KR20140130685A - Ｃｘ3ｃｒ1-결합 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, CX3CR1 결합 폴리펩타이드, 특히, 특이적 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 상기 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법; 상기 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물; 및 특히, 예방학적, 치료학적 및 진단학적 목적을 위한 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

ＣＸ3ＣＲ1-결합 폴리펩타이드{CX3CR1-BINDING POLYPEPTIDES}
본 발명은, CX3CR1-결합 폴리펩타이드, 특히, 특이적 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법; 상기 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물; 및 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물의 용도, 특히, 예방학적, 치료학적 및 진단학적 목적을 위한 용도에 관한 것이다.
CX3CR1은, 케모카인 수용체인 G-단백질 커플링된 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이다. CX3CR1은, 죽상 동맥경화성 플라크의 개시 및 진행과 연관되어 있는, 단핵구, 수지상 세포 및 T 세포와 같은 세포 유형 상에서 주로 발현된다. CX3CR1은, 산화된 지질에 의해 단핵구 상에서 상향조절되고, 이들 세포의 플라크 내로의 이동 및 플라크 내에서의 생존을 매개한다. 이의 고유 리간드 프랙탈카인(FKN)은, 이것이 백혈구 부착을 조절하는 병변에서의 혈관 내피 및 평활근 세포의 표면 상에서 발현된다. 프랙탈카인은, 또한, 이것이 화학주화성 제제로서 기능하는 순환계로 단백질분해 절단에 의해 방출된다.
사람에서, 감소된 활성을 갖는 CX3CR1 변이체(V249I/T280M)는 심혈관 질환(관상 심장 질환, 뇌혈관 질환 또는 말초 혈관 질환)(문헌 참조: McDermott, 2001; Circ Res 89:401), 관상 동맥 질환(협착증의 혈관조영적 증거)(문헌 참조: McDermott, 2003; J. Clin . Invest . 111:1241), 및 경동맥 폐색성 질환(Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276)의 보다 낮은 위험성과 연관되어 있는 것으로 나타났다. CX3CR1은 죽상 동맥경화성 플라크 내에 폴리클로날 항체에 의해 증진된 면역염색을 나타낸 프랙탈카인과 동시에 국재화되어 있다(문헌 참조: Wong, 2002 Cardiovasc . Path. 11:332). 어떠한 프랙탈카인 염색도 비-플라크 동맥 영역에서는 관찰되지 않았다.
수개의 독립적 마우스 유전학적 연구는 죽상 동맥경화증에 대한 CX3CR1 결핍의 이로운 효과를 나타냈다. 플라크 내에서의 단핵구/대식세포 축적의 감소 뿐만 아니라 대동맥 및 흉대동맥에서의 병변 영역의 감소는 고지방 식이물을 공급받은 2개의 독립적으로 유도된 스트레인의 CX3CRr-/- apoE-/- 마우스에서 나타났다(문헌 참조: Combadiere, 2003; Circulation, 107:1009, Lesnik, 2003; J. Clin . Invest . 111:333).
이것은, CX3CR1이 심혈관 질환에 관여하고 이의 활성 조절이 전망 있는 치료요법을 제공할 수 있음을 보여준다. 따라서, 사람에서 질환, 특히, 심혈관 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제로서 사용될 수 있는, 이로운 약리학적 성질을 갖는, CX3CR1에 대한 길항제 분자가 요구된다.
따라서, 본 발명의 한 목적은, 항-CX3CR1 길항제 분자, 특히, CX3CR1에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 항-CX3CR1 길항제 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은, CX3CR1에 대해 높은 특이성을 갖는 항-CX3CR1 길항제 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 강력한 활성을 갖는 항-CX3CR1 길항제를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 선호되는 생체이용률 및 반감기를 갖는 항-CX3CR1 길항제를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 선호되는 생물물리학적 성질을 갖는 항-CX3CR1 길항제를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기된 목적들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 요약
본 발명은, 사람 CX3CR1에 결합하여 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있는 폴리펩타이드를 제공한다. 한 양상에서, 상기 폴리펩타이드는, 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는 면역글로불린이고, 여기서, 상기 면역글로불린은 사람 CX3CR1에 결합하여 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있다. 추가의 양상에서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기의 성질들 중 하나 이상을 특징으로 한다:
· 사람 CX3CR1에 대해 높은 친화성으로 결합한다;
· 사람 CX3CR1에 대한 가용성 프랙탈카인의 결합을 차단한다;
· 프랙탈카인 유도된 주화성을 억제한다;
· 프랙탈카인 유도된 사람 CX3CR1 수용체 내재화를 억제한다;
· 결합 및 기능적 억제에 대해 사람 CX3CR1에 대한 E/IC50의 10배 이내에서 cyno CX3CR1과 교차 반응한다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 반감기 연장 모이어티, 예를 들면, 알부민 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자 또는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은 링커 펩타이드에 의해 공유 결합된다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드에서 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드에서 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 반감기 연장 모이어티, 예를 들면, 알부민 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자 또는 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 제1 링커 펩타이드에 의해 알부민 결합 모이어티에 공유 결합된 제1 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 알부민 결합 모이어티는, 제2 링커 펩타이드에 의해 제2 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 추가로 공유 결합된다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 링커 펩타이드에 의해 Fc 도메인에 공유 결합된 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 링커 펩타이드에 의해 Fc 도메인에 공유 결합된 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 상기 폴리펩타이드는, 예를 들면, 디설파이드 가교를 통해 이량체로서 제공된다. 본 발명의 폴리펩타이드는, CX3CR1-연관된 질환, 장애 또는 병태, 특히, 심혈관 질환, 예를 들면, 죽상 동맥경화증의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단을 위해 사용된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 하기의 실시형태들을 제공한다:
실시형태 1: 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는 면역글로불린으로서, 상기 면역글로불린은 사람 CX3CR1에 결합하여 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있는, 면역글로불린.
실시형태 2: 하나 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있는, 폴리펩타이드.
실시형태 3: 실시형태 2에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 필수적으로 4개의 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3)로 이루어진, 폴리펩타이드.
실시형태 4: 실시형태 3에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 구조를 갖는, 폴리펩타이드.
실시형태 5: 실시형태 2 내지 실시형태 4 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 항체 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 6: 실시형태 5에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이, VH, VL, VHH, 낙타화된 VH, 또는 안정성, 효력, 제조가능성 및/또는 사람 프레임워크 영역과의 유사성에 대해 최적화된 VHH인, 폴리펩타이드.
실시형태 7: 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가,
a) 세포 결합 FACS에 의한 측정시, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 EC50; 또는
b) 경쟁 FACS에 의한 측정시, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로, 사람 CX3CR1에 대한 친화성을 갖는, 폴리펩타이드.
실시형태 8: 실시형태 1 내지 실시형태 7 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 300nM 이하, 100nM 이하, 또는 20nM 이하, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로 차단하는, 폴리펩타이드.
실시형태 9: 실시형태 1 내지 실시형태 8 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 사람 CX3CR1에 의해 매개되는 프랙탈카인 유도된 주화성을 500nM 이하, 100nM 이하, 75nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하 또는 5nM 이하의 IC50으로 억제하는, 폴리펩타이드.
실시형태 10: 실시형태 1 내지 실시형태 9 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 사람 CX3CR1에 의해 매개되는 프랙탈카인 내재화를 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로 억제하는, 폴리펩타이드.
실시형태 11: 실시형태 3 내지 실시형태 10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 CDR3이, Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(서열번호 197)[여기서,
- Xaa1은 Pro, Ala 또는 Gly이고;
- Xaa2는 Asp 또는 Asn이고;
- Xaa3은 Thr 또는 Ser이고;
- Xaa4는 Arg, Lys, Ala 또는 Gly이고;
- Xaa5는 Tyr 또는 Phe이다]의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
실시형태 12: 실시형태 3 내지 실시형태 11 중 어느 한 실시형태에 있어서,
a) - Xaa1이 Pro, Ala 또는 Gly이고;
- Xaa2가 Asp 또는 Asn이고;
- Xaa3이 Thr이고;
- Xaa4가 Arg 또는 Lys이고;
- Xaa5가 Tyr이고/이거나,
b) 상기 CDR3이 서열번호 186 내지 190 중 어느 하나로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 13: 실시형태 3 내지 실시형태 12 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 CDR3이 Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr(서열번호 186)의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
실시형태 14: 실시형태 3 내지 실시형태 10 중 어느 한 실시형태에 있어서,
i) 상기 CDR1이,
a) 서열번호 141의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 141의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 141의 아미노산 서열과 2개 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 2번 위치에서, S가 T 또는 G로 변화되어 있고/있거나;
- 6번 위치에서 S가 R로 변화되어 있고/있거나;
- 7번 위치에서 N이 T로 변화되어 있고/있거나;
- 9번 위치에서 M이 K로 변화되어 있는, 아미노산 서열을 갖거나;
d) 서열번호 141 내지 145 및 213 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
ii) 상기 CDR2가,
a) 서열번호 164의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 164의 아미노산 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 164의 아미노산 서열과 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 1번 위치에서 G가 A, L, V 또는 S로 변화되어 있고/있거나;
- 3번 위치에서 N이 D, S, Q, G 또는 T로 변화되어 있고/있거나;
- 4번 위치에서 S가 T, K, G 또는 P로 변화되어 있고/있거나;
- 5번 위치에서 V가 A로 변화되어 있고/있거나;
- 6번 위치에서 G가 D로 변화되어 있고/있거나;
- 7번 위치에서 I가 T 또는 V로 변화되어 있고/있거나;
- 8번 위치에서 T가 A로 변화되어 있고/있거나;
- 9번 위치에서 K가 R로 변화되어 있는, 아미노산 서열을 갖거나;
d) 서열번호 162 내지 175 및 214 내지 221 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
iii) 상기 CDR3이,
a) 서열번호 186의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 186의 아미노산 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 186의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 2번 위치에서 P가 A 또는 G로 변화되어 있고/있거나;
- 7번 위치에서 D가 N으로 변화되어 있고/있거나;
- 9번 위치에서 R이 K로 변화되어 있는, 아미노산 서열을 갖거나;
d) 서열번호 186 내지 190 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
실시형태 15: 실시형태 3 내지 실시형태 10 중 어느 한 실시형태에 있어서,
i) 상기 CDR1이 서열번호 146의 아미노산 서열을 갖고;
ii) 상기 CDR2가, a) 서열번호 176의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는, 아미노산 서열을 갖거나, b) 서열번호 176 또는 177의 아미노산 서열을 갖고;
iii) 상기 CDR3이 서열번호 191의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
실시형태 16: 실시형태 3 내지 실시형태 10 중 어느 한 실시형태에 있어서,
i) 상기 CDR1이,
a) 서열번호 147의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 147의 아미노산 서열과 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 1번 위치에서 G가 K, R, 또는 A로 변화되어 있고/있거나;
- 2번 위치에서 T가 I, P, S 또는 L로 변화되어 있고/있거나;
- 3번 위치에서 I가 V 또는 T로 변화되어 있고/있거나;
- 4번 위치에서 F가 L로 변화되어 있고/있거나;
- 5번 위치에서 S가 R 또는 D로 변화되어 있고/있거나;
- 6번 위치에서 N이 S, T, 또는 D로 변화되어 있고/있거나;
- 7번 위치에서 N이 T 또는 Y로 변화되어 있는, 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 147 내지 161 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
ii) 상기 CDR2가,
a) 서열번호 179의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 179의 아미노산 서열과 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 3번 위치에서 S가 T 또는 G로 변화되어 있고/있거나;
- 4번 위치에서 N이 S 또는 I로 변화되어 있고/있거나;
- 5번 위치에서 S가 T로 변화되어 있고/있거나;
- 6번 위치에서 G가 Y로 변화되어 있고/있거나;
- 8번 위치에서 T가 A로 변화되어 있는, 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 178 내지 185 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
iii) 상기 CDR3이,
a) 서열번호 192의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 192의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 192의 아미노산 서열과 2개 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 2번 위치에서 A가 G로 변화되어 있고/있거나;
- 8번 위치에서 T가 S로 변화되어 있고/있거나;
- 9번 위치에서 A가 G로 변화되어 있고/있거나;
- 10번 위치에서 Y가 F로 변화되어 있는, 아미노산 서열을 갖거나;
d) 서열번호 192 내지 196 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
실시형태 17: 실시형태 3에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이,
- 각각 서열번호 141, 162 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 163 및 187; 또는
- 각각 서열번호 141, 164 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 166 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 167 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 167 및 189; 또는
- 각각 서열번호 141, 168 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 168 및 187; 또는
- 각각 서열번호 141, 169 및 190; 또는
- 각각 서열번호 141, 170 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 171 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 174 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 175 및 187; 또는
- 각각 서열번호 142, 165 및 188; 또는
- 각각 서열번호 142, 173 및 188; 또는
- 각각 서열번호 143, 164 및 186; 또는
- 각각 서열번호 144, 172 및 187; 또는
- 각각 서열번호 145, 172 및 187; 또는
- 각각 서열번호 141, 214 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 215 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 216 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 217 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 218 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 219 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 220 및 186; 또는
- 각각 서열번호 213, 221 및 186; 또는
- 각각 서열번호 213, 214 및 186에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 18: 실시형태 3에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이,
- 각각 서열번호 146, 176 및 191; 또는
- 각각 서열번호 146, 177 및 191에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 19: 실시형태 3에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이,
- 각각 서열번호 147, 178 및 192; 또는
- 각각 서열번호 147, 179 및 192; 또는
- 각각 서열번호 147, 179 및 194; 또는
- 각각 서열번호 148, 179 및 193; 또는
- 각각 서열번호 149, 179 및 192; 또는
- 각각 서열번호 149, 180 및 192; 또는
- 각각 서열번호 149, 181 및 192; 또는
- 각각 서열번호 149, 183 및 192; 또는
- 각각 서열번호 149, 185 및 192; 또는
- 각각 서열번호 150, 179 및 194; 또는
- 각각 서열번호 150, 182 및 194; 또는
- 각각 서열번호 151, 179 및 193; 또는
- 각각 서열번호 151, 182 및 194; 또는
- 각각 서열번호 151, 184 및 196; 또는
- 각각 서열번호 152, 179 및 195; 또는
- 각각 서열번호 153, 179 및 194; 또는
- 각각 서열번호 154, 182 및 194; 또는
- 각각 서열번호 155, 179 및 195; 또는
- 각각 서열번호 156, 181 및 192; 또는
- 각각 서열번호 157, 179 및 194; 또는
- 각각 서열번호 158, 179 및 192; 또는
- 각각 서열번호 159, 178 및 192; 또는
- 각각 서열번호 160, 179 및 194; 또는
- 각각 서열번호 161, 179 및 194에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 20: 실시형태 3에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 각각 서열번호 141, 164 및 186, 또는 각각 141, 162 및 186에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 21: 실시형태 3에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 각각 서열번호 213, 214 및 186, 각각 서열번호 213, 221 및 186, 또는 각각 서열번호 141, 162 및 186에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 22: 실시형태 2 내지 실시형태 10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이,
a) 서열번호 3의 아미노산 서열;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열번호 3의 아미노산 서열과 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 서열 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 1 내지 48, 121 내지 140 또는 222 내지 224 중 어느 하나의 아미노산 서열에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 23: 실시형태 2 내지 실시형태 10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이,
a) 서열번호 49의 아미노산 서열;
b) 서열번호 49의 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열번호 49의 아미노산 서열과 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 49 내지 52 중 어느 하나의 아미노산 서열에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 24: 실시형태 2 내지 실시형태 10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이,
a) 서열번호 67의 아미노산 서열;
b) 서열번호 67의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열번호 67의 아미노산 서열과 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 53 내지 120 중 어느 하나의 아미노산 서열에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 25: 실시형태 2에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 26: 실시형태 2에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 121 내지 140 또는 서열번호 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 27: 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 사람화되고/되거나, 안정성, 효력, 제조가능성 및/또는 사람 프레임워크 영역과의 유사성에 대해 최적화되는, 폴리펩타이드.
실시형태 28: 실시형태 27에 있어서, 사람화되고/되거나, 1번, 11번, 14번, 16번, 74번, 83번 및 108번 위치들(캐뱃 번호매김에 따름) 중 하나 이상에서 최적화된 서열인, 폴리펩타이드.
실시형태 29: 실시형태 28에 있어서, E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R 또는 Q108L의 돌연변이들 중 하나 이상을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 30: 실시형태 3 내지 실시형태 29 중 어느 한 실시형태에 있어서,
i) FR1이 서열번호 198 내지 204로부터 선택되고/되거나;
ii) FR2가 서열번호 205 내지 208로부터 선택되고/되거나;
iii) FR3이 서열번호 209 및 210으로부터 선택되고/되거나;
iv) FR4가 서열번호 211 및 212로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 31: 실시형태 3 내지 실시형태 30 중 어느 한 실시형태에 있어서, 사람화되고/되거나, 52번 및 53번 위치들(캐뱃 번호매김에 따름) 중 하나 이상에서 최적화된 서열인, 폴리펩타이드.
실시형태 32: 실시형태 31에 있어서, N52S 및 S53T 돌연변이들 중 하나 이상을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 33: 실시형태 3 내지 실시형태 32 중 어느 한 실시형태에 있어서, CDR2가 서열번호 214 내지 221로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 34: 실시형태 2 내지 실시형태 33 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 138 내지 140 또는 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 35: 실시형태 22 내지 실시형태 26 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 VHH 도메인이 상기 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진, 폴리펩타이드.
실시형태 36: 실시형태 2 내지 실시형태 35 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이, CX3CR1에 대한 서열번호 1 내지 120, 121 내지 140 및 222 내지 224의 면역글로불린 단일 가변 도메인들 중 하나 이상의 결합을 교차 차단하는, 폴리펩타이드.
실시형태 37: 실시형태 2 내지 실시형태 35 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 1 내지 120, 121 내지 140 및 222 내지 224의 아미노산 서열들 중 하나 이상에 의한 CX3CR1에 대한 결합이 교차 차단되는, 폴리펩타이드.
실시형태 38: 실시형태 2 내지 실시형태 37 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 39: 실시형태 38에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가, 상기 폴리펩타이드에 공유 결합되고, 상기 반감기 연장 모이어티가, 항-알부민-면역글로불린 도메인과 같은 알부민 결합 모이어티, 항-트랜스페린 면역글로불린 도메인과 같은 트랜스페린 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 사람 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민의 단편, 알부민 결합 펩타이드 또는 Fc 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 40: 실시형태 38 또는 실시형태 39에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 이루어진, 폴리펩타이드.
실시형태 41: 실시형태 40에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인, 사람화된 VHH 도메인, 낙타화된 VH 도메인, 도메인 항체, 단일 도메인 항체 및/또는 "dAb"로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 42: 실시형태 41에 있어서, 상기 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열번호 230 내지 232로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 43: 실시형태 2 내지 실시형태 39 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해, Fc 부분(예를 들면, 서열번호 252에 제시된 바와 같은 사람 Fc)에 연결되는, 폴리펩타이드.
실시형태 44: 실시형태 2 내지 실시형태 39 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해, 하나 이상의 불변 도메인(예를 들면, Fc 부분의 일부로서 사용되거나 Fc 부분을 형성하기 위해 사용될 수 있는 2개 또는 3개의 불변 도메인), Fc 부분 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드에 하나 이상의 이펙터 기능을 부여하고/하거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 부여할 수 있는, 하나 이상의 항체 부분, 단편 또는 도메인에 추가로 연결되는, 폴리펩타이드.
실시형태 45: 실시형태 2 내지 실시형태 37 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인, 바람직하게는 제2 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 46: 실시형태 45에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, 링커 펩타이드에 의해 공유 결합되는, 폴리펩타이드.
실시형태 47: 실시형태 45 또는 실시형태 46에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 4개의 프레임워크 영역들(FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역들(CDR1 내지 CDR3)로 필수적으로 이루어진, 폴리펩타이드.
실시형태 48: 실시형태 45 내지 실시형태 47 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이 항체 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 49: 실시형태 45 내지 실시형태 48 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, VH, VL, VHH, 낙타화된 VH, 또는 안정성, 효력, 제조가능성 및/또는 사람 프레임워크 영역과의 유사성에 대해 최적화된 VHH인, 폴리펩타이드.
실시형태 50: 실시형태 45 내지 실시형태 49 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인의 상기 CDR1 내지 CDR3이 실시형태 11 내지 실시형태 21 중 어느 한 실시형태에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 51: 실시형태 45 내지 실시형태 50 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, 동일한 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 52: 실시형태 51에 있어서, 상기 CDR3이 제11 내지 제13 실시형태 중 어느 한 실시형태에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 53: 실시형태 45 내지 실시형태 53 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 54: 실시형태 53에 있어서, 상기 CDR1 내지 CDR3이 실시형태 11 내지 실시형태 21 중 어느 하나에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 55: 실시형태 45 내지 실시형태 54 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, 동일한 VHH 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 56: 실시형태 45 내지 실시형태 55 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 VHH 도메인이 실시형태 22 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 제시되는, 폴리펩타이드.
실시형태 57: 서열번호 141, 164 및 186 또는 서열번호 141, 162 및 186에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 실시형태 2 내지 실시형태 37 중 어느 한 실시형태에 제시된 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
상기 폴리펩타이드는, 특히, 실시형태 45 내지 실시형태 56 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드일 수 있다.
실시형태 58: 실시형태 57에 있어서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 213, 214 및 186, 서열번호 213, 221 및 186, 또는 서열번호 141, 162 및 186에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 59: 실시형태 57 또는 실시형태 58에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 141, 164 및 186, 또는 서열번호 141, 162 및 186에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 60: 실시형태 57 또는 실시형태 58에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 213, 214 및 186, 서열번호 213, 221 및 186, 또는 서열번호 141, 162 및 186에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 61: 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 실시형태 2 내지 실시형태 37 중 어느 한 실시형태에 따른 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
상기 폴리펩타이드는, 특히, 실시형태 45 내지 실시형태 60 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드일 수 있다.
실시형태 62: 실시형태 61에 있어서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 121 내지 140 또는 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 63: 실시형태 61 또는 실시형태 62에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 64: 실시형태 63에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 121 내지 140 또는 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
실시형태 65: 실시형태 45 내지 실시형태 64 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 66: 실시형태 65에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가, 상기 폴리펩타이드에 공유 결합되고, 상기 반감기 연장 모이어티가, 항-알부민 면역글로불린 도메인과 같은 알부민 결합 모이어티, 항-트랜스페린 면역글로불린 도메인과 같은 트랜스페린 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 사람 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민의 단편, 알부민 결합 펩타이드 또는 Fc 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 67: 실시형태 66에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 이루어진, 폴리펩타이드.
실시형태 68: 실시형태 67에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인, 사람화된 VHH 도메인, 낙타화된 VH 도메인, 도메인 항체, 단일 도메인 항체 및/또는 "dAb"로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 69: 실시형태 68에 있어서, 상기 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열번호 230 내지 232로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 70: 실시형태 45 내지 실시형태 64 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해 Fc 부분(예를 들면, 서열번호 252에 제시된 바와 같은 사람 Fc)에 연결되는, 폴리펩타이드.
실시형태 71: 실시형태 45 내지 실시형태 66 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 하나 이상의 불변 도메인(예를 들면, Fc 부분의 일부로서 사용될 수 있거나 Fc 부분을 형성하기 위해 사용될 수 있는 2 또는 3개의 불변 도메인), Fc 부분 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드에 하나 이상의 이펙터 기능을 부여하고/하거나 임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 부여할 수 있는 하나 이상의 항체 부분, 단편 또는 도메인에 추가로 연결되는, 폴리펩타이드.
실시형태 72: 서열번호 225 내지 227 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 73: 서열번호 249 또는 277 내지 281 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 74: 서열번호 257 내지 262 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 75: 서열번호 253 또는 254 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 76: 서열번호 263 또는 266 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 77: 서열번호 267 내지 276 및 282 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
실시형태 78: 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는, 핵산 분자.
실시형태 79: 실시형태 78에 따른 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
실시형태 80: 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 지닌 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가, 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 발현할 수 있고, 상기 숙주 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인, 숙주 세포.
실시형태 81: (i) 활성 성분으로서 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드, 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체, 및 임의로 (iii) 희석제, 부형제, 애쥬번트 및/또는 안정화제를 포함하는, 약제학적 조성물.
실시형태 82: 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
- 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계[여기서, 상기 숙주 세포는, 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 지니고, 여기서, 상기 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다];
- 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계; 및
- 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 83: 특히, 사람에서의 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화를 위해 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 사용하는 방법.
실시형태 84: 실시형태 83에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가, CX3CR1-연관된 질환, 장애 또는 병태인, 방법.
실시형태 85: 실시형태 83에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 죽상 동맥경화증인, 방법.
실시형태 86: 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 주사가능한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이 사람에서 정맥내 또는 피하 주사용으로 적합한, 주사가능한 약제학적 조성물.
실시형태 87: CX3CR1과 연관된 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이, 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드의 약제학적 활성량을 필요로 하는 대상체에게 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드의 약제학적 활성량을 투여함을 포함하는, CX3CR1과 연관된 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법.
실시형태 88: 실시형태 85에 있어서, 스타틴, 항혈소판제, 항응고제, 항당뇨병제 및 항고혈압제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 추가의 치료학적 제제를 추가로 투여함을 포함하는, 방법.
실시형태 89: 포유동물 세포에서 프랙탈카인에 대한 CX3CR1의 결합을 억제하기 위한 방법으로서, 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 세포에 투여함을 포함하여 프랙탈카인에 의해 매개되는 신호 전달을 억제하는, 포유동물 세포에서 프랙탈카인에 대한 CX3CR1의 결합을 억제하기 위한 방법.
실시형태 90: 샘플을 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키고, 상기 폴리펩타이드와 CX3CR1의 결합을 검출함으로써 생물학적 샘플에서의 CX3CR1 수준을 검출하고/하거나 정량하기 위한 방법.
실시형태 91: CX3CR1-연관된 장애를 진단하거나 대상체가 CX3CR1-연관된 장애를 발병할 증가된 위험성을 갖는지를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법이, 대상체 유래의 생물학적 샘플을 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키고 CX3CR1에 대한 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하여 CX3CR1의 발현 또는 농도를 측정함을 포함하는, CX3CR1-연관된 장애를 진단하거나 대상체가 CX3CR1-연관된 장애를 발병할 증가된 위험성을 갖는지를 결정하기 위한 방법.
실시형태 92: 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 있어서, 사람에서의 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화에 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
실시형태 93: 실시형태 92에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가, CX3CR1-연관된 질환, 장애 또는 병태인, 폴리펩타이드.
실시형태 94: 실시형태 92에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura) 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 또는 암으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
실시형태 95: 실시형태 92에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 죽상 동맥경화증인, 폴리펩타이드.
실시형태 96: 사람에서의 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화용 의약을 제조하기 위한, 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드의 용도.
실시형태 97: 실시형태 87에 있어서, 상기 질환 또는 장애가, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 또는 암으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 98: 실시형태 87에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 죽상 동맥경화증인, 방법.
실시형태 99: 실시형태 1 내지 실시형태 77 중 어느 한 실시형태에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 용도를 포함하는, 진단 키트 또는 진단 방법.
실시형태 100: 실시형태 99에 있어서, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증 또는 암 중 하나 이상을 진단하기 위한, 진단 키트 또는 진단 방법.
정의
본 발명의 상기 및 다른 양상 및 실시형태는 본원의 추가의 기재로부터 명백해질 것이고, 여기서:
a) 달리 나타내거나 정의되지 않는 경우, 사용된 모든 용어는 당업자에게 명백할 것인, 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들면, 표준 핸드북[예를 들면, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), 및 Roitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)] 및 본원에 인용된 일반 배경 기술 문헌을 참조한다. 추가로, 달리 나타내지 않는 경우, 상세히 구체적으로 기재되어 있지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은, 당업자에게 명백할 것인 바와 같이 공지되어 있는 방식 자체로 수행될 수 있고 공지되어 있는 방식 자체로 수행되었다. 예를 들면, 표준 핸드북, 상기 언급된 일반적 배경 기술 문헌 및 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조한다.
b) 달리 나타내지 않는 경우, 용어 "면역글로불린" 및 "면역글로불린 서열"은, 본원에서 중쇄 항체를 언급하거나 종래의 4-쇄 항체를 언급하기 위해 사용되든지간에 상관없이, 완전한 크기의 항체, 이의 개별 쇄 및 이의 모든 부분, 도메인 또는 단편들(각각 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인과 같은 항원-결합 도메인 또는 단편들을 포함하지만 이들에 제한되지 않음) 모두를 포함하는 일반 용어로서 사용된다. 추가로, 본원에 사용된 용어 "서열"(예를 들면, "면역글로불린 서열", "항체 서열", (단일) 가변 도메인 서열", "VHH 서열", 또는 "단백질 서열"에서와 같은 용어에서)은, 문장이 보다 제한된 해석을 요구하지 않는 경우, 일반적으로 관련 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.
c) 본원에 사용된 용어 (폴리펩타이드 또는 단백질의) "도메인"은, 단백질의 나머지 부분과는 무관하게 이의 3차원 구조를 보유하는 능력을 갖는 폴딩된 단백질 구조를 말한다. 일반적으로, 도메인은, 단백질의 별개의 기능적 성질에 관여하고, 다수의 경우에 단백질의 나머지 부분의 및/또는 도메인의 기능 상실 없이 부가되거나, 제거되거나, 다른 단백질로 전이될 수 있다.
d) 본원에 사용된 용어 "면역글로불린 도메인"은 항체 쇄의 구형 영역(예를 들면, 종래의 4-쇄 항체 또는 중쇄 항체의 쇄와 같음) 또는 상기 구형 영역으로 필수적으로 이루어진 폴리펩타이드를 말한다. 면역글로불린 도메인은, 이들이, 보존된 디설파이드 결합에 의해 임의로 안정화된, 2개의 베타-시트로 배열된 약 7개의 역평행 베타-가닥의 2층 샌드위치로 이루어지는, 항체 분자들의 특징인 면역글로불린 폴드(fold)를 보유함을 특징으로 한다.
e) 본원에 사용된 용어 "면역글로불린 가변 도메인"은, 당업계 및 하기 본원에서 각각 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로서 나타내는 4개의 "프레임워크 영역"들로 필수적으로 이루어진 면역글로불린 도메인을 의미하고; 상기 프레임워크 영역들에는, 당업계에서 및 하기 본원에서 각각 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"로서 나타내는 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이 개재되어 있다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반 구조 또는 서열은 하기와 같이 나타낼 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 이것은 항원-결합 부위를 가짐으로써 항체에 항원에 대한 특이성을 부여하는 면역글로불린 가변 도메인이다.
f) 본원에 사용된 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 및 "단일 가변 도메인"은, 추가의 가변 면역글로불린 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명의 의미에서 면역글로불린 단일 가변 도메인의 한 예는, 면역글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL(VH 도메인 및 VL 도메인)과 같은 "도메인 항체"이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 다른 예는 본원에서 이후 정의된 바와 같은 낙타 유래의 "VHH 도메인"(또는 단순히 "VHH")이다.
상기 정의의 관점에서, 종래의 4-쇄 항체(예를 들면, 당업계에 공지되어 있는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자) 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 예를 들면, 디설파이드 연결된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 상기 종래의 4-쇄 항체로부터 유도된 디아바디(모두 당업계에 공지되어 있음)의 항원-결합 도메인은, 통상적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 간주되지 않고, 그 이유는, 이들 경우에, 항원의 각각의 에피토프에 대한 결합이 통상적으로 하나의(단일) 면역글로불린 도메인에 의해 발생하지 않고 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 한쌍의 (연합) 면역글로불린 도메인, 즉, 함께 각각의 항원의 에피토프에 결합하는 VH-VL 쌍의 면역글로불린 도메인에 의해 발생하기 때문이다.
f1) VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로서도 공지되어 있는 "VHH 도메인"은, 본래 "중쇄 항체"의(즉, "경쇄가 없는 항체"의; 문헌 참조: Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)) 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로서 기재되었다. 상기 용어 "VHH 도메인"은, 종래의 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(본원에서 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"으로서 언급됨) 유래의 및 종래의 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(본원에서 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"으로서 언급됨) 유래의 상기 가변 도메인을 구분하기 위해 선택되었다. VHH 도메인은 (에피토프가 VH 도메인과 더불어 VL 도메인에 의해 인식되는 종래의 4-쇄 항체에서의 VH 또는 VL 도메인과 대비되는) 추가의 항원 결합 도메인없이 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. VHH 도메인은, 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성된 작고 강력하면서 효율적인 항원 인식 단위이다.
본 발명과 관련하여, 상기 용어 VHH 도메인, VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, VHH 항체, 및 "Nanobody®" 및 "Nanobody® 도메인"("Nanobody"는 제조원(company Ablynx N.V.; Ghent; Belgium)의 상표명이다)은 상호교환적으로 사용되고, 면역글로불린 단일 가변 도메인(구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 갖고, 제2 면역글로불린 가변 도메인의 존재를 요구하지 않으면서 에피토프에 특이적으로 결합함)을 대표하고, 이는, 예를 들면, WO2009/109635, 도 1에 정의된 바와 같이 소위 "홀마크 잔기"에 의해 VH 도메인과는 구분된다.
VHH 도메인의 아미노산 잔기는, 예를 들면, 문헌[참조: Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231 , 25-38 (1999)]의 도 2에 나타낸 바와 같이 낙타 유래의 VHH 도메인에 적용되는 캐뱃 등("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)에 의해 주어진 VH 도메인에 대한 일반적인 번호매김에 따라 번호가 매겨진다. 상기 번호매김에 따르면,
- FR1은 1번 내지 30번 위치에 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR1은 31번 내지 35번 위치에 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR2는 36번 내지 49번 위치에 아미노산을 포함하고,
- CDR2는 50번 내지 65번 위치에 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR3은 66번 내지 94번 위치에 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR3은 95번 내지 102번 위치에 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR4는 103번 내지 113번 위치에 아미노산 잔기를 포함한다.
그러나, VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 널리 공지된 바와 같이 CDR 각각에서의 아미노산 잔기들의 총 수는 다양할 수 있고, 캐뱃 번호매김에 의해 나타낸 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있음에 주의해야 한다(즉, 캐뱃 번호매김에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서는 존재하지 않을 수 있거나, 실제 서열은 캐뱃 번호매김에 의해 허용되는 수보다 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이것은, 일반적으로, 캐뱃에 따른 번호매김이 실제 서열에서의 아미노산 잔기의 실제 번호매김에 상응하거나 상응하지 않을 수 있음을 의미한다.
VH 도메인의 아미노산 잔기를 번호매기는 대안의 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이 방법은, 또한, VHH 도메인에 유사한 방식으로 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 특허청구범위 및 도면에서 달리 나타내지 않는 경우에, 캐뱃에 따르고 상기된 바와 같이 VHH 도메인에 적용되는 번호매김에 따를 것이다.
VHH 도메인에서 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110개 내지 120개 범위 내일 수 있고, 흔히 112개 내지 115개이다. 그러나, 보다 작고 보다 긴 서열이, 또한, 본원에 기술된 목적에 적합할 수 있음에 주의해야 한다.
VHH 도메인 및 상기 도메인을 함유하는 폴리펩타이드의 추가의 구조적 특징 및 기능적 성질은 하기와 같이 요약될 수 있다:
VHH 도메인(경쇄 가변 도메인의 존재 없이 및 경쇄 가변 도메인과의 임의의 상호작용없이 항원에 기능적으로 결합하도록 본래 "고안"되었음)은, 단일의 비교적 작은 기능적 항원-결합 구조 단위, 도메인 또는 폴리펩타이드로서 기능할 수 있다. 이것은, 자체로서는 단일 항원-결합 단백질 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 실제 적용에 일반적으로 적합하지 않지만 기능성 항원-결합 단위(예를 들면, VL 도메인에 공유 결합된 VH 도메인으로 이루어진 scFv 단편에서, Fab 단편과 같은 종래의 항체 단편에서와 같음)를 제공하기 위해 일부 형태 또는 다른 형태로 조합될 필요가 있는, 종래의 4-쇄 항체의 VH 및 VL 도메인과 VHH 도메인을 구분한다.
이들의 고유한 성질 때문에, 단독으로 또는 보다 큰 폴리펩타이드의 일부로서의 VHH 도메인의 사용은, 종래의 VH 및 VL 도메인, scFv 또는 종래의 항체 단편(예를 들면, Fab- 또는 F(ab')2 단편)의 사용보다 다수의 상당한 이점을 제공한다:
- 높은 친화성 및 높은 선택성으로 항원에 결합하는데 단일 도메인만이 요구되어, 2개의 별도의 도메인이 존재할 필요가 없고, 이들 2개의 도메인이 올바른 공간 입체구조 및 입체배치로 존재함을 확실하게 할(즉, scFv와 함께 특별히 고안된 링커의 사용을 통함) 필요도 없다;
- VHH 도메인은 단일 유전자로부터 발현될 수 있고, 임의의 번역-후 폴딩 또는 변형도 요구하지 않는다;
- VHH 도메인은, 다가 및 다특이적 포맷(본원에 추가로 논의된 바와 같음)으로 용이하게 가공될 수 있다;
- VHH 도메인은 고도로 가용성이고 응집하는 경향을 갖지 않는다[문헌(Ward et al., Nature 341:544-546 (1989))에 기술된 마우스-유도된 항원-결합 도메인에서와 같음);
- VHH 도메인은 열, pH, 프로테아제 및 다른 변성제 또는 조건에 고도로 안정하고, 따라서, 냉각 장비를 사용하지 않고 제조하거나 저장하거나 수송할 수 있어, 비용, 시간 및 환경적 절감을 유도한다.
- VHH 도메인은, 심지어 생산에 요구되는 규모로도 제조하기가 용이하고 비교적 저렴하다. 예를 들면, VHH 도메인 및 이를 함유하는 폴리펩타이드는, 미생물 발효를 사용하여 생산될 수 있고(예를 들면, 하기에 추가로 기술되는 바와 같음), 예를 들면, 종래의 항체 단편을 이용하는 경우와 같이 포유동물 발현 시스템의 사용을 필요로 하지 않는다;
- VHH 도메인은 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편과 비교하여 비교적 소형(대략 15kDa, 또는 종래의 IgG 보다 10배 작음)이고, 따라서,
-- 조직으로의 (보다) 높은 침투를 나타내고
-- 상기 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편보다 더욱 고용량으로 투여될 수 있다;
- VHH 도메인은 소위 공동(cavity)-결합 성질(특히, 종래의 VH 도메인과 비교하여 이들의 연장된 CDR3 루프로 인함)을 나타낼 수 있고, 따라서, 또한, 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편이 접근할 수 없는 표적 및 에피토프에 접근할 수 있다.
특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH 도메인을 수득하기 위한 방법은, 보다 일찍이, 예를 들면, WO2006/040153 및 WO2006/122786에 기재되어 있다. 또한, 본원에서 상세히 기재된 바와 같이, 낙타로부터 유도된 VHH 도메인은, 본래 VHH 서열의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람 유래의 종래의 4-쇄 항체 유래의 VH 도메인에서 상응하는 위치(들)에 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 "사람화"될 수 있다. 사람화된 VHH 도메인은 하나 이상의 완전한 사람 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 보다 더 구체적인 실시형태에서, 임의로 JH5와 같은 JH 서열과 조합된 DP-29, DP-47, DP-51, 또는 이의 일부로부터 유도된 사람 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다.
f2) 또한, "Dab", "도메인 항체" 및 "dAb"(상기 용어 "도메인 항체" 및 "dAb"는 GlaxoSmithKline에 의한 상표로서 사용되고 있다)로서도 공지되어 있는 "도메인 항체"는, 예를 들면, 문헌[참조: Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21 (11): 484-490 (2003); 및 WO2003/002609]에 기재되어 있다.
도메인 항체는 필수적으로 비-낙타 포유동물, 특히, 사람 4-쇄 항체의 VH 또는 VL 도메인에 상응한다. 단일 항원 결합 도메인으로서, 즉, 각각 VL 또는 VH 도메인과 쌍을 이루지 않고 에피토프에 결합하기 위해서는, 예를 들면, 사람 단일 VH 또는 VL 도메인 서열의 라이브러리를 사용함으로써 상기 항원 결합 성질에 대한 특이적 선택이 요구된다. 도메인 항체는 VHH와 같이 분자량이 대략 13 내지 대략 16kDa이고, 완전한 사람 서열로부터 유도되는 경우, 예를 들면, 사람에서의 치료학적 용도를 위한 사람화를 요구하지 않는다. VHH 도메인의 경우에서와 같이, 이들은, 또한, 원핵 발현 시스템에서도 잘 발현되어 전체 제조 비용을 상당히 감소시킨다.
도메인 항체, 및 VHH 도메인은, 각각의 모 분자와 비교하여 이의 각각의 항원에 대해 수득한 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화성을 개선시키는 하나 이상의 변형을 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열에 도입함으로써, 친화성 성숙될 수 있다. 본 발명의 친화성-성숙된 면역글로불린 단일 가변 도메인 분자는 예를 들면, 문헌[참조: Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, 또는 Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996]에 기술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
f3) 추가로, 또한, 사람 스캐폴드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 "스캐폴드" 상에 상기 언급된 CDR들 중 하나 이상을 "절편이식"할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 적합한 스캐폴드 및 상기 CDR 절편이식을 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
g) 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "에피토프" 및 "항원 결정 인자"는, 종래의 항체 또는 본 발명의 폴리펩타이드와 같은 항원-결합 분자에 의해, 그리고 보다 구체적으로는 상기 분자의 항원-결합 부위에 의해 인식되는, 폴리펩타이드와 같은 거대 분자의 부분을 말한다. 에피토프는 면역글로불린에 대한 최소 결합 부위를 의미하고, 따라서 면역글로불린의 특이성의 표적을 나타낸다.
에피토프를 인식하는 항원-결합 분자(예를 들면, 종래의 항체 또는 본 발명의 폴리펩타이드)의 부분은 파라토프라고 칭한다.
h) 본원에 사용된 용어 "바이파라토픽" (항원-) 결합 분자 또는 본원에 사용된 "바이파라토픽" 폴리펩타이드는, 본원에 정의된 바와 같은 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하고, 여기서, 이들 2개의 가변 도메인은 하나의 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 에피토프는 통상적으로 하나의 단일특이적 면역글로불린, 예를 들면, 종래의 항체 또는 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인에 의해 동시에 결합되지 않는다. 바이파라토픽 폴리펩타이드는, 상이한 에피토프 특이성들을 갖는 가변 도메인들로 구성될 수 있고, 동일한 에피토프에 결합하는 상호 상보성 가변 도메인 쌍을 함유하지 않는다. 따라서, 상기 2개의 가변 도메인은 상기 표적에 결합하기 위해 서로 경쟁하지 않는다.
i) 소정 에피토프, 항원 또는 단백질(또는 이들의 적어도 한 부분, 단편 또는 에피토프)에 "결합" 또는 "특이적으로 결합"할 수 있고/있거나, 이에 대해 "친화성을 갖고/갖거나", "특이성을 갖는" 폴리펩타이드(예를 들면, 본 발명의 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩타이드, 또는 일반적으로 이의 항원 결합 분자 또는 단편)은, 상기 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대한" 또는 "대해 지시되는" 것으로 일컬어지거나, "항"-에피토프, "항"-항원 또는 "항"-단백질(예를 들면, 항-CX3CR1)로 일컬어진다.
k) 일반적으로, 상기 용어 "특이성"은, 특정 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질(예를 들면, 본 발명의 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 폴리펩타이드)이 결합할 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 에피토프의 수를 말한다. 항원-결합 단백질의 특이성은 이의 친화성 및/또는 결합 활성을 기초로 측정할 수 있다. 항원-결합 단백질과 항원의 해리에 대한 평형 상수(KD)로 나타내는 친화성은, 에피토프와 항원-결합 단백질 상의 항원-결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 척도이다: KD 값이 적을수록 에피토프와 항원-결합 분자 사이의 결합 강도는 보다 강하다(대안으로, 친화성은, 또한, 친화성 상수(KA), 1/KD로 표현될 수 있다). 당업자에게 명백할 것인 바와 같이(예를 들면, 본원의 추가의 기재를 기초하여), 친화성은 목적하는 특이적 항원에 따라 공지되어 있는 방식 자체로 측정할 수 있다. 결합 활성은 항원-결합 분자(예를 들면, 본 발명의 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 폴리펩타이드)와 적절한 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합 활성은, 에피토프와 항원 결합 분자 상의 이의 항원-결합 부위 사이의 친화성, 및 항원-결합 분자 상에 존재하는 적절한 결합 부위 둘 다와 관련된다.
l) 아미노산 잔기는, 일반적으로 당업계에 공지되어 있고 협의되어 있는 바와 같이, 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 나타낼 것이다. 2개의 아미노산 서열을 비교하는 경우, 용어 "아미노산 차이"는, 제2 서열과 비교하여, 표준 서열의 위치에서 지적된 수의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 말한다. 치환(들)의 경우에, 상기 치환(들)은 바람직하게 보존성 아미노산 치환(들)일 것이고, 이는, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미하고, 이는 폴리펩타이드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 성질에 거의 또는 필수적으로 어떠한 영향도 갖지 않는다. 상기 보존성 아미노산 치환은 당업계에, 예를 들면, WO 98/49185에 익히 공지되어 있고, 여기서, 보존성 아미노산 치환은, 바람직하게는 하기의 그룹 (i) 내지 (v) 내에 아미노산이, 동일한 그룹 내의 다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (i) 소형 지방족, 비극성 또는 약간의 극성 잔기들: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (ii) 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 (비하전된) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (iii) 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (iv) 대형 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (v) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존성 아미노산 치환은 다음과 같다:
Ala의 Gly 또는 Ser로의 치환;
Arg의 Lys로의 치환;
Asn의 Gln 또는 His로의 치환;
Asp의 Glu로의 치환;
Cys의 Ser로의 치환;
Gln의 Asn으로의 치환;
Glu의 Asp로의 치환;
Gly의 Ala 또는 Pro로의 치환;
His의 Asn 또는 Gln으로의 치환;
Ile의 Leu 또는 Val로의 치환;
Leu의 Ile 또는 Val로의 치환;
Lys의 Arg, Gln 또는 Glu로의 치환;
Met의 Leu, Tyr 또는 Ile로의 치환;
Phe의 Met, Leu 또는 Tyr로의 치환;
Ser의 Thr로의 치환;
Thr의 Ser로의 치환;
Trp의 Tyr로의 치환;
Tyr의 Trp 또는 Phe로의 치환;
Val의 Ile 또는 Leu로의 치환.
m) 핵산 또는 폴리펩타이드 분자는, 예를 들면, 이것이 수득된 이의 고유 생물학적 공급원 및/또는 반응 매질 또는 배양 배지와 비교한 경우, 이것이 상기 공급원 또는 매질 중에서 연합되어 있는 하나 이상의 다른 구성성분, 예를 들면, 다른 핵산, 다른 단백질/폴리펩타이드, 다른 생물학적 구성성분 또는 거대분자 또는 하나 이상의 오염물, 불순물 또는 최소 성분으로부터 분리된 경우, "필수적으로 분리된 (형태)"인 것으로 간주된다. 특히, 핵산 또는 폴리펩타이드 분자는, 이것이 적어도 2배, 특히, 적어도 10배, 보다 구체적으로 적어도 100배 및 1000배 이상으로 정제된 경우 "필수적으로 분리된" 것으로 간주된다. "필수적으로 분리된 형태"인 핵산 또는 폴리펩타이드 분자는, 적합한 크로마토그래피 기술, 예를 들면, 폴리아크릴아미드-겔 전기영동을 사용한 측정시, 바람직하게는 필수적으로 균일하다;
n) 예를 들면, 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인 서열 사이의 "서열 동일성"은, 상기 2개의 서열 사이에 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 이것은 WO08/020079의 49페이지 및 50페이지의 문단 f)에 기술된 바와 같이 계산되거나 측정될 수 있다. "서열 유사성"은, 동일하거나 보존성 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 %를 나타낸다.
표적 특이성
본 발명의 폴리펩타이드는 사람 CX3CR1에 대해 특이성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 사람 CX3CR1(서열번호 255)에 결합한다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 또한, 사이노몰거스 CX3CR1(서열번호 256)에 결합한다.
본 발명의 폴리펩타이드
본 발명은, CX3CR1 연관된 질환, 장애 또는 병태, 예를 들면, 심혈관 질환의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단을 위한 신규한 약제학적 활성 제제를 제공한다. 특히, 본 발명은, 사람 CX3CR1에 결합하여 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있는 폴리펩타이드를 제공한다. 한 양상에서, 상기 폴리펩타이드는, 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는 면역글로불린이고, 여기서, 상기 면역글로불린은, 사람 CX3CR1에 결합하여 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있다. 추가의 양상에서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기의 성질들 중 하나 이상을 특징으로 한다:
· 세포 결합 FACS로 측정시, 예를 들면, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 EC50으로, 사람 CX3CR1에 고친화성으로 결합한다;
· 예를 들면, 300nM 이하, 100nM 이하, 20nM 이하, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로, 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단한다;
· 예를 들면, 500nM 이하, 100nM 이하, 75nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하 또는 5nM 이하의 IC50으로, 사람 CX3CR1에 의해 매개되는 프랙탈카인 유도된 주화성을 억제하고; 상기 수득된 억제 효능은 15% 이상, 50% 이상, 80% 이상, 또는 95% 이상이다;
· 예를 들면, 10nM 이하 또는 5nM 이하의 IC50으로, 사람 CX3CR1에 의해 매개되는 프랙탈카인 유도된 내재화를 억제한다;
· 예를 들면, 결합 및 기능적 억제에 대해 사람 CX3CR1에 대한 E/IC50의 10배 이내에서 사이노몰거스 CX3CR1와 교차 반응한다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 반감기 연장 모이어티, 예를 들면, 알부민 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자 또는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은 링커 펩타이드에 의해 공유 결합된다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드에서 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드에서 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 반감기 연장 모이어티, 예를 들면, 알부민 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자 또는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 제1 링커 펩타이드에 의해 알부민 결합 모이어티에 공유 결합된 제1 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 알부민 결합 모이어티는 제2 링커 펩타이드에 의해 제2 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 추가로 공유 결합된다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 링커 펩타이드에 의해 Fc 도메인에 공유 결합된 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 링커 펩타이드에 의해 Fc 도메인에 공유 결합된 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 상기 폴리펩타이드는, 예를 들면, 디설파이드 가교를 통해 이량체로서 제공된다.
본 발명에 따른 폴리렙타이드는 하기에 기술되는 바와 같이 수득한다. 요약하면, 본 발명의 단일 가변 도메인은, 사람 CX3CR1을 암호화하는 DNA로 면역화된 라마로부터 유도된 단일 가변 도메인(VHH)을 발현하는 라이브러리로부터 동정되었다. 상기 파지 라이브러리는 hCX3CR1 바이러스 지질 입자 상에 패닝시키고, 결합 파지는, 알렉사플루오르 표지된 프랙탈카인(AF-FKN)과 결합하는 수용체와 경쟁하는 이들의 능력에 대해 스크리닝하였다. 본 발명의 대표적인 단일 가변 도메인은 본원에서 추가로 상세하게 기재된다.
한 양상에서, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 필수적으로, 4개의 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 및 3개의 상보적 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3)로 이루어진다. 특히, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 구조 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4를 갖는다. 한 양상에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 도메인이다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은, 서열번호 197에 제시된 Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5의 아미노산 서열을 갖고, 여기서:
- Xaa1은 Pro, Ala 또는 Gly이고;
- Xaa2는 Asp 또는 Asn이고;
- Xaa3은 Thr 또는 Ser이고;
- Xaa4는 Arg, Lys, Ala 또는 Gly이고;
- Xaa5는 Tyr 또는 Phe이다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은, 서열번호 197에 제시된 Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5의 아미노산 서열을 갖고, 여기서:
- Xaa1은 Pro, Ala 또는 Gly이고;
- Xaa2는 Asp 또는 Asn이고;
- Xaa3은 Thr이고;
- Xaa4는 Arg 또는 Lys이고;
- Xaa5는 Tyr이다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은, 서열번호 186에 제시된 Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은 하기의 CDR1 , CDR2 및 CDR3을 갖는다:
- CDR1은,
a) GSIFSSNAMA (서열번호 141)의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 141의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 141의 아미노산 서열과 2개 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열[여기서,
- 2번 위치에서, S가 T 또는 G로 변화되어 있고/있거나,
- 6번 위치에서, S가 R로 변화되어 있고/있거나,
- 7번 위치에서, N이 T로 변화되어 있고/있거나,
- 9번 위치에서, M이 K로 변화되어 있다)]을 갖거나, 또는
d) 서열번호 141 내지 145 및 213 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
- CDR2는,
a) GINSVGITK (서열번호 164)의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 164의 아미노산 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 164의 아미노산 서열과 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열[여기서,
1번 위치에서, G가 A, L, V 또는 S로 변화되어 있고/있거나;
3번 위치에서, N이 D, S, Q, G 또는 T로 변화되어 있고/있거나;
4번 위치에서, S가 T, K, G 또는 P로 변화되어 있고/있거나;
5번 위치에서, V가 A로 변화되어 있고/있거나;
6번 위치에서, G가 D로 변화되어 있고/있거나;
7번 위치에서, I가 T 또는 V로 변화되어 있고/있거나;
8번 위치에서, T가 A로 변화되어 있고/있거나;
9번 위치에서, K가 R로 변화되어 있다]을 갖거나; 또는
d) 서열번호 162 내지 175 및 214 내지 221 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
- CDR3은,
a) DPRRGWDTRY (서열번호 186)의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 186의 아미노산 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나;
c) 서열번호 186의 아미노산 서열과 3, 2 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열[여기서,
- 2번 위치에서, P가 A 또는 G로 변화되고/되거나;
- 7번 위치에서, D가 N으로 변화되고/되거나;
- 9번 위치에서, R이 K로 변화되어 있다]을 갖거나; 또는
d) 서열번호 186 내지 190 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은 하기의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖고, 여기서,
- 상기 CDR1은 GRTFSSYAMG (서열번호 146)의 아미노산 서열을 갖고;
- 상기 CDR2는, a) GISGSASRKY (서열번호 176)의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖거나, b) 서열번호 176 또는 177의 아미노산 서열을 갖는, 아미노산 서열을 갖고;
- 상기 CDR3은 SNSYPKVQFDY (서열번호 191)의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은 하기의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖고, 여기서,
- 상기 CDR1은,
a) GTIFSNNAMG (서열번호 147)의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 147의 아미노산 서열과 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열[여기서,
- 1번 위치에서, G가 K, R 또는 A로 변화되고/되거나;
- 2번 위치에서, T가 I, P, S 또는 L로 변화되고/되거나;
- 3번 위치에서, I가 V 또는 T로 변화되고/되거나;
- 4번 위치에서, F가 L로 변화되고/되거나;
- 5번 위치에서, S가 R 또는 D로 변화되고/되거나;
- 6번 위치에서, N이 S, T 또는 D변화되고/되거나;
- 7번 위치에서, N이 T 또는 Y로 변화되어 있다]을 갖거나; 또는
c) 서열번호 147 내지 161 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
- 상기 CDR2는,
a) SISNSGSTN (서열번호 179)의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 179의 아미노산 서열과 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열[여기서,
- 3번 위치에서, S가 T 또는 G로 변화되고/되거나;
- 4번 위치에서, N이 S 또는 I로 변화되고/되거나;
- 5번 위치에서, S가 T로 변화되고/되거나;
- 6번 위치에서, G가 Y로 변화되고/되거나;
- 8번 위치에서, T가 A로 변화되어 있다]을 갖거나; 또는
c) 서열번호 178 내지 185 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
- 상기 CDR3은,
a) DARRGWNTAY (서열번호 192)의 아미노산 서열을 갖거나;
b) 서열번호 192의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖거나; 또는
c) 서열번호 192의 아미노산 서열과 2 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열[여기서,
- 2번 위치에서, A가 G로 변화되고/되거나;
- 8번 위치에서, T가 S로 변화되고/되거나;
- 9번 위치에서, A가 G로 변화되고/되거나;
- 10번 위치에서, Y가 F로 변화되어 있다]을 갖거나; 또는
d) 서열번호 192 내지 196 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은 하기의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다:
- 각각 서열번호 141, 162 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 163 및 187; 또는
- 각각 서열번호 141, 164 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 166 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 167 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 167 및 189; 또는
- 각각 서열번호 141, 168 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 168 및 187; 또는
- 각각 서열번호 141, 169 및 190; 또는
- 각각 서열번호 141, 170 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 171 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 174 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 175 및 187; 또는
- 각각 서열번호 142, 165 및 188; 또는
- 각각 서열번호 142, 173 및 188; 또는
- 각각 서열번호 143, 164 및 186; 또는
- 각각 서열번호 144, 172 및 187; 또는
- 각각 서열번호 145, 172 및 187; 또는
- 각각 서열번호 141, 214 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 215 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 216 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 217 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 218 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 219 및 186; 또는
- 각각 서열번호 141, 220 및 186; 또는
- 각각 서열번호 213, 221 및 186; 또는
- 각각 서열번호 213, 214 및 186.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은 하기의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다:
- 각각 서열번호 146, 176 및 191; 또는
- 각각 서열번호 146, 177 및 191.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은 하기의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다:
- 각각 서열번호 147, 178 및 192;
- 각각 서열번호 147, 179 및 192;
- 각각 서열번호 147, 179 및 194;
- 각각 서열번호 148, 179 및 193;
- 각각 서열번호 149, 179 및 192;
- 각각 서열번호 149, 180 및 192;
- 각각 서열번호 149, 181 및 192;
- 각각 서열번호 149, 183 및 192;
- 각각 서열번호 149, 185 및 192;
- 각각 서열번호 150, 179 및 194;
- 각각 서열번호 150, 182 및 194;
- 각각 서열번호 151, 179 및 193;
- 각각 서열번호 151, 182 및 194;
- 각각 서열번호 151, 184 및 196;
- 각각 서열번호 152, 179 및 195;
- 각각 서열번호 153, 179 및 194;
- 각각 서열번호 154, 182 및 194;
- 각각 서열번호 155, 179 및 195;
- 각각 서열번호 156, 181 및 192;
- 각각 서열번호 157, 179 및 194;
- 각각 서열번호 158, 179 및 192;
- 각각 서열번호 159, 178 및 192;
- 각각 서열번호 160, 179 및 194; 또는
- 각각 서열번호 161, 179 및 194.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은,
- 서열번호 141, 164 및 186; 또는
- 서열번호 141, 162 및 186에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 도메인은,
- 서열번호 213, 214 및 186;
- 서열번호 213, 221 및 186; 또는
- 서열번호 141, 162 및 186에 제시된 CDR2 및 CDR3을 갖는다.
상기 기술된 CDR을 갖는 본 발명의 대표적인 폴리펩타이드는 표 1, 표 2, 표 3(각각 패밀리 101, 9 및 13의 대표적인 폴리펩타이드) 및 표 4(패밀리 101의 최적화된 변이체의 대표적인 폴리펩타이드)에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
*CDR 서열은 문헌[Konetermann & Dubel에 의한 Antibody Engineering, vol 2 (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010]에 따라 결정하였다. 표에서의 서열번호(SEQ)는 본 출원의 서열목록에서의 서열을 말한다.
[표 2]
Figure pct00004
*CDR 서열은 문헌[Konetermann & Dubel에 의한 Antibody Engineering, vol 2 (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010]에 따라 결정하였다. 표에서의 서열번호(SEQ)는 본 출원의 서열목록에서의 서열을 말한다.
[표 3]
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
*CDR 서열은 문헌[Konetermann & Dubel에 의한 Antibody Engineering, vol 2 (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010]에 따라 결정하였다. 표에서의 서열번호(SEQ)는 본 출원의 서열목록에서의 서열을 말한다.
[표 4]
Figure pct00009
Figure pct00010
*CDR 서열은 문헌[Konetermann & Dubel에 의한 Antibody Engineering, vol 2 (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010]에 따라 결정하였다. 표에서의 서열번호(SEQ)는 본 출원의 서열목록에서의 서열을 말한다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 하나 이상의 VHH 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명의 VHH 도메인은,
a) 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는
b) 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
c) 서열번호 3의 아미노산 서열과 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 1 내지 48, 서열번호 121 내지 140 또는 서열번호 222-224 중 어느 하나의 아미노산 서열
에 제시된 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어진다.
추가의 양상에서, 본 발명의 VHH 도메인은,
a) 서열번호 49의 아미노산 서열; 또는
b) 서열번호 49의 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
c) 서열번호 49의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 49 내지 52 중 어느 하나의 아미노산 서열
에 제시된 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어진다.
추가의 양상에서, 본 발명의 VHH 도메인은,
a) 서열번호 67의 아미노산 서열; 또는
b) 서열번호 67의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
c) 서열번호 67의 아미노산 서열과 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는
d) 서열번호 53 내지 120 중 어느 하나의 아미노산 서열
에 제시된 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어진다.
추가의 양상에서, 본 발명의 VHH 도메인은, 서열번호 121 내지 140 또는 서열번호 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어진다.
추가의 양상에서, 본 발명의 VHH 도메인은 서열번호 138 내지 140 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어진다.
추가의 양상에서, 본 발명의 VHH 도메인은 서열번호 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어진다.
본 발명의 대표적인 VHH 도메인은 표 5에 나타내고, 본 발명의 대표적인 최적화된 VHH 도메인은 하기 표 6에 나타낸다:
[표 5]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
[표 6]
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
추가의 양상에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 사람화되고/되거나, 안정성, 효력, 제조가능성 및/또는 사람 프레임워크 영역과의 유사성에 대해 최적화된다. 예를 들면, 상기 폴리펩타이드는, 사람화되고/되거나, 하기의 위치(캐뱃 번호매김에 따름) 1, 11, 14, 16, 74, 83, 및 108번 중 하나 이상에서 최적화된 서열이다. 한 양상에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 돌연변이들 중 하나 이상을 포함한다: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.
한 양상에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 하나 이상의 프레임워크 영역, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 사람화되고/되거나, 최적화된 서열이다. 한 양상에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 예를 들면, 하기에 제시된 바와 같은 프레임워크 영역(FR)을 포함한다:
i) FR1은 서열번호 198 내지 204 중 어느 하나로부터 선택되고/되거나;
ii) FR2는 서열번호 205 내지 208 중 어느 하나로부터 선택되고/되거나;
iii) FR3은 서열번호 209 내지 210 중 어느 하나로부터 선택되고/되거나;
iv) FR4는 서열번호 211 내지 212 중 어느 하나로부터 선택된다.
상기 기술된 바와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대한 프레임워크 영역 서열로서도 사용될 수 있는 사람 면역글로불린 프레임워크 영역 서열(FR)이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 사람 이외의 종으로부터 유도된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 프레임워크 영역을 사람화하기 위한 방법도 당업계에 공지되어 있다.
추가의 양상에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 하나 이상의 CDR 영역, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 사람화되고/되거나, 최적화된 서열이다. 한 양상에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 사람화되고/되거나, 하기의 위치(캐뱃 번호매김에 따름): 52 및 53 중 하나 이상에서 최적화된 서열이다.
추가의 양상에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하기의 돌연변이들 중 하나 이상을 포함한다: N52S, S53T.
추가의 양상에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 서열번호 214 내지 221 중 어느 하나로부터 선택되는 CDR2를 포함한다.
본 발명의 대표적인 사람화되고/되거나 최적화된 서열은 본원에서 상기 표 4 및 표 6, 및 하기 본원의 표 7에 나타낸다.
[표 7]
서열 최적화된 변이체
표 7a는 서열 최적화된 변이체의 FR1-CDR1-FR2-CRD2를 나타내고, 표 7b는 상기 변이체의 FR3-CDR3-FR4-CDR4를 나타낸다. 표에서의 서열번호(SEQ)는 본 출원의 서열목록에서의 서열을 말한다.
[표 7a]
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
[표 7b]
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
본 발명의 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 글리코실 잔기, 및 변형된 아미노산 측쇄 등과 같은 변형을 추가로 함유할 수 있다.
사람에서의 약제학적 용도를 위해서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 사람 CX3CR1에 대해 지시되고, 반면, 수의학적 목적을 위해서는 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 치료될 종 유래의 CX3CR1에 대해 지시된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
또한, 사람에서 치료학적 제제로서 사용되는 경우, 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 포함되는 면역글로불린 단일 가변 도메인이 바람직하게는 사람화된 면역글로불린 단일 가변 도메인임은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 상기 기술된 바와 같이 도메인 항체, 즉, VL 또는 VH 항체, 및/또는 VHH 도메인, 및/또는 임의의 다른 종류의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면, 낙타화된 VH일 수 있고, 단, 이들 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
본 발명의 한 양상에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 상기 기술된 바와 같이 도메인 항체 서열 또는 VHH 도메인 서열로 필수적으로 이루어진다. 특히, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH 도메인 서열로 필수적으로 이루어진다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면, 항-CX3CR1 VHH를 포함한다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드에서 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드에서 상기 2개의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드에 존재하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서로 직접적으로(즉, 링커를 사용하지 않고) 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커는, 바람직하게는 링커 펩타이드이고, 본 발명에 따르면 1개 및 동일한 CX3CR1 분자 내에서 또는 2개의 상이한 분자 내에서 CX3CR1에 대한 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합을 허용하도록 선택될 것이다.
적합한 링커는, 특히, 에피토프, 구체적으로는 면역글로불린 단일 가변 도메인이 결합하는 CX3CR1 상의 에피토프 사이의 거리에 의존할 것이고, 임의로 일부 제한된 정도의 통상적인 실험 후, 본원의 기재를 토대로 당업자에게 명백할 것이다.
또한, 2개 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 도메인 항체 또는 VHH 도메인인 경우, 이들은, 또한, 제3 도메인 항체 또는 VHH 도메인을 통해 서로 연결될 수 있다(여기서, 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 제3 도메인 항체 또는 VHH 도메인에 직접 연결되거나 적합한 링커를 통해 연결될 수 있다). 상기 제3 도메인 항체 또는 VHH 도메인은, 예를 들면, 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 증가된 반감기를 제공하는 도메인 항체 또는 VHH 도메인일 수 있다. 예를 들면, 후자 도메인 항체 또는 VHH 도메인은, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, (사람) 혈청 알부민 또는 (사람) 트랜스페린과 같은 (사람) 혈청 단백질에 결합할 수 있는 도메인 항체 또는 VHH 도메인일 수 있다.
대안으로, 2개 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 연속으로(직접적으로 또는 적합한 링커를 통해) 연결될 수 있고, 제3 (단일) 도메인 항체 또는 VHH 도메인(이는 상기 기술된 바와 같이 증가된 반감기를 제공할 수 있음)은 직접적으로 또는 링커를 통해 상기 언급된 2개 이상의 면역글로불린 서열 중 하나에 연결될 수 있다.
적합한 링커는, 본 발명의 특정 폴리펩타이드와 연계하여 본원에 기술되고, 예를 들면, 제한 없이 바람직하게는 길이가 5개 이상, 7개 이상, 9개 이상, 또는 11개 이상, 15개 이상, 또는 17개 이상인 아미노산, 예를 들면, 약 20개 내지 40개 아미노산인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 상한치는 중요하지 않지만, 예를 들면, 상기 폴리펩타이드의 생물 약제학적 생산과 관련된 편의를 이유로 선택된다.
상기 링커 서열은 천연 발생 서열 또는 비천연 발생 서열일 수 있다. 치료학적 목적을 위해 사용되는 경우, 상기 링커는, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드가 투여되는 대상체에서 비면역원성이다.
링커 서열 중 하나의 유용한 그룹은, WO 96/34103 및 WO 94/04678에 기술된 바와 같은 중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유도된 링커이다.
다른 예는 Ala-Ala-Ala와 같은 폴리-알라닌 링커 서열이다.
링커 서열의 추가의 바람직한 예는, (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3, 및 (gly3ser2)3를 포함하는, (glyxsery)z 링커와 같은 상이한 길이의 Gly/Ser 링커이다.
본 발명의 폴리펩타이드가 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티의 부착에 의해 변형되는 경우, 상기 링커 서열은 바람직하게 시스테인 또는 라이신과 같은 아미노산 잔기를 포함하여 상기 링커 영역에서 상기 변형, 예를 들어, 페길화(PEGylation)를 가능하게 한다.
링커의 예는 다음과 같다:
GGGGS (5GS 링커, 서열번호 233)
SGGSGGS (7GS 링커, 서열번호 234)
GGGGCGGGS (8GS 링커, 서열번호 235)
GGGGSGGGS (9GS 링커, 서열번호 236)
GGGGSGGGGS (10GS 링커, 서열번호 237)
GGGGSGGGGSGGGGS (15GS 링커, 서열번호 238)
GGGGSGGGGSGGGGGGGS (18GS 링커, 서열번호 239)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (20GS 링커, 서열번호 240)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (25GS 링커, 서열번호 241)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (30GS 링커, 서열번호 242)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS 링커, 서열번호 243)
EPKSCDKTHTCPPCP (G1 힌지 링커, 서열번호 244)
GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (9GS-G1 힌지 링커, 서열번호 245)
EPKTPKPQPAAA (라마 상부의 긴 힌지 영역, 서열번호 246)
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (G3 힌지, 서열번호 247)
AAA (Ala 링커, 서열번호 248)
추가로, 상기 링커는, 또한, 예를 들면, WO04/081026에 나타낸 바와 같은 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티일 수 있다.
2개 이상의 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩타이드의 비제한적 예는 표 8a에 제공된다.
[표 8a]
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서, 이미 상기 기술된 바와 같은 추가의 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있는 다른 폴리펩타이드와 같은 다른 모이어티(임의로 1개 또는 2개의 링커)를 통해 서로 연결된다. 상기 모이어티는 필수적으로 불활성이거나, 상기 폴리펩타이드의 목적하는 성질을 개선시키는 것과 같은 생물학적 효과를 가질 수 있거나, 상기 폴리펩타이드에 하나 이상의 추가의 목적하는 성질을 부여할 수 있다. 예를 들면, 그리고 제한 없이, 상기 모이어티는 상기 단백질 또는 폴리펩타이드의 반감기를 개선시킬 수 있고/있거나, 이의 면역원성을 감소시키거나 임의의 다른 목적하는 성질을 개선시킬 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 특히, 치료학적 제제로서 사용되는 경우, 환자의 혈청 또는 다른 체액 중에서 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 모이어티를 포함한다. 상기 용어 "반감기"는, 상기 (변형된) 폴리펩타이드의 혈청 농도가, 예를 들면, 폴리펩타이드의 분해 및/또는 중화 기작에 의한 제거 및/또는 격리로 인해 생체내에서 50%까지 감소되는데 소요되는 시간을 의미한다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 상기 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 예를 들면, WO01/79271 및 WO03/59934에 기술된 바와 같이 혈청 알부민 분자에 융합될 수 있다.
대안으로, 상기 반감기 연장 잔기는 상기 폴리펩타이드에 공유적으로 연결되거나 융합될 수 있고, 제한 없이 Fc 부분, 알부민 모이어티, 알부민 모이어티의 단편, 알부민 결합 모이어티, 예를 들면, 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인, 트랜스페린 결합 모이어티, 예를 들면, 항-트랜스페린 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리옥시알킬렌 분자, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 알부민 결합 펩타이드, 또는 하이드록시에틸 전분(HES) 유도체일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 피브리노겐 또는 트랜스페린과 같이, 혈액에서 발견되는 항원에 결합함으로써 수득한 본 발명의 폴리펩타이드에 증가된 생체내 반감기를 부여하는 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에 따르면, 상기 모이어티는 알부민-결합 면역글로불린이고, 특히, 알부민-결합 VHH 도메인과 같은 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 혈청 알부민에 결합하는 모이어티를 포함하고, 여기서, 상기 모이어티는, 국제 특허 공보 WO2008/068280 및 WO2009/127691에 기술된 바와 같은 알부민 결합 펩타이드이다.
사람에서 사용하고자 하는 경우, 상기 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인(또한, 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인으로도 불리움)은, 바람직하게 사람 혈청 알부민에 결합할 것이고, 바람직하게는 사람화된 알부민-결합 VHH 도메인일 것이다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, WO2006/122786에 추가로 상세하게 기술되어 있다. 특이적으로 유용한 알부민 결합 VHH 도메인은, 서열번호 230 내지 232 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열로 이루어지거나 이들을 함유한다:
[표 8b]
Figure pct00037
한 실시형태에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는, 본 발명의 폴리펩타이드에 하나 이상의 이펙터 기능을 부여하고/하거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 부여할 수 있는, 하나 이상의 항체 부분, 단편 또는 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들면, 상기 목적을 위해, 그리고 이들에 제한되지 않고, 상기 항체 부분은, 예를 들면, 중쇄 항체(상기 기술된 바와 같음) 유래, 보다 바람직하게는 종래의 사람 4-쇄 항체 유래의 항체의 CH2 및/또는 CH3 도메인일 수 있거나 이들을 포함할 수 있고; 구체적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들면, 사람 IgG 유래, 사람 IgE 유래, 또는 다른 사람 Ig 유래의 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를 들면, WO 94/04678은, 낙타 VHH 도메인 또는 이의 사람화된 유도체를 포함하는, 중쇄 항체를 기술하고 있고, 여기서, 상기 낙타 CH2 및/또는 CH3 도메인은 사람 CH2 및/또는 CH3 도메인으로 대체되어 각각 임의로 사람화된 VHH 도메인 및 사람 CH2 및 CH3 도메인(그러나 CH1 도메인은 아님)을 포함하는 2개의 중쇄로 이루어지고, CH2 및 CH3 도메인에 의해 제공된 이펙터 기능을 갖는 면역글로불린을 제공할 수 있고, 임의의 경쇄의 존재 없이 기능할 수 있고, 상기 변형이 없는 상응하는 VHH 도메인과 비교하여 증가된 반감기를 가질 수 있다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개의 항-CX3CR1 VHH 및 혈청 알부민에 결합할 수 있는 VHH를 포함한다. 한 양상에서, 상기 VHH는 링커 펩타이드를 사용하여 융합된다. 본 발명의 상기 폴리펩타이드의 대표적인 예는 하기에 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 제1 링커 펩타이드에 융합된 제1 항-CX3CR1 VHH를 포함하고, 상기 제1 링커 펩타이드 자체는, 혈청 알부민에 결합할 수 있는 VHH에 융합되고, 상기 혈청 알부민 자체는 제2 링커 펩타이드에 융합되고, 상기 제2 링커 펩타이드 자체는 제2 항-CX3CR1 VHH에 융합된다. 한 양상에서, 상기 제1 또는 제2 링커 펩타이드는 9GS 링커이고, 한 양상에서, 상기 제1 및 제2 링커 펩타이드는 9GS 링커이다. 한 양상에서, 혈청 알부민에 결합할 수 있는 VHH는 사람 혈청 알부민에 결합할 수 있다. 한 양상에서, 혈청 알부민에 결합할 수 있는 VHH는, 서열번호 231에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 양상에서, 상기 제1 및 제2 항-CX3CR1 VHH는, 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 한 양상에서, 상기 제1 또는 제2 항-CX3CR1 VHH는, 하기 서열번호에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다:
- 서열번호 213, 214 및 186;
- 서열번호 213, 221 및 186; 또는
- 서열번호 141, 162 및 186.
한 양상에서, 상기 제1 및 제2 항-CX3CR1 VHH는, 하기 서열번호에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다:
- 서열번호 213, 214 및 186;
- 서열번호 213, 221 및 186; 또는
- 서열번호 141, 162 및 186.
한 양상에서, 상기 제1 또는 제2 항-CX3CR1 VHH는, 서열번호 138 내지 140 또는 서열번호 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 양상에서, 상기 제1 및 제2 항-CX3CR1 VHH는, 동일한 아미노산 서열을 갖고, 여기서, 상기 아미노산 서열은, 서열번호 138 내지 140 또는 서열번호 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 서열이다.
본 발명의 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 서열번호 225 내지 227, 249 또는 277 내지 281 중 어느 하나의 폴리펩타이드이다.
[표 9]
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 항-CX3CR1 VHH 및 Fc 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 그 자체가 Fc에 융합되는, 링커 펩타이드에 융합된 항-CX3CR1 VHH를 포함한다. 한 양상에서, 상기 링커 펩타이드는 15GS 링커이다. 한 양상에서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 250 또는 252에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 양상에서, 상기 VHH는 하기 서열번호에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다:
- 서열번호 213, 214 및 186;
- 서열번호 213, 221 및 186; 또는
- 서열번호 141, 162 및 186.
한 양상에서, 상기 VHH는 서열번호 138 내지 140 또는 서열번호 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 한 양상에서, 상기 폴리펩타이드는 이량체 형태이고, 예를 들면, 여기서, 상기 이량체는 하나 이상의 디설파이드 가교에 의해 형성된다.
본 발명의 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 서열번호 251, 253 또는 254의 폴리펩타이드이다.
[표 10]
Figure pct00041
Figure pct00042
본 발명의 폴리펩타이드는, 이의 성질을 개선시키기 위해 변형될 수 있다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 저장시 이의 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 특정 숙주 시스템에서 이의 발현을 촉진시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드의 제1 코돈이 변형될 수 있다. 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이의 첫번째 아미노산으로서 글루탐산(glu)으로 시작한다. 다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들면, 저장 동안에 N-말단에서 피로글루타메이트 형성을 감소시켜 생성물 안정성을 증가시키기 위해, 이의 첫번째 아미노산으로서 아스파르트산(asp)으로 시작한다. 다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 원핵 세포 발현 시스템에서 폴리펩타이드의 발현을 촉진시키기 위해 이의 첫번째 아미노산으로서 알라닌(ala) 또는 발린(val)으로 시작한다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 상기 변형은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 수행한다.
변형된 제1 코돈을 갖는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 대표적인 예는 서열번호 257 내지 262 및 263 내지 266 중 어느 하나에 제시되어 있고, 하기 표 11 및 표 12에 나타낸다:
[표 11]
Figure pct00043
Figure pct00044
[표 12]
Figure pct00045
Figure pct00046
하나의 추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기의 성질들 중 하나 이상을 특징으로 한다:
· 사람 CX3CR1에 대해 높은 친화성으로 결합한다;
· 사람 CX3CR1에 대한 가용성 프랙탈카인의 결합을 억제한다;
· 프랙탈카인 유도된 주화성을 억제한다;
· 프랙탈카인 유도된 사람 CX3CR1 수용체 내재화를 억제한다;
· 결합 및 기능성 억제에 대해 사람 CX3CR1에 대한 E/IC50의 10배 이내에서 cyno CX3CR1과 교차 반응한다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 경쟁 FACS에 의한 측정시, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로 사람 CX3CR1에 대한 친화성을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 세포 결합 FACS에 의한 측정시, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 EC50으로 사람 CX3CR1에 대한 친화성을 갖는다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 사람 프랙탈카인에 대한 사람 CX3CR1의 결합을 사람 프랙탈카인과의 경쟁 FACS에 의한 측정시 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상으로 차단한다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 사람 프랙탈카인과의 경쟁 FACS에 의한 측정시 300nM 이하, lOOnM 이하, 20nM 이하, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로 차단한다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 사람 CX3CR1에 의해 매개되는 프랙탈카인 유도된 주화성을 10% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상으로 억제한다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 사람 CX3CR1에 의해 매개되는 프랙탈카인 유도된 주화성을 500nM 이하, 100nM 이하, 75nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하 또는 5nM 이하의 IC50으로 억제한다.
추가의 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 프랙탈카인 유도된 사람 CX3CR1 수용체 내재화를 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로 억제한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기 연장 변형(또한, 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시키는 상기 변형)은, 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 또는 이의 유도체(예를 들면, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG)와 같은 약리학적으로 허용되는 적합한 중합체의 부착을 포함한다. 일반적으로, 항체 및 항체 단편(도메인 항체 및 scFv를 포함하지만 이들에 제한되지 않음)에 대해 당업계에 사용되는 페길화와 같은 임의의 적합한 형태의 페길화가 사용될 수 있고; 예를 들면, 문헌[Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); WO 04/060965; 및 US6,875,841]을 참조한다.
Sunbright® EA 시리즈, SH 시리즈, MA 시리즈, CA 시리즈, 및 ME 시리즈, 예를 들면, Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, 및 Sunbright® ME-400MA와 같은, 폴리펩타이드의 페길화를 위한 다양한 시약이, 또한, 예를 들면, 제조원[Nektar Therapeutics, USA, 또는 NOF Corporation, Japan]으로부터 시판되고 있다.
바람직하게, 부위-지시된 페길화는, 특히, 시스테인-잔기를 통해 사용된다(문헌 참조: 예를 들면, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). 예를 들면, 상기 목적을 위해, PEG는, 본 발명의 폴리펩타이드에서 천연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 부착될 수 있고/있거나, 본 발명의 폴리펩타이드는, PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기가 적합하게 도입되도록 변형시킬 수 있고/있거나, PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 잔기가 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있고/있거나, PEG는, 본 발명의 폴리펩타이드의 2개의 이상의 기능성 도메인을 가교하는 링커 영역에 부착될 수 있고, 상기 모두는 당업자에게 공지되어 있는 단백질 가공 기술 자체를 사용한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드에 대해, 분자량이 5kDa 초과, 예를 들면, 10kDa 초과 및 200kDa 미만, 예를 들면, 100kDa 미만이고; 예를 들면, 20kDa 내지 80kDa인 PEG가 사용된다.
페길화와 관련하여, 본 발명은, 일반적으로, 바람직하게는 페길화가, (1) 생체내 반감기를 증가시키고/시키거나; (2) 면역원성을 감소시키고/시키거나; (3) 페길화에 대해 공지되어 있는 하나 이상의 추가의 이로운 성질 자체를 제공하고/하거나; (4) CX3CR1에 대한 폴리페타이드의 친화성에 필수적으로 영향을 미치지 않고/않거나(예를 들면, 하기 실시예에 기술된 것들과 같은 적합한 검정에 의해 측정시 50% 초과로, 보다 바람직하게는 10% 초과로 친화성을 감소시키지 않음); (5) 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 다른 목적하는 성질에 영향을 미치지 않는 방식으로, 하나 이상의 아미노산 위치에서 페길화된 본 발명의 임의의 폴리펩타이드를 포함함을 주의해야 한다. 적합한 PEG 그룹 및 이들을 특이적으로 또는 비특이적으로 부착시키기 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 구체적으로 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 페길화된 폴리펩타이드는 40kDa 또는 60kDa의 분자량을 갖는 선형 PEG의 하나의 PEG 모이어티를 포함하고, 여기서, 상기 PEG 모이어티는 링커 영역 내에서, 그리고 구체적으로 Cys 잔기, 예를 들면, 서열번호 235에 나타낸 바와 같은 GS8-링커 펩타이드의 5번 위치에서 상기 폴리펩타이드에 부착된다.
본 발명의 페길화된 폴리펩타이드의 바람직한 예는, 바람직하게는 상기 언급된 바와 같은 PEG 시약 중 하나, 예를 들면, 하기 화학식으로 나타낸, 40kDa의 평균 분자량을 갖는 "Sunbright® ME-400MA"로 페길화된다.
Figure pct00047
치료학적 용도
한 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 폴리펩타이드, 또는 의약으로서 사용하기 위한 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 또는 암의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명의 폴리펩타이드의 용도, 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 죽상 동맥경화증의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명의 폴리펩타이드의 용도, 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 새로운 죽상 경화성 병변 또는 플라크의 형성을 예방하고/하거나 감소시키고/시키거나 기존의 병변 및 플라크의 진행을 예방하거나 지연시킴에 의한 죽상 동맥경화증의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명의 폴리펩타이드의 용도, 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 플라크의 조성을 변화시켜 플라크 파열 및 죽상 동맥혈전 사건들의 위험성을 감소시킴에 의한 죽상 동맥경화증의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명의 폴리펩타이드의 용도, 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은, 또한, 하기 질환 또는 병태를 앓거나 이의 위험에 처한 사람에서, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 또는 암을 치료하거나 이의 위험을 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은, 상기 사람에게 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은, 또한, 상기 질환 또는 병태를 앓거나 이의 위험에 처한 사람에서, 죽상 동맥경화증을 치료하거나 이의 위험을 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은, 상기 사람에게 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은, 또한, 하기 질환 및 병태를 앓거나 이의 위험에 처한 사람에서, 새로운 죽상 경화성 병변 또는 플라크의 형성을 예방하고/하거나 감소시킴에 의해 그리고/또는 기존의 병변 및 플라크를 예방하거나 이의 진행을 지연시킴에 의해, 죽상 동맥경화증을 치료하거나 이의 위험을 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은, 상기 사람에게 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은, 또한, 하기 질환 또는 병태를 앓거나 이의 위험에 처한 사람에서 플라크의 조성을 변화시켜 플라크 파열 및 죽상 동맥혈전 사건들을 감소시킴에 의해 죽상 동맥경화증을 치료하거나 이의 위험을 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은, 상기 사람에게 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, CX3CR1과 연관된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용으로 지시된다.
한 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, CX3CR1 수용체에서의 활성 조절이 요구되는 질환 또는 병태의 치료 또는 예방용으로 지시된다. 한 양상에서, 본 발명은, 또한, CX3CR1 수용체의 길항작용이 이로운 질환 또는 병태를 치료하거나 이의 위험을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 상기 질환 또는 병태를 앓거나 이의 위험에 처한 사람에게 본 발명의 폴리펩타이드를 투여함을 포함한다.
예방은, 의문의 질환 또는 병태의 이전 에피소드를 앓았거나, 그렇지 않으면 이의 증가된 위험에 처한 것으로 고려되는 사람들의 치료에 특히 적절한 것으로 예상된다. 특정 질환 또는 병태의 발병 위험에 처한 사람들로는, 일반적으로, 상기 질환 또는 병태의 가족력을 갖는 사람들, 또는 상기 질환 또는 병태의 발병에 특히 민감한 것으로 유전학적 시험 또는 스크리닝에 의해 동정된 사람들이 포함된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "예방, 치료 및/또는 완화"는, 질환을 예방하고/하거나 치료하고/하거나 완화시킴을 포함할 뿐만 아니라, 일반적으로, 질환의 개시를 예방하거나, 질환의 진행을 지연시키거나 역전시키고, 상기 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 개시를 예방하거나 지연시키거나, 상기 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 감소시키고/시키거나 완화시키거나, 상기 질환 및/또는 이와 연관된 임의의 증상들의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시키고/시키거나, 상기 질환 및/또는 이와 연관된 임의의 증상들의 중증도의 추가의 증가를 예방하거나, 상기 질환에 의해 야기되는 임의의 생리학적 손상, 및 일반적으로치료될 환자에게 이로운 임의의 약리학적 작용을 예방하거나, 감소시키거나 역전시킴을 포함한다.
치료될 대상체는 포유동물이고, 보다 구체적으로는 사람이다. 당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 치료될 대상체는, 특히, 본원에 언급된 질환, 장애 또는 병태를 앓거나 이의 위험에 처한 사람일 것이다.
질환의 상기 치료 방법은 상기 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 포함함은 당업자에게 명백할 것이다. 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드가 상기 질환의 치료를 위해 의도된 의약 또는 약제학적 조성물에서 활성 성분으로서 사용될 수 있음은 명백하다. 따라서, 본 발명은, 또한, 상기 언급된 임의의 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 완화용 약제학적 조성물을 제조하는데 있어서 본 발명의 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은, 추가로, 치료학적 또는 예방학적 용도를 위한, 그리고 구체적으로 상기 언급된 임의의 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 완화를 위한, 본 발명의 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은, 추가로, 상기 언급된 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 완화를 위한 약제학적 조성물에 관한 것이고, 여기서, 상기 조성물은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은, 상기 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 필요로 하는 환자에게, 사용될 특정 약제학적 제형 또는 조성에 따라 임의의 적합한 방식으로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은, 예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 경피, 경구, 설하(예를 들면, 혀 아래에 위치하여 점막을 통해 설하 모세관 네트워크를 통해 흡수되는 설하 정제, 분무제 또는 점적제 형태), 비강(내)(예를 들면, 비강 분무제 형태 및/또는 에어로졸 형태), 국소적으로, 좌제의 수단에 의해, 흡입에 의해, 유리체 내로(특히, 건조 AMD 또는 녹내장의 치료를 위해) 또는 임의의 다른 적합한 방식으로 유효량 또는 유효 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은, 예방되거나, 치료되거나 완화될 질환, 장애 또는 병태를 예방하고/하거나 치료하고/하거나 완화시키기 위해 적합한 치료 용법에 따라 투여된다. 임상의는, 일반적으로, 예방되거나, 치료되거나 완화될 질환, 장애 또는 병태, 상기 질환의 중증도, 이의 증상의 중증도, 사용될 본 발명의 특정 폴리펩타이드, 특정 투여 경로, 사용될 약제학적 제형 또는 조성, 환자의 연령, 성별, 체중, 식이, 일반적 조건, 및 임상의에게 익히 공지되어 있는 유사 인자들에 따라 적합한 치료 용법을 결정할 수 있다. 일반적으로, 상기 치료 용법은, 치료학적 및/또는 예방학적 유효량 또는 용량에서 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 조성물의 투여를 포함할 것이다.
일반적으로, 본원에 언급된 질환, 장애 및 병태의 예방, 치료 및/또는 완화를 위해, 그리고 치료될 특정 질환, 장애 또는 병태, 사용될 본 발명의 특정 폴리펩타이드의 효력, 특정 투여 경로 및 사용되는 특정 약제학적 제형 또는 조성에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는, 일반적으로, 체중 kg 및 용량당 0.005 내지 20.0mg, 바람직하게 0.05 내지 10.0mg/kg/용량, 및 보다 바람직하게는 0.5 내지 10mg/kg/용량의 양으로, 연속적으로(예를 들면, 주입에 의해) 또는 단일 용량(예를 들면, 매일, 매주, 또는 매월 용량; 하기 참조)으로서 투여될 것이지만, 특히, 상기 언급된 파라미터에 따라 상당히 변할 수 있다.
예방적 응용을 위해, 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 조성물은, 또한, 유사하거나 약간 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은, 또한, 임의의 합병증의 경우에 개별 담당의에 의해 조정될 수 있다.
본 발명의 특정 폴리펩타이드 및 이의 특정 약동학적 성질 및 다른 성질에 따라, 이것은 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다 또는 6일마다, 매주 또는 매월 투여될 수 있다. 투여 용법은 장기 주간 치료를 포함할 수 있다. "장기"란 2주 이상, 바람직하게는 수개월 또는 수년의 지속기간을 의미한다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 조성물의 효능은, 임의의 적합한 시험관내 검정, 세포-기반 검정, 생체내 검정 및/또는 공지된 동물 모델 자체, 또는 이들의 조합을 사용하여, 관련된 특정 질환에 따라 시험될 수 있다. 적합한 검정 및 동물 모델은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면, 하기 실시예에 사용되는 검정 및 동물 모델을 포함한다.
약제학적 용도를 위해, 본 발명의 폴리펩타이드는, (i) 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드, 및 (ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제, 및 (iii) 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약제학적 제제로서 제형화될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이란, 각각의 물질이 개체에게 투여되는 경우 어떠한 생물학적 또는 다른 목적하지 않은 효과를 나타내지 않고 이것이 함유된 약제학적 조성물 중의 다른 임의의 구성성분들(예를 들면, 약제학적 활성 성분)과 해로운 방식으로 상호작용하지 않음을 의미한다. 구체 예는 표준 핸드북, 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)]에서 발견될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드는 종래의 항체 및 항체 단편 및 다른 약제학적 활성 단백질에 대해 임의의 공지된 방법으로 제형화되고 투여될 수 있다. 따라서, 추가의 실시형태에 따르면, 본 발명은, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제, 및 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 물질을 함유하는, 약제학적 조성물 또는 제제에 관한 것이다.
비제한적인 예로서, 상기 제형은 경구 투여용, 비경구 투여용(예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 척추강내, 음경해면체내 또는 복강내 주사 또는 정맥내 주입), 국소 투여용, 설하 투여용, 흡입 투여용, 피부 패치 투여용, 임플란트용, 좌제, 경피, 비강, 유리체내, 직장내 또는 질내 투여용으로 적합한 형태일 수 있다. 투여 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는, 상기 적합한 투여 형태, 및 이의 제제에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자에게 명백할 것이다.
정맥내, 근육내, 피하 주사 또는 정맥내 주입과 같은 비경구 투여를 위한 약제학적 제제는, 예를 들면, 활성 성분을 포함하고 임의로 추가의 용해 또는 희석 단계 후 주입 또는 주사를 위해 적합한, 멸균 용제, 현탁제, 분산제, 에멀젼 또는 산제일 수 있다. 예를 들면, 상기 제제에 적합한 담체 또는 희석제로는, 제한 없이 멸균수 및 약제학적으로 허용되는 수성 완충제 및 용제, 예를 들면, 생리학적 포스페이트-완충 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액; 수성 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들면, 프로필렌 글리콜, 및 광유, 동물성유 및 식물성유, 예를 들면, 땅콩유, 대두유, 및 이들의 적합한 혼합물이 포함된다.
활성 화합물 또는 이의 염의 용액은, 또한, 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살(티오머살) 등과 같이, 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 함유할 수 있다. 다수의 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 완충제 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 적당한 유동성은, 예를 들면, 리포좀의 형성에 의해, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 흡수를 지연시키는 다른 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴이 또한 첨가될 수 있다.
모든 경우에, 궁극적인 용량 형태는 제조 및 저장 조건 하에 멸균성, 유동성이고, 안정해야만 한다. 멸균 주사가능한 용액은, 필요에 따라, 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 중에서 상기 활성 화합물의 필요량을 혼입시키고, 이어서, 여과 멸균하여 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이고, 이는 이전에 멸균 여과된 용액 중에 존재하는 임의의 추가의 목적하는 성분 및 활성 성분의 산제를 생성시킨다.
일반적으로, 수용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드와 같은 치료학적 단백질에 적합한 제형은, 완충된 단백질 용액, 예를 들면, 적합한 농도(예를 들면, 0.001 내지 400mg/ml, 바람직하게 0.005 내지 200mg/ml, 보다 바람직하게 0.01 내지 200mg/ml, 보다 바람직하게 1.0 내지 100mg/ml, 예를 들면, 1.0mg/ml(정맥내 투여) 또는 100mg/ml(피하 투여))의 단백질 및 수성 완충제, 예를 들면:
- 포스페이트 완충된 염수, pH 7.4,
- 다른 포스페이트 완충제, pH 6.2 내지 8.2,
- 히스티딘 완충제, pH 5.5 내지 7.0,
- 숙시네이트 완충제, pH 3.2 내지 6.6, 및
- 시트레이트 완충제, pH 2.1 내지 6.2,
및 임의로, 상기 용액의 등장성을 제공하기 위한 염(예를 들면, NaCl) 및/또는 당 또는 폴리알콜(예를 들면, 트레할로스, 만니톨, 또는 글리세롤)을 포함하는, 용액이다.
바람직한 완충된 단백질 용액은, 25mM 포스페이트 완충액(pH 6.5) 중에 용해된 본 발명의 폴리펩타이드 약 0.05mg/ml를 포함하고 220mM 트레할로스를 부가함에 의해 등장성으로 조정된 용액이다. 추가로, 세제, 예를 들면, 0.02% Tween-20 또는 Tween-80과 같은 다른 제제는 상기 용액에 포함될 수 있다. 피하 적용을 위한 제형은, 상당히 높은 농도(예를 들면, 100mg/ml 이하 또는 심지어 100mg/ml 초과)의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 주어진 성분 및 이의 양이 단지 하나의 바람직한 선택사항을 대표한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 이의 대안 및 변형은 바로 당업자에게 명백할 것이거나 상기된 바로부터 용이하게 알 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 또한, 적합한 데포, 예를 들면, 주사용으로 적합한 서방출 또는 지연-방출 제형을 사용하고/하거나, 피부 아래 이식하기 위한 제어-방출 장치를 사용하고/하거나 약제학적 활성 물질 또는 기본 물질의 투여를 위해 공지되어 있는 투약 펌프 또는 다른 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는, 피부 상에 위치하는 경우, 피부를 통과하는 겔, 크림, 분무, 적가, 패치 또는 필름 형태로 제형화될 수 있다.
또한, 종래의 항체 또는 항체 단편과 비교하여, 본 발명의 폴리펩타이드의 용도의 하나의 주요 이점은, 상기 폴리펩타이드가, 또한, 비경구 투여 이외의 다른 경로를 통해 용이하게 투여될 수 있고 상기 투여를 위해 용이하게 제형화될 수 있다는 것이다. 예를 들면, 국제 출원 WO2004/041867에 기술된 바와 같이, 상기 폴리펩타이드는 경구, 비강내, 폐내 및 경피 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 본원에 기술된 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드, 및 스타틴, 항혈소판제, 항응고제, 항당뇨병제 및 항고혈압제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 치료학적 제제를 포함하는 약제학적 병용물이 제공된다.
상기 약제학적 병용물은 임의로 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다.
2개 이상의 물질 또는 기본 물질이 병용 치료 용법의 일부로서 사용되어야만 하는 경우, 이들은, 동일한 투여 경로를 통해 또는 상이한 투여 경로를 통해 필수적으로 동시에 또는 상이한 시점에(예를 들면, 필수적으로 동시에, 연속적으로, 또는 대안적 용법에 따라) 투여될 수 있다. 상기 물질 또는 기본 물질이, 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되어야만 하는 경우, 이들은 상이한 약제학적 제형 또는 조성물 또는 병용 약제학적 제형 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 또한, 2개 이상의 활성 물질 또는 기본 물질이 병용 치료 용법의 일부로서 사용되어야만 하는 경우, 상기 물질 또는 기본 물질 각각은 상기 화합물 또는 기본 물질이 그 자체로 사용되는 경우에 사용된 바와 동일한 양 및 동일한 용법에 따라 투여될 수 있고, 상기 병용 용도는 공동상승작용 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 기본 물질의 병용 사용이 공동상승작용 효과를 유도하는 경우, 또한, 목적하는 치료학적 작용을 성취하면서 투여될 물질 또는 기본 물질 중 하나 이상 또는 모두의 양을 감소시킬 수 있다. 이것은, 예를 들면, 목적하는 약제학적 또는 치료학적 효과를 수득하면서, 이들이 이들의 통상의 양으로 사용되는 경우, 상기 물질 또는 기본 물질 중 하나 이상의 사용과 연관되는 원치 않는 임의의 부작용을 회피하거나, 제한하거나 감소시키기 위해 유용할 수 있다.
그러나, 본 발명의 추가의 실시형태는, 개체에게, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드, 및 스타틴, 항혈소판제, 항응고제, 항당뇨병제 및 항고혈압제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 유효량을 동시에, 별도로, 또는 연속으로 투여함을 포함하는, 상기된 바와 같은 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법이다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는, 상기 제시된 질환 및 장애의 치료용으로 사용되는 다른 약물과 병용 투여되도록 제조되고, 상기 다른 약물은, 스타틴, 항혈소판제, 항응고제, 항당뇨병제 및 항고혈압제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 상기 제시된 질환 및 장애의 치료를 위해 사용되는 약물, 스타틴, 항혈소판제, 항응고제, 항당뇨병제 및 항고혈압제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약물은, 본 발명의 폴리펩타이드와 병용 투여되도록 제조된다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는, 시린지, 주입기 펜 또는 기타 장치와 같이, 폴리펩타이드의 투여에 유용한 장치와 병용하여 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, CX3CR1 기능부전에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태를 진단하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a) 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계,
b) 상기 샘플을 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드와 시험관내에서 접촉시키는 단계, 및
c) 상기 샘플에 대한 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계, 및
d) 단계 (c)에서 검출된 결합을 표준물과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 샘플에 비한 결합의 차이는 CX3CR1 기능부전을 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 진단한다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, CX3CR1 기능부전에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태를 진단하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a) 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계, 및
b) 상기 샘플을 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계,
c) 상기 샘플 중의 CX3CR1의 양을 측정하는 단계, 및
d) 단계 (c)에서 측정된 양을 표준물과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 샘플에 비한 양의 차이는 CX3CR1 기능부전을 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 진단한다.
상기 진단 방법은, 또한, 대상체의 치료학적 처치의 유효성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 정의된 방법에서 사용하기 위해, CX3CR1 기능부전에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태를 진단하는 키트가 제공되고, 상기 키트는, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드, 및 임의로 하나 이상의 매질, 검출 수단 및/또는 시험관내 또는 생체내 조영제, 및 추가로, 임의로 사용 지침서를 포함한다. 적합한 생체내 조영제로는 99mTc, 111인듐, 123요오드, 및 자기 공명 이미지화를 위한 상자성(paramagnetic) 화합물을 포함한다.
본 발명은, 추가로, 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드, 및 추가로 상기된 바와 같은 질환 및 장애의 치료를 위해 사용되는 다른 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 성분들, 및 상기된 장치를 포함하는, 키트를 제공한다.
본 발명은, 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 일반적으로,
- 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산(이하에: "본 발명의 핵산")을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
- 배양물로부터, 숙주 세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하거나 단리하는 단계; 및
- 임의로 본 발명의 폴리펩타이드를 추가로 정제하고/하거나 변형시키고/시키거나 제형화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 핵산은, 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA(예를 들면, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현을 위해 특이적으로 적응된 코돈 사용을 갖는 DNA와 같음)일 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에 따르면, 본 발명의 핵산은, 필수적으로 상기된 바와 같이 단리된 형태로 존재한다.
본 발명의 핵산은, 또한, 다시 필수적으로 단리된 형태로 존재할 수 있는, 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드 또는 YAC와 같은 벡터 및/또는 벡터의 일부의 형태로 존재하거나 이들로 나타날 수 있다. 상기 벡터는 특히 발현 벡터, 즉, 시험관내 및/또는 생체내에서(예를 들면, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서) 폴리펩타이드의 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는, 일반적으로, 하나 이상의 적합한 조절 요소(들), 예를 들면, 프로모터(들), 인핸서(들) 및 터미네이터(들) 등에 작동적으로 연결되는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 포함한다. 상기 조절 요소들 및 다른 요소들, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시키는데 유용하거나 필요한 통합 인자(들), 선별 마커(들), 신호 또는 리더 서열(들) 및 리포터 유전자(들) 등은, 예를 들면, WO2006/040153의 131 내지 133페이지에 기재되어 있다.
본 발명의 핵산은, 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열에 대한 정보를 기준으로, 공지된 방법과 같이(예를 들면, 자동화 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해) 제조되거나 수득될 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다.
다른 실시형태에 따르면, 본 발명은, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있고/있거나; 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는, 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유동물 세포이다.
적합한 세균 세포는, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프로테우스(Proteus), 및 슈도모나스(Pseudomonas)의 균주와 같은 그람-음성 세균 균주, 및 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스태필로코커스(Staphylococcus), 및 락토코커스(Lactococcus)의 균주와 같은 그람-양성 세균 균주 유래의 세포를 포함한다. 적합한 진균류 세포는, 트리코더마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 및 아스퍼질러스(Aspergillus)의 종 유래의 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces)의 종(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)의 종(예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 피키아(Pichia)의 종(예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)), 및 한세눌라(Hansenula)의 종 유래의 세포를 포함한다.
적합한 포유동물 세포는, 예를 들면, CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, NS0 세포, 및 HEK 세포 등을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 이종성 단백질의 발현을 위해 당업계에서 사용되는 임의의 다른 세포가 또한 사용될 수 있다.
산업적 규모상의 생산을 위해, 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩타이드 및 이들을 함유하는 단백질 치료제의 (산업적) 생산에 바람직한 이종성 숙주는, 대규모 발현, 생산 및 발효에, 그리고 특히 대규모 (생물-)약제학적 발현, 생산 및 발효에 적합한 이. 콜라이(E. coli), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)의 균주를 포함한다.
특이적 발현 시스템의 선택은 부분적으로 소정 번역 후 변형, 보다 구체적으로는 당화를 위한 요건에 의존한다. 당화가 요망되거나 요구되는 본 발명의 폴리펩타이드의 생산은, 발현된 단백질을 당화시키는 능력을 갖는 포유동물 발현 숙주의 사용을 필요로 한다. 이러한 관점에서, 수득된 당화 패턴(즉, 부착된 잔기들의 종류, 수 및 위치)이, 발현을 위해 사용되는 세포 또는 세포주에 의존할 것임은 당업자에게 명백할 것이다.
상기 제시된 세포에서 생산되는 본 발명의 폴리펩타이드는, 세포내(예를 들면, 세포질내, 주변세포질내 또는 봉입체내)에서 생산되고, 이어서, 숙주 세포로부터 단리되고, 임의로 정제될 수 있거나; 이들은 세포외에서(숙주 세포가 배양된 배지로 분비됨) 생산되고, 이어서, 배양 배지로부터 단리되고, 임의로 추가로 정제될 수 있다.
적합한 발현 벡터, 형질전환 또는 형질감염 방법, 선택 마커, 단백질 발현의 유도 방법, 및 배양 조건 등과 같은 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해 사용되는 추가의 방법 및 시약은 당업계에 공지되어 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩타이드의 제조 방법에 유용한 단백질 단리 및 정제 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
이. 콜라이 및 효모와 같은 편리한 재조합 숙주 유기체에서의 발효를 통한 본 발명의 폴리펩타이드의 생산은, 고비용의 포유동물 세포 배양 설비도 필요로 하는 종래의 항체와 비교하여 저렴하다. 추가로, 성취가능한 발현 수준은 높고, 본 발명의 폴리펩타이드의 수율은 1 내지 10g/l(이. 콜라이) 및 10g/l(효모) 이상의 범위 내이다.
실시예
사람 CX3CR1 또는 사이노몰거스 CX3CR1 을 과발현하는 CHO , Baf /3, Caki 및 HEK293 세포주의 생성
사람 또는 사이노몰거스 CX3CR1을 과발현하는 CHO 및 Baf/3 세포는, 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 생성되었다. 사람 CCR2 또는 CCR5를 발현하는 세포도, 또한, 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 생성되었다.
상기 cDNA는 사람 CX3CR1에 대해 pCDNA3.1(+)-neo로 클로닝되었고, 반면, pcDNA-DEST40-neo를 마우스 CX3CR1용으로 사용하였다.
사람 CX3CR1 및 사이노몰거스 CX3CR1의 아미노산 서열은 각각 서열번호 255 및 256에 나타낸다.
사람 CX3CR1 또는 마우스 CX3CR1을 과발현하는 낙타 신장 (Caki) 세포를 확립하기 위해, 모 Caki 세포를 각각 pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1 또는 pcDNA-DEST40-neo-mCX3CR1과 함께 전기천공하였다. 모든 조건에 대해, 형질감염체는, 1mg/mL 제네티신을 부가함으로써 선택되었다(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
사람 CX3CR1 또는 사이노몰거스 CX3CR1을 과발현하는 사람 배아 신장 (HEK293) 세포는, 각각 HEK293 모 세포주에서 pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1 또는 cyCX3CR1 플라스미드의 푸진(Fugene)(Roche)으로 지질-매개된 형질감염으로 생성되었다. 이들 세포는 일시적 형질감염체로서 사용되었고, 이와 같이 선택받지 않는다. 간략하게, 2*1 0E6 세포는 T75 당 씨딩되었고, 형질감염 전 밤새 항온배양하였다. 배양 배지의 제거 후, 세포는 제조업자의 지침에 따라 각각 플라스미드(9㎍) 및 푸진(27㎕)을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 수거하고 추가의 사용을 위해 동결시켰다.
실시예 1: CX3CR1 을 사용한 면역화는 라마에서의 체액 면역 반응을 유도한다
1.1. 면역화
윤리 위원회(University Antwerp, Belgium, UA2008A1, 2008/096, 2007/068)의 승인 후, 9마리의 라마(368, 369, 370, 381, 382, 384, 312, 313 및 314번으로 지정됨)를 면역화시켰다.
6마리의 라마(312, 313, 314, 381, 382 및 384번)를 pVAX1-huCX3CR1 플라스미드 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 4회의 근육내 주사(주간 또는 격주 간격으로 2mg/용량)로 면역화하였다. 후속적으로 3마리의 라마(381, 382 및 384번)에게 상기 기술된 바와 같이 확립된 사람 CX3CR1 과발현 Caki 세포를 4회 피하 주사하였다. 세포를 D-PBS 중에 재현탁시켰고, 주사 전 빙상에 유지하였다.
3마리의 추가의 라마(368, 369 및 370번으로 지정됨)를 상기 기술된 바와 같이 확립된 사람 CX3CR1 과발현 Caki 세포의 4회의 피하 주사로 표준 프로토콜에 따라 면역화하였다. 세포를 D-PBS 중에 재현탁시켰고, 주사 전 빙상에 유지하였다. 후속적으로, 이들 라마에게 BSA에 커플링된 재조합 CX3CR1 NT/EC3 단편을 2회 주사하여 투여하였다(표 13). 펩타이드는 NeoMPS(Polypeptidegroup, Strasbourg, France)에서 구입하였고 표준 프로토콜에 따라 BSA에 커플링시켰다.
[표 13]
Figure pct00048
제1 주사는 완전한 프로인트 애쥬번트(Difco, Detroit, Ml, USA) 중에 제형화되었고, 한편, 후속적 주사는 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco, Detroit, Ml, USA) 중에 제형화되었다.
1.2. 라마에서 유도된 면역 반응의 평가
사람 CX3CR1에 대한 동물에서의 면역 반응 유도를 ELISA 또는 FACS에 의해 평가하기 위해, 0일째(면역화전) 및 면역화 스케줄에서의 상이한 시점(말초 혈액 림프구[PBL] 수집 시점)에서 라마 312, 313 및 314번으로부터 혈청을 수집하였다.
간략하게, 뉴트라비딘(2㎍/ml)을 96웰 맥시소브(Maxisorb) 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 4℃에서 밤새 고정화시켰다. PBS 중의 카세인 용액(1%)으로 웰을 차단시켰다. 후속적으로, CX3CR1의 비오티닐화된 재조합 NT 단편((Polypeptide, Strasbourg, France) 또는 비오티닐화된 EC3 단편(Polypeptide, Strasbourg, France)을 2μg/ml으로 포획하였다. 혈청 희석액의 첨가 후, 특이적으로 결합된 면역글로불린은, 기질 TMB One(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘)(Promega, Mannheim, Germany)의 존재시에 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-라마 면역글로불린(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) 및 후속적 효소 반응을 사용하여 검출하였고, 이는, CX3CR1에 대해 상당한 항체-의존성 면역 반응이 펩타이드 면역화 후 유도되었음을 보여준다.
추가로, 세포 면역화된 동물의 혈청 역가는, 활성적으로 성장하는 사람 CX3CR1 과발현 CHO 세포에 대한 FACS 분석에 의해 확인하였다. 라마 368, 369 및 370에 대한 CX3CR1 혈청 역가 반응은, 4회의 세포 면역화(49일째), 4회의 세포 면역화 및 1회의 펩타이드 부스트(77일째) 및 4회의 세포 면역화 및 2회의 펩타이드 부스트(81일째) 후 샘플 채취된 혈청을 사용하여 측정하였다. 세포를 수거하고, 혈청 희석액과의 항온배양 전에 세척하였다. 검출은, 염소 항-라마 IgG(Bethyl, Montgomery, TX, USA)에 이어서 PE와 커플링된 당나귀 항-염소(Jackson Laboratories, Suffolk, UK)를 사용하여 수행하였고, FACSArray(BD Biosciences) 상에서의 분석에 의해 판독하였다. ELISA 또는 FACS에 의한 측정시 수득된 혈청 반응의 요약은 표 14 및 표 15에 나타낸다.
[표 14]
Figure pct00049
[표 15]
Figure pct00050
단지 DNA 면역화된 라마(312, 313 및 314번)에 대해 어떠한 혈청 역가도 측정하지 않았다.
실시예 2: 중쇄만의 항체 단편 레퍼토리의 클로닝 및 파지의 제조
각각의 서브 세트의 최종 면역원 주사 후, 면역화된 라마로부터 중쇄 항체를 생산하는 B-세포의 공급원으로서의 면역 조직을 수집하였다. 라마 312, 313 및 314번에 대해, 마지막 항원 주사 후 4일 및 8일째 수집된 2개의 150-ml 혈액 샘플을 동물당 수집하였다. 라마 368, 369 및 370번에 대해, 4개의 150ml 혈액 샘플을 마지막 세포 면역화 후 5일 및 7일째에 및 추가로 마지막 펩타이드 면역화 후 4일 및 8일째에 수집하였다. 이어서, 2개의 림프절 생검을 마지막 세포 면역화 후 12일째 및 마지막 펩타이드 면역화 후 12일째에 채취하였다. 라마 381, 382 및 384번에 대해 5개의 150ml 혈액 샘플을 마지막 DNA 면역화 후 8일째 및 제1 세포 부스트 후 추가로 4일째, 제2 세포 부스트 후 8일 및 11일째, 및 마지막 세포 면역화 후 8일째에 수집하였다. 이어서, 하나의 림프절 생검은 제2 세포 면역화 후 8일째에 채취하였다.
혈액 샘플로부터, 말초 혈액 림프구(PBL)는 제조업자의 지침(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)에 따라 Ficoll-Hypaque를 사용하여 제조하였다. PBL 및 림프절 생검(NL)으로부터, 총 RNA를 추출하였고, VHH 암호화 DNA 분절을 증폭시키기 위해 RT-PCR에 대한 출발 물질로서 사용하였다.
각각 면역화된 라마에 대해, 면역화 스케줄, 즉, 한가지 유형의 면역화 항원 후 소정 서브세트로부터 기원하는 샘플로부터 단리된 총 RNA를 풀링함으로써 라이브러리를 작제하였고, 일부 라마에 대해 상이한 동물 유래의 라마 샘플을 하나의 라이브러리로 풀링하였다(표 16).
[표 16]
Figure pct00051
간략하게, PCR-증폭된 VHH 레퍼토리는 특정 제한 부위를 통해 상기 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진하도록 고안된 벡터에 클로닝하였다. 상기 벡터는 pUC119로부터 유도되었고, LacZ 프로모터, M13 파지 gIII 단백질 암호화 서열, 암피실린 또는 카르베니실린에 대한 내성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열(pAX050)을 함유한다. VHH 암호화 서열과의 프레임에서, 상기 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 His6 태그를 암호화한다. 표준 프로토콜에 따라 파지를 제조하였고, 추가의 사용을 위해 20% 글리세롤 중에 4℃ 또는 -80℃에서 필터 멸균화 후 저장하였다.
실시예 3: 파지 디스플레이를 통한 CX3CR1 특이적 VHH의 선별
모든 라마로부터 수득되고 파지 라이브러리로서 클로닝된 VHH 레퍼토리는, 다수의 선별 조건을 적용하여 상이한 선별 전략에 사용하였다. 변수는 i) CX3CR1 단백질의 제시 형태(상이한 배경 상에서 또는 리포좀/VLP 상에서), ii) 항원 제시 방법(세포를 사용하는 경우 용액 중에서, 또는 VLP를 사용하는 경우 플레이트 상에 피복됨), iii) 항원 농도, iv) 사용되는 오톨로그(사람 또는 사이노몰거스), v) 선별 횟수, 및 vi) 상이한 용출 방법(트립신을 통한 비특이적 또는 리간드 프랙탈카인을 통한 특이적)을 포함한다. 모든 고체 피복된 상 선별은 맥시소브 96웰 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 수행하였다.
선별은 하기와 같이 수행하였다: 고체 및 용액 상 선별 포맷을 위해 CX3CR1 항원 제제를 다중 농도로 상기 기술된 바와 같이 제시하였다. 파지 라이브러리와의 2시간의 항온배양에 이어서 광범위한 세척 후, 결합된 파지를 15분 동안 트립신(1mg/ml)으로 용출시켰다. 트립신이 파지 용출을 위해 사용된 경우, 상기 프로테아제 활성은 0.8mM 프로테아제 억제제 ABSF를 적용함에 의해 즉시 중화되었다. 대조군으로서, 항원 부재 하의 선별을 병행하여 수행하였다.
파지 산출물은 이. 콜라이를 감염시키기 위해 사용하였고, 이는, 이어서, 다음 선별 과정 동안 파지를 제조(파지 구제)하기 위해 사용하였다. 제2회의 선별 후, 파지 산출물은 이. 콜라이를 감염시키기 위해 사용하였고, 이는, 이어서, 개별 VHH 클론의 분석을 위해 한천 플레이트(LB+carb+글루코스2%) 상에 플레이팅하였다. 특정 결합제에 대한 선별 산출물을 스크리닝하기 위해, 단일 콜로니를 한천 플레이트로부터 찍어내고(picked) 1mL의 96-딥-웰 플레이트에서 성장시켰다. LacZ-조절된 VHH 발현은 글루코스의 부재하에 IPTG(1mM 최종)을 부가하여 유도하였다. 주변세포질 추출물(약 80㎕의 용적에서)을 표준 프로토콜에 따라 제조하였다.
실시예 4: CX3CR1-프랙탈카인 경쟁 FACS 검정에서 주변세포질 추출물의 스크리닝
주변세포질 추출물은 사람 CX3CR1/사람 프랙탈카인 FACS 경쟁 검정에서 스크리닝하여 발현된 VHH의 차단 능력을 평가하였다. 사람 CX3CR1은 CX3CR1을 과발현하는 CHO 세포 상에 제시되었다. 활성적으로 성장하는 배양물로부터 수거된 세포를 사용한 셋업 및 동결된 세포를 사용하는 셋업 둘 다를 사용하였다. 검출 시약으로서, 표지된 프랙탈카인을 사용하였고(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), alexa647(A647-프랙탈카인)을 1의 표지화 정도로 표지시켰다. 상기 검정을 셋업하기 위해, 제1 적정 시리즈의 표지된 프랙탈카인을 CHO-huCX3CR1 세포 상에서 수행하여 결합에 대한 EC50 값을 측정하였다. 초기 스크리닝은, 보다 높은 농도의 프랙탈카인(3nM)에서으로 수행하여 검정 강도를 증가시켰다. 스크리닝의 민감성을 최대로 증가시키기 위해, EC30 농도(1nM)는 후속적 스크리닝을 위해 선택하였다. 간략하게, 50㎕의 주변세포질 추출물을 6nM 표지된 프랙탈카인(50㎕) 및 200 000 CHO-huCX3CR1 세포에 첨가하였다. 4℃에서 1시간의 항온배양한 후, FACS 어레이(Becton Dickinson) 상에서 판독을 수행하기 전에 세포를 3회 세척하였다. 첫번째로, 스캐터 프로파일로부터 측정된 바와 같이 온전한 세포상에 게이트를 설정하였다. 이어서, 죽은 세포는 PI 염색(Sigma, St Louis, US)으로부터 이들의 형광 프로파일에 의해 게이트 아웃시켰다. alexa647 표지로부터의 형광 프로파일은 각각의 샘플에 대해 측정하였고, 차단 능력의 계산을 위해 사용하였다. 대조군으로서, 조건은, 과량의 냉각 프랙탈카인이 포함된 경우, 주변 추출물 또는 공지의 부적절한 VHH 및 샘플 중에 존재하는 VHH가 함유되지 않은 경우가 되도록 취하였다. 각각의 샘플에 대해, % 차단은 대조군 샘플을 사용하여 측정하여 검정 윈도우를 결정하였다.
상기 스크리닝으로부터, VHH를 선별하였고, 서열 분석은, 3개의 상이한 B-세포 계열에 속하는 120개의 고유한 VHH를 밝혔다. 각각의 B-세포 계열에 대해 발견된 변이체의 총 수는 표 17에 나타낸다.
[표 17]
Figure pct00052
초기 스크리닝 동안에 선별 과정 및 수행에 대한 고찰은 모든 VHH에 대해 표 18에 나타낸다.
[표 18]
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
모든 수득된 고유한 VHH의 아미노산 서열은 서열목록 및 상기에 나타낸다(CDR 및 프레임워크 영역을 나타냈다).
실시예 5: 정제된 VHH의 특성확인
실시예 4에 기술된 스크리닝으로부터 선택된 억제성 항-CX3CR1 VHH를 추가로 정제하고 특성확인하였다. 선택된 VHH는 c-myc, His6-태그된 단백질로서 이. 콜라이 TG1에서 발현되었다. 발현은 1mM IPTG를 부가하여 유도하였고 37℃에서 4시간 동안 계속 방치하였다. 세포 배양물을 회전시킨 후, 주변세포질 추출물은 펠렛을 동결-해동시켜 제조하였다. 이들 추출물은 출발 물질로서 사용하였고, VHH는 IMAC 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하여 SDS-PAGE를 통해 평가된 바와 같이 95%의 순도를 수득하였다.
BA /F3 세포 상에서 발현된 사람 CX3CR1 에 대해 결합하는 사람 플랙탈카인의 항- CX3CR1 VHH 에 의한 억제
VHH의 리간드 프랙탈카인에 대한 차단 능력은, 실시예 4에 개요된 바와 같이 사람 CX3CR1 경쟁 FACS에서 평가하였다. CHO-huCX3CR1 세포, BA/F3-huCX3CR1 세포 또는 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하였다. 상이한 경쟁 셋업에서 사용된 표지된 리간드의 양은 또한 다양하였다. 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC50 값은 표 19에 나타낸다.
[표 19]
Figure pct00057
Figure pct00058
항- CX3CR1 VHH 에 의한 사람 CX3CR1 을 과발현하는 BA /F3 세포의 사람 프랙탈카인 유도된 주화성의 억제
프랙탈카인 유도된 주화성의 억제를 평가하기 위해, 5㎛ 공극 크기를 갖는 ChemoTx 1회용 챔버(Neuroprobe, Gaithersburg, US)를 사용하여 주화성 검정을 셋업하였다. 세포는 활성적으로 성장하는 배양물로부터 수거하였고, 0.1% BSA가 보충된 검정 배지, RPMI(Gibco, Carlsbad, US)에 사용하기 전에 세척하였다. 바닥 챔버에는 총 용적 300㎕로 320pM 사람 프랙탈카인을 충전시켰다. 상기 막의 적용시, 0.13E6 세포를 총 용적 70㎕로 막 상부에 침적시켰다. CO2와 함께 습한 챔버에서 37℃에서 3시간 동안 주화성을 허용하였다. 상기 항온배양 기간 후, 상기 막을 제거하고 바닥 챔버 내 세포를 재현탁시켰다. 웰에 존재하는 ATP의 양은 CellTiter-Glo 키트(Promega, Madison WI, US)를 사용하여 측정하였다. 발광 판독을 위한 표준 셋팅으로 Envision(Perkin Elmer, Massachusetts, US) 상에서 판독을 수행하였다. 적정 시리즈는 3회 수행하였고, 각각의 플레이트는, 또한, 3회 대조군 샘플을 함유했다. 대조군으로서, 사람 프랙탈카인이 바닥 챔버에 부가되지 않은 샘플 뿐만 아니라 VHH가 없는 샘플도, 또한, 함유되었다. 상기 결과의 요약은 표 20에 나타낸다.
[표 20]
Figure pct00059
사이노몰거스 CX3CR1 에 대한 항- CX3CR1 VHH 의 교차 반응성의 평가
처음에, FACS 기반 결합 셋업을 사용하여 사이노몰거스 교차 반응성을 평가하였다. 이를 위해, 상기 VHH는 4℃에서 30분 동안 각각의 세포와 항온배양하고, 이어서, 3회 세척 단계를 행하고, 후속적으로 검출 시약과 항온배양하였다. 검출로서, 마우스 항-cmyc 항체(Serotec, MCA2200)에 이어서 PE에 커플링된 염소 항-마우스 항체(Jackson 115-116-071)를 사용하였고, 각각 4℃에서 30분 동안 항온배양하였고, 이어서, 3회의 세척 단계를 행하였다. 상기 검정의 결과는 표 21에 나타낸다.
[표 21]
Figure pct00060
이후 동정된 VHH에 대해, HEK293T 세포에서 발현된 사람 또는 사이노몰거스 CX3CR1을 사용하여 사람 프랙탈카인 경쟁 FACS를 셋업하였다. 사람 및 사이노몰거스 수용체 둘 다를 HEK293T 세포에 일시적으로 형질감염시켰고, 형질감염은, 표지된 리간드, 사람 프랙탈카인의 결합에 의해 일치시켰다. 상기 경쟁은 프랙탈카인의 EC30 농도를 사용하여 평가하였고, 상기와 같이 수득된 IC50 값은, 친화성에 대한 척도인 Ki 값의 양호한 추정치이다(표 22). 상기 실험은, 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 사이노몰거스 원숭이 및 사람 CX3CR1에 대한 IC50 값의 비율을 사용하여 둘 다의 종에서 CX3CR1에 대한 친화성의 잠재력 차이를 평가하였다.
[표 22]
Figure pct00061
사람 CCR2 , 사람 CCR5 또는 마우스 CX3CR1 에 대한 항-사람 CX3CR1 VHH 의 결합
huCX3CR1 수용체에 대한 특이성은, huCCR2, huCCR5 또는 msCX3CR1을 발현하는, CHO-K1 모 세포 또는 CHO 세포에 대한 FACS 결합 실험을 수행함으로써, 평가하였다. 상기 VHH는 30분 동안 4℃에서 각각의 세포주와 항온배양하고, 이어서, 3회의 세척 단계를 수행하고, 후속적으로 검출 시약과 항온배양하였다. 검출로서, 마우스 항-cmyc 항체(Serotec, MCA2200)에 이어서 PE와 커플링된 염소 항-마우스 항체(Jackson 115-116-071)를 사용하였고, 각각 4℃에서 30분 동안 항온배양함에 이어서 3회의 세척 단계를 수행하였다. 각각의 세포주에 대해, 수용체-특이적 항체를 이용한 질적 대조군이 포함되었다. 추가로, 각각의 VHH의 최고 농도는, 또한, 양성 대조군으로서 huCX3CR1을 발현하는 CHO 세포와 함께 항온배양하였다. msCX3CR1, huCCR2 또는 huCCR5와 어떠한 결합도 없었음이 관찰될 수 있었다.
에피토프 빈(bin)의 측정
경쟁 결합 실험은, VHH가 CX3CR1 상의 중첩된 에피토프와 결합하는지를 측정하기 위해 셋업하였다. 이를 위해, alexa647로 표지된 VHH 66B02를, huCX3CR1을 발현하는 BA/F3 세포에 대한 경쟁 FACS에 사용하였다. 3개의 기능성 패밀리 유래의 대표적인 VHH를, 표지된 66B02의 결합에 대한 경쟁자들로서 사용하였다. 수득된 IC50 값은 표 23에 나타낸다.
[표 23]
Figure pct00062
66B02 결합의 경쟁 억제가, 상이한 리간드 차단 패밀리 유래의 모든 대표적인 VHH에 의해 수득될 수 있으므로, 이것은, 모든 기능성 패밀리가 서로 충분히 근접되게 밀접하게 결합하여 이들이 66B02의 결합과 경쟁하게 되는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 6: 2가로의 VHH의 포맷팅
2가물의 작제
선별된 수득된 VHH로부터 효력 및/또는 효능을 증가시키기 위해, 유전자 조작에 의해 2가의 분자를 작제하였다. 2개의 VHH를 2개의 빌딩 블록 사이에 35GS 링커와 함께 유전학적으로 연결하였고, 후속적으로 1가 VHH에 대해 상기 기술된 바와 같이 이. 콜라이에서 발현시켰다. 상이한 2가의 작제물은, 표 24에 열거된 바와 같이 제조하였다.
[표 24]
Figure pct00063
항- CX3CR1 VHH 에 의한 BA /F3 세포 상에 발현된 사람 CX3CR1 에 대한 사람 프랙탈카인의 결합의 억제
사람 CX3CR1에 결합하는 리간드의 억제는 실시예 4에 기술된 바와 같이 상이한 포맷에 대해 조사하였다. 상기 특성확인을 위해, 사람 CX3CR1 수용체의 안정한 발현을 보여주는 BA/F3- huCX3CR1 세포주를 사용하였다. 상기 alexa647 표지된 리간드 프랙탈카인은 이의 EC30 농도로 사용하였고, 이에 의해 수득된 IC50 값은 Ki 값을 반영한다. 상기 수득된 데이터의 고찰은 표 25에 나타낸다.
[표 25]
Figure pct00064
항- CX3CR1 VHH 에 의한 사람 CX3CR1 을 과발현하는 BA /F3 세포의 사람 프랙탈카인 유도된 주화성의 억제
1가의 항-CX3CR1 VHH에 대해 기술된 것과 유사하게, BA/F3-huCX3CR1 세포에 대한 프랙탈카인 유도된 주화성의 억제는 2가 작제물에 대해 평가하였다. 동일한 검정 셋업을 상기 기술된 바와 같이 사용하였고, 수득된 결과는 표 26에 요약한다.
[표 26]
Figure pct00065
사이노몰거스 CX3CR1 에 대한 항- CX3CR1 VHH 의 교차 반응성의 평가
또한, 2가 작제물에 대해, 사이노몰거스 CX3CR1에 대한 교차 반응성을 평가하였고 사람 반응성과 비교하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 결합 셋업(표 27) 또는 리간드 경쟁 셋업(표 28)은, 일시적 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하여 적용하였다. 일시적 형질감염된 세포의 배치를 이들의 수용체 발현 수준에 의해 일치시켰다.
[표 27]
Figure pct00066
[표 28]
Figure pct00067
실시예 7: 링커 길이 및 반감기 연장의 탐구
링커 길이, 및 alb11 VHH의 위치선정의 평가
2가 포맷에 사용되는 링커 길이가, 상기 수득된 효력에 현저하게 영향을 미칠 수 있으므로, 상이한 링커 길이를 평가하였다.
또한, 사람 혈청 알부민에 결합하는 나노바디인 Alb11을 포함시켜, 포맷된 분자의 생체내 반감기를 증가시켰다(WO 06/122787). 사용되는 링커 길이에 대한 변화 및 상이한 조성의 VHH의 위치선정을 포함하는 상이한 포맷을 제조하였다. 탐구된 포맷의 요약은 표 29에 나타낸다.
[표 29]
Figure pct00068
포맷된 VHH에 대한 암호화 서열을, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현 및 배양 배지로의 분비를 허용하는 내부(in-house) 작제된 플라스미드에 클로닝하였다. 상기 발현 벡터는 pPICZa (Invitrogen)로부터 유도되었고, 엄격하게 조절된 메탄올 유도된 발현을 위한 AOX1 프로모터, Zeocin™에 대한 내성 유전자, 다중클로닝 부위 및 α-인자 분비 신호를 함유하였다. 형질전환시, 발현 배양물을 성장시켰고, VHH 발현은 메탄올의 첨가에 의해 유도되었고, 30℃에서 48시간 동안 계속되도록 방치하였다.
이들 상이한 포맷의 효력은, 상기 기술된 바와 같이 리간드 경쟁 검정을 사용하여 평가하였다. 사용되는 상기 리간드 농도가 EC50 값 미만인 것으로 보아, 수득된 IC50은 Ki 값과 등가이다. 상이한 포맷에 대해 수득된 Ki는 표 30에 요약한다.
[표 30]
Figure pct00069
상기 효력에 대한 사람 혈청 알부민의 영향
alb11 VHH에 대한 사람 혈청 알부민(HSA)의 결합은 상기 포맷의 효력에 영향을 미칠 수 있고, 따라서, HSA의 존재 하에 리간드 경쟁을 반복하였다. 간략하게, alb11 VHH에 대한 HSA의 결합을 가능하게 하기 위해, 평가 하의 작제물 및 프랙탈카인은 세포에 첨가하기 전에 30분 동안 HSA와 예비 항온배양하였다. 또한, 상기 세포는, HSA가 보충된 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. 사용되는 HSA의 최종 농도는, 사용되는 최고 VHH 농도를 50배 초과하였다. 후속적으로, 경쟁을 2시간 동안 허용하였고, 추가의 프로세싱은 실시예 4에 기술된 바와 같았다.
Figure pct00070
HSA의 잠재적인 간섭은, 또한, 검정의 상이한 격실 내에 HSA를 포함하는 적응된 주화성 셋업에서 평가하였다. 사용된 HSA 농도는 다시 사용된 작제물의 최고 농도를 50배 초과하였고, 검정 개시 전에 30분 동안 작제물에 HSA를 로딩하였다. 상기 검정 완충액에, 또한, HSA를 보충하여 HSA가 전체 실험 기간 동안에 존재하도록 하였다. 상기 기술된 바와 같이, 5㎛ 공극 크기를 갖는 1회용 ChemoTx 챔버(Neuroprobe, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하였다. 활성적으로 성장하는 배양물로부터 세포를 수거하였고, 0.1% BSA 및 62.5μM HSA(Sigma, A8763)가 보충된 검정 배지인 RPMI (Gibco, Carlsbad, US)에서 사용하기 전에 세척하였다. 상기 바닥 챔버에 총 300㎕의 용적으로 320pM 사람 프랙탈카인을 충전시켰다. 막의 적용시, 0.13E6 세포를 총 70㎕의 용적으로 막의 상부에 침적시켰다. CO2를 갖는 습윤화된 챔버에서 37℃에서 3시간 동안 주화성을 허용하였다. 상기 항온배양 기간 후, 상기 막을 제거하였고 바닥 챔버 내의 세포를 재현탁시켰다. 웰에 존재하는 ATP의 양은 CellTiter-Glo 키트(Promega, Madison WI, USA)를 사용하여 측정하였다. 판독은, 발광 판독을 위한 표준 설비 셋팅을 갖는 Envision(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) 상에서 수행하였다. 적정 시리즈는 3회 수행하였고, 각각의 플레이트는, 또한, 3개의 대조군 샘플을 함유하였다. 대조군으로서, VHH가 없는 샘플 및 어떠한 사람 프랙탈카인도 바닥 챔버에 첨가되지 않은 샘플이 포함되었다. 상기 수득된 IC50은 표 31에 열거한다.
[표 31]
Figure pct00071
상기 포맷된 2가 반감기 연장된 폴리펩타이드에 의한 프랙탈카인 내재화의 억제
추가의 기능성 검정을 수행하여 2가 반감기 연장된 폴리펩타이드의 길항제 활성을 입증하였다. 상기 폴리펩타이드는, CHO huCX3CR1 세포에서 A647-프랙탈카인의 내재화를 억제하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 간략하게, 1E4 세포/웰을 96웰 플레이트(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)의 검은 투명한 바닥에 플레이팅하고 밤새 성장시켰다. 상기 세포를 1회 세척하고, 이어서, 검정 완충액(10mM HEPES 및 0.1% BSA가 보충된 칼슘 및 마그네슘(Gibco)을 갖는 HBSS)에 평형화시켰다. 상기 포맷된 폴리펩타이드 작제물을 첨가하고, 상기 플레이트를 37℃에서 15분 동안 항온배양하였다. 이어서, A647-프랙탈카인을 8nM의 최종 농도로 첨가하고, 상기 세포는 37℃에서 60분 동안 항온배양하였다. 상기 배지를 제거하고, 상기 세포를, 3.7% 포름알데하이드 용액(Polysciences, Warrington, PA, USA)을 사용하여 10분 동안 고정화시켰다. 상기 세포를 PBS로 1회 세정하고, 핵을 Hoechst 염료(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 표지화시켰다. 내재화된 표지된 프랙탈카인을 정량하기 위해, 상기 세포는 BD 경로 생물 이미지화 시스템을 사용하여 이미지화하였다. 이미지 분할은, 표지된 세포 핵을 동정하고 상기 마스크 주변에 3픽셀 링을 그림에 의해 수행하였다. 평균 A647 강도는 세포질 링에서 측정하였다. 상기 포맷된 폴리펩타이드는, 표 32에 요약된 바와 같이 프랙탈카인 내재화를 강하게 억제하였다:
[표 32]
Figure pct00072
항-CX3CR1 포맷된 2가 반감기 연장된 폴리펩타이드는 효능제 활성이 없다
2가 항-CX3CR1 반감기 연장된 폴리펩타이드가 효능제 활성을 갖지 않았음을 확인하기 위해, CX3CR1 BII036은 CHO huCX3CR1 세포내 칼슘 유입의 유도에 대해 평가하였다. 프랙탈카인은 CX3CR1 의존적 방식으로 상기 세포내 세포질 칼슘 수준의 증가를 매개하였고, CX3CR1 BII036는 상기 반응을 억제하였다.
상기 CHO huCX3CR1 세포는, 96웰 플레이트(BD)에 5E4 세포/웰로 플레이팅하였고 밤새 성장시켰다. 상기 세포는, 20mM HEPES가 보충된 HBSS에서 37℃에서 60분 동안 칼슘-4 염료/2mM 프로베니시드(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)와 항온배양하였다. 폴리펩타이드 길항작용을 입증하기 위해, CX3CR1BII036를, 이의 EC80 값으로 프랙탈카인의 첨가 전에 15분 동안 세포와 예비 항온배양하였다. 칼슘 동원은 제조업자의 지침에 따라 FLIPR 테트라 시스템(Molecular Devices) 상에서 모니터링하였다. 효능작용을 측정하기 위해, 폴리펩타이드와 예비 항온배양하지 않고 프랙탈카인 자극 대신에 CX3CR1 BII036을 사용하였다. CX3CR1 BII036가, 프랙탈카인 매개된 칼슘 유입을 1.3nM의 IC50으로 억제하였지만, 단독의 폴리펩타이드가 1μM 이하의 농도로 첨가되는 경우 세포질 칼슘 수준에서의 증가는 관찰되지 않았다.
실시예 8: 마우스 Fc를 사용한 반감기 연장 포맷의 탐구
대안적인 반감기 연장 방식을 조사하기 위해, 66B02 VHH 도메인은 마우스 IgG2 Fc 도메인(66B02-mFc)과의 융합 단백질로서 제조하였다. 아스파르트산의 알라닌으로의 돌연변이(D265A)를 CH2 도메인에 혼입하여 상기 작제물에서 잠재적인 Fc-매개된 이펙터 기능을 폐지시켰다(문헌 참조: Baudino, J. Immunol., 181, 6664-6669 (2008)). 66B02-mFc는 HEK293T 세포 또는 NS0 세포에서 발현시키고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 분자는, 실시예 7에 기술된 검정 포맷을 사용하여 활성에 대해 시험하였다. 상기 결과는 표 33에 요약한다:
[표 33]
Figure pct00073
66B02-mFc는 잠재적으로 프랙탈카인 매개된 CX3CR1 활성화를 억제하였고, 이것은 효능제 활성을 나타내지 않았다. 세포질 칼슘 수준의 증가는 1μM 이하의 상기 분자로 처리시 관찰되지 않았다.
실시예 9: 마우스 죽상 동맥경화증 모델 2가 반감기 연장된 폴리펩타이드에서의 플라크 진행의 억제
사람 CX3CR1 녹-인(knock-in) Apo E -/- 마우스의 생성
마우스 CX3CR1에 대해 동정된 VHH의 교차 반응성이 결여된 경우(실시예 5), 사람 CX3CR1 녹-인 마우스주(hu CX3CR1 KI)는 TaconicArtemis(Koeln, Germany)에서 제조하여 마우스 질환 모델에서 이들 분자의 시험을 가능할 수 있게 하였다. 내인성 마우스 단백질의 발현을 붕괴시키면서 상응하는 마우스 프로모터의 조절 하에 사람 케모카인 수용체의 발현을 가능하게 하는 전략을 사용하였다. 간략하게, 엑손 2에서 마우스 CX3CR1 암호화 영역이, 완전한 사람 CX3CR1 개방 판독 프레임으로 대체되고, 선별 마커 및 loxP 부위에 의해 플랭킹된, 표적화 벡터를 작제하였다. 상기 표적화 벡터는 마우스 ES 세포에 도입하였고, 성공적으로 상동성 재조합을 진행한 클론을 사용하여 키메라 마우스를 제조하였다. 이들 마우스는 고도로 효율적인 Flp-결실자 마우스로 사육하여 선별 마커를 제거하고 생식선 전이를 성취하였다. C57BL/6 백그라운드에서 상기 수득한 hu CX3CR1 KI 마우스는, 이어서, Apo E-/- 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)와 교차시켜 hu CX3CR1 KI Apo E-/- 마우스를 생성시켰다. 상기 Apo E-/- 마우스 모델은, 플라크 형성, 조직학적 조성, 및 공지된 위험 인자(콜레스테롤, 염증, 고혈압 등)의 부위 특이적 국소화와 관련하여 사람 질환과 유사한 광범위 죽상 동맥경화증 플라크 형성을 유발하는 강한 방법을 제공한다.
상기 마우스 Apo E -/- 죽상 동맥경화증 모델에서 항-CX3CR1 2가 반감기 연장된 폴리펩타이드의 평가
암컷 hu CX3CR1KI ApoE-/- 마우스는, 4주령에 시작하여 1.5% 콜레스테롤을 함유하는 고지방/고콜레스테롤 식이물을 16주 동안 공급하였다. 10주 후, 상기 동물에 복강 주사 비히클(20mM Na시트레이트 pH 6.0, 115mM NaCl)에 의해, 10mg/kg 66B02-mFc를 주당 1회 또는 2회 또는 30mg/kg CX3CR1 BII036을 2회 6주 동안 투여하였다. 상기 동물은 가스 마취제에 의해 마취시키고, 0.9% 염수로 관류시켰다. 회장 분기로의 하행 대동맥을 주의 깊게 제거하고, 포르말린 중에 고정시켰다. 이어서, 세로로 개방하고, 15분 동안 수단 IV에 이어서 2분 동안 70% 메탄올로 염색시켰다. 상기 용기는 흐르는 물에 세척하고, PBS로 채웠다. 상기 조직은 SPOT 어드밴스드 소프트웨어(SPOT 이미지화 용액, Sterling Heights, MI, USA)를 사용하는 디지털 카메라로 촬영하였다. 지질 염색의 %는 이미지 분석 소프트웨어(Image-Pro Plus, MediaCybernetics, Rockville, MD, USA)로 측정하고, 상기 용기의 % 양성 염색으로서 나타내었다. 상기 연구로부터의 결과는 표 34에 요약한다:
[표 34]
Figure pct00074
66B02-mFc 및 CX3CR1 BII036 둘 다는, 주당 2회 투약되는 경우 플라크 진행을 상당히 억제하였다. 이들 분자의 혈장 수준으로서 범위와 상호관련된 이것은, 상기 연구 전반에 걸쳐 유지되는 것으로 확인될 수 있다. 66B02-mFc를 주당 1회 투약하기 위해, 검출가능한 혈장 수준은 유지되지 않았고, 이것은 치료 6주 후에 관찰된 상당한 효능의 결여와 상호관련되어 있다. 분자는 혈장 콜레스테롤 또는 트리글리세라이드 수준에 현저한 영향을 미치지 않았다.
실시예 10: 모 VHH의 서열 최적화
일반적으로, VHH 서열 최적화 동안에, 모 야생형 VHH 서열을 돌연변이시켜 사람 VH3-JH 생식선 컨센서스 서열과 보다 동일한 VHH 서열을 생성시킨다. VHH와 사람 VH3-JH 생식선 컨센서스 사이에 상이한 프레임워크 영역에서 특이적 아미노산은, 단백질 구조, 활성 및 안정성이 온전하게 유지되는 방식으로 사람 대응물로 변경된다. 이를 조사하기 위해, 모든 서열 최적화 변이체는, 3개의 상이한 검정으로 모 VHH와 비교하였다: (i) 열 시프트 검정(TSA)에서의 용융 온도(Tm)의 측정, (ii) 프랙탈카인 경쟁 FACS에서 및 일부 작제물에 대한 시험관내 잠재력의 분석, (iii) 프랙탈카인 유도된 주화성 검정에서의 시험관내 효력의 분석.
프레임워크 잔기의 돌연변이
서열 최적화를 위해, 하기의 돌연변이를 조사하였다: E1D, S11L, A14P, E16G, R44Q, D46E, A74S, K83R 및 Q108L. CX3CR1 BII66B02의 모 서열에서 생성된 상기 개별 돌연변이는 표 35에 나타낸다:
[표 35]
Figure pct00075
모든 작제물은 이. 콜라이 발현 벡터에서 클로닝하였고, 이. 콜라이에서 2.25L 내지 0.5L TB 배지의 배양 용적으로 myc/His-태그된 단백질로서 발현시켰다. 1mM IPTG의 첨가로 발현을 유도하였고, 37℃ 및 250rpm에서 4시간 동안 계속 발현시켰다. 세포를 펠렛화하였고, 주변세포질 추출물은, 동결 건조시키고 dPBS 중에 재현탁시켜 제조하였다. 이들 추출물은 Histrap FF 조 컬럼(GE healthcare)을 사용하는 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 위한 출발 물질로서 사용하였다. 나노바디는 250mM 이미다졸로 상기 칼럼으로부터 용출시켰고, 후속적으로, dPBS로 탈염시켰다. 나노바디의 순도 및 통합성은 환원성 SDS-PAGE에 의해 입증되었다.
표 36에 요약된 바와 같이, A14P, A74S, K83R 및 Q108L 돌연변이는 경쟁 FACS로부터 측정된 바와 같이 효력에 대한 명백한 효과를 갖지 않았다. 유사하게, 상기 추가의 돌연변이 E1D, S11L 및 E16G는 효력에 영향을 미치지 않았다. 다른 한편 R44Q 또는 D46E의 도입은, 양쪽 돌연변이를 둘 다 도입한 경우에도 보다 현저하게 효력을 상당히 저하시켰다.
[표 36]
Figure pct00076
또한, VHH의 안정성을 예측하는 용융 온도를 평가하였다. 대부분의 개별 돌연변이는, 용융 온도를 대략 6℃까지 상승시키는 D46E 돌연변이를 제외하고는 어떠한 효과로 제한되지 않았다. 조합된 돌연변이의 도입은, 또한, 열 안정성, cfr 057 및 060을 증진시켰다.
리간드 경쟁 FACS에서 효력에 대한 주요 효과로 인해, 돌연변이 R44Q 및 D46E를 최종 서열에 포함시키지 않았다.
CDR 잔기들의 돌연변이
모 서열의 인 실리코(in silico) 분석을 기준으로, 당화 부위는 52번 위치에서 예측하였다. 따라서, 2개의 라이브러리, 52번 위치에서 1개 및 53번 위치에서 1개를 작제하였고, 이들은 각각의 위치에서 모든 가능한 아미노산을 포함하도록 고안되었다. 상기 라이브러리는, 리간드 경쟁 FACS에서 주변세포질 추출물로서 스크리닝되었다. 첫번째로, 연속 희석물은 모 서열 유래의 주변세포질 물질로 이루어졌고, 3개의 희석물은 추가의 스크리닝을 위해 선별하였다. 제1 희석점(2배)은 리간드 상호작용을 완전히 차단시키는 것으로 선택된 반면 다른 2개의 희석점(128 및 512배)은 각각 70% 및 40% 차단시켜야만 한다. 라이브러리 유래의 주변세포질 추출물의 생성시, 모든 샘플을 2개로 나누고, 이들 중 하나를 열 처리하였다. 후속적으로, 비처리된 샘플과 열 처리된 샘플 둘 다를 3개의 희석점에서 리간드 경쟁 FACS에서 분석하였다. 돌연변이의 영향은, 모 서열 유래의 차단과 수득된 차단을 비교함에 의해 평가될 수 있었다. 열 처리된 샘플의 분석은, 돌연변이의 안정성에 대한 잠재적 영향에 대한 척도를 제공한다.
초기 스크리닝 결과를 기준으로, 7개의 돌연변이가 추가의 특성확인을 위해 선택되었다. 리간드 경쟁 FACS에서 상기 수득된 효력은 표 37에 나타낸다.
[표 37]
Figure pct00077
상기 분석으로부터, 사람 참조 서열과의 서열 정렬, 및 인 실리코 T 세포 에피토프 인식 예측 프로그램을 기초로, 상기 서열에서 돌연변이 N52S 및 S53T가 포함되도록 결정되었다.
안정성의 이유로, 추가의 라이브러리는 32번 위치에 대해 제조되었다. 상기 리간드 경쟁 스크리닝은, 상기 기술된 바와 유사한 방식으로 설정하였다. 다시, 주변세포질 추출물의 3개의 희석물을 스크리닝하였고, 수득된 차단 %을 모 서열에 대해 수득된 것과 비교하였다. 다양한 돌연변이체의 분석으로 N32T의 치환을 선택하였고, 최종 서열 최적화된 변이체에 포함시켰다.
실시예 11: 최적화된 변이체의 분석
최종 특성확인 라운드에서, 표 38에 열거된 작제물을 특성확인하였다.
[표 38]
Figure pct00078
용융 온도의 측정 뿐만 아니라 경쟁 FACS 실험은, 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 상기 수득된 값은 표 39에 나타낸다.
[표 39]
Figure pct00079
이들 작제물은, 또한, 상기 기술된 바와 같은 프랙탈카인 유도된 주화성에서 특성확인하였다(표 40).
[표 40]
Figure pct00080
선택된 작제물은, CHO huCX3CR1 세포에서 A647-프랙탈카인 유도된 내재화의 억제에 대해 평가하였다. 상기 결과는 표 41에 요약한다:
[표 41]
Figure pct00081
서열 최적화된 항-CX3CR1 반감기 연장된 폴리펩타이드는 효능제 활성이 없다
서열 최적화된 항-CX3CR1 반감기 연장된 폴리펩타이드가 효능제 활성을 갖지 않음을 확인하기 위해, CX3CR1 BII00313은, CHO huCX3CR1 세포에서의 칼슘 유입의 유도에 대해 평가하였다. CX3CR1 BII00313과의 예비 항온배양이 1.3nM의 IC50으로 프랙탈카인-매개된 칼슘 유입을 억제하였고, 단독의 폴리펩타이드가 1μM 이하의 농도로 첨가되는 경우 세포질 칼슘 수준의 증가가 관찰되지 않았다.
실시예 12: 사람 Fc를 사용하는 반감기 연장 포맷의 탐구
추가의 반감기 연장 방식을 조사하기 위해, CX3CR1 BII00306 및 CX3CR1 BII00307 서열 최적화된 VHH 도메인을 사람 IgG1 Fc 도메인(306D-hFc 및 307D-hFc)과의 융합 단백질로서 제조하였다. 2개의 돌연변이를 CH2 도메인에 혼입하여 상기 작제물에서 잠재적인 Fc-매개된 이펙터 기능을 제거하였다. 306D-hFc 및 307D-hFc는 HEK293T 세포 또는 NS0 세포에서 발현시키고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이들 분자는, 실시예 7에 기술된 검정 포맷을 사용하여 기능적 활성에 대해 시험하였다. 상기 결과는 표 42에 요약한다:
[표 42]
Figure pct00082
이들 분자는 프랙탈카인 매개된 CX3CR1 활성화를 억제하였지만, 이들은 효능제 활성을 나타내지 않았다. 세포질 칼슘 수준의 증가는 1μM 이하의 이들 단독의 나노바디 처리시 관찰되지 않았다.
실시예 13: 서열 최적화된 항-CX3CR1 나노바디에 의한 마우스 죽상 동맥경화증 모델에서의 플라크 진행의 억제
암컷 hu CX3CR1KI ApoE-/- 마우스에 4주령에 시작하여 1.5% 콜레스테롤을 함유하는 고지방/고콜레스테롤 식이물을 16주 동안 공급하였다. 10주 후, 상기 동물에 복강 주사 비히클(20mM Na시트레이트 pH 6.0, 115mM NaCl)에 의해, 6주 동안 30mg/kg의 CX3CR1 BII036을 주당 1회 또는 2회 또는 30mg/kg의 CX3CR1 BII036을 주당 2회 투여하였다. 상기 동물은 희생시키고, 하행 대동맥에서 플라크 영역의 %를, 상기 기술된 바와 같이 정량하였다. 상기 연구로부터의 결과는 표 43에 요약한다:
[표 43]
Figure pct00083
CX3CR1 BII00313 및 CX3CR1 BII036 둘 다는, 주당 2회 투약되는 경우, 플라크 진행을 상당히 억제하였다. 이들 분자의 혈장 수준으로서 범위와 상호관련된 이것은, 상기 연구 전반에 걸쳐 유지되는 것으로 확인될 수 있었다. CX3CR1 BII00313을 주당 1회 투약하기 위해, 검출가능한 혈장 수준은 유지되지 않았고, 이것은 치료 6주 후에 관찰된 상당한 효능의 결여와 상호관련되어 있다. 분자는, 혈장 콜레스테롤 또는 트리글리세라이드 수준에 상당한 영향을 미치지 않았다.
실시예 14: 전혈에서 주요 사람 및 사이노몰거스 원숭이 CD14+ 세포에 결합하는 나노바디
포맷된 서열 최적화된 항-CX3CR1 나노바디와의 FACS의 경쟁
사람 주요 세포에 대한 상기 포맷된 서열 최적화된 항-CX3CR1 나노바디의 결합을 확인하기 위해, CX3CR1 BII00313은, 전혈에서 경쟁 FACS 검정에서 CD14+ 세포에 대한 A647 표지된 CX3CR1 BII018(A647-018)의 결합을 위해 경쟁하는 것으로 입증되었다. 간략하게, eFluor 450(eBioscience, San Diego, CA, USA)과 접합된 마우스 항-사람 CD14 항체는, 건강한 사람 공여자 유래의 EDTA 처리된 전혈에서 1:10으로 희석시켰다. 40㎕/웰은 96웰 폴리스티렌 환저 플레이트에 첨가하고, 이어서, 10㎕/웰의 CX3CR1 BII00313을 100nM 내지 0.002pM 범위의 최종 농도로 BSA(BD Pharmingen)으로 스타인 완충액 중에 희석시키고, 상기 샘플은 20분 동안 실온에서 항온배양하였다. 이어서, 스타인 완충액 중에서 10㎕/웰의 A647-018을 첨가하여 최종 농도가 1nM(A647-018 결합의 EC80)이 되도록 하였고, 상기 샘플은 실온에서 추가로 20분 동안 항온배양하였다. 이어서, 220㎕/웰의 1-단계 Fix/Lyse 용액(eBioscience)을 첨가하였다. 10분의 실온 항온배양 후, 상기 세포를 펠렛화하고, 스타인 완충액 중에서 2회 세척하고, 상기 완충액에 재현탁시켰다. 상기 샘플은 BD LSR II 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. AlexaFluor 647에 대한 평균 형광 강도는 게이트 CD14 양성 세포 집단에 대해 정량하였다. CX3CR1 BII00313은, 사람 혈액에서 CD14 양성 세포에 대한 A647-018의 결합을 0.35nM의 IC50(n=8)으로 잠재적으로 억제하였다.
사이노몰거스 원숭이 주요 세포에 대한 상기 포맷된 서열 최적화된 항-CX3CR1 나노바디의 결합을 확인한 결과, CX3CR1 BII00313은, 사이노몰거스 원숭이 전혈에서 경쟁 FACS 검정에서 CD14+ 세포에 대한 A647 표지된 CX3CR1 BII018 (A647-018)의 결합에 대해 경쟁하는 것으로 입증되었다. 사용된 상기 방법은, A647-018의 최종 농도가 3nM(A647-018 결합의 EC80)이고 ACK 가수분해 완충액(Life Technologies)이 1-단계 Fix/Lyse 용액 대신 사용하였다는 것을 제외하고는 상기 개요된 바와 유사하였다. 상기 세포는, 분석 전에 1% 포름알데하이드가 보충된 스타인 완충액 중에 재현탁시켰다. CX3CR1 BII00313은, 사이노몰거스 원숭이 혈액에서 CD14 양성 세포에 대한 A647-018의 결합을 0.43nM의 IC50(n=4)으로 억제하였다.
실시예 15: 사이노몰거스 원숭이에서의 약동학(PK)
약동학적 연구는 2 내지 5년령이고 체중 범위가 2.4 내지 3.5kg인 순수 수컷 사이노몰거스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에서 수행하였다. 상기 원숭이는 4개의 처리 그룹으로 나누었다. 그룹 1(n=3)에 정맥내로 0.2mg/kg의 CX3CR1 BII00313을 투여하고; 그룹 2(n=3)에는 2mg/kg의 CX3CR1 BII00313을 정맥내로 투여하고; 그룹 3(n=3)에는 2mg/kg의 CX3CR1 BII00313을 피하 투여하고; 그룹 4(n=3)에는 5mg/kg의 CX3CR1 BII00313을 정맥내 투여하였다. CX3CR1 BII00313을 시트레이트 완충액(20mM 나트륨 시트레이트/115mM 염화 나트륨, pH 6.0) 중에서 2mg/ml의 용액으로서 투여하였다. 혈액 샘플은, PK 분석을 위해 말초 정맥으로부터 혈청 분리기 튜브에 6주 이상 수집하였다.
혈청 샘플은 MSD(Meso Scale Discovery) 포맷을 사용하여 분석하였다. 간략하게, 비오티닐화된 항-나노바디 항체는 MSD 표준 스트렙트아비딘 플레이트(Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA)에 결합시켰다. 상기 플레이트는, 혈청 샘플과의 항온배양 전에 인산 완충 염수에서 0.05% Tween 20으로 세척하고 5% w/v의 SeraCare BSA(SeraCare Life Sciences, Milford, MA, USA)로 차단시켰다. CX3CR1 BII00313은 황-표지된 항-나노바디 나노바디를 사용하여 검출하였고, 상기 플레이트는 Sector Imager 2400(Meso Scale Discovery) 상에서 분석하였다. 5% 원숭이 혈청에서 5000 내지 0.5ng/ml의 다양한 농도의 CX3CR1 BII0313을 표준물로서 사용하였다. 표적 관여는, CD14+ 게이팅된 단핵구 상의 유리된 CX3CR1의 수준을 모니터링함에 의해 평가하였다. 상기 검정은, 어떠한 추가의 CX3CR1 BII00313이 첨가되지 않는 것을 제외하고는 실시예 14에 요약된 경쟁 FACS 검정과 유사하였다. 혈청 샘플은, 또한, PK 및 유리된 CX3CR1의 평가에 영향을 줄 수 있으므로 영장류 항-사람 항체(PAHA)의 존재에 대해 모니터링하였다.
ForteBio RED96은 PAHA의 검출을 위해 사용하였다. 간략하게, 비오티닐화된CX3CR1BII0313은 스트렙트아비딘 센서 상에 포획하였다. 이어서, 풀링된 순수 원숭이 혈청을 컷-오프 값(순수 혈청의 평균 결합 신호 2배의 초과로서 정의된다)을 계산하기 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 혈청 샘플은 완충액 중에서 20배 희석시키고, PAHA 반응은 결합 신호가 상기 컷-오프 값을 초과하는 경우 양성인 것으로 측정되었다.
PAHA의 검출 후 시점에 대한 데이터는 PK/PD 분석으로부터 배제하였다. PK 데이터는 하기 표 44에 요약한다.
[표 44]
Figure pct00084
정맥내 2.0mg/kg에서 제거율 및 반감기는 각각 9.4 mL/d/kg 및 9.6일이었다. 정맥내 0.2mg/kg에서, 제거율은, 포화시킬 수 있는 표적-매개된 기질(TMP) 약동학에 일치하여 실질적으로 높았다(113mL/d/kg). 용량-조정된 AUC(0-14d)는, 정맥내 2 내지 5mg/kg 용량에서 비교가능하였고, 이는 2mg/kg 용량에서 TMD의 포화를 시사한다. 정맥내 또는 피하 나노바디 투여 후 2주째에 노출은, > 70nM이었고, 피하 투여 후 생체이용률은 54%였다. 90% 초과의 표적 범위와의 노출로 추적된 유리된 수용체는 10nM 초과의 노출에서 유지시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH <120> CX3CR1-BINDING POLYPEPTIDES <130> 09-0569 <150> US 61/603,622 <151> 2013-02-27 <160> 282 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 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Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln 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Ser 115 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Val Asp Ile Thr Lys 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sequence <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu 35 40 45 Val Ala Leu Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys 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<220> <223> Linker sequence <400> 241 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 242 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 242 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 243 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 243 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 244 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 244 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 245 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 245 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 1 5 10 15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 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Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu 260 265 270 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met 275 280 285 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser 290 295 300 Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 305 310 315 320 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln 325 330 335 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile 340 345 350 Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 355 360 365 Ser <210> 278 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 278 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 165 170 175 Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln 180 185 190 Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly 195 200 205 Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 210 215 220 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp 245 250 255 Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 290 295 300 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 305 310 315 320 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser 325 330 335 Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 340 345 350 Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 355 360 365 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg 370 375 380 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 385 390 395 <210> 279 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 279 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala 145 150 155 160 Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala 165 170 175 Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser 210 215 220 Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 290 295 300 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 305 310 315 320 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser 325 330 335 Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 340 345 350 Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 355 360 365 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg 370 375 380 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 385 390 395 <210> 280 <211> 421 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 280 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 165 170 175 Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln 180 185 190 Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly 195 200 205 Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 210 215 220 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp 245 250 255 Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 305 310 315 320 Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 325 330 335 Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 340 345 350 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp 355 360 365 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 370 375 380 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 385 390 395 400 Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu 405 410 415 Val Thr Val Ser Ser 420 <210> 281 <211> 421 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 281 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 165 170 175 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln 180 185 190 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 210 215 220 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 225 230 235 240 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser 245 250 255 Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 260 265 270 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 290 295 300 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser 305 310 315 320 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala 325 330 335 Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala 340 345 350 Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 355 360 365 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 370 375 380 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser 385 390 395 400 Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 405 410 415 Val Thr Val Ser Ser 420 <210> 282 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody sequence <400> 282 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gln Phe Asp Tyr Tyr Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe 180 185 190 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val Ala Gly Ile Ser Gly 195 200 205 Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220 Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Asn Ser 245 250 255 Tyr Pro Lys Val Gln Phe Asp Tyr Tyr Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 260 265 270 Val Ser Ser 275

Claims (59)

  1. 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는, 사람 CX3CR1에 대한 사람 프랙탈카인의 결합을 차단할 수 있는, 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 필수적으로 4개의 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3)로 이루어진, 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VH, VL, VHH, 낙타화된 VH, 또는 사람 프레임워크 영역들에 대한 안정성, 효력, 제조가능성 및/또는 유사성에 대해 최적화된 VHH인, 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가,
    c) 세포 결합 FACS에 의한 측정시, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 EC50; 또는
    d) 경쟁 FACS에 의한 측정시, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로, 사람 CX3CR1에 대해 친화성을 갖는, 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 사람 프랙탈카인의 사람 CX3CR1에 대한 결합을 300nM 이하, 100nM 이하, 20nM 이하, 10nM 이하, 5nM 이하, 2.5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50으로 차단하는, 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(서열번호 197)[여기서,
    - Xaa1는 Pro, Ala 또는 Gly이고;
    - Xaa2는 Asp 또는 Asn이고;
    - Xaa3은 Thr 또는 Ser이고;
    - Xaa4는 Arg, Lys, Ala 또는 Gly이고;
    - Xaa5는 Tyr 또는 Phe이다]의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 CDR3이 Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr(서열번호 186)의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서,
    - 각각 서열번호 213, 221 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 162 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 163 및 187;
    - 각각 서열번호 141, 164 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 166 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 167 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 167 및 189;
    - 각각 서열번호 141, 168 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 168 및 187;
    - 각각 서열번호 141, 169 및 190;
    - 각각 서열번호 141, 170 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 171 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 174 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 175 및 187;
    - 각각 서열번호 142, 165 및 188;
    - 각각 서열번호 142, 173 및 188;
    - 각각 서열번호 143, 164 및 186;
    - 각각 서열번호 144, 172 및 187;
    - 각각 서열번호 145, 172 및 187;
    - 각각 서열번호 141, 214 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 215 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 216 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 217 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 218 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 219 및 186;
    - 각각 서열번호 141, 220 및 186; 또는
    - 각각 서열번호 213, 214 및 186
    에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서,
    - 각각 서열번호 146, 176 및 191; 또는
    - 각각 서열번호 146, 177 및 191에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서,
    - 각각 서열번호 147, 178 및 192;
    - 각각 서열번호 147, 179 및 192;
    - 각각 서열번호 147, 179 및 194;
    - 각각 서열번호 148, 179 및 193;
    - 각각 서열번호 149, 179 및 192;
    - 각각 서열번호 149, 180 및 192;
    - 각각 서열번호 149, 181 및 192;
    - 각각 서열번호 149, 183 및 192;
    - 각각 서열번호 149, 185 및 192;
    - 각각 서열번호 150, 179 및 194;
    - 각각 서열번호 150, 182 및 194;
    - 각각 서열번호 151, 179 및 193;
    - 각각 서열번호 151, 182 및 194;
    - 각각 서열번호 151, 184 및 196;
    - 각각 서열번호 152, 179 및 195;
    - 각각 서열번호 153, 179 및 194;
    - 각각 서열번호 154, 182 및 194;
    - 각각 서열번호 155, 179 및 195;
    - 각각 서열번호 156, 181 및 192;
    - 각각 서열번호 157, 179 및 194;
    - 각각 서열번호 158, 179 및 192;
    - 각각 서열번호 159, 178 및 192;
    - 각각 서열번호 160, 179 및 194; 또는
    - 각각 서열번호 161, 179 및 194
    에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서, 각각 서열번호 141, 164 및 186, 각각 서열번호 141, 162 및 186, 각각 서열번호 213, 214 및 186, 또는 각각 서열번호 213, 221 및 186에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이,
    a) 서열번호 3의 아미노산 서열,
    b) 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    c) 서열번호 1 내지 48, 121 내지 140 또는 222 내지 224 중 어느 하나의 아미노산 서열에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이,
    a) 서열번호 49의 아미노산 서열,
    b)서열번호 49의 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    c) 서열번호 49 내지 52 중 어느 하나의 아미노산 서열에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이,
    a) 서열번호 67의 아미노산 서열,
    b)서열번호 67의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    c) 서열번호 53 내지 120 중 어느 하나의 아미노산 서열에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 1에, 서열번호 3에, 서열번호 121 내지 140 또는 서열번호 222 내지 224에 제시된 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로로불린 단일 가변 도메인이,
    a) 서열번호 1 내지 120, 121 내지 140 및 222 내지 224의 면역글로불린 단일 가변 도메인들 중 하나 이상의 CX3CR1에 대한 결합을 교차 차단하거나,
    b) 서열번호 1 내지 120, 121 내지 140 및 222 내지 224의 면역글로불린 단일 가변 도메인들 중 하나 이상에 의한 CX3CR1에 대한 결합이 교차 차단되는, 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가, 상기 폴리펩타이드에 공유 결합되고, 항-알부민-면역글로불린 도메인과 같은 알부민 결합 모이어티, 항-트랜스페린 면역글로불린 도메인과 같은 트랜스페린 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 사람 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민의 단편, 알부민 결합 펩타이드 또는 Fc 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 이루어진, 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이, VHH 도메인, 사람화된 VHH 도메인, 낙타화된 VH 도메인, 도메인 항체, 단일 도메인 항체 및/또는 "dAb"로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 230 내지 232 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해 Fc 부분에 연결되는, 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제2 항-CX3CR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, VH, VL, VHH, 낙타화된 VH, 또는 안정성, 효력, 제조가능성 및/또는 사람 프레임워크 영역과의 유사성에 대해 최적화된 VHH인, 폴리펩타이드.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이, 동일한 VHH 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  30. 제1항에 있어서, 서열번호 141, 164 및 186, 서열번호 141, 162 및 186, 서열번호 213, 214 및 186, 또는 서열번호 213, 221 및 186에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 제시된 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 141, 164 및 186, 서열번호 141, 162 및 186, 서열번호 213, 214 및 186, 또는 서열번호 213, 221 및 186에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  32. 제1항에 있어서, 서열번호 1에, 서열번호 3에, 또는 서열번호 121 내지 140 또는 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이, 서열번호 1에, 서열번호 3에, 또는 서열번호 121 내지 140 또는 222 내지 224 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 VHH 도메인인, 폴리펩타이드.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가, 상기 폴리펩타이드에 공유 결합되고, 항-알부민-면역글로불린 도메인과 같은 알부민 결합 모이어티, 항-트랜스페린 면역글로불린 도메인과 같은 트랜스페린 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 사람 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민의 단편, 알부민 결합 펩타이드 또는 Fc 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  36. 제35항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 이루어진, 폴리펩타이드.
  37. 제36항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인, 사람화된 VHH 도메인, 낙타화된 VH 도메인, 도메인 항체, 단일 도메인 항체 및/또는 "dAb"으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열번호 230 내지 232로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  39. 제35항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해 Fc 부분에 연결되는, 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 225 내지 227 또는 257 내지 262 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  41. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 253, 254, 또는 263 내지 266 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  42. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 249, 277 내지 281, 및 267 내지 276 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는, 핵산 분자.
  44. 제43항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  45. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 상기 폴리펩타이드를 발현할 수 있는, 숙주 세포.
  46. (i) 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, (ii)약제학적으로 허용되는 담체, 및 (iii) 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 사람에서의 정맥 주사 또는 피하 주사에 적합한, 약제학적 조성물.
  48. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
    - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 숙주 세포가, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 지니고, 상기 숙주 세포가 원핵 또는 진핵 세포인, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    - 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계; 및
    - 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 사람에서의 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화에 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
  51. 제50항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가, CX3CR1-연관된 질환, 장애 또는 병태인, 폴리펩타이드.
  52. 제51항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura) 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 또는 암으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  53. 제52항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 죽상 동맥경화증인, 폴리펩타이드.
  54. 사람에서 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 용도.
  55. CX3CR1 연관된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 활성량의 폴리펩타이드를 투여함을 포함하는, CX3CR1 연관된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 또는 암으로부터 선택되는, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 죽상 동맥경화증인, 방법.
  58. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 용도를 포함하는, 진단 키트 또는 진단 방법.
  59. 제58항에 있어서, 심혈관 및 뇌혈관 죽상 동맥경화성 장애, 말초 동맥 질환, 재협착증, 당뇨성 신경병증, 사구체신염, 사람 반월형 사구체신염, IgA 신경병증, 막성 신경병증, 낭창성 신장염, 헤노흐 쇤라인 자반증 및 베게너 육아종증을 포함하는 혈관염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식편 거부, 전신성 경화증, 신경 퇴행성 장애 및 탈수초 질환, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머 질환, COPD와 같은 폐 질환, 천식, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 또는 암 중 하나 이상의 진단을 위한, 진단 키트 또는 진단 방법.
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