JP6101715B2 - Ｃｘ３ｃｒ１結合ポリペプチド - Google Patents

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Description

本発明は、ＣＸ３ＣＲ１結合ポリペプチド、特に、特定の免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドに関する。本発明はまた、かかるポリペプチドをコードする核酸；かかるポリペプチドの製造方法；かかるポリペプチドを発現するか又は発現する能力のある宿主細胞；かかるポリペプチドを含む組成物；及び特に、予防、治療及び診断目的のためのかかるポリペプチド又はかかる組成物の使用に関する。
発明の背景
ＣＸ３ＣＲ１は、ケモカイン受容体である、Ｇタンパク質共役膜内在性タンパク質である。これは、動脈硬化プラークの惹起及び進行と関連する細胞種（例えば、単球、樹状細胞、及びＴ細胞）に主に発現する。これは、単球上で酸化脂質によりアップレギュレーションされ、これらの細胞のプラーク内への遊走、及びプラーク内での生存を仲介する。この固有のリガンドであるフラクタルカイン（ＦＫＮ）は、病変における血管内皮細胞、及び平滑筋細胞の表面に発現して白血球接着を仲介する。フラクタルカインはまた、タンパク分解性切断により循環系に放出されて走化性物質として機能する。
ヒトにおいて、低減した活性を有するＣＸ３ＣＲ１バリアント（Ｖ２４９Ｉ／Ｔ２８０Ｍ）は、心血管疾患（冠動脈心疾患、脳血管疾患、又は末梢血管疾患）（McDermott, 2001; Circ Res 89:401）、冠動脈疾患（狭窄の血管造影の証拠）（McDermott, 2003; J. Clin. Invest. 111:1241）、及び頸動脈閉塞性疾患（Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276）のより低いリスクと関連することが示されている。ＣＸ３ＣＲ１は、動脈硬化プラーク内でポリクローナル抗体による増強した免疫染色を示したフラクタルカインと共存した（Wong, 2002 Cardiovasc. Path. 11:332）。フラクタルカイン染色は、非プラーク動脈領域において観察されない。
いくつかの独立したマウス遺伝子研究により、ＣＸ３ＣＲ１欠損のアテローム性動脈硬化症に対する有益な効果が示されている。大動脈弓及び胸大動脈における病変領域の減少、並びにプラークにおける単球／マクロファージ蓄積の低減は、高脂肪食餌を与えられたＣＸ３ＣＲ１−／−アポＥ−／−マウスの２つの独立した派生系統で観察された（Combadiere, 2003; Circulation, 107:1009, Lesnik, 2003; J. Clin. Invest. 111:333）。
これは、ＣＸ３ＣＲ１が心血管疾患に関与し、その活性の調節が約束された治療をもたらし得ることを示している。それ故、疾患、特に、ヒトにおける心血管疾患を処置するための治療剤として用いられ得る、有益な薬理学特性を有するＣＸ３ＣＲ１に対するアンタゴニスト分子に対する要求がある。
従って、本発明の１つの目的は、抗ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト分子、特に、ＣＸ３ＣＲ１に高い結合親和性を有する抗ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト分子を提供することである。
本発明の更なる目的は、ＣＸ３ＣＲ１に対する高い特異性を有する、抗ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト分子を提供することである。
本発明の更なる目的は、強力な活性を有する、抗ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストを提供することである。
本発明の更なる目的は、好ましいバイオアベイラビリティ及び半減期を有する、抗ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストを提供することである。
本発明の更なる目的は、好ましい生物物理学的特性を有する、抗ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストを提供することである。
本発明の更なる目的は、上で説明される目的のいずれかの組み合わせを含む。
発明の概要
本発明は、ヒトＣＸ３ＣＲ１に結合し、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力がある、ポリペプチドを提供する。１つの態様において、ポリペプチドは、３個の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンである（ここで、当該免疫グロブリンは、ヒトＣＸ３ＣＲ１に結合し、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力がある）。更なる態様において、ポリペプチドは、１個又は複数の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む（ここで、当該ポリペプチドは、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力がある）。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、以下の特性の１つ又は複数により特徴付けられる：
・ 高い親和性でヒトＣＸ３ＣＲ１に結合し；
・ 可溶性フラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害し；
・ フラクタルカインにより誘導される走化性を阻害し；
・ フラクタルカインにより誘導されるヒトＣＸ３ＣＲ１受容体内部移行を阻害し；
・ 結合及び機能的阻害について、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対するＥ／ＩＣ５０の１０倍以内でカニクイザルＣＸ３ＣＲ１と交差反応する。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、半減期延長部分（例えば、アルブミン結合部分、ポリエチレングリコール分子、又はＦｃドメイン）を更に含む。更なる態様において、本発明のポリペプチドは、２個以上の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。１つの態様において、２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、リンカーペプチドにより共有結合する。１つの態様において、本発明のポリペプチド中の２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、同一のアミノ酸配列を有する。別の態様において、本発明のポリペプチド中の２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、異なるアミノ酸配列を有する。１つの態様において、本発明のポリペプチドは、２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、半減期延長部分（例えば、アルブミン結合部分、ポリエチレングリコール分子、又はＦｃドメイン）を更に含む。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、アルブミン結合部分に第１のリンカーペプチドにより共有結合した第１の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む（ここで、当該アルブミン結合部分は、第２の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインに第２のリンカーペプチドにより更に共有結合する）。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、リンカーペプチドによりＦｃドメインに共有結合した抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。１つの態様において、リンカーペプチドによりＦｃドメインに共有結合した抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むかかるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド架橋を介して２量体として提供される。
本発明のポリペプチドは、ＣＸ３ＣＲ１関連疾患、障害又は状態、特に、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）の予防、処置、緩和、及び／又は診断のために用いられる。
更なる態様において、本発明は、以下を提供する。
実施態様１：３個の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンであって、ヒトＣＸ３ＣＲ１に結合し、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力がある、免疫グロブリン。
実施態様２：１個又は複数の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力がある、ポリペプチド。
実施態様３：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、４個のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）、及び３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）から本質的になる、実施態様２記載のポリペプチド。
実施態様４：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有する、実施態様３記載のポリペプチド。
実施態様５：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、抗体ドメインである、実施態様２〜４のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様６：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は安定性、有効性、製造可能性、及び／又はヒトフレームワーク領域に対する類似性について最適化されているＶＨＨである、実施態様５記載のポリペプチド。
実施態様７：
ａ）１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＥＣ５０（細胞結合ＦＡＣＳにより測定）；又は
ｂ）１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０（競合的ＦＡＣＳにより測定）
のヒトＣＸ３ＣＲ１への親和性を有する、実施態様１〜６のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様８：ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を３００ｎＭ以下、又は１００ｎＭ以下、又は２０ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ以下、又は２．５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、実施態様１〜７のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様９：ヒトＣＸ３ＣＲ１により仲介される、フラクタルカインにより誘導される走化性を５００ｎＭ以下、又は１００ｎＭ以下、又は７５ｎＭ以下、又は５０ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、実施態様１〜８のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１０：ヒトＣＸ３ＣＲ１により仲介される、フラクタルカイン内部移行を１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、実施態様１〜９のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１１：ＣＤＲ３が、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（配列番号１９７）（式中：
− Ｘａａ１は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、又はＧｌｙであり；
− Ｘａａ２は、Ａｓｐ、又はＡｓｎであり；
− Ｘａａ３は、Ｔｈｒ、又はＳｅｒであり；
− Ｘａａ４は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、又はＧｌｙであり；
− Ｘａａ５は、Ｔｙｒ、又はＰｈｅである）
を有する、実施態様３〜１０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１２：
ａ）
− Ｘａａ１が、Ｐｒｏ、Ａｌａ、又はＧｌｙであり；
− Ｘａａ２が、Ａｓｐ、又はＡｓｎであり；
− Ｘａａ３が、Ｔｈｒであり；
− Ｘａａ４が、Ａｒｇ、又はＬｙｓであり；
− Ｘａａ５が、Ｔｙｒであり、
及び／又は
ｂ）ＣＤＲ３が、配列番号１８６〜１９０のいずれかから選択される、
実施態様３〜１１のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１３：ＣＤＲ３が、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（配列番号１８６）を有する、実施態様３〜１２のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１４：
ｉ）ＣＤＲ１が：
ａ）配列番号１４１のアミノ酸配列を有するか；
ｂ）配列番号１４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；
ｃ）配列番号１４１のアミノ酸配列と２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ２位で、Ｓが、Ｔ、又はＧに変更され；
− ６位で、Ｓが、Ｒに変換され；
− ７位で、Ｎが、Ｔに変換され；及び／又は
− ９位で、Ｍが、Ｋに変換される）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１４１〜１４５、及び２１３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
ｉｉ）ＣＤＲ２が：
ａ）配列番号１６４のアミノ酸配列を有するか；
ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；
ｃ）配列番号１６４のアミノ酸配列と４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− １位で、Ｇが、Ａ、Ｌ、Ｖ、又はＳに変更され；
− ３位で、Ｎが、Ｄ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、又はＴに変更され；
− ４位で、Ｓが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、又はＰに変更され；
− ５位で、Ｖが、Ａに変更され；
− ６位で、Ｇが、Ｄに変更され；
− ７位で、Ｉが、Ｔ、又はＶに変更され；
− ８位で、Ｔが、Ａに変更され；及び／又は
− ９位で、Ｋが、Ｒに変更される）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１６２〜１７５、及び２１４〜２２１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が：
ａ）配列番号１８６のアミノ酸配列を有するか；
ｂ）配列番号１８６のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；
ｃ）配列番号１８６のアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ２位で、Ｐが、Ａ、又はＧに変更され；
− ７で、Ｄが、Ｎに変更され；及び／又は
− ９で、Ｒが、Ｋに変更される）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１８６〜１９０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する、
実施態様３〜１０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１５：
ｉ）ＣＤＲ１が、配列番号１４６のアミノ酸配列を有し；
ｉｉ）ＣＤＲ２が、ａ）配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するか、又はｂ）配列番号１７６、又は１７７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有し；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、配列番号１９１のアミノ酸配列を有する、
実施態様３〜１０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１６：
ｉ）ＣＤＲ１が：
ａ）配列番号１４７のアミノ酸配列を有するか；又は
ｂ）配列番号１４７のアミノ酸配列と６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− １位で、Ｇが、Ｋ、Ｒ、又はＡに変更され；
− ２位で、Ｔが、Ｉ、Ｐ、Ｓ、又はＬに変更され；
− ３位で、Ｉが、Ｖ、又はＴに変更され；
− ４位で、Ｆが、Ｌに変更され；
− ５位で、Ｓが、Ｒ、又はＤに変更され；
− ６位で、Ｎが、Ｓ、Ｔ、又はＤに変更され；及び／又は
− ７位で、Ｎが、Ｔ、又はＹに変更される）
を有するか；又は
ｃ）配列番号１４７〜１６１のずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
ｉｉ）ＣＤＲ２が：
ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列を有するか；又は
ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列と４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ３位で、Ｓが、Ｔ、又はＧに変更され；
− ４位で、Ｎが、Ｓ、又はＩに変更され；
− ５位で、Ｓが、Ｔに変更され；
− ６位で、Ｇが、Ｙに変更され；及び／又は
− ８位で、Ｔが、Ａに変更される）
を有するか；又は
ｃ）配列番号１７８〜１８５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が：
ａ）配列番号１９２のアミノ酸配列を有するか；又は
ｂ）配列番号１９２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；又は
ｃ）配列番号１９２のアミノ酸配列と２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ２位で、Ａが、Ｇに変更され；
− ８位で、Ｔが、Ｓに変更され；
− ９位で、Ａが、Ｇに変更され；及び／又は
− １０位で、Ｙが、Ｆに変更さる）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１９２〜１９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する、
実施態様３〜１０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様１７：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、
− それぞれ、配列番号１４１、１６２、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６３、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６６、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６７、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６７、及び１８９；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６８、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６８、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６９、及び１９０；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７０、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７１、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７５、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４２、１６５、及び１８８；又は
− それぞれ、配列番号１４２、１７３、及び１８８；又は
− それぞれ、配列番号１４３、１６４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４４、１７２、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４５、１７２、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１５、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１６、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１７、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１８、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１９、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２２０、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号２１３、２１４、及び１８６
に示される、実施態様３記載のポリペプチド。
実施態様１８：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、
− それぞれ、配列番号１４６、１７６、及び１９１；又は
− それぞれ、配列番号１４６、１７７、及び１９１
に示される、実施態様３記載のポリペプチド。
実施態様１９：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、
− それぞれ、配列番号１４７、１７８、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４７、１７９、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４７、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１４８、１７９、及び１９３；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１７９、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８０、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８１、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８３、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８５、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１５０、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５０、１８２、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５１、１７９、及び１９３；又は
− それぞれ、配列番号１５１、１８２、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５１、１８４、及び１９６；又は
− それぞれ、配列番号１５２、１７９、及び１９５；又は
− それぞれ、配列番号１５３、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５４、１８２、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５５、１７９、及び１９５；又は
− それぞれ、配列番号１５６、１８１、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１５７、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５８、１７９、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１５９、１７８、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１６０、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１６１、１７９、及び１９４
に示される、実施態様３記載のポリペプチド。
実施態様２０：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１４１、１６４、及び１８６、又はそれぞれ、配列番号１４１、１６２、及び１８６に示される、実施態様３記載のポリペプチド。
実施態様２１：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２１３、２１４、及び１８６、それぞれ、配列番号２１３、２２１、及び１８６、又はそれぞれ、配列番号１４１、１６２、及び１８６に示される、実施態様３記載のポリペプチド。
実施態様２２：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列；又は
ｄ）配列番号１〜４８、１２１〜１４０、又は２２２〜２２４のいずれか１つのアミノ酸配列
に示される配列を含むＶＨＨドメインである、実施態様２〜１０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様２３：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、
ａ）配列番号４９のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列と５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列；又は
ｄ）配列番号４９〜５２のいずれか１つのアミノ酸配列
に示される配列を含むＶＨＨドメインである、実施態様２〜１０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様２４：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、
ａ）配列番号６７のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列と１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列；又は
ｄ）配列番号５３〜１２０のいずれか１つのアミノ酸配列
に示される配列を含むＶＨＨドメインである、実施態様２〜１０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様２５：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１又は配列番号３に示される配列を含む、実施態様２記載のポリペプチド。
実施態様２６：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１２１〜１４０、又は配列番号２２２〜２２４のいずれか１つに示される配列を含む、実施態様２記載のポリペプチド。
実施態様２７：ヒト化され、及び／又は安定性、有効性、製造可能性、及び／又はヒトフレームワーク領域に対する類似性について最適化された、上記の実施態様の１つのいずれか記載のポリペプチド。
実施態様２８：ヒト化され、及び／又は１つ又は複数の以下の位置（カバットナンバリングによる）：１、１１、１４、１６、７４、８３、１０８で最適化された配列である、実施態様２７記載のポリペプチド。
実施態様２９：１個又は複数の以下の変異：Ｅ１Ｄ、Ｓ１１Ｌ、Ａ１４Ｐ、Ｅ１６Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｑ１０８Ｌを含む、実施態様２８記載のポリペプチド。
実施態様３０：
ｉ）ＦＲ１が、配列番号１９８〜２０４から選択され；
ｉｉ）ＦＲ２が、配列番号２０５〜２０８から選択され；
ｉｉｉ）ＦＲ３が、配列番号２０９〜２１０から選択され；及び／又は
ｉｖ）ＦＲ４が、配列番号２１１〜２１２から選択される、
実施態様３〜２９のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３１：ヒト化され、及び／又は１つ又は複数の以下の位置（カバットナンバリングによる）：５２、５３で最適化された配列である、実施態様３〜３０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３２：１個又は複数の以下の変異：Ｎ５２Ｓ、Ｓ５３Ｔを含む、実施態様３１記載のポリペプチド。
実施態様３３：ＣＤＲ２が、配列番号２１４〜２２１から選択される、実施態様３〜３２のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３４：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１３８〜１４０、又は２２２〜２２４のいずれかに示される配列を含む、実施態様２〜３３のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３５：ＶＨＨドメインが、アミノ酸配列のいずれか１つからなる、実施態様２２〜２６のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３６：免疫グロブリン単一可変ドメインが、少なくとも１個の配列番号１〜１２０、１２１〜１４０、及び２２２〜２２４の免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＸ３ＣＲ１への結合を交差阻害する、実施態様２〜３５のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３７：免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＣＸ３ＣＲ１への結合から、少なくとも１個の配列番号１〜１２０、１２１〜１４０、及び２２２〜２２４のアミノ酸配列により交差阻害される、実施態様２〜３５のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３８：半減期延長部分を更に含む、実施態様２〜３７のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様３９：半減期延長部分が、ポリペプチドに共有結合し、アルブミン結合部分（例えば、抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合部分（例えば、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組み換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、又はＦｃドメインからなる群より選択される、実施態様３８記載のポリペプチド。
実施態様４０：半減期延長部分が、抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインからなる、実施態様３８又は３９記載のポリペプチド。
実施態様４１：免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨＨドメイン、ヒト化ＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、及び／又は「ｄＡｂ」から選択される、実施態様４０記載のポリペプチド。
実施態様４２：抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２３０〜２３２から選択される、実施態様４１記載のポリペプチド。
実施態様４３：Ｆｃ部分（例えば、ヒトＦｃ（例えば、配列番号２５２に示される））に、場合により、適当なリンカー又はヒンジ領域を介して結合する、実施態様２〜３９のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様４４：１個又は複数の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の一部として／Ｆｃ部分を形成するための部分として用いられ得る２又は３個の定常ドメイン）、Ｆｃ部分、及び／又は１個又は複数のエフェクター機能を本発明のポリペプチドに付与し、及び／又は１個又は複数のＦｃ受容体に場合により適当なリンカー又はヒンジ領域を介して結合する能力を付与し得る、１個又は複数の抗体部分、フラグメント、又はドメインに更に結合する、実施態様２〜３９のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様４５：第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくは、第２の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを更に含む、実施態様２〜３７のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様４６：第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、リンカーペプチドにより共有結合する、実施態様４５記載のポリペプチド。
実施態様４７：第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、４個のフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）、及び３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、実施態様４５又は４６記載のポリペプチド。
実施態様４８：第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、抗体ドメインである、実施態様４５〜４７のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様４９：第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は安定性、有効性、製造可能性、及び／又はヒトフレームワーク領域に対する類似性について最適化されたＶＨＨである、実施態様４５〜４８のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様５０：第２の免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が、実施態様１１〜２１のいずれか１つに示される、実施態様４５〜４９のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様５１：第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、同一のＣＤＲ３を含む、実施態様４５〜５０のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様５２：ＣＤＲ３が、実施態様１１〜１３のいずれか１つに示される、実施態様５１記載のポリペプチド。
実施態様５３：第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、実施態様４５〜５３のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様５４：ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が、実施態様１１〜２１のいずれか１つに示される、実施態様５３記載のポリペプチド。
実施態様５５：第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、同一のＶＨＨドメインを含む、実施態様４５〜５４のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様５６：ＶＨＨドメインが、実施態様２２〜３７のいずれか１つに示される、実施態様４５〜５５のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様５７：配列番号１４１、１６４、及び１８６、又は配列番号１４１、１６２、及び１８６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び実施態様２〜３７のいずれか１つに示される第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ポリペプチド。
かかるポリペプチドは、特に、実施態様４５〜５６のいずれか記載のポリペプチドであってもよい。
実施態様５８：第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２１３、２１４、及び１８６、配列番号２１３、２２１、及び１８６、又は配列番号１４１、１６２、及び１８６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、実施態様５７記載のポリペプチド。
実施態様５９：第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１４１、１６４、及び１８６、又は配列番号１４１、１６２、及び１８６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、実施態様５７又は５８記載のポリペプチド。
実施態様６０：第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２１３、２１４、及び１８６、配列番号２１３、２２１、及び１８６、又は配列番号１４１、１６２、及び１８６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、実施態様５７又は５８記載のポリペプチド。
実施態様６１：配列番号１又は配列番号３に示される配列を含むＶＨＨドメインである第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び実施態様２〜３７のいずれか１つ記載の第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ポリペプチド。
かかるポリペプチドは、特に、実施態様４５〜６０のいずれか記載のポリペプチドであってもよい。
実施態様６２：第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１２１〜１４０、又は２２２〜２２４のいずれか１つに示される配列を含むＶＨＨドメインである、実施態様６１記載のポリペプチド。
実施態様６３：第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１又は配列番号３に示される配列を含むＶＨＨドメインである、実施態様６１又は６２記載のポリペプチド。
実施態様６４：第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１２１〜１４０、又は２２２〜２２４のいずれか１つに示される配列を含むＶＨＨドメインである、実施態様６３記載のポリペプチド。
実施態様６５：半減期延長部分を更に含む、実施態様４５〜６４のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様６６：半減期延長部分が、ポリペプチドに共有結合し、アルブミン結合部分（例えば、抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合部分（例えば、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組み換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、又はＦｃドメインからなる群より選択される、実施態様６５記載のポリペプチド。
実施態様６７：半減期延長部分が、抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインからなる、実施態様６６記載のポリペプチド。
実施態様６８：免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨＨドメイン、ヒト化ＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、及び／又は「ｄＡｂ」から選択される、実施態様６７記載のポリペプチド。
実施態様６９：抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２３０〜２３２から選択される、実施態様６８記載のポリペプチド。
実施態様７０：ポリペプチドが、Ｆｃ部分（例えば、ヒトＦｃ（例えば、配列番号２５２に示される））に、場合により適当なリンカー又はヒンジ領域を介して結合する、実施態様４５〜６４のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様７１：１個又は複数の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の一部として／Ｆｃ部分を形成するための部分として用いられ得る２又は３個の定常ドメイン）、Ｆｃ部分、及び／又は１個又は複数のエフェクター機能を本発明のポリペプチドに付与し、及び／又は１個又は複数のＦｃ受容体に場合により適当なリンカー又はヒンジ領域を介して結合する能力を付与し得る、１個又は複数の抗体部分、フラグメント、又はドメインに更に結合する、実施態様４５〜６６のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様７２：配列番号２２５〜２２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
実施態様７３：配列番号２４９、又は２７７〜２８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
実施態様７４：配列番号２５７〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
実施態様７５：配列番号２５３又は２５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
実施態様７６：配列番号２６３又は２６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
実施態様７７：配列番号２６７〜２７６、及び２８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
実施態様７８：実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドをコードする領域を含む、核酸分子。
実施態様７９：実施態様７８記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
実施態様８０：核酸分子を含む発現ベクターを有する宿主細胞であって、核酸分子は、実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドをコードする領域を含み、宿主細胞は、実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドを発現する能力があり、原核生物又は真核生物の細胞である、宿主細胞。
実施態様８１：（ｉ）有効成分として、１個又は複数の実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、及び場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含む、医薬組成物。
実施態様８２：実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドの製造方法であって、
− 宿主細胞を、実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、
（ここで、宿主細胞は、核酸分子（実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドをコードする領域を含む）を含む発現ベクターを有し、原核生物又は真核生物の細胞である）；
− ポリペプチドを回収し；
− ポリペプチドを精製する、
工程を含む、製造方法。
実施態様８３：特に、ヒトにおける、疾患、障害、又は状態の処置、予防、又は緩和のための、実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドの使用方法。
実施態様８４：疾患、障害、又は状態が、ＣＸ３ＣＲ１関連疾患、障害、又は状態である、実施態様８３の方法。
実施態様８５：疾患、障害、又は状態が、アテローム性動脈硬化症である、実施態様８３の方法。
実施態様８６：ヒトでの静脈内又は皮下注射に適当である、実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドを含む、注射可能な医薬組成物。
実施態様８７：ＣＸ３ＣＲ１と関連する疾患又は障害の予防及び／又は処置方法であって、必要とする対象に、医薬上有効量の少なくとも１個の実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドを投与することを含む、方法。
実施態様８８：スタチン、抗血小板物質、抗凝固剤、抗糖尿病薬、及び降圧剤からなる群より選択される更なる治療剤を投与することを更に含む、実施態様８５の方法。
実施態様８９：哺乳類細胞においてＣＸ３ＣＲ１のフラクタルカインへの結合を阻害する方法であって、細胞に実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドを投与し、これにより、フラクタルカインにより仲介されるシグナル伝達が阻害される、方法。
実施態様９０：試料を、実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドと接触させ、ポリペプチドのＣＸ３ＣＲ１との結合を検出することによる、生物学的試料におけるＣＸ３ＣＲ１レベルの検出及び／又は定量方法。
実施態様９１：ＣＸ３ＣＲ１関連障害の診断方法、又は対象がＣＸ３ＣＲ１関連障害を発症する増大したリスクを有するかどうかの決定方法であって、対象由来の生物学的試料を実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドと接触させ、ポリペプチドのＣＸ３ＣＲ１への結合を検出して、ＣＸ３ＣＲ１の発現又は濃度を決定することを含む、方法。
実施態様９２．ヒトにおいて、疾患、障害、又は状態の処置、予防、又は緩和で用いるための、実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチド。
実施態様９３．疾患、障害、又は状態が、ＣＸ３ＣＲ１関連疾患、障害、又は状態である、実施態様９２記載の使用のためのポリペプチド。
実施態様９４．疾患、障害、又は状態が、心血管及び脳血管アテローム性障害、末梢動脈障害、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月体形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む脈管炎、関節リウマチ、骨関節炎、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性障害、及び脱髄性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌から選択される、実施態様９２記載の使用のためのポリペプチド。
実施態様９５．疾患、障害、又は状態が、アテローム性動脈硬化症である、実施態様９２記載の使用のためのポリペプチド。
実施態様９６．ヒトにおける疾患、障害、又は状態の処置、予防、又は緩和用医薬の製造のための、実施態様１〜７７のいずれか記載のポリペプチドの使用。
実施態様９７．疾患又は障害が、心血管及び脳血管アテローム性障害、末梢動脈障害、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月体形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む脈管炎、関節リウマチ、骨関節炎、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性障害、及び脱髄性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌から選択される、実施態様８７記載の方法。
実施態様９８．疾患、障害、又は状態が、アテローム性動脈硬化症である、実施態様８７記載の方法。
実施態様９９．実施態様１〜７７のいずれか１つ記載のポリペプチドを含む、診断キット又は診断方法、又はその使用。
実施態様１００．心血管及び脳血管アテローム性障害、末梢動脈障害、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月体形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む脈管炎、関節リウマチ、骨関節炎、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性障害、及び脱髄性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌の少なくとも１つの診断のための、実施態様９９記載の診断キット又は診断方法。
発明の詳細な説明
定義
本発明の上記及び他の態様及び実施態様は、以下の本明細書の更なる記載から明らかになるだろう。
ａ）別に示されるか、又は定義されない限り、用いられる全ての用語は、当該技術分野において通常の意味を有し、当業者に明確であろう。例えば、標準的な参考書、例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)、及びRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、並びに本明細書で引用される一般的な背景技術が参照され；更に、別に示されない限り、詳細に具体的に記載されない全ての方法、工程、技術、及び操作を行うことができ、それ自体既知の方法（当業者にとって明確であろう）で行われている。例えば、標準的な参考書、上で言及された一般的な背景技術、及びこれらにおいて引用される更なる参考文献が再度参照される。
ｂ）別に示されない限り、用語「免疫グロブリン」及び「免疫グロブリン配列」は、重鎖抗体又は通常の４本鎖抗体に言及するために本明細書で用いられる場合、一般的な用語として用いられ、これは、全長サイズの抗体、その個々の鎖、並びにその全ての部分、ドメイン、又はフラグメント（抗原結合ドメイン、又はフラグメント、例えば、それぞれ、ＶＨＨドメイン、又はＶＨ／ＶＬドメインを含むが、これらに限定されない）の両方を含む。加えて、本明細書で用いられる用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「（単一）可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語において）は、文脈がより限定的な解釈を必要としない限り、一般的に、適切なアミノ酸配列、並びにそれをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の両方を含むと解されるべきである。
ｃ）本明細書で用いられる用語（ポリペプチド又はタンパク質の）「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分とは無関係に３次構造を保持する能力を有する折り畳みタンパク質構造に言及する。一般的に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性に関与し、多くの場合で、タンパク質の残り及び／又はドメインの機能を喪失することなく、加えられ、取り除かれ、又は他のタンパク質に転移され得る。
ｄ）本明細書で用いられる用語「免疫グロブリンドメイン」は、抗体鎖の球状領域（例えば、通常の４本鎖抗体、又は重鎖抗体の鎖）、又はかかる球状領域から本質的になるポリペプチドに言及する。免疫グロブリンドメインは、それらが、抗体分子の免疫グロブリン折り畳み特徴を保持し、場合により、保存ジスルフィド結合により安定化された、２枚のβ−シート中に並べられた約７本の逆平行β鎖の２層のサンドイッチからなることを特徴とする。
ｅ）本明細書で用いられる用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、それぞれ、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」として当該技術分野及び本明細書において以下で言及されるものから本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し；そのフレームワーク領域は、それぞれ、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」として当該技術分野及び本明細書において以下で言及される、３個の「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により妨げられる。従って、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下の：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４として示され得る。それは、抗原結合部位を有することにより、抗体に抗原に対する特異性を付与する免疫グロブリン可変ドメイン（複数を含む）である。
ｆ）本明細書で用いられる用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」及び「単一可変ドメイン」は、更なる可変免疫グロブリンドメインと対形成をすることなく、抗原のエピトープに特異的に結合する能力がある免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味において、免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、「ドメイン抗体」、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨ及びＶＬ（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）である。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、本明細書において以下で定義される、ラクダ類由来の「ＶＨＨドメイン」（又は単に「ＶＨＨ」）である。
上記の定義を考慮して、通常の４本鎖抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子；当該技術分野で知られている）の抗原結合ドメイン、又はかかる通常の４本鎖抗体由来のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えば、ジスルフィド結合したＦｖ又はｓｃＦｖフラグメント、又は二重特異性抗体（全て当該技術分野で知られている）の抗原結合ドメインは、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインと見なされず、これらの場合において、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は、通常、１個（単一）の免疫グロブリンドメインによっては生じないが、１対の（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば、軽鎖及び重鎖可変ドメイン、すなわち、ＶＨ−ＶＬ対の免疫グロブリンドメインによって生じ、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する。
ｆ１）ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体としても知られている「ＶＨＨドメイン」は、本来、「重鎖抗体」の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメイン（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」のもの；Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)）として記載される。用語「ＶＨＨドメイン」は、通常の４本鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書で「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」として言及される）、及び通常の４本鎖抗体（本明細書で「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」として言及される）中に存在する軽鎖可変ドメイン由来のこれらの可変ドメインを区別するために選択される。ＶＨＨドメインは、エピトープに、更なる抗原結合ドメインなく、特異的に結合し得る（通常の４本鎖抗体中のＶＨ又はＶＬドメインと対立し、その場合、エピトープは、ＶＬドメインによりＶＨドメインと一緒に認識される）。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインにより形成される小さい、頑強で、かつ効率的な抗原認識単位である。
本発明の構成において、用語ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、ＶＨＨ抗体、並びに「Nanobody（登録商標）」、及び「Nanobody（登録商標）ドメイン」（「Nanobody」は、Ablynx N.V.社；Ghent；Belgiumの登録商標である）は、互換的に用いられ得、代表的な免疫グロブリン単一可変ドメイン（構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、エピトープに、第２の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要とすることなく特異的に結合する）であり、そしてこれは、ＶＨドメインと、例えば、国際公開公報第２００９／１０９６３５号、図１において定義される、いわゆる「特徴残基」により区別される。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、例えば、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999)の図２に示される、ラクダ類由来のＶＨＨドメインに適用される、Kabat等（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD、公開番号第９１号）により付与される、ＶＨドメインについての一般的なナンバリングに従い番号付けされる。このナンバリングによると、
− ＦＲ１は、アミノ酸残基を１〜３０位で含み、
− ＣＤＲ１は、アミノ酸残基を３１〜３５位で含み、
− ＦＲ２は、アミノ酸を３６〜４９位で含み、
− ＣＤＲ２は、アミノ酸残基を５０〜６５位で含み、
− ＦＲ３は、アミノ酸残基を６６〜９４位で含み、
− ＣＤＲ３は、アミノ酸残基を９５〜１０２位で含み、
− ＦＲ４は、アミノ酸残基を１０３〜１１３位で含む。
しかしながら、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当該技術分野で周知であるように、各ＣＤＲ中のアミノ酸残基の総数は、変動し得、カバットナンバリングにより示されるアミノ酸残基の総数に対応し得ない（つまり、カバットナンバリングによる１個又は複数の位置は、実際の配列に占有され得ず、又は実際の配列は、カバットナンバリングにより可能とされる数より多いアミノ酸残基を含有し得る）ことは注意されるべきである。これは、一般的に、カバットによるナンバリングは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応し得るか、又はし得ないことを意味する。
ＶＨＨドメインに対する同様の方法で適用され得る、ＶＨドメインのアミノ酸残基のナンバリングの代替方法が、当該技術分野で知られている。しかしながら、本明細書、請求項、図面において、別に示されない限り、カバットによる、かつ上述のＶＨＨドメインに適用されるナンバリングが、後に続く。
ＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０、しばしば、１１２〜１１５の範囲にある。しかしながら、より短い配列、及びより長い配列も、本明細書に記載の目的に適当であり得ることは注意されるべきである。
ＶＨＨドメイン、及びそれを含有するポリペプチドの更なる構造的特徴及び機能特性が、以下に要約され得る。
ＶＨＨドメイン（軽鎖可変ドメインの存在なく、かつ軽鎖可変ドメインと相互作用することなく、抗原に機能的に結合する性質により、「設計」されている）は、単一の、比較的小さい、機能的抗原結合構造単位、ドメイン又はポリペプチドとして機能し得る。これは、ＶＨＨドメインを通常の４本鎖抗体のＶＨ及びＶＬドメインと区別し、それ自体、一般的には、単一の抗原結合タンパク質、又は免疫グロブリン単一可変ドメインとしての実際の適用について研究されないが、機能抗原結合単位（例えば、通常の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）；ｓｃＦｖ'ｓにおいて、ＶＬドメインに共有結合したＶＨドメインからなる）を提供するためのくつかの形態又は別の形態で組み合わされる必要がある。
これらの固有の特性のため、ＶＨＨドメインの使用（単独、又はより長いポリペプチドの一部としてののいずれか）は、通常のＶＨ及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ'ｓ、又は通常の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ−又はＦ（ａｂ'）２−フラグメント）の使用を上回る多数の有意な利点を示す：
− ２個の別々のドメインを有する必要がなく、これら２つのドメインが、右の空間構造及び配置に存在すること（すなわち、特に、設計されたリンカーのｓｃＦｖ'ｓとの使用を通じて）を保証しないように、単一ドメインは、抗原を高親和性及び高選択性で結合することを必要とする；
− ＶＨＨドメインは、単一遺伝子から発現することができ、翻訳後の折り畳み又は修飾の必要がない；
− ＶＨＨドメインは、多価かつ多選択性フォーマットに容易に操作され得る（本明細書で更に開示される）；
− ＶＨＨドメインは、高度に可溶性であり、凝集する傾向を有しない（Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)）により記載されるマウス由来抗原結合ドメインと同様）；
− ＶＨＨドメインは、熱、pH、タンパク質分解酵素、及び他の変性剤、又は条件に対して高度に安定であり、従って、冷凍装置を使用することなく調製され、保存され、又は輸送され得、これにより、コスト、時間、及び環境保護がもたらされる；
− ＶＨＨドメインは、産生に必要なスケール上でさえ、調製するのが容易かつ比較的安価であり（例えば、ＶＨＨドメイン及びそれを含有するポリペプチドは、微生物発酵を用いて産生され得る（例えば、更に後述される））、例えば、通常の抗体フラグメントのような哺乳類発現系の使用を必要としない；
− ＶＨＨドメインは、通常の４本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して、比較的小さく（約１５kDa、又は通常のＩｇＧより１０倍小さい）、それ故、
−− 組織への（より）高い浸透を示し
−− より高用量で投与され得る；
− ＶＨＨドメインは、（いわゆる空洞）結合特性を示し（とりわけ、通常のＶＨドメインと比較して、延長されたＣＤＲ３ループに起因する）、それ故、通常の４本鎖抗体、及びその抗原結合フラグメントにアクセス可能でない標的及びエピトープにアクセスできる。
特異的抗原又はエピトープに結合するＶＨＨドメインを得る方法は、例えば、国際特許出願公開公報第２００６／０４０１５３号、及び第２００６／１２２７８６号のいずれかに記載されている。そこでも詳細に記載されているように、ラクダ類由来のＶＨＨドメインは、ヒト由来の通常の４本鎖抗体由来のＶＨドメイン中の対応する位置（複数を含む）で生じる１個又は複数のアミノ酸残基により、本来のＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１個又は複数のアミノ酸残基を置換することにより、「ヒト化」され得る。ヒト化ＶＨＨドメインは、１個又は複数の全ヒトフレームワーク領域配列を含有し得、なおより特異的な実施態様において、場合により、ＪＨ配列、例えば、ＪＨ５と組み合わされた、ＤＰ−２９、ＤＰ−４７、ＤＰ−５１、又はその一部由来のヒトフレームワーク領域配列を含有し得る。
ｆ２）「Ｄａｂ」としても知られている「ドメイン抗体」、「ドメイン抗体」、及び「ｄＡｂｓ」（用語「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂｓ」は、GlaxoSmithKlineグループ会社により登録商標として用いられている）は、例えば、Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003)；及び国際特許出願公開公報第２００３／００２６０９号に記載されている。
ドメイン抗体は、本質的には、非ラクダ類哺乳類、特に、ヒト４本鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインに対応する。エピトープを、単一抗原結合ドメインとして、すなわち、それぞれ、ＶＬ又はＶＨドメインと対形成することなく結合するために、かかる抗原結合特性についての特異的選択が、例えば、ヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを用いることにより、必要とされる。
ドメイン抗体は、ＶＨＨ同様、分子量約１３〜約１６kDaを有し、全ヒト配列に由来する場合、例えば、ヒトにおける治療上の使用のため、ヒト化を必要としない。ＶＨＨドメインの場合、それらは、原核生物発現系においても十分に発現し、全体的な製造コストの有意な低減をもたらす。
ドメイン抗体、並びにＶＨＨドメインは、１個又は複数の変更を１個又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列中に導入することにより、親和性成熟の対象にされることができ、その変更は、それぞれの親分子と比較し、そのそれぞれの抗原について得られた免疫グロブリン単一可変ドメインの改良された親和性を生じる。本発明の親和性成熟免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、例えば、Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783、又はBarbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809 3813.；Shier et al., 1995, Gene 169:147-155；Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004；Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9；及びHawkins et al., 1992, J. MoI. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996により記載される、当該技術分野で既知の方法により調製され得る。
ｆ３）更に、上述の１個又は複数のＣＤＲを、ヒトスキャフォールド、又は非免疫グロブリンスキャフォールドを含むが、これらに限定されない、他の「スキャフォールド」上に「移植する」ことは可能であることも、当業者に明らかであろう。かかるＣＤＲ移植の適当なスキャフォールド及び技術は、当該技術分野で知られている。
ｇ）互換的に用いられ得る、用語「エピトープ」及び「抗原決定基」は、抗原結合分子、例えば、通常の抗体又は本発明のポリペプチド、より具体的には、当該分子の抗原結合部位により認識される、高分子の一部、例えば、ポリペプチドに言及する。エピトープは、免疫グロブリンに対する最小結合部位を定義し、従って、免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
エピトープを認識する抗原結合分子の一部（例えば、通常の抗体、又は本発明のポリペプチド）は、パラトープと呼ばれる。
ｈ）本明細書で用いられる用語「２重パラトピック（biparatopic）」（抗原）結合分子、又は「２重パラトピック」ポリペプチドは、本明細書で定義される、第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを意味し、ここで、これら２個の可変ドメインは、１個の抗原の２個の異なるエピトープに結合する能力があり、そのエピトープは、通常、同時に、１個の単一特異的免疫グロブリン、例えば、通常の抗体、又は１個の免疫グロブリン単一可変ドメインにより結合しない。２重パラトピックポリペプチドは、異なるエピトープ特異性を有する可変ドメインからなることができ、同一のエピトープに結合する互いに相補的な可変ドメイン対を含有しない。それ故、２個の可変ドメインは、標的への結合に対して互いに競合しない。
ｉ）ある種のエピトープ、抗原、又はタンパク質（又は少なくとも１個のその一部、フラグメント、又はエピトープ）に「結合する」か、又は「特異的に結合する」、「親和性を有する」か、及び／又は「特異性を有する」ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、本発明のポリペプチド、又は一般的な抗原結合分子、又はそのフラグメント）は、当該エピトープ、抗原、又はタンパク質に「対する」か、又は「対して指定されている」と言われるか、又はかかるエピトープ、抗原、又はタンパク質に関して「結合」分子であるか、又は「抗」エピトープ、「抗」抗原、又は「抗」タンパク質（例えば、抗ＣＸ３ＣＲ１）であると言われる。
ｋ）一般的に、用語「特異性」は、特定の抗原結合分子、又は抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は本発明のポリペプチド）が結合し得る、異なる種類の抗原又はエピトープの数に言及する。抗原結合タンパク質の特異性は、その親和性、及び／又は結合活性に基づき決定され得る。抗原の抗原結合タンパク質（ＫＤ）での解離平衡定数により表される、親和性は、抗原結合タンパク質上のエピトープと抗原結合部位間の結合強度の測定値である：ＫＤの値が小さいほど、エピトープと抗原結合分子間の結合強度は強い（或は、親和性は、１／ＫＤである親和性定数（ＫＡ）としても表され得る）。（例えば、本明細書の更なる開示に基づき）当業者に明らかなように、親和性は、対象の特異的抗原に依存して、それ自体既知の方法で決定され得る。結合活性は、抗原結合分子（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は本発明のポリペプチド）と関連抗原間の結合の強度の測定値である。結合活性は、抗原結合分子上のエピトープとその抗原結合部位間の親和性、及び抗原結合分子上に提示される関連結合部位の数の両方に関連する。
ｌ）アミノ酸残基は、当該技術分野で一般的に知られ、一致した標準的な３文字又は１文字アミノ酸コードにより示される。２種のアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸相違」は、第２の配列と比較して、参考配列の位置で示された数のアミノ酸残基の挿入、欠損、又は置換に言及する。置換（複数を含む）の場合、かかる置換（複数を含む）は、好ましくは、保存的アミノ酸置換（複数を含む）であり、これは、アミノ酸残基が、同様の化学的構造の別のアミノ酸残基で置換されることを意味し、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に影響しないか、又は本質的に影響しない。かかる保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で周知であり（例えば、国際特許出願公開公報第９８／４９１８５号から）、ここで、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、置換であり、以下の群（ｉ）〜（ｖ）内の１個のアミノ酸が、同一群内の別のアミノ酸残基により置換される：（ｉ）小さな脂肪族、非極性、又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；（ｉｉ）極性、負に帯電した残基、及びその（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；（ｉｉｉ）極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｉｖ）巨大な脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；及び（ｖ）芳香族性残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下の通りである：
Ａｌａが、Ｇｌｙ又はＳｅｒに；
Ａｒｇが、Ｌｙｓに；
Ａｓｎが、Ｇｌｎ又はＨｉｓに；
Ａｓｐが、Ｇｌｕに；
Ｃｙｓが、Ｓｅｒに；
Ｇｌｎが、Ａｓｎに；
Ｇｌｕが、Ａｓｐに；
Ｇｌｙが、Ａｌａ又はＰｒｏに；
Ｈｉｓが、Ａｓｎ又はＧｌｎに；
Ｉｌｅが、Ｌｅｕ又はＶａｌに；
Ｌｅｕが、Ｉｌｅ又はＶａｌに；
Ｌｙｓが、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕに；
Ｍｅｔが、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、又はＩｌｅに；
Ｐｈｅが、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒに；
Ｓｅｒが、Ｔｈｒに；
Ｔｈｒが、Ｓｅｒに；
Ｔｒｐが、Ｔｙｒに；
Ｔｙｒが、Ｔｒｐ又はＰｈｅに；
Ｖａｌが、Ｉｌｅ又はＬｅｕに。
ｍ）核酸又はポリペプチド分子は、例えば、それが得られた、その天然の生物学的供給源、及び／又は反応培地又は培養培地と比較したとき（当該供給源又は培地において通常関連する少なくとも１個の他の成分（例えば、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分、又は高分子又は少なくとも１個の混入物質、不純物、又はマイナー成分）から分離されるとき）「本質的に単離された（形態）（にある）」とみなされる。特に、核酸又はポリペプチド分子は、少なくとも２倍、特に、少なくとも１０倍、なお特に、少なくとも１００倍、最大１０００倍以上に精製されたとき、「本質的に単離された」とみなされる。「本質的に単離された形態にある」核酸又はポリペプチド分子は、好ましくは、本質的に均一である（適当な技術、例えば、適当なクロマトグラフィー技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて決定される）。
ｎ）例えば、２個の免疫グロブリン単一可変ドメイン配列間の「配列同一性」は、これら２個の配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。これは、国際特許出願公開公報第０８／０２００７９号の第４９及び５０頁の段落ｆ）に記載される通り、計算されるか、又は決定され得る。「配列類似性」は、同一であるか、又は保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。
標的特異性
ポリペプチドは、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対する特異性を有する。従って、本発明のポリペプチドは、好ましくは、ヒトＣＸ３ＣＲ１（配列番号２５５）に結合する。１つの態様において、本発明のポリペプチドはまた、カニクイザルＣＸ３ＣＲ１（配列番号２５６）に結合する。
本発明のポリペプチド
本発明は、ＣＸ３ＣＲ１関連疾患、障害、又は状態（例えば、心血管疾患）の予防、処置、緩和、及び／又は診断のための、新規の医薬的に有効な剤を提供する。特に、本発明は、ヒトＣＸ３ＣＲ１に結合し、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力があるポリペプチドを提供する。１つの態様において、ポリペプチドは、３個の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンであり、ここで、当該免疫グロブリンは、ヒトＣＸ３ＣＲ１に結合し、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力がある。更なる態様において、ポリペプチドは、１個又は複数の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ここで、当該ポリペプチドは、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する能力がある。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、１個又は複数の以下の特性：
・ 高親和性でヒトＣＸ３ＣＲ１に結合する（例えば、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＥＣ５０（細胞結合ＦＡＣＳにより測定）で）；
・ ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する（例えば、３００ｎＭ以下、又は１００ｎＭ以下、又は２０ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ、又は２．５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０で）；
・ ヒトＣＸ３ＣＲ１により仲介される、フラクタルカインにより誘導される走化性を阻害する（例えば、５００ｎＭ以下、又は１００ｎＭ以下、又は７５ｎＭ以下、又は５０ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ以下のＩＣ５０で；阻害の得られた有効性は、１５％以上、又は５０％以上、又は８０％以上、又は９５％以上である）；
・ ヒトＣＸ３ＣＲ１により仲介される、フラクタルカインにより誘導される内部移行を阻害する（例えば、１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ以下のＩＣ５０で）；
・ カニクイザルＣＸ３ＣＲ１と交差反応する（例えば、結合及び機能的阻害について、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対するＥ／ＩＣ５０の１０倍以内で）、
により特徴付けられる。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、半減期延長部分（例えば、アルブミン結合部分、ポリエチレングリコール分子、又はＦｃドメイン）を更に含む。更なる態様において、本発明のポリペプチドは、２個以上の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。１つの態様において、２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、リンカーペプチドにより共有結合する。１つの態様において、本発明のポリペプチド中の２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、同一のアミノ酸配列を有する。別の態様において、本発明のポリペプチド中の２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、異なるアミノ酸配列を有する。１つの態様において、本発明のポリペプチドは、２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、半減期延長部分（例えば、アルブミン結合部分、ポリエチレングリコール分子、又はＦｃドメイン）を更に含む。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、アルブミン結合部分に第１のリンカーペプチドにより共有結合した第１の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ここで、当該アルブミン結合部分は、第２の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインに第２のリンカーペプチドにより更に共有結合する。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインにリンカーペプチドにより共有結合した抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。１つの態様において、Ｆｃドメインにリンカーペプチドにより共有結合した抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むかかるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド架橋を介して２量体として提供される。
本発明によるポリペプチドは、後述される通りに得られる。要約すると、本発明の単一可変ドメインは、ヒトＣＸ３ＣＲ１をコードするＤＮＡで免疫されたラマからもたらされた単一可変ドメイン（ＶＨＨ）発現ライブラリーから同定された。ファージライブラリーは、ｈＣＸ３ＣＲ１ウイルス脂質粒子上にピックアップされ、結合ファージは、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ標識フラクタルカイン（ＡＦ−ＦＫＮ）との受容体結合に対して競合する能力についてスクリーニングされた。本発明の代表的な単一可変ドメインは、本明細書において更に詳細に記載される。
１つの態様において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、４個のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）、及び３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）から本質的になる。特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有する。１つの態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗体ドメインである。
１つの態様において、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、配列番号１９７に示されるアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（式中：
− Ｘａａ１は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、又はＧｌｙであり；
− Ｘａａ２は、Ａｓｐ、又はＡｓｎであり；
− Ｘａａ３は、Ｔｈｒ、又はＳｅｒであり；
− Ｘａａ４は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、又はＧｌｙであり；
− Ｘａａ５は、Ｔｙｒ、又はＰｈｅである）
を有する。
１つの態様において、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、配列番号１９７に示されるアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（式中：
− Ｘａａ１は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、又はＧｌｙであり；
− Ｘａａ２は、Ａｓｐ、又はＡｓｎであり；
− Ｘａａ３は、Ｔｈｒであり；
− Ｘａａ４は、Ａｒｇ、又はＬｙｓであり；
− Ｘａａ５は、Ｔｙｒである）
を有する。
１つの態様において、本発明のポリペプチドのＣＤＲ３、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、配列番号１８６に示されるアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒを有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有し：
− ＣＤＲ１は：
ａ）アミノ酸配列ＧＳＩＦＳＳＮＡＭＡ（配列番号１４１）を有するか；又は
ｂ）配列番号１４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；又は
ｃ）配列番号１４１のアミノ酸配列と２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ２位で、Ｓは、Ｔ、又はＧに変更され；
− ６位で、Ｓは、Ｒに変更され；
− ７位で、Ｎは、Ｔに変更され；及び／又は
− ９位で、Ｍは、Ｋに変更される）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１４１〜１４５、及び２１３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
− ＣＤＲ２が：
ａ）アミノ酸配列ＧＩＮＳＶＧＩＴＫ（配列番号１６４）を有するか；又は
ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；又は
ｃ）配列番号１６４のアミノ酸配列と４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− １位で、Ｇは、Ａ、Ｌ、Ｖ、又はＳに変更され；
− ３位で、Ｎは、Ｄ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、又はＴに変更され；
− ４位で、Ｓは、Ｔ、Ｋ、Ｇ、又はＰに変更され；
− ５位で、Ｖは、Ａに変更され；
− ６位で、Ｇは、Ｄに変更され；
− ７位で、Ｉは、Ｔ、又はＶに変更され；
− ８位で、Ｔは、Ａに変更され；及び／又は
− ９位で、Ｋは、Ｒに変更される）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１６２〜１７５、及び２１４〜２２１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
− ＣＤＲ３は：
ａ）アミノ酸配列ＤＰＲＲＧＷＤＴＲＹ（配列番号１８６）を有するか；又は
ｂ）配列番号１８６のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；又は
ｃ）配列番号１８６のアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ２位で、Ｐは、Ａ、又はＧに変更され；
− ７位で、Ｄは、Ｎに変更され；及び／又は
− ９位で、Ｒは、Ｋに変更される）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１８６〜１９０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有し、ここで：
− 当該ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧ（配列番号１４６）を有し；
− 当該ＣＤＲ２は、ａ）アミノ酸配列ＧＩＳＧＳＡＳＲＫＹ（配列番号１７６）と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するか、又はｂ）配列番号１７６又は１７７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有し；
− 当該ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＮＳＹＰＫＶＱＦＤＹ（配列番号１９１）を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有し：
− 当該ＣＤＲ１は：
ａ）アミノ酸配列ＧＴＩＦＳＮＮＡＭＧ（配列番号１４７）を有するか；又は
ｂ）配列番号１４７のアミノ酸配列と６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− １位で、Ｇは、Ｋ、Ｒ、又はＡに変更され；
− ２位で、Ｔは、Ｉ、Ｐ、Ｓ、又はＬに変更され；
− ３位で、Ｉは、Ｖ、又はＴに変更され；
− ４位で、Ｆは、Ｌに変更され；
− ５位で、Ｓは、Ｒ、又はＤに変更され；
− ６位で、Ｎは、Ｓ、Ｔ、又はＤに変更され；及び／又は
− ７位で、Ｎは、Ｔ、又はＹに変更される）
を有するか；又は
ｃ）配列番号１４７〜１６１のずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
− 当該ＣＤＲ２は：
ａ）アミノ酸配列ＳＩＳＮＳＧＳＴＮ（配列番号１７９）を有するか；又は
ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列と４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ３位で、Ｓは、Ｔ、又はＧに変更され；
− ４位で、Ｎは、Ｓ、又はＩに変更され；
− ５位で、Ｓは、Ｔに変更され；
− ６位で、Ｇは、Ｙに変更され；及び／又は
− ８位で、Ｔは、Ａに変更される）
を有するか；又は
ｃ）配列番号１７８〜１８５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し；
− 当該ＣＤＲ３は：
ａ）アミノ酸配列ＤＡＲＲＧＷＮＴＡＹ（配列番号１９２）を有するか；又は
ｂ）配列番号１９２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するか；又は
ｃ）配列番号１９２のアミノ酸配列と２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列（ここで、
− ２位で、Ａは、Ｇに変更され；
− ８位で、Ｔは、Ｓに変更され；
− ９位で、Ａは、Ｇに変更され；及び／又は
− １０位で、Ｙは、Ｆに変更される）
を有するか；又は
ｄ）配列番号１９２〜１９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３：
− それぞれ、配列番号１４１、１６２、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６３、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６６、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６７、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６７、及び１８９；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６８、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６８、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１６９、及び１９０；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７０、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７１、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、１７５、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４２、１６５、及び１８８；又は
− それぞれ、配列番号１４２、１７３、及び１８８；又は
− それぞれ、配列番号１４３、１６４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４４、１７２、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４５、１７２、及び１８７；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１４、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１５、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１６、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１７、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１８、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２１９、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号１４１、２２０、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
− それぞれ、配列番号２１３、２１４、及び１８６
を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３：
− それぞれ、配列番号１４６、１７６、及び１９１；又は
− それぞれ、配列番号１４６、１７７、及び１９１
を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３：
− それぞれ、配列番号１４７、１７８、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４７、１７９、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４７、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１４８、１７９、及び１９３；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１７９、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８０、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８１、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８３、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１４９、１８５、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１５０、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５０、１８２、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５１、１７９、及び１９３；又は
− それぞれ、配列番号１５１、１８２、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５１、１８４、及び１９６；又は
− それぞれ、配列番号１５２、１７９、及び１９５；又は
− それぞれ、配列番号１５３、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５４、１８２、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５５、１７９、及び１９５；又は
− それぞれ、配列番号１５６、１８１、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１５７、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１５８、１７９、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１５９、１７８、及び１９２；又は
− それぞれ、配列番号１６０、１７９、及び１９４；又は
− それぞれ、配列番号１６１、１７９、及び１９４
を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは：
− 配列番号１４１、１６４、及び１８６；又は
− 配列番号１４１、１６２、及び１８６
に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一ドメインは：
− 配列番号２１３、２１４、及び１８６；又は
− 配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
− 配列番号１４１、１６２、及び１８６
に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。
上述のＣＤＲを有する本発明の代表的なポリペプチドは、表１、２、３（それぞれ、ファミリー１０１、９、及び１３の代表的なポリペプチド）、及び４（ファミリー１０１の最適化された変異体の代表的なポリペプチド）に示される。
Figure 0006101715
Figure 0006101715

Figure 0006101715
＊ＣＤＲ配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering, vol 2に従い、決定された。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。
Figure 0006101715
＊ＣＤＲ配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering, vol 2に従い、決定された。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。
Figure 0006101715
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＊ＣＤＲ配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering, vol 2に従い、決定された。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。
Figure 0006101715
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＊ＣＤＲ配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering, vol 2に従い、決定された。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。
更なる態様において、本発明は、１個又は複数のＶＨＨドメインを有するポリペプチドを提供する。
１つの態様において、本発明のＶＨＨドメインは、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列；又は
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列；又は
ｄ）配列番号１〜４８、又は配列番号１２１〜１４０、又は配列番号２２２〜２２４のいずれか１つのアミノ酸配列
に示される配列を含むか、又は本質的になる。
更なる態様において、本発明のＶＨＨドメインは、
ａ）配列番号４９のアミノ酸配列；又は
ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列と５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列；又は
ｄ）配列番号４９〜５２のいずれか１つのアミノ酸配列
に示される配列を含むか、又は本質的になる。
更なる態様において、本発明のＶＨＨドメインは、
ａ）配列番号６７のアミノ酸配列；又は
ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列と１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列；又は
ｄ）配列番号５３〜１２０のいずれか１つのアミノ酸配列
に示される配列を含むか、又は本質的になる。
更なる態様において、本発明のＶＨＨドメインは、配列番号１２１〜１４０、又は配列番号２２２〜２２４に示されるアミノ酸配列を含むか、又は本質的になる。
更なる態様において、本発明のＶＨＨドメインは、配列番号１３８〜１４０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又は本質的になる。
更なる態様において、本発明のＶＨＨドメインは、配列番号２２２〜２２４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又は本質的になる。
本発明の代表的なＶＨＨドメインは、表５に示され、本発明の代表的な最適化されたＶＨＨドメインは、以下の表６に示される。
表５：ＶＨＨドメイン
配列番号１〜４８は、ファミリー１０１のＶＨＨドメインである。配列番号４９〜５２は、ファミリー９のＶＨＨドメインである。配列番号５３〜１２０は、ファミリー１３のＶＨＨドメインである。
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更なる態様において、本発明によるポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化され、及び／又は安定性、有効性、製造可能性、及び／又はヒトフレームワーク領域に対する類似性について最適化されている。例えば、ポリペプチドは、ヒト化され、及び／又は１個又は複数の以下の位置（カバットナンバリングによる）：１、１１、１４、１６、７４、８３、１０８で最適化された配列である。１つの態様において、ポリペプチドは、１個又は複数の以下の変異：Ｅ１Ｄ、Ｓ１１Ｌ、Ａ１４Ｐ、Ｅ１６Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｑ１０８Ｌを含む。
１つの態様において、本発明によるポリペプチドの１個又は複数のフレームワーク領域、特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化され、及び／又は最適化された配列である。１つの態様において、本発明によるポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、以下に示されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む：
ｉ）ＦＲ１は、配列番号１９８〜２０４のいずれか１つから説明され；
ｉｉ）ＦＲ２は、配列番号２０５〜２０８のいずれか１つから説明され；
ｉｉｉ）ＦＲ３は、配列番号２０９〜２１０のいずれか１つから説明され；及び／又は
ｉｖ）ＦＲ４は、配列番号２１１〜２１２のいずれか１つから示される。
上述の免疫グロブリン単一可変ドメインについてフレームワーク領域配列としても用いられ得る、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域配列（ＦＲ）は、当該技術分野において知られている。ヒト以外の種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域をヒト化する方法も、当該技術分野で知られている。
更なる態様において、本発明によるポリペプチドの１個又は複数のＣＤＲ領域、特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化され、及び／又は最適化された配列である。１つの態様において、本発明によるポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化され、及び／又は１個又は複数の以下の位置（カバットナンバリングによる）：５２、５３で最適化された配列である。
更なる態様において、本発明によるポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、１個又は複数の以下の変異：Ｎ５２Ｓ、Ｓ５３Ｔを含む。
更なる態様において、本発明によるポリペプチド、特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号２１４〜２２１のいずれか１つから選択されるＣＤＲ２を含む。
本発明の代表的なヒト化及び／又は最適化された配列は、上記の表４及び６、及び後述の表７に示される。
表７：配列最適化変異体
表７ａは、配列最適化変異体であるＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＲＤ２を示し、表７ｂは、当該変異体であるＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−ＣＤＲ４を示す。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本願の配列表の配列に言及する。
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本発明の１つの態様において、本発明のポリペプチドは、修飾、例えば、グリコシル残基、修飾アミノ酸側鎖などを更に含有し得る。
ヒトにおいて医薬上使用するため、本発明のポリペプチドは、好ましくは、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対して指定され、一方、獣医学の目的のため、本発明のポリペプチドは、好ましくは、試験されるべき種由来のＣＸ３ＣＲ１に対して指定されることは、当業者に明らかだろう。
ヒトにおいて治療剤として用いられるとき、本発明によるポリペプチドに含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは、ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインであることは、当業者に明らかだろう。
本発明によると、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、すなわち、上述のＶＬ又はＶＨ抗体、及び／又はＶＨＨドメイン、及び／又は任意の他の種類の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、ラクダ化ＶＨであり得る（但し、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインである）。
本発明の１つの態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、本質的には、上述のドメイン抗体配列、又はＶＨＨドメイン配列のいずれかからなる。特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、本質的には、ＶＨＨドメイン配列からなる。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、２個以上の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。更なる態様において、本発明のポリペプチドは、２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨを含む。１つの態様において、本発明のポリペプチド中の２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、同一のアミノ酸配列を有する。別の態様において、本発明のポリペプチド中の２個の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、異なるアミノ酸配列を有する。
本発明の別の実施態様によると、本発明のポリペプチド中に存在する少なくとも２個の免疫グロブリン単一可変ドメインは、互いに、直接（すなわち、リンカーを使用することなく）、又はリンカーを解して結合し得る。リンカーは、好ましくは、リンカーペプチドであり、本発明によると、１個かつ同一のＣＸ３ＣＲ１分子、又は２個の異なる分子内のいずれかで、少なくとも２個の免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＸ３ＣＲ１への結合を可能にするように選択される。
適当なリンカーは、とりわけ、エピトープ、具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインが結合するＣＸ３ＣＲ１上のエピトープ間の距離に依存し、本明細書の開示に基づき、場合により、いくつかの制限された程度の所定の実験後に、当業者に明らかであろう。
又は、２個以上の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、ドメイン抗体又はＶＨＨドメインであるとき、これらはまた、互いに、第３のドメイン抗体又はＶＨＨドメインを介して結合してもよい（ここで、２個以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、直接、第３のドメイン抗体又はＶＨＨドメインに、又は適当なリンカーを介して結合してもよい）。かかる第３のドメイン抗体又はＶＨＨドメインは、例えば、本明細書に更に開示される、増大した半減期のため提供するドメイン抗体又はＶＨＨドメインであってもよい。例えば、後者のドメイン抗体又はＶＨＨドメインは、本明細書で更に記載される、（ヒト）血清タンパク質、例えば、（ヒト）血清アルブミン、又は（ヒト）トランスフェリンに結合する能力があるドメイン抗体又はＶＨＨドメインであってもよい。
或は、２個以上の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、連続して（直接、又は適当なリンカーを介してのいずれか）結合してもよく、第３の（単一）ドメイン抗体又はＶＨＨドメイン（上述の通り、増大した半減期のため提供し得る）は、直接、又はリンカーを介して、これら２個以上の後述の免疫グロブリン配列の１つに結合してもよい。
適当なリンカーは、本発明の特定のポリペプチドと関連して、本明細書で記載され、例えば、非限定的に、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列は、好ましくは、５個以上のアミノ酸長、７個以上のアミノ酸長、９個以上のアミノ酸長、１１個以上のアミノ酸長、１５個以上のアミノ酸長、又は少なくとも１７個のアミノ酸長、例えば、約２０〜４０個のアミノ酸長を有する。しかしながら、上限は、重大ではなく、例えば、かかるポリペプチドの生物医薬製品に関する利便性の理由から選択される。
リンカー配列は、天然に存在する配列、又は天然に存在しない配列であってもよい。治療目的に用いられる場合、リンカーは、好ましくは、本発明のポリペプチドが投与される対象において非免疫原性である。
リンカー配列の１つの有用な群は、国際特許出願公開公報第９６／３４１０３号、及び第９４／０４６７８号に記載される、重鎖抗体のヒンジ領域由来のリンカーである。
他の例は、ポリ−アラニンリンカー配列、例えば、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａである。
リンカー配列の更なる好ましい例は、異なる長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、例えば、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）、ｇｌｙ３、及び（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３を含む（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚリンカーである。
本発明のポリペプチドは、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の結合により修飾され、リンカー配列は、好ましくは、かかる修飾を可能にする、アミノ酸残基、例えば、システイン又はリジン（例えば、ペグ化）をリンカー領域中に含む。
リンカーの例は、以下である：
ＧＧＧＧＳ（５ＧＳリンカー、配列番号２３３）
ＳＧＧＳＧＧＳ（７ＧＳリンカー、配列番号２３４）
ＧＧＧＧＣＧＧＧＳ（８ＧＳリンカー、配列番号２３５）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（９ＧＳリンカー、配列番号２３６）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（１０ＧＳリンカー、配列番号２３７）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（１５ＧＳリンカー、配列番号２３８）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＧＳ（１８ＧＳリンカー、配列番号２３９）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（２０ＧＳリンカー、配列番号２４０）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（２５ＧＳリンカー、配列番号２４１）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（３０ＧＳリンカー、配列番号２４２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（３５ＧＳリンカー、配列番号２４３）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（Ｇ１ヒンジリンカー、配列番号２４４）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（９ＧＳ−Ｇ１ヒンジリンカー、配列番号２４５）
ＥＰＫＴＰＫＰＱＰＡＡＡ（ラマの上流の長いヒンジ領域、配列番号２４６）
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（Ｇ３ヒンジ、配列番号２４７）
ＡＡＡ（Ａｌａリンカー、配列番号２４８）
更に、リンカーはまた、例えば、国際特許出願公開公報第０４／０８１０２６号に示される、ポリ（エチレングリコール）部分であってもよい。
２個以上の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又はからなるポリペプチドの非限定的な例が、表８ａに示される。
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別の実施態様において、本発明のポリペプチド少なくとも２個の免疫グロブリン単一可変ドメインは、互いに、別の部分（例えば、別のポリペプチド（好ましいが、非限定的な実施態様において、既に上述された更なる免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよい））を介して（場合により、１又は２個のリンカーを介して）結合する。かかる部分は、本質的には不活性であってもよく、又は生物学的な効果（例えば、ポリペプチドの所望の特性を改良すること）を有してもよく、又は１個又は複数の更なる所望の特性をポリペプチドに付与してもよい。例えば、限定することなく、当該部分は、タンパク質、又はポリペプチドの半減期を改良してもよく、及び／又はその免疫原性を低減してもよく、又は任意の他の所望の特性を改良してもよい。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、特に、治療剤として用いられるとき、患者の血清又は他の体液における本発明のポリペプチドの半減期を延長する部分を含む。用語「半減期」は、（修飾）ポリペプチドの血清濃度について、インビボで、例えば、ポリペプチドの分解、及び／又はクリアランス、及び／又は天然のメカニズムによる隔離により、５０％低減するのにかかる時間を意味する。
本発明の更なる実施態様によると、２個の免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、国際公開公報第０１／７９２７１号及び国際公開公報第０３／５９９３４号に記載される、血清アルブミン分子に融合してもよい。
或は、かかる半減期延長部分は、当該ポリペプチドに共有結合するか、又は融合することができ、非限定的に、Ｆｃ部分、アルブミン部分、アルブミン部分のフラグメント、アルブミン結合部分、例えば、抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン、トランスフェリン結合部分、例えば、抗トランスフェリン免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリオキシアルキレン分子、例えば、ポリエチレングリコール分子、アルブミン結合ペプチド、又はヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）誘導体であってもよい。
別の態様において、本発明のポリペプチドは、血中で見出される抗原、例えば、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合タンパク質、フィブリノゲン、又はトランスフェリンに結合する部分を含み、これにより、インビボでの増大した半減期を、得られた本発明のポリペプチドに付与する。１つの実施態様によると、かかる部分は、アルブミン結合免疫グロブリン、特に、アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、アルブミン結合ＶＨＨドメイン）である。
別の実施態様において、本発明のポリペプチドは、血清アルブミンに結合する部分を含み、ここで、かかる部分は、例えば、国際特許出願公開公報第２００８／０６８２８０号、及び第２００９／１２７６９１号に記載される、アルブミン結合ペプチドである。
ヒトでの使用が意図されている場合、かかるアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインとも呼ばれる）は、好ましくは、ヒト血清アルブミンに結合し、ヒト化アルブミン結合ＶＨＨドメインである。
ヒト血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、当該技術分野において知られており、例えば、国際公開公報第２００６／１２２７８６号に更に詳細に記載される。特異的に有用なアルブミン結合ＶＨＨドメインは、配列番号２３０〜２３２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるか、又は含有する。
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１つの実施態様によると、本発明のポリペプチドは、１個又は複数のエフェクター機能を本発明のポリペプチドに付与する、及び／又は１個又は複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与し得る１個又は複数の抗体部分、フラグメント、又はドメインに結合してもよい。例えば、この目的のため、これらに限定されることなく、抗体部分は、例えば、重鎖抗体（上述される）由来、より好ましくは、通常のヒト４本鎖抗体由来の抗体のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインであっても、又は含んでもよく；具体的には、本発明のポリペプチドは、例えば、ヒトＩｇＧ由来、ヒトＩｇＥ由来、又は別のヒトＩｇ由来のＦｃ領域に結合してもよい。例えば、国際公開公報第９４／０４６７８号には、ラクダ類ＶＨＨドメイン、又はそのヒト化誘導体を含む重鎖抗体が記載され、ここで、ラクダ類ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは、場合によりヒト化ＶＨＨドメイン及びヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（しかし、ＣＨ１ドメインはない）を含むそれぞれの２重鎖からなる免疫グロブリン（この免疫グロブリンは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインによりもたらされるエフェクター機能を有し、任意の軽鎖が存在することなく、機能することができ、かかる修飾のない対応するＶＨＨドメインと比較して、増大した半減期を有する）をもたらすために、ヒトＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインに置換されている。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、血清アルブミンに結合可能な、２個の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨ及びＶＨＨを含む。１つの態様において、ＶＨＨは、リンカーペプチドを用いて融合される。かかる本発明のポリペプチドの代表例は、以下に示される。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、第１のリンカーペプチドに融合した第１の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨを含み、血清アルブミンに結合する能力があるＶＨＨに融合したものであり、第２のリンカーペプチドに融合したものであり、第２の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨに融合したものである。１つの態様において、第１又は第２のリンカーペプチドは、９ＧＳリンカーであり、１つの態様において、第１及び第２のリンカーペプチドは、９ＧＳリンカーである。１つの態様において、血清アルブミンに結合する能力があるＶＨＨは、ヒト血清アルブミンに結合する能力がある。１つの態様において、血清アルブミンに結合する能力があるＶＨＨは、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列を有する。１つの態様において、第１及び第２の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨは、同一のアミノ酸配列を有する。１つの態様において、第１又は第２の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨは、
− 配列番号２１３、２１４、及び１８６；又は
− 配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
− 配列番号１４１、１６２、及び１８６
に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。
１つの態様において、第１及び第２の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨは、
− 配列番号２１３、２１４、及び１８６；又は
− 配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
− 配列番号１４１、１６２、及び１８６
に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。
１つの態様において、第１又は第２の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨは、配列番号１３８〜１４０、又は配列番号２２２〜２２４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。１つの態様において、第１及び第２の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨは、同一のアミノ酸配列（ここで、当該アミノ酸配列は、配列番号１３８〜１４０、又は配列番号２２２〜２２４のいずれか１つに示される配列である）を有する。
本発明のポリペプチドの非限定的な例は、配列番号２２５〜２２７、２４９、又は２７７〜２８１のいずれか１つのポリペプチドである。
Figure 0006101715
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別の態様において、本発明のポリペプチドは、抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨ、及びＦｃドメインを含む。１つの態様において、本発明のポリペプチドは、リンカーペプチドに融合した抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨを含み、Ｆｃドメインに融合したものである。１つの態様において、リンカーペプチドは、１５ＧＳリンカーである。１つの態様において、Ｆｃドメインは、配列番号２５０、又は２５２に示されるアミノ酸配列を有する。１つの態様において、ＶＨＨは、
− 配列番号２１３、２１４、及び１８６；又は
− 配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
− 配列番号１４１、１６２、及び１８６
に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。
１つの態様において、ＶＨＨは、配列番号１３８〜１４０、又は配列番号２２２〜２２４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。１つの態様において、ポリペプチドは、２量体の形態であり、例えば、ここで、２量体は、１個又は複数のジスルフィド架橋により形成される。
本発明のポリペプチドの非限定的な例は、配列番号２５１、２５３、又は２５４のポリペプチドである。
Figure 0006101715
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本発明のポリペプチドを修飾して、その特性を改良してもよい。１つの態様において、本発明のポリペプチドを修飾して、保存に対するその安定性を増大してもよい。１つの態様において、本発明のポリペプチドを修飾して、特定の宿主系におけるその発現を促進してもよい。例えば、本発明のポリペプチドの第１のコドンが修飾されてもよい。１つの態様において、本発明のポリペプチドは、その第１のアミノ酸としてグルタミン酸（ｇｌｕ）で始まる。別の態様において、本発明のポリペプチドは、その第１のアミノ酸としてアスパラギン酸（ａｓｐ）で始まり、例えば、保存中のＮ末端でのピログルタミン酸形成を低減し、故に、製品の安定性を増大する。別の態様において、本発明のポリペプチドは、第１のアミノ酸としてアラニン（ａｌａ）又はバリン（ｖａｌ）で始まり、例えば、原核生物の発現系（例えば、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）においてポリペプチドの発現を促進する。本発明によるポリペプチドのかかる修飾は、当該技術分野で既知の技術を用いてなされる。
修飾された第１のコドンを有する本発明によるポリペプチドの代表例は、配列番号２５７〜２６２、及び２６３〜２６６のいずれか１つに説明され、以下の表１１及び１２に示される。
Figure 0006101715
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１つの更なる態様において、本発明のポリペプチドは、１個又は複数の以下の特性により特徴付けられる：
・ 高親和性でヒトＣＸ３ＣＲ１に結合する；
・ 可溶性フラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を阻害する；
・ フラクタルカインにより誘導される走化性を阻害する；
・ フラクタルカインにより誘導されるヒトＣＸ３ＣＲ１受容体内部移行を阻害する；
・ 結合及び機能的阻害について、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対するＥ／ＩＣ５０の１０倍以内でカニクイザルＣＸ３ＣＲ１と交差反応する。
従って、１つの態様において、本発明のポリペプチドは、１０nM以下、又は５nM以下、又は２．５nM以下、又は１nM以下のＩＣ５０（競合的ＦＡＣＳにより測定）の、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対する親和性を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、１０nM以下、又は５nM以下、又は２．５nM以下、又は１nM以下のＥＣ５０（細胞結合ＦＡＣＳにより測定）の、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対する親和性を有する。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトＣＸ３ＣＲ１のヒトフラクタルカインへの結合を、５０％以上、又は６０％以上、又は７０％以上、又は８０％以上、又は９０％以上、又は９５％以上（ヒトフラクタルカインとの競合的ＦＡＣＳにより測定）阻害する。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への結合を、３００nM以下、又は１００nM以下、又は２０nM以下、又は１０nM以下、又は５nM以下、又は２．５nM以下、又は１nM以下のＩＣ５０（ヒトフラクタルカインとの競合的ＦＡＣＳにより測定）で阻害する。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトＣＸ３ＣＲ１により仲介される、フラクタルカインにより誘導される走化性を、１０％以上、又は３０％以上、又は４０％以上、又は５０％以上、又は６０％以上、又は７０％以上、又は８０％以上、又は９０％以上で阻害する。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトＣＸ３ＣＲ１により仲介される、フラクタルカインにより誘導される走化性を、５００nM以下、又は１００nM以下、又は７５nM以下、又は５０nM以下、又は１０nM以下、又は５nM以下のＩＣ５０で阻害する。
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、フラクタルカインにより誘導されるヒトＣＸ３ＣＲ１受容体内部移行を、１０nM以下、又は５nM以下、又は１nM以下のＩＣ５０で阻害する。
なお別の実施態様によると、本発明のポリペプチドの半減期延長修飾（かかる修飾はまた、ポリペプチドの免疫原性も低減する）は、適当な薬理学的に許容されるポリマー、例えば、直鎖又は分岐鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、又はその誘導体（例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧ）の結合を含む。一般的に、ペグ化（例えば、抗体及び抗体フラグメント（ドメイン抗体及びｓｃＦｖ'ｓを含むが、これらに限定されない）の技術分野において用いられるペグ化）の任意の適当な形態が用いられ得る；例えば、Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); 国際特許出願公開公報第０４／０６０９６５号；米国特許第６，８７５，８４１号を参照。
ポリペプチドのペグ化用の種々の試薬は、市販もされている（例えば、Nektar Therapeutics, USA又はNOF Corporation, Japan、例えば、Sunbright（登録商標）ＥＡシリーズ、ＳＨシリーズ、ＭＡシリーズ、ＣＡシリーズ、及びＭＥシリーズ、例えば、Sunbright（登録商標）ME-100MA、Sunbright（登録商標）ME-200MA、及びSunbright（登録商標）ME-400MA）。
好ましくは、部位指定ペグ化は、特に、システイン残基を介して用いられる（例えば、Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)を参照）。例えば、この目的のため、ＰＥＧは、本発明のポリペプチド中に天然に生じるシステイン残基に結合してもよく、本発明のポリペプチドを修飾して、１個又は複数のシステイン残基をＰＥＧの結合のため適当に導入してもよく、又はＰＥＧの結合のため１個又は複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列は、Ｎ及び／又はＣ末端に融合してもよく、及び／又はＰＥＧは、本発明のポリペプチドの２個以上の機能ドメインを架橋するリンカー領域に結合してもよい（全て、それ自体当業者に既知のタンパク質操作技術を用いる）。
好ましくは、本発明のポリペプチドについて、ＰＥＧは、５kDaより大きく（例えば、１０kDaより大きく）、２００kDa未満（例えば、１００kDa未満）の分子量；例えば、２０kDa〜８０kDaの範囲で用いられる。
ペグ化に関して、一般的に、本発明はまた、１個又は複数のアミノ酸位置でペグ化されている任意の本発明のポリペプチドを、好ましくは、当該ペグ化が、（１）インビボでの半減期を増大し；（２）免疫原性を低減し；（３）ペグ化についてそれ自体既知の、１個又は複数の更なる有益な特性をもたらし；（４）ポリペプチドのＣＸ３ＣＲ１に対する親和性に本質的には影響せず（例えば、親和性を５０％より高く、より好ましくは１０％以下低減せず（適当なアッセイ（例えば、以下の実施例に記載されるもの）により決定される）；及び／又は（４）本発明のポリペプチドの任意の他の所望の特性に影響しないような方法で、包含することは注意されるべきである。これらを特異的又は非特異的のいずれかで結合する適当なＰＥＧ基及び方法は、当業者に明らかである。
本発明の特に好ましい実施態様によると、本発明のペグ化ポリペプチドは、分子量４０ｋＤａ又は６０ｋＤａを有する直鎖ＰＥＧの１個のＰＥＧ部分を含み、ここで、ＰＥＧ部分は、リンカー領域中のポリペプチド、具体的には、Ｃｙｓ残基（例えば、配列番号２３５に示されるＧＳ８リンカーペプチドの５位）に結合する。
本発明のペグ化ポリペプチドの好ましい例は、好ましくは、上述のＰＥＧ試薬の１つ、例えば、以下の化学式：
Figure 0006101715
に示され、平均分子量４０kDaを有する、「Sunbright（登録商標）ME-400MA」でペグ化される。
治療上の使用
１つの態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
１つの態様において、本発明は、心血管及び脳血管アテローム性障害、末梢動脈障害、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月体形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む脈管炎、関節リウマチ、骨関節炎、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性障害、及び脱髄性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌の処置又は予防のための、本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、アテローム性動脈硬化症の処置又は予防のための、本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、新規のアテローム硬化性病変又はプラークの形成を予防及び／又は低減することにより、及び／又は既存の病変及びプラークの進行を予防するか、又は遅延させることによる、アテローム性動脈硬化症の処置又は予防のための、本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、プラークの組成を変化させて、プラークの破裂、及びアテローム血栓現象のリスクを低減することによる、アテローム性動脈硬化症の処置又は予防のための、本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。
１つの態様において、本発明はまた、疾患又は状態に罹患しているか、又はリスクのある個人における、心血管及び脳血管アテローム性障害、末梢動脈障害、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月体形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む脈管炎、関節リウマチ、骨関節炎、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性障害、及び脱髄性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌の処置方法、又はそのリスクの低減方法であって、個人に、治療上有効量の本発明によるポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
１つの態様において、本発明はまた、疾患又は状態に罹患しているか、又はリスクのある個人におけるアテローム性動脈硬化症の処置方法、又はリスクの低減方法であって、個人に、治療上有効量の本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物を含む方法を提供する。
１つの態様において、本発明はまた、疾患又は状態に罹患している個人又はリスクのある個人において、新規のアテローム硬化性病変又はプラークの形成を予防及び／又は低減することによる、及び／又は既存の病変及びプラークの進行を予防するか、又は遅延させることによる、アテローム性動脈硬化症の処置方法、又はリスクの低減方法であって、個人に、治療上有効量の本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
１つの態様において、本発明はまた、疾患又は状態に罹患しているか、又はリスクのある個人において、プラークの組成を変化させて、プラーク破裂及びアテローム血栓性現象のリスクを低減することにより、アテローム性動脈硬化症の処置方法、又はリスクの低減方法であって、個人に、治療上有効量の本発明のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、ＣＸ３ＣＲ１と関連する疾患又は障害の処置又は予防における使用のため示される。
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、疾患又は状態の処置又は予防における使用（ここで、ＣＸ３ＣＲ１受容体での活性の調整が所望される）のため示される。１つの態様において、本発明はまた、疾患又は状態を処置する方法、又はリスクを低減する方法（ここで、ＣＸ３ＣＲ１受容体のアンタごニズムが有益である）であって、疾患又は状態に罹患するか、又はリスクのある個人に、本発明のポリペプチドを投与することを含む方法も提供する。
予防は、問題の疾患又は状態の従前の発作に罹患した個人、そうでなければ増大したリスクがあるとみなされる個人の処置に特に関することが予測される。特定の疾患又は状態を発症するリスクのある個人は、一般的に、疾患又は状態の家族歴を有するもの、又は疾患又は状態を発症することが特に疑われる、遺伝子検査又はスクリーンングにより同定されるものを含む。
本発明の構成において、用語「予防すること、処置すること、及び／又は緩和すること」は、疾患を予防すること、及び／又は処置すること、及び／又は緩和することを含むだけでなく、一般的には、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅延させるか、又は逆にすること、疾患と関連する１個又は複数の症状の発症を予防するか、又は遅延させること、疾患と関連する１個又は複数の症状を低減すること、及び／又は緩和すること、疾患及び／又はこれに関連する任意の症状の重症度及び／又は持続を低減すること、及び／又は疾患及び／又はこれと関連する任意の症状の重症度の更なる増大を予防すること、疾患により引き起こされる任意の生理的損傷、及び一般的には、処置される患者に有益な任意の薬理学的作用を予防するか、低減するか、又は逆にすることを含む。
処置されるべき対象は、哺乳類であり、特に、ヒトである。当業者に明らかなように、処置されるべき対象は、特に、本明細書に記載される疾患、障害、又は状態に罹患するか、又はリスクのある個人である。
上記の疾患の処置方法は、当該疾患の処置用医薬の調製を含むことも、当業者に明らかだろう。更に、本発明のポリペプチドは、上記疾患の処置を意図する医薬又は医薬組成物中の有効成分として用いられ得ることは明らかである。従って、本発明はまた、上述の任意の疾患、障害、又は状態の予防、処置、及び／又は緩和用医薬組成物の調製における本発明のポリペプチドの使用に関する。本発明は、更に、治療又は予防上の使用のため、具体的には、上述の任意の疾患、障害、又は状態の予防、処置、及び／又は緩和のための本発明のポリペプチドに関する。本発明は、更に、少なくとも１個の本発明のポリペプチドを含む、上述の疾患、障害、又は状態の予防、処置、及び／又は緩和用医薬組成物に関する。
本発明のポリペプチド、及び／又はそれを含む組成物は、用いられるべき特定の医薬製剤又は組成物に依存して、必要とする患者に、任意の適当な方法で投与され得る。従って、本発明のポリペプチド及び／又はそれを含む組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、舌下（例えば、舌下に置かれ、粘膜を介して舌下の毛細血管網に吸収される舌下錠剤、スプレー、又はドロップの形態で）、経鼻（例えば、鼻用スプレーの形態で、及び／又はエアロゾルとして）、局所、座剤、吸入、硝子体内（特に、乾燥ＡＭＤ又は緑内障の処置のため）により、又は任意の多の方法で、有効量又は用量で投与され得る。
本発明のポリペプチド、及び／又はそれを含む組成物は、予防、処置、又は緩和されるべき疾患、障害、又は状態の予防、処置、及び／又は緩和に適当な処置の投薬計画に従い、投与される。臨床医は、一般的に、要因、例えば、予防、処置、又は緩和されるべき疾患、障害、又は状態、疾患の重症度、その症状の重症度、用いられるべき特定の本発明のポリペプチド、用いられるべき特定の投与経路、医薬製剤、及び組成物、年齢、性別、体重、食事、患者の一般的な状態、及び臨床医に周知の同様の要因に依存して、適当な処置の投薬計画を決定することができる。一般的に、処置の投薬計画は、治療上及び／又は予防上有効量又は用量での、１個又は複数の本発明のポリペプチド、又は１個又は複数のそれを含む組成物の投与を含む。
一般的に、本明細書で記載される疾患、障害、及び状態の予防、処置、及び／又は緩和のため、処置されるべき特定の疾患、障害、又は状態、用いられるべき特定の本発明のポリペプチドの有効性、特定の投与経路、及び用いられる特定の医薬製剤又は組成物に依存して、本発明のポリペプチドは、一般的には、体重１キログラム当たり０．００５〜２０．０mgの量、及び好ましくは、０．０５〜１０．０mg/kg/用量、より好ましくは、０．５〜１０mg/kg/用量の用量で、継続的に（例えば、点滴により）、又は１回用量（例えば、毎日、毎週、又は毎月用量；以下を参照）として投与されるが、特に、上述のパラメーターに依存して、有意に変動し得る。
予防上適用するため、本発明のポリペプチドを含有する組成物はまた、同様の投薬量又はわずかに少ない投薬量で投与され得る。投薬量はまた、任意の合併症の事象において個々の医師により調節され得る。
特定の本発明のポリペプチド、及びその特定の薬物動態及び他の特性に依存して、毎日、それは、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、又は６日毎、毎週、毎月などで投与され得る。投与の投薬計画は、長期の毎週の処置を含み得る。「長期」は、少なくとも２週間、好ましくは、数ヶ月又は数年の持続を意味する。
本発明のポリペプチド、及びそれを含む組成物の有効性は、関与する特定の疾患に依存して、任意の適当なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ、及び／又はそれ自体既知の動物モデル、又はその任意の組み合わせを用いて試験され得る。適当なアッセイ及び動物モデルは、当業者に明らかであり、例えば、以下の実施例で用いられるアッセイ及び動物モデルを含む。
医薬上の使用のため、本発明のポリペプチドは、（ｉ）少なくとも１個の本発明のポリペプチド、及び（ｉｉ）少なくとも１個の医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤、及び（ｉｉｉ）場合により、１個又は複数の更なる医薬的に有効なポリペプチド、及び／又は化合物を含む医薬製剤として製剤され得る。「医薬的に許容される」は、個々に投与されたとき、任意の生物学的効果、又はそうでなければ不所望の効果を示さず、含有される医薬組成物の任意の他の成分（例えば、医薬的に有効な成分）と有害な方法で作用しないことを意味する。具体例は、標準的な参考書、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)に見出され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、通常の抗体及び抗体フラグメント、及び他の医薬的に有効なタンパク質についてそれ自体既知の任意の方法で製剤され、投与され得る。従って、更なる実施態様によると、本発明は、少なくとも１個の本発明のポリペプチド、及び少なくとも１個の医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤、及び場合により、１個又は複数の更なる医薬的に有効な物質を含有する医薬組成物又は製剤に関する。
非限定的な例により、かかる製剤は、経口投与、非経腸投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、陰茎海綿体内、又は腹腔内注射、又は静脈内注射による）、局所投与、舌下投与、吸入、皮膚パッチ、インプラント、座剤による投与に適当な形態、経皮、経鼻、硝子体内、直腸又は膣内投与などに適した形態であってもよい。かかる適当な投与形態は、投与方法に依存して、固形、半固形、又は液体であってもよく、並びにその製剤において使用するための方法及び担体は、当業者に明らかであろう。
非経腸投与用医薬製剤（例えば、静脈内、筋肉内、皮下注射、又は静脈内注射）は、例えば、有効成分を含み、場合により、注入又は注射のため、更なる溶解又は希釈工程後に適当である、無菌の溶液、懸濁液、分散液、乳液、又は粉末であってもよい。かかる製剤に適当な担体又は希釈剤は、例えば、無菌水、及び医薬的に許容される水性バッファー及び溶液、例えば、生理リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液；水油；グリセロール；エタノール；グリコール、例えば、プロピレングリコール、並びに鉱油、動物油、及び植物油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、並びにその適当な混合物を含むが、これらに限定されない。
有効な化合物又はその塩の溶液はまた、微生物の成長を防ぐための保存剤、例えば、抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（チオメルサール）などを含有してもよい。多くの場合、等調剤、例えば、糖、バッファー、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散液の場合、必要な粒子サイズの維持により、又は界面活性剤の使用により維持され得る。吸収を遅延させる他の剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンが加えられてもよい。
全ての場合で、最終的投薬形態は、製造及び保存条件下で安定な無菌の液体でなければならない。無菌の注射可能な溶液は、必要な量の有効化合物を適当な溶媒中に、上で列挙された種々の他の成分と取り込むことにより、調製され、必要なら、続いて濾過滅菌される。無菌の注射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥、及び凍結乾燥技術であり、これにより、既に濾過殺菌された溶液中に存在する有効成分及び任意の更なる所望の成分の粉末を得る。
通常、水溶液又は水性懸濁液が好ましい。一般的に、治療用タンパク質、例えば、本発明のポリペプチドに適当な製剤は、緩衝タンパク質溶液、例えば、適当な濃度（例えば、０．００１〜４００mg/ml、好ましくは、０．００５〜２００mg/ml、より好ましくは、０．０１〜２００mg/ml、より好ましくは、１．０〜１００mg/ml、例えば、１．０mg/ml（静脈投与）、又は１００mg/ml（皮下投与）のタンパク質、及び水性バッファー、例えば：
− リン酸緩衝食塩水、pH７．４、
− 他のリン酸緩衝液、pH６．２〜８．２、
− ヒスチジン緩衝液、pH５．５〜７．０、
− コハク酸塩緩衝液、pH３．２〜６．６、及び
− クエン酸緩衝液、pH２．１〜６．２、
及び、場合により、溶液の等張性をもたらすため、塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び／又は糖又は多価アルコール（例えば、トレハロース、マンニトール、又はグリセロール）を含む溶液である。
好ましい緩衝タンパク質溶液は、２２０mMトレハロースを加えることにより等張に調整した２５mMリン酸緩衝液、pH６．５に溶解された約０．０５mg/ml本発明のポリペプチドを含む溶液である。加えて、他の剤、例えば、界面活性剤（例えば、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０又はＴｗｅｅｎ−８０）が、かかる溶液に含まれてもよい。皮下適用用製剤は、有意に高い濃度の本発明のポリペプチド（例えば、最大１００mg/ml、又は１００mg/mlより高い）を含んでもよい。しかしながら、上で与えられる成分及びその量は、１つの好ましいオプションを表すだけであることは、当業者に明らかだろう。その代替及びバリエーションは、直ぐに、当業者に明らかだろうし、又は上の開示から出発して容易になされ得る。
本発明のポリペプチドは、適当なデポー剤、遅延性又は持続性放出製剤（例えば、注射に安定）を用いて、皮膚下への移植用制御放出装置を用いて、及び／又は医薬的に有効な物質又は成分の投与についてそれ自体既知の投与ポンプ又は他の装置を用いて、投与されてもよい。加えて、本発明のポリペプチドは、皮膚に置かれた場合、皮膚を通過する、ゲル、クリーム、スプレー、ドロップ、パッチ、又はフィルムの形態で製剤されてもよい。
又は、通常の抗体又は抗体フラグメントと比較して、本発明のポリペプチドの使用の１つの主要な利点は、それらが、非経腸投与以外の経路を介して容易に投与され、かかる投与のために容易に製剤化され得ることである。例えば、国際特許出願公開公報第２００４／０４１８６７号に記載される通り、かかるポリペプチドは、経口、鼻腔内、肺内、及び経皮投与用に製剤されてもよい。
本発明の別の実施態様によると、本明細書で開示される少なくとも１個の本発明のポリペプチド、及びスタチン、抗血小板物質、抗凝固剤、抗糖尿病薬、及び降圧剤からなる群より選択される少なくとも１個の他の治療剤を含む医薬的併用が提供される。
かかる医薬的併用は、場合により、更に、希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含んでもよい。
２種以上の物質又は成分が、併用される処置投薬計画の一部として用いられるべきとき、それらは、同一の投与経路、又は異なる投与経路を介して、本質的に同時又は異なる時間（例えば、本質的には同時、連続、又は代替投薬計画に従い）で投与され得る。物質又は成分が、同時に、同一の投与経路を介して投与されるべきとき、それらは、異なる医薬製剤、又は組成物、又は併用される医薬製剤又は組成物の一部として投与されてもよい。又は、２種以上の有効な物質又は成分が、併用される処置投薬計画の一部として用いられるべきとき、各物質又は成分は、化合物又は成分が単独で用いられるときに用いられるのと同量かつ同一の投薬計画に従い、投与されてもよく、かかる併用使用は、相乗効果を導いても、導かなくてもよい。しかしながら、２種以上の有効な物質又は成分の併用使用が、相乗効果を導くとき、１個、複数、又は全ての投与されるべき物質又は成分の量を低減する一方、所望の治療作用を依然達成することも可能である。これは、それらが、通常の量で用いられたとき、１個又は複数の物質又は成分の使用と関連する、任意の不所望の副作用を回避するか、制限するか、又は低減するのに有用であり得る一方、所望の医薬効果又は治療効果を依然得る。
なお、本発明の更なる実施態様は、上述の疾患及び障害の処置方法であって、個人に、同時に、別々に、又は連続して、有効量の少なくとも１個の本発明のポリペプチド、及びスタチン、抗血小板物質、抗凝固剤、抗糖尿病薬、及び降圧剤からなる群より選択される少なくとも１個の剤を投与することを含む、方法である。
本発明の更なる態様によると、本発明のポリペプチドは、上述の疾患及び障害の処置のために用いられる他の薬物と併用して投与するために調製され、かかる他の薬物は、スタチン、抗血小板物質、抗凝固剤、抗糖尿病薬、及び降圧剤からなる群より選択される。
本発明の別の態様によると、上述の疾患及び障害の処置のために用いられる薬物（かかる薬物は、スタチン、抗血小板物質、抗凝固剤、抗糖尿病薬、及び降圧剤からなる群より選択される）は、本発明のポリペプチドと併用して投与するように調製される。
本発明の更なる態様によると、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの投与に有用なデバイス、例えば、シリンジ、注射ペン、又は他のデバイスと組み合わせて用いられる。
本発明のなお別の実施態様によると、ＣＸ３ＣＲ１機能障害により仲介される疾患、障害、又は状態の診断方法であって、工程：
ａ）対象から試料を得て、次に、
ｂ）インビトロで、試料を上で定義される本発明のポリペプチドと接触させ、次に、
ｃ）当該ポリペプチドの当該試料への結合を検出し、次に、
ｄ）工程（ｃ）において検出された結合を、標準と比較し、ここで、当該試料と比較した結合における相違は、ＣＸ３ＣＲ１機能障害により特徴付けられる疾患、障害、又は状態の診断である、を含む方法が提供される。
本発明の別の実施態様によると、ＣＸ３ＣＲ１機能障害により仲介される疾患、障害、又は状態の診断方法であって、工程：
ａ）対象から試料を得て、次に、
ｂ）試料を上で定義される本発明のポリペプチドと接触させ、次に、
ｃ）試料中のＣＸ３ＣＲ１の量を決定し、次に、
ｄ）工程（ｃ）において決定された量を、標準と比較し、ここで、当該試料と比較した量における相違は、ＣＸ３ＣＲ１機能障害により特徴付けられる疾患、障害、又は状態の診断である、を含む方法が提供される。
上記の診断方法はまた、対象の治療的処置の有効性のモニタリングのために用いられ得る。
本発明の別の実施態様によると、上で定義される方法で使用するための、ＣＸ３ＣＲ１機能障害により仲介される疾患、障害、又は状態を診断するためのキットであって、少なくとも１個の本発明のポリペプチド、及び場合により、１個又は複数の媒体、検出手段、及び／又はインビトロ又はインビボ画像化剤、及び更に、場合により、使用の指示書を含むキットが提供される。適当なインビボ画像化剤は、９９ｍＴｃ、１１１インジウム、１２３ヨウ素、及び磁気共鳴画像診断用の常磁性化合物を含む。
本発明は、更に、少なくとも１個の本発明のポリペプチド、及び更に、上述の疾患及び障害の処置のために使用される他の薬物、上述のデバイスからなる群より選択される１個又は複数の他の成分を含むキットを提供する。
本発明は更に、本発明のポリペプチドの製造方法を提供し、かかる方法は、一般的に、工程：
− 本発明のポリペプチドをコードする能力がある核酸（本明細書で以下：「本発明の核酸」）を含む宿主細胞を、本発明のポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し；次に、
− 宿主細胞により発現されたポリペプチドを培地から回収し；次に
− 場合により更に、本発明のポリペプチドを精製するか、及び／又は修飾するか、及び／又は製剤化する、を含む。
本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ（例えば、意図される宿主細胞又は宿主生物での発現に特異的に適合したコドン使用頻度を有するＤＮＡ）であり得る。本発明の１つの実施態様によると、本発明の核酸は、上で定義される通り、本質的に単離された形態である。
本発明の核酸はまた、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、又はＹＡＣ）の形態であるか、そこに存在するか、及び／又はその一部であってもよく、そしてそれは、再度、本質的に単離されてもよい。ベクターは、本質的には、発現ベクター、すなわち、インビトロ及び／又はインビボ（例えば、適当な宿主細胞、宿主生物、及び／又は発現系において）でのポリペプチドの発現をもたらし得るベクターであってもよい。かかる発現ベクターは、一般的には、１個又は複数の適当な制御エレメント（複数を含む）、例えば、プロモーター（複数を含む）、エンハンサー（複数を含む）、ターミネーター（複数を含む）などに作動可能に結合した、少なくとも１個の本発明の核酸を含む。本発明のポリペプチドの発現に有用又は必要な、かかる制御エレメント及び他のエレメント、例えば、統合因子（複数を含む）、選択マーカー（複数を含む）、シグナル又はリーダー配列（複数を含む）、受容体遺伝子（複数を含む）などの具体例は、例えば、国際特許出願公開公報第２００６／０４０１５３号の第１３１〜１３３頁に開示される。
本発明の核酸は、本明細書に示される本発明のポリペプチドについてのアミノ酸配列の情報に基づき、それ自体既知の方法（例えば、自動ＤＮＡ合成、及び／又は組み換えＤＮＡ技術）で調製するか、又は得られることができ、及び／又は適当な天然の供給源から単離され得る。
別の実施態様によると、本発明は、本発明のポリペプチドを発現するか、又は発現する能力がある；及び／又は本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主又は宿主細胞に関する。特に好ましい実施態様によると、当該宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、又は哺乳類細胞である。
適当な細菌細胞は、グラム陰性細菌株、例えば、エシェリキア・コリ、プロテウス（Proteus）、及びシュードモナス（Pseudomonas）の株、及びグラム陽性細菌株、例えば、Bacillus（バチルス）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、及びラクトコッカス（Lactococcus）の株を含む。適当な真菌細胞は、トリコダーム（Trichoderma）、ニューロスポラ（Neurospora）、及びアスペルギルス（Aspergillus）種由来の細胞を含む。適当な酵母細胞は、サッカロマイセス（Saccharomyces）(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）)、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）(例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）)、ピキア（Pichia）(例えば、ピキア・パトリス（Pichia pastoris）、及びピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、及びハンゼヌラ（Hansenula）種由来の細胞を含む。
適当な哺乳類細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ細胞などが挙げられる。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び異種性タンパク質の発現のために当該技術分野で用いられる任意の他の細胞は、同様に用いられ得る。
産業的スケールでの産生のため、免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチド及びそれを含有するタンパク質治療剤の（産業的）産生に好ましい異種性宿主は、大量発現、産生、及び発酵、特に、大量（生物）医薬的発現、産生、及び発酵に適当なエシェリキア・コリ、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）株を含む。
特定の発現系の選択は、部分的に、ある種の翻訳後修飾、より具体的には、グリコシル化の要求に依存する。グリコシル化が所望されるか、又は必要とされる、本発明のポリペプチドの産生は、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳類発現宿主の使用を必要とする。本態様において、得られたグリコシル化パターン（すなわち、結合した残基の種類、数、及び位置）は、発現のため用いられる細胞又は細胞株に依存することは、当業者に明らかだろう。
上述の細胞で産生される本発明のポリペプチドは、細胞内（例えば、細胞質中、ペリプラズム中、又は封入体中）に産生され、宿主細胞から単離され、場合により、更に精製され得る；又はそれらは、細胞外に産生され（宿主細胞が培養される培地中へ分泌される）、次に、培養培地から単離され、場合により、更に精製され得る。
ポリペプチドの組み換え産生のため用いられる更なる方法及び試薬、例えば、適当な発現ベクター、トランスフォーメション又は遺伝子導入方法、選択マーカー、タンパク質発現の導入方法、培養条件などは、当該技術分野で知られている。同様に、本発明のポリペプチドの製造方法において有用なタンパク質の単離及び精製技術は、当業者に周知である。
通常の組み換え宿主生物、例えば、エシェリキア・コリ、及び酵母における発酵を通じた、本発明のポリペプチドの産生は、高価な哺乳類細胞培養施設も必要とする通常の抗体と比較して、コスト的に有効である。更に、達成可能な発現レベルは高く、本発明のポリペプチドの収量は、１〜１０g/lの範囲（エシェリキア・コリ）、及び最大１０g/l（酵母）である。
実施例
ヒトＣＸ３ＣＲ１又はカニクイザルＣＸ３ＣＲ１を過剰発現するＣＨＯ、Ｂａｆ／３、Ｃａｋｉ、及びＨＥＫ２９３細胞株の作成
ヒト又はカニクイザルＣＸ３ＣＲ１を過剰発現するＣＨＯ及びＢａｆ／３細胞を、当該技術分野で知られた技術を用いて、作成した。ヒトＣＣＲ２又はＣＣＲ５を発現する細胞も、当該技術分野で知られた技術を用いて、作成した。
ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ｎｅｏにヒトＣＸ３ＣＲ１のためクローン化し、一方、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ｎｅｏをマウスＣＸ３ＣＲ１のため用いた。
ヒトＣＸ３ＣＲ１及びカニクイザルＣＸ３ＣＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２５５及び２５６に示される。
ヒトＣＸ３ＣＲ１又はマウスＣＸ３ＣＲ１を過剰発現するラクダ腎臓（Ｃａｋｉ）細胞を確立するために、親Ｃａｋｉ細胞を、それぞれ、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ｎｅｏ−ｈＣＸ３ＣＲ１、又はｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ｎｅｏ−ｍＣＸ３ＣＲ１で電気穿孔した。全条件について、トランスフェクタントを、ジェネテシン（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）により選択した。
ヒトＣＸ３ＣＲ１又はカニクイザルＣＸ３ＣＲ１を過剰発現するヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を、ＨＥＫ２９３親細胞株において、それぞれ、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ｎｅｏ−ｈＣＸ３ＣＲ１、又はｃｙＣＸ３ＣＲ１プラスミドのFugene（Roche）で脂質仲介による遺伝子導入により作成した。これらの細胞を、一過性トランスフェクタントとして用いて、それ自体を選択下に置かなかった。簡単に言うと、２＊１０Ｅ６細胞を、Ｔ７５毎に播種し、一晩インキュベーション後、遺伝子導入した。培地を取り除いた後、細胞を、それぞれのプラスミド（９μg）、及びFugene（２７μl）で、製造元の指示に従い、形質導入した。遺伝子導入の４８時間後、細胞を回収し、更なる使用のために凍結した。
実施例１：ＣＸ３ＣＲ１での免疫は、ラマにおいて体液性免疫応答を誘導する
１．１．免疫
倫理委員会（University Antwerp, Belgium、ＵＡ２００８Ａ１、２００８／０９６、２００７／０６８）の承認後、９匹のラマ（３６８、３６９、３７０、３８１、３８２、３８４、３１２、３１３、及び３１４番と命名）を免疫した。
６匹のラマ（３１２、３１３、３１４、３８１、３８２、及び３８４）を、ｐＶＡＸ１−ｈｕＣＸ３ＣＲ１プラスミドベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）の４度の筋内注射（２mg／用量、毎週、又は隔週の間隔で）で免疫した。その後、３匹のラマ（３８１、３８２、及び３８４）を、上述の通りに確立したヒトＣＸ３ＣＲ１過剰発現Ｃａｋｉ細胞の皮下注射を４度投与した。細胞をＤ−ＰＢＳに再懸濁し、注射まで氷上で維持した。
３匹の更なるラマ（３６８、３６９、及び３７０と命名）を、標準的プロトコールに従い、上述の通り確立したヒトＣＸ３ＣＲ１過剰発現Ｃａｋｉ細胞の４度の皮下注射で免疫した。細胞をＤ−ＰＢＳに再懸濁し、注射まで氷上で維持した。その後、３匹のラマに、ＢＳＡに結合した組み換えＣＸ３ＣＲ１ＮＴ／ＥＣ３フラグメントを含む注射を２度投与した（表１３）。ペプチドを、ＮｅｏＭＰＳ（Polypeptidegroup, Strasbourg, France）でオーダーし、標準的プロトコールに従い、ＢＳＡに結合した。
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第１の注射をフロイント完全アジュバント（Difco, Detroit, MI, USA）において製剤化し、一方、その後の注射を、不完全フロイントアジュバント（Difco, Detroit, MI, USA）において製剤化した。
１．２．ラマにおける誘導された免疫応答の評価
ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対する動物における免疫応答の誘導を評価するために、血清を、３１２、３１３、及び３１４番のラマから、０日目（免疫前）、及び免疫スケジュール中の異なる時間点（末梢血リンパ球［ＰＢＬ］回収時間）で回収した。
簡単に言うと、ニュートラアビジン（２μg/ml）を、一晩、４℃で、９６ウェルMaxisorbプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）に固定化した。ウェルを、ＰＢＳ中のカゼイン溶液（１％）でブロッキングした。続いて、ＣＸ３ＣＲ１のビオチン化組み換えＮＴフラグメント（ポリペプチド、Strasbourg, France）、又はビオチン化ＥＣ３フラグメント（ポリペプチド、Strasbourg, France）を、２μg/mlで捕獲した。血清希釈液を添加後、特異的に結合した免疫グロブリンを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ラマ免疫グロブリン（Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA）、及び基質ＴＭＢ Ｏｎｅ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン）（Promega, Mannheim, Germany）の存在下での続く酵素反応を用いて検出し、ＣＸ３ＣＲ１に対して有意な抗体依存性免疫応答が、ペプチド免疫の後に誘導されることを示した。
加えて、細胞で免疫した動物の血清力価を、活発に増殖しているヒトＣＸ３ＣＲ１過剰発現ＣＨＯ細胞でのＦＡＣＳ分析により確認した。３６８、３６９、及び３７０番のラマについてのＣＸ３ＣＲ１血清力価応答を、４度の細胞免疫（４９日目）、４度の細胞免疫、及び１度のペプチドブースト（７７日目）、及び４度の細胞免疫、及び２度のペプチドブースト（８１日目）後に採取した血清で決定した。細胞を回収し、洗浄した後、血清希釈液とインキュベーションした。検出を、ヤギ抗ラマＩｇＧ（Bethyl, Montgomery, TX, USA）、続いて、ＰＥと結合したロバ抗ヤギ（Jackson Laboratories, Suffolk, UK）を用いて行い、ＦＡＣＳアレイ（BD Biosciences）上での分析により読み取った。ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳのいずれかにより決定した得られた血清応答の要約を、表１４及び表１５に示す。
Figure 0006101715
Figure 0006101715
ＤＮＡのみで免疫したラマ（３１２、３１３、及び３１４）については、血清力価を検出しなかった。
実施例２：重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニング、及びファージの調製
各サブセットの最終免疫原の注射後、重鎖抗体を生じるＢ細胞の供給源としての免疫組織を、免疫したラマから回収した。３１２、３１３、及び３１４番のラマについて、最終抗原注射の４及び８日後に回収した、２種の血液試料１５０mlを、動物毎に採取した。３６８、３６９、及び３７０番のラマについて、最終細胞免疫の５日及び７日後、更に、最終ペプチド免疫の４日及び８日後、４種の血液試料１５０mlを採取した。次に、最終細胞免疫の１２日後、及び最終ペプチド免疫の１２日後に、２回のリンパ節生検を行った。３８１、３８２、及び３８４番のラマについて、最終ＤＮＡ免疫の８日後、更に、１度目の細胞ブーストの４日後、２度目の細胞ブーストの８及び１１日後、及び最終細胞免疫の８日後に、５種の血液試料１５０mlを採取した。次に、２度目の細胞免疫の８日後に、リンパ節生検を行った。
血液試料から、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、Ficoll-Hypaqueを用いて、製造元（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）の指示に従い、調製した。ＰＢＬ及びリンパ節生検（ＬＮ）、総ＲＮＡを抽出し、これを、ＤＮＡセグメントをコードするＶＨＨを増幅するためのＲＴ−ＰＣＲの出発材料として用いた。
それぞれの免疫したラマについて、ライブラリーを、免疫スケジュールのあるサブセット（すなわち、１種の免疫抗原後）に由来する試料から単離した総ＲＮＡを貯蔵することにより、構築し、異なる動物由来のいくつかのラマ試料を、１つのライブラリーに貯蔵した（表１６）。
Figure 0006101715
要するに、ＰＣＲにより増幅したＶＨＨレパートリーを、特異的な制限部位を介して、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレーを促進するように設計したベクターにクローニングした。ベクターは、ｐＵＣ１１９に由来し、ＬａｃＺプロモーター、Ｍ１３ファージｇＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子、多重クローニング部位、及びハイブリッドｇＩＩＩ−ｐｅｌＢリーダー配列（ｐＡＸ０５０）を含有する。ＶＨＨコード配列を有するフレームにおいて、ベクターは、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグ、及びＨｉｓ６タグをコードする。ファージを、標準的プロトコールに従い調製し、フィルター殺菌後、更なる使用のため４℃又は−８０℃で、２０％グリセロール中に保存した。
実施例３：ファージディスプレーを介したＣＸ３ＣＲ１特異的ＶＨＨの選択
全てのラマから得て、ファージライブラリーとしてクローニングしたＶＨＨレパートリーを、多数の選択条件を適用した、異なる選択ストラテジーにおいて用いた。可変のものは、ｉ）ＣＸ３ＣＲ１タンパク質の提示形態（異なる細胞骨格、又はリポソーム／ＶＬＰ上）、ｉｉ）抗原提示方法（細胞を用いたときは、溶液中に、又はＶＬＰを用いたときは、プレート上にコートされる）、ｉｉｉ）抗原濃度、ｉｖ）用いたオルソログ（ヒト又はカニクイザル）、ｖ）選択ラウンドの数、及びｖｉ）異なる溶出方法（トリプシンを介した非特異的、又はリガンドであるフラクタルカインを介した特異的）を含む。全ての固体コートファージ選択を、Maxisorp９６ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）にて行った。
選択を以下の通り行った：固体及び溶液相選択フォーマットのためのＣＸ３ＣＲ１抗原調製物を、上述の通り、複数の濃度で提示した。ファージライブラリーと２時間インキュベーション後、広範囲に渡り洗浄し、結合したファージをトリプシン（１mg/mL）で１５分間溶出した。トリプシンをファージ溶出のため用いたとき、タンパク質分解酵素活性を、０．８mMタンパク質分解酵素阻害剤ＡＢＳＦを適用することにより、直ちに中和した。対照として、並行して、抗原を用いない選択を行った。
ファージアウトプットを用いて、エシェリキア・コリを感染させ、順に、次の選択ラウンドのためファージを調製した（ファージレスキュー）。第２ラウンドの選択後、ファージアウトプットを用いて、エシェリキア・コリを感染さえ、個々のＶＨＨクローンの分析のため、寒天プレート（ＬＢ＋ｃａｒｂ＋グルコース２％）上に播種した。特異的な結合物についての選択アウトプットをスクリーンングするために、単一クローンを、寒天プレートからピックアップし、１mLの９６（深）ウェルプレートにて成長させた。ＬａｃＺにより制御されたＶＨＨ発現を、ＩＰＴＧ（１mM（最終））を、グルコースの不存下で加えることにより、導入した。ペリプラズム抽出物（〜８０μLの容量）を、標準的プロトコールに従い調製した。
実施例４：ＣＸ３ＣＲ１−フラクタルカイン競合的ＦＡＣＳアッセイにおけるペリプラズム抽出物のスクリーンング
ペリプラズム抽出物を、ヒトＣＸ３ＣＲ１／ヒトフラクタルカインＦＡＣＳ競合アッセイにおいてスクリーニングして、発現したＶＨＨの阻害能を評価した。ヒトＣＸ３ＣＲ１を、ＣＸ３ＣＲ１を過剰発現するＣＨＯ細胞上に提示させた。活発に成長した培地から回収した細胞を用いた設定、及び凍結細胞を用いた設定の両方を用いた。検出試薬として、標識程度１でalexa647で標識した、標識フラクタルカイン（Ａ６４７−フラクタルカイン）を用いた（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）。アッセイを設定するために、標識フラクタルカインの１度目の力価測定を、結合についてのＥＣ５０値を決定するために、ＣＨＯ−ｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞上にて行った。まず、スクリーニングを、より高濃度のフラクタルカイン（３nM）で行い、アッセイロバスト性を増大させた。スクリーニングの感度を最大まで増大させるために、ＥＣ３０濃度（１nM）を、続くスクリーニングに選択した。簡単に言うと、ペリプラズム抽出物５０μlを、６nM標識フラクタルカイン（５０μl）及び２０００００個のＣＨＯ−ｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞に加えた。４℃で１時間インキュベーション後、細胞を３回洗浄し、その後、読み取りを、ＦＡＣＳアレイ（Becton Dickinson）にて行った。まず、ゲートを、散乱特性から決定した、無傷の細胞上に設定した。次に、死細胞を、ＰＩ染色（Sigma, St Louis, US）由来の蛍光特性により、ゲートから外した。alexa647標識由来の蛍光特性を、各試料について決定し、阻害能の計算のため用いた。対照として、ペリプラズム抽出物中に存在するＶＨＨがないか、又は既知の無関係のＶＨＨによって、条件を取得し、過剰の冷フラクタルカインを含む試料を含んでいた。各試料について、阻害の割合を、アッセイウィンドウを決定するための対照試料を用いて、決定した。
このスクリーニングから、ＶＨＨを選択し、配列分析により、３種の異なるＢ細胞系統に属する１２０個の固有のＶＨＨが明らかになった。各Ｂ細胞系統について見出された変異体の総数を、表１７に表す。
Figure 0006101715
選択法、及び最初のスクリーニング中の性能の概要を、全てのＶＨＨについて、表１８に示す。
Figure 0006101715
Figure 0006101715

Figure 0006101715

Figure 0006101715
全ての得られた固有のＶＨＨのアミノ酸配列を、配列表及び上に示す（ＣＤＲ及びフレームワーク領域を示した）。
実施例５：精製したＶＨＨの特徴決定
実施例４に記載のスクリーニングから選択した阻害性抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨを、更に精製し、特徴付けた。選択したＶＨＨを、エシェリキア・コリＴＧ１において、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６タグタンパク質として発現させた。１mM ＩＰＴＧの添加により、発現を誘導し、そのまま３７℃で４時間継続した。細胞培養物を遠心後、ペレットを凍結解凍することにより、ペリプラズム抽出物を調製した。これらの抽出物を出発材料として用い、ＶＨＨを、ＩＭＡＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して精製し、純度９５％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して評価）を得た。
ＢＡ／Ｆ３細胞上に発現したヒトＣＸ３ＣＲ１に結合するヒトフラクタルカインの抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨによる阻害
ＶＨＨのリガンドであるフラクタルカインに対する阻害能を、実施例４に概説する、ヒトＣＸ３ＣＲ１競合的ＦＡＣＳにて評価した。ＣＨＯ−ｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞、ＢＡ／Ｆ３−ｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞、又は一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のいずれかを用いた。異なる競合設定で用いた標識リガンドの量も変動させた。ヒトフラクタルカインのヒトＣＸ３ＣＲ１への相互作用を阻害するＶＨＨのＩＣ５０値を、表１９に示す。
Figure 0006101715
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ヒトＣＸ３ＣＲ１を過剰発現するＢＡ／Ｆ３細胞のヒトフラクタルカインにより誘導される走化性の、抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨによる阻害
フラクタルカインにより誘導される走化性の阻害を評価するために、走化性アッセイを、５μmの孔サイズを有するＣｈｅｍｏＴｘ使い捨てチャンバー（Neuroprobe, Gaithersburg, US）を用いて、設定した。活発に成長した培地から、細胞を回収し、洗浄し、その後、０．１％ＢＳＡを添加したアッセイ培地ＲＰＭＩ（Gibco, Carlsbad, US）を用いた。ボトムチャンバーに、総容量３００μlの３２０pMヒトフラクタルカインを充填した。メンブレンの適用の際、０．１３Ｅ６細胞を、総容量７０μlのメンブレン上部に堆積させた。ＣＯ２を含む加湿チャンバー中、３７℃で３時間、走化を可能にした。このインキュベーション時間後、メンブレンを取り除き、ボトムチャンバー中の細胞を再懸濁した。ウェルに存在するＡＴＰの量を、CellTiter-Gloキット（Promega, Madison WI, US）を用いて、決定した。読み取った発光について標準的設定を用いてEnvision（Perkin Elmer, Massachusetts, US）上にて、読み取りを行った。力価測定を、トリプリケートで行い、対照試料を含有する各プレートも同様にトリプリケートで行った。対照として、ＶＨＨを含まない試料、並びに、ヒトフラクタルカインをボトムチャンバーに加えていない試料を含んだ。結果の概要を表２０に示す。
Figure 0006101715
カニクイザルＣＸ３ＣＲ１に対する抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨの交差反応性の評価
最初に、ＦＡＣＳベース結合設定を用いて、カニクイザル交差反応性を評価した。このため、ＶＨＨを、それぞれの細胞と４℃で３０分間インキュベーションし、洗浄工程を３回続け、検出試薬とインキュベーションした。検出として、マウス抗ｃｍｙｃ抗体（Serotec, MCA2200）、続いて、ＰＥに結合したヤギ抗マウス抗体（Jackson １１５−１１６−０７１）を用い、４℃で３０分間インキュベーションし、続いて、洗浄工程を３回続けた。アッセイの結果を表２１に示す。
Figure 0006101715
後で同定したＶＨＨについて、ヒトフラクタルカイン競合的ＦＡＣＳを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現したヒト又はカニクイザルＣＸ３ＣＲ１を用いて、設定した。ヒト及びカニクイザル受容体の両方を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクションし、遺伝子導入を、標識リガンドであるヒトフラクタルカインの結合により、マッチさせた。競合を、ＥＣ３０濃度のフラクタルカインを用いて評価し、かかる得られたＩＣ５０値は、Ｋｉ値の良好な推定値、及び親和性の測定値であった（表２２）。実施例４に記載の通りに、実験を行った。カニクイザル及びヒトＣＸ３ＣＲ１に対するＩＣ５０値の比を用いて、両方の種におけるＣＸ３ＣＲ１に対する親和性における強力な相違を評価した。
Figure 0006101715
抗ヒトＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨのヒトＣＣＲ２、ヒトＣＣＲ５、又はマウスＣＸ３ＣＲ１への結合
ｈｕＣＸ３ＣＲ１受容体に対する特異性を、ｈｕＣＣＲ２、ｈｕＣＣＲ５、又はｍｓＣＸ３ＣＲ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１親細胞又はＣＨＯ細胞上でＦＡＣＳ結合実験を行うことにより、評価した。ＶＨＨを、それぞれの細胞株と４℃で３０分間インキュベーションし、洗浄工程を３回続け、検出試薬とインキュベーションした。検出として、マウス抗ｃｍｙｃ抗体（Serotec, MCA2200）、続いて、ＰＥに結合したヤギ抗マウス抗体（Jackson １１５−１１６−０７１）を用い、４℃で３０分間インキュベーションし、洗浄工程を３回続けた。各細胞株について、受容体特異的抗体を用いた質対照を含んだ。加えて、最高濃度の各ＶＨＨを、正の対照としてｈｕＣＸ３ＣＲ１を発現するＣＨＯ細胞とインキュベーションした。ｍｓＣＸ３ＣＲ１、ｈｕＣＣＲ２、又はｈｕＣＣＲ５への結合を観察することはできなかった。
エピトープ場所の決定
ＶＨＨが、ＣＸ３ＣＲ１上の重複するエピトープに結合するかどうかを決定するために、競合的結合実験を設定した。このために、alexa647で標識したＶＨＨ６６Ｂ０２を、ｈｕＣＸ３ＣＲ１を発現するＢＡ／Ｆ３細胞上での競合的ＦＡＣＳにおいて用いた。３つの機能ファミリー由来の代表的ＶＨＨを、標識６６Ｂ０２の結合のための競合物として用いた。得られたＩＣ５０値を表２３に示した。
Figure 0006101715
６６Ｂ０２結合の完全な阻害を、異なるリガンド阻害ライブラリー由来の全ての代表的ＶＨＨにより得ることができたので、全ての機能ファミリーは、６６Ｂ０２の結合と競合するように、互いに十分に近接して、結合すると結論することができる。
実施例６：ＶＨＨの２価へのフォーマット
２価分子の構築
得られたＶＨＨの選択から効力及び／又は有効性を増大するために、２価の分子を遺伝子操作により構築した。２個のＶＨＨを、３５ＧＳリンカーと２個の構成要素間で遺伝的に結合させ、続いて、１価のＶＨＨについて上述した通り、エシェリキア・コリにて発現させた。異なる２価のコンストラクトを、表２４に挙げる通り、作成した。
Figure 0006101715
ＢＡ／Ｆ３細胞上に発現したヒトＣＸ３ＣＲ１へのヒトフラクタルカイン結合の、抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨによる阻害
ヒトＣＸ３ＣＲ１へのリガンド結合の阻害を、実施例４に記載した通り、異なるフォーマットについて調べた。この特徴決定のため、ヒトＣＸ３ＣＲ１受容体の安定的発現を示す、ＢＡ／Ｆ３−ｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞株を用いた。alexa647標識リガンドであるフラクタルカインを、そのＥＣ３０濃度で用い、これにより、得られたＩＣ５０値は、Ｋｉ値を反映する。得られたデータの概要を、表２５に示す。
Figure 0006101715
ヒトＣＸ３ＣＲ１を過剰発現するＢＡ／Ｆ３細胞のヒトフラクタルカインにより誘導される走化性の、抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨによる阻害
１価の抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨについて記載したものと同様に、ＢＡ／Ｆ３−ｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞上でのフラクタルカインにより誘導される走化性の阻害を、２価のコンストラクトについて評価した。上述と同一のアッセイ設定を用い、得られた結果を、表２６に要約する。
Figure 0006101715
カニクイザルＣＸ３ＣＲ１に対する抗ＣＸ３ＣＲ１ＶＨＨの交差反応性の評価
２価のコンストラクトについて、カニクイザルＣＸ３ＣＲ１に対する交差反応性を評価し、ヒトの反応性と比較した。上述の通り、結合設定（表２７）又はリガンド競合設定（表２８）のいずれかを、一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて適用した。一過性にトランスフェクションした細胞のバッチを、その受容体発現レベルにより一致させた。
Figure 0006101715
Figure 0006101715
実施例７：リンカーの長さ及び半減期延長の調査
ａｌｂ１１ＶＨＨのリンカーの長さ及び位置の評価
２価のフォーマットに用いたリンカーの長さは、得られた効力に対して大幅に影響を与えることができるので、異なるリンカーの長さを評価した。
加えて、ヒト血清アルブミンに結合するナノボディであるＡｌｂ１１を含むと、フォーマット化した分子のインビボ半減期を増大した（国際特許出願公開公報第０６／１２２７８７号）。用いたリンカーの長さ、又は異なる構成ＶＨＨの位置についてのバリエーションを含む、異なるフォーマットを作成した。調査したフォーマットの概要を、表２９に示す。
Figure 0006101715
フォーマット化したＶＨＨについてのコード配列を、ピキア・パストリスにおける発現、培養培地への分泌を可能にする、実験室内で構築したプラスミドにクローニングした。発現ベクターを、ｐＰＩＣＺａ（Invitrogen）からもたらし、強固な制御のためのＡＯＸ１プロモーター、メタノールにより誘導される発現、Zeocin（商標）に対する耐性遺伝子、マルチクローニング部位、及びα因子分泌シグナルを含有する。形質転換発現の際、培養物を成長させ、ＶＨＨ発現をメタノールの添加により誘導し、３０℃で４８時間続けた。
これらの異なるフォーマットの効力を、上述のリガンド競合アッセイを用いて、評価した。用いたリガンド濃度は、ＥＣ５０値未満であり、得られたＩＣ５０値は、Ｋｉ値と均等であることが分かった。異なるフォーマットについて得られたＫｉを、表３０に要約する。
Figure 0006101715
効力に対するヒト血清アルブミンの影響
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のａｌｂ１１ＶＨＨへの結合は、フォーマットの効力に影響することができ、それ故、リガンド競合を、ＨＳＡの存在下で繰り返した。簡単に言うと、ＨＳＡのａｌｂ１１ＶＨＨへの結合を可能にするために、評価中のコンストラクト、及びフラクタルカインを、ＨＳＡと３０分間予めインキュベーションし、その後、細胞に加えた。細胞を、ＨＳＡを添加したＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。用いた終濃度ＨＳＡは、用いた最大のＶＨＨ濃度の５０倍であった。続いて、２時間競合させ、更なる処理は、実施例４に記載の通りであった。
Figure 0006101715
ＨＳＡの強力な干渉を、アッセイの異なる部分にＨＳＡを含む、適合した走化性設定においても評価した。用いたＨＳＡ濃度は、用いたコンストラクトの最高濃度を超えて５０倍であり、コンストラクトを、ＨＳＡと３０分間ロードし、その後アッセイを開始した。実験の全期間に存在するように、アッセイバッファーにもＨＳＡを添加する。上述の通り、５μmの孔サイズを有する使い捨てのＣｈｅｍｏＴｘチャンバー（Neuroprobe, Gaithersburg, MD, USA）を用いた。活発に成長した培地から、細胞を回収し、洗浄し、その後、アッセイ培地である、０．１％ＢＳＡ及び６２．５μM ＨＳＡ（Sigma, A8763）を添加したＲＰＭＩ（Gibco, Carlsbad, US）において用いた。ボトムチャンバーを、総容量３００μlの３２０pMヒトフラクタルカインで充填した。メンブレンに適用する際、０．１３Ｅ６細胞を、総容量７０μlでメンブレンの上部に堆積させた。３７℃で３時間、ＣＯ２を有する加湿チャンバー内で走化させた。このインキュベーション後、メンブレンを取り除き、ボトムチャンバー内の細胞を再懸濁した。ウェルに存在するＡＴＰの量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Promega, Madison WI, USA）を用いて決定した。読み取った発光について標準的な要因設定を用いてEnvision（Perkin Elmer, Massachusetts, US）上にて、読み取りを行った。力価測定を、トリプリケートで行い、対照試料を含有する各プレートも同様にトリプリケートで行った。対照として、ＶＨＨを含まない試料、並びに、ヒトフラクタルカインをボトムチャンバーに加えていない試料を含んだ。得られたＩＣ５０値を、表３１に挙げる。
Figure 0006101715
フォーマット化した２価の半減期延長ポリペプチドによるフラクタルカイン内部移行の阻害
更なる機能アッセイを行い、２価の半減期延長ポリペプチドのアンタゴニスト活性を示した。ポリペプチドを、ＣＨＯｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞におけるＡ６４７−フラクタルカインの内部移行を阻害する能力について評価した。簡単に言うと、１Ｅ４細胞／ウェルを、黒い透明ボトムの９６ウェルプレート（BD, Franklin Lakes, NJ, USA）に播種し、一晩成長させた。細胞を１回洗浄し、次に、アッセイバッファー（１０nM ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＢＳＡを添加した、カルシウム及びマグネシウム（Gibco）を有するＨＢＳＳ）にて平衡化した。フォーマット化したポリペプチドコンストラクトを加え、プレートを３７℃で１５分間インキュベーションした。次に、Ａ６４７−フラクタルカインを、終濃度８nMで加え、細胞を、３７℃で６０分間インキュベーションした。培地を取り除き、細胞を、３．７％ホルムアルデヒド溶液（Polysciences, Warrington, PA, USA）で１０分間固定した。細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、核をHoechstダイ（Life Technologies, Grand Island, NY, USA）で標識した。内在化標識フラクタルカインを定量化するために、細胞を、ＢＤ Ｐａｔｈｗａｙバイオイメージングシステムを用いてイメージ化した。標識細胞核を同定し、当該覆いの周りに３画素環を描くことにより、画像分割を行った。平均Ａ６４７強度を、細胞質環において測定した。フォーマット化したポリペプチドは、表３２に要約する通り、フラクタルカイン内部移行を強力に阻害した。
Figure 0006101715
抗ＣＸ３ＣＲ１フォーマット化２価半減期延長ポリペプチドはアゴニスト活性を欠く
２価の抗ＣＸ３ＣＲ１半減期延長ポリペプチドが、アゴニスト活性を有さないことを確認するために、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６を、ＣＨＯｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞においてカルシウム流入の導入について評価した。フラクタルカインは、これらの細胞における細胞質カルシウムレベルの増大をＣＸ３ＣＲ１依存性方法で仲介し、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６は、この目的を阻害した。
ＣＨＯｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞を、黒い透明のボトムの９６ウェルプレート（ＢＤ）において５Ｅ４細胞／ウェルで播種し、一晩成長させた。細胞を、２０mM ＨＥＰＥＳを添加したＨＢＳＳ中のカルシウム−４ダイ／２mMプロベニシド（Molecular Devices、Sunnyvale, CA, USA）と３７℃で６０分間インキュベーションした。ポリペプチド拮抗作用を示すために、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６を、細胞と１５分間予めインキュベーションし、その後、ＥＣ８０値のフラクタルカインを加えた。カルシウム動員を、ＦＬＩＰＲテトラシステム（Molecular Devices）上で、製造元の指示に従い、モニタリングした。アゴニズムを決定するために、ポリペプチドとプレインキュベーションし、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６を、フラクタルカイン刺激の場所で用いた。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６は、フラクタルカインにより仲介されるカルシウム動員を１．３nMのＩＣ５０で阻害したが、ポリペプチドを、最大１μMの濃度で加えたとき、細胞質カルシウムレベルの増大を観察しなかった。
実施例８：マウスＦｃを用いた半減期延長フォーマットの調査
代替の半減期延長法を評価するために、６６Ｂ０２ＶＨＨドメインを、マウスＩｇＧ２Ｆｃドメインを有する融合タンパク質（６６Ｂ０２−ｍＦｃ）として生成した。アスパラギン酸のアラニンへの変異（Ｄ２６５Ａ）を、ＣＨ２ドメインにおいて取り込み、このコンストラクトにおける強力なＦｃ仲介エフェクター機能を無効にした（Baudino, J. Immunol., 181, 6664-6669 (2008)）。６６Ｂ０２−ｍＦｃを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＮＳ０細胞において発現させ、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより、続いて、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。実施例７に記載のアッセイフォーマットを用いて、この分子を活性について試験した。結果を、表３３に要約する。
Figure 0006101715
６６Ｂ０２−ｍＦｃは、フラクタルカインにより仲介されるＣＸ３ＣＲ１活性を強力に阻害し、アゴニスト活性を示さなかった。１μMのこの分子での処置で、細胞質カルシウムレベルの増大を、観察しなかった。
実施例９：マウスアテローム性動脈硬化症モデルにおける、２価半減期延長ポリペプチドによるプラーク進行の阻害
ヒトＣＸ３ＣＲ１ノックインアポＥ−／−マウスの作成
マウスＣＸ３ＣＲ１について同定したＶＨＨの交差反応性の欠如を与える（実施例５）、ヒトＣＸ３ＣＲ１ノックインマウス株（ｈｕＣＸ３ＣＲ１ＫＩ）を、TaconicArtemis（Koeln, Germany）で作成し、マウス疾患モデルでのこれらの分子の試験を可能にした。対応するマウスプロモーターの制御下でヒトケモカイン受容体の発現を可能にする一方、内在性マウスタンパク質の発現を妨害する、ストラテジーを用いた。簡単に言うと、エクソン２中のマウスＣＸ３ＣＲ１コード領域を完全ヒトＣＸ３ＣＲ１オープンリーディングフレームと置き換え、選択マーカー及びｌｏｘＰ部位により隣接させた標的ベクターを構築した。標的ベクターをマウスＥＳ細胞に導入し、十分な相同組換えを有するクローンを用いて、キメラマウスを作成した。これらのマウスを、高度に効率的なFlp-deleterマウスまで育て、選択マーカー及び生殖細胞伝達の除去を達成した。次に、得られた、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのｈｕＣＸ３ＣＲ１ＫＩマウスを、アポＥ−／−マウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA）と交配し、ｈｕＣＸ３ＣＲ１ＫＩＡｐｏＥ−／−マウスを作成した。アポＥ−／−マウスモデルは、プラーク形成、組織学的組成、及び既知のリスク因子（コレステロール、炎症、高血圧など）の部位特異的な局所化に関して、ヒト疾患と大いに類似する、広範囲に渡る動脈硬化プラーク形成を導く強固な方法をもたらす。
マウスアポＥ−／−アテローム性動脈硬化症モデルにおける抗ＣＸ３ＣＲ１２価の半減期延長ポリペプチドの評価
メスのｈｕＣＸ３ＣＲ１ＫＩアポＥ−／−マウスに、１．５％コレステロールを含有する高脂肪／高コレステロール食餌を１６週間与えた（４週齢に開始）。１０週後、動物に、ビークル（２０mMクエン酸ナトリウム、pH６．０、１１５mM ＮａＣｌ）、１０mg/kg６６Ｂ０２−ｍＦｃを週１回又は２回、又は３０mg/kg ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６を週２回、６週間、腹腔内投与した。動物を、ガス麻酔により麻酔し、０．９％食塩水で灌流した。回腸に２分岐する下行大動脈を、注意深く取り出し、ホルマリン固定した。次に、をれを、縦方向に開き、スダンＩＶで１５分間、続いて７０％メタノールで２分間染色した。血管を流水下で洗浄し、ＰＢＳで満たした。組織を、ＳＰＯＴ高度ソフトウエア（SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI, USA）を用いたデジタルカメラで写真撮影した。脂質染色の割合を、画像分析ソフトウエア（Image-Pro Plus, MediaCybernetics, Rockville, MD, USA）で決定し、血管の陽性染色の割合として表した。この研究の結果を、表３４に要約する。
Figure 0006101715
１週間に２回投与するとき、６６Ｂ０２−ｍＦｃ及びＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６の両方が、プラークの進行を有意に阻害した。これらの分子の血漿レベルは、研究を通じて維持されることが確認され得るので、適用範囲と相関した。６６Ｂ０２−ｍＦｃの１週間に１回の投与のため、検出可能な血漿レベルを維持せず、これは、処置の６週間後に観察した有意な有効性の欠如と相関した。分子は、血漿コレステロール又はトリグリセリドレベルに有意に影響しなかった。
実施例１０：親ＶＨＨの配列最適化
一般的に、ＶＨＨ配列最適化中、親の野生型ＶＨＨ配列を、変異させて、ヒトＶＨ３−ＪＨ生殖細胞一致配列と同一であるＶＨＨ配列を生じた。タンパク質構造、活性、及び安定性を無傷で維持するように、ＶＨＨとヒトＶＨ３−ＪＨ生殖細胞間で異なるフレームワーク領域中の特定のアミノ酸を、ヒト同等物に変える。これを評価するために、全ての配列最適化変異体を、３つの異なるアッセイで親ＶＨＨと比較した：（ｉ）Thermal Shift Assay（ＴＳＡ）における融点（Ｔｍ）の決定、（ｉｉ）フラクタルカイン競合的ＦＡＣＳにおいてインビトロ効力の分析、及びいくつかのコンストラクトについて、（ｉｉｉ）フラクタルカインにより誘導される走化性アッセイにおけるインビトロの効力の分析。
フレームワーク残基の変異
配列最適化のため、以下の変異を評価した：Ｅ１Ｄ、Ｓ１１Ｌ、Ａ１４Ｐ、Ｅ１６Ｇ、Ｒ４４Ｑ、Ｄ４６Ｅ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、及びＱ１０８Ｌ。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２の親配列において生成した個々の変異を、表３５に示す。
Figure 0006101715
全てのコンストラクトを、エシェリキア・コリ発現ベクターにクローンングし、エシェリキア・コリにおいて、ｍｙｃ／Ｈｉｓタグタンパク質として、０．２５Ｌ〜０．５Ｌの培地容量のＴＢ培地中で発現した。１mM ＩＰＴＧを加えることにより、発現を導入し、３７℃で４時間、２５０rpmで続けた。細胞をペレット化し、ペリプラズム抽出物を、乾燥凍結し、ｄＰＢＳ中に再懸濁することにより、調製した。これらの抽出物を、HistrapFF粗カラム（GE healthcare）を用いた、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の出発材料として用いた。ナノボディを、カラムから、２５０mM イミダゾールで溶出し、続いて、ｄＰＢＳに対して脱塩した。ナノボディの純度と完全性を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、評価した。
表３６に要約されるように、Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、及びＱ１０８Ｌ変異は、競合的ＦＡＣＳから決定するように、効力に対する明確な効果を有さなかった。同様に、更なる変異Ｅ１Ｄ、Ｓ１１Ｌ、及びＥ１６Ｇは、効力に影響しなかった。一方、Ｒ４４Ｑ又はＤ４６Ｅのいずれかの導入は、効力の有意な低下を生じ、これは、両方の変異を導入した場合より断定される。
Figure 0006101715
ＶＨＨの安定性を予測する融点を評価した。大抵の個々の変異は、約６℃融点を上昇させるＤ４６Ｅ変異以外、効果を有さなかった。組み合わせ変異の導入はまた、温度安定性を増強した（０５７及び０６０を参照）。
リガンド競合的ＦＡＣＳにおける効力に対する主要な効果に起因して、変異Ｒ４４Ｑ及びＤ４６Ｅは、最終配列に含まれなかった。
ＣＤＲ残基の変異
親配列のインシリコ分析に基づき、グリコシル化部位を、５２位であると予測した。それ故、２個のライブラリーを構築した；５２位について１つ、及び５３位について１つであり、それは、全ての可能なアミノ酸を、それぞれの位置で含むように設計した。ライブラリーを、リガンド競合的ＦＡＣＳにおいて、ペリプラズム抽出物としてスクリーニングした。まず、親配列由来のペリプラスム材料から、連続希釈を行い、３つの希釈液を、更なるスクリーニングのために選択した。第１の希釈点（２倍）を、リガンド相互作用の完全阻害を生じるように選択し、他の２箇所の希釈点（１２８及び５１２倍）は、それぞれ、７０％、及び４０％阻害を得る必要がある。ライブラリーからのペリプラズム抽出物の生成の際、全ての試料を、２つに分け、そのうち１つを、加熱処理の対象にした。無処理及び熱処理試料の両方を、続いて、リガンド競合的ＦＡＣＳにおいて、３箇所の希釈点で分析した。得られた妨害物を、親配列由来のものと比較することにより、変異の影響を推定することができる。熱処理試料の分析により、変異の安定性に対する強力な影響の測定値がもたらされる。
最初のスクリーニング結果に基づき、７個の変異を、更なる特徴決定のため選択した。リガンド競合的ＦＡＣＳにおいて得られた効力を、表３７に示す。
Figure 0006101715
この分析から、ヒト参照配列を用いた配列アラインメント、及びインシリコT細胞エピトープ認識予測プログラムに基づき、それは、配列中に変異N52S及びS53Tを含むことが決定した。
安定性の理由のため、３２位についての更なるライブラリーを作成した。リガンド競合スクリーニングを、上述と同様の方法で設定した。再度、ペリプラズム抽出物の３種の希釈液をスクリーニングし、得られた％阻害を、親配列について得られたものと比較した。種々の変異の分析の際、Ｎ３２Ｔの置換を選択し、最終配列最適化変異体に含めた。
実施例１１：最適化変異体の分析
最終特徴決定ラウンドにおいて、表３８に列挙したコンストラクトを特徴付けた。
Figure 0006101715
競合的ＦＡＣＳ実験を、上述の通り行い、並びに融点を決定した。得られた値を、表３９に表す。
Figure 0006101715
これらのコンストラクトを、上述の、フラクタルカインにより誘導される走化性においても特徴付けた（表４０）。
Figure 0006101715
選択したコンストラクトを、ＣＨＯｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞において、Ａ６４７−フラクタルカインにより誘導される内部移行の阻害について評価した。結果を、表４１に要約する。
Figure 0006101715
配列最適化抗ＣＸ３ＣＲ１半減期延長ポリペプチドは、アゴニスト活性を欠く
配列最適化抗ＣＸ３ＣＲ１半減期延長ポリペプチドがアゴニスト活性を有さないことを確認するために、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３を、ＣＨＯｈｕＣＸ３ＣＲ１細胞におけるカルシウム動員の導入について評価した。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３とのプレインキュベーションにより、フラクタルカインにより仲介されるカルシウム動員を１．３nMのＩＣ５０で阻害し、ポリペプチドのみを、最大１μMの濃度で加えたとき、細胞質レベルの増大を観察しなかった。
実施例１２：ヒトＦｃを用いた半減期延長フォーマットの調査
更なる半減期延長法を評価するために、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３０６及びＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３０７配列最適化ＶＨＨドメインを、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインとの融合タンパク質（３０６Ｄ−ｈＦｃ及び３０７Ｄ−ｈＦｃ）として提供した。２個の変異をＣＨ２ドメインにおいて取り込み、このコンストラクトにおける強力なＦｃ仲介エフェクター機能を無効にした。３０６Ｄ−ｈＦｃ及び３０７Ｄ−ｈＦｃを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＮＳ０細胞において発現させ、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより、続いて、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。これらの分子を、実施例７に記載のアッセイフォーマットを用いて、機能的活性について試験した。結果を、表４２に要約する。
Figure 0006101715
これらの分子は、フラクタルカインにより仲介されるＣＸ３ＣＲ１活性化を強力に阻害する一方、アゴニスト活性を表さなかった。最大１μMのこれらのナノボディのみを用いた処置で、細胞質カルシウムレベルの増大を観察しなかった。
実施例１３：配列最適化抗ＣＸ３ＣＲ１ナノボディによる、マウスアテローム性動脈硬化症モデルにおけるプラーク進行の阻害
メスのｈｕＣＸ３ＣＲ１ＫＩアポＥ−／−マウスに、１．５％コレステロールを含有する高脂肪／高コレステロール食餌を１６週間与えた（４週齢に開始）。１０週後、動物に、ビークル（２０mMクエン酸ナトリウム、pH６．０、１１５mM ＮａＣｌ）、３０mg/kg ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３を週１回又は２回、又は３０mg/kg ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６を週２回、６週間、腹腔内投与した。動物を屠殺し、下行大動脈におけるプラーク範囲の割合を、上述の通り、定量した。この研究の結果を、表４３に要約する。
Figure 0006101715
ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３及びＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３６の両方は、週に２回投与したとき、プラークの進行を有意に阻害した。これらの分子の血漿レベルは、研究を通じて維持されることが確認され得るので、適用範囲と相関した。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３の１週間に１回の投与のため、検出可能な血漿レベルを維持せず、これは、処置の６週間後に観察した有意な有効性の欠如と相関した。分子は、血漿コレステロール又はトリグリセリドレベルに有意に影響しなかった。
実施例１４：全血中の初代ヒト及びカニクイザルＣＤ１４＋細胞へのナノボディ結合
フォーマット化配列最適化抗ＣＸ３ＣＲ１ナノボディとの競合的ＦＡＣＳ
フォーマット化配列最適化抗ＣＸ３ＣＲ１ナノボディのヒト初代細胞への結合を確認するために、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３が、全血において、競合的ＦＡＣＳアッセイにおけるＡ６４７標識ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０１８（Ａ６４７−０１８）のＣＤ１４＋細胞への結合に対して競合することを示した。簡単に言うと、eFluor450（eBioscience, San Diego, CA, USA）と結合したマウス抗ヒトＣＤ１４抗体を、ＥＤＴＡ中に１：１０で希釈し、健常なヒトドナー由来の全血で処理した。４０μl/ウェルを、９６ウェルポリスチレン丸底プレートに加え、続いて、終濃度１００nM〜０．００２pMの範囲で、ＢＳＡ（BD Pharmingen）を含む染色バッファー中に希釈した１０μl/ウェルＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３を加え、試料を、室温で２０分間インキュベーションした。次に、染色バッファー中の１０μｌ／ウェルＡ６４７−０１８を加え、終濃度１nM（Ａ６４７−０１８結合のＥＣ８０）を得て、試料を、室温で更に２０分間インキュベーションした。次に、２２０μl/ウェル 1-Step Fix/Lyse溶液（eBioscience）を加えた。室温で１０分間インキュベーション後、細胞をペレットにし、染色バッファー中で洗浄し、このバッファーに再懸濁した。試料を、BD LSR IIフローサイトメトリーにて分析した。ＣＤ１４陽性細胞集団のゲートについて、AlexaFluor 647についての蛍光強度の中央値を定量した。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３は、ヒトの血液において、Ａ６４７−０１８のＣＤ１４陽性細胞への結合を、０．３５nMのＩＣ５０で、強力に阻害した（ｎ＝８）。
フォーマット化配列最適化抗ＣＸ３ＣＲ１ナノボディのカニクイザル初代細胞への結合を確認するために、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３が、カニクイザル全血において、競合的ＦＡＣＳアッセイにおけるＡ６４７標識ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０１８（Ａ６４７−０１８）のＣＤ１４＋細胞への結合に対して競合することを示した。用いた方法は、Ａ６４７−０１８の終濃度が３nM（Ａ６４７−０１８結合のＥＣ８０）であり、1-Step Fix/Lyse溶液の代わりに、ＡＣＫ溶解バッファー（Life Technologies）を用いた以外、上で概説したものと同じであった。１％ホルムアルデヒドを添加した染色バッファーに、細胞を再懸濁した後に、分析した。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３は、カニクイザルの血において、Ａ６４７−０１８のＣＤ１４陽性細胞への結合を、０．４３nMのＩＣ５０で強力に阻害した（ｎ＝４）。
実施例１５：カニクイザルにおける薬物動態学（ＰＫ）
２〜５歳、体重２．４〜３．５kgの無処置のオスカニクイザル（Macaca fascicularis）において、薬物動態研究を行った。サルを４つの処置群に分けた。群１（ｎ＝３）は、０．２mg/kgＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３（腹腔内）を受け；群２（ｎ＝３）は、２mg/kgＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３（腹腔内）を受け；群３（ｎ＝３）は、２mg/kgＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３（皮下）を受け、及び群４（ｎ＝３）は、５mg/kgＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３（腹腔内）を受けた。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３を、クエン酸緩衝液中の２mg/ml溶液（２０mMクエン酸ナトリウム／１１５mM塩化ナトリウム、pH６．０）として投与した。血液試料を、６週に渡り、末梢静脈から、ＰＫ分析用血清分離チューブに回収した。
血清試料を、ＭＳＤ（Meso Scale Discovery）フォーマットを用いて分析した。簡単に言うと、ビオチン化抗ナノボディ抗体を、MSD標準ストレプトアビジンプレート（Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA）に結合させた。プレートを、リン酸緩衝食塩水中の０．０５％Tween20で洗浄し、５％w/v SeraCare BSA（SeraCare Life Sciences, Milford, MA, USA）でブロッキングした後、血清試料とインキュベーションした。ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３をスルホ標識抗ナノボディナノボディを用いて検出し、プレートをSector Imager 2400（Meso Scale Discovery）にて分析した。５％サルの血中の５０００〜０．５ng/mlの濃度のＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３１３を、標準として用いた。標的会合を、ＣＤ１４＋ゲート化単球上の遊離ＣＸ３ＣＲ１のレベルをモニタリングすることにより、評価した。このアッセイは、ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ００３１３を更に加えていないこと以外、実施例１４に概説される競合的ＦＡＣＳと同じであった。血清試料を、ＰＫ及び遊離ＣＸ３ＣＲ１の評価にも影響し得る、１次抗ヒト抗体（ＰＡＨＡ）の存在についてもモニタリングした。
ForteBio RED96を、ＰＡＨＡの検出のため用いた。簡単に言うと、ビオチン化ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ０３１３を、ストレプトアビジンセンサー上に捕獲させた。次に、貯蔵した無処理のサル血清を、カットオフ値（無処理血清の平均結合シグナルの２倍上である）を決定するための負の対照として用いた。全血清試料を、緩衝液中に２０倍希釈し、結合シグナルが、カットオフ値より大きい場合、ＰＡＨＡ応答が陽性であると決定した。
ＰＡＨＡの検出後の時間点についてのデータを、ＰＫ／ＰＤ分析から除外した。ＰＫデータを、以下の表４４に要約する。
Figure 0006101715
＊＊最終相の特徴決定に不十分なデータ
２．０mg/kg（静脈注射）でのクリアランス及び半減期は、それぞれ、９．４mL/日/kg及び９．６日であった。０．２mg/kg（静脈注射）で、クリアランスは、飽和性標的介在性質（ＴＭＤ）薬物動態と一致して、実質的に高くなった（１１３mL/d/日）。用量調節ＡＵＣ（０〜１４日）は、２〜５mg/kg（静脈注射）用量で比較可能であり、これは、ＴＭＤが２mg/kg用量で飽和することを示唆している。静脈注射又は腹腔内注射のいずれかのナノボディ投与の２週間後での暴露は、＞７０nMであり、腹腔内投与後のバイオアベイラビリティは、５４％であった。９０％より高い標的対象との暴露で跡を付けたフリーの受容体は、＞１０nMの暴露で維持した。

Claims (49)

  1. 抗ＣＸ３ＣＲ１（抗ＣＸ３ケモカイン受容体１）免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが４個のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）、及び３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）から本質的になり、かつ、ＣＤＲ３が、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（配列番号１８６）のアミノ酸配列を有し、かつ、ポリペプチドが、
    − それぞれ、配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６２、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６６、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６７、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６８、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１７０、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１７１、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１７４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４３、１６４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１５、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１６、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１７、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１８、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１９、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２２０、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号２１３、２１４、及び１８６
    に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、ポリペプチド。
  2. ポリペプチドが、それぞれ、配列番号１４１、１６４、及び１８６、それぞれ、配列番号１４１、１６２、及び１８６、それぞれ、配列番号２１３、２１４、及び１８６、又はそれぞれ、配列番号２１３、２２１、及び１８６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、
    ａ）配列番号３のアミノ酸配列；又は
    ｂ）配列番号１、３〜５、７、９、１０、１２〜１４、１８〜２４、２９〜３４、３８〜４４、１２１〜１４０、又は２２２〜２２４のいずれか１つのアミノ酸配列
    に示される配列を含むＶＨＨドメインである、請求項１〜２のいずれか１項記載のポリペプチド。
  4. 抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号３、配列番号１２１〜１４０、又は配列番号２２２〜２２４に示される配列を含む、請求項３記載のポリペプチド。
  5. 抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は安定性、有効性、製造可能性、及び／又はヒトフレームワーク領域に対する類似性について最適化されているＶＨＨである、請求項１〜４いずれか１項記載のポリペプチド。
  6. 半減期延長部分を更に含む、請求項１記載のポリペプチド。
  7. 半減期延長部分が、ポリペプチドに共有結合し、アルブミン結合部分（例えば、抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合部分（例えば、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組み換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、又はＦｃドメインからなる群より選択される、請求項６記載のポリペプチド。
  8. 半減期延長部分が、抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインからなる、請求項６又は７記載のポリペプチド。
  9. 免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨＨドメイン、ヒト化ＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、及び／又は「ｄＡｂ」から選択される、請求項８記載のポリペプチド。
  10. 抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２３０〜２３２のいずれか１つから選択される配列を含む、請求項９記載のポリペプチド。
  11. 第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを更に含む、請求項１記載のポリペプチド。
  12. 第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、第２の抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項１１記載のポリペプチド。
  13. 第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は安定性、有効性、製造可能性、及び／又はヒトフレームワーク領域に対する類似性について最適化されているＶＨＨである、請求項１１記載のポリペプチド。
  14. 第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、
    − それぞれ、配列番号２１３、２２１、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６２、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６６、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６７、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１６８、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１７０、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１７１、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、１７４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４３、１６４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１４、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１５、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１６、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１７、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１８、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２１９、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号１４１、２２０、及び１８６；又は
    − それぞれ、配列番号２１３、２１４、及び１８６
    に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１２記載のポリペプチド。
  15. 第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１４記載のポリペプチド。
  16. 第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、
    ａ）配列番号３のアミノ酸配列；又は
    ｂ）配列番号１、３〜５、７、９、１０、１２〜１４、１８〜２４、２９〜３４、３８〜４４、１２１〜１４０、又は２２２〜２２４のいずれか１つのアミノ酸配列
    に示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、請求項１５記載のポリペプチド。
  17. 第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、同一のＶＨＨドメインを含む、請求項１６記載のポリペプチド。
  18. それぞれが、配列番号１４１、１６４、及び１８６、又は配列番号１４１、１６２、及び１８６、又は配列番号２１３、２１４、及び１８６、又は配列番号２１３、２２１、及び１８６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ＣＸ３ＣＲ１に結合する、ポリペプチド。
  19. 第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインのそれぞれが、それぞれが配列番号１、配列番号３、又は配列番号１２１〜１４０又は２２２〜２２４のいずれか１つに示される配列を含むＶＨＨドメインである、第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ポリペプチド。
  20. 半減期延長部分を更に含む、請求項１１〜１９のいずれか１項記載のポリペプチド。
  21. 半減期延長部分が、ポリペプチドに共有結合し、アルブミン結合部分（例えば、抗アルブミン免疫グロブリンドメイン）、トランスフェリン結合部分（例えば、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン）、ポリエチレングリコール分子、組み換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、又はＦｃドメインからなる群より選択される、請求項２０記載のポリペプチド。
  22. 半減期延長部分が、抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインからなる、請求項２１記載のポリペプチド。
  23. 免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＶＨＨドメイン、ヒト化ＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、及び／又は「ｄＡｂ」から選択される、請求項２２記載のポリペプチド。
  24. 抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２３０〜２３２から選択される、請求項２３記載のポリペプチド。
  25. 配列番号２２５〜２２７、又は２５７〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  26. 請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
  27. 請求項２６記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  28. 請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、ポリペプチドを発現する能力がある、宿主細胞。
  29. （ｉ）請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、及び場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含む、医薬組成物。
  30. ヒトにおける静脈内又は皮下注射に適した、請求項２９記載の医薬組成物。
  31. 請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチドの製造方法であって、
    − 宿主細胞を、請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程を含み、
    ここで、宿主細胞が、請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする領域を含む核酸分子を含む発現ベクターを有し、宿主細胞が原核生物又は真核生物の細胞である、方法。
  32. − ポリペプチドを回収し；次に
    − ポリペプチドを精製する、
    工程を更に含む、請求項３１記載の方法。
  33. ヒトにおける疾患、障害、又は状態の処置、予防、又は緩和において使用するための、請求項１〜２５のいずれか記載のポリペプチド。
  34. 疾患、障害、又は状態が、ＣＸ３ＣＲ１関連疾患、障害、又は状態である、請求項３３記載の使用のためのポリペプチド。
  35. 疾患、障害、又は状態が、心血管及び脳血管アテローム性障害、末梢動脈障害、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月体形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む脈管炎、関節リウマチ、骨関節炎、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性障害、及び脱髄性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌から選択される、請求項３４記載の使用のためのポリペプチド。
  36. 疾患、障害、又は状態が、アテローム性動脈硬化症である、請求項３５記載の使用のためのポリペプチド。
  37. ヒトにおける疾患、障害、又は状態の処置、予防、又は緩和用医薬の製造のための、請求項１〜２５のいずれか記載のポリペプチドの使用。
  38. 請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチドを含む診断キット。
  39. 心血管及び脳血管アテローム性障害、末梢動脈障害、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月体形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む脈管炎、関節リウマチ、骨関節炎、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性障害、及び脱髄性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌の少なくとも１つの診断のための、請求項３８記載の診断キット。
  40. 配列番号２２５のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  41. 配列番号２２６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  42. 配列番号２２７のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  43. 配列番号２５８のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  44. 配列番号２６１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  45. （ｉ）請求項４０記載のポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、及び場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含む、医薬組成物。
  46. （ｉ）請求項４１記載のポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、及び場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含む、医薬組成物。
  47. （ｉ）請求項４２記載のポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、及び場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含む、医薬組成物。
  48. （ｉ）請求項４３記載のポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、及び場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含む、医薬組成物。
  49. （ｉ）請求項４４記載のポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、及び場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び／又は安定剤を含む、医薬組成物。
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