽，其中該多肽進一步與以下部分連接：一或多個恆定結構域(例如，2個或3個可用作Fc部分之一部分/用於形成Fc部分之恆定結構域)、Fc部分及/或賦予本發明多肽一或多個效應子功能及/或可賦予視情況經由適宜連接體或鉸鏈區與一或多個Fc受體結合之能力之一或多個抗體部分、片段或結構域。
實施例72：包含SEQ ID NO：225-227中之任一者之胺基酸序列 之多肽。
實施例73：包含SEQ ID NO：249或277-281中之任一者之胺基酸序列之多肽。
實施例74：包含SEQ ID NO：257-262中之任一者之胺基酸序列之多肽。
實施例75：包含SEQ ID NO：253或254中之任一者之胺基酸序列之多肽。
實施例76：包含SEQ ID NO：263或266中之任一者之胺基酸序列之多肽。
實施例77：包含SEQ ID NO：267-276及282中之任一者之胺基酸序列之多肽。
實施例78：包含編碼根據實施例1至77中任一實施例之多肽之區的核酸分子。
實施例79：包含根據實施例78之核酸分子之表現載體。
實施例80：攜帶包含核酸分子之表現載體之宿主細胞，該核酸分子包含編碼根據實施例1至77中任一實施例之多肽之區，其中該宿主細胞能夠表現根據實施例1至77中任一實施例之多肽，且其中該宿主細胞係原核或真核細胞。
實施例81：包含以下之醫藥組合物：(i)作為活性成分之根據實施例1至77中任一實施例之一或多種多肽、及(ii)醫藥上可接受之載劑、及視情況(iii)稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑。
實施例82：製造根據實施例1至77中任一實施例之多肽之方法，其包含以下步驟：- 在容許表現根據實施例1至77中任一實施例之多肽之條件下培養宿主細胞，其中攜帶包含核酸分子之表現載體之該宿主細胞，該核酸分 子包含編碼根據實施例1至77中任一實施例之多肽之區，且其中該宿主細胞係原核或真核細胞；- 回收該多肽；及- 純化該多肽。
實施例83：使用根據實施例1至77中任一實施例之多肽在(特定而言)人類中治療、預防或緩和疾病、病症或病狀之方法。
實施例84：如實施例83之方法，其中該疾病、病症或病狀係CX3CR1相關疾病、病症或病狀。
實施例85：如實施例83之方法，其中該疾病、病症或病狀係動脈粥樣硬化。
實施例86：包含根據實施例1至77中任一實施例之多肽之可注射醫藥組合物，該組合物適於在人類中靜脈內或皮下注射。
實施例87：預防及/或治療與CX3CR1相關之疾病或病症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投與醫藥活性量之根據實施例1至77中任一實施例之至少一種多肽。
實施例88：如實施例85之方法，其進一步包含投與選自由史他汀(statin)、抗血小板劑、抗凝劑、抗糖尿病劑及抗高血壓劑組成之群之其他治療劑。
實施例89：抑制哺乳動物細胞中CX3CR1與弗萊托肯趨化因子結合之方法，其包含向細胞投與根據實施例1至77中任一實施例之多肽，藉此抑制藉由弗萊托肯趨化因子介導之信號傳導。
實施例90：檢測及/或量化生物樣品中之CX3CR1含量之方法，其藉由將樣品與根據實施例1至77中任一實施例之多肽接觸並檢測多肽與CX3CR1之結合來實現。
實施例91：診斷CX3CR1相關病症或確定個體是否具有患CX3CR1相關病症之增加之風險的方法，其中該方法包含將來自個體 之生物樣品與根據實施例1至77中任一實施例之多肽接觸及檢測多肽與CX3CR1之結合以測定CX3CR1之表現或濃度。
實施例92. 用於在人類中治療、預防或緩和疾病、病症或病狀之根據實施例1至77中任一實施例之多肽。
實施例93. 根據實施例92使用之多肽，其中該疾病、病症或病狀係CX3CR1相關疾病、病症或病狀。
實施例94. 根據實施例92使用之多肽，其中該疾病、病症或病狀係選自心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病(Henoch-Schonlein purpura)及華格納氏肉芽病(Wegener’s granulomatosis))、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症。
實施例95. 根據實施例92使用之多肽，其中該疾病、病症或病狀係動脈粥樣硬化。
實施例96. 根據實施例1至77中之任一者之多肽之用途，其用於製造用以在人類中治療、預防或緩和疾病、病症或病狀之醫藥。
實施例97. 根據實施例87之方法，其中該疾病或病症係選自心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病及華格納氏肉芽病)、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症。
實施例98. 根據實施例87之方法，其中該疾病、病症或病狀係動脈粥樣硬化。
實施例99. 包含根據實施例1至77中任一實施例之多肽之診斷套組或診斷方法或其用途。
實施例100. 根據實施例99之診斷套組或診斷方法，其用於診斷以下至少一種疾病：心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病及華格納氏肉芽病)、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症。
定義
根據本文中之其他說明，本發明之以上及其他態樣及實施例將變得顯而易見，其中：
a)除非另外指明或定義，否則所用之所有術語具有其業內之常用含義，此為熟習此項技術者所明瞭。參照(例如)標準手冊，例如Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第2版)，第1至3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin，「Genes IV」，Oxford University Press,New York,(1990)，及Roitt等人，「Immunology」(第2版)，Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文所引用之一般背景；此外，除非另外指明，否則可以本身已知之方法實施並已實施未詳細地具體闡述 之所有方法、步驟、技術及操作，如熟習此項技術者所明瞭。再次參照(例如)標準手冊、上文所提及之一般背景技術及其中引用之其他參考文獻。
b)除非另外指明，否則術語「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白序列」-不論在本文中用於指重鏈抗體或習用4鏈抗體-係用作包括全長抗體、其個別鏈以及其所有部分、結構域或片段(分別包括(但不限於)抗原結合結構域或片段，例如VHH結構域或VH/VL結構域)的一般術語。另外，除非上下文需要更有限解釋，否則本文所用術語「序列」(例如，在如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「(單一)可變結構域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」等術語中)通常應理解為包括編碼其之相關胺基酸序列以及核酸序列或核苷酸序列。
c)本文所用術語(多肽或蛋白質之)「結構域」係指摺疊蛋白質結構，其具有保留其獨立於蛋白質之剩餘部分之三級結構的能力。通常，結構域負責蛋白質之離散功能性質，且在許多情形下可添加、移除或轉移至其他蛋白質中而不損失蛋白質及/或結構域之剩餘部分之功能。
d)本文所用術語「免疫球蛋白結構域」係指抗體鏈(例如習用4鏈抗體或重鏈抗體之鏈)之球形區，或係指基本上係由此一球形區組成之多肽。免疫球蛋白結構域之特徵在於其保留抗體分子之免疫球蛋白摺疊特性，其由佈置成2個β片且視情況由保守二硫鍵穩定之約7條反平行β鏈之2層夾層組成。
e)本文所用術語「免疫球蛋白可變結構域」意指基本上係由4個「框架區」組成之免疫球蛋白結構域，該等框架區在業內及下文中分別稱作「框架區1」或「FR1」；「框架區2」或「FR2」；「框架區3」或「FR3」及「框架區4」或「FR4」，該等框架區雜有3個「互補決定區」或「CDR」，其在業內及下文中分別稱作「互補決定區 1」或「CDR1」；「互補決定區2」或「CDR2」及「互補決定區3」或「CDR3」。因此，可如下指示免疫球蛋白可變結構域之通用結構或序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域藉由攜帶抗原結合位點賦予抗體對抗原之特異性。
f)本文所用術語「免疫球蛋白單一可變結構域」及「單一可變結構域」意指能夠與抗原之表位特異性結合而不與另一可變免疫球蛋白結構域配對之免疫球蛋白可變結構域。本發明含義中之免疫球蛋白單一可變結構域之一實例係「結構域抗體」，例如免疫球蛋白單一可變結構域VH及VL(VH結構域及VL結構域)。免疫球蛋白單一可變結構域之另一實例係下文所定義駱駝科之「VHH結構域」(或簡寫為「VHH」)。
鑒於上述定義，習用4鏈抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；業內已知)或源自該習用4鏈抗體之Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如二硫鍵鍵結之Fv或scFv片段)或雙抗體(所有均為業內已知)的抗原結合結構域通常將不被視為免疫球蛋白單一可變結構域，此乃因在該等情形下通常將不由一個(單一)免疫球蛋白結構域而是由一對(結合)免疫球蛋白結構域(例如輕鏈及重鏈可變結構域)，即由與各別抗原之表位共同結合之免疫球蛋白結構域之VH-VL對與抗原之各別表位結合。
f1)「VHH結構域」亦稱作VHH、VHH結構域、VHH抗體片段及VHH抗體，其最初闡述為「重鏈抗體」(即「無輕鏈之抗體」；Hamers-Casterman C、Atarhouch T、Muyldermans S、Robinson G、Hamers C、Songa EB、Bendahman N、Hamers R.：「Naturally occurring antibodies devoid of light chains」；Nature 363,446-448(1993))之抗原結合免疫球蛋白(可變)結構域。選擇術語「VHH結構域」以區分該等可變結構域與習用4鏈抗體中存在之重鏈可變結構域 (其在本文中稱作「VH結構域」或「VH結構域」)及習用4鏈抗體中存在之輕鏈可變結構域(其在本文中稱作「VL結構域」或「VL結構域」)。VHH結構域可在無另一抗原結合結構域情況下與表位特異性結合(與習用4鏈抗體中之VH或VL結構域相反，在該情形下由VL結構域與VH結構域一起識別表位)。VHH結構域係由單一免疫球蛋白結構域形成之小的穩健且有效抗原識別單元。
在本發明上下文中，術語VHH結構域、VHH、VHH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體以及「奈米抗體®(Nanobody®)」及「奈米抗體®結構域」(「奈米抗體」為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium之商標)可互換使用且可代表免疫球蛋白單一可變結構域(具有結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4並與表位特異性結合而無需第二免疫球蛋白可變結構域之存在)，且藉由如(例如)WO2009/109635之圖1中所定義所謂「標誌殘基」將其與VH結構域區分。
根據Kabat等人所給之針對VH結構域之通用編號對VHH結構域之胺基酸殘基編號(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，公開案第91號)，如適於來自駱駝科之VHH結構域如(例如)Riechmann and Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)之圖2中所顯示。根據此編號，- FR1包含1位至30位處之胺基酸殘基，- CDR1包含31位至35位處之胺基酸殘基，- FR2包含36位至49位處之胺基酸，- CDR2包含50位至65位處之胺基酸殘基，- FR3包含66位至94位處之胺基酸殘基，- CDR3包含95位至102位處之胺基酸殘基，且 - FR4包含103位至113位處之胺基酸殘基。
然而，應注意-如針對VH結構域及VHH結構域業內所熟知-CDR中之每一者中之胺基酸殘基的總數量可有所變化且可不對應於由Kabat編號指示之胺基酸殘基的總數量(即，實際序列中可不佔據根據Kabat編號之一或多個位置，或實際序列可含有比由Kabat編號容許之數量更多之胺基酸殘基)。此意指，根據Kabat之編號通常可對應於或可不對應於實際序列中之胺基酸殘基之實際編號。
業內已知對VH結構域之胺基酸殘基編號之替代方法，該等方法亦可以相似方式適於VHH結構域。然而，除非另外指明，否則在本發明說明、申請專利範圍及圖中，遵循如上文所述根據Kabat且適於VHH結構域之編號。
VHH結構域中之胺基酸殘基之總數量通常將在110至120之範圍內，經常介於112與115之間。然而，應注意，較小且較長序列亦可適於本文所述目的。
VHH結構域及含有其之多肽之其他結構特性及功能性質可總結如下：VHH結構域(其已經天然「設計」以在不存在輕鏈可變結構域且不與輕鏈可變結構域相互作用之情況下與抗原功能結合)可用作單一且相對較小之功能性抗原結合結構單元、結構域或多肽。此區分VHH結構域與習用4鏈抗體之VH及VL結構域，該等VH及VL結構域自身通常不適於作為單一抗原結合蛋白或免疫球蛋白單一可變結構域進行實踐應用，但需要以某種形式或另一形式組合以提供功能性抗原結合單元(如呈(例如)諸如Fab片段等習用抗體片段之形式；呈由與VL結構域共價連接之VH結構域組成之scFv之形式)。
由於該等獨特性質，使用VHH結構域-單獨或作為較大多肽之一部分-提供許多優於使用習用VH及VL結構域、scFv或習用 抗體片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)之顯著優勢：
- 僅需要單一結構域以高親和力及高選擇性結合抗原，從而使得既不需要存在兩個單獨結構域，亦不需要確保該兩個結構域以適當空間構形及組態存在(即與scFv一般，藉助使用經特別設計之連接體)；
- VHH結構域可自單一基因表現且不需要轉譯後摺疊或修飾；
- VHH結構域可容易地改造成多價及多特異性格式(如本文進一步論述)；
- VHH結構域高度可溶且無聚集(如Ward等人，Nature 341：544-546(1989)所闡述之小鼠源性抗原結合結構域一樣)趨勢；
- VHH結構域對熱、pH、蛋白酶及其他變性劑或條件高度穩定，且因此可在製備、儲存或運輸中不使用冷凍設備，從而達成成本、時間及環境節約；
- VHH結構域易於製備且相對廉價，甚至在生產所需之規模上亦如此。例如，VHH結構域及含有其之多肽可使用微生物發酵(例如，如下文進一步闡述)產生且如(例如)習用抗體片段一樣不需使用哺乳動物表現系統；
- VHH結構域與習用4鏈抗體及其抗原結合片段相比相對較小(大約15 kDa或大小為習用IgG之1/10)，且因此相比於習用4鏈抗體及其抗原結合片段，
-- 顯示較高之組織滲透性且
-- 可以較高劑量投與。
- VHH結構域可顯示所謂腔結合性質(尤其歸因於與習用VH結構域相比其延長之CDR3環)且從而亦可到達習用4鏈抗體及其抗原結合片段不可到達之靶及表位。
先前已在(例如)WO2006/040153及WO2006/122786中闡述獲得 與特異性抗原或表位結合之VHH結構域之方法。其中亦詳細闡述，源自駱駝科之VHH結構域可藉由出現在習知來自人類之4鏈抗體之VH結構域中之相應位置處一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列之胺基酸序列中一或多個胺基酸殘基來進行「擬人化」。擬人化VHH結構域可含有一或多個完整人類框架區序列，且在甚至更具體實施例中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分之人類框架區序列，其情況與JH序列(例如JH5)組合。
f2)「結構域抗體(Domain antibodies)」亦稱作「Dab」、「結構域抗體(Domain Antibodies)」及「dAb」(術語「結構域抗體」及「dAb」係GlaxoSmithKline公司集團使用之商標)，其闡述於(例如)Ward,E.S.等人：「Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli」；Nature 341：544-546(1989)；Holt,L.J.等人：「Domain antibodies：proteins for therapy」；TRENDS in Biotechnology 21(11)：484-490(2003)；及WO2003/002609中。
結構域抗體基本上對應於非駱駝科哺乳動物，特定而言人類4鏈抗體之VH或VL結構域。為結合作為單一抗原結合結構域之表位，即不分別與VL或VH結構域配對，需要藉由(例如)使用人類單一VH或VL結構域序列之文庫明確選擇該等抗原結合性質。
與VHH一樣，結構域抗體具有大約13 kDa至大約16 kDa之分子量，且若源自完整人類序列，則不需要針對(例如)用於人類之治療用途進行擬人化。如在VHH結構域之情形下，其亦在原核表現系統中充分表現，從而顯著降低整體製造成本。
結構域抗體及VHH結構域可藉由在一或多個CDR之胺基酸序列中引入一或多個改變來進行親和力突變，該等改變導致與各別親本分子相比，可以改善所得免疫球蛋白單一可變結構域對其各別抗原之 親和力。本發明之親和力成熟免疫球蛋白單一可變結構域分子可藉由業內已知之方法製得，如(例如)Marks等人，1992,Biotechnology 10：779-783或Barbas，等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813；Shier等人，1995,Gene 169：147-155；Yelton等人，1995,Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992,J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson and RE Hawkins,「Affinity maturation of antibodies using phage display」,Oxford University Press 1996所述。
f3)此外，熟習此項技術者亦將明瞭，可將上文所提及一或多個CDR「移植」於其他「架構」(包括(但不限於)人類架構或非免疫球蛋白架構)上。業內已知適宜架構及該CDR移植之技術。
g)術語「表位」及「抗原決定簇」可互換使用，其係指由抗原結合分子(例如本發明習用抗體或多肽)且更特定而言由該等分子之抗原結合位點識別之大分子(例如多肽)的一部分。表位界定免疫球蛋白之最小結合位點，且因此代表免疫球蛋白之特異性的靶。
抗原結合分子(例如本發明習用抗體或多肽)中識別表位之部分稱作互補位。
h)本文所用術語「雙互補位」(抗原-)結合分子或「雙互補位」多肽應意指如本文所定義包含第一免疫球蛋白單一可變結構域及第二免疫球蛋白單一可變結構域之多肽，其中該兩個可變結構域能夠與一抗原之兩個不同表位結合，該等表位通常不同時由一單特異性免疫球蛋白(例如習用抗體或一免疫球蛋白單一可變結構域)結合。雙互補位多肽可包括具有不同表位特異性之可變結構域，且不含與同一表位結合之互補可變結構域對。因此，該兩個可變結構域不彼此競爭與靶結合。
i)據稱可與某一表位、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或 表位)「結合」或「特異性結合」且對其「具有親和力」及/或「具有特異性」之多肽(例如本發明免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域、或通常抗原結合分子或其片段)係「針對」(「against」或「directed against」)該表位、抗原或蛋白質或係關於該表位、抗原或蛋白質之「結合」分子，據稱該多肽係「抗」表位、「抗」抗原或「抗」蛋白質(例如抗CX3CR1)。
k)術語「特異性」通常係指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如本發明免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域或多肽)可結合之不同類型抗原或表位的數量。抗原結合蛋白之特異性可基於其親和力及/或親合力測定。親和力由抗原與抗原結合蛋白之解離平衡常數(KD)代表，其係表位與抗原結合蛋白上之抗原結合位點之間之結合強度的量度：KD值愈小，則表位與抗原結合分子之間之結合強度愈強(或者，親和力亦可表示為親和力常數(KA)，其係1/KD)。如熟習此項技術者所明瞭(例如，基於本文其他揭示內容)，視目標特異性抗原而定，可以本身已知方式測定親和力。親合力係抗原結合分子(例如本發明免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域或多肽)與有關抗原之間之結合強度的量度。親合力與表位與其在抗原結合分子上之抗原結合位點之間之親和力及抗原結合分子上存在之有關結合位點的數量有關。
l)根據標準的三個字母或一個字母胺基酸代碼指示胺基酸殘基，如業內通常所知並認可。在比較兩種胺基酸序列時，術語「胺基酸差別」係指與第二序列相比在參照序列位置處的所指示數量之胺基酸殘基的插入、缺失或取代。在取代之情形下，該(等)取代較佳為保守胺基酸取代，此意指胺基酸殘基經具有相似化學結構且對多肽之功能、活性或其他生物性質具有極小或基本上無影響之另一胺基酸殘基替代。該等保守胺基酸取代已為業內自(例如)WO 98/49185所熟知， 其中保守胺基酸取代較佳係以下群組(i)-(v)中之一胺基酸經同一群組中之另一胺基酸殘基取代的取代：(i)小的脂肪族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)極性、帶負電荷之殘基及其(不帶電荷)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)極性、帶正電荷之殘基：His、Arg及Lys；(iv)大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤佳保守胺基酸取代係如以下：Ala取代為Gly或取代為Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或取代為His；Asp取代為Glu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或取代為Pro；His取代為Asn或取代為Gln；Ile取代為Leu或取代為Val；Leu取代為Ile或取代為Val；Lys取代為Arg、取代為Gln或取代為Glu；Met取代為Leu、取代為Tyr或取代為Ile；Phe取代為Met、取代為Leu或取代為Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp或取代為Phe；Val取代為Ile或取代為Leu。
m)例如，在與獲得核酸或多肽分子之天然生物來源及/或反應培養基或培養基相比時-若核酸或多肽分子已與通常在該來源或培養基中與其結合之至少一種其他組份(例如另一核酸、另一蛋白質/多肽、另一生物組份或大分子或至少一種污染物、雜質或次要組份)分離，則將其視為「(呈)基本上分離(形式)」。特定而言，若核酸或多肽分子已純化至少2倍、特定而言至少10倍、更特定而言至少100倍及高達1000倍或更多倍，則將其視為「基本上分離」。「呈基本上分離形式」之核酸或多肽分子較佳基本上均勻，如使用適宜技術(例如適宜層析技術，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳)所測定。
n)例如兩個免疫球蛋白單一可變結構域序列之間之「序列一致性」指示該兩個序列之間一致之胺基酸之百分比。其可如WO08/020079第49及50頁上第f)段中所述計算或測定。「序列相似性」指示一致或代表保守胺基酸取代之胺基酸之百分比。
靶特異性
本發明多肽對人類CX3CR1具有特異性。因此，本發明多肽較佳與人類CX3CR1(SEQ ID NO：255)結合。在一態樣中，本發明多肽亦與食蟹猴CX3CR1(SEQ ID NO：256)結合。
本發明多肽
本發明提供預防、治療、緩和及/或診斷CX3CR1相關疾病、病症或病狀(例如心血管疾病)之新穎醫藥活性劑。特定而言，本發明提供與人類CX3CR1結合且能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合之多肽。在一態樣中，該多肽係包含抗原結合結構域之免疫球蛋白，該抗原結合結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2及CDR3，其中該免疫球蛋白與人類CX3CR1結合且能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合。在又一態樣中，該多肽包含一或多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域，其中該 多肽能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合。
在一態樣中，本發明多肽之特徵在於一或多個以下性質：●以高親和力與人類CX3CR1結合，例如EC50小於或等於10 nM、小於或等於5 nM、小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM，如藉由來測定細胞結合FACS；●以(例如)如下之IC50阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合：小於或等於300 nM、或小於或等於100 nM、或小於或等於20 nM、或小於或等於10 nM、或小於或等於5 nM、或小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM；●以(例如)如下之IC50抑制藉由人類CX3CR1介導之弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用：小於或等於500 nM或小於或等於100 nM、或小於或等於75 nM、或小於或等於50 nM、或小於或等於10 nM或小於或等於5 nM；所獲得之抑制效力超過或等於15%、或超過或等於50%、或超過或等於80%或超過或等於95%；●以(例如)如下之IC50抑制藉由人類CX3CR1介導之弗萊托肯趨化因子誘導之內化：小於或等於10 nM或小於或等於5 nM；●以在(例如)人類CX3CR1之結合及功能抑制之E/IC50之10倍內的E/IC50與食蟹猴CX3CR1交叉反應。
在又一態樣中，本發明多肽進一步包含延長半衰期之部分，例如白蛋白結合部分、聚乙二醇分子或Fc結構域。在又一態樣中，本發明多肽包含兩個或更多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域。在一態樣中，該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係藉由連接肽共價連接。在一態樣中，本發明多肽中之該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域具有相同胺基酸序列。在另一態樣中，本發明多肽中之該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域具有不同胺基酸序列。在一態樣中，本發明多肽包含兩個抗 CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域且進一步包含延長半衰期之部分，例如白蛋白結合部分、聚乙二醇分子或Fc結構域。
在一態樣中，本發明多肽包含藉由第一連接肽與白蛋白結合部分共價連接之第一抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域，其中該白蛋白結合部分進一步藉由第二連接肽與第二抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域共價連接。
在一態樣中，本發明多肽包含藉由連接肽與Fc結構域共價連接之抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域。在一態樣中，包含藉由連接肽與Fc結構域共價連接之抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域之該多肽係以(例如)藉助雙硫橋之二聚體形式提供。
本發明多肽係如下文所闡述獲得。總而言之，自表現源自用編碼人類CX3CR1之DNA進行免疫之駱馬之單一可變結構域(VHH)的文庫識別本發明單一可變結構域。在hCX3CR1病毒性脂質顆粒上淘選噬菌體文庫，且針對競爭與Alexa-fluor標記弗萊托肯趨化因子(AF-FKN)結合之受體之能力篩選結合噬菌體。本文進一步闡述本發明之代表性單一可變結構域。
在一態樣中，本發明之免疫球蛋白單一可變結構域基本上係由四個框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)及三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)組成。特定而言，免疫球蛋白單一可變結構域具有結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在一態樣中，免疫球蛋白單一可變結構域係抗體結構域。
在一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明之免疫球蛋白單一結構域之CDR3具有SEQ ID NO：197中所闡釋之胺基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5，其中：- Xaa1係Pro、Ala或Gly；- Xaa2係Asp或Asn； - Xaa3係Thr或Ser；- Xaa4係Arg、Lys、Ala或Gly；且- Xaa5係Tyr或Phe。
在一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域之CDR3具有SEQ ID NO：197中所闡釋之胺基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5，其中：- Xaa1係Pro、Ala或Gly；- Xaa2係Asp或Asn；- Xaa3係Thr；- Xaa4係Arg或Lys；且- Xaa5係Tyr。
在一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域之CDR3具有SEQ ID NO：186中所闡釋之Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr之胺基酸序列。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：- CDR1：a)具有胺基酸序列GSIFSSNAMA(SEQ ID NO：141)；或b)具有與SEQ ID NO：141之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)具有與SEQ ID NO：141之胺基酸序列具有2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於2位處S已變為T或G；- 於6位處S已變為R；- 於7位處N已變為T；及/或- 於9位處M已變為K；或 d)具有選自SEQ ID NO：141-145及213中之任一者之胺基酸序列；- CDR2：a)具有胺基酸序列GINSVGITK(SEQ ID NO：164)；或b)具有與SEQ ID NO：164之胺基酸序列具有至少70%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)具有與SEQ ID NO：164之胺基酸序列具有4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於1位處G已變為A、L、V或S；- 於3位處N已變為D、S、Q、G或T；- 於4位處S已變為T、K、G或P；- 於5位處V已變為A；- 於6位處G已變為D；- 於7位處I已變為T或V；- 於8位處T已變為A；及/或- 於9位處K已變為R；或d)具有選自SEQ ID NO：162-175及214-221中之任一者之胺基酸序列；且- CDR3：a)具有胺基酸序列DPRRGWDTRY(SEQ ID NO：186)；或b)具有與SEQ ID NO：186之胺基酸序列具有至少70%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)具有與SEQ ID NO：186之胺基酸序列具有3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於2位處P已變為A或G；- 於7位處D已變為N；及/或 - 於9位處R已變為K；或d)具有選自SEQ ID NO：186-190中之任一者之胺基酸序列。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有以下CDR1、CDR2及CDR3，其中：- 該CDR1具有胺基酸序列GRTFSSYAMG(SEQ ID NO：146)；- 該CDR2具有a)與胺基酸序列GISGSASRKY(SEQ ID NO：176)具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列，或b)具有SEQ ID NO：176或177之胺基酸序列；且- 該CDR3具有胺基酸序列SNSYPKVQFDY(SEQ ID NO：191)。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：- 該CDR1：a)具有胺基酸序列GTIFSNNAMG(SEQ ID NO：147)；或b)具有與SEQ ID NO：147之胺基酸序列具有6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於1位處G已變為K、R或A；- 於2位處T已變為I、P、S或L；- 於3位處I已變為V或T；- 於4位處F已變為L；- 於5位處S已變為R或D；- 於6位處N已變為S、T或D；及/或- 於7位處N已變為T或Y；或c)具有選自SEQ ID NO：147-161中之任一者之胺基酸序列；- 該CDR2：a)具有胺基酸序列SISNSGSTN(SEQ ID NO：179)；或 b)具有與SEQ ID NO：179之胺基酸序列具有4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於3位處S已變為T或G；- 於4位處N已變為S或I；- 於5位處S已變為T；- 於6位處G已變為Y；及/或- 於8位處T已變為A；或c)具有選自SEQ ID NO：178-185中之任一者之胺基酸序列；且- 該CDR3：a)具有胺基酸序列DARRGWNTAY(SEQ ID NO：192)；或b)具有與SEQ ID NO：192之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)具有與SEQ ID NO：192之胺基酸序列具有2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列，其中- 於2位處A已變為G；- 於8位處T已變為S；- 於9位處A已變為G；及/或- 於位10處Y已變為F；或d)具有選自SEQ ID NO：192-196中之任一者之胺基酸序列。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：- 分別如SEQ ID No：141、162及186；或- 分別如SEQ ID No：141、163及187；或- 分別如SEQ ID No：141、164及186；或- 分別如SEQ ID No：141、166及186；或 - 分別如SEQ ID No：141、167及186；或- 分別如SEQ ID No：141、167及189；或- 分別如SEQ ID No：141、168及186；或- 分別如SEQ ID No：141、168及187；或- 分別如SEQ ID No：141、169及190；或- 分別如SEQ ID No：141、170及186；或- 分別如SEQ ID No：141、171及186；或- 分別如SEQ ID No：141、174及186；或- 分別如SEQ ID No：141、175及187；或- 分別如SEQ ID No：142、165及188；或- 分別如SEQ ID No：142、173及188；或- 分別如SEQ ID No：143、164及186；或- 分別如SEQ ID No：144、172及187；或- 分別如SEQ ID No：145、172及187；或- 分別如SEQ ID No：141、214及186；或- 分別如SEQ ID No：141、215及186；或- 分別如SEQ ID No：141、216及186；或- 分別如SEQ ID No：141、217及186；或- 分別如SEQ ID No：141、218及186；或- 分別如SEQ ID No：141、219及186；或- 分別如SEQ ID No：141、220及186；或- 分別如SEQ ID No：213、221及186；或- 分別如SEQ ID No：213、214及186。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：- 分別如SEQ ID No：146、176及191；或 - 分別如SEQ ID No：146、177及191。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：- 分別如SEQ ID No：147、178及192；或- 分別如SEQ ID No：147、179及192；或- 分別如SEQ ID No：147、179及194；或- 分別如SEQ ID No：148、179及193；或- 分別如SEQ ID No：149、179及192；或- 分別如SEQ ID No：149、180及192；或- 分別如SEQ ID No：149、181及192；或- 分別如SEQ ID No：149、183及192；或- 分別如SEQ ID No：149、185及192；或- 分別如SEQ ID No：150、179及194；或- 分別如SEQ ID No：150、182及194；或- 分別如SEQ ID No：151、179及193；或- 分別如SEQ ID No：151、182及194；或- 分別如SEQ ID No：151、184及196；或- 分別如SEQ ID No：152、179及195；或- 分別如SEQ ID No：153、179及194；或- 分別如SEQ ID No：154、182及194；或- 分別如SEQ ID No：155、179及195；或- 分別如SEQ ID No：156、181及192；或- 分別如SEQ ID No：157、179及194；或- 分別如SEQ ID No：158、179及192；或- 分別如SEQ ID No：159、178及192；或- 分別如SEQ ID No：160、179及194；或 - 分別如SEQ ID No：161、179及194。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有如下CDR1、CDR2及CDR3：- SEQ ID NO：141、164及186；或- SEQ ID NO：141、162及186。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一結構域具有如下CDR1、CDR2及CDR3：- SEQ ID NO：213、214及186；或- SEQ ID NO：213、221及186；或- SEQ ID NO：141、162及186。
具有上文所闡述CDR之本發明代表性多肽係顯示於表1、表2、表3(分別如家族101、9及13之代表性多肽)及表4(家族101之優化變體之代表性多肽)中。
輯)，Springer Verlag Heidelberg Berlin，2010測定CDR序列。表(SEQ)中之序列編號係指本申請案之序列清單中之序列。
在又一態樣中，本發明提供具有一或多個VHH結構域之多肽。
在一態樣中，本發明VHH結構域包含如下序列或基本上係由其組成：a)SEQ ID NO：3之胺基酸序列；或b)與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基 酸序列；或d)SEQ ID NO：1-48或SEQ ID NO：121-140或SEQ ID NO：222-224中之任一者之胺基酸序列。
在又一態樣中，本發明VHH結構域包含如下序列或基本上係由其組成：a)SEQ ID NO：49之胺基酸序列；或b)與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少95%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列；或d)SEQ ID NO：49-52中之任一者之胺基酸序列。
在又一態樣中，本發明VHH結構域包含如下序列或基本上係由其組成：a)SEQ ID NO：67之胺基酸序列；或b)與SEQ ID NO：67之胺基酸序列具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)與SEQ ID NO：67之胺基酸序列具有12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸差異之胺基酸序列；或d)SEQ ID NO：53-120中之任一者之胺基酸序列。
在又一態樣中，本發明VHH結構域包含SEQ ID NO：121-140或SEQ ID NO：222-224中之任一者中所闡述之胺基酸序列或基本上係由其組成。
在又一態樣中，本發明VHH結構域包含SEQ ID NO：138-140中之任一者中所闡述之胺基酸序列或基本上係由其組成。
在又一態樣中，本發明VHH結構域包含SEQ ID NO：222-224中 之任一者中所闡述之胺基酸序列或基本上係由其組成。
本發明之代表性VHH結構域係顯示於表5中且本發明之代表性經優化VHH結構域係顯示於下表6中：
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一可變結構域針對穩定性、效能、可製造性及/或與人類框架區之相似性經擬人化及/或優化。例如，該多肽在以下位置(根據Kabat編號)中之一或多者經擬人化及/或序列優化：1、11、14、16、74、83、108。在一態樣中，該多肽包含以下突變中之一或多者：E1D、 S11L、A14P、E16G、A74S、K83R、Q108L。
在一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一可變結構域之一或多個框架區經擬人化及/或序列優化。在一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一可變結構域包含如(例如)下文所闡釋之框架區(FR)：i)FR1係選自SEQ ID NO：198-204中之任一者；ii)FR2係選自SEQ ID NO：205-208中之任一者；iii)FR3係選自SEQ ID No：209-210中之任一者；及/或iv)FR4係選自SEQ ID NO：211-212中之任一者。
業內已知亦可用作上文所闡述免疫球蛋白單一可變結構域之框架區序列之人類免疫球蛋白框架區序列(FR)。業內亦已知使源自除人類以外物種之免疫球蛋白單一可變結構域之框架區擬人化的方法。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一可變結構域之一或多個CDR區經擬人化及/或序列優化。在一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一可變結構域在以下位置(根據Kabat編號)中之一或多者經擬人化及/或序列優化：52、53。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一可變結構域包含以下突變中之一或多者：N52S、S53T。
在又一態樣中，本發明多肽、特定而言本發明免疫球蛋白單一可變結構域包含選自SEQ ID NO：214-221中之任一者之CDR2。
本發明之代表性擬人化及/或優化序列係顯示於上文表4及表6及下表7中。
表7：序列經優化變體
表7a顯示序列經優化變體之FR1-CDR1-FR2-CRD2，表7b顯示該等變體之FR3-CDR3-FR4-CDR4。表中之序列編號(SEQ)係指本申 請案之序列清單中之序列。
在本發明之一態樣中，本發明多肽可另外含有修飾，例如糖基殘基、經修飾胺基酸側鏈及諸如此類。
熟習此項技術者將明瞭，對於在人類中之醫藥用途，本發明多肽較佳係針對人類CX3CR1，而出於獸醫目的，本發明多肽較佳係針對來自欲治療物種之CX3CR1。
熟習此項技術者亦將明瞭，當用作人類之治療劑時，本發明多肽中所包含之免疫球蛋白單一可變結構域較佳係擬人化免疫球蛋白單一可變結構域。
根據本發明，免疫球蛋白單一可變結構域可係結構域抗體(即VL或VH抗體)及/或上文所闡述VHH結構域及/或任一其他種類之免疫球蛋白單一可變結構域(例如駱駝化VH)，限制條件係此等免疫球蛋白單一可變結構域係抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域。
在本發明之一態樣中，免疫球蛋白單一可變結構域基本上係由結構域抗體序列或上文所闡述VHH結構域序列組成。特定而言，免疫球蛋白單一可變結構域基本上係由VHH結構域序列組成。
在又一態樣中，本發明多肽包含兩個或更多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域。在又一態樣中，本發明多肽包含兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域，例如抗CX3CR1 VHH。在一態樣中，本發明多肽中之該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域具有相同胺基酸序列。在另一態樣中，本發明多肽中之該兩個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域具有不同胺基酸序列。
根據本發明之另一實施例，本發明多肽中存在之至少兩個免疫球蛋白單一可變結構域可彼此直接(亦即不使用連接體)連接或經由連接體連接。該連接體較佳係連接肽，且根據本發明將選擇可以容許在同一個CX3CR1分子內或在兩個不同分子內結合至少兩個免疫球蛋白單一可變結構域與CX3CR1。
適宜連接體尤其取決於表位且特別是免疫球蛋白單一可變結構域所結合CX3CR1上之表位之間的距離，且熟習此項技術者將可基於本文揭示內容，視情況在一定有限程度之常規實驗後了解適宜之連接體。
而且，當兩個或更多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域 係結構域抗體或VHH結構域時，其亦可經由第三結構域抗體或VHH結構域彼此連接(其中該兩個或更多個免疫球蛋白單一可變結構域可與第三結構域抗體或VHH結構域直接連接或經由適宜連接體連接)。此一第三結構域抗體或VHH結構域可係(例如)延長半衰期之結構域抗體或VHH結構域，如本文中所經一步闡述。例如，後一結構域抗體或VHH結構域可係能夠與(人類)血清蛋白(例如(人類)血清白蛋白或(人類)轉鐵蛋白)結合之結構域抗體或VHH結構域。
或者，兩個或更多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域可串聯連接(直接或經由適宜連接體)且第三(單一)結構域抗體或VHH結構域(其可延長半衰期，如上文所闡述)可與該兩個或更多個上述免疫球蛋白序列中之一者直接連接或經由連接體連接。
適宜連接體係結合本發明之具體多肽闡述於本文中，且可-例如且不限於-包含胺基酸序列，該胺基酸序列之長度較佳為5個或更多個胺基酸、7個或更多個胺基酸、9個或更多個胺基酸、11個或更多個胺基酸、15個或更多個胺基酸或至少17個胺基酸，例如約20個至40個胺基酸。然而，上限並非關鍵，但出於便於(例如)該等多肽之生物醫藥生產之原因進行選擇。
連接體序列可為天然存在之序列或非天然存在之序列。若用於治療目的，則連接體較佳在投與本發明多肽之個體中具有非免疫原性。
連接體序列之一有用群組係源自重鏈抗體之鉸鏈區之連接體，如WO 96/34103及WO 94/04678中所闡述。
其他實例係聚丙胺酸連接體序列，例如Ala-Ala-Ala。
連接體序列之更佳實例係不同長度之Gly/Ser連接體，例如(glyxsery)z連接體，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3及(gly3ser2)3。
若藉由附接聚合物(例如聚乙二醇(PEG)部分)修飾本發明多肽，則連接體序列較佳包括胺基酸殘基，例如半胱胺酸或離胺酸，其容許在連接體區中進行該修飾(例如聚乙二醇化)。
連接體之實例係：
GGGGS(5GS連接體，SEQ ID NO：233)
SGGSGGS(7GS連接體，SEQ ID NO：234)
GGGGCGGGS(8GS連接體，SEQ ID NO：235)
GGGGSGGGS(9GS連接體，SEQ ID NO：236)
GGGGSGGGGS(10GS連接體，SEQ ID NO：237)
GGGGSGGGGSGGGGS(15GS連接體，SEQ ID NO：238)
GGGGSGGGGSGGGGGGGS(18GS連接體，SEQ ID NO：239)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(20GS連接體，SEQ ID NO：240)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(25GS連接體，SEQ ID NO：241)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(30GS連接體，SEQ ID NO：242)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS連接體，SEQ ID NO：243)
EPKSCDKTHTCPPCP(G1鉸鏈連接體，SEQ ID NO：244)
GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(9GS-G1鉸鏈連接體，SEQ ID NO：245)
EPKTPKPQPAAA(駱馬上游長鉸鏈區，SEQ ID NO：246)
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP(G3鉸鏈，SEQ ID NO：247)
AAA(Ala連接體，SEQ ID NO：248)
此外，連接體亦可為聚(乙二醇)部分，如(例如)WO04/081026中 所顯示。
包含兩個或更多個抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域或由其組成之多肽之非限制性實例係在表8a中給出。
在另一實施例中，本發明多肽之至少兩個免疫球蛋白單一可變結構域經由另一部分(視情況經由一或多個連接體)、例如在較佳但非 限制性實施例中可為上文已闡述之又一免疫球蛋白單一可變結構域的多肽彼此連接。該部分可基本上無活性或可具有生物效應(例如改良多肽之期望性質)或可賦予多肽一或多個其他期望性質。例如且不限於，該部分可改良蛋白質或多肽之半衰期，及/或可降低其免疫原性或改良任一其他期望性質。
在一態樣中，本發明多肽尤其在用作治療劑時包括延長本發明多肽在血清或患者之其他體液中之半衰期之部分。術語「半衰期」意指(經修飾)多肽之血清濃度因(例如)多肽之降解及/或由天然機制進行之清除及/或隔離在活體內降低50%所耗費之時間。
根據本發明之又一實施例，兩個免疫球蛋白單一可變結構域可與血清白蛋白分子融合，例如於(例如)WO01/79271及WO03/59934中所闡述。
或者，該延長半衰期之部分可與多肽共價連接或融合且可為(不限於)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白部分之片段、白蛋白結合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域)、轉鐵蛋白結合部分(例如抗轉鐵蛋白免疫球蛋白單一可變結構域)、聚環氧烷分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白結合肽或羥乙基澱粉(HES)衍生物。
在另一實施例中，本發明多肽包含與血液中發現之抗原(例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、血纖維蛋白原或轉鐵蛋白)結合之部分，藉此賦予本發明所得之多肽延長之活體內半衰期。根據一實施例，該部分係白蛋白結合免疫球蛋白且特定而言白蛋白結合免疫球蛋白單一可變結構域，例如白蛋白結合VHH結構域。
在另一實施例中，本發明多肽包含與血清白蛋白結合之部分，其中該部分係白蛋白結合肽，如(例如)國際專利公開案WO2008/068280及WO2009/127691中所闡述。
若意欲用於人類中，則該白蛋白結合免疫球蛋白單一可變結構 域(亦稱作抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域)將較佳與人類血清白蛋白結合，且將較佳為擬人化白蛋白結合VHH結構域。
與人類血清白蛋白結合之免疫球蛋白單一可變結構域為業內所已知且進一步詳細闡述於(例如)WO2006/122786中。特別有用之白蛋白結合VHH結構域係由SEQ ID NO：230-232中之任一者中所闡述之胺基酸序列組成或含有其：
根據一實施例，本發明多肽可與賦予本發明多肽一或多個效應子功能及/或可賦予與一或多個Fc受體結合之能力的一或多個抗體部分、片段或結構域連接。例如，出於此目的，且不限於此，抗體部分可為或可包含抗體、例如重鏈抗體(如上文所闡述)且更佳習用人類4鏈抗體之CH2及/或CH3結構域；具體而言，本發明多肽可與來自(例如)人類IgG、人類IgE或另一人類Ig之Fc區連接。例如，WO 94/04678闡述包含駱駝科VHH結構域或其擬人化衍生物之重鏈抗體，其中駱駝科CH2及/或CH3結構域已經人類CH2及/或CH3結構域替代，以提供由2個重鏈組成之免疫球蛋白，每一重鏈包含-視 情況擬人化-VHH結構域及人類CH2及CH3結構域(但無CH1結構域)，該免疫球蛋白具有由CH2及CH3結構域提供之效應子功能，可在不存在任何輕鏈之情況下起作用，且與無該修飾之相應VHH結構域相比具有延長之半衰期。
在一態樣中，本發明多肽包含兩個抗CX3CR1 VHH及能夠與血清白蛋白結合之VHH。在一態樣中，使用連接肽融合VHH。本發明該等多肽之代表性實例係顯示於下文中。
在一態樣中，本發明多肽包含與第一連接肽融合之第一抗CX3CR1 VHH，該第一連接肽自身與能夠與血清白蛋白結合之VHH融合，該VHH自身與第二連接肽融合，該第二連接肽自身與第二抗CX3CR1 VHH融合。在一態樣中，第一或第二連接肽係9GS連接體，在一態樣中，第一及第二連接肽係9GS連接體。在一態樣中，能夠與血清白蛋白結合之VHH能夠與人類血清白蛋白結合。在一態樣中，能夠與血清白蛋白結合之VHH具有SEQ ID NO：231中所闡述之胺基酸序列。在一態樣中，第一及第二抗CX3CR1 VHH具有相同胺基酸序列。在一態樣中，第一或第二抗CX3CR1 VHH具有如下CDR1、CDR2及CDR3：- SEQ ID NO：213、214及186；或- SEQ ID NO：213、221及186；或- SEQ ID NO：141、162及186。
在一態樣中，第一及第二抗CX3CR1 VHH具有如下CDR1、CDR2及CDR3：- SEQ ID NO：213、214及186；或- SEQ ID NO：213、221及186；或- SEQ ID NO：141、162及186。
在一態樣中，第一或第二抗CX3CR1 VHH具有SEQ ID NO：138 至140或SEQ ID NO：222至224中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一態樣中，第一及第二抗CX3CR1 VHH具有相同胺基酸序列，其中該胺基酸序列係SEQ ID NO：138至140或SEQ ID NO：222至224中之任一者中所闡述之序列。
本發明多肽之非限制性實例係SEQ ID NO：225至227、249或277至281中之任一者之多肽。
在另一態樣中，本發明多肽包含抗CX3CR1 VHH及Fc結構域。在一態樣中，本發明多肽包含與連接肽融合之抗CX3CR1 VHH，該連接肽自身與Fc結構域融合。在一態樣中，連接肽係15GS連接體。在一態樣中，Fc結構域具有SEQ ID NO：250或252中所闡述之胺基酸序列。在一態樣中，VHH具有如下CDR1、CDR2及CDR3：- SEQ ID NO：213、214及186；或- SEQ ID NO：213、221及186；或- SEQ ID NO：141、162及186。
在一態樣中，VHH具有SEQ ID NO：138至140或SEQ ID NO：222至224中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一態樣中，多肽係呈二聚體之形式，例如其中二聚體係藉由一或多個雙硫橋形成。
本發明多肽之非限制性實例係SEQ ID NO：251、253或254之多肽。
本發明多肽可經修飾以改良其性質。在一態樣中，本發明多肽可經修飾以增加其儲存時之穩定性。在一態樣中，本發明多肽可經修飾以促進其在特定宿主系統中之表現。例如，可修飾本發明多肽之第一密碼子。在一態樣中，本發明多肽以麩胺酸(glu)開始作為其第一胺基酸。在另一態樣中，本發明多肽以天冬胺酸(asp)開始作為其第一胺基酸，以(例如)降低儲存期間N端處之焦麩胺酸鹽形成前從而增加產物穩定性。在另一態樣中，本發明多肽以丙胺酸(ala)或纈氨酸(val)開始作為其第一胺基酸，以(例如)促進多肽在原核表現系統(例如大腸桿菌(Escherichia coli))中之表現。使用業內已知技術進行本發明多肽之該修飾。
具有經修飾第一密碼子之本發明多肽之代表性實例係闡釋於 SEQ ID NO：257-262及263-266中之任一者中，且係顯示於下表11及表12中：
在又一態樣中，本發明多肽之特徵在於中之一或多者以下性質：●以高親和力與人類CX3CR1結合；●抑制可溶弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合；●抑制弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用；●抑制弗萊托肯趨化因子誘導之人類CX3CR1受體內化；●以在人類CX3CR1之結合及功能抑制之E/IC50之10倍內的E/IC50與食蟹猴CX3CR1交叉反應。
因此，在一態樣中，本發明多肽對人類CX3CR1具有IC50小於或等於10 nM、或小於或等於5 nM、或小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM之親和力，如藉由來測定競爭FACS。
在又一態樣中，本發明多肽對人類CX3CR1具有EC50小於或等於10 nM、或小於或等於5 nM、或小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM之親和力，如藉由來測定細胞結合FACS。
在又一態樣中，本發明多肽以或高於50%、或以或高於60%、或以或高於70%、或以或高於80%、或以或高於90%或以或高於 95%阻斷人類CX3CR1與人類弗萊托肯趨化因子之結合，如藉由競爭FACS利用人類弗萊托肯趨化因子來測定。
在又一態樣中，本發明多肽以如下之IC50阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合：小於或等於300 nM、或小於或等於100 nM、或小於或等於20 nM、或小於或等於10 nM、小於或等於5 nM、小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM，如藉由競爭FACS利用人類弗萊托肯趨化因子來測定。
在又一態樣中，本發明多肽以或高於10%、或以或高於30%、或以或高於40%、或以或高於50%、或以或高於60%、或以或高於70%、或以或高於80%或以或高於90%抑制藉由人類CX3CR1介導之弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用。
在又一態樣中，本發明多肽以如下之IC50抑制藉由人類CX3CR1介導之弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用：小於或等於500 nM、或小於或等於100 nM、或小於或等於75 nM、或小於或等於50 nM、或小於或等於10 nM或小於或等於5 nM。
在又一態樣中，本發明多肽以如下之IC50抑制弗萊托肯趨化因子誘導之人類CX3CR1受體內化：小於或等於10 nM、或小於或等於5 nM或小於或等於1 nM。
根據再一實施例，本發明多肽之半衰期延長修飾(該修飾亦降低多肽之免疫原性)包含附接適宜之藥理上可接受之聚合物，例如直鏈或具支鏈聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可使用任一適宜形式之聚乙二醇化，例如業內針對抗體及抗體片段(包括但不限於結構域抗體及scFv)所用之聚乙二醇化；例如，參見：Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；WO 04/060965；及 US6,875,841。
用於多肽之聚乙二醇化之各種試劑亦可購自(例如)Nektar Therapeutics,USA、或NOF公司，Japan，例如Sunbright® EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如Sunbright® ME-100MA、Sunbright® ME-200MA及Sunbright® ME-400MA。
較佳地，特定而言經由半胱胺酸殘基使用定點聚乙二醇化(例如，參見Yang等人，Protein Engineering 16,761-770(2003))。例如，出於此目的，可將PEG附接至本發明多肽中天然存在之半胱胺酸殘基，本發明多肽可經修飾以便適宜引入一或多個用於附接PEG之半胱胺酸殘基，或可將包含一或多個用於附接PEG之半胱胺酸殘基之胺基酸序列與N端及/或C端融合，及/或可將PEG附接至橋連本發明多肽之兩個或更多個功能結構域之連接區，其均使用本身為熟習此項技術者已知之蛋白質改造技術。
較佳地，對於本發明多肽而言，所用PEG之分子量超過5 kDa，例如超過10 kDa且小於200 kDa，例如小於100 kDa；例如在20 kDa至80 kDa之範圍內。
關於聚乙二醇化，應注意，本發明通常亦涵蓋在一或多個胺基酸位置處、較佳以使該聚乙二醇化出現以下情況之方式聚乙二醇化的任一本發明多肽：(1)延長活體內半衰期；(2)降低免疫原性；(3)為聚乙二醇化提供一或多個本身已知之其他有益性質；(4)基本上不會影響多肽對CX3CR1之親和力(例如，不會將該親和力降低超過50%，且更佳不超過10%，如藉由適宜分析、例如下文實例中所闡述之彼等測定)；及/或(5)不會影響本發明多肽之其他期望性質中之任一者。適宜PEG基團及附接其之方法將特別或非特別地為熟習此項技術者所明瞭。
根據本發明之特別佳實施例，本發明之聚乙二醇化多肽包括分 子量為40 kDa或60 kDa之直鏈PEG之一個PEG部分，其中將該PEG部分附接至連接區中之多肽、且具體而言在Cys殘基處、例如SEQ ID NO：235中所顯示GS8-連接肽之5位處附接。
較佳用上文所提及PEG試劑中之一者聚乙二醇化本發明聚乙二醇化多肽之較佳實例，該等試劑係例如「Sunbright® ME-400MA」，如以下化學式中所顯示：
其具有40 kDa之平均分子量。
治療用途
在一態樣中，本發明提供本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物用作醫藥。
在一態樣中，本發明提供本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物用於治療或預防以下疾病之用途：心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病及華格納氏肉芽病)、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症。
在另一態樣中，本發明提供本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物用於治療或預防動脈粥樣硬化之用途。
在另一態樣中，本發明提供本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物用於治療或預防動脈粥樣硬化之用途，此藉由預防及/或減緩新動脈粥樣硬化病灶或斑之形成及/或藉由預防或減慢現有病灶及斑之 進展來實現。
在另一態樣中，本發明提供本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物用於治療或預防動脈粥樣硬化之用途，此藉由改變斑之組成以降低斑破裂及動脈粥樣硬化血栓形成事件之風險來實現。
在一態樣中，本發明亦提供在罹患或具有該疾病或病狀之人中治療或降低以下疾病之風險之方法：心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病及華格納氏肉芽病)、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症，其中該方法包含向此人投與治療有效量之本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物。
在一態樣中，本發明亦提供在罹患或具有該疾病或病狀之風險之人中治療或降低動脈粥樣硬化之風險之方法，其中該方法包含向此人投與治療有效量之本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物。
在一態樣中，本發明亦提供在罹患或具有該疾病或病狀之風險之人中治療或降低動脈粥樣硬化之風險之方法，此藉由預防及/或減緩新動脈粥樣硬化病灶或斑之形成及/或藉由預防或減慢現有病灶及斑之進展來實現，其中該方法包含向此人投與治療有效量之本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物。
在一態樣中，本發明亦提供在罹患或具有該疾病或病狀之風險之人中治療或降低動脈粥樣硬化之風險之方法，此藉由改變斑之組成以降低斑破裂及動脈粥樣硬化血栓形成事件之風險來實現，其中該方法包含向此人投與治療有效量之本發明多肽或包含該多肽之醫藥組合物。
在一態樣中，本發明多肽適用於治療或預防與CX3CR1相關之疾病或病症。
在一態樣中，本發明多肽適用於治療或預防調節CX3CR1受體處之活性較為合意之疾病或病狀。在一態樣中，本發明亦提供治療或降低對CX3CR1受體之拮抗作用較為有益之疾病或病狀之風險之方法，該方法包含向罹患或具有該疾病或病狀之人投與本發明多肽。
預期預防與對已經受所討論疾病或病狀之先前發作或否則認為具有所討論疾病或病狀之增加之風險之人的治療尤其相關。具有患特定疾病或病狀之風險之人通常包括具有疾病或病狀之家族史之彼等或已藉由遺傳測試或篩選識別出尤其易於患該疾病或病狀之彼等。
在本發明之上下文中，術語「預防、治療及/或緩和」不僅包含預防及/或治療及/或緩和疾病，且亦通常包含預防疾病之發作、減慢或逆轉疾病之進展、預防或減慢一或多個與疾病相關之症狀之發作、減輕及/或緩和一或多個與疾病相關之症狀、減輕疾病及/或與其相關之任何症狀之嚴重性及/或持續時間及/或預防疾病及/或與其相關之任何症狀之嚴重性之進一步提高、預防、減輕或逆轉由疾病引起之任何生理損傷，及通常對所治療患者有益之任何藥理作用。
欲治療個體將係哺乳動物，且更特定而言為人類。如熟習此項技術者所明瞭，特定而言欲治療個體將為罹患或具有上文所提及疾病、病症或病狀之風險之人。
熟習此項技術者亦將明瞭，治療疾病之以上方法包括製備用於治療該疾病之醫藥。此外，很明顯，本發明多肽可用作意欲用於治療以上疾病之醫藥或醫藥組合物中之活性成分。因此，本發明亦係關於本發明多肽用於製備用以預防、治療及/或緩和上文所提及疾病、病症或病狀中之任一者之醫藥組合物的用途。本發明進一步係關於用於治療或預防用途、且具體而言用於預防、治療及/或緩和上文所提及 疾病、病症或病狀中之任一者之本發明多肽。本發明進一步係關於用於預防、治療及/或緩和上文所提及疾病、病症或病狀之醫藥組合物，其中該組合物包含至少一種本發明多肽。
本發明多肽及/或包含其之組合物可以任一適宜方式向有需要之患者投與，此取決於欲使用之具體醫藥調配物或組合物。因此，本發明多肽及/或包含其之組合物可(例如)經靜脈內、經皮下、經肌內、經腹膜內、經皮、經口、經舌下(例如呈置於舌下且在舌下吸收穿過黏膜進入毛細血管網中之舌下錠劑、噴霧或滴劑之形式)、經鼻(內)(例如以鼻噴霧及/或氣溶膠之形式)、局部地、藉助栓劑、藉助吸入、經玻璃體內(尤其用於治療乾性AMD或青光眼)或任一其他適宜方式以有效量或劑量投與。
根據適於預防、治療及/或緩和欲預防、治療或緩和之疾病、病症或病狀之治療方案投與本發明多肽及/或包含其之組合物。臨床醫師通常將能夠確定適宜治療方案，此取決於諸如以下等因素：欲預防、治療或緩和之疾病、病症或病狀、疾病之嚴重性、其症狀之嚴重性、欲使用之具體本發明多肽、欲使用之具體投與途徑及醫藥調配物或組合物、年齡、性別、體重、飲食、患者之一般狀況及臨床醫師所熟知之相似因素。通常，治療方案將包含以治療及/或預防有效量或劑量投與一或多種本發明多肽或一或多種包含其之組合物。
通常，為預防、治療及/或緩和本文所提及之疾病、病症及病狀且視欲治療之具體疾病、病症或病狀、欲使用之具體本發明多肽之效能、具體投與途徑及所使用之具體醫藥調配物或組合物而定，本發明多肽通常將以以下之量連續地(例如藉由輸注)或以單一劑量(例如每天、每週或每月劑量；參見下文)投與：介於每公斤體重及劑量0.005 mg與20.0 mg之間、較佳介於0.05 mg/kg/劑量與10.0 mg/kg/劑量之間且更佳介於0.5 mg/kg/劑量與10 mg/kg/劑量之間，但可視(尤其)前 述參數而顯著不同。
對於預防應用，含有本發明多肽之組合物亦可以相似或稍微較低劑量投與。亦可由個別內科醫師在任一併發症之事件中調整劑量。
視具體本發明多肽及其具體藥物動力學及其他性質而定，其可每天、每兩天、每三天、每四天、每五天或每六天、每週、每月及諸如此類投與。投與方案可包括長期、每週治療。「長期」意指持續至少兩週且較佳若干月或年。
視所涉及之具體疾病而定，可使用任一適宜活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知之動物模型或其任一組合測試本發明多肽及包含其之組合物之效力。適宜分析及動物模型將為熟習此項技術者所明瞭，且包括(例如)下文實例中所用之分析及動物模型。
對於醫藥用途，可將本發明多肽調配成包含以下之醫藥製劑：(i)至少一種本發明多肽，及(ii)至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑，及(iii)視情況一或多種其他醫藥活性多肽及/或化合物。「醫藥上可接受」意指各別材料在向個體投與時不顯示任何生物效應或其他方面不期望效應，且不以有害方式與含有其之醫藥組合物之任一其他組份(例如醫藥活性成分)相互作用。具體實例可參見標準手冊，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing公司，USA(1990)。例如，本發明多肽可經調配，並以任一本身已知用於習用抗體及抗體片段及其他醫藥活性蛋白質之方式投與。因此，根據又一實施例，本發明係關於含有至少一種本發明多肽及至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑及視情況一或多種其他醫藥活性物質之醫藥組合物或製劑。
藉助非限制性實例，此一調配物可呈適於如下投與之形式：經 口投與、非經腸投與(例如藉由靜脈內、肌內、皮下、鞘內、海綿體內或腹膜內注射或靜脈內輸注)、局部投與、舌下投與、藉由吸入、藉由皮膚貼片、藉由植入物、藉由栓劑投與、經皮、經鼻、玻璃體內、經直腸或經陰道投與及諸如此類。該等適宜投與形式-其可謂固體、半固體或液體，取決於投與方式-以及用於其製備之方法及載劑將為熟習此項技術者所明瞭。
用於非經腸投與(例如靜脈內、肌內、皮下注射或靜脈內輸注)之醫藥製劑可為(例如)包含活性成分且視情況在又一溶解或稀釋步驟後適於輸注或注射之無菌溶液、懸浮液、分散液、乳液或粉劑。適於該等製劑之載劑或稀釋劑包括(例如，但不限於)無菌水及醫藥上可接受之水性緩衝液及溶液(例如生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solutions)、右旋糖溶液及漢克氏溶液(Hanks’solution))；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油；以及其適宜混合物。
活性化合物或其鹽之溶液亦可含有防止微生物生長之防腐劑，例如抗細菌及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙汞硫柳酸鈉(硫柳汞(thiomersal))及諸如此類。在許多情形下，其將較佳包括等滲劑，例如糖、緩衝液或氯化鈉。可藉由(例如)形成脂質體、在分散液之情形下藉由維持所需粒徑或藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。亦可添加其他延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠。
在所有情形下，最終劑量形式必須在製造及儲存之條件下為無菌、流體且穩定。藉由將所需量之活性化合物與(視需要)各種上文所列舉之其他成分納入適當溶劑中、接著過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。在使用無菌粉劑來製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其產生由預先經無菌過濾之溶液中所存 在之活性成分加任一其他期望成分構成之粉劑。
通常，水性溶液或懸浮液將較佳。通常，適於治療性蛋白(例如本發明多肽)之調配物係緩衝蛋白質溶液，例如包括適宜濃度(例如0.001 mg/ml至400 mg/ml、較佳0.005 mg/ml至200 mg/ml、更佳0.01 mg/ml至200 mg/ml、更佳1.0 mg/ml至100 mg/ml，例如1.0 mg/ml(i.v.投與)或100 mg/ml(s.c.投與))蛋白質之溶液；及水性緩衝液，例如：- 磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，- 其他磷酸鹽緩衝液，pH 6.2至8.2，- 組胺酸緩衝液，pH 5.5至7.0，- 琥珀酸鹽緩衝液，pH 3.2至6.6，及- 檸檬酸鹽緩衝液，pH 2.1至6.2，及視情況，用於為溶液提供等滲性之鹽(例如NaCl)及/或糖或多元醇(例如海藻糖、甘露醇或甘油)。
較佳緩衝蛋白質溶液為包括溶解於25 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中之約0.05 mg/ml本發明多肽且藉由添加220 mM海藻糖調整至等滲之溶液。另外，該等溶液中可包括其他試劑，例如清潔劑，例如0.02% Tween-20或Tween-80。用於皮下施用之調配物可包括顯著較高濃度之本發明多肽，例如高達100 mg/ml或甚至100 mg/ml以上。然而，熟習此項技術者將明瞭，上文所給成分及其量僅代表一較佳選擇。其替代選擇及變化形式將為熟習此項技術者立即瞭解，或可容易地自上文揭示內容設想到。
本發明多肽亦可使用適於(例如)注射之適宜儲庫、緩慢釋放或持續釋放調配物、使用用於皮膚下植入之受控釋放器件及/或使用給藥泵或本身已知用於投與醫藥活性物質或成分之其他器件來投與。另外，可將本發明多肽調配成若置於皮膚上則穿過皮膚之凝膠、乳膏、 噴霧、滴劑、貼片或薄膜之形式。
而且，與習用抗體或抗體片段相比，使用本發明多肽之一主要優勢在於，其亦可容易地經由除非經腸投與以外之途徑來投與且可容易地經調配用於該投與。例如，如國際申請案WO2004/041867中所闡述，該等多肽可經調配用於經口、鼻內、肺內及經皮投與。
根據本發明之另一實施例，提供醫藥組合，其包含至少一種本文所揭示之本發明多肽及至少一種選自由史他汀、抗血小板劑、抗凝劑、抗糖尿病劑及抗高血壓劑組成之群之其他治療劑。
該醫藥組合視情況可另外包含稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑。
當欲使用兩種或更多種物質或成分作為組合治療方案之一部分時，其可經由同一投與途徑或經由不同投與途徑基本上同時或在不同時間(例如基本上同時、連續地或根據交替方案)投與。當欲經由同一投與途徑同時投與該等物質或成分時，其可作為不同醫藥調配物或組合物或組合醫藥調配物或組合物之一部分投與。而且，當欲使用兩種或更多種活性物質或成分作為組合治療方案之一部分時，每一物質或成分可以與當單獨使用化合物或成分時所用之量相同的量並根據與其方案相同之方案投與，且該組合使用可導致或可不導致協同效應。然而，當組合使用兩種或更多種活性物質或成分導致協同效應時，亦可能降低欲投與物質或成分中之一者、更多者或所有之量，而仍達成期望治療作用。此可用於(例如)避免、限制或減輕與當該等物質或成分中之一或多者以其常用量使用時其之使用相關之任何不期望副效應，而仍獲得期望醫藥或治療效應。
再者，本發明之又一實施例係治療上文所闡釋疾病及病症之方法，該方法包含向個體同時、單獨或依序投與有效量之至少一種本發明多肽及至少一種選自由史他汀、抗血小板劑、抗凝劑、抗糖尿病劑 及抗高血壓劑組成之群之藥劑。
根據本發明之又一態樣，本發明多肽經製備以與治療上文所闡釋疾病及病症所用之其他藥物組合投與，該等其他藥物係選自由史他汀、抗血小板劑、抗凝劑、抗糖尿病劑及抗高血壓劑組成之群。
根據本發明之再一態樣，治療上文所闡釋疾病及病症所用之藥物經製備以與本發明多肽組合投與，該等藥物係選自由史他汀、抗血小板劑、抗凝劑、抗糖尿病劑及抗高血壓劑組成之群。
根據本發明之又一態樣，本發明多肽係與用於投與多肽之器件(例如注射器、注射筆或其他器件)組合使用。
根據本發明之再一實施例，提供診斷藉由CX3CR1功能障礙介導之疾病、病症或病狀之方法，該方法包含以下步驟：a)自個體獲得樣品，及b)在活體外將樣品與上文所定義之本發明多肽接觸，及c)檢測該多肽與該樣品之結合，及d)將步驟(c)中所檢測之結合與標準物比較，其中相對於該樣品之結合差異對特徵在於CX3CR1功能障礙之疾病、病症或病狀具有診斷性。
根據本發明之另一實施例，提供診斷藉由CX3CR1功能障礙介導之疾病、病症或病狀之方法，該方法包含以下步驟：a)自個體獲得樣品，及b)將樣品與上文所定義之本發明多肽接觸；c)測定樣品中CX3CR1之量；及d)將步驟(c)中所測定之量與標準物比較，其中相對於該樣品之量之差異對特徵在於CX3CR1功能障礙之疾病、病症或病狀具有診斷性。
以上診斷方法亦可用於監測個體之治療性治療之有效性。
根據本發明之另一實施例，提供診斷藉由CX3CR1功能障礙介導之疾病、病症或病狀且用於上文所定義之方法之套組，該套組包含至少一種本發明多肽及視情況一或多種培養基、檢測構件及/或活體外或活體內顯像劑及進一步視情況使用說明書。適宜活體內顯像劑包括99mTc、111銦、123碘及用於磁共振成像之順磁化合物。
本發明進一步提供套組，該套組包含至少一種本發明多肽及另外一或多種選自由治療上文所闡述疾病及病症所用之其他藥物組成之群的其他組份及上文所闡述器件。
本發明進一步提供製造本發明多肽之方法，該等方法通常包含以下步驟：- 在容許表現本發明多肽之條件下培養包含能夠編碼本發明多肽之核酸(下文：「本發明核酸」)之宿主細胞；及，- 自培養基回收或分離由宿主細胞表現之多肽；及- 視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明多肽。
本發明核酸可為基因組DNA、cDNA或合成DNA(例如特別適於在預期宿主細胞或宿主有機體中表現之使用密碼子的DNA)。根據本發明之一實施例，本發明核酸呈基本上分離形式，如上文所定義。
本發明核酸亦可呈載體(例如質粒、黏粒或YAC)形式，可存於該載體中及/或可為該載體之一部分，該載體又可呈基本上分離形式。載體尤其可為表現載體，即可在活體外及/或活體內(即在適宜宿主細胞、宿主有機體及/或表現系統中)表現多肽之載體。該表現載體通常包含至少一種本發明核酸，其與一或多種適宜調控要素(例如啟動子、增強子、終止子及諸如此類)可操作連接。該等調控要素及表現本發明多肽所用或所必需之其他要素(例如整合因子、選擇標記、信號或前導序列、報告基因及諸如此類)之具體實例係揭示於(例如)WO2006/040153之第131頁至第133頁。
本發明核酸可以本身已知之方式(例如，藉由自動DNA合成及/或重組DNA技術)基於本文所給出之關於本發明多肽之胺基酸序列的資訊製備或獲得，及/或可分離自適宜天然來源。
根據另一實施例，本發明係關於表現或能夠表現本發明多肽；及/或含有編碼本發明多肽之核酸之宿主或宿主細胞。根據尤佳實施例，該等宿主細胞係細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
適宜細菌細胞包括來自革蘭氏(gram)陰性細菌菌株(例如大腸桿菌、變形桿菌屬(Proteus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽胞桿菌屬(Bacillus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)及乳球菌屬(Lactococcus)等菌株)之細胞。適宜真菌細胞包括來自木黴屬(Trichoderma)、紅黴菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)之細胞。適宜酵母細胞包括來自酵母屬(Saccharomyces)(例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如甲醇酵母(Pichia pastoris)及甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢遜氏酵母屬(Hansenula)之細胞。
適宜哺乳動物細胞包括(例如)CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞、NS0細胞、HEK細胞及諸如此類。然而，亦可使用業內用於表現異源蛋白之兩棲動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞及任何其他細胞。
為以工業規模生產，用於(工業)生產免疫球蛋白單一可變結構域多肽及含有其之蛋白質治療劑之較佳異源宿主包括適於大規模表現、生產及發酵、且特定而言適於大規模(生物-)醫藥表現、生產及發酵之大腸桿菌、甲醇酵母及啤酒酵母菌株。
具體表現系統之選擇將部分取決於對某些轉譯後修飾、更具體而言糖基化之需要。期望或需要糖基化之本發明多肽之產生將必須使用具有使所表現蛋白質糖基化之能力的哺乳動物表現宿主。就此而言，熟習此項技術者將明瞭，所獲得之糖基化模式(即所附接殘基之種類、數量及位置)將取決於用於表現之細胞或細胞系。
在上文所闡釋細胞中產生之本發明多肽可在細胞內(例如，在細胞溶質中、在胞外質中或在包涵體中)產生且隨後自宿主細胞分離並視情況進一步純化；或其可在細胞外(分泌至培養宿主細胞之培養基中)產生且隨後自培養基分離並視情況進一步純化。
業內已知用於多肽之重組產生之方法及試劑(例如，適宜表現載體、轉化或轉染方法、選擇標記、誘導蛋白質表現之方法、培養條件及諸如此類)。相似地，熟習此項技術者熟知用於本發明多肽之製造方法中之蛋白質分離及純化技術。
與亦需要昂貴哺乳動物細胞培養設施之習用抗體相比，藉助發酵在便利的重組宿主有機體(例如大腸桿菌及酵母)中產生本發明多肽較成本有效。此外，可達成之表現位準較高，且本發明多肽之產率係在1 g/l至10 g/l之範圍內(大腸桿菌)且高達10 g/l(酵母)及更多。
實例 過表現人類CX3CR1或食蟹猴CX3CR1之CHO、Baf/3、Caki及HEK293細胞系之生成
使用業內已知技術生成過表現人類或食蟹猴CX3CR1之CHO及Baf/3細胞。亦使用業內已知技術生成表現人類CCR2或CCR5之細胞。
對於人類CX3CR1，將cDNA選殖至pCDNA3.1(+)-neo中，而對於小鼠CX3CR1，使用pcDNA-DEST40-neo。
人類CX3CR1及食蟹猴CX3CR1之胺基酸序列係分別描述於 SEQ ID NO：255及256中。
為產生過表現人類CX3CR1或小鼠CX3CR1之駱駝腎(Caki)細胞，分別用pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1或pcDNA-DEST40-neo-mCX3CR1對親代Caki細胞實施電穿孔。對於所有條件，藉由添加1 mg/mL遺傳黴素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)選擇轉染子。
在人類胎腎(HEK293)親代細胞系中分別利用pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1或cyCX3CR1質粒之Fugene(Roche)藉由脂質介導之轉染來生成過表現人類CX3CR1或食蟹猴CX3CR1之HEK293細胞。該等細胞係用作瞬時轉染子且如此不進行選擇。簡言之，每個T75接種2*10E6個細胞，且將該等細胞在轉染前培育過夜。移除培養基後，根據製造商說明書用各別質粒(9 μg)及Fugene(27 μl)轉染細胞。轉染後48小時，收穫細胞並將其冷凍以供進一步使用。
實例1：在駱馬中利用CX3CR1之免疫誘導體液免疫反應 1.1. 免疫
倫理委員會(University Antwerp,Belgium,UA2008A1,2008/096,2007/068)批准後，對9只駱馬(指定編號368、369、370、381、382、384、312、313及314)進行免疫。
利用4次肌內注射(每週或每兩週間隔處2 mg/劑量)之pVAX1-huCX3CR1質粒載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)對6隻駱馬(312、313、314、381、382及384)進行免疫。隨後3隻駱馬(381、382及384)接受4次皮下注射之如上文所闡述產生之過表現人類CX3CR1之Caki細胞。將細胞再懸浮於D-PBS中並在注射前保持在冰上。
根據標準方案利用4次皮下注射之如上文所闡述產生之過表現人類CX3CR1之Caki細胞對三隻另外駱馬(指定編號368、369及370)進行免疫。將細胞再懸浮於D-PBS中並在注射前保持在冰上。隨後，向三 隻駱馬投與兩次具有與BSA偶合之重組CX3CR1 NT/EC3片段之注射物(表13)。肽係定購於NeoMPS(Polypeptidegroup,Strasbourg,France)並根據標準方案與BSA偶合。
將第一次注射物調配於弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant)(Difco,Detroit,MI,USA)中，而將後續注射物調配於弗氏不完全佐劑(Difco,Detroit,MI,USA)中。
1.2. 對駱馬中所誘導免疫反應之評估
為藉由ELISA或FACS評估對動物中針對人類CX3CR1之免疫反應之誘導，於第0天(免疫前)及免疫時間表中之不同時間點(外周血淋巴細胞[PBL]收集之時間)自駱馬312、313及314收集血清。
簡而言之，於4℃下使Neutravidin(2 μg/ml)在96孔Maxisorb板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定化過夜。用存於PBS中之酪蛋白溶液(1%)封阻各孔。隨後在2 μg/ml下捕獲CX3CR1之生物素化重組NT片段(Polypeptide,Strasbourg,France)或生物素化EC3片段(Polypeptide,Strasbourg,France)。添加血清稀釋液後，使用山葵過氧化酶(HRP)偶聯之山羊抗駱馬免疫球蛋白(Bethyl Laboratories公司，Montgomery，TX，USA)及在受質TMB One(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)(Promega,Mannheim,Germany)存在下之後續酶促反應檢測特異性結合之免疫球蛋白，此顯示肽免疫後針對CX3CR1之顯著抗體依賴性免疫反應經誘導。
另外，藉由對活躍生長之過表現人類CX3CR1之CHO細胞之FACS分析證實經細胞免疫動物之血清力價。利用4次細胞免疫(第49天)、4次細胞免疫及1次肽加強(第77天)及4次細胞免疫及2次肽加強(第81天)後所取樣之血清測定駱馬368、369及370之CX3CR1血清力價反應。收穫細胞並洗滌，然後利用血清稀釋液培育。利用山羊抗駱馬IgG(Bethyl,Montgomery,TX,USA)、隨後利用與PE偶合之驢抗山羊抗體(Jackson Laboratories,Suffolk,UK)實施檢測並藉由FACSArray(BD Biosciences)上之分析讀出。如藉由ELISA或FACS測定所獲得之血清反應之總結係顯示於14及15中。
對於僅經DNA免疫之駱馬(312、313及314)而言，未測定到血清力價。
實例2：僅有重鏈之抗體片段譜之選殖及噬菌體之製備
在每一亞群之最後一次免疫原注射後，自經免疫駱馬收集作為 產生重鏈抗體之B細胞之來源的免疫組織。對於駱馬312、313及314而言，在最後一次抗原注射後4天及8天每一動物收集兩個150 ml血液樣品。對於駱馬368、369及370而言，在最後一次細胞免疫後5天及7天且另外在最後一次肽免疫後4天及8天收集四個150 ml血液樣品。在彼等操作之後，在最後一次細胞免疫後12天且在最後一次肽免疫後12天取得兩個淋巴結生檢。對於駱馬381、382及384而言，在最後一次DNA免疫後8天且另外在第一次細胞加強後4天、在第二次細胞加強後8天及11天及在最後一次細胞免疫後8天，收集五個150 ml血液樣品。在彼等操作之後，在第二次細胞免疫後8天取得一個淋巴結生檢。
使用Ficoll-Hypaque根據製造商說明書(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)自血液樣品製備外周血淋巴細胞(PBL)。自PBL及淋巴結生檢(LN)提取總RNA，將其用作RT-PCR之起始材料來擴增編碼DNA區段之VHH。
對於每一免疫駱馬而言，藉由彙集分離自源於免疫時間表之某一亞群(即在一類免疫抗原之後)之樣品之總RNA來構築文庫，且對於一些駱馬而言，將來自不同動物之樣品彙集成一個文庫(表16)。
簡而言之，經由具體限制位點將PCR擴增之VHH譜選殖至指定載體中以有利於VHH文庫之噬菌體展示。載體源自pUC119且含有LacZ啟動子、M13噬菌體gIII蛋白質編碼序列、胺苄青黴素(ampicillin)或卡本西林(carbenicillin)之抗性基因、多選殖位點及雜合gIII-pelB前導序列(pAX050)。在具有VHH編碼序列之框架中，載體編碼C端c-myc標籤及His6標籤。根據標準方案製備噬菌體，並在過濾滅菌後將其於4℃或-80℃下儲存於20%甘油中以供進一步使用。
實例3：經由噬菌體展示選擇CX3CR1特異性VHH
將自所有駱馬獲得並選殖為噬菌體文庫之VHH譜用於應用大量選擇條件之不同選擇策略。變量包括i)CX3CR1蛋白質之呈遞形式(於不同細胞背景上或於脂質體/VLP上)、ii)抗原呈遞方法(當使用細胞時存於溶液中或當使用VLP時塗覆至板上)、iii)抗原濃度、iv)所用直系同源物(人類或食蟹猴)、v)選擇輪數及vi)不同溶析方法(非特異性的經由胰蛋白酶或特異性的經由配體弗萊托肯趨化因子)。所有固體塗覆相選擇均係在Maxisorp 96孔板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中實施。
如下實施選擇：如上文所闡述以多個濃度呈遞用於固體及溶液相選擇格式之CX3CR1抗原製劑。與噬菌體文庫一起培育2 h、接著充分洗滌後，用胰蛋白酶(1 mg/mL)將所結合噬菌體溶析15分鐘。當 使用胰蛋白酶用於噬菌體溶析時，立即藉由施加0.8 mM蛋白酶抑制劑或ABSF來中和蛋白酶活性。作為對照，平行實施無抗原之選擇。
使用噬菌體輸出物感染大腸桿菌，然後進而使用大腸桿菌製備噬菌體用於下一輪選擇(噬菌體營救)。在第二輪選擇後，使用噬菌體輸出物感染大腸桿菌，然後將大腸桿菌平鋪於瓊脂板(LB+carb+葡萄糖2%)上以供分析個別VHH純系。為篩選具體結合劑之選擇輸出物，自瓊脂板挑選單一純系並使其在1 mL 96深孔板中生長。在葡萄糖之不存在下藉由添加IPTG(最終1 mM)誘導LacZ控制之VHH表現。根據標準方案製備周質提取物(體積為約80 μL)。
實例4：在CX3CR1-弗萊托肯趨化因子競爭FACS分析中篩選周質提取物
在人類CX3CR1/人類弗萊托肯趨化因子FACS競爭分析中篩選周質提取物以評價所表現之VHH之阻斷能力。於過表現CX3CR1之CHO細胞上呈遞人類CX3CR1。利用使用自活躍生長之培養物收穫之細胞之設定及使用冷凍細胞之設定。使用經alexa647標記(A647-弗萊托肯趨化因子)且標記度為1之經標記弗萊托肯趨化因子(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)作為檢測試劑。為設定該分析，首先於CHO-huCX3CR1細胞上實施一系列劑量遞增之經標記弗萊托肯趨化因子以測定結合之EC50值。以較高濃度之弗萊托肯趨化因子(3 nM)實施初始篩選以提高分析穩健性。為將篩選之靈敏度提高至最大，選擇EC30濃度(1 nM)用於後續篩選。簡言之，將50 μl周質提取物添加至6 nM經標記弗萊托肯趨化因子(50 μl)及200 000個CHO-huCX3CR1細胞中。於4℃下培育1小時後，將細胞洗滌三次，然後於FACS陣列(Becton Dickinson)上實施讀數。首先如自散射譜所測定在完整細胞上設門。接著，藉由來自PI染色劑(Sigma,St Louis,US)之螢光譜門控選出死細胞。測定每一樣品來自alexa647標記之螢光 譜並使用該螢光譜計算阻斷能力。作為對照，採取周質提取物中不存在VHH或包括已知不相關VHH及樣品且包括過量冷弗萊托肯趨化因子之條件。對於每一樣品，使用對照樣品測定分析窗來測定阻斷百分比。
根據此篩選選擇VHH，且序列分析揭露120個屬於3個不同B細胞譜系之獨特VHH。針對每一B細胞譜系所發現之變體總數描述於17中。
關於所有VHH，對初始篩選期間之選擇程序及性能之概述係於表18中給出。
所有所獲得獨特VHH之胺基酸序列係顯示於序列清單及上文中(標明CDR及框架區)。
實例5：對經純化VHH之表徵
進一步純化並表徵選自實例4中所闡述篩選之抑制性抗CX3CR1 VHH。所選VHH在大腸桿菌TG1中表現為c-myc、His6標記之蛋白質。藉由添加1 mM IPTG誘導表現並允許於37℃下繼續表現4小時。在使細胞培養物旋轉後，藉由使沈澱冷凍-解凍來製備周質提取物。使用該等提取物作為起始材料，且經由IMAC及粒徑排阻層析法純化VHH，產生95%純度，如經由SDS-PAGE所評價。
藉由抗CX3CR1 VHH抑制人類弗萊托肯趨化因子與BA/F3細胞上所表現之人類CX3CR1結合
在實例4中所概述之人類CX3CR1競爭FACS中評估對VHH之配體弗萊托肯趨化因子之阻斷能力。使用CHO-huCX3CR1細胞、BA/F3-huCX3CR1細胞或經瞬時轉染HEK293T細胞。不同競爭設定中所用之經標記配體之量亦有所不同。VHH阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之相互作用之IC50值係描述於19中。
藉由抗CX3CR1 VHH抑制過表現人類CX3CR1之BA/F3細胞之人類弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用
為評估對弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用之抑制，使用具有5 μm孔徑之ChemoTx可棄式室(Neuroprobe,Gaithersburg,US)設定趨化作用分析。自活躍生長之培養物收穫細胞並洗滌，然後用於分析培養基(即補充有0.1% BSA之RPMI(Gibco,Carlsbad,US))。用總體積為300 μl之320 pM人類弗萊托肯趨化因子填充底部室。在施加膜之後，將總體積為70 μl之0.13E6個細胞沈積於膜之頂部。使趨化作用於37℃下在具有CO2之潮濕室中進行3小時。此培育期之後，移除膜，且再懸浮底部室中之細胞。使用CellTiter-Glo套組(Promega,Madison WI,US)測定孔中存在之ATP量。利用發光讀數之標準設定在Envision(Perkin Elmer,Massachusetts,US)上實施讀數。以一式三份實施劑量遞增系列，且每一板亦以一式三份含有對照樣品。作為對照，包括無VHH之樣品以及未向底部室中添加人類弗萊托肯趨化因子之樣品。結果之總結係顯示於20中。
表20 VHH在阻斷弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用中之效能及效力
對抗CX3CR1 VHH對食蟹猴CX3CR1之交叉反應性之評估
最初，使用基於FACS之結合設定評估食蟹猴交叉反應性。為此，於4℃下將VHH與各別細胞一起培育30分鐘，接著進行三個洗滌步驟，且隨後利用檢測試劑培育。作為檢測，使用小鼠抗cmyc抗體(Serotec,MCA2200)、接著使用與PE偶合之山羊抗小鼠抗體(Jackson 115-116-071)，各自於4℃下培育30分鐘，接著進行三個洗滌步驟。分析結果係顯示於21中。
對於稍後識別之VHH，使用HEK293T細胞中所表現之人類或食蟹猴CX3CR1設定人類弗萊托肯趨化因子競爭FACS。在HEK293T 細胞中瞬時轉染人類及食蟹猴受體，且藉由結合經標記配體人類弗萊托肯趨化因子來匹配轉染。使用EC30濃度之弗萊托肯趨化因子評估競爭，且如此獲得之IC50值係對Ki值之良好評估，即對親和力(22)之量度。如實例4中所闡述實施實驗。使用食蟹猴及人類CX3CR1之IC50值之比率評估CX3CR1在兩個物種中之親和力之潛在差異。
抗人類CX3CR1 VHH與人類CCR2、人類CCR5或小鼠CX3CR1之結合
藉由在表現huCCR2、huCCR5或msCX3CR1之CHO-K1親代細胞或CHO細胞上實施FACS結合實驗來評估對huCX3CR1受體之特 異性。於4℃下將VHH與各別細胞系一起培育30分鐘，接著進行三個洗滌步驟，且隨後利用檢測試劑培育。作為檢測，使用小鼠抗cmyc抗體(Serotec,MCA2200)、接著使用與PE偶合之山羊抗小鼠抗體(Jackson 115-116-071)，各自於4℃下培育30分鐘，接著進行三個洗滌步驟。對於每一細胞系，包括利用受體特異性抗體之品質控制。另外，亦將最高濃度之每一VHH與表現huCX3CR1之CHO細胞一起培育作為陽性對照。未觀測到與msCX3CR1、huCCR2或huCCR5之結合。
表位框之測定
設定競爭性結合實驗以確定VHH是否結合CX3CR1上之重疊表位。為此，在競爭FACS中於表現huCX3CR1之BA/F3細胞上使用經alexa647標記之VHH 66B02。使用來自三個功能家族之代表性VHH作為結合經標記66B02之競爭者。所獲得之IC50值係顯示於23中。
由於藉由來自不同配體阻斷家族之所有代表性VHH可獲得對66B02結合之完全抑制，故可得出結論，所有功能家族彼此緊鄰結合以便其與66B02之結合競爭。
實例6：將VHH格式化成二價 二價體之構築
為自對所獲得VHH之選擇提高效能及/或效力，藉由遺傳工程構築二價分子。將兩個VHH以介於該兩個建構組元之間之35GS連接 體遺傳連接在一起，且隨後如上文針對單價VHH所闡述於大腸桿菌中表現。如24中所列示來製造不同二價構築體。
藉由抗CX3CR1 VHH抑制人類弗萊托肯趨化因子與BA/F3細胞上所表現之人類CX3CR1結合
如實例4中所闡述研究不同格式對人類CX3CR1之配體結合之抑制。對於此表徵，使用顯示人類CX3CR1受體之穩定表現之BA/F3-huCX3CR1細胞系。以EC30濃度使用經alexa647標記之配體弗萊托肯趨化因子，且由此獲得之IC50值反映Ki值。對所獲得數據之概述係顯示於25中。
藉由抗CX3CR1 VHH抑制過表現人類CX3CR1之BA/F3細胞之人類弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用
與針對單價抗CX3CR1 VHH所闡述相似，評估二價構築體對BA/F3-huCX3CR1細胞上弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用之抑制。使用與上文所闡述相同之分析設定，且所獲得之結果係總結於26中。
對抗CX3CR1 VHH對食蟹猴CX3CR1之交叉反應性之評估
而且，對於二價構築體，評估對食蟹猴CX3CR1之交叉反應性並將其與人類反應性相比較。如先前所闡述，使用經瞬時轉染HEK293T細胞應用結合設定(27)或配體競爭設定(28)。各批之經瞬時轉染細胞係藉由其受體表現位準來匹配。
實例7：對連接體長度及半衰期延長之探究 對連接體長度之評估及alb11 VHH之定位
由於二價格式中所用連接體長度可對所獲得之效能產生極大影響，故評估不同連接體長度。
另外，包括與人類血清白蛋白結合之奈米抗體Alb11以延長格式化分子之活體內半衰期(WO 06/122787)。製造包括所用連接體長度之變化亦及不同組成VHH之定位之不同格式。對所探究格式之總結係顯示於29中。
將格式化VHH之編碼序列選殖至內部構築質粒中，容許在甲醇酵母中表現並分泌至培養基中。表現載體源自pPICZa(Invitrogen)且含有用於經緊密調控且經甲醇誘導之表現之AOX1啟動子、ZeocinTM之抗性基因、多選殖位點及α因子分泌信號。轉化後，使表現培養物生長，且藉由添加甲醇來誘導VHH表現並使VHH表現於30℃下繼續48小時。
使用上文所闡述之配體競爭分析評估該等不同格式之效能。由於所用配體濃度低於EC50值，故所獲得之IC50值等於Ki值。不同格式之所獲得之Ki係總結於30中。
人類血清白蛋白對效能之影響
人類血清白蛋白(HSA)與alb11 VHH之結合可對格式之效能產生影響，且因此在HSA之存在下重複配體競爭。簡言之，為容許HSA 與alb11 VHH結合，將評估中之構築體及弗萊托肯趨化因子與HSA一起預培育30分鐘，然後添加至細胞中。亦將細胞再懸浮於補充有HSA之FACS緩衝液中。所用HSA最終濃度超過所用最高VHH濃度50倍。隨後，使競爭進行2小時，且如實例4中所闡述進行進一步處理。
亦在經調適趨化作用設定中評估HSA之潛在干預，該設定在分析之不同隔室中包括HSA。所用HSA濃度再次超過所用之最高構築體濃度50倍，且向構築體加載HSA並持續30分鐘，然後開始分析。分析緩衝液亦補充有HSA，以便在整個實驗期間存在HSA。如上文所闡述，使用具有5 μm孔徑之可棄式ChemoTx室(Neuroprobe,Gaithersburg,MD,USA)。自活躍生長之培養物收穫細胞並在用於補充有0.1% BSA及62.5 μM HSA(Sigma,A8763)之分析培養基RPMI(Gibco,Carlsbad,US)中之前洗滌。用總體積為300 μl之320 pM人類弗萊托肯趨化因子填充底部室。在施加膜之後，將總體積為70 μl之0.13E6個細胞沈積於膜之頂部。使趨化作用於37℃下在具有CO2之潮濕室中進行3小時。此培育期之後，移除膜，且再懸浮底部室中之細胞。使用CellTiter-Glo套組(Promega,Madison WI,USA)測定孔中存在之ATP量。利用發光讀數之標準工業設定在Envision(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上實施讀數。以一式三份實施劑量遞增系列，且每一板亦以一式三份含有對照樣品。作為對照，包括無VHH之樣品以及未向底部室中添加人類弗萊托肯趨化因子之樣品。所獲得之IC50值係列示於31中。
半衰期延長之經格式化二價多肽對弗萊托肯趨化因子內化之抑制
實施其他功能分析以展示半衰期延長之二價多肽之拮抗劑活性。評估多肽在CHO huCX3CR1細胞中抑制A647-弗萊托肯趨化因子內化之能力。簡言之，將1E4個細胞/孔平鋪於具有黑色透明底部之96孔板(BD,Franklin Lakes,NJ,USA)中並生長過夜。將細胞洗滌一次，且然後在分析緩衝液(補充有10 mM HEPES及0.1% BSA之具有鈣及鎂之HBSS(Gibco))中平衡。添加格式化多肽構築體，且於37℃下將該等板培育15分鐘。然後以8 nM之最終濃度添加A647-弗萊托肯趨化因子，且於37℃下將細胞培育60分鐘。移除培養基，且利用3.7%甲醛溶液(Polysciences,Warrington,PA,USA)將細胞固定10分鐘。用PBS將細胞沖洗一次，且利用Hoechst染料(Life Technologies,Grand Island,NY,USA)標記細胞核。為定量內化經標記弗萊托肯趨化因子，使用BD Pathway生物成像系統使細胞成像。藉由識別經標記細胞核並在該領域(mask)周圍畫一個3像素環來實施影像分割。量測細胞質環中之平均A647強度。格式化多肽有效地抑制弗萊托肯趨化因子內化，如表32中所總結：
半衰期延長之經格式化二價抗CX3CR1多肽缺乏激動劑活性
為證實半衰期延長之二價抗CX3CR1多肽不具有激動劑活性，評估CX3CR1BII036對CHO huCX3CR1細胞中鈣流入之誘導。弗萊托肯趨化因子介導該等細胞中之細胞溶質鈣含量以CX3CR1依賴性方式提高，且CX3CR1BII036抑制此反應。
以5E4個細胞/孔將CHO huCX3CR1細胞平鋪於具有黑色透明底部之96孔板(BD)中並生長過夜。於37℃下，將細胞與鈣-4染料/2 mM丙磺舒(probenicid，Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)在補充有20 mM HEPES之HBSS中一起培育60分鐘。為展示多肽拮抗作用，將CX3CR1BII036與細胞一起預培育15分鐘，然後以其EC80值添加弗萊托肯趨化因子。根據製造商說明書於FLIPR Tetra系統(Molecular Devices)上監測鈣動員。為測定致效作用，不用多肽進行預培育，而是使用CX3CR1BII036代替弗萊托肯趨化因子刺激。雖然CX3CR1BII036以1.3 nM之IC50抑制弗萊托肯趨化因子介導之鈣流入，但當以高達1 μM之濃度僅添加多肽時，未觀察到細胞溶質鈣含量提高。
實例8：使用小鼠Fc探究半衰期延長格式
為研究替代半衰期延長形式，66B02 VHH結構域係以具有小鼠IgG2 Fc結構域之融合蛋白(66B02-mFc)之形式產生。將天冬胺酸至丙胺酸突變(D265A)納入CH2結構域中以消除此構築體中之潛在的Fc介導效應子功能(Baudino,J.Immunol.,181,6664-6669(2008))。66B02-mFc係在HEK293T細胞或NS0細胞中表現，且藉由蛋白質A親和力層析法、接著離子交換層析法純化。利用實例7中所闡述之分析格式測試此分子之活性。結果係總結於表33中：
雖然66B02-mFc有效地抑制弗萊托肯趨化因子介導之CX3CR1活化，但其不展示激動劑活性。利用1 μM之此分子治療未觀察到細胞溶質鈣含量提高。
實例9：半衰期延長之二價多肽對小鼠動脈粥樣硬化模型中之斑進展之抑制 人類CX3CR1基因敲入Apo E -/- 小鼠之生成
考慮到小鼠CX3CR1之所識別VHH缺乏交叉反應性(實例5)，在TaconicArtemis(Koeln,Germany)生成人類CX3CR1基因敲入小鼠品系(hu CX3CR1 KI)，以使能夠測試小鼠疾病模型中之該等分子。採用容許人類趨化因子受體在相應小鼠啟動子之控制下之表現同時中斷內源性小鼠蛋白質之表現之策略。簡言之，構築如下靶向載體：其中外顯子2中之小鼠CX3CR1編碼區經完整人類CX3CR1開放讀碼框替代並由選擇標記物及loxP位點側接。將靶向載體引入小鼠ES細胞中，且使用已成功經歷同源重組之純系生成嵌合小鼠。將該等小鼠餵養成高效Flp-deleter小鼠以達成選擇標記物之移除及種系傳遞。然後將C57BL/6背景下之所得hu CX3CR1 KI小鼠與Apo E-/-小鼠(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,USA)雜交，以生成hu CX3CR1 KI Apo E-/-小鼠。Apo E-/-小鼠模型提供引發在斑形成之位點特異性定位、組織學組成及已知風險因素(膽固醇、發炎、高血壓等)方面與人類疾病極相似之廣泛動脈粥樣硬化斑形成的穩健方法。
在小鼠Apo E -/- 動脈粥樣硬化模型中對半衰期延長之二價抗CX3CR1多肽之評估
自4週齡開始向雌性hu CX3CR1KI Apo E-/-小鼠餵養含有1.5%膽固醇之高脂肪/高膽固醇飲食並持續16週。10週後，藉由腹膜內注射向動物投與媒劑(20 mM檸檬酸鈉pH 6.0、115 mM NaCl)、10 mg/kg 66B02-mFc(每週一次或兩次)或30 mg/kg CX3CR1BII036(每週兩次)並持續6週。藉由氣體麻醉使動物麻醉並向其灌注0.9%鹽水。小心移除降主動脈至回腸分岔點並將其於福馬林(formalin)中固定。然後將其縱向打開，並利用蘇丹IV(Sudan IV)染色15分鐘，接著利用70%甲醇染色2分鐘。在流水下洗滌血管並用PBS覆蓋。用使用SPOT Advanced軟體之數位相機(SPOT Imaging Solutions,Sterling Heights,MI,USA)對組織拍照。利用影像分析軟體(Image-Pro Plus,MediaCybernetics,Rockville,MD,USA)測定脂質染色百分比並表示為血管之陽性染色百分比。此研究之結果係總結於表34中：
當每週給藥兩次時，66B02-mFc及CX3CR1BII036均顯著抑制斑進展。此與覆蓋率相關，此乃因可證實在整個研究中均維持該等分子之血漿含量。對於每週給藥一次66B02-mFc，未維持可檢測血漿含量，且此與6週治療後未觀察到顯著效力相關。兩種分子均不顯著影 響血漿膽固醇或三酸甘油酯含量。
實例10：親代VHH之序列優化
通常，在VHH序列優化期間，使親代野生型VHH序列突變以產生與人類VH3-JH種系一致序列更一致之VHH序列。以保持蛋白質結構、活性及穩定性完整之方式將框架區中在VHH與人類VH3-JH種系一致序列之間不同之具體胺基酸改變成人類對應物。為研究此，在三種不同分析中將所有序列優化變體與親代VHH比較：(i)在熱移位分析(TSA)中測定熔融溫度(Tm)、(ii)在弗萊托肯趨化因子競爭FACS中分析活體外效能，且對於一些構築體(iii)在弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用分析中分析活體外效能。
框架殘基之突變
對於序列優化，研究以下突變：E1D、S11L、A14P、E16G、R44Q、D46E、A74S、K83R及Q108L。CX3CR1BII66B02之親代序列中所生成之個別突變體係描述於35中：
將所有構築體選殖於大腸桿菌表現載體中，並在0.25 L至0.5 L 培養物體積之TB培養基中於大腸桿菌中表現為經myc/His標記之蛋白質。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現並允許於37℃及250 rpm下繼續表現4小時。使細胞沈澱，且藉由冷凍-解凍及再懸浮於dPBS中來製備周質提取物。使用該等提取物作為起始材料用於使用Histrap FF粗柱(GE healthcare)之固定化金屬親和力層析法(IMAC)。用250 mM咪唑自該柱溶析納米抗體，且隨後利用dPBS去鹽。藉由還原性SDS-PAGE來驗證納米抗體之純度及完整性。
如表36中所總結，A14P、A74S、K83R及Q108L突變對效能沒有明顯效應，如自競爭FACS所測定。相似地，其他突變E1D、S11L及E16G不影響效能。另一方面，R44Q或D46E之引入使得效能顯著下降，若引入兩種突變則效能下降甚至更明顯。
亦評估預測VHH之穩定性之熔融溫度。大多數個別突變效應有限甚至沒有效應，但D46E突變除外，其使熔融溫度提高大約6℃。組合突變之引入亦增強熱穩定性，參見057及060。
由於在配體競爭FACS中對效能具有顯著效應，突變R44Q及D46E不包括在最終序列中。
CDR殘基之突變
基於親代序列之電腦上分析，預測糖基化位點在52位處。因此構築兩個文庫；一個文庫係針對52位且一個文庫係針對53位，其經設計以在各別位置處包括所有可能胺基酸。在配體競爭FACS中以周質提取物形式篩選文庫。首先，自親代序列製造周質材料之稀釋系列且選擇三個稀釋液用於進一步篩選。選擇第一稀釋點(2倍)以完全阻斷配體相互作用，而另兩個稀釋點(128倍及512倍)應分別導致70%及40%阻斷。自文庫產生周質提取物後，將所有樣品分為兩部分，且使其中之一者進行熱處理。隨後在配體競爭FACS中於三個稀釋點處分析未經處理及熱處理樣品。可藉由比較該所獲得之阻斷與自親代序列所獲得之阻斷來估計突變之影響。對熱處理樣品之分析提供對突變穩定性之潛在影響之量度。
基於初始篩選結果，選擇三種突變用於經一步表徵。配體競爭FACS中所獲得之效能係顯示於37中。
自此分析(即與人類參照序列之序列比對)且基於電腦上T細胞表 位識別預測程式，顯然序列中包括突變N52S及S53T。
由於穩定性原因，針對32位製造其他文庫。以與上文所闡述相似之方式設定配體競爭篩選。再次篩選周質提取物之三個稀釋液，且將所獲得之阻斷%與針對親代序列所獲得之阻斷%比較。分析各種突變體後，N32T之取代經選擇且包括在最終序列經優化變體中。
實例11：對優化變體之分析
在最後一輪表徵中，表徵38中所列示構築體。
如上文所闡述實施競爭FACS實驗以及熔融溫度之測定。所獲得之值係呈現於39中。
亦在上文所闡述弗萊托肯趨化因子誘導之趨化作用中表徵該等構築體(表40)。
評估所選擇構築體在CHO huCX3CR1細胞中對A647-弗萊托肯趨化因子誘導之內化之抑制。結果係總結於表41中：
序列經優化之半衰期延長之抗CX3CR1多肽缺乏激動劑活性
為證實序列經優化之半衰期延長之抗CX3CR1多肽不具有激動劑活性，評估CX3CR1BII00313在CHO huCX3CR1細胞中對鈣流入 之誘導。雖然與CX3CR1BII00313一起之預培育以1.3 nM之IC50抑制弗萊托肯趨化因子介導之鈣流入，但當以高達1 μM之濃度僅添加多肽時，未觀察到細胞溶質鈣含量提高。
實例12：使用人類Fc探究半衰期延長格式
為研究其他半衰期延長形式，CX3CR1BII00306及CX3CR1BII00307序列經優化之VHH結構域係以具有人類IgG1 Fc結構域之融合蛋白(306D-hFc及307D-hFc)之形式產生。將兩種突變納入CH2結構域中以消除此構築體中潛在的Fc介導效應子功能。306D-hFc及307D-hFc係在HEK293T細胞或NS0細胞中表現，且藉由蛋白質A親和力層析法、接著離子交換層析法純化。利用實例7中所闡述之分析格式測試該等分子之功能活性。結果係總結於表42中：
雖然該等分子有效地抑制弗萊托肯趨化因子介導之CX3CR1活化，但其不展示激動劑活性。僅利用高達1 μM之該等納米抗體治療未觀察到細胞溶質鈣含量提高。
實例13：序列經優化之抗CX3CR1奈米抗體對小鼠動脈粥樣硬化模型中之斑進展之抑制
自4週齡開始向雌性hu CX3CR1KI Apo E-/-小鼠餵養含有1.5%膽固醇之高脂肪/高膽固醇飲食並持續16週。10週後，藉由腹膜內注 射向動物投與媒劑(20 mM檸檬酸鈉pH 6.0、115 mM NaCl)、30 mg/kg CX3CR1BII00313(每週一次或兩次)或30 mg/kg CX3CR1BII036(每週兩次)並持續6週。將動物處死，且如上文所闡述定量降主動脈中斑面積之百分比。此研究之結果係總結於表43中：
當每週給藥兩次時，CX3CR1BII00313及CX3CR1BII036均顯著抑制斑進展。此與覆蓋率相關，此乃因可證實在整個研究中均維持該等分子之血漿含量。對於每週給藥一次CX3CR1BII00313，未維持可檢測血漿含量且此與6週治療後未觀察到顯著效力相關。兩種分子均不顯著影響血漿膽固醇或三酸甘油酯含量。
實例14：奈米抗體與全血中之原代人類及食蟹猴CD14+細胞結合 經格式化且序列經優化之抗CX3CR1奈米抗體之競爭FACS
為證實經格式化且序列經優化之抗CX3CR1奈米抗體與人類原代細胞之結合，在全血中之競爭FACS分析中展示CX3CR1BII00313與經A647標記之CX3CR1BII018(A647-018)競爭結合CD14+細胞。簡言之，將與eFluor 450(eBioscience,San Diego,CA,USA)偶聯之小鼠抗人類CD14抗體1：10稀釋於來自健康人類供體之經EDTA處理之全血中。以40 μl/孔添加至96孔聚苯乙烯圓底板中，接著以在100 nM至0.002 pM範圍內之最終濃度添加10 μl/孔稀釋於具有BSA之染色緩衝液(BD Pharmingen)中之CX3CR1BII00313，且將樣品於室溫下培育20分鐘。然後添加10 μl/孔存於染色緩衝液中之A647-018，從而得到1 nM之最終濃度(A647-018結合之EC80)，且將樣品於室溫下再培育20分鐘。然後添加220 μl/孔之1步式固定/裂解溶液(eBioscience)。在室溫下培育10分鐘後，使細胞沈澱，在染色緩衝液中洗滌兩次並使其再懸浮於此緩衝液中。在BD LSR II流式細胞儀上分析樣品。量化門CD14陽性細胞群針對AlexaFluor 647之中值螢光強度。CX3CR1BII00313在人類血液中以0.35 nM之IC50有效地抑制A647-018與CD14陽性細胞之結合(n=8)。
為證實經格式化且序列經優化之抗CX3CR1奈米抗體與食蟹猴原代細胞之結合，在食蟹猴全血中之競爭FACS分析中展示CX3CR1BII00313與A647標記之CX3CR1BII018(A647-018)競爭與CD14+細胞結合。所用方法與上文所概述者類似，只是A647-018之最終濃度為3 nM(A647-018結合之EC80)且使用ACK裂解緩衝液(Life Technologies)替代1步式固定/裂解溶液。在分析之前將細胞再懸浮於補充有1%甲醛之染色緩衝液中。CX3CR1BII00313以0.43 nM之IC50有效地抑制A647-018與食蟹猴血液中之CD14陽性細胞結合(n=4)。
實例15：藥食蟹猴中之物動力學(PK)
在2歲至5歲大且體重在2.4 kg至3.5 kg範圍內之純真雄性食蟹猴(馬來猴(Macaca fascicularis))中實施藥物動力學研究。將該等猴分成四個治療群組。群組1(n=3)接受0.2 mg/kg之CX3CR1BII00313 i.v.；群組2(n=3)接受2 mg/kg之CX3CR1BII00313 i.v.；群組3(n=3)接受2 mg/kg CX3CR1BII00313 s.c.且群組4(n=3)接受5 mg/kg CX3CR1BII00313 i.v.。以存於檸檬酸鹽緩衝液(20 mM檸檬酸鈉/115 mM氯化鈉，pH 6.0)中之2 mg/ml溶液之形式投與CX3CR1BII00313。6週後自外周靜脈收集血液樣品並收集至血清分離管中用於PK分析。
使用MSD(Meso Scale Discovery)格式分析血清樣品。簡言之，使生物素化抗奈米抗體抗體與MSD標準鏈黴抗生物素板(Meso Scale Discovery,Rockville,MD,USA)結合。利用存於磷酸鹽緩衝鹽水中之0.05% Tween 20洗滌該等板並利用5% w/v之SeraCare BSA(SeraCare Life Sciences,Milford,MA,USA)進行阻斷，然後與血清樣品一起培育。利用硫標記抗奈米抗體奈米抗體檢測CX3CR1BII00313，且在Sector Imager 2400(Meso Scale Discovery)上分析該等板。使用存於5%猴血清中5000 ng/ml至0.5 ng/ml之不同濃度之CX3CR1BII0313作為標準物。藉由監測游離CX3CR1在CD14+門控單核細胞上之含量來評價靶接合。此分析與實例14中所總結之競爭FACS分析類似，只是不添加其他CX3CR1BII00313。亦監測血清樣品中是否存在靈長動物抗人類抗體(PAHA)，此乃因其可影響對PK及游離CX3CR1之評價。
使用ForteBio RED96來檢測PAHA。簡言之，在鏈黴抗生物素感測器上方捕獲生物素化CX3CR1BII0313。然後使用經彙集純真猴血清作為陰性對照來計算截止值(定義為高於純真血清之平均結合信號兩倍)。將所有血清樣品於緩衝液中稀釋20倍，且若結合信號大於截止值，則PAHA反應經測定為陽性。
自PK/PD分析排除PAHA檢測後之時間點之數據。PK數據係總結於下表44中。
靜脈內2.0 mg/kg之清除率及半衰期分別為9.4 mL/d/kg及9.6天。在靜脈內0.2 mg/kg下，清除率顯著較高(113 mL/d/kg)，此結果符合可飽和靶介導配置(TMD)藥物動力學。在2 mg/kg與5 mg/kg靜脈內劑量之間，隨劑量調整之AUC(0-14d)相當，此表示在2 mg/kg劑量下TMD已飽和。在靜脈內或皮下投與奈米抗體後2週時，暴露濃度>70 nM，且在皮下投與後生體可用率為54%。以大於90%之靶覆蓋率暴露濃度所追蹤之游離受體維持在>10 nM之暴露濃度下。
<110> 山加亞 幸(SINGH,SANJAYA) 亞莉莎 K 瓦特曼(WATERMAN,ALISA K.) 艾瑞克 戴普拉(DEPLA,ERIK) 杜恩 雷洛曼斯(LAEREMANS,TOON) 黛安 凡 何瑞克(VAN HOORICK,DIANE) 希朵克 J 維維肯(VERVERKEN,CEDRIC J.)
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<150> 61/603,622
<151> 2012-02-27
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 163
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> CDR序列
<400> 164
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 165
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<211> 9
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<213> 人工序列
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<223> CDR序列
<400> 166
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<213> 人工序列
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<223> CDR序列
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<213> 人工序列
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<223> CDR序列
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<223> CDR序列
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<223> CDR序列
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<220>
<223> CDR序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
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<212> PRT
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<223> CDR序列
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<211> 10
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> CDR序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 193
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 194
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 195
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 196
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=Pro、Ala或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=Asp或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=Thr或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=Arg、Lys、Ala或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=Tyr或Phe
<400> 197
<210> 198
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 198
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> 框架序列
<400> 199
<210> 200
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 200
<210> 201
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 201
<210> 202
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 202
<210> 203
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 203
<210> 204
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 204
<210> 205
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 205
<210> 206
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 206
<210> 207
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 207
<210> 208
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 208
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 209
<210> 210
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 210
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 211
<210> 212
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 框架序列
<400> 212
<210> 213
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
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<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 215
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 219
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 220
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 221
<210> 222
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 222
<210> 223
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 223
<210> 224
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 224
<210> 225
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 225
<210> 226
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 226
<210> 227
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 227
<210> 228
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CX3CR1 N末端序列
<400> 228
<210> 229
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CX3CR1-EC3
<400> 229
<210> 230
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 230
<210> 231
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 231
<210> 232
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 232
<210> 233
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 233
<210> 234
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 234
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 235
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 236
<210> 237
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 237
<210> 238
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 238
<210> 239
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 239
<210> 240
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 240
<210> 241
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 241
<210> 242
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 242
<210> 243
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 243
<210> 244
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 244
<210> 245
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 245
<210> 246
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 246
<210> 247
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 247
<210> 248
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體序列
<400> 248
<210> 249
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 249
<210> 250
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Fc結構域
<400> 250
<210> 251
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Fc結構域之奈米抗體
<400> 251
<210> 252
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類Fc結構域
<400> 252
<210> 253
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Fc結構域之奈米抗體
<400> 253
<210> 254
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Fc結構域之奈米抗體
<400> 254
<210> 255
<211> 355
<212> PRT
<213> 智人
<400> 255
<210> 256
<211> 355
<212> PRT
<213> 馬來猴
<400> 256
<210> 257
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 257
<210> 258
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 258
<210> 259
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 259
<210> 260
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 260
<210> 261
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 261
<210> 262
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 262
<210> 263
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 263
<210> 264
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 264
<210> 265
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 265
<210> 266
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 266
<210> 267
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 267
<210> 268
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 268
<210> 269
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 269
<210> 270
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 270
<210> 271
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 271
<210> 272
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 272
<210> 273
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 273
<210> 274
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 274
<210> 275
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 275
<210> 276
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 276
<210> 277
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 277
<210> 278
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 278
<210> 279
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 279
<210> 280
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 280
<210> 281
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 281
<210> 282
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 奈米抗體序列
<400> 282

Claims (59)

  1. 一種多肽，其包含抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域，其中該多肽能夠阻斷人類弗萊托肯趨化因子(fractalkine)與人類CX3CR1之結合。
  2. 如請求項1之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域基本上係由四個框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)及三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)組成。
  3. 如請求項1或2之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係VH、VL、VHH、駱駝化VH或針對穩定性、效能、可製造性及/或與人類框架區之相似性經過優化之VHH。
  4. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽對人類CX3CR1具有如下親和力：c)如藉由細胞結合FACS來測定，EC50小於或等於10 nM、小於或等於5 nM、小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM；或d)如藉由競爭FACS來測定，IC50小於或等於10 nM、小於或等於5 nM、小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM。
  5. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽阻斷人類弗萊托肯趨化因子與人類CX3CR1之結合性之IC50為：小於或等於300 nM、或小於或等於100 nM、或小於或等於20 nM、或小於或等於10 nM、或小於或等於5 nM、或小於或等於2.5 nM或小於或等於1 nM。
  6. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽包含具有胺基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO：197)之CDR3，其中：Xaa1係Pro、Ala或Gly； Xaa2係Asp或Asn；Xaa3係Thr或Ser；Xaa4係Arg、Lys、Ala或Gly；且Xaa5係Tyr或Phe。
  7. 如請求項6之多肽，其中該CDR3具有胺基酸序列Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr(SEQ ID NO：186)。
  8. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽包含具有如下胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3：分別如SEQ ID No：213、221及186；或分別如SEQ ID No：141、162及186；或分別如SEQ ID No：141、163及187；或分別如SEQ ID No：141、164及186；或分別如SEQ ID No：141、166及186；或分別如SEQ ID No：141、167及186；或分別如SEQ ID No：141、167及189；或分別如SEQ ID No：141、168及186；或分別如SEQ ID No：141、168及187；或分別如SEQ ID No：141、169及190；或分別如SEQ ID No：141、170及186；或分別如SEQ ID No：141、171及186；或分別如SEQ ID No：141、174及186；或分別如SEQ ID No：141、175及187；或分別如SEQ ID No：142、165及188；或分別如SEQ ID No：142、173及188；或分別如SEQ ID No：143、164及186；或分別如SEQ ID No：144、172及187；或 分別如SEQ ID No：145、172及187；或分別如SEQ ID No：141、214及186；或分別如SEQ ID No：141、215及186；或分別如SEQ ID No：141、216及186；或分別如SEQ ID No：141、217及186；或分別如SEQ ID No：141、218及186；或分別如SEQ ID No：141、219及186；或分別如SEQ ID No：141、220及186；或分別如SEQ ID No：213、214及186。
  9. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽包含具有如下胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3：分別如SEQ ID No：146、176及191；或分別如SEQ ID No：146、177及191。
  10. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽包含具有如下胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3：分別如SEQ ID No：147、178及192；或分別如SEQ ID No：147、179及192；或分別如SEQ ID No：147、179及194；或分別如SEQ ID No：148、179及193；或分別如SEQ ID No：149、179及192；或分別如SEQ ID No：149、180及192；或分別如SEQ ID No：149、181及192；或分別如SEQ ID No：149、183及192；或分別如SEQ ID No：149、185及192；或分別如SEQ ID No：150、179及194；或分別如SEQ ID No：150、182及194；或 分別如SEQ ID No：151、179及193；或分別如SEQ ID No：151、182及194；或分別如SEQ ID No：151、184及196；或分別如SEQ ID No：152、179及195；或分別如SEQ ID No：153、179及194；或分別如SEQ ID No：154、182及194；或分別如SEQ ID No：155、179及195；或分別如SEQ ID No：156、181及192；或分別如SEQ ID No：157、179及194；或分別如SEQ ID No：158、179及192；或分別如SEQ ID No：159、178及192；或分別如SEQ ID No：160、179及194；或分別如SEQ ID No：161、179及194。
  11. 如請求項1之多肽，其中該多肽包含具有如下胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3：分別如SEQ ID NO：141、164及186，分別如SEQ ID NO：141、162及186，分別如SEQ ID NO：213、214及186，或分別如SEQ ID NO：213、221及186。
  12. 如請求項1或2之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係包含如下序列之VHH結構域：a)SEQ ID NO：3之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO：3之該等胺基酸序列具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)SEQ ID NO：1至48、121至140或222至224中之任一者之胺基酸序列。
  13. 如請求項1或2之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係包含如下序列之VHH結構域： a)SEQ ID NQ：49之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO：49之該等胺基酸序列具有至少95%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)SEQ ID NO：49至52中之任一者之胺基酸序列。
  14. 如請求項1或2之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域係包含如下序列之VHH結構域：a)SEQ ID NQ：67之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO：67之該等胺基酸序列具有至少90%胺基酸一致性之胺基酸序列；或c)SEQ ID NO：53至120中之任一者之胺基酸序列。
  15. 如請求項1之多肽，其中該抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：121至140或SEQ ID NO：222至224中所闡述之序列。
  16. 如請求項1或2之多肽，其中該免疫球蛋白單一可變結構域a)交叉阻斷SEQ ID NO：1至120、121至140及222至224之該等免疫球蛋白單一可變結構域中之至少一者與CX3CR1之結合，或b)被SEQ ID NO：1至120、121至140及222至224之該等免疫球蛋白單一可變結構域中之至少一者交叉阻斷與CX3CR1之結合。
  17. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽進一步包含延長半衰期之部分。
  18. 如請求項17之多肽，其中該延長半衰期之部分與該多肽共價連接且係選自由以下組成之群：白蛋白結合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白結構域)、轉鐵蛋白結合部分(例如抗轉鐵蛋白免疫球蛋白結構域)、聚乙二醇分子、重組聚乙二醇分子、人類血清白蛋 白、人類血清白蛋白之片段、白蛋白結合肽或Fc結構域。
  19. 如請求項17之多肽，其中該延長半衰期之部分係由抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域組成。
  20. 如請求項19之多肽，其中該免疫球蛋白單一可變結構域係選自VHH結構域、擬人化VHH結構域、駱駝化VH結構域、結構域抗體、單一結構域抗體及/或「dAb」。
  21. 如請求項20之多肽，其中該抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域包含選自SEQ ID NO：230至232中之任一者之序列。
  22. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽視情況經由適宜連接體或鉸鏈區連接Fc部分。
  23. 如請求項1之多肽，其中該多肽進一步包含第二免疫球蛋白單一可變結構域。
  24. 如請求項23之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含第二抗CX3CR1免疫球蛋白單一可變結構域。
  25. 如請求項23或24之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域係VH、VL、VHH、駱駝化VH或針對穩定性、效能、可製造性及/或與人類框架區之相似性經優化之VHH。
  26. 如請求項23或24之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含如請求項6至11中任一項所闡述之CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列。
  27. 如請求項26之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含相同CDR1、CDR2及CDR3。
  28. 如請求項23或24之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含具有如請求項12至15中任一項所闡述之胺基酸序列之VHH結構域。
  29. 如請求項28之多肽，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變 結構域包含相同VHH結構域。
  30. 如請求項1之多肽，其包含第一免疫球蛋白單一可變結構域及第二免疫球蛋白單一可變結構域，該第一免疫球蛋白單一可變結構域包含具有SEQ ID NO141、164及186、或SEQ ID NO：141、162及186、或SEQ ID NO：213、214及186、或SEQ ID NO：213、221及186中所闡述之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3，該第二免疫球蛋白單一可變結構域係如請求項1至16中任一項所闡述。
  31. 如請求項30之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域包含具有SEQ ID NO：141、164及186、或SEQ ID NO：141、162及186、或SEQ ID NO：213、214及186、或SEQ ID NO：213、221及186所闡述之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
  32. 如請求項1之多肽，其包含第一免疫球蛋白單一可變結構域及如請求項1至16中任一項之第二免疫球蛋白單一可變結構域，其中該第一免疫球蛋白單一可變結構域係包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：121至140或222至224中之任一者所闡述之序列之VHH結構域。
  33. 如請求項32之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變結構域係包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：121至140或222至224中之任一者所闡述之序列之VHH結構域。
  34. 如請求項23、24及30至33中任一項之多肽，其中該多肽進一步包含延長半衰期之部分。
  35. 如請求項34之多肽，其中該延長半衰期之部分與該多肽共價連接且係選自由以下組成之群：白蛋白結合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白結構域)、轉鐵蛋白結合部分(例如抗轉鐵蛋白免疫球蛋白結構域)、聚乙二醇分子、重組聚乙二醇分子、人類血清白蛋 白、人類血清白蛋白之片段、白蛋白結合肽或Fc結構域。
  36. 如請求項35之多肽，其中該延長半衰期之部分係由抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域組成。
  37. 如請求項36之多肽，其中該免疫球蛋白單一可變結構域係選自VHH結構域、擬人化VHH結構域、駱駝化VH結構域、結構域抗體、單一結構域抗體及/或「dAb」。
  38. 如請求項37之多肽，其中該抗白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域係選自SEQ ID NO：230至232。
  39. 如請求項35之多肽，其中該多肽視情況經由適宜連接體或鉸鏈區連接Fc部分。
  40. 如請求項1或2之多肽，其包含SEQ ID NO：225至227或257至262中之任一者之胺基酸序列。
  41. 如請求項1或2之多肽，其包含SEQ ID NO：253、254或263至266中之任一者之胺基酸序列。
  42. 如請求項1或2之多肽，其包含SEQ ID NO：249、277至281及267至276中之任一者之胺基酸序列。
  43. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至42中任一項之多肽。
  44. 一種表現載體，其包含如請求項43之核酸分子。
  45. 一種宿主細胞，其包含編碼如請求項1至42中任一項之多肽之核酸分子，其中該宿主細胞能夠表現該多肽。
  46. 一種醫藥組合物，其包含(i)如請求項1至42中任一項之多肽，及(ii)醫藥上可接受之載劑，及視情況(iii)稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑。
  47. 如請求項46之醫藥組合物，其中該醫藥組合物適於在人類中經靜脈內或皮下注射。
  48. 一種製造如請求項1至42中任一項之多肽之方法，其包括以下 步驟：在容許表現如請求項1至42中任一項之多肽之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞攜帶包含核酸分子之表現載體，該核酸分子包含編碼如請求項1至42中任一項之多肽之區，且其中該宿主細胞係原核或真核細胞。
  49. 如請求項48之方法，其進一步包括以下步驟：回收該多肽；及純化該多肽。
  50. 如請求項1至42中任一項之多肽，其用於在人類中治療、預防或緩和疾病、病症或病狀。
  51. 如請求項50之多肽，其中該疾病、病症或病狀係CX3CR1相關疾病、病症或病狀。
  52. 如請求項51之多肽，其中該疾病、病症或病狀係選自心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病(Henoch-Schonlein purpura)及華格納氏肉芽病(Wegener’s granulomatosis))、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症。
  53. 如請求項52使用之多肽，其中該疾病、病症或病狀係動脈粥樣硬化。
  54. 一種如請求項1至42中任一項之多肽之用途，其用於製造用以在人類中治療、預防、緩和或診斷疾病、病症或病狀之醫藥。
  55. 如請求項54之用途，其中該疾病、病症或病狀係CX3CR1相關疾病、病症或病狀。
  56. 如請求項55之用途，其中該疾病或病症係選自心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病及華格納氏肉芽病)、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症。
  57. 如請求項55之用途，其中該疾病或病症係動脈粥樣硬化。
  58. 一種診斷套組，其包含如請求項1至42中任一項之多肽，或其用途。
  59. 如請求項58之診斷套組，其用於診斷以下至少一種疾病：心血管及腦血管動脈粥樣硬化病症、外周動脈疾病、再狹窄、糖尿病性腎病、腎小球性腎炎、人類新月形腎小球性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎、脈管炎(包括亨-舒二氏紫斑病及華格納氏肉芽病)、類風濕性關節炎、骨關節炎、同種異體排斥、全身性硬化症、神經退化病症及脫髓鞘疾病、多發性硬化症(MS)、阿茲海默氏病、肺病(例如COPD)、氣喘、神經性病變疼痛、發炎性疼痛或癌症。
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