MD4548C1 - Polipeptide care se leagă de CX3CR1 - Google Patents

Polipeptide care se leagă de CX3CR1 Download PDF

Info

Publication number
MD4548C1
MD4548C1 MDA20140104A MD20140104A MD4548C1 MD 4548 C1 MD4548 C1 MD 4548C1 MD A20140104 A MDA20140104 A MD A20140104A MD 20140104 A MD20140104 A MD 20140104A MD 4548 C1 MD4548 C1 MD 4548C1
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
polypeptide
seq
secv
cx3cr1
amino acid
Prior art date
Application number
MDA20140104A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Other versions
MD20140104A2 (ro
MD4548B1 (ro
Inventor
Санджайа СИНГХ
Алиса К. Уотерман
Эрик ДЕПЛА
Тун ЛАЕРМАНС
ХОРИК Дайен ВАН
Седрик Йозеф Неотере ВЕРВЕРКЕН
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47884535&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MD4548(C1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Publication of MD20140104A2 publication Critical patent/MD20140104A2/ro
Publication of MD4548B1 publication Critical patent/MD4548B1/ro
Publication of MD4548C1 publication Critical patent/MD4548C1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la imunologie, în special la polipeptide care se leagă de CX3CR1, şi anume la polipeptide care cuprind domenii imunoglobulinice specifice.Invenţia se referă, de asemenea, la acizi nucleici care codifică astfel de polipeptide, la procedee de obţinere a unor astfel de polipeptide, la celule-gazdă care expresează sau sunt capabile să expreseze astfel de polipeptide, la compoziţii care conţin astfel de polipeptide şi la utilizări ale unor astfel de polipeptide sau ale acestor compoziţii în scopuri profilactice, terapeutice şi diagnostice.Secvenţe: 282

Description

Prezenta invenţie se referă la polipeptide care se leagă de CX3CR1, în special polipeptide care cuprind domenii imunoglobulinice specifice. Invenţia se referă, de asemenea, la acizi nucleici care codifică astfel de polipeptide; la procedee de obţinere a unor astfel de polipeptide; la celule-gazdă care exprimă sau sunt capabile să exprime astfel de polipeptide; la compoziţii care conţin astfel de polipeptide; şi la utilizări ale unor astfel de polipeptide sau astfel de compoziţii, în special pentru scopuri profilactice, terapeutice şi diagnostice.
CX3CR1 este o proteină membranică integrală cuplată cu G-proteina, care este un receptor de chemokine. Ea este exprimată predominant pe tipuri de celule, cum ar fi monocitele, celulele dendritice şi celulele T care au fost asociate cu iniţierea şi progresia plăcilor aterosclerotice. Ea este suprareglată pe monocite de lipidele oxidate şi mediază migrarea acestor celule şi supravieţuirea lor în interiorul plăcilor. Fractalkina (FKN) sa unică ligandă este exprimată pe suprafaţa celulelor endoteliale vasculare şi musculare netede în leziunile unde ea modulează adeziunea leucocitelor. Fractalkina este, de asemenea, eliberată în circulaţie prin clivaj proteolitic unde aceasta funcţionează ca un agent chemotactic.
La fiinţele umane, o variantă CX3CR1 (V249I/T280M) cu activitate redusă s-a dovedit a fi asociată cu un risc mai redus de boli cardiovasculare (boli coronariene, boli cerebro-vasculare sau boli vasculare periferice) [1], boli arteriale coronariene (dovezi angiografice privind stenoza) [2], şi boli oclusive ale arterei carotide [3]. CX3CR1 s-a colocalizat cu fractalkina care a demonstrat o imunocolorare sporită de anticorpii policlonali în plăcile aterosclerotice [4]. Nu s-a observat colorarea fractalkinei în regiunile arteriale fără plăci.
Mai multe studii genetice independente pe şoareci au demonstrat un efect benefic al deficienţei CX3CR1 asupra aterosclerozei. O reducere în zona leziunii în arcul aortic şi aorta toracică, precum şi o scădere în acumularea monocitelor/macrofagilor în plăci s-a observat în două tulpini derivate independent ale şoarecilor CX3CR1-/- apoE-/- hrăniţi cu o dietă bogată în grăsimi (Combadière.; Circulation, 107, 2003, p.1009), [5].
Acest lucru arată că CX3CR1 este implicată în bolile cardiovasculare şi modularea activităţii sale ar putea oferi terapii promiţătoare. Prin urmare, există necesitatea de molecule antagoniste împotriva CX3CR1 cu proprietăţi farmacologice benefice, care pot fi utilizate ca agenţi terapeutici pentru a trata boli, în special boli cardiovasculare la fiinţele umane.
Prin urmare, un obiectiv al prezentei invenţii este de a oferi molecule antagoniste anti-CX3CR1, în special molecule antagoniste anti-CX3CR1, care au afinitate mare de legare la CX3CR1.
Un alt obiectiv al prezentei invenţii este de a oferi molecule antagoniste anti-CX3CR1, care au specificitate înaltă pentru CX3CR1.
Un alt obiectiv al prezentei invenţii este de a oferi antagonişti anti-CX3CR1, care au o activitate puternică.
Un alt obiectiv al prezentei invenţii este de a oferi antagonişti anti-CX3CR1, care posedă o biodisponibilitate şi timp de înjumătăţire favorabil.
Un alt obiectiv al prezentei invenţii este de a oferi antagonişti anti-CX3CR1, care posedă proprietăţi biofizice favorabile.
Obiective suplimentare ale prezentei invenţii includ combinaţii din oricare dintre obiectivele sus-menţionate.
Invenţia furnizează polipeptide care se leagă de CX3CR1 umană şi sunt capabile să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană. Într-un aspect, polipeptida este o imunoglobulină care conţine un domeniu de legare la antigen, care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii CDR1, CDR2 şi CDR3, unde imunoglobulina respectivă se leagă de CX3CR1 umană şi este capabilă să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană. Într-un alt aspect, polipeptida cuprinde unul sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1, unde polipeptida respectivă este capabilă să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană.
Într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii este caracterizată prin una sau mai multe dintre următoarele proprietăţi:
- de a se lega cu afinitate mare de CX3CR1 umană;
- de a bloca legarea fractalkinei solubile de CX3CR1 umană;
- de a inhiba chemotaxia indusă de fractalkină;
- de a inhiba internalizarea receptorului CX3CR1 umane indusă de fractalkină;
- de a reacţiona încrucişat cu CX3CR1 cino de 10 ori a E/IC50 pentru CX3CR1 umană pentru legarea şi inhibarea funcţională.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 şi cuprinde în plus o fracţiune de extindere a timpului de înjumătăţire, de exemplu, o fracţiune de legare a albuminei, o moleculă de polietilen glicol sau un domeniu Fc. Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde două sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1. Într-un aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 sunt legate covalent de o peptidă linker. Într-un aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 într-o polipeptidă din prezenta invenţie au aceeaşi secvenţă de aminoacizi. Într-un alt aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 într-o polipeptidă din prezenta invenţie au diferite secvenţe de aminoacizi. Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 şi cuprinde în plus o fracţiune de extindere a timpului de înjumătăţire, de exemplu, o fracţiune de legare a albuminei, o moleculă de polietilenglicol sau un domeniu Fc.
Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde un prim domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 legat covalent la o fracţiune de legare a albuminei printr-o primă peptidă linker, unde fracţiunea respectivă de legare a albuminei este ulterior legată covalent de un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 printr-o a doua peptidă linker.
Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 legat covalent de un domeniu Fc printr-o peptidă linker. Într-un aspect, o astfel de polipeptidă care cuprinde un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 legat covalent la un domeniu Fc printr-o peptidă linker este furnizată ca un dimer, de exemplu prin punţi disulfurice.
Polipeptidele din prezenta invenţie sunt folosite pentru prevenirea, tratamentul, atenuarea şi/sau diagnosticul bolilor, afecţiunilor sau stărilor asociate cu CX3CR1, în special a bolilor cardiovasculare, cum ar fi ateroscleroza.
Într-un alt aspect, prezenta invenţie prevede următoarele:
Varianta 1 de executare: o imunoglobulină care cuprinde un domeniu de legare a antigenului, care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii CDR1, CDR2 şi CDR3, unde imunoglobulina menţionată se leagă de CX3CR1 umană şi este capabilă să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană.
Varianta 2 de executare: o polipeptidă care cuprinde unul sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1, unde polipeptida respectivă este capabilă să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană.
Varianta 3 de executare: o polipeptidă conform variantei 2 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 constă, în principal, din patru regiuni-cadru (FR1, FR2, FR3 şi FR4) şi trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR1, CDR2 şi CDR3).
Varianta 4 de executare: o polipeptidă conform variantei 3 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 are structura FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.
Varianta 5 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…4 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 este un domeniu de anticorpi.
Varianta 6 de executare: o polipeptidă conform variantei 5 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 este un VH, VL, VHH, VH camelizat, sau VHH care este optimizat în ce priveşte stabilitatea, eficacitatea, posibilitatea de producţie şi/sau similitudinea cu regiunile-cadru umane.
Varianta 7 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…6 de executare, unde polipeptida respectivă are afinitate cu CX3CR1 umană la:
a) o CE50 mai mică sau egală cu 10nM, mai mică sau egală cu 5nM, mai mică sau egală cu 2,5mM sau mai mică sau egală cu 1nM, precum este determinat de FACS (Sortarea celulelor activate prin fluorescenţă) de legare de celule; sau
b) o CI50 mai mică sau egală cu 10nM, mai mică sau egală cu 5nM, mai mică sau egală cu 2,5nM sau mai mică sau egală cu 1nM, precum este determinat prin FACS de concurenţă.
Varianta 8 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…7 de executare, unde blocurile de polipeptide menţionate care leagă fractalkina umană de CX3CR1 umană la o CI50 mai mică sau egală cu 300 nM, sau mai mică sau egală cu 100 nM, sau mai mică sau egală cu 20 nM, sau mai mică sau egală cu 10 nM, sau mai mică sau egală cu 5 nM, sau mai mică sau egală cu 2,5 nM sau mai mică sau egală cu 1 nM.
Varianta 9 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…8 de executare, unde polipeptida respectivă inhibă chemotaxia indusă de fractalkină mediată de CX3CR1 umană la o CI50 mai mică sau egală cu 500 nM, sau mai mică sau egală cu 100 nM, sau mai mică sau egală cu 75 nM, sau mai mică sau egală cu 50 nM, sau mai mică sau egală cu 10 nM sau mai mică sau egală cu 5 nM.
Varianta 10 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…9 de executare, unde polipeptida respectivă inhibă internalizarea fractalkinei mediată de CX3CR1 umană la o CI50 mai mică sau egală cu 10 nM, sau mai mică sau egală cu 5 nM sau sau mai mică sau egală cu 1 nM.
Varianta 11 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…10 de executare, unde CDR3 menţionată are secvenţa de aminoacizi Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SECV ID Nr.: 197), unde:
- Xaa1 este Pro, Ala sau Gly;
- Xaa2 este Asp sau Asn;
- Xaa3 este Thr sau Ser;
- Xaa4 este Arg, Lys, Ala sau Gly; şi
- Xaa5 este Tyr sau Phe.
Varianta 12 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…11 de executare, unde:
a)
- Xaa1 este Pro, Ala sau Gly;
- Xaa2 este Asp sau Asn;
- Xaa3 este Thr;
- Xaa4 este Arg sau Lys; şi
- Xaa5 este Tyr,
şi/sau
b) unde CDR3 menţionat este selectat dintre oricare din SECV ID Nr.: 186-190.
Varianta 13 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…12 de executare, unde CDR3 menţionat are secvenţa de aminoacizi Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr (SECV ID Nr.: 186).
Varianta 14 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…10 de executare, unde:
i) CDR1 menţionat:
a) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 141;
b) are o secvenţă de aminoacizi care are identitate a aminoacizilor de cel puţin 80% cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 141;
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 141, unde
- în poziţia 2 S a fost modificat în T, sau G;
- în poziţia 6 S a fost modificat în R;
- în poziţia 7 N a fost modificat în T; şi/sau
- în poziţia 9 M a fost modificat în K; sau
d) are o secvenţa de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 141-145 şi 213;
ii) CDR2 sus-menţionată:
a) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 164;
b) are o secvenţă de aminoacizi care are o identitate a aminoacizilor de cel puţin 70% cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 164;
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 164, unde
- la poziţia 1 G a fost modificat în A, L, V sau S;
- la poziţia 3 N a fost modificat în D, S, Q, G sau T;
- la poziţia 4 S a fost modificat în T, K, G sau P;
- la poziţia 5 V a fost modificat în A;
- la poziţia 6 G a fost modificat în D;
- la poziţia 7 I a fost modificat în T, sau V;
- la poziţia 8 T a fost modificat în A; şi/sau
- la poziţia 9 K a fost modificat în R; sau
d) are o secvenţa de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 162-175 şi 214-221; şi
iii) CDR3 menţionat:
a) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 186;
b) are o secvenţă de aminoacizi care are o identitate a aminoacizilor de cel puţin 70% cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 186;
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţele de aminoacizi SECV ID Nr.: 186, unde
- la poziţia 2 P a fost modificat în A, sau G;
- la poziţia 7 D a fost modificat în N; şi/sau
- la poziţia 9 R a fost modificat în K; sau
d) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 186-190.
Varianta 15 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…10 de executare, unde
i) CDR1 menţionat are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 146;
ii) CDR2 menţionat are o secvenţă de aminoacizi care a) are o identitate a aminoacizilor de cel puţin 90% cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 176 sau b) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 176 sau 177; şi
iii) CDR3 menţionat are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 191.
Varianta 16 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…10 de executare, unde
i) CDR1 menţionat:
a) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 147; sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 6, 5, 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 147, unde
- în poziţia 1 G a fost modificat în K, R, sau A;
- în poziţia 2 T a fost modificat în I, P, S sau L;
- în poziţia 3 I a fost modificat în V, sau T;
- în poziţia 4 F a fost modificat în L;
- în poziţia 5 S a fost modificat în R, sau D;
- în poziţia 6 N a fost modificat în S, T, sau D; şi/sau
- în poziţia 7 N a fost modificat în T, sau Y; şi/sau
c) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 147-161;
ii) CDR2 menţionat:
a) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 179; sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 179, unde
- în poziţia 3 S a fost modificat în T, sau G;
- în poziţia 4 N a fost modificat în S, sau I;
- în poziţia 5 S a fost modificat în T;
- în poziţia 6 G a fost modificat în Y; şi/sau
- în poziţia 8 T a fost modificat în A; sau
c) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 178-185; şi
iii) CDR3 menţionat:
a) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 192; sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are o identitate a aminoacizilor de cel puţin 80% cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 192; sau
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 192, unde
- în poziţia 2 A a fost modificat în G;
- în poziţia 8 T a fost modificat în S;
- în poziţia 9 A a fost modificat în G; şi/sau
- în poziţia 10 Y a fost modificat în F; sau
d) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 192-196.
Varianta 17 de executare: o polipeptidă conform variantei 3 de executare, unde secvenţele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 şi CDR3 sus-menţionaţi sunt prezentate în:
- SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 163 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 141, 164 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 166 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 167 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 167 şi, respectiv, 189; sau
- SECV ID Nr.: 141, 168 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 168 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 141, 169 şi, respectiv, 190; sau
- SECV ID Nr.: 141, 170 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 171 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 174 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 175 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 142, 165 şi, respectiv, 188; sau
- SECV ID Nr.: 142, 173 şi, respectiv, 188; sau
- SECV ID Nr.: 143, 164 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 144, 172 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 145, 172 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 141, 214 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 215 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 216 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 217 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 218 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 219 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 220 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 221 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 214 şi, respectiv, 186.
Varianta 18 de executare: o polipeptidă conform variantei 3 de executare, unde secvenţele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 şi CDR3 sus-menţionaţi sunt prezentate în:
- SECV ID Nr.: 146, 176 şi, respectiv, 191; sau
- SECV ID Nr.: 146, 177 şi, respectiv, 191.
Varianta 19 de executare: o polipeptidă conform variantei 3 de executare, unde secvenţele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 şi CDR3 sus-menţionaţi sunt prezentate în:
- SECV ID Nr.: 147, 178 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 147, 179 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 147, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 148, 179 şi, respectiv, 193; sau
- SECV ID Nr.: 149, 179 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 180 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 181 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 183 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 185 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 150, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 150, 182 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 151, 179 şi, respectiv, 193; sau
- SECV ID Nr.: 151, 182 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 151, 184 şi, respectiv, 196; sau
- SECV ID Nr.: 152, 179 şi, respectiv, 195; sau
- SECV ID Nr.: 153, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 154, 182 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 155, 179 şi, respectiv, 195; sau
- SECV ID Nr.: 156, 181 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 157, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 158, 179 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 159, 178 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 160, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 161, 179 şi, respectiv, 194.
Varianta 20 de executare: o polipeptidă conform variantei 3 de executare, unde secvenţele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 şi CDR3 sus-menţionaţi sunt prezentate în: SECV ID Nr.: 141, 164 şi 186, respectiv, sau SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv, 186.
Varianta 21 de executare: o polipeptidă conform variantei 3 de executare, unde secvenţele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 şi CDR3 sus-menţionaţi sunt prezentate în: SECV ID Nr.: 213, 214 şi, respectiv, 186, SECV ID Nr.: 213, 221 şi, respectiv, 186, sau SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv, 186.
Varianta 22 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…10 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 este un domeniu VHH care cuprinde secvenţa prezentată în:
a) secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 3;
b) secvenţele de aminoacizi care au o identitate a aminoacizilor de cel puţin 90% cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 3;
c) secvenţe de aminoacizi care au o diferenţă de 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 3; sau
d) o secvenţă de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 1-48, 121-140 sau 222-224.
Varianta 23 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…10 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 este un domeniu VHH care cuprinde secvenţa prezentată în:
a) secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 49;
b) o secvenţă de aminoacizi care are o identitate a aminoacizilor de cel puţin 95% cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 49;
c) o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 5, 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 49; sau
d) o secvenţă de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 49-52.
Varianta 24 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…10 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 este un domeniu VHH care cuprinde secvenţa prezentată în:
a) secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 67;
b) o secvenţă de aminoacizi care are o identitate a aminoacizilor de cel puţin 90% cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 67;
c) o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 67; sau
d) o secvenţă de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 53-120.
Varianta 25 de executare: o polipeptidă conform variantei 2 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 cuprinde secvenţa prezentată în SECV ID Nr.: 1 sau SECV ID Nr.: 3.
Varianta 26 de executare: o polipeptidă conform variantei 2 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 cuprinde secvenţa prezentată în oricare din SECV ID Nr.: 121-140 sau SECV ID Nr.: 222-224.
Varianta 27 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele de executare de mai sus, care este umanizată şi/sau optimizată în ce priveşte stabilitatea, eficacitatea, posibilitatea de producţie şi/sau similitudinea cu regiunile-cadru umane.
Varianta 28 de executare: o polipeptidă conform variantei 27 de executare, care este umanizată şi/sau optimizată secvenţional în una sau mai multe din următoarele poziţii (conform numerotării Kabat): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108.
Varianta 29 de executare: o polipeptidă conform variantei 28 de executare, care cuprinde una sau mai multe din următoarele mutaţii: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.
Varianta 30 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…29 de executare, unde:
i) FR1 este selectat dintre SECV ID Nr: 198-204;
ii) FR2 este selectat dintre SECV ID Nr: 205-208;
iii) FR3 este selectat dintre SECV ID Nr: 209-210; şi/sau
iv) FR4 este selectat dintre SECV ID Nr.: 211-212.
Varianta 31 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…30 de executare, care este umanizată şi/sau optimizată secvenţional în una sau mai multe din următoarele poziţii (conform numerotării Kabat): 52, 53.
Varianta 32 de executare: o polipeptidă conform variantei 31 de executare, care cuprinde una sau mai multe din următoarele mutaţii: N52S, S53T.
Varianta 33 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 3…32 de executare, în care CDR2 este selectat din SECV ID Nr.: 214-221.
Varianta 34 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…33 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 sus-menţionat cuprinde secvenţa indicată în oricare din SECV ID Nr.: 138-140 sau 222-224.
Varianta 35 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 22… 26 de executare, unde domeniul VHH sus-menţionat constă din oricare dintre secvenţele de aminoacizi.
Varianta 36 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…35 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic sus-menţionat transblochează legătura a cel puţin unuia dintre domeniile variabile unice imunoglobulinice a SECV ID Nr.: 1-120, 121-140 şi 222-224 la CX3CR1.
Varianta 37 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…35 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic sus-menţionat este transblocat de la legarea la CX3CR1 prin cel puţin una dintre secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 1-120, 121-140 şi 222-224.
Varianta 38 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…37 de executare, unde polipeptida cuprinde în plus o fracţiune de extindere a timpului de înjumătăţire.
Varianta 39 de executare: o polipeptidă conform variantei 38 de executare, unde fracţiunea respectivă de extindere a timpului de înjumătăţire este legată covalent de polipeptida respectivă şi este selectată din grupul ce constă dintr-o fracţiune de legare a albuminei, cum ar fi un domeniu imunoglobulinic anti-albumină, o fracţiune de legare a transferinei, cum ar fi un domeniu imunoglobulinic anti-transferin, o moleculă de polietilenglicol, o moleculă de polietilenglicol recombinant, albumină serică umană, un fragment de albumină serică umană, o peptidă de legare a albuminei sau un domeniu Fc.
Varianta 40 de executare: o polipeptidă conform variantei 38 sau 39 de executare, unde fracţiunea respectivă de extindere a timpului de înjumătăţire constă dintr-un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-albumină.
Varianta 41 de executare: o polipeptidă conform variantei 40 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic este selectat dintr-un domeniu VHH, un domeniu VHH umanizat, un domeniu VH camelizat, un domeniu de anticorpi, un domeniu unic de anticorpi şi/sau "dAb"s.
Varianta 42 de executare: o polipeptidă conform variantei 41 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-albumină este selectat dintre SECV ID Nr.: 230-232.
Varianta 43 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…39 de executare, unde polipeptida respectivă este legată la o porţiune Fc (cum ar fi un Fc uman, de exemplu precum este indicat în SECV ID Nr.: 252), opţional printr-un linker adecvat sau regiune de articulare.
Varianta 44 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…39 de executare, unde polipeptida respectivă este legată ulterior de unul sau mai multe domenii constante (de exemplu, 2 sau 3 domenii constante care pot fi utilizate ca parte a/pentru a forma o porţiune Fc), de o porţiune Fc şi/sau de una sau mai multe părţi, fragmente sau domenii de anticorpi care conferă una sau mai multe funcţii efectoare polipeptidei din invenţie şi/sau poate conferi capacitatea de legare de unul sau mai mulţi receptori Fc, opţional printr-un linker sau regiune de articulare adecvată.
Varianta 45 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 2…37 de executare, unde polipeptida respectivă cuprinde ulterior un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic, de preferinţă un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1.
Varianta 46 de executare: o polipeptidă conform variantei 45 de executare, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic sus-menţionate sunt legate covalent de o peptidă linker.
Varianta 47 de executare: o polipeptidă conform variantei 45 sau 46 de executare, unde cel de-al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat constă, în principal, din patru regiuni-cadru (FR1 - FR4) şi trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR1 - CDR3).
Varianta 48 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…47 de executare, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic sus-menţionate reprezintă domenii de anticorpi.
Varianta 49 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…48 de executare, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic sus-menţionate sunt un VH, VL, VHH, VH camelizat, sau VHH care este optimizat în ce priveşte stabilitatea, eficacitatea, posibilitatea de producţie şi/sau similitudinea cu regiunile-cadru umane.
Varianta 50 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…49 de executare, unde CDR1 - CDR3 menţionate ale domeniului al doilea variabil unic imunoglobulinic sus-menţionat sunt indicate în oricare dintre variantele 11…21 de executare.
Varianta 51 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…50 de executare, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic sus-menţionate cuprind acelaşi CDR3.
Varianta 52 de executare: o polipeptidă conform variantei 51 de executare, unde CDR3 menţionat este indicat în oricare dintre variantele 11…13 de executare.
Varianta 53 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…53 de executare, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic sus-menţionate cuprind aceleaşi CDR1, CDR2 şi CDR3.
Varianta 54 de executare: o polipeptidă conform variantei 53 de executare, unde CDR1 - CDR3 sus-menţionate sunt prezentate în oricare dintre variantele 11…21 de executare.
Varianta 55 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…54 de executare, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic sus-menţionate cuprind acelaşi domeniu VHH.
Varianta 56 de executare: polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…55 de executare, unde domeniul VHH sus-menţionat este prezentat în oricare dintre variantele 22…37 de executare.
Varianta 57 de executare: o polipeptidă care cuprinde un prim domeniu variabil unic imunoglobulinic, care cuprinde CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentate în SECV ID Nr.: 141, 164 şi 186, sau SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186 şi un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic precum se prevede în oricare dintre variantele 2…37 de executare.
O asemenea polipeptidă poate fi, în special, o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…56 de executare.
Varianta 58 de executare: o polipeptidă conform variantei 57 de executare, unde primul domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat cuprinde CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentate în SECV ID Nr.: 213, 214 şi 186, SECV ID Nr.: 213, 221 şi 186, sau SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Varianta 59 de executare: o polipeptidă conform variantei 57 sau 58 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic menţionat cuprinde CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentate în SECV ID Nr.: 141, 164 şi 186, sau SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Varianta 60 de executare: o polipeptidă conform variantei 57 sau 58 de executare, unde cel de-al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat cuprinde CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentate în: SECV ID Nr.: 213, 214 şi 186, SECV ID Nr.: 213, 221 şi 186, sau SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Varianta 61 de executare: o polipeptidă care cuprinde un prim domeniu variabil unic imunoglobulinic, unde primul domeniu variabil unic imunoglobulinic respectiv este un domeniu VHH care cuprinde secvenţa prezentată în SECV ID Nr.: 1 sau SECV ID Nr.: 3 şi un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic conform oricăreia dintre variantele 2…37 de executare.
O asemenea polipeptidă poate fi, în special, o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…60 de executare.
Varianta 62 de executare: o polipeptidă conform variantei 61 de executare, unde primul domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat este un domeniu VHH care cuprinde secvenţa prezentată în oricare din SECV ID Nr.: 121-140 sau 222-224.
Varianta 63 de executare: o polipeptidă conform variantei 61 sau 62 de executare, unde cel de-al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat este un domeniu VHH care cuprinde secvenţa prezentată în oricare din SECV ID Nr.: 1 sau SECV ID Nr.: 3.
Varianta 64 de executare: o polipeptidă conform variantei 63 de executare, unde cel de-al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat este un domeniu VHH care cuprinde secvenţa prezentată în oricare din SECV ID Nr.: 121-140 sau 222-224.
Varianta 65 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…64 de executare, unde polipeptida cuprinde în plus o fracţiune de extindere a timpului de înjumătăţire.
Varianta 66 de executare: o polipeptidă conform variantei 65 de executare, unde fracţiunea respectivă de extindere a timpului de înjumătăţire este legată covalent de polipeptida respectivă şi este selectată din grupul ce constă dintr-o fracţiune de legare a albuminei, cum ar fi un domeniu imunoglobulinic anti-albumină, o fracţiune de legare a transferinei, cum ar fi un domeniu imunoglobulinic anti-transferină, o moleculă de polietilenglicol, o moleculă de polietilenglicol recombinant, albumină serică umană, un fragment de albumină serică umană, o peptidă de legare a albuminei sau un domeniu Fc.
Varianta 67 de executare: o polipeptidă conform variantei 66 de executare, unde fracţiunea respectivă de extindere a timpului de înjumătăţire constă dintr-un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-albumină.
Varianta 68 de executare: o polipeptidă conform variantei 67 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic este selectat dintr-un domeniu VHH, un domeniu VHH umanizat, un domeniu VH camelizat, un domeniu de anticorpi, un domeniu unic de anticorpi şi/sau "dAb"s.
Varianta 69 de executare: o polipeptidă conform variantei 68 de executare, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-albumină este selectat dintre SECV ID Nr.: 230-232.
Varianta 70 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…64 de executare, unde polipeptida respectivă este legată de o porţiune Fc (cum ar fi un Fc uman, de exemplu după cum este prezentat în SECV ID Nr.: 252), opţional printr-un linker adecvat sau regiune de articulare.
Varianta 71 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 45…66 de executare, unde polipeptida respectivă este legată ulterior de unul sau mai multe domenii constante (de exemplu, 2 sau 3 domenii constante, care pot fi utilizate ca parte a/pentru a forma o porţiune Fc), de o porţiune Fc şi/sau de una sau mai multe părţi, fragmente sau domenii de anticorpi care conferă una sau mai multe funcţii efectoare polipeptidei din invenţie şi/sau poate conferi capacitatea de legare de unul sau mai mulţi receptori Fc, opţional printr-un linker adecvat sau regiune de articulare.
Varianta 72 de executare: o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 225-227.
Varianta 73 de executare: o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 249 sau 277-281.
Varianta 74 de executare: o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 257-262.
Varianta 75 de executare: o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 253 sau 254.
Varianta 76 de executare: o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 263 sau 266.
Varianta 77 de executare: o polipeptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 267-276 şi 282.
Varianta 78 de executare: o moleculă de acid nucleic care cuprinde o regiune ce codifică o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare.
Varianta 79 de executare: un vector de expresie care cuprinde o moleculă de acid nucleic conform variantei 78 de executare.
Varianta 80 de executare: o celulă-gazdă care poartă un vector de expresie şi care cuprinde o moleculă de acid nucleic, molecula respectivă de acid nucleic cuprinzând o regiune care codifică o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, unde celula-gazdă menţionată este capabilă să exprime o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, şi unde celula-gazdă menţionată este o celulă procariotă sau eucariotă.
Varianta 81 de executare: compoziţie farmaceutică care conţine (i) în calitate de ingredient activ, una sau mai multe polipeptide conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, şi (ii) un purtător acceptabil farmaceutic, şi opţional (iii) un diluant, excipient, adjuvant şi/sau stabilizator.
Varianta 82 de executare: procedeu de fabricare a unei polipeptide conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, care cuprinde etapele de
- cultivare a unei celule-gazdă în condiţii care permit expresia unei polipeptide conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare,
unde celula-gazdă menţionată care poartă un vector de expresie şi care cuprinde o moleculă de acid nucleic, molecula respectivă de acid nucleic cuprinzând o regiune care codifică o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, şi unde celula-gazdă menţionată este o celulă procariotă sau eucariotă;
- extragere a polipeptidei respective; şi
- purificare a polipeptidei respective.
Varianta 83 de executare: procedeu de utilizare a polipeptidei conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, pentru tratarea, prevenirea sau atenuarea unei boli, afecţiuni sau stări, în special la o fiinţă umană.
Varianta 84 de executare: procedeu conform variantei 83 de executare, unde boala, afecţiunea sau starea sus-menţionată este o boală, afecţiune sau stare asociată cu CX3CR1.
Varianta 85 de executare: procedeu conform variantei 83 de executare, unde boala, afecţiunea sau starea sus-menţionată este ateroscleroză.
Varianta 86 de executare: o compoziţie farmaceutică injectabilă care cuprinde polipeptida conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, compoziţia respectivă fiind adecvată pentru injectarea intravenoasă sau subcutanată la o fiinţă umană.
Varianta 87 de executare: procedeu de prevenire şi/sau tratare a unei boli sau afecţiuni asociate cu CX3CR1, unde procedeul dat cuprinde administrarea unui subiect, care necesită aceasta, a unei cantităţi farmaceutic active de cel puţin o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare.
Varianta 88 de executare: procedeu conform variantei 85 de executare, care cuprinde în plus administrarea unui agent terapeutic suplimentar selectat din grupul ce constă dintr-o statină, un antiagregant, un anticoagulant, un antidiabetic şi un antihipertensiv.
Varianta 89 de executare: procedeu de inhibare a legării CX3CR1 de fractalkină într-o celulă de mamifer, care cuprinde administrarea unei polipeptide celulei conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, unde semnalizarea mediată de fractalkină este inhibată.
Varianta 90 de executare: procedeu de detectare şi/sau cuantificare a nivelurilor CX3CR1 într-o probă biologică prin tratarea probei cu o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare şi detectarea legării polipeptidei cu CX3CR1.
Varianta 91 de executare: procedeu pentru diagnosticarea unei afecţiuni asociate cu CX3CR1 sau pentru determinarea faptului dacă un subiect are un risc sporit de dezvoltare a unei afecţiuni asociate cu CX3CR1, unde procedeul cuprinde tratarea unei probe biologice de la un subiect cu o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare şi detectarea legării polipeptidei de CX3CR1 pentru a determina expresia sau concentraţia CX3CR1.
Varianta 92 de executare: o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare pentru utilizarea în tratarea, prevenirea sau atenuarea unei boli, afecţiuni sau stări, la o fiinţă umană.
Varianta 93 de executare: polipeptidă pentru utilizarea conform variantei 92 de executare, unde boala, afecţiunea sau starea este o boală, afecţiune sau stare asociată cu CX3CR1.
Varianta 94 de executare: polipeptidă pentru utilizarea conform variantei 92 de executare, unde boala, afecţiunea sau starea este selectată dintre afecţiunile cardio şi cerebro-vasculare aterosclerotice, boala arterială periferică, restenoză, nefropatie diabetică, glomerulonefrită, glomerulonefrită crescentică umană, nefropatie IgA, nefropatie membranoasă, nefrită lupică, vasculită ce include purpura Henoch-Schonlein şi granulomatoză Wegener, artrită reumatoidă, osteoartrită, rejetul alogrefei, scleroza sistemică, afecţiunile neurodegenerative şi boala demielinizantă, scleroza multiplă (SM), boala Alzheimer, bolile pulmonare, cum ar fi BPOC, astm, durerea neuropatică, durerea inflamatorie, sau cancer.
Varianta 95 de executare: polipeptidă pentru utilizarea conform variantei 92 de executare, unde boala, afecţiunea sau starea este ateroscleroza.
Varianta 96 de executare: utilizarea unei polipeptide conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea, prevenirea sau atenuarea unei boli, afecţiuni sau stări, la o fiinţă umană.
Varianta 97 de executare: procedeu conform variantei 87 de executare, unde boala sau afecţiunea este selectată dintre afecţiunile cardio şi cerebrovasculare aterosclerotice, boala arterială periferică, restenoză, nefropatie diabetică, glomerulonefrită, glomerulonefrită crescentică umană, nefropatie IgA, nefropatie membranoasă, nefrită lupică, vasculită ce include purpura Henoch-Schonlein şi granulomatoză Wegener, artrită reumatoidă, osteoartrită, rejetul alogrefei, scleroza sistemică, afecţiunile neurodegenerative şi boala demielinizantă, scleroza multiplă (SM), boala Alzheimer, bolile pulmonare, cum ar fi BPOC, astm, durerea neuropatică, durerea inflamatorie, sau cancer.
Varianta 98 de executare: procedeu conform variantei 87 de executare, unde boala, afecţiunea sau starea este ateroscleroza.
Varianta 99 de executare: un kit de diagnosticare sau procedeu de diagnosticare care cuprinde o polipeptidă conform oricăreia dintre variantele 1…77 de executare, sau utilizarea acestora.
Varianta 100 de executare: un kit de diagnosticare sau procedeu de diagnosticare conform variantei 99 de executare, pentru diagnosticarea a cel puţin uneia dintre afecţiunile cardio şi cerebrovasculare aterosclerotice, boala arterială periferică, restenoză, nefropatie diabetică, glomerulonefrită, glomerulonefrită crescentică umană, nefropatie IgA, nefropatie membranoasă, nefrită lupică, vasculită ce include purpura Henoch-Schonlein şi granulomatoză Wegener, artrită reumatoidă, osteoartrită, rejetul alogrefei, scleroza sistemică, afecţiunile neurodegenerative şi boala demielinizantă, scleroza multiplă (SM), boala Alzheimer, bolile pulmonare, cum ar fi BPOC, astm, durerea neuropatică, durerea inflamatorie, sau cancer.
Aspectele sus-menţionate şi alte aspecte şi variante de executare a invenţiei vor deveni clare din descrierea ulterioară din prezenta, în care:
a) Dacă nu se indică sau defineşte altfel, toţi termenii utilizaţi au semnificaţia lor obişnuită în domeniu, care va fi clară specialistului. De exemplu, se face referinţă la manualele standard, cum sunt Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2nd Ed.), voI. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989; Lewin. .Genes IV. Oxford University Press., New York, 1990, şi Roitt et al. Immunology, (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York, 1989, precum şi la stadiul general al tehnicii menţionat în prezenta; Pe lângă aceasta, dacă nu se indică altfel, toate procedeele, etapele, tehnicile şi manipulările care nu sunt descrise în mod specific detaliat pot fi efectuate şi au fost efectuate într-un mod cunoscut per se, aşa cum va fi clar specialistului. De exemplu, din nou se face referinţă la manualele standard, la stadiul general al tehnicii la care s-a făcut referinţă mai sus şi la alte referinţe citate în prezenta.
b) Dacă nu se indică altfel, termenii "imunoglobulină" şi "secvenţă de imunoglobulină" - în cazul în care sunt folosiţi în prezenta pentru a se referi la un anticorp cu lanţ greu sau la un anticorp convenţional din 4-lanţuri - sunt folosiţi ca termeni generali incluzând atât anticorpul de dimensiuni reale, lanţurile individuale ale acestora, precum şi toate părţile, domeniile sau fragmentele acestora (inclusiv, dar fără a se limita la domenii sau fragmente de legare a antigenului cum sunt domeniile VHH sau, respectiv, domeniile VH/VL). În plus, termenul "secvenţă" aşa cum este folosit în prezenta (de exemplu, în termeni ca "secvenţă de imunoglobulină", "secvenţă de anticorp", "secvenţă de domeniu variabil (unic)", "secvenţă VHH" sau "secvenţă de proteină"), ar trebui să fie înţeles, în general, ca incluzând atât secvenţa corespunzătoare de aminoacizi, precum şi secvenţele de acid nucleic sau secvenţele de nucleotide care le codifică, cu excepţia cazului în care contextul solicită o interpretare mai limitată.
c) Termenul "domeniu" (al unei polipeptide sau proteine) aşa cum este utilizat în prezenta se referă la o structură de proteină pliată, care are capacitatea de a reţine structura sa terţiară independent de restul proteinei. În general, domeniile sunt responsabile de proprietăţile funcţionale discrete ale proteinelor, şi în multe cazuri pot fi adăugate, înlăturate sau transferate altor proteine fără pierderea funcţiei restului proteinei şi/sau domeniului.
d) Termenul "domeniu imunoglobulinic" aşa cum este utilizat în prezenta se referă la o regiune globulară a unui lanţ de anticorpi (cum ar fi, de ex., un lanţ de un anticorp convenţional din 4 lanţuri sau de un anticorp cu lanţ greu), sau la o polipeptidă care constă, în principal, dintr-o astfel de regiune globulară. Domeniile imunoglobulinice se caracterizează prin aceea că ele reţin caracteristica aranjării lanţului imunoglobulinic al moleculelor de anticorpi, care constă dintr-un sandvici de 2 straturi de circa 7 beta-catene antiparalele aranjate în două beta-straturi, stabilizate opţional printr-o legătură disulfurică conservată.
e) Termenul "domeniu variabil imunoglobulinic" aşa cum este folosit în prezenta înseamnă un domeniu imunoglobulinic care constă, în principal, din patru "regiuni-cadru", care sunt menţionate în domeniu şi în continuare ca "regiunea-cadru 1" sau "FR1"; ca "regiunea-cadru 2" sau "FR2"; ca "regiunea-cadru 3" sau "FR3"; şi, respectiv, ca "regiunea-cadru 4" sau "FR4"; regiunile-cadru respective fiind întrerupte de trei "regiuni de determinare a complementarităţii" sau "CDR-uri", care sunt menţionate în domeniu şi în continuare ca "regiunea de determinare a complementarităţii 1" sau "CDR1"; ca "regiunea de determinare a complementarităţii 2" sau "CDR2"; şi, respectiv, ca "regiunea de determinare a complementarităţii 3" sau "CDR3". Astfel, structura generală sau secvenţa unui domeniu variabil imunoglobulinic poate fi indicată după cum urmează: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Anume domeniul(ile) variabil(e) imunoglobulinic(e) conferă specificitate unui anticorp pentru antigen prin transportarea situsului de legare a antigenului.
f) termenii "domeniu variabil unic imunoglobulinic" şi "domeniu variabil unic" aşa cum sunt folosiţi în prezenta înseamnă un domeniu variabil imunoglobulinic care este capabil de legare specifică la un epitop al antigenului fără a se cupla cu un domeniu variabil suplimentar imunoglobulinic. Un exemplu de domenii variabile unice imunoglobulinice în sensul prezentei invenţii sunt "anticorpi domenii", cum ar fi domeniile variabile unice imunoglobulinice VH şi VL (domeniile VH şi domeniile VL). Un alt exemplu de domenii variabile unice imunoglobulinice sunt "domeniile VHH" (sau simplu "VHH-urile") din camelide, precum sunt definite în continuare.
Având în vedere definiţia de mai sus, domeniul de legare a antigenului al unui anticorp convenţional cu 4 lanţuri (cum ar fi o moleculă de IgG, IgM, IgA, IgD sau IgE, cunoscută în domeniu), sau al unui fragment Fab, al unui fragment F(ab')2, al unui fragment Fv, cum ar fi o disulfură legată la un fragment Fv sau scFv, sau la un diacorp (toate cunoscute în domeniu), obţinute de la un asemenea anticorp convenţional cu 4 lanţuri, în mod normal, nu va fi considerat un domeniu variabil unic imunoglobulinic, aşa cum, în aceste cazuri, legarea la epitopul respectiv al unui antigen, în mod normal, nu va avea loc printr-un domeniu (unic) imunoglobulinic, ci printr-o pereche de domenii imunoglobulinice (de asociere), cum ar fi domeniile variabile cu lanţuri uşoare şi grele, şi anume printr-o pereche VH-VL de domenii imunoglobulinice , care se leagă împreună la un epitop al antigenului respectiv.
f.1) "Domeniile VHH", cunoscute, de asemenea, ca VHH-uri, domenii VHH, fragmente de anticorpi VHH, şi anticorpi VHH, au fost descrise iniţial ca domeniu (variabil) imunoglobulinic de legare la antigen a "anticorpilor cu lanţuri grele" (adică a "anticorpilor fără lanţuri uşoare"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa E.B, Bendahman N, Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 1993, p. 446-448. Termenul "domeniu VHH" a fost ales pentru a distinge aceste domenii variabile de domeniile variabile cu lanţuri grele, care sunt prezente în anticorpii convenţionali cu 4-lanţuri (care sunt denumiţi în prezenta "domenii VH" sau "domenii VH") şi de domeniile variabile cu lanţuri uşoare, care sunt prezente în anticorpii convenţionali cu 4-lanţuri (care sunt denumiţi în prezenta "domenii VL" sau "domenii VL"). Domeniile VHH pot să se lege, în mod specific, la un epitop fără un domeniu suplimentar de legare la antigen (spre deosebire de domeniile VH sau VL într-un anticorp convenţional cu 4-lanţuri, caz în care epitopul este recunoscut de un domeniu VL împreună cu un domeniu VH). Domeniile VHH sunt unităţi mici, robuste şi eficiente de recunoaştere a antigenului formate dintr-un singur domeniu imunoglobulinic.
În contextul prezentei invenţii, termenii domeniu VHH, VHH, domeniu VHH, fragment de anticorp VHH, anticorp VHH, precum şi "Nanobody®" şi "domeniul Nanobody®" ("Nanobody" fiind o marcă a companiei Ablynx N.V.; Ghent, Belgia) sunt folosiţi în mod interschimbabil şi sunt reprezentanţi ai domeniilor variabile unice imunoglobulinice (având structura: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 şi se leagă specific la un epitop fără a necesita prezenţa unui al doilea domeniu variabil imunoglobulinic), şi care se deosebesc de domeniile VH prin aşa-numitele "reziduuri distinctive", precum sunt definite, de ex., în WO 2009109635 (A2) 2009-09-11, fig. 1.
Reziduurile de aminoacizi ale unui domeniu VHH sunt numerotate conform numerotării generale a domeniilor VH oferită de Kabat et al. Sequence of proteins of immunological interest. US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91, precum se aplică domeniilor VHH din Camelide, prezentate, de ex., în fig. 2 din Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 1999, p. 25-38. Conform numerotării date:
- FR1 cuprinde reziduurile de aminoacizi la poziţiile 1…30,
- CDR1 cuprinde reziduurile de aminoacizi la poziţiile 31…35,
- FR2 cuprinde aminoacizii la poziţiile 36…49,
- CDR2 cuprinde reziduurile de aminoacizi la poziţiile 50…65,
- FR3 cuprinde reziduurile de aminoacizi la poziţiile 66…94,
- CDR3 cuprinde reziduurile de aminoacizi la poziţiile 95…102, şi
- FR4 cuprinde reziduurile de aminoacizi la poziţiile 103…113.
Cu toate acestea, este necesar de remarcat faptul că - după cum este bine cunoscut în domeniu pentru domeniile VH şi pentru domeniile VHH - numărul total de reziduuri de aminoacizi în fiecare din CDR-uri poate varia şi poate să nu corespundă numărului total de reziduuri de aminoacizi indicat de numerotarea Kabat (adică, una sau mai multe poziţii conform numerotării Kabat nu poate fi ocupată în secvenţa reală, sau secvenţa reală poate conţine mai multe reziduuri de aminoacizi decât numărul permis de numerotarea Kabat). Aceasta înseamnă că, în general, numerotarea Kabat poate sau poate să nu corespundă numerotării reale de reziduuri de aminoacizi în secvenţa reală.
În domeniu sunt cunoscute metode alternative pentru numerotarea reziduurilor de aminoacizi din domeniile VH, aceste metode pot fi, de asemenea, aplicate în mod similar domeniilor VHH. Cu toate acestea, în prezenta descriere, vor fi urmate revendicările şi desenele, numerotarea Kabat şi aplicată domeniilor VHH după cum este descris mai sus, dacă nu se indică altfel.
Numărul total de reziduuri de aminoacizi într-un domeniu VHH va fi cuprins, de obicei, între 110…120, adesea între 112 şi 115. Totuşi, este necesar de remarcat că secvenţele mai mici şi mai mari pot fi, de asemenea, adecvate pentru scopurile descrise în prezenta.
Alte caracteristici structurale şi proprietăţi funcţionale ale domeniilor VHH şi polipeptidelor care le conţin pot fi rezumate după cum urmează:
Domeniile VHH (care au fost "elaborate" de natură pentru a se lega funcţional la un antigen fără prezenţa, şi fără nici o interacţiune cu un domeniu variabil cu lanţ uşor) pot funcţiona ca o singură unitate, domeniu sau polipeptidă structurală funcţională, relativ mică, de legare la antigen. Aceasta deosebeşte domeniile VHH de domeniile VH şi VL ale anticorpilor convenţionali cu 4 lanţuri, care de sine stătător nu sunt, în general, potrivite pentru aplicarea practică ca proteine unice de legare la antigen sau domenii variabile unice imunoglobulinice , dar trebuie să fie combinate într-o anumită formă sau alta pentru a furniza o unitate funcţională de legare la antigen (ca, de exemplu în fragmente convenţionale de anticorpi, cum ar fi fragmentele Fab; în scFv-uri, care constau dintr-un domeniu VH legat covalent la un domeniu VL).
Datorită acestor proprietăţi unice, utilizarea domeniilor VHH - fie de sine stătător, fie ca parte a unei polipeptide mai mari - oferă mai multe avantaje semnificative faţă de utilizarea domeniilor convenţionale VH şi VL, scFv-urilor sau fragmentelor convenţionale de anticorpi (cum ar fi fragmentele Fab- sau F(ab')2):
- este necesar doar un singur domeniu pentru a lega un antigen cu afinitate şi selectivitate mare, astfel încât să nu existe necesitatea de a avea două domenii separate, nici pentru a asigura faptul că aceste două domenii sunt prezente în conformaţia şi configuraţia spaţială corectă (adică prin utilizarea linkerilor special elaboraţi, ca şi în cazul scFv-urilor);
- domeniile VHH pot fi exprimate dintr-o singură genă şi nu necesită aranjare sau modificări post-translaţionale;
- domeniile VHH pot fi uşor proiectate în formate multivalente şi multispecifϊce (după cum se va menţiona în continuare);
- domeniile VHH sunt foarte solubile şi nu au tendinţa de a se agrega (ca în cazul domeniilor de legare la antigen obţinute de la şoareci descrise de Ward et al., Nature 341, 1989, p. 544-546;
- domeniile VHH sunt foarte stabile la căldură, pH, proteaze şi alţi agenţi sau condiţii de denaturare şi, prin urmare, pot fi preparate, păstrate sau transportate fără utilizarea echipamentelor de refrigerare, ceea ce asigură economii de costuri, timp şi efecte pozitive asupra mediului;
- domeniile VHH sunt uşor şi relativ ieftin de preparat, chiar şi la o scară necesară pentru producţie.
De exemplu, domeniile VHH şi polipeptidele care le conţin pot fi produse cu ajutorul fermentării microbiene (de ex., după cum este descris în continuare mai jos) şi nu necesită utilizarea sistemelor de expresie de mamifere, ca de exemplu în cazul fragmentelor convenţionale de anticorpi;
- domeniile VHH sunt relativ mici (aproximativ 15 kDa, sau de 10 ori mai mici decât o IgG convenţională), comparativ cu anticorpii convenţionali cu 4 lanţuri şi fragmentele de legare la antigen ale acestora, şi, prin urmare:
- prezintă o penetrare mare (mai mare) în ţesuturi şi;
- pot fi administrate în doze mai mari, decât astfel de anticorpi convenţionali cu 4 lanţuri şi fragmentele de legare la antigen ale acestora;
- domeniile VHH pot prezenta aşa-numitele proprietăţi de legare la cavitate (printre altele datorită inelului lor extins al CDR3, comparativ cu domeniile convenţionale VH) şi, prin urmare, pot accesa, de asemenea, porţiuni-ţinte şi epitopi care nu sunt accesibili anticorpilor convenţionali cu 4 lanţuri şi fragmentelor de legare la antigen ale acestora.
Metode de obţinere a domeniilor VHH de legare la un antigen sau epitop specific au fost descrise anterior, de ex. în WO 2006040153 (A2) 2006.04.20 şi WO2006/122786 (A2) 2006.11.23. După cum, de asemenea, este descris detaliat în prezenta, domeniile VHH obţinute din camelide pot fi "umanizate", prin înlocuirea unuia sau mai multor reziduuri de aminoacizi în secvenţa de aminoacizi a secvenţei iniţiale VHH cu unul sau mai multe reziduuri de aminoacizi care apar la poziţia(iile) corespunzătoare într-un domeniu VH de la un anticorp convenţional cu patru lanţuri de la o fiinţă umană. Un domeniu umanizat VHH poate conţine una sau mai multe secvenţe de regiuni-cadru complet umane, şi, într-o variantă de executare mai specifică, poate conţine secvenţe de regiuni-cadru umane obţinute din DP-29, DP-47, DP-51, sau părţi ale acestora, combinate opţional cu scvenţe JH, cum ar fi JH5.
f.2) „Anticorpi domenii" (eng. Domain Antibodies) cunoscute şi ca "Dab-uri", "Anticorpii domenii" şi "Dab-urile" (termenii "Domain Antibodies" şi "Dab-uri" fiind utilizaţi în calitate de mărci de către grupul de companii GlaxoSmithKline) au fost descrişi, de ex., în Ward, E.S., et al. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 1989, p. 544-546; Holt, L.J. et al. Domain antibodies: proteins for therapy; TRENDS in Biotechnology 21(11), 2003, p. 484-490 and WO2003/002609 (A2) 2003.01.09.
Anticorpi domenii corespund, în principal, domeniilor VH sau VL a mamiferelor necamelide, în special anticorpilor umani cu 4 lanţuri. În scopul de a lega un epitop ca un domeniu unic de legare la antigen, adică fără a fi asociat cu un domeniu VL sau, respectiv, VH, este necesară selecţia specifică pentru astfel de proprietăţi de legare la antigen, de exemplu, prin utilizarea băncilor de secvenţe de domenii unice umane VH sau VL.
Anticorpi domenii au, ca şi VHH-urile, o greutate moleculară de aproximativ 13 până la aproximativ 16 kDa şi, dacă provin din secvenţele total umane, nu au nevoie de umanizare, de ex., pentru utilizarea terapeutică la oameni. Ca şi în cazul domeniilor VHH, ei sunt bine exprimaţi, de asemenea, în sisteme de expresie procariote, oferind o reducere semnificativă a costului total de producţie.
Anticorpi domenii, precum şi domeniile VHH, pot fi supuşi fenomenului de maturare a afinităţii prin introducerea uneia sau mai multor modificări în secvenţa de aminoacizi a uneia sau mai multor CDR-uri, care duc la o afinitate îmbunătăţită a domeniului variabil unic imunoglobulinic rezultat pentru antigenul său respectiv, comparativ cu molecula iniţială respectivă. Moleculele domeniilor variabile unice imunoglobulinice cu afinitate maturată conform invenţiei pot fi preparate prin metode cunoscute în domeniu, de exemplu, precum este descris de către Marks et al., Biotechnology 10, 1992, p. 779-783, or Barbas, et al. Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91, 1994,p. 3809-3813.; Shier et al. Gene 169, 1995, p. 147-155; Yelton et al. Immunol. 155, 1995, p. 1994-2004; Jackson et al. J. Immunol. 154(7), 1995, p. 3310-9; and Hawkins et al. J. MoI. Biol. 226(3), 1992, p. 889 896; KS Johnson and RE Hawkins. Affinity maturation of antibodies using phage displ.", Oxford University Press 1996.
f.3) În plus, specialistului îi va fi, de asemenea, clar că este posibil de a "grefa" una sau mai multe CDR-uri sus-menţionate pe alte "eşafodaje", inclusiv dar fără a se limita la eşafodajele umane sau eşafodajele non-imunoglobulinice. Eşafodaje şi tehnici adecvate pentru asemenea grefare a CDR-urilor sunt cunoscute în domeniu.
g) Termenii „epitop” şi „determinant antigenic”, care pot fi folosiţi alternativ, se referă la partea de o macromoleculă, cum ar fi o polipeptidă, care este recunoscută de moleculele de legare la antigen, cum ar fi anticorpii convenţionali sau polipeptidele conform invenţiei, şi în special de situsul de legare la antigen a moleculelor respective. Epitopii definesc situsul minim de legare pentru o imunoglobulină, şi reprezintă astfel ţinta specificităţii unei imunoglobuline.
Partea unei molecule de legare la antigen (cum ar fi un anticorp convenţional sau o polipeptidă a invenţiei) care recunoaşte epitopul este numită paratop.
h) Termenul „molecula de legare” (la antigen) "biparatopică" sau polipeptidă "biparatopică", după cum este utilizat în prezenta, înseamnă o polipeptidă care cuprinde un prim domeniu variabil unic imunoglobulinic şi un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic după cum este definit în prezenta, unde aceste două domenii variabile sunt capabile să se lege de doi epitopi diferiţi ai unui antigen, epitopii respectivi nefiind legaţi de obicei, în acelaşi timp, de o imunoglobulină monospecifică, cum ar fi, de ex., un anticorp convenţional sau un domeniu variabil unic imunoglobulinic. Polipeptidele biparatopice pot fi compuse din domenii variabile care au diferite specificităţi de epitopi, şi nu conţin perechi de domenii variabile reciproc complementare care se leagă la acelaşi epitop. Prin urmare, cele două domenii variabile nu concurează între ele pentru legarea la porţiunea ţintă.
i) O polipeptidă (cum ar fi o imunoglobulină, un anticorp, un domeniu variabil unic imunoglobulinic, o polipeptidă conform invenţiei, sau, în general, o moleculă de legare la antigen sau un fragment al acesteia), care poate "să se lege la" sau "să se lege în mod specific la" şi/sau care "are afinitate pentru" şi/sau care "are specificitate pentru" un anumit epitop, antigen sau proteină (sau pentru cel puţin o parte, fragment sau epitop al acestora) se spune că este "împotriva" sau "orientată împotriva" epitopului, antigenului sau proteinei respective sau este o moleculă "de legare" cu privire la un astfel de epitop, antigen sau proteină, sau se afirmă că este "anti"-epitop, "anti"-antigen sau "anti"-proteină (de ex., anti-CX3CR1).
k) În general, termenul "specificitate" se referă la numărul de diferite tipuri de antigene sau epitopi de care poate să se lege o anumită moleculă sau proteină de legare la antigen (cum ar fi o imunoglobulină, un anticorp, un domeniu variabil unic imunoglobulinic, sau o polipeptidă a invenţiei). Specificitatea unei proteine de legare la antigen poate fi determinată pe baza afinităţii şi/sau avidităţii sale. Afinitatea, reprezentată de constanta de echilibru pentru disocierea unui antigen cu o proteină de legare la antigen (KD), este o măsură a capacităţii de legare dintre un epitop şi un situs de legare la antigen pe proteina de legare la antigen: cu cât mai mică este valoarea KD, cu atât mai mare este capacitate de legare dintre un epitop şi molecula de legare la antigen (alternativ, afinitatea poate fi, de asemenea, exprimată ca constanta de afinitate (KA), care este 1/KD). După cum va fi clar specialistului (de exemplu, pe baza dezvăluirii ulterioare din prezenta), afinitatea poate fi determinată într-un mod cunoscut în sine, în funcţie de antigenul specific de interes. Aviditatea este măsura capacităţii de legare dintre o moleculă de legare la antigen (cum ar fi o imunoglobulină, un anticorp, un domeniu variabil unic imunoglobulinic, sau o polipeptidă a invenţiei) şi antigenul adecvat. Aviditatea este legată atât de afinitatea dintre un epitop şi situsul său de legare la antigen de pe molecula de legare la antigen şi numărul de situsuri adecvate de legare prezente pe molecula de legare la antigen.
l) Reziduurile de aminoacizi vor fi indicate conform codului de aminoacizi standard din trei litere sau o literă, care este, în general, cunoscut şi aprobat în domeniu. La compararea a două secvenţe de aminoacizi, termenul "diferenţa de aminoacizi" se referă la inserţii, deleţii sau substituţii ale numărului indicat de reziduuri de aminoacizi la o poziţie a secvenţei de referinţă, faţă de a doua secvenţă. În caz de substituţie(i), o astfel de substituţie(i) va (vor) fi, de preferinţă, substituţie(i) conservativă(e) de aminoacizi, ceea ce înseamnă că un reziduu de aminoacizi este înlocuit cu un alt reziduu de aminoacizi cu structură chimică similară şi care are o influenţă mică sau, în esenţă, nu are nici o influenţă asupra funcţiei, activităţii sau altor proprietăţi biologice ale polipeptidei. Astfel de substituţii de aminoacizi conservative sunt bine cunoscute în domeniu, de exemplu din WO 98/49185 (A1) 1998.11.05, unde substituţiile de aminoacizi conservative sunt, de preferinţă, substituţii în care un aminoacid din următoarele grupe (i) - (v) este substituit cu un alt reziduu de aminoacizi în cadrul aceluiaşi grup: (i) reziduuri alifatice mici, nepolare sau slab polare: Ala, Ser, Thr, Pro şi GIy; (ii) reziduuri polare, încărcate negativ şi amidele lor (neîncărcate): Asp, Asn, GIu şi GIn; (iii) reziduuri polare, încărcate pozitiv: His, Arg şi Lys; (iv) reziduuri alifatice mari, nepolare: Met, Leu, Ile, VaI şi Cys; şi (v) reziduuri aromatice: Phe, Tyr şi Trp. Substituţii de aminoacizi conservative îndeosebi preferate sunt următoarele:
Ala în GIy sau în Ser;
Arg în Lys;
Asn în GIn sau în His;
Asp în GIu;
Cys în Ser;
GIn în Asn;
GIu în Asp;
GIy în Ala sau în Pro;
His în Asn sau în GIn;
Ile în Leu sau în VaI;
Leu în Ile sau în VaI;
Lys în Arg, în GIn sau în GIu;
Met în Leu, în Tyr sau în Ile;
Phe în Met, în Leu sau în Tyr;
Ser în Thr;
Thr în Ser;
Trp în Tyr;
Tyr în Trp sau în Phe;
VaI în Ile sau în Leu.
m) Un acid nucleic sau o moleculă de polipeptidă este considerată a fi "(sub formă) esenţial izolată" - de exemplu, în comparaţie cu sursa sa biologică nativă şi/sau mediul de reacţie sau mediul de cultivare din care a fost obţinut - când aceasta a fost separată de cel puţin un alt component cu care este asociată, de obicei, în sursa sau mediul respectiv, cum ar fi un alt acid nucleic, o altă proteină/polipeptidă, o altă componentă biologică sau macromoleculă sau cel puţin un contaminant, o impuritate sau componentă minoră. În special, un acid nucleic sau o moleculă de polipeptidă este considerată "esenţial izolată" atunci când a fost purificată de cel puţin 2 ori, în special de cel puţin 10 ori, mai în special de cel puţin 100 de ori, şi până la 1000 de ori sau mai mult. Un acid nucleic sau o moleculă de polipeptidă care este "sub formă esenţial izolată" este, de preferinţă, esenţial omogenă, aşa cum s-a determinat cu ajutorul unei tehnici adecvate, cum ar fi o tehnică cromatografică adecvată, cum ar fi poliacrilamida-electroforeza în gel;
n) "Identitatea de secvenţă" dintre, de ex., două secvenţe ale domeniilor variabile unice imunoglobulinice indică procentajul aminoacizilor care sunt identici între aceste două secvenţe. Ea poate fi calculată sau determinată conform descrierii din alineatul f) de la paginile 49 şi 50 din WO08/020079 (A1) 2008.02.21. "Similitudinea de secvenţă" indică procentajul aminoacizilor care sunt identici sau care reprezintă substituţii de aminoacizi conservative.
Specificitatea ţintă
Polipeptidele din invenţie au specificitate pentru CX3CR1 umană. Astfel, polipeptidele din invenţie se leagă, de preferinţă, de CX3CR1 umană (SECV ID Nr.: 255). Într-un aspect, polipeptidele din prezenta invenţie se leagă, de asemenea, de CX3CR1 de cynomolgus (SECV ID Nr.: 256).
Polipeptidele din invenţie
Invenţia furnizează agenţi noi farmaceutic activi pentru prevenirea, tratarea, atenuarea şi/sau diagnosticarea bolilor, afecţiunilor sau stărilor asociate cu CX3CR1, cum ar fi bolile cardiovasculare. În special, invenţia furnizează polipeptide care se leagă de CX3CR1 umană şi sunt capabile să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană. Într-un aspect, polipeptida este o imunoglobulină care cuprinde un domeniu de legare la antigen, care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii CDR1, CDR2 şi CDR3, în care imunoglobulina menţionată se leagă de CX3CR1 umană şi este capabilă să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană. Într-un alt aspect, polipeptida cuprinde unul sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1, unde polipeptida respectivă este capabilă să blocheze legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană.
Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie este caracterizată prin una sau mai multe din următoarele proprietăţi:
- de a se lega cu afinitate mare de CX3CR1 umană, de exemplu la o valoare CE50 mai mică sau egală cu 10nM, mai mică sau egală cu 5nM, mai mică sau egală cu 2,5mM sau mai mică sau egală cu 1 nM, precum este determinat prin analiza FACS a legării celulelor;
- de a bloca legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană, de exemplu la o valoare CI50 mai mică sau egală cu 300nM, sau mai mică sau egală cu 100 nM, sau mai mică sau egală cu 20nM, sau mai mică sau egală cu 10nM, sau mai mică sau egală cu 5nM, sau mai mică sau egală cu 2,5nM sau mai mică sau egală cu 1nM;
- de a inhiba chemotaxia indusă de fractalkină mediată de CX3CR1 umană, de exemplu, la o valoare CI50 mai mică sau egală cu 500 nM, sau mai mică sau egală cu 100 nM, sau mai mică sau egală cu 75 nM, sau mai mică sau egală cu 50 nM , sau mai mică sau egală cu 10 nM sau mai mică sau egală cu 5 nM; eficacitatea obţinută a inhibării este mai mare sau egală cu 15%, sau mai mare sau egală cu 50%, sau mai mare sau egală cu 80%, sau mai mare sau egală cu 95%;
- de a inhiba internalizarea indusă de fractalkină mediată de CX3CR1 umană, de exemplu la o valoare de CI50 mai mică sau egală cu 10 nM sau mai mică sau egală cu 5 nM;
- de a reacţiona încrucişat cu CX3CR1 de cinomolgus, de exemplu în mărime de 10 ori a valorii CE/I50 pentru CX3CR1 umană pentru legarea şi inhibarea funcţională.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde o fracţiune de extindere a timpului de înjumătăţire, de exemplu, o fracţiune de legare a albuminei, o moleculă de polietilenglicol sau un domeniu Fc. Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde două sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1. Într-un aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 sunt legate covalent printr-o peptidă linker. Într-un aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 într-o polipeptidă din prezenta invenţie au aceeaşi secvenţă de aminoacizi. Într-un alt aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 într-o polipeptidă din prezenta invenţie au diferite secvenţe de aminoacizi. Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde două domenii variabile unice de imunoglobulinice anti-CX3CR1 şi cuprinde în plus o fracţiune de extindere a timpului de înjumătăţire, de exemplu, o fracţiune de legare a albuminei, o moleculă de polietilenglicol sau un domeniu Fc.
Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde un prim domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 legat covalent la o fracţiune de legare a albuminei printr-o primă peptidă linker, unde fracţiunea respectivă de legare a albuminei este ulterior legată covalent de un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 prin a doua peptidă linker.
Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 legat covalent de un domeniu Fc printr-o peptidă linker. Într-un aspect, o astfel de polipeptidă care cuprinde un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 legat covalent la un domeniu Fc printr-o peptidă linker este furnizată ca un dimer, de exemplu prin punţi disulfurice.
Polipeptidele conform prezentei invenţii sunt obţinute după cum este descris mai jos. Pe scurt, domeniile variabile unice ale prezentei invenţii au fost identificate dintr-o bancă care exprimă domeniile variabile unice (VHH) obţinute dintr-o lamă imunizată cu ADN care codifică CX3CR1 umană. Banca de fagi a fost aplicată pe lipoparticulele virale ale hCX3CR1 şi fagii de legare au fost examinaţi pentru capacitatea lor de a concura pentru legarea receptorilor cu fractalkina marcată Alexa-fluor (AF-FKN). Domenii variabile unice reprezentative din prezenta invenţie sunt descrise mai detaliat în prezenta.
Într-un aspect, un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţie constă în principal din patru regiuni-cadru (FR1, FR2, FR3 şi FR4) şi trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR1, CDR2 şi CDR3). În special, domeniul variabil unic imunoglobulinic are structura FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Într-un aspect, domeniul variabil unic imunoglobulinic este un domeniu de anticorpi.
Într-un aspect, CDR3 a unei polipeptide din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie are secvenţa de aminoacizi Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 prezentată în SECV ID Nr.: 197, unde:
- Xaa1 este Pro, Ala sau Gly;
- Xaa2 este Asp sau Asn;
- Xaa3 este Thr sau Ser;
- Xaa4 este Arg, Lys, Ala sau Gly; şi
- Xaa5 este Tyr sau Phe.
Într-un aspect, CDR3 a unei polipeptide din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie are secvenţa de aminoacizi Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 prezentată în SECV ID Nr.: 197, unde:
- Xaa1 este Pro, Ala sau Gly;
- Xaa2 este Asp sau Asn;
- Xaa3 este Thr;
- Xaa4 este Arg sau Lys; şi
- Xaa5 este Tyr.
Într-un aspect, CDR3 a unei polipeptide din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are secvenţa de aminoacizi Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr prezentată în SECV ID Nr.: 186.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are următoarea CDR1, CDR2 şi CDR3:
- CDR1:
a) are secvenţa de aminoacizi GSIFSSNAMA (SECV ID Nr.: 141); sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 80% identitate cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 141; sau
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 141, unde
- în poziţia 2 S a fost modificat în T, sau G;
- în poziţia 6 S a fost modificat în R;
- în poziţia 7 N a fost modificat în T; şi/sau
- în poziţia 9 M a fost modificat în K; sau
d) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 141-145 şi 213;
- CDR2:
a) are secvenţa de aminoacizi GINSVGITK (SECV ID Nr.: 164); sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 70% identitate cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 164; sau
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 164, unde
- în poziţia 1 G a fost modificat în A, L, V sau S;
- în poziţia 3 N a fost modificat în D, S, Q, G sau T;
- în poziţia 4 S a fost modificat în T, K, G sau P;
- în poziţia 5 V a fost modificat în A;
- în poziţia 6 G a fost modificat în D;
- în poziţia 7 I a fost modificat în T, sau V;
- în poziţia 8 T a fost modificat în A; şi/sau
- în poziţia 9 K a fost modificat în R; sau
- are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 162-175 şi 214-221; şi CDR3:
a) are secvenţa de aminoacizi DPRRGWDTRY (SECV ID Nr.: 186); sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 70% identitate cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 186; sau
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 186, unde
- în poziţia 2 P a fost modificat în A, sau G;
- în poziţia 7 D a fost modificat în N; şi/sau
- în poziţia 9 R a fost modificat în K; sau
d) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 186-190.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are următoarea CDR1, CDR2 şi CDR3, unde:
- CDR1 sus-menţionat are secvenţa de aminoacizi GRTFSSYAMG (SECV ID Nr.: 146);
- CDR2 sus-menţionat are o secvenţă de aminoacizi care a) are cel puţin 90% identitate cu secvenţa de aminoacizi GISGSASRKY (SECV ID Nr.: 176) sau b) are secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 176 sau 177; şi
- CDR3 sus-menţionat are secvenţa de aminoacizi SNSYPKVQFDY (SECV ID Nr.: 191).
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are următoarea CDR1, CDR2 şi CDR3:
- CDR1 menţionată:
a) are secvenţa de aminoacizi GTIFSNNAMG (SECV ID Nr.: 147); sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 6, 5, 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 147, unde
- în poziţia 1 G a fost modificat în K, R, sau A;
- în poziţia 2 T a fost modificat în I, P, S sau L;
- în poziţia 3 I a fost modificat în V, sau T;
- în poziţia 4 F a fost modificat în L;
- în poziţia 5 S a fost modificat în R, sau D;
- în poziţia 6 N a fost modificat în S, T, sau D; şi/sau
- în poziţia 7 N a fost modificat în T, sau Y; şi/sau
c) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 147-161;
- CDR2 sus-menţionată:
a) are secvenţa de aminoacizi SISNSGSTN (SECV ID Nr.: 179); sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 179, unde
- în poziţia 3 S a fost modificat în T, sau G;
- în poziţia 4 N a fost modificat în S, sau I;
- în poziţia 5 S a fost modificat în T;
- în poziţia 6 G a fost modificat în Y; şi/sau
- în poziţia 8 T a fost modificat în A; sau
c) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 178-185; şi
- CDR3 sus-menţionată:
a) are secvenţa de aminoacizi DARRGWNTAY (SECV ID Nr.: 192); sau
b) are o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 80% identitate cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 192; sau
c) are o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 192, unde
- în poziţia 2 A a fost modificat în G;
- în poziţia 8 T a fost modificat în S;
- în poziţia 9 A a fost modificat în G; şi/sau
- în poziţia 10 Y a fost modificat în F; sau
d) are o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 192-196.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are următoarea CDR1, CDR2 şi CDR3:
- SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 163 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 141, 164 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 166 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 167 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 167 şi, respectiv, 189; sau
- SECV ID Nr.: 141, 168 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 168 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 141, 169 şi, respectiv, 190; sau
- SECV ID Nr.: 141, 170 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 171 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 174 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 175 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 142, 165 şi, respectiv, 188; sau
- SECV ID Nr.: 142, 173 şi, respectiv, 188; sau
- SECV ID Nr.: 143, 164 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 144, 172 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 145, 172 şi, respectiv, 187; sau
- SECV ID Nr.: 141, 214 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 215 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 216 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 217 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 218 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 219 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 220 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 221 şi, respectiv, 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 214 şi, respectiv, 186.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are următoarea CDR1, CDR2 şi CDR3:
- SECV ID Nr.: 146, 176 şi, respectiv, 191; sau
- SECV ID Nr.: 146, 177 şi, respectiv, 191.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are următoarea CDR1, CDR2 şi CDR3:
- SECV ID Nr.: 147, 178 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 147, 179 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 147, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 148, 179 şi, respectiv, 193; sau
- SECV ID Nr.: 149, 179 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 180 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 181 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 183 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 149, 185 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 150, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 150, 182 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 151, 179 şi, respectiv, 193; sau
- SECV ID Nr.: 151, 182 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 151, 184 şi, respectiv, 196; sau
- SECV ID Nr.: 152, 179 şi, respectiv, 195; sau
- SECV ID Nr.: 153, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 154, 182 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 155, 179 şi, respectiv, 195; sau
- SECV ID Nr.: 156, 181 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 157, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 158, 179 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 159, 178 şi, respectiv, 192; sau
- SECV ID Nr.: 160, 179 şi, respectiv, 194; sau
- SECV ID Nr.: 161, 179 şi, respectiv, 194.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentată în:
- SECV ID Nr.: 141, 164 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie, în special un domeniu unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, are CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentată în:
- SECV ID Nr.: 213, 214 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 221 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Polipeptide reprezentative din prezenta invenţie având CDR-urile descrise mai sus sunt prezentate în tab. 1, 2, 3 (polipeptide reprezentative din familiile 101, 9 şi, respectiv, 13) şi 4 (polipeptide reprezentative ale variantelor optimizate din familia 101.
Familia 101
Tabel 1
Numărul clonei SECV CDR1* SECV CDR1 CDR2* SECV CDR2 CDR3* SECV CDR3 CX3CR1BIIPMP66B02 1 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54A12 2 GSIFSSNAMA 141 VINSVGITK 163 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP54A3 3 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54A4 4 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54A5 5 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54A7 6 GTIFSSNAMA 142 GINSVDITK 165 DPRRGWNTRY 188 CX3CR1BIIPMP54B1 7 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54B2 8 GTIFSSNAMA 142 GINSVDITK 165 DPRRGWNTRY 188 CX3CR1BIIPMP54B3 9 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54B5 10 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54D5 11 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DGRRGWDTRY 189 CX3CR1BIIPMP54D8 12 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54F6 13 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54G3 14 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP54H1 15 GTIFSSNAMA 142 GINSVDITK 165 DPRRGWNTRY 188 CX3CR1BIIPMP54H4 16 GSIFSSNAMA 141 VINSVGITK 163 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP61F10 17 GTIFSSNAMA 142 GINSVDITK 165 DPRRGWNTRY 188 CX3CR1BIIPMP61D1 18 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP61D5 19 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP61E2 20 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP61F11 21 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP61G2 22 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP61G3 23 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP61G4 24 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP61F4 25 GSIFSSNAMA 141 VINTVGITK 168 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP61A11 26 GSIFSSNAMA 141 VINSVGITK 163 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP61B2 27 GSIFSSNAMA 141 VINTVGITK 168 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP61C9 28 GSIFSSNAMA 141 LIDSAGITK 169 DARRGWNTKY 190 CX3CR1BIIPMP65H02 29 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP65E11 30 GSIFSSNAMA 141 GINSVGIAK 170 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP65E10 31 GSIFSSNAKA 143 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP65E05 32 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP65B11 33 GSIFSSNAMA 141 VINKVGITK 171 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP65B07 34 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP65B09 35 GSIFSRNAMA 144 SINSVGITK 172 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP65H01 36 GGIFSRNAMA 145 SINSVGITK 172 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP65G07 37 GTIFSSNAMA 142 GINSVDITR 173 DPRRGWNTRY 188 CX3CR1BIIPMP66H08 38 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP66H04 39 GSIFSSNAMA 141 AINSVGITK 166 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP66F02 40 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP66E11 41 GSIFSSNAMA 141 AINSVGTTK 174 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP66D10 42 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP66D08 43 GSIFSSNAMA 141 GINSVGITK 164 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP66A04 44 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BIIPMP66D04 45 GTIFSSNAMA 142 GINSVDITK 165 DPRRGWNTRY 188 CX3CR1BIIPMP66D02 46 GSIFSSNAMA 141 VINSVGITK 163 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP66D06 47 GSIFSSNAMA 141 SIDSVGITK 175 DARRGWDTRY 187 CX3CR1BIIPMP66G01 48 GSIFSSNAMA 141 LINSVGITK 167 DGRRGWDTRY 189
* Secvenţele CDR au fost determinate conform Ingineriei Anticorpilor, vol. 2 de către Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Numerele secvenţelor în tabel (SECV) se referă la secvenţele din lista secvenţelor cererii în cauză.
Familia 9
Tabel 2
Numărul clonei SECV CDR1* SECV CDR1 CDR2* SECV CDR2 CDR3* SECV CDR3 CX3CR1BIIPMP11H11 49 GRTFSSYAMG 146 GISGSASRKY 176 SNSYPKVQFDY 191 CX3CR1BIIPMP12B6 50 GRTFSSYAMG 146 GISGSASRKY 176 SNSYPKVQFDY 191 CX3CR1BIIPMP12G9 51 GRTFSSYAMG 146 GISGSGSRKY 177 SNSYPKVQFDY 191 CX3CR1BIIPMP15G11 52 GRTFSSYAMG 146 GISGSGSRKY 177 SNSYPKVQFDY 191
* Secvenţele CDR au fost determinate conform Ingineriei Anticorpilor, vol 2 de către Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Numerele secvenţelor în tabel (SECV) se referă la secvenţele din lista secvenţelor cererii în cauză.
Familia 13
Tabel 3
Numărul clonei SECV CDR1* SECV CDR1 CDR2* SECV CDR2 CDR3* SECV CDR3 CX3CR1BIIPMP18E6 53 GTIFSNNAMG 147 SISSSGSTN 178 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP12C2 54 GTIFSNTAMG 148 SISNSGSTN 179 DARRGWNSGY 193 CX3CR1BIIPMP18A10 55 GIIFSNNAMG 149 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18A2 56 GIIFSNNAMG 149 SIGSTYSTN 180 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18A8 57 RTIFRSNAMG 150 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP18A9 58 GIIFSNNAMG 149 SISSTYSTN 181 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18B7 59 GTIFRSNAMG 151 SISNSGSTN 179 DARRGWNSGY 193 CX3CR1BIIPMP18B9 60 GTIFSNNAMG 147 SISSSGSTN 178 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18C6 61 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18C9 62 GIIFSNNAMG 149 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18D1 63 GIIFSNNAMG 149 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18D10 64 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18D12 65 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18F1 66 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18F5 67 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18F6 68 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18F9 69 GTIFRTNAMG 152 SISNSGSTN 179 DGRRGWNTGY 195 CX3CR1BIIPMP18G5 70 RTIFRSNAMG 150 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP18H1 71 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18H10 72 KTIFRSNAMG 153 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP18H7 73 GIIFSNNAMG 149 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP18H9 74 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP20B3 75 GIIFSNNAMG 149 SIGSTYSTN 180 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP20C12 76 GTIFRSNAMG 151 SISNSGSTN 179 DARRGWNSGY 193 CX3CR1BIIPMP20C3 77 GIIFSNNAMG 149 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP20C6 78 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP20D8 79 GTTFRSNAMG 154 SITNSGSTN 182 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP20E11 80 RTIFRSNAMG 150 SITNSGSTN 182 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP20E5 81 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP20F3 82 GTIFSNNAMG 147 SISSSGSTN 178 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP20F4 83 ATIFRSNAMG 155 SISNSGSTN 179 DGRRGWNTGY 195 CX3CR1BIIPMP20F5 84 ATIFRSNAMG 155 SISNSGSTN 179 DGRRGWNTGY 195 CX3CR1BIIPMP21B6 85 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP24A12 86 GIIFSNNAMG 149 SISNSGSAN 183 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP24A6 87 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP24B9 88 GTIFRSNAMG 151 SISISGSTN 184 DARRGWNTGF 196 CX3CR1BIIPMP24D3 89 GIIFSNNAMG 149 SISSTYSTN 181 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP24F7 90 GLIFSNNAMG 156 SISSTYSTN 181 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP28B4 91 ATIFRSNAMG 155 SISNSGSTN 179 DGRRGWNTGY 195 CX3CR1BIIPMP28F1 92 GIIFSNNAMG 149 SIGSTYSTN 180 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP28F6 93 GIIFSNNAMG 149 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP28F9 94 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP29A5 95 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP29D5 96 GTIFRSNAMG 151 SISNSGSTN 179 DARRGWNSGY 193 CX3CR1BIIPMP29E3 97 KTIFRSNAMG 153 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP29E7 98 KTIFRSNAMG 153 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP29G10 99 GTIFRSNAMG 151 SITNSGSTN 182 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP29G7 100 GIIFSNNAMG 149 SITNTGSTN 185 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP29H1 101 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP37A8 102 RTIFRSNAMG 150 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP37B9 103 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP37C12 104 GSIFRSNAMG 157 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP37C7 105 RTIFSNNAMG 158 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP37D9 106 GTVFSNNAMG 159 SISSSGSTN 178 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP37E12 107 KPIFRSNAMG 160 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP41B10 108 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP41B11 109 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP41B8 110 GIIFSNNAMG 149 SIGSTYSTN 180 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP41C10 111 RTIFRSNAMG 150 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP41F9 112 GIIFSNNAMG 149 SIGSTYSTN 180 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP41H10 113 GLTLDDYAMG 161 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP46B5 114 RTIFRSNAMG 150 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP46D3 115 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP46H5 116 GIIFSNNAMG 149 SISSTYSTN 181 DARRGWNTAY 192 CX3CR1BIIPMP48B8 117 KTIFRSNAMG 153 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP48D11 118 RTIFRSNAMG 150 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP48G8 119 RTIFRSNAMG 150 SISNSGSTN 179 DARRGWNTGY 194 CX3CR1BIIPMP48H9 120 GTIFSNNAMG 147 SISNSGSTN 179 DARRGWNTAY 192
* Secvenţele CDR au fost determinate conform Ingineriei Anticorpilor, vol. 2 de către Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Numerele secvenţelor în tabel (SECV) se referă la secvenţele din lista secvenţelor cererii în cauză.
Variante optimizate
Tabel 4
Numărul clonei SECV CDR1 SECV CDR1 CDR2 SECV CDR2 CDR3 SECV CDR3 CX3CR1BIIPMP66B02 1 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII043 121 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII045 122 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII047 123 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII048 124 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII049 125 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII050 126 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII061 127 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII056 128 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII057 129 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII060 130 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII065 131 GSIFSSNAMA 141 AISSVGVTK 214 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII067 132 GSIFSSNAMA 141 AIQSVGVTK 215 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII068 133 GSIFSSNAMA 141 AIGSVGVTK 216 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII074 134 GSIFSSNAMA 141 AITSVGVTK 217 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII118 135 GSIFSSNAMA 141 AINTVGVTK 218 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII129 136 GSIFSSNAMA 141 AINGVGVTK 219 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII158 137 GSIFSSNAMA 141 AINPVGVTK 220 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII306 138 GSIFSSTAMA 213 AISSVGVTK 214 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII307 139 GSIFSSTAMA 213 AISTVGVTK 221 DPRRGWDTRY 186 CX3CR1BII308 140 GSIFSSNAMA 141 AINSVGVTK 162 DPRRGWDTRY 186
* Secvenţele CDR au fost determinate conform Ingineriei Anticorpilor, vol 2 de către Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Numerele secvenţelor în tabel (SECV) se referă la secvenţele din lista secvenţelor cererii în cauză.
Într-un alt aspect, prezenta invenţie furnizează polipeptide care au unul sau mai multe domenii VHH.
Într-un aspect, un domeniu VHH din prezenta invenţie cuprinde sau constă, în principal, din secvenţa prezentată în:
a) secvenţa de aminoacizi SECV ID Nr.: 3; sau
b) secvenţele de aminoacizi care au cel puţin 90% identitate cu secvenţele de aminoacizi SECV ID Nr.: 3; sau
c) secvenţe de aminoacizi care au o diferenţă de 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţe de aminoacizi SECV ID Nr.: 3 sau
d) o secvenţă de aminoacizi a oricărora dintre SECV ID Nr.: 1-48, sau SECV ID Nr.: 121-140, sau SECV ID Nr.: 222-224.
Într-un alt aspect, un domeniu VHH din prezenta invenţie cuprinde sau constă, în principal, din secvenţa prezentată în:
a) secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 49; sau
b) o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 95% identitate cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 49; sau
c) o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 5, 4, 3, 2 sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 49; sau
d) o secvenţă de aminoacizi a oricărora dintre SECV ID Nr.: 49-52.
Într-un alt aspect, un domeniu VHH din prezenta invenţie cuprinde sau constă, în principal, din secvenţa prezentată în:
a) secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 67; sau
b) o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 90% identitate cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 67; sau
c) o secvenţă de aminoacizi care are o diferenţă de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, sau 1 aminoacid(zi) cu secvenţele de aminoacizi ale SECV ID Nr.: 67; sau
d) o secvenţă de aminoacizi a oricărora dintre SECV ID Nr.: 53-120.
Într-un alt aspect, un domeniu VHH din prezenta invenţie cuprinde sau constă, în principal, din secvenţa de aminoacizi prezentată în oricare dintre SECV ID Nr.: 121-140, sau SECV ID Nr.: 222-224.
Într-un alt aspect, un domeniu VHH din prezenta invenţie cuprinde sau constă, în principal, din secvenţa de aminoacizi prezentată în oricare dintre SECV ID Nr.: 138-140.
Într-un alt aspect, un domeniu VHH din prezenta invenţie cuprinde sau constă, în principal, din secvenţa de aminoacizi prezentată în oricare dintre SECV ID Nr.: 222-224.
Domenii VHH reprezentative ale prezentei invenţii sunt prezentate în Tabelul 5 şi domenii VHH optimizate reprezentative ale prezentei invenţii sunt prezentate în tab. 6 de mai jos:
Domeniile VHH
SECV ID Nr.: 1-48 sunt domenii VHH din familia 101. SECV ID Nr.: 49-52 sunt domenii VHH din familia 9. SECV ID Nr.: 53-120 sunt domenii VHH din familia 13.
Tabel 5
CX3CR1BIIPMP66B02 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 1 CX3CR1BIIPMP54A12 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 2 CX3CR1BIIPMP54A3 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 3 CX3CR1BIIPMP54A4 EVQLVESGRGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 4 CX3CR1BIIPMP54A5 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 5 CX3CR1BIIPMP54A7 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 6 CX3CR1BIIPMP54B1 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 7 CX3CR1BIIPMP54B2 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 8 CX3CR1BIIPMP54B3 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 9 CX3CR1BIIPMP54B5 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 10 CX3CR1BIIPMP54D5 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 11 CX3CR1BIIPMP54D8 EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 12 CX3CR1BIIPMP54F6 KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 13 CX3CR1BIIPMP54G3 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 14 CX3CR1BIIPMP54H1 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 15 CX3CR1BIIPMP54H4 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 16 CX3CR1BIIPMP61F10 KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 17 CX3CR1BIIPMP61D1 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAFGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 18 CX3CR1BIIPMP61D5 KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAFGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 19 CX3CR1BIIPMP61E2 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDMAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 20 CX3CR1BIIPMP61F11 KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQPPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTIFRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 21 CX3CR1BIIPMP61G2 EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 22 CX3CR1BIIPMP61G3 KVQLVESGGGSMQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMMSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 23 CX3CR1BIIPMP61G4 KVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMMSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 24 CX3CR1BIIPMP61F4 EVQLVESGGGSVQAGASLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINTVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 25 CX3CR1BIIPMP61A11 EVQLVESRGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 26 CX3CR1BIIPMP61B2 EVQLVESRGGSVQAGASLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINTVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 27 CX3CR1BIIPMP61C9 EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQALGKQRDLVALIDSAGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCASDARRGWNTKYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 28 CX3CR1BIIPMP65H02 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 29 CX3CR1BIIPMP65E11 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGIAKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 30 CX3CR1BIIPMP65E10 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAKAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 31 CX3CR1BIIPMP65E05 KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 32 CX3CR1BIIPMP65B11 EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINKVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 33 CX3CR1BIIPMP65B07 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 34 CX3CR1BIIPMP65B09 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSRNAMAWYRQAPGKQRDLVASINSVGITKYGDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 35 CX3CR1BIIPMP65H01 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGGIFSRNAMAWYRQAPGKQRDLVASINSVGITKYGDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 36 CX3CR1BIIPMP65G07 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITRYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 37 CX3CR1BIIPMP66H08 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 38 CX3CR1BIIPMP66H04 EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMMSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 39 CX3CR1BIIPMP66F02 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYAGSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 40 CX3CR1BIIPMP66E11 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGTTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 41 CX3CR1BIIPMP66D10 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQALGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 42 CX3CR1BIIPMP66D08 EVQLMESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 43 CX3CR1BIIPMP66A04 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQALGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 44 CX3CR1BIIPMP66D04 KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 45 CX3CR1BIIPMP66D02 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTTSGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 46 CX3CR1BIIPMP66D06 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVASIDSVGITKYRDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 47 CX3CR1BIIPMP66G01 EMQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 48 CX3CR1BIIPMP11H11 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 49 CX3CR1BIIPMP12B6 EVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGRERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 50 CX3CR1BIIPMP12G9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISGSGSRKYYADSVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLKPEDRAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 51 CX3CR1BIIPMP15G11 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISGSGSRKYYADSVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLKPEDRAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 52 CX3CR1BIIPMP18E6 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGAQVTVSS SECV ID Nr.: 53 CX3CR1BIIPMP12C2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNTAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 54 CX3CR1BIIPMP18A10 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSAKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 55 CX3CR1BIIPMP18A2 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 56 CX3CR1BIIPMP18A8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 57 CX3CR1BIIPMP18A9 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 58 CX3CR1BIIPMP18B7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 59 CX3CR1BIIPMP18B9 EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 60 CX3CR1BIIPMP18C6 EVQLMESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 61 CX3CR1BIIPMP18C9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 62 CX3CR1BIIPMP18D1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKSTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 63 CX3CR1BIIPMP18D10 EVQLVESGGGLVQPGGSLGLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 64 CX3CR1BIIPMP18D12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 65 CX3CR1BIIPMP18F1 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 66 CX3CR1BIIPMP18F5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 67 CX3CR1BIIPMP18F6 EVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 68 CX3CR1BIIPMP18F9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRTNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 69 CX3CR1BIIPMP18G5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 70 CX3CR1BIIPMP18H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQALGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 71 CX3CR1BIIPMP18H10 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 72 CX3CR1BIIPMP18H7 EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 73 CX3CR1BIIPMP18H9 EVQLVKSGGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 74 CX3CR1BIIPMP20B3 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 75 CX3CR1BIIPMP20C12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSGYWGQGTRVTVSS SECV ID Nr.: 76 CX3CR1BIIPMP20C3 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 77 CX3CR1BIIPMP20C6 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 78 CX3CR1BIIPMP20D8 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGTTFRSNAMGWYRQGPGKKRDLVASITNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMSSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 79 CX3CR1BIIPMP20E11 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQGPGKKRDLVASITNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDRNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 80 CX3CR1BIIPMP20E5 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQVPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 81 CX3CR1BIIPMP20F3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 82 CX3CR1BIIPMP20F4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSATIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 83 CX3CR1BIIPMP20F5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSATIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRSTVSRDNDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 84 CX3CR1BIIPMP21B6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDMGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 85 CX3CR1BIIPMP24A12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSANYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 86 CX3CR1BIIPMP24A6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSGDNDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 87 CX3CR1BIIPMP24B9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISISGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGFWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 88 CX3CR1BIIPMP24D3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 89 CX3CR1BIIPMP24F7 EVQLMESGGGMVQVGGSLRLSCTASGLIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 90 CX3CR1BIIPMP28B4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAISATIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 91 CX3CR1BIIPMP28F1 EMQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 92 CX3CR1BIIPMP28F6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNHADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 93 CX3CR1BIIPMP28F9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQVPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 94 CX3CR1BIIPMP29A5 EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 95 CX3CR1BIIPMP29D5 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 96 CX3CR1BIIPMP29E3 EVQLVESEGGLVQPGGSLRLPCATSKTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 97 CX3CR1BIIPMP29E7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKTIFRSNAMGWYRQAPGKKRGLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 98 CX3CR1BIIPMP29G10 EVQLMESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGWYRQGPGKKRDLVASITNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMSSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 99 CX3CR1BIIPMP29G7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASITNTGSTNYADSVKGRFTVSRDNDRNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 100 CX3CR1BIIPMP29H1 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 101 CX3CR1BIIPMP37A8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSAKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 102 CX3CR1BIIPMP37B9 EVQLVESGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 103 CX3CR1BIIPMP37C12 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 104 CX3CR1BIIPMP37C7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 105 CX3CR1BIIPMP37D9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTVFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 106 CX3CR1BIIPMP37E12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKPIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 107 CX3CR1BIIPMP41B10 EVQLVESEGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 108 CX3CR1BIIPMP41B11 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSPKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 109 CX3CR1BIIPMP41B8 EVQLVESEGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 110 CX3CR1BIIPMP41C10 EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKSTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 111 CX3CR1BIIPMP41F9 EVQLVESGGGVVQPGESLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 112 CX3CR1BIIPMP41H10 KVQLVESGGGLVQPGDSLRLSCAASGLTLDDYAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 113 CX3CR1BIIPMP46B5 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 114 CX3CR1BIIPMP46D3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQVPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLRMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 115 CX3CR1BIIPMP46H5 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGWYRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAYWGQGTPVTVSS SECV ID Nr.: 116 CX3CR1BIIPMP48B8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYTDSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 117 CX3CR1BIIPMP48D11 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 118 CX3CR1BIIPMP48G8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFAVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 119 CX3CR1BIIPMP48H9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADFVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 120
Domeniile VHH optimizate
Tabel 6
CX3CR1BII043 EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 121 CX3CR1BII045 DVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 122 CX3CR1BII047 EVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 123 CX3CR1BII048 EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 124 CX3CR1BII049 EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 125 CX3CR1BII050 EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRELVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 126 CX3CR1BII061 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 127 CX3CR1BII056 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 128 CX3CR1BII057 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRELVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 129 CX3CR1BII060 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRELVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 130 CX3CR1BII065 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 131 CX3CR1BII067 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAIQSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 132 CX3CR1BII068 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAIGSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 133 CX3CR1BII074 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAITSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 134 CX3CR1BII118 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINTVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 135 CX3CR1BII129 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINGVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 136 CX3CR1BII158 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINPVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 137 CX3CR1BII306 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 138 CX3CR1BII307 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 139 CX3CR1BII308 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 140 CX3CR1BII00306 (D1E) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 222 CX3CR1BII00307 (D1E) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 223 CX3CR1BII00308 (D1E) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 224
Într-un alt aspect, o polipeptidă conform prezentei invenţii, în special un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţie este umanizat şi/sau optimizat în ce priveşte stabilitatea, eficacitatea, posibilitatea de producţie şi/sau similitudinea cu regiunile-cadru umane. De exemplu, polipeptida este umanizată şi/sau optimizată secvenţional în una sau mai multe dintre următoarele poziţii (conform numerotării Kabat): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108. Într-un aspect, polipeptida cuprinde una sau mai multe dintre următoarele mutaţii: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.
Într-un aspect, una sau mai multe regiuni-cadru ale unei polipeptide conform prezentei invenţii, în special un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţiei, sunt umanizate şi/sau optimizate secvenţional. Într-un aspect, o polipeptidă conform prezentei invenţii, în special un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, cuprinde regiuni-cadru (FR), de exemplu, după cum este prezentat mai jos:
i) FR1 este selectată dintre oricare din SECV ID Nr: 198-204;
ii) FR2 este selectată dintre oricare din SECV ID Nr: 205-208;
iii) FR3 este selectată dintre oricare din SECV ID Nr: 209-210; şi/sau
iv) FR4 este selectată dintre oricare din SECV ID Nr: 211-212.
În domeniu sunt cunoscute secvenţele regiunilor-cadru imunoglobulinice umane (FR), care, de asemenea, pot fi folosite ca secvenţe ale regiunilor-cadru pentru domeniile variabile unice imunoglobulinice, după cum sunt descrise mai sus. De asemenea, în domeniu sunt cunoscute metode pentru umanizarea regiunilor-cadru ale domeniilor variabile unice imunoglobulinice obţinute de la alte specii, cu excepţia celei umane.
Într-un alt aspect, una sau mai multe regiuni CDR ale unei polipeptide conform prezentei invenţii, în special un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, este umanizat şi/sau optimizat secvenţional. Într-un aspect, o polipeptidă conform prezentei invenţii, în special un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, este umanizată şi/sau optimizată secvenţional în una sau mai multe dintre următoarele poziţii (conform numerotării Kabat): 52, 53.
Într-un alt aspect, o polipeptidă conform prezentei invenţii, în special un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, cuprinde una sau mai multe dintre următoarele mutaţii: N52S, S53T.
Într-un alt aspect, o polipeptidă conform prezentei invenţii, în special un domeniu variabil unic imunoglobulinic din prezenta invenţie, cuprinde o regiune CDR2 selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 214-221.
Secvenţe umanizate şi/sau optimizate reprezentative din prezenta invenţie sunt prezentate în Tabelul 4 şi 6 de mai sus şi în Tabelul 7 de mai jos.
Tabel 7: Variante de secvenţe optimizate
Tab. 7a indică FR1-CDR1-FR2-CDR2 ale variantelor de secvenţe optimizate, tab. 7b indică FR3-CDR3-FR4-CDR4 ale variantelor respective. Numerele secvenţelor în tabele (SECV) se referă la secvenţele din lista de secvenţe a cererii în cauză.
Variante de secvenţe optimizate (FR1-CDR1-FR2-CDR2)
Tabel 7a
Numărul clonei SECV FR1 SECV FR1 CDR1 SECV CDR1 FR2 SECV FR2 CDR2 SECV CDR2 CX3CR1BIIPMP66B02 1 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII043 121 EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAAS 199 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII045 122 DVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAAS 200 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII047 123 EVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAAS 201 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII048 124 EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAAS 202 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII049 125 EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAAS 199 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKQRDLVA 206 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII050 126 EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAAS 199 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRELVA 207 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII061 127 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 203 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII056 128 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 203 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKQRDLVA 206 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII057 129 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 203 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRELVA 207 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII060 130 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 203 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKQRELVA 208 AINSVGVTK 162 CX3CR1BII065 131 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AISSVGVTK 214 CX3CR1BII067 132 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AIQSVGVTK 215 CX3CR1BII068 133 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AIGSVGVTK 216 CX3CR1BII074 134 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AITSVGVTK 217 CX3CR1BII118 135 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINTVGVTK 218 CX3CR1BII129 136 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINGVGVTK 219 CX3CR1BII158 137 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAAS 198 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINPVGVTK 220 CX3CR1BII306 138 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 204 GSIFSSTAMA 213 WYRQAPGKRRDLVA 205 AISSVGVTK 214 CX3CR1BII307 139 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 204 GSIFSSTAMA 213 WYRQAPGKRRDLVA 205 AISTVGVTK 221 CX3CR1BII308 140 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 204 GSIFSSNAMA 141 WYRQAPGKRRDLVA 205 AINSVGVTK 162
Variante de secvenţe optimizate (FR3-CDR3-FR4)
Tabel 7b
Numărul clonei SECV FR3 SECV FR3 CDR3 SECV CDR3 FR4 SECV FR4 CX3CR1BIIPMP66B02 1 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTQVTVSS 211 CX3CR1BII043 121 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII045 122 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII047 123 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII048 124 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII049 125 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII050 126 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII061 127 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII056 128 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII057 129 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII060 130 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII065 131 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII067 132 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII068 133 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII074 134 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII118 135 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII129 136 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII158 137 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTS 209 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII306 138 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII307 139 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212 CX3CR1BII308 140 YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTS 210 DPRRGWDTRY 186 WGQGTLVTVSS 212
Într-un aspect al prezentei invenţii, o polipeptidă a invenţiei poate conţine suplimentar modificări, cum ar fi reziduuri de glicozil, catene laterale de aminoacizi modificate, şi altele.
Specialistului îi va fi clar că pentru utilizări farmaceutice la om, polipeptidele din invenţie sunt îndreptate, de preferinţă, împotriva CX3CR1 umane, în timp ce în scopuri veterinare, polipeptidele din invenţie sunt îndreptate, de preferinţă, împotriva CX3CR1 din speciile care urmează a fi tratate.
De asemenea, specialistului îi va clar că atunci când sunt utilizate în calitate de agent terapeutic la om, domeniile variabile unice imunoglobulnice cuprinse în polipeptidele conform invenţiei sunt, de preferinţă, domenii variabile unice imunoglobulnice umanizate.
Conform invenţiei, un domeniu variabil unic imunoglobulinic poate fi un anticorp domeniu, şi anume un anticorp VL sau VH, şi/sau domeniile VHH după cum este descris mai sus, şi/sau orice alt tip de domeniu variabil unic imunoglobulinic, de exemplu VH camelizat, cu condiţia ca aceste domenii variabile unice imunoglobulinice sunt domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1.
Într-un aspect al invenţiei, domeniul variabil unic imunoglobulinic constă, în principal, dintr-o secvenţă de anticorp domeniu sau o secvenţă de domeniu VHH, după cum este descris mai sus În special, domeniul variabil unic imunoglobulinic constă, în principal, din secvenţe ale domeniului VHH.
Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde două sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1. Într-un alt aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1, de exemplu VHH-uri anti-CX3CR1. Într-un aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 într-o polipeptidă din prezenta invenţie au aceeaşi secvenţă de aminoacizi. Într-un alt aspect, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 într-o polipeptidă din prezenta invenţie au diferite secvenţe de aminoacizi.
Conform unei alte variante de executare a invenţiei, cel puţin două domenii variabile unice imunoglobulinice prezente într-o polipeptidă din invenţie pot fi legate între ele în mod direct (adică fără utilizarea unui linker) sau prin intermediul unui linker. De preferinţă, linkerul este o peptidă linker şi, conform invenţiei, va fi selectat, astfel încât să permită legarea, cel puţin, a celor două domenii variabile unice imunoglobulinice de CX3CR1, fie în una şi aceeaşi moleculă CX3CR1, sau în două molecule diferite.
Linkerii adecvaţi vor depinde, printre altele, de epitopi şi, în mod special, de distanţa dintre epitopi pe CX3CR1 de care se leagă domeniile variabile unice imunoglobulinice, şi specialistului îi va fi clar în baza dezvăluirii din prezenta, opţional după un număr limitat de experimente obişnuite.
De asemenea, în cazul în care cele două sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 sunt anticorpi domeniu sau domenii VHH, acestea pot, de asemenea, să fie legate între ele printr-un al treilea anticorp domeniu sau domeniu VHH (în care cele două sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice pot fi legate direct de al treilea anticorp domeniu sau domeniul VHH sau prin linkeri adecvaţi). Un asemenea al treilea anticorp domeniu sau domeniul VHH poate fi, de exemplu, un anticorp domeniu sau domeniu VHH care asigură un timp de înjumătăţire sporit, după cum este descris în continuare în prezenta. De exemplu, cel din urmă anticorp domeniu sau domeniul VHH poate fi un anticorp domeniu sau domeniu VHH care este capabil să se lege de o proteină serică (umană), cum ar fi albumina serică (umană) sau transferina (umană), precum este descris în continuare în prezenta.
În mod alternativ, cele două sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 pot fi legate în serie (fie direct, fie prin intermediul unui linker adecvat) şi cel de-al treilea anticorp domeniu (unic) sau domeniul VHH (care poate asigura un timp de înjumătăţire sporit, precum este descris mai sus) poate fi conectat direct sau prin intermediul unui linker la una dintre aceste două sau mai multe secvenţe imunoglobulinice sus-menţionate.
Linkeri adecvaţi sunt descrişi în prezenta în legătură cu polipeptidele specifice ale invenţiei şi pot - de exemplu şi fără limitare - cuprinde o secvenţă de aminoacizi, care are, de preferinţă, o lungime de 5 sau mai mulţi aminoacizi, 7 sau mai mulţi aminoacizi, 9 sau mai mulţi aminoacizi, 11 sau mai mulţi aminoacizi, 15 sau mai mulţi aminoacizi sau, cel puţin, 17 aminoacizi, cum ar fi aproximativ 20 - 40 aminoacizi. Cu toate acestea, limita superioară nu este critică, dar este aleasă din motive de comoditate în ce priveşte, de ex., producerea biofarmaceutică a unor astfel de polipeptide.
Secvenţa de linkeri poate fi o secvenţă de origine naturală sau o secvenţă de origine nenaturală. Dacă este folosit în scopuri terapeutice, linker-ul, de preferinţă, nu este imunogen în subiectul căruia i se administrează polipeptida invenţiei.
Un grup util de secvenţe de linkeri sunt obţinuţi din regiunea de articulare a anticorpilor cu lanţuri grele după precum sunt descrişi în WO96/34103 (A1) 1996.10.31 şi WO 94/04678 (A1) 1994.03.03.
Alte exemple sunt secvenţe de linkeri poli-alanini cum sunt Ala-Ala-Ala.
Alte exemple preferate de secvenţe de linkeri sunt linkerii Gly/Ser cu lungime diferită cum ar fi linkeri (glyxsery)z, inclusiv (gly4ser)3 , (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3, şi (gly3ser2)3.
Dacă polipeptida din invenţie este modificată prin ataşarea unui polimer, de exemplu, a unei fracţiuni de polietilenglicol (PEG), secvenţa de linkeri include, de preferinţă, un reziduu de aminoacizi, cum ar fi o cisteină sau o lizină, care permite o astfel de modificare, de ex. Polietilenglicarea, în regiunea linkerilor.
Exemple de linkeri sunt:
GGGGS (linker 5 GS, SECV ID Nr.: 233)
SGGSGGS (linker 7GS, SECV ID Nr.: 234)
GGGGCGGGS (linker 8GS, SECV ID Nr.: 235)
GGGGSGGGS (linker 9GS, SECV ID Nr.: 236)
GGGGSGGGGS (linker 10GS, SECV ID Nr.: 237)
GGGGSGGGGSGGGGS (linker 15GS, SECV ID Nr.: 238)
GGGGSGGGGSGGGGGGGS (linker 18GS, SECV ID Nr.: 239)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (linker 20GS, SECV ID Nr.: 240)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (linker 25GS, SECV ID Nr.: 241)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (linker 30GS, SECV ID Nr.: 242)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (linker 35GS, SECV ID Nr.: 243)
EPKSCDKTHTCPPCP (linker de articulare G1, SECV ID Nr.: 244)
GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (linker de articulare 9GS-G1, SECV ID Nr.: 245)
EPKTPKPQPAAA (regiunea de articulare lungă superioară a lamei, SECV ID Nr.: 246)
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (articulare G3, SECV ID Nr.: 247) AAA (linker Ala, SECV ID Nr.: 248)
În plus, linkerul poate fi, de asemenea, o fracţiune de poli(etilenglicol), după cum este arătat, de ex.,în WO04/081026 (A2) 2004-09-23.
Exemple nelimitative de polipeptide care cuprind sau constau din două sau mai multe domenii variabile unice imunoglobulinice anti-CX3CR1 sunt prezentate în tab. 8a.
Polipeptide bivalente anti-CX3CR1
Tabel 8a
CX3CR1BII007 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGAQVTVSS SECV ID Nr.: 267 CX3CR1BII009 KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGAQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 268 CX3CR1BII012 EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAYWGQGAQVTVSS SECV ID Nr.: 269 CX3CR1BII016 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 270 CX3CR1BII017 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 271 CX3CR1BII018 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 272 CX3CR1BII019 EMQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEMQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 273 CX3CR1BII020 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 274 CX3CR1BII026 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 275 CX3CR1BII027 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 276 CX3CR1BII006 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYYGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 282
Într-o altă variantă de executare, cel puţin, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice ale polipeptidei din invenţie sunt legate între ele prin intermediul unei alte fracţiuni (opţional prin intermediul unuia sau a doi linkeri), cum ar fi o altă polipeptidă care, într-o variantă de executare preferată, dar nelimitativă, poate fi un alt domeniu variabil unic imunoglobulinic aşa cum s-a descris deja mai sus. O astfel de fracţiune poate fi, în principal, inactivă sau poate avea un efect biologic, cum ar fi îmbunătăţirea proprietăţilor dorite ale polipeptidei sau poate conferi una sau mai multe proprietăţi dorite suplimentare polipeptidei. De exemplu, şi fără limitare, fracţiunea poate îmbunătăţi timpul de înjumătăţire a proteinei sau polipeptidei, şi/sau poate reduce imunogenitatea acesteia sau îmbunătăţi orice altă proprietate dorită.
Într-un aspect, o polipeptidă a invenţiei include, în special atunci când este utilizată în calitate de agent terapeutic, o fracţiune care extinde timpul de înjumătăţire a polipeptidei invenţiei în ser sau în alte lichide organice ale unui pacient. Termenul "timp de înjumătăţire" semnifică timpul necesar pentru concentraţia serică a polipeptidei (modificate) de a reduce cu 50%, in vivo, de exemplu datorită degradării polipeptidei şi/sau clearance-ului şi/sau sechestrării prin mecanisme naturale.
Conform unei alte variante de executare a invenţiei, cele două domenii variabile unice imunoglobulinice pot fi unite la o moleculă de albumină serică, precum este descris, de ex., în WO01/79271 (A1) 2001.10.25 şi WO03/59934 (A2) 2003.07.24.
Alternativ, o astfel de fracţiune de extindere a timpului de înjumătăţire poate fi legată covalent sau unită la polipeptida respectivă şi poate fi, fără limitare, o porţiune Fc, o fracţiune de albumină, un fragment dintr-o fracţiune de albumină, o fracţiune de legare a albuminei, cum ar fi un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-albumină, o fracţiune de legare a transferinei, cum ar fi un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-transferină, o moleculă polioxialchilen, cum ar fi o moleculă de polietilenglicol, o peptidă de legare a albuminei, sau derivaţi de amidon hidroxietil (HES).
Într-un alt aspect, polipeptida invenţiei cuprinde o fracţiune care se leagă la un antigen găsit în sânge, cum ar fi albumina serică, imunoglobulinele serice, proteina de legare a tiroxinei, fibrinogenul sau transferina, conferind astfel un timp de înjumătăţire sporit in vivo polipeptidei rezultate a invenţiei. Conform unei variante de executare, o astfel de fracţiune este o imunoglobulină de legare a albuminei şi, în special, un domeniu variabil unic imunoglobulinic de legare a albuminei, cum ar fi un domeniu VHH de legare a albuminei.
Într-o altă variantă de executare, polipeptida invenţiei cuprinde o fracţiune care se leagă de albumina serică, unde o astfel de fracţiune este o peptidă de legare a albuminei, aşa cum este descris, de ex., în publicaţiile internaţionale de brevet WO2008/068280 (A1) 2008.06.12 şi WO2009/127691 (A1) 2009.10.22.
Dacă este destinat utilizării umane, un asemenea domeniu variabil unic imunoglobulinic de legare a albuminei (numit, de asemenea, domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-albumină) se va lega, de preferinţă, de albumina serică umană şi, de preferinţă, va fi un domeniu VHH umanizat de legare a albuminei.
Domeniile variabile unice imunoglobulinice care se leagă de albumina serică umană sunt cunoscute în domeniu şi sunt descrise mai detaliat, de ex., în WO2006/122786 (A2) 2006.11.23. Un domeniu VHH îndeosebi util, care se leagă de albumină constă sau conţine secvenţa de aminoacizi după cum este prezentat în oricare dintre SECV ID Nr.: 230-232:
Tabel 8b
ALB-1 AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 230 ALB-11 (ALB-1 umanizată) EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 231 ALB-2 AVQLVESGGGLVQGGGSLRLACAASERIFDLNLMGWYRQGPGNERELVATCITVGDSTNYADSVKGRFTISMDYTKQTVYLHMNSLRPEDTGLYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 232
Conform unei variante de executare, o polipeptidă a invenţiei poate fi legată de una sau mai multe părţi, fragmente sau domenii de anticorpi care conferă una sau mai multe funcţii efectoare polipeptidei din invenţie şi/sau poate conferi capacitatea de a se lega de unul sau mai mulţi receptori Fc. De exemplu, în acest scop, şi fără a se limita la acesta, părţile de anticorpi pot fi sau pot cuprinde domeniile CH2 şi/sau CH3 ale unui anticorp, cum ar fi de la un anticorp cu lanţ greu (aşa cum este descris mai sus) şi mai preferabil de la un anticorp uman convenţional cu 4 lanţuri; în mod specific, polipeptida invenţiei poate fi legată de o regiune Fc, de ex. de la IgG umană, de la IgE umană sau de la o altă Ig umană. De exemplu, în WO 94/04678 se descriu anticorpi cu lanţuri grele care cuprind un domeniu VHH de camelide sau un derivat umanizat al acestuia, în care domeniul CH2 şi/sau CH3 de camelide au fost înlocuite cu domeniile CH2 şi/sau CH3 umane, astfel încât să frunizeze o imunoglobulină care constă din 2 lanţuri grele fiecare cuprinzând un domeniu VHH - umanizat opţional - şi domenii umane CH2 şi CH3 (dar niciun domeniu CH1), imunoglobulina respectivă având funcţia efectoare asigurată de domeniile CH2 şi CH3, poate funcţiona fără prezenţa lanţurilor uşoare, şi are un timp de înjumătăţire sporit în comparaţie cu domeniile VHH corespunzătoare fără o astfel de modificare.
Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde două VHH-uri anti-CX3CR1 şi un VHH capabil de legare a albumineia serice. Într-un aspect, VHH-urile sunt unite cu ajutorul peptidelor linker. Exemple reprezentative de asemenea polipeptide din prezenta invenţie sunt prezentate mai jos.
Într-un aspect, o polipeptidă din prezenta invenţie cuprinde un prim VHH anti-CX3CR1 unit la o primă peptidă linker, care însăşi este unită la un VHH capabil să se lege de albumina serică, care însăşi este unită la o a doua peptidă linker, care însăşi este unită la un al doilea VHH anti-CX3CR1. Într-un aspect, prima sau a doua peptidă linker este un linker 9GS, într-un aspect, prima şi a doua peptidă linker este un linker 9GS. Într-un aspect, VHH-ul capabil să se lege de albumina serică este capabil să se lege de albumina serică umană. Într-un aspect, VHH-ul capabil să se lege de albumina serică are secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID Nr.: 231. Într-un aspect, primul şi al doilea VHH anti-CX3CR1 au aceeaşi secvenţă de aminoacizi. Într-un aspect, primul sau al doilea VHH anti-CX3CR1 are CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentate în:
- SECV ID Nr.: 213, 214 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 221 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Într-un aspect, primul şi al doilea VHH anti-CX3CR1 au CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentate în:
- SECV ID Nr.: 213, 214 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 221 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Într-un aspect, primul sau al doilea VHH anti-CX3CR1 are secvenţa de aminoacizi prezentată în oricare dintre SECV ID Nr.: 138 - 140 sau SECV ID Nr.: 222 - 224. Într-un aspect, primul şi al doilea VHH anti-CX3CR1 au aceeaşi secvenţă de aminoacizi, unde secvenţa de aminoacizi respectivă este secvenţa prezentată în oricare dintre SECV ID Nr.: 138 - 140 sau SECV ID Nr.: 222 - 224.
Exemple nelimitative de polipeptide ale prezentei invenţii sunt polipeptide ale oricăror dintre SECV ID Nr.: 225 - 227, 249 sau 277 - 281.
Tabel 9
CX3CR1BII00312 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 225 CX3CR1BII00313 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 226 CX3CR1BII00314 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 227 CX3CR1BII032 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 277 CX3CR1BII034 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 278 CX3CR1BII036 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 249 CX3CR1BII040 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 279 CX3CR1BII041 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 280 CX3CR1BII042 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSS SECV ID Nr.: 281
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii cuprinde un VHH anti-CX3CR1 şi un domeniu Fc. Într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii cuprinde un VHH anti-CX3CR1 unit la o peptidă linker, care însăşi este unită la un domeniu Fc. Într-un aspect, peptida linker este un linker 15GS Într-un aspect, domeniul Fc are secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID Nr.: 250 sau 252. Într-un aspect, VHH-ul are CDR1, CDR2 şi CDR3 prezentate în:
- SECV ID Nr.: 213, 214 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 213, 221 şi 186; sau
- SECV ID Nr.: 141, 162 şi 186.
Într-un aspect, VHH-ul are secvenţa de aminoacizi prezentată în oricare dintre SECV ID Nr.: 138 - 140 sau SECV ID Nr.: 222 - 224. Într-un aspect, polipeptida este sub formă de dimer, de exemplu, unde dimerul este format de una sau mai multe punţi disulfurice.
Exemple nelimitative de polipeptide ale prezentei invenţii sunt polipeptide ale SECV ID Nr.: 251, 253 sau 254.
Tabel 10
Domeniul Fc de şoarece PPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SECV ID Nr.: 250 66B02-mFc EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SECV ID Nr.: 251 Domeniul Fc uman CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SECV ID Nr.: 252 306D-hFc DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SECV ID Nr.: 253 307D-hFc DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SECV ID Nr.: 254
O polipeptidă a invenţiei poate fi modificată pentru a îmbunătăţi proprietăţile sale. Într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii poate fi modificată pentru a spori stabilitatea sa în tipul păstrării. Într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii poate fi modificată pentru a facilita expresia sa într-un anumit sistem gazdă. De exemplu, primul codon al unei polipeptide a prezentei invenţii poate fi modificat. Într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii începe cu un acid glutamic (glu) ca primul său aminoacid. Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii începe cu un acid aspartic (asp) ca primul său aminoacid, de exemplu, pentru a reduce formarea piroglutamatului la capătul N-terminal în timpul păstrării şi, prin urmare, pentru a spori stabilitatea produsului. Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii începe cu o alanină (ala) sau o valină (val) ca primul său aminoacid, de exemplu pentru a facilita expresia polipeptidei într-un sistem de expresie procariot, cum ar fi Escherichia coli. Astfel de modificări a unei polipeptide conform prezentei invenţii sunt efectuate cu ajutorul tehnicilor cunoscute în domeniu.
Exemple reprezentative de polipeptide conform prezentei invenţii cu un prim codon modificat sunt prezentate în oricare dintre SECV ID Nr.: 257-262 şi 263-266 şi sunt prezentate în tab. 11 şi 12 de mai jos.
Tabel 11
CX3CR1BII00312 (D1A) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 257 CX3CR1BII00313 (D1A) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 258 CX3CR1BII00314 (D1A) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 259 CX3CR1BII00312 (D1V) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 260 CX3CR1BII00313 (D1V) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 261 CX3CR1BII00314 (D1V) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSS SECV ID Nr.: 262
Tabel 12
306D-hFc (D1A) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SECV ID Nr.: 263 307D-hFc (D1A) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SECV ID Nr.: 264 306D-hFc (D1V) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SECV ID Nr.: 265 307D-hFc (D1V) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SECV ID Nr.: 266
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii este caracterizată prin una sau mai multe dintre următoarele proprietăţi:
- de a se lega cu afinitate mare de CX3CR1 umană;
- de a inhiba legarea fractalkinei solubile de CX3CR1 umană;
- de a inhiba chemotaxia indusă de fractalkină;
- de a inhiba internalizarea receptorului CX3CR1 umane indusă de fractalkină;
- de a reacţiona încrucişat cu CX3CR1 cino în mărime de 10 ori a CE/C50 pentru CX3CR1 umană pentru legarea şi inhibarea funcţională.
Corespunzător, într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii are afinitate cu CX3CR1 umană la o valoare CI50 mai mică sau egală cu 10nM, sau mai mică sau egală cu 5nM, sau mai mică sau egală cu 2,5nM sau mai mică sau egală cu 1nM, precum este determinat prin analiza FACS de concurenţă.
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii are afinitate cu CX3CR1 umană la o valoare CI50 mai mică sau egală cu 10 nM, sau mai mică sau egală cu 5 nM, sau mai mică sau egală cu 2,5 nM sau mai mică sau egală cu 1 nM, precum este determinat prin analiza FACS a legăturii celulare.
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii blochează legarea CX3CR1 umane de fractalkina umană la sau mai sus de 50%, sau la sau mai sus de 60%, sau la sau mai sus de 70%, sau la sau mai sus de 80%, sau la sau mai sus de 90%, sau la sau mai sus de 95%, precum este determinat prin analiza FACS de concurenţă cu fractalkina umană.
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii blochează legarea fractalkinei umane de CX3CR1 umană la o valoare CI50 mai mică sau egală cu 300 nM, sau mai mică sau egală cu 100 nM, sau mai mică sau egală cu 20 nM, sau mai mică sau egală cu 10 nM, mai mică sau egală cu 5 nM, mai mică sau egală cu 2,5 nM sau mai mică sau egală cu 1 nM, precum este determinat prin analiza FACS de concurenţă cu fractalkina umană.
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii inhibă chemotaxia indusă de fractalkină mediată prin CX3CR1 umană la sau mai sus de 10%, sau la sau mai sus de 30%, sau la sau mai sus de 40%, sau la sau mai sus de 50%, sau la sau mai sus de 60%, sau la sau mai sus de 70%, sau la sau mai sus de 80%, sau la sau mai sus de 90%.
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii inhibă chemotaxia indusă de fractalkină mediată de CX3CR1 umană la o valoare CI50 mai mică sau egală cu 500 nM, sau mai mică sau egală cu 100 nM, sau mai mică sau egală cu 75 nM, sau mai mică sau egală cu 50 nM, sau mai mică sau egală cu 10 nM sau mai mică sau egală cu 5 nM.
Într-un alt aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii inhibă internalizarea receptorului CX3CR1 umană indusă de fractalkină la o valoare de CI50 mai mică sau egală cu 10 nM, sau mai mică sau egală cu 5 nM sau mai mică sau egală cu 1 nM.
Conform unei alte variante de executare, o modificare de extindere a timpului de înjumătăţire a unei polipeptide a invenţiei (o astfel de modificare reducând, de asemenea, imunogenitatea polipeptidei) cuprinde ataşarea unui polimer adecvat acceptabil farmacologic, cum ar fi poli(etilenglicol) (PEG) cu lanţuri liniare sau ramificate sau derivaţi ai acestora (cum ar fi metoxipoli(etilenglicol) sau mPEG). În general, poate fi utilizată orice formă adecvată de Polietilenglicare, cum ar fi Polietilenglicarea utilizată în domeniu pentru anticorpi şi fragmente de anticorpi (inclusiv, dar fără a se limita la anticorpi domeniu şi scFv-uri); se face referinţă, de exemplu, la: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 2002, p. 531-545; Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 2003, p. 453-456; Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2, 2003; WO 04/060965 (A2) 2004.07.22; şi US6,875,841 (A1) 2003.04.03.
Diverşi reactivi pentru Polietilenglicarea polipeptidelor sunt, de asemenea, disponibili pe piaţă, de exemplu de la compania Nektar Therapeutics, SUA sau NOF Corporation, Japonia, cum ar fi Sunbright® EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, şi ME Series, cum ar fi Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200mA, şi Sunbright® ME-400MA.
De preferinţă, se utilizează polietilenglicarea situs-direcţionată, în special prin intermediul unui reziduu de cisteină (a se vedea, de exemplu, Yang et al., Protein Engineering 16, 2003, p. 761-770 ). De exemplu, în acest scop, PEG poate fi ataşat la un reziduu de cisteină care apare în mod natural într-o polipeptidă a invenţiei, o polipeptidă a invenţiei poate fi modificată pentru a introduce în mod adecvat unul sau mai multe reziduuri de cisteină pentru ataşarea PEG, sau o secvenţă de aminoacizi cuprinzând unul sau mai multe reziduuri de cisteină pentru ataşarea PEG poate fi unită de capătul N- şi/sau C-terminal şi/sau PEG poate fi ataşat la o regiune linker care uneşte două sau mai multe domenii funcţionale ale unei polipeptide a invenţiei, toate cu ajutorul tehnicilor de inginerie proteică cunoscute în sine unui specialist în domeniu.
De preferinţă, pentru polipeptidele invenţiei, un PEG este utilizat cu o greutate moleculară mai mare de 5 kDa, cum ar fi mai mare de 10 kDa şi mai mică de 200 kDa, cum ar fi mai mică de 100 kDa; de exemplu, în intervalul 20 kDa şi 80 kDa.
În ceea ce priveşte polietilenglicarea, e necesar de remarcat faptul că, în general, invenţia cuprinde, de asemenea, orice polipeptidă a invenţiei care a fost polietilenglicată la una sau mai multe poziţii de aminoacizi, de preferinţă, astfel încât Polietilenglicarea respectivă fie că (1) sporeşte timpul de înjumătăţire in vivo; (2) reduce imunogenitatea; (3) oferă una sau mai multe proprietăţi suplimentare benefice cunoscute în sine pentru Polietilenglicare; (4) nu afectează esenţial afinitatea polipeptidei pentru CX3CR1 (de ex., nu reduce afinitatea respectivă cu peste 50%, şi, mai preferabil, nu reduce cu peste 10%, după cum s-a determinat printr-un test adecvat, cum ar fi cele descrise în Exemplele de mai jos); şi/sau (4) nu afectează oricare dintre celelalte proprietăţi dorite ale polipeptidelor invenţiei. Grupurile PEG adecvate şi metodele de ataşare a acestora, fie în mod specific sau nespecific, vor fi clare specialistului.
Conform unei variante de executare a invenţiei îndeosebi preferate, o polipeptidă polietilenglicată a invenţiei include o fracţiune PEG cu PEG liniar având o greutate moleculară de 40 kDa sau 60 kDa, unde fracţiunea PEG este ataşată la polipeptidă într-o regiune linker şi, în mod specific, la un reziduu Cys, de exemplu, la poziţia 5 a unei peptide GS8-linker după cum este prezentat în SECV ID Nr.: 235.
Exemple preferate de polipeptide polietilenglicate ale invenţiei sunt polietilenglicate preferabil cu unul dintre reactivii PEG sus-menţionaţi, cum ar fi "Sunbright® ME-400mA", după cum se arată în următoarea formulă chimică:
care are o greutate moleculară medie de 40 kDa.
Utilizări terapeutice
Într-un aspect, prezenta invenţie furnizează o polipeptidă a prezentei invenţii sau o compoziţie farmaceutică care conţine polipeptida respectivă pentru utilizarea în calitate de medicament.
Într-un aspect, prezenta invenţie prevede utilizarea unei polipeptide a prezentei invenţii sau a unei compoziţii farmaceutice care conţine polipeptida respectivă pentru tratamentul sau profilaxia afecţiunilor cardio şi cerebrovasculare aterosclerotice, bolii arteriale periferice, restenozei, nefropatiei diabetice, glomerulonefritei, glomerulonefritei crescentice umane, nefropatiei IgA, nefropatiei membranoase, nefritei lupice, vasculitei ce include purpura Henoch-Schonlein şi granulomatoza Wegener, artritei reumatoide, osteoartritei, rejetului alogrefei, sclerozei sistemice, afecţiunilor neurodegenerative şi bolii demielinizante, sclerozei multiple (SM), bolii Alzheimer, bolilor pulmonare, cum ar fi BPOC, astmului, durerii neuropatice, durerii inflamatorii, sau cancerului. Într-un alt aspect, prezenta invenţie prevede utilizarea unei polipeptide a prezentei invenţii sau a unei compoziţii farmaceutice care conţine polipeptida respectivă pentru tratamentul sau profilaxia aterosclerozei.
Într-un alt aspect, prezenta invenţie prevede utilizarea unei polipeptide a prezentei invenţii sau a unei compoziţii farmaceutice care conţine polipeptida respectivă pentru tratamentul sau profilaxia aterosclerozei prin prevenirea şi/sau reducerea formării noilor leziuni sau plăci aterosclerotice şi/sau prin prevenirea sau încetinirea progresiei leziunilor şi plăcilor existente.
Într-un alt aspect, prezenta invenţie prevede utilizarea unei polipeptide a prezentei invenţii sau a unei compoziţii farmaceutice care conţine polipeptida respectivă pentru tratamentul sau profilaxia aterosclerozei prin modificarea compoziţiei plăcilor pentru a reduce riscul rupturii plăcilor şi accidentelor aterotrombotice.
Într-un aspect, prezenta invenţie prevede, de asemenea, un procedeu de tratare, sau reducere a riscului, a afecţiunilor cardio- şi cerebrovasculare aterosclerotice, bolii arteriale periferice, restenozei, nefropatiei diabetice, glomerulonefritei, glomerulonefritei crescentice umane, nefropatiei IgA, nefropatiei membranoase, nefritei lupice, vasculitei ce include purpura Henoch-Schonlein şi granulomatoza Wegener, artritei reumatoide, osteoartritei, rejetului alogrefei, sclerozei sistemice, afecţiunilor neurodegenerative şi bolii demielinizante, sclerozei multiple (SM), bolii Alzheimer, bolilor pulmonare, cum ar fi BPOC, astmului, durerii neuropatice, durerii inflamatorii, sau cancerului, la o persoană care suferă sau prezintă risc de boala sau starea menţionată, caracterizat prin acea că procedeul cuprinde administrarea persoanei respective a unei cantităţi eficiente terapeutic de o polipeptidă conform prezentei invenţii sau o compoziţie farmaceutică care conţine polipeptida respectivă.
Într-un aspect, prezenta invenţie prevede, de asemenea, un procedeu de tratare sau reducere a riscului de ateroscleroză la o persoană care suferă sau prezintă risc de boala sau starea menţionată, caracterizat prin acea că procedeul cuprinde administrarea persoanei respective a unei cantităţi eficiente terapeutic de polipeptidă conform prezentei invenţii sau o compoziţie farmaceutică care conţine polipeptida respectivă.
Într-un aspect, prezenta invenţie prevede, de asemenea, un procedeu de tratare sau reducere a riscului de ateroscleroză prin prevenirea şi/sau reducerea formării noilor leziuni sau plăci aterosclerotice şi/sau prin prevenirea sau încetinirea progresiei leziunilor şi plăcilor existente la o persoană care suferă sau prezintă risc de boala sau starea menţionată, caracterizat prin acea că procedeul cuprinde administrarea persoanei respective a unei cantităţi eficiente terapeutic de polipeptidă a prezentei invenţii sau o compoziţie farmaceutică care conţine polipeptida respectivă. Într-un aspect, prezenta invenţie prevede, de asemenea, un procedeu de tratare sau reducere a riscului de ateroscleroză prin modificarea compoziţiei plăcilor pentru a reduce riscul rupturii plăcilor şi accidentelor aterotrombotice la o persoană care suferă sau prezintă risc de boala sau starea menţionată, caracterizat prin acea că procedeul cuprinde administrarea persoanei respective a unei cantităţi eficiente terapeutic de polipeptidă a prezentei invenţii sau o compoziţie farmaceutică care conţine polipeptida respectivă.
Într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii este indicată pentru utilizarea în tratamentul sau profilaxia unei boli sau afecţiuni care este asociată cu CX3CR1.
Într-un aspect, o polipeptidă a prezentei invenţii este indicată pentru utilizarea în tratamentul sau profilaxia bolilor sau stărilor în care este dezirabilă modularea activităţii la receptorul CX3CR1. Într-un aspect, prezenta invenţie prevede, de asemenea, un procedeu de tratare, sau reducere a riscului, a bolilor sau stărilor, în care antagonismul receptorului CX3CR1 este benefic, care cuprinde administrarea unei persoane care suferă sau prezintă risc de boala sau starea menţionată, a unei polipeptide a prezentei invenţii.
Se preconizează ca profilaxia să fie îndeosebi relevantă pentru tratamentul persoanelor care au suferit o criză anterioară, sau sunt în alt mod considerate a fi supuse unui risc sporit de boala sau starea în cauză. Persoanele cu risc de dezvoltare a unei anumite boli sau stări includ, în general, cele care au un istoric familial al bolii sau stării, sau cele care au fost identificate prin testare sau examinare genetică a fi deosebit de susceptibile să dezvolte boala sau starea.
În contextul prezentei invenţii, termenul "prevenirea, tratamentul şi/sau atenuarea" nu cuprinde doar prevenirea şi/sau tratarea şi/sau atenuarea bolii, ci, de asemenea, cuprinde, în general, prevenirea apariţiei bolii, încetinirea sau inversarea progresului bolii, prevenirea sau încetinirea apariţiei unuia sau mai multor simptome asociate cu boala, reducerea şi/sau atenuarea unuia sau mai multor simptome asociate cu boala, reducerea severităţii şi/sau duratei bolii şi/sau a oricăror simptome asociate cu aceasta şi/sau prevenirea sporirii suplimentare a severităţii bolii şi/sau a oricăror simptome asociate cu aceasta, prevenirea, reducerea sau inversarea oricăror daune fiziologice cauzate de boală, şi, în general, orice acţiune farmacologică, care este benefică pentru pacientul tratat.
Subiectul care urmează a fi tratat va fi un mamifer, şi mai în special, o fiinţă umană. După cum va fi clar specialistului, subiectul care urmează a fi tratat va fi, în special, o persoană care suferă sau este supusă riscului bolilor, afecţiunilor sau stărilor menţionate în prezenta.
De asemenea, va fi clar specialistului că procedeele sus-menţionate de tratament a unei boli includ prepararea unui medicament pentru tratamentul bolii respective. Mai mult decât atât, este clar că polipeptidele invenţiei pot fi utilizate în calitate de ingredient activ într-un medicament sau compoziţie farmaceutică destinată tratamentului bolilor sus-menţionate. Astfel, invenţia se referă, de asemenea, la utilizarea unei polipeptide a invenţiei în prepararea unei compoziţii farmaceutice pentru prevenirea, tratamentul şi/sau atenuarea oricărora dintre bolile, afecţiunile sau stările sus-menţionate. Invenţia se referă în continuare la o polipeptidă a invenţiei pentru utilizarea terapeutică sau profilactică şi, în mod special, pentru prevenirea, tratamentul şi/sau atenuarea oricărora dintre bolile, afecţiunile sau stările sus-menţionate. Invenţia se referă în continuare la o compoziţie farmaceutică pentru prevenirea, tratamentul şi/sau atenuarea bolilor, afecţiunilor sau stărilor sus-menţionate, caracterizată prin aceea că o astfel de compoziţie conţine, cel puţin, o polipeptidă a invenţiei.
Polipeptidele invenţiei şi/sau compoziţiile care le conţin pot fi administrate unui pacient care necesită aceasta, în orice mod adecvat, în funcţie de formula farmaceutică specifică sau compoziţia care urmează a fi utilizată. Astfel, polipeptidele invenţiei şi/sau compoziţiile care le conţin pot fi, de exemplu, administrate intravenos, subcutanat, intramuscular, intraperitoneal, transdermic, oral, sublingual (de ex., sub formă de comprimate sublinguale, spray-uri sau picături sub limbă şi adsorbite prin membranele mucoase în reţeaua capilară sub limbă), (intra)nazal (de ex., sub formă de spray nazal şi/sau sub formă de aerosol), local, prin intermediul unui supozitor, prin inhalare, intravitros (în special, pentru tratamentul AMD uscate sau glaucomului), sau în orice alt mod adecvat într-o cantitate sau doză eficientă.
Polipeptidele invenţiei şi/sau compoziţiile care le conţin sunt administrate conform unei scheme de tratament, care este adecvat pentru prevenirea, tratamentul şi/sau atenuarea bolii, afecţiunii sau stării care trebuie prevenită, tratată sau atenuată. Clinicianul va fi, în general, capabil să stabilească o schemă de tratament adecvată, în funcţie de factori cum sunt boala, afecţiunea sau starea care trebuie prevenită, tratată sau atenuată, severitatea bolii, severitatea simptomelor acesteia, polipeptida specifică a invenţiei care urmează să fie utilizată, calea specifică de administrare şi formula sau compoziţia farmaceutică care urmează să fie utilizată, vârsta, sexul, greutatea, dieta, starea generală a pacientului, şi factori similari bine cunoscuţi de către clinician. În general, schema de tratament va cuprinde administrarea uneia sau mai multor polipeptide a invenţiei, sau a uneia sau mai multor compoziţii care le conţin, în cantităţi sau doze eficiente terapeutic şi/sau profilactic.
În general, pentru prevenirea, tratamentul şi/sau atenuarea bolilor, afecţiunilor şi stărilor menţionate în prezenta şi în funcţie de boala, afecţiunea sau starea specifică care trebuie tratată, eficacitatea polipeptidei specifice a invenţiei care urmează a fi utilizată, calea specifică de administrare şi formula sau compoziţia farmaceutică specifică folosită, polipeptidele invenţiei vor fi administrate, în general, într-o cantitate cuprinsă între 0,005 şi 20,0 mg per kilogram de greutate corporală şi doză, de preferinţă, între 0,05 şi 10,0 mg/kg/doză, şi mai preferabil între 0,5 şi 10 mg/kg/doză, fie continuu (de ex., prin infuzie) sau ca doze unice (cum ar fi de ex., doze zilnice, săptămânale, sau lunare; a se vedea mai jos), dar pot varia în mod semnificativ, în special, în funcţie de parametrii sus-menţionaţi.
În scopuri profilactice, compoziţiile care conţin polipeptidele invenţiei pot fi administrate, de asemenea, în doze similare sau puţin mai mici. Doza poate fi, de asemenea, ajustată de către medicul individual în caz de complicaţie.
În funcţie de polipeptida specifică a invenţiei şi proprietăţile sale specifice farmacocinetice şi altele, aceasta poate fi administrată zilnic, o dată la două, trei, patru, cinci sau şase zile, săptămânal, lunar, şi în mod asemănător. O schemă de administrare poate include tratament de lungă durată, săptămânal. Prin tratament "de lungă durată" se înţelege cel puţin două săptămâni şi preferabil luni sau ani.
Eficacitatea polipeptidelor invenţiei, şi a compoziţiilor care le conţin, poate fi testată cu ajutorul oricărui test adecvat in vitro, test pe bază de celule, test in vivo şi/sau model de animale cunoscut în sine, sau orice combinaţie a acestora, în funcţie de boala specifică. Testele adecvate şi modelele de animale vor fi clare specialistului, şi, de ex., includ testele şi modelele de animale utilizate în exemplele de mai jos.
În scopuri farmaceutice, polipeptidele invenţiei pot fi preparate ca un preparat farmaceutic care conţine (i), cel puţin, o polipeptidă a invenţiei şi (ii), cel puţin, un purtător, diluant, excipient, adjuvant, şi/sau stabilizator acceptabil farmaceutic, şi (iii), opţional, una sau mai multe polipeptide şi/sau compuşi farmaceutic activi. Prin "acceptabil farmaceutic" se înţelege că materialul respectiv nu prezintă efecte biologice nedorite sau de alt gen, când se administrează unui individ şi nu interacţionează în mod nociv cu oricare dintre celelalte componente ale compoziţiei farmaceutice (cum ar fi, de ex., ingredientul farmaceutic activ), în care se conţine. Exemple specifice pot fi găsite în manuale obişnuite, cum ar fi de ex. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA, 1990. De exemplu, polipeptidele invenţiei pot fi preparate şi administrate în orice mod bine cunoscut pentru anticorpii convenţionali şi fragmentele de anticorpi şi alte proteine farmaceutic active. Astfel, conform unei alte variante de executare, invenţia se referă la o compoziţie sau preparat farmaceutic care conţine, cel puţin, o polipeptidă a invenţiei şi, cel puţin, un purtător, diluant, excipient, adjuvant şi/sau stabilizator acceptabil farmaceutic, şi, opţional, una sau mai multe substanţe farmaceutic active.
Prin intermediul exemplelor nelimitative, un astfel de preparat poate fi într-o formă adecvată pentru administrarea orală, pentru administrarea parenterală (cum ar fi prin injectare intravenoasă, intramusculară, subcutanată, intratecală, intracavernoasă sau intraperitoneală sau infuzie intravenoasă), pentru administrarea locală, administrarea sublinguală, administrarea prin inhalare, printr-un plasture cutanat, printr-un implant, printr-un supozitor, pentru administrarea transdermică, nazală, intravitroasă, rectală sau vaginală, şi altele. Astfel de forme de administrare adecvate - care pot fi solide semi-solide sau lichide, în funcţie de modul de administrare - precum şi metode şi purtători pentru utilizarea în prepararea acestora, vor fi clare specialistului.
Preparatele farmaceutice pentru administrarea parenterală, cum ar fi injectarea intravenoasă, intramusculară, subcutanată sau infuzia intravenoasă pot fi, de exemplu, soluţii sterile, suspensii, dispersii, emulsii sau pulberi care conţin ingredientul activ şi care sunt adecvate, opţional, după o dizolvare ulterioară sau etapă de diluare, pentru infuzie sau injectare. Purtători sau diluanţi adecvaţi pentru astfel de preparate includ, de exemplu, fără limitare, apa sterilă şi soluţiile-tampon apoase şi soluţiile acceptabile farmaceutic, cum ar fi soluţia salină fiziologică tamponată cu fosfat, soluţiile Ringer, soluţia de dextroză şi soluţia Hank; uleiurile apoase; glicerolul; etanolul; glicolii cum ar fi propilenglicolul, precum şi uleiurile minerale, uleiurile de origine animală şi vegetală, de exemplu uleiul de arahide, uleiul de soia, precum şi amestecurile adecvate ale acestora.
Soluţiile de compus activ sau sărurile sale pot conţine, de asemenea, un conservant pentru a preveni dezvoltarea microorganismelor, cum ar fi agenţi antibacterieni şi antifungici, de exemplu, parabeni, clorbutanol, fenol, acid sorbic, timerosal (tiomersal), şi alţii. În multe cazuri, va fi preferabilă includerea agenţilor izotonici, de exemplu, a zahărurilor, soluţiilor-tampon sau clorurii de sodiu. Fluiditatea potrivită poate fi menţinută, de exemplu, prin formarea lipozomilor, prin menţinerea dimensiunii necesare a particulelor în cazul dispersiilor sau prin utilizarea agenţilor tensioactivi. De asemenea, pot fi adăugaţi alţi agenţi care întârzie absorbţia, de exemplu, monostearatul de aluminiu şi gelatina.
În toate cazurile, forma de dozare finală trebuie să fie sterilă, fluidă şi stabilă în condiţiile de fabricare şi păstrare. Soluţiile injectabile sterile sunt preparate prin încorporarea compusului activ în cantitatea necesară în solventul adecvat cu diverşi alţi ingredienţi enumeraţi mai sus, după necesitate, urmată de sterilizarea prin filtrare. În cazul pulberilor sterili pentru prepararea soluţiilor injectabile sterile, metodele preferate de preparare sunt tehnicile de uscare sub vid şi de liofilizare, care oferă o pulbere de ingredient activ plus orice ingredient suplimentar dorit prezent în soluţiile filtrate steril anterior.
De obicei, se va prefera soluţiile sau suspensiile apoase. În general, formule adecvate de proteine terapeutice, cum ar fi polipeptidele invenţiei sunt soluţii proteice tamponate, cum ar fi soluţii ce includ proteina într-o concentraţie adecvată (cum ar fi de la 0,001 până la 400 mg/ml, preferabil, de la 0,005 până la 200 mg/ml, mai preferabil 0,01 - 200 mg/ml, mai preferabil 1,0 - 100 mg/ml, cum ar fi 1,0 mg/ml (administrarea intraventriculară - i.v.) sau 100 mg/ml (administrarea subcutanată - s.c.) şi o soluţie-tampon apoasă, cum ar fi:
- soluţie salină tamponată cu fosfat, pH 7,4,
- alte soluţii-tampon fosfate, pH 6,2 - 8,2,
- soluţii-tampon de histidină, pH 5,5 - 7,0,
- soluţii-tampon de succinat, pH 3,2 - 6,6, şi
- soluţii-tampon de citrat, pH 2,1 - 6,2,
şi, opţional, săruri (de ex. NaCI) şi/sau zaharuri sau polialcooli (cum ar fi trehaloză, manitol, sau glicerol) pentru asigurarea izotonicităţii soluţiei.
Soluţii proteice tamponate preferate sunt soluţiile ce includ circa 0,05 mg/ml de polipeptidă a invenţiei dizolvate în 25 mM de soluţie-tampon fosfat, pH 6,5, ajustat până la izotonicitate prin adăugarea a 220 mM de trehaloză. În plus, alţi agenţi, cum ar fi un detergent, de ex., Tween-20 sau Tween-80 0,02%, pot fi incluşi în astfel de soluţii. Preparatele pentru aplicarea subcutanată pot include concentraţii semnificativ mai mari de polipeptidă a invenţiei, cum ar fi de până la 100 mg/ml sau chiar mai mari de 100 mg/ml. Totuşi, va fi clar specialistului în domeniu că ingredientele şi cantităţile acestora sus-indicate reprezintă doar o opţiune preferată. Alternative şi variaţii ale acestora vor fi evidente imediat specialistului, sau pot fi uşor elaborate pornind de la dezvăluirea de mai sus.
Polipeptidele invenţiei pot fi administrate, de asemenea, cu ajutorul preparatelor adecvate cu eliberare treptată, cu eliberare lentă sau cu eliberare susţinută, de ex., adecvate pentru injectare, folosind dispozitive pentru eliberarea controlată pentru implantarea sub piele, şi/sau cu ajutorul unei pompe de dozare sau altor dispozitive bine cunoscute pentru administrarea substanţelor sau principiilor farmaceutic active. În plus, polipeptidele invenţiei pot fi preparate sub formă de gel, cremă, spray, picături, plasture sau peliculă care, în cazul plasării pe piele, trece prin piele.
De asemenea, în comparaţie cu anticorpii convenţionali sau fragmentele de anticorpi, un avantaj major al utilizării polipeptidelor invenţiei este faptul că acestea pot fi, de asemenea, administrate uşor prin diverse căi, cu excepţia administrării parenterale şi pot fi uşor preparate pentru o astfel de administrare. De exemplu, după cum este descris în cererea internaţională WO2004/041867 (A2) 2004.05.21, astfel de polipeptide pot fi preparate pentru administrarea orală, intranazală, intrapulmonară şi transdermică.
Conform unei alte variante de executare a invenţiei se prevede o combinaţie farmaceutică care conţine, cel puţin, o polipeptidă a invenţiei după cum se descrie în prezenta şi, cel puţin, un alt agent terapeutic selectat din grupul ce constă din statine, antiagregante plachetare, anticoagulante, antidiabetice şi antihipertensive.
O asemenea combinaţie farmaceutică poate să conţină opţional, suplimentar, un diluant, excipient, adjuvant şi/sau stabilizator.
Când două sau mai multe substanţe sau principii trebuie să fie utilizate ca parte a unei scheme de tratament combinată, ele pot fi administrate prin aceeaşi cale de administrare sau prin căi diferite de administrare, esenţial în acelaşi timp sau în perioade de timp diferite (de ex., în mod esenţial simultan, consecutiv, sau conform unei scheme alternative). Atunci când substanţele sau principiile trebuie să fie administrate simultan prin aceeaşi cale de administrare, acestea pot fi administrate ca preparate sau compoziţii farmaceutice diferite sau ca parte a unui preparat sau unei compoziţii farmaceutice combinate. De asemenea, atunci când două sau mai multe substanţe sau principii active trebuie să fie utilizate ca parte a unei scheme de tratament combinate, fiecare dintre substanţe sau principii pot fi administrate în aceeaşi cantitate şi conform aceleiaşi scheme după cum este utilizat atunci când compusul sau principiul este utilizat de sine stătător, şi o astfel de utilizare combinată poate sau nu poate să conducă la un efect sinergetic. Cu toate acestea, atunci când utilizarea combinată a celor două sau mai multor substanţe sau principii active conduce la un efect sinergetic, poate fi posibil, de asemenea, de a reduce cantitatea unuia, mai multor sau a tuturor substanţelor sau principiilor care trebuie administrate, în timp ce se atinge totuşi acţiunea terapeutică dorită. Aceasta poate fi, de exemplu, util pentru evitarea, limitarea sau reducerea oricăror efecte secundare nedorite, care sunt asociate cu utilizarea uneia sau mai multor dintre substanţe sau principii, atunci când sunt utilizate în cantităţile lor obişnuite, în timp ce se obţine totuşi efectul farmaceutic sau terapeutic dorit.
Totuşi, o altă variantă de executare a invenţiei reprezintă un procedeu pentru tratarea bolilor şi afecţiunilor după cum s-a menţionat mai sus, care cuprinde administrarea unui individ, simultan, separat sau succesiv, a unei cantităţi eficiente de, cel puţin, o polipeptidă a invenţiei şi, cel puţin, un agent selectat din grupul ce constă dintr-o statină, un antiagregant plachetar, un anticoagulant, un antidiabetic şi un antihipertensiv.
Conform unui alt aspect al invenţiei, polipeptida invenţiei este preparată pentru a fi administrată în combinaţie cu alte medicamente utilizate pentru tratamentul bolilor şi afecţiunilor sus-menţionate, astfel de medicamente fiind selectate din grupul ce constă dintr-o statină, un antiagregant plachetar, un anticoagulant, un antidiabetic şi un antihipertensiv.
Conform unui alt aspect al invenţiei, medicamentele utilizate pentru tratamentul bolilor şi a afecţiunilor sus-menţionate, astfel de medicamente fiind selectate din grupul ce constă dintr-o statină, un antiagregant plachetar, un anticoagulant, un antidiabetic şi un antihipertensiv sunt preparate pentru a fi administrate în combinaţie cu polipeptida invenţiei.
Conform unui alt aspect al invenţiei, polipeptida invenţiei este utilizată în combinaţie cu un dispozitiv util pentru administrarea polipeptidei, cum ar fi o seringă, un stilou injector, sau un alt dispozitiv.
Conform unei alte variante de executare a invenţiei, se prevede un procedeu de diagnosticare a unei boli, afecţiuni sau stări mediate de disfuncţia CX3CR1 care cuprinde etapele de:
a) obţinere a unei probe de la un subiect, şi
b) tratare, in vitro, a probei cu o polipeptidă a invenţiei precum este definit mai sus, şi
c) detectare a legării polipeptidei respective de proba menţionată, şi
d) comparare a legării detectate în etapa (c) cu un standard, unde o diferenţă în legare în raport cu proba respectivă reprezintă diagnosticul unei boli, afecţiuni sau stări caracterizate de disfuncţia CX3CR1.
Conform unei alte variante de executare a invenţiei, se prevede un procedeu de diagnosticare a unei boli, afecţiuni sau stări mediate de disfuncţia CX3CR1 care cuprinde etapele de:
a) obţinere a unei probe de la un subiect, şi
b) tratare a probei cu o polipeptidă a invenţiei precum este definit mai sus;
c) determinare a cantităţii de CX3CR1 în probă; şi
d) comparare a cantităţii determinate în etapa (c) cu un standard, unde o diferenţă în cantitate în raport cu proba respectivă reprezintă diagnosticul unei boli, afecţiuni sau stări caracterizate de disfuncţia CX3CR1.
Procedeele de diagnosticare sus-menţionate pot fi utilizate, de asemenea, pentru monitorizarea eficacităţii tratamentului terapeutic al unui subiect.
Conform unei alte variante de executare a invenţiei, se prevede un kit pentru diagnosticarea unei boli, afecţiuni sau stări mediate de disfuncţia CX3CR1, pentru utilizarea într-un procedeu precum este definit mai sus, un astfel de kit cuprinzând, cel puţin, o polipeptidă a invenţiei şi, opţional, una sau mai multe mijloace, mijloace de detectare şi/sau agenţi de imagistică in vitro sau in vivo, şi, în plus, opţional, instrucţiuni de utilizare. Agenţi de imagistică adecvaţi in vivo includ 99 mTc, 111lndium, 123Iodine, şi, pentru imagistica prin rezonanţă magnetică, compuşi paramagnetici.
Invenţia furnizează în plus un kit care conţine, cel puţin, o polipeptidă a invenţiei şi, suplimentar, una sau mai multe alte componente selectate din grupul ce constă din alte medicamente utilizate pentru tratamentul bolilor şi afecţiunilor descrise mai sus, şi dispozitive descrise mai sus.
Invenţia se referă în continuare la procedee de fabricare a unei polipeptide a invenţiei, astfel de procedee cuprinzând, în general, etapele de:
- cultivare a celulelor-gazdă care conţin un acid nucleic capabil să codifice o polipeptidă a invenţiei (în continuare: "acid nucleic al invenţiei"), în condiţii care permit expresia polipeptidei invenţiei; şi,
- recuperare sau izolare a polipeptidei exprimate de către celulele-gazdă din cultură; şi
- opţional, de purificare şi/sau modificare şi/sau preparare a polipeptidei invenţiei.
Un acid nucleic al invenţiei poate fi ADN, ADNc genomic sau ADN sintetic (cum ar fi ADN-ul cu o utilizare a codonului adaptată în mod specific pentru expresia în celula-gazdă sau organismul-gazdă preconizat). Conform unei variante de executare a invenţiei, acidul nucleic al invenţiei este sub formă izolată esenţial, după cum este definit mai sus.
Acidul nucleic al invenţiei poate fi, de asemenea, sub formă de, poate fi prezent în şi/sau să facă parte dintr-un vector, cum ar fi, de exemplu, o plasmidă, o cosmidă sau CAD (cromozomi artificiali de drojdie), care din nou poate fi sub formă izolată esenţial. Vectorul poate fi, în special, un vector de expresie, adică un vector care poate prevedea expresia polipeptidei in vitro şi/sau in vivo (de ex. într-o celulă gazdă, organism gazdă şi/sau sistem de expresie adecvat). Un astfel de vector de expresie cuprinde, în general, cel puţin, un acid nucleic al invenţiei, care este legat funcţional de unul sau mai multe elemente regulatoare adecvate, cum ar fi promotori, potenţiatori, terminatori, şi altele. Exemple specifice de astfel de elemente regulatoare şi alte elemente, cum ar fi factorul(ii) de integrare, markerul(ii) de selecţie, secvenţa(ele) de semnal sau lider, gena(ele) reporter, şi altele, utile sau necesare pentru expresia polipeptidelor invenţiei, sunt dezvăluite, de ex., la pag. 131-133 din WO2006/040153 (A2) 2006.04.20.
Acizii nucleici ai invenţiei pot fi preparaţi sau obţinuţi într-un mod bine cunoscut (de ex., prin sinteza automată a ADN-ului şi/sau tehnologia ADN-ului recombinant), pe baza informaţiilor privind secvenţele de aminoacizi pentru polipeptidele din prezenta invenţie, şi/sau pot fi izolaţi dintr-o sursă naturală adecvată.
Conform unei alte variante de executare, invenţia se referă la o gazdă sau celulă-gazdă care exprimă sau este capabilă să exprime o polipeptidă a invenţiei; şi/sau care conţine un acid nucleic care codifică o polipeptidă a invenţiei. Conform unei variante de executare îndeosebi preferate, celulele-gazdă respective sunt celule bacteriene, celule de drojdii, celule fungice sau celule de mamifere.
Celule bacteriene adecvate includ celule din tulpinile bacteriene gram-negative cum ar fi tulpinile de Escherichia coli, Proteus, şi Pseudomonas, şi tulpinile bacteriene gram-pozitive cum ar fi tulpinile de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, şi Lactococcus. Celule fungice adecvate includ celule din specii de Trichoderma, Neurospora, şi Aspergillus. Celule de drojdii adecvate includ celule din specii de Saccharomyces (de ex. Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (de ex. Schizosaccharomyces pombe), Pichia (de ex. Pichia pastoris şi Pichia methanolica), şi Hansenula.
Celule de mamifere adecvate includ, de ex., celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), celule renale de pui de hamster (BHK), celule HeLa, celule renale de maimuţă (COS), celule NS0, celule renale embrionare umane (HEK) şi altele. Cu toate acestea, pot fi utilizate, de asemenea, celule de amfibieni, celule de insecte, celule de plante, precum şi orice alte celule utilizate în domeniu pentru expresia proteinelor heteroloage.
Pentru producerea la scară industrială, gazde heteroloage preferate pentru producerea (industrială) polipeptidelor cu domenii variabile unice imunoglobulinice şi terapiilor cu proteine care le conţin includ tulpini de E. coli, Pichia pastoris, şi S. cerevisiae, care sunt potrivite pentru expresia, producerea şi fermentarea la scară largă, şi, în special, pentru expresia, producerea şi fermentarea (bio)farmaceutică la scară largă.
Alegerea sistemului de expresie specific va depinde în parte de cerinţa pentru anumite modificări post-translaţionale, îndeosebi glicozilare. Producerea unei polipeptide a invenţiei, pentru care se doreşte sau este necesară glicozilarea va necesita utilizarea gazdelor de expresie de mamifere, care au capacitatea de a glicozila proteina exprimată. În acest sens, va fi clar specialistului că modelul de glicozilare obţinut (adică, tipul, numărul şi poziţia reziduurilor ataşate) va depinde de celula sau linia de celule care este utilizată pentru expresie.
Polipeptidele invenţiei produse într-o celulă, precum este prevăzut mai sus, pot fi produse intracelular (de ex., în citosol, în periplasmă sau în corpii de incluziune) şi apoi izolate din celulele gazdă şi, opţional, purificate; sau ele pot fi produse extracelular (secretate în mediul în care celulele-gazdă sunt cultivate) şi apoi izolate din mediul de cultură şi opţional purificate.
Alte metode şi reactivi utilizaţi pentru producerea recombinantă a polipeptidelor, cum ar fi vectori de expresie adecvaţi, metode de transformare sau transfecţie, markeri de selecţie, metode de inducere a expresiei proteinelor, condiţii de cultivare şi altele, sunt cunoscute în domeniu. În mod similar, izolarea proteinelor şi tehnici de purificare utile într-o metodă de fabricare a unei polipeptide a invenţiei sunt bine cunoscute specialistului.
Producerea polipeptidelor invenţiei prin fermentare în organisme-gazdă recombinante convenabile, cum ar fi E. coli şi drojdie este rentabilă, comparativ cu anticorpii convenţionali, care necesită, de asemenea, echipamente costisitoare de cultivare a celulelor de mamifere. În plus, nivelurile de expresie care pot fi atinse sunt înalte şi randamentele polipeptidelor invenţiei sunt cuprinse între 1 şi 10 g/l (E. coli) şi până la 10 g/l (drojdie) şi mai mult.
Exemple
Generarea liniilor celulare CHO, Baf/3, Caki şi HEK293 care supraexprimă CX3CR1 umană sau CX3CR1 de cynomolgus
Celulele CHO şi BAF/3 care supraexprimă CX3CR1 umană sau de cynomolgus au fost generate cu ajutorul tehnicilor cunoscute în domeniu. Celulele care exprimă CCR2 sau CCR5 umană au fost, de asemenea, generate cu ajutorul tehnicilor cunoscute în domeniu.
ADNc a fost clonat în ADNCp3.1(+)-neo pentru CX3CR1 umană, în timp ce ADNpc-DEST40-neo a fost utilizat pentru CX3CR1 de şoarece.
Secvenţe de aminoacizi ale CX3CR1 umană şi CX3CR1 de cynomolgus sunt descrise în SECV ID Nr.: 255 şi 256, respectiv.
Pentru a stabili celulele renale de cămilă (Caki) care supraexprimă CX3CR1 umană sau CX3CR1 de şoarece, celulele Caki parentale au fost electroporate cu ADNCp3.1(+)-neo-hCX3CR1 sau, respectiv, ADNpc-DEST40-neo-mCX3CR1. Pentru toate condiţiile, transfectanţii au fost selectaţi prin adăugarea a 1 mg/ml de geneticină (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA).
Celulele renale embrionare umane (HEK293) care supraexprimă CX3CR1 umană sau CX3CR1 de cynomolgus au fost generate prin transfecţia mediată de lipide cu Fugene (Roche) a ADNCp3.1(+)-neo-hCX3CR1 sau, respectiv, plasmide cyCX3CR1 în linia celulară parentală HEK293. Aceste celule au fost utilizate ca transfectanţi tranzitorii şi, ca atare, n-au fost supuşi selecţiei. Pe scurt, celulele 2*10E6 au fost însămânţate per T75 şi incubate timp de o noapte înainte de transfecţie. După înlăturarea mediului de cultură, celulele au fost transfectate cu plasmidele respective (9 µg) şi Fugene (27 µl) conform instrucţiunilor producătorului. Peste 48 de ore după transfecţie, celulele au fost recoltate şi congelate pentru utilizarea ulterioară.
Exemplul 1: Imunizarea cu CX3CR1 induce un răspuns imun umoral în lamă
1.1. Imunizări
În urma aprobării Comitetului de etică (Universitatea Antwerp, Belgia, UA2008A1, 2008/096, 2007/068), 9 lame (desemnate cu nr. 368, 369, 370, 381, 382, 384, 312, 313 şi 314) au fost imunizate.
Şase lame (312, 313, 314, 381, 382 şi 384) au fost imunizate cu 4 injecţii intramusculare (2mg/doză la intervale săptămânale sau bilunare) ale vectorului pasmidic pVAX1-huCX3CR1(Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Trei lame (381, 382 şi 384) au primit ulterior 4 injecţii subcutanate de CX3CR1 umană care supraexprimă celulele Caki stabilite în modul descris mai sus. Celulele au fost repuse în suspensie în D-PBS şi păstrate pe gheaţă înainte de injectare.
Trei lame suplimentare (nr. desemnat 368, 369 şi 370) au fost imunizate conform protocoalelelor standard cu 4 injecţii subcutanate de CX3CR1 umană care supraexprimă celulele Caki stabilite în modul descris mai sus. Celulele au fost repuse în suspensie în D-PBS şi păstrate pe gheaţă înainte de injectare. Ulterior, acestor lame li s-au administrat două injecţii cu fragment recombinant de CX3CR1 NT/EC3 cuplat la BSA (3). Peptidele au fost comandate de la NeoMPS (Polypeptide group, Strasbourg, Franţa) şi cuplate la BSA conform protocoalelor standard.
Secvenţa fragmentelor peptidice utilizate pentru stimularea imunizării
Tabel 3
Fragment secvenţă SECV ID Nr.: CX3CR1-NT Ac-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Glu-Ser-Val-Thr-Glu-Asn-Phe-Glu-Tyr-Asp-Asp-Leu-Ala-Glu-Ala-Cys-NH2 228 CX3CR1-EC3 Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Cys-Asp-Met-Arg-Lys-Asp-Leu-Arg-Leu-NH2 229
Prima injecţie a fost preparată în Complete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, SUA), în timp ce injecţia ulterioară a fost preparată în Incomplete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, SUA).
1.2. Evaluarea răspunsurilor imune induse în lamă
Pentru a evalua inducerea răspunsurilor imune în animale împotriva CX3CR1 umane prin metodele de analiză ELISA sau FACS, seruri au fost colectate de la lamele 312, 313 şi 314 la ziua 0 (pre-imun), şi la diferite intervale de timp în schema de imunizare (timpul colectării limfocitelor din sângele periferic [LSP]).
Pe scurt, Neutravidin (2µg/ml) a fost imobilizat timp de o noapte la 4°C într-o placă cu 96 de godeuri Maxisorb (Nunc, Wiesbaden, Germania). Godeurile au fost blocate cu o soluţie de cazeină (1%) în PBS. Fragment de NT recombinant biotinilat ulterior (Polypeptide, Strasbourg, Franţa) sau fragmente de EC3 biotinilate ale CX3CR1 (Polypeptide, Strasbourg, Franţa) au fost capturate în cantitate de 2 µg/ml. După adăugarea diluţiilor de ser, imunoglobulinele legate specific au fost detectate cu ajutorul unei imunoglobuline de capră anti-lamă conjugată cu peroxidaza de hrean (HRP) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, SUA) şi o reacţie enzimatică ulterioară în prezenţa substratului TMB One (3,3', 5,5'-tetramentilbenzidină) (Promega, Mannheim, Germania), care arată că un răspuns imun semnificativ dependent de anticorpi împotriva CX3CR1 a fost indus după imunizările peptidice.
În plus, titrele serice ale animalelor cu celule imunizate au fost confirmate prin analiza FACS pe CX3CR1 umană în creştere activă care supraexprimă celulele CHO. Răspunsurile titrelor serice ale CX3CR1 pentru lamele 368, 369 şi 370 au fost determinate cu ser prelevat după 4 imunizări celulare (ziua 49), 4 imunizări celulare şi o stimulare peptidică (ziua 77) şi 4 imunizări celulare şi 2 stimulări peptidice (ziua 81). Celulele au fost recoltate şi spălate înainte de incubare cu diluţii de ser. Detectarea a fost realizată cu IgG de capră anti-lamă (Bethyl, Montgomery, TX, SUA), urmată de măgar anti-capră cuplată cu PE (Jackson Laboratories, Suffolk, MB) şi înregistrările au fost afectuate cu ajutorul analizei pe FACSArray (BD Biosciences). Un rezumat al răspunsurilor serice obţinute precum au fost determinate prin analizele ELISA sau FACS este prezentat în tab. 14 şi 15.
Analiza titrelor serice pentru animalele cu celule/peptide imunizate
Tabel 14
ELISA FACS Lama Imunogen NT recombinant EC3 recombinant După imunizarea celulară După stimulările peptidice 368 Caki-huCX3CR1 + Peptida NT/EC3 + +/- - - 369 Caki-huCX3CR1 + Peptida NT/EC3 + +/- + + 370 Caki-huCX3CR1 + Peptida NT/EC3 ++ ++ - +
Analiza titrelor serice pentru animalele cu ADN/celule imunizate
Tabel 15
ELISA FACS Lama Imunogen NT recombinant EC3 recombinant După imunizarea ADN-ului După stimulările celulare 381 DNA + Caki-huCX3CR1 ++ + ++ ++ 382 DNA + Caki-huCX3CR1 + - - - 384 DNA + Caki-huCX3CR1 ++ - - -
Pentru lamele cu doar ADN-ul imunizat (312, 313 şi 314) n-a fost determinat titrul seric.
Exemplul 2: Clonarea spectrelor de fragmente de anticorpi doar cu lanţ greu şi prepararea fagului
După injecţia finală a imunogenului a fiecărui subgrup, ţesuturile imune ca sursă de celule B care produc anticorpii cu lanţ greu au fost colectate de la lamele imunizate. Pentru lamele 312, 313 şi 314, două probe de sânge de 150 ml, colectate peste 4 şi 8 zile după ultima injecţie de antigen au fost colectate pentru fiecare animal. Pentru lamele 368, 369 şi 370, patru probe de sânge de 150 ml au fost colectate, peste 5 şi 7 zile după ultima imunizare celulară şi, suplimentar, peste 4 şi 8 zile după ultima imunizare peptidică. Pe lângă acestea, au fost prelevate două biopsii de ganglioni limfatici, peste 12 zile după ultima imunizare celulară şi peste 12 zile după ultima imunizare peptidică. Pentru lamele 381, 382 şi 384 au fost colectate cinci probe de sânge a câte 150 ml, peste 8 zile după ultima imunizare a ADN-ului şi suplimentar peste 4 zile după prima stimulare celulară, peste 8 şi 11 zile după cea de-a doua stimulare celulară şi peste 8 zile după ultima imunizare celulară. Pe lângă acestea, a fost prelevată o biopsie de ganglioni limfatici, peste 8 zile după a doua imunizare celulară.
Din probele de sânge, au fost preparate limfocite din sângele periferic (LSP) utilizând Ficoll-Hypaque conform instrucţiunilor producătorului (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SUA). Din LSP şi biopsia de ganglioni limfatici (GL), a fost extras ARN-ul total, care a fost utilizat ca materie primă pentru RT-PCR pentru a amplifica segmentele de ADN care codifică VHH.
Pentru fiecare lamă imunizată, au fost create bănci prin punerea în comun a ARN-ului total izolat din probele care provin de la un anumit subgrup din schema de imunizare, adică după un tip de antigen de imunizare, şi pentru unele lame probe de la diferite animale au fost reunite într-o singură bancă (6).
Unificarea diverselor probe pentru crearea băncii
Tabel 16
Denumirea băncii Lamă Probă 368-LSP1+2+GL-V-100209 368 LSP 1 şi 2, GL 369+370-LSP1 +2+GL-V-100209 369, 370 LSP 1 şi 2, GL 368-LSP3+4-V-280909 368 LSP 3 şi 4 369-LSP3+4-V-070409 369 LSP 3 şi 4 370-LSP3+4-V-070409 370 LSP 3 şi 4 381-LSP1-V-180310 381 LSP 1 382-LSP1-V-180310 382 LSP1 384-LSP1-V-180310 384 LSP1 381-LSP1+2+3+4+5+GL-V-280909 381 LSP 1, 2, 3, 4, 5 şi GL 382-LSP1+2+3+4+5+GL-V-280909 382 LSP 1, 2, 3, 4, 5 şi GL 384-LSP1+2+3+4+5+GL-V-280909 384 LSP 1, 2, 3, 4, 5 şi GL 312+313+314-LSP1+2-V-220210 312, 313 şi 314 LSP 1 şi 2 312-LSP1+2-V-180310 312 LSP 1 şi 2 313-LSP1+2-V-180310 313 LSP 1 şi 2 314-LSP1+2-V-180310 314 LSP 1 şi 2
Pe scurt, spectrul VHH amplificat prin RLP a fost clonat prin situsuri specifice de restricţie într-un vector destinat facilitării expunerii fagilor din banca VHH. Vectorul a fost obţinut din pUC119 şi conţine promotorul LacZ, o secvenţă de codificare a proteinei gIII a fagului M13, o genă de rezistenţă pentru ampicilină sau carbenicilină, un situs de clonare multiplă şi o secvenţă lider hibrid gIII-pelB (pAX050). În cadrul cu secvenţa de codificare VHH, vectorul codifică un marcaj C-terminal c-myc şi un marcaj His6. Fagul a fost preparat conform protocoalelor standard şi păstrat după sterilizarea prin filtrare la 4°C sau la -80°C în glicerol de 20% pentru utilizarea ulterioară.
Exemplul 3: Selecţia VHH-urilor specifice CX3CR1 prin expunerea fagilor
Spectrele VHH obţinute din toate lamele şi clonate ca bancă de fagi au fost utilizate în diferite strategii de selecţie, aplicând o multitudine de condiţii de selecţie. Variabilele includ i) forma de prezentare a proteinei CX3CR1 (pe diverse medii celulare sau pe lipozomi/VLP-uri (particule asemănătoare virusului), ii) metoda de prezentare a antigenului (În soluţie atunci când se utilizează celule sau acoperite pe plăci la utilizarea VLP-urilor), iii) concentraţia de antigen iv ) ortologul utilizat (uman sau de cynomolgus) v) numărul de runde de selecţie şi vi) diferite metode de eluţie (nespecifice prin tripsină sau specifice prin Fractalkina ligand). Toate selecţiile în fază solidă acoperită au fost efectuate pe plăci Maxisorp cu 96 de godeuri (Nunc, Wiesbaden, Germania).
Selecţiile au fost realizate în modul următor: Preparatele de antigen CX3CR1 pentru formatele de selecţie în fază solidă şi solubilă au fost prezentate precum s-a descris mai sus în multiple concentraţii. După 2 ore de incubare cu băncile de fagi, urmată de spălarea abundentă, fagii legaţi au fost eluaţi cu tripsină (1 mg/ml) timp de 15 minute. Când tripsina a fost utilizată pentru eluţia fagilor, activitatea proteazei a fost neutralizată imediat prin aplicarea a 0,8 mM de inhibitor de protează ABSF. În calitate de martor, selecţiile fără antigen au fost realizate în paralel.
Au fost utilizate producţii de fagi pentru a infecta E. coli, care au fost apoi, la rândul lor, utilizate pentru a prepara fagi pentru următoarea rundă de selecţie (salvarea fagilor). După a doua rundă de selecţie producţiile de fagi au fost utilizate pentru a infecta E. coli, care apoi au fost plasate pe plăci de agar (LB+carb+glucoză2%) pentru analiza clonelor individuale de VHH. Pentru sortarea unei producţii de selecţie pentru lianţi specifici, au fost extrase colonii unice de pe plăcile de agar şi crescute în plăci cu 96 de godeuri cu adâncimea de 1 ml. Expresia VHH controlată de LacZ a fost indusă prin adăugarea IPTG (1mM final) în absenţa glucozei. Extracte periplasmice (într-un volum de ~ 80 ul) au fost preparate conform protocoalelor standard.
Exemplul 4: Examinarea extractelor periplasmice în testul FACS de concurenţă CX3CR1-fraktalkină
Extractele periplasmice au fost examinate printr-un test FACS de concurenţă CX3CR1 umană/Fractalkină umană pentru a evalua capacitatea de blocare a VHH-urilor exprimate. CX3CR1 umană a fost prezentată pe celulele CHO care supraexprimă CX3CR1. S-a utilizat atât o setare folosind celule recoltate de la o cultură în creştere activă şi o setare folosind celule congelate. În calitate de reactiv de detectare a fost utilizată o fractalkină marcată (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA), marcată cu alexa647 (A647-Fractalkină) la un grad de marcare 1. Pentru a seta testul, s-a efectuat mai întâi o serie de titrare a fractalkinei marcate pe celulele CHO-CX3CR1 umană pentru a determina valoarea CE50 pentru legare. Iniţial examinarea a fost realizată la o concentraţie mai mare de fractalkină (3 nM) pentru a spori soliditatea testului. Pentru a spori sensibilitatea examinării până la maximum, concentraţia CE30 (1 nM) a fost aleasă pentru examinarea ulterioară. Pe scurt, 50 µl de extract periplasmic s-a adăugat la 6 nM de fractalkină marcată (50 µl) şi 200 000 de celule CHO-CX3CR1 umană. După o oră de incubare la 4°C, celulele au fost spălate de trei ori înainte de efectuarea înregistrării pe un Test FACS (Becton Dickinson). Mai întâi, o supapă a fost setată pe celulele intacte precum s-a determinat din profilul de dispersie. Apoi, celulele moarte au fost extrase prin profilul lor de fluorescenţă de la tulpina PI (Sigma, St. Louis, SUA). Profilul de fluorescenţă de la marcajul alexa647 a fost determinat pentru fiecare probă şi utilizat pentru calcularea capacităţii de blocare. În calitate de martori, s-a adus la condiţiile în care nu era prezent nici un VHH în extractul peri sau un VHH irelevant cunoscut şi probele au fost incluse acolo unde era inclusă fractalkină rece în exces. Pentru fiecare probă blocul procentual a fost determinat cu ajutorul probelor de control pentru a determina fereastra de analiză.
Din această examinare, au fost selectate VHH-urile şi analiza secvenţelor a dezvăluit 120 de VHH-uri unice care se referă la 3 linii diferite de celule B. Numărul total de variante depistate pentru fiecare linie de celule B este descris în 7.
Parametrii de selecţie utilizaţi pentru identificarea liniilor de celule B ale VHH-urilor specifice CX3CR1 umane
Tabel 17
Linia de celule B ID-ul VHH-ului reprezentativ nr. variantelor bănci 9 CX3CR1BII11H11 4 368-LSP1+2+GL-V-100209 13 CX3CR1BII18E06 68 368-LSP1+2+GL-V-100209 368-LSP3+4-V-280909 101 CX3CR1BII66B02 48 312+313+314-LSP1+2-V-220210 314-LSP1+2-V-180310
O analiză a procedurii de selecţie şi executării acesteia în timpul examinării iniţiale este prezentată pentru toate VHH-urile în tab. 18.
Condiţiile de selecţie şi rezultatul examinării primare pentru VHH-ul specific CX3CR1 umane
Tabel 18
ID-ul VHH-ului Familia Banca Selecţiile % blocării runda I runda II CX3CR1BIIPMP11H11 9 368-LSP1+2+GL-V-100209 BA/F3_hCX3CR1 (tripsină) total CHO-K1_hCX3CR1 (tripsină) total 99,0 CX3CR1BIIPMP18E6 13 368-LSP3+4-V-280909 BA/F3_hCX3CR1 (tripsină) total CHO-K1_hCX3CR1 (tripsină) total 53,1 CX3CR1BIIPMP54A12 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 93,8 CX3CR1BIIPMP54A3 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 90,8 CX3CR1BIIPMP54A4 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 86,6 CX3CR1BIIPMP54A5 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 92,5 CX3CR1BIIPMP54A7 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) (tripsină) total VLPs-hCX3CR1 (10U) (tripsină) total 68,9 CX3CR1BIIPMP54B1 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 92,1 CX3CR1BIIPMP54B2 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 65,3 CX3CR1BIIPMP54B3 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 90,1 CX3CR1BIIPMP54B5 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 92,6 CX3CR1BIIPMP54D5 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 87,8 CX3CR1BIIPMP54D8 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) total (tripsină) VLPs-hCX3CR1 (10U) (tripsină) total 64,1 CX3CR1BIIPMP54F6 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 96,6 CX3CR1BIIPMP54G3 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 74,7 CX3CR1BIIPMP54H1 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 74,6 CX3CR1BIIPMP54H4 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 96,0 CX3CR1BIIPMP61F10 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 73,5 CX3CR1BIIPMP61D1 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 68,4 CX3CR1BIIPMP61D5 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 94,9 CX3CR1BIIPMP61E2 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 70,3 CX3CR1BIIPMP61F11 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 96,5 CX3CR1BIIPMP61G2 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 82,0 CX3CR1BIIPMP61G3 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 92,1 CX3CR1BIIPMP61G4 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 94,5 CX3CR1BIIPMP61F4 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 94,4 CX3CR1BIIPMP61A11 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 78,0 CX3CR1BIIPMP61B2 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) 94,5 CX3CR1BIIPMP61C9 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) (tripsină) total VLPs-hCX3CR1 (10U) (tripsină) total 69,4 CX3CR1BIIPMP65H02 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65E11 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65E10 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65E05 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65B11 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65B07 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65B09 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65H01 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP65G07 101 312+313+314-LSP1+2-V-220210 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66H08 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66H04 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66F02 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66E11 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66D10 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66D08 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66B02 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66A04 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66D04 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66D02 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66D06 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A CX3CR1BIIPMP66G01 101 314-LSP1+2-V-180310 VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) VLPs-hCX3CR1 (10U) hFrac (2 µM) #N/A
Secvenţele de aminoacizi a tuturor VHH-urilor unice obţinute sunt prezentate în Lista de secvenţe şi mai sus (au fost indicate CDR-urile şi regiunile-cadru).
Exemplul 5: Caracterizarea VHH-urilor purificate
VHH-urile inhibitorii anti-CX3CR1 selectate din examinarea descrisă în exemplul 4 au fost ulterior purificate şi caracterizate. VHH-urile selectate au fost exprimate în E. coli TG1 ca proteine c-myc, marcate His6. Expresia a fost indusă prin adăugarea a 1 mM IPTG şi lăsată să continue timp de 4 ore la 37°C. După rotirea culturilor de celule, extractele periplasmice au fost preparate prin congelarea-decongelarea peletelor. Aceste extracte au fost utilizate ca materie primă şi VHH-urile au fost purificate prin IMAC şi cromatografia de excluziune sterică (SEC), ceea ce a rezultat într-o puritate de 95%, fapt determinat prin SDS-PAGE.
Inhibarea de către VHH-urile anti-CX3CR1 ale legării Fractalkinei umane de CX3CR1 umană exprimată pe celulele BA/F3.
Capacitatea de blocare spre fractalkina ligand a VHH-urilor a fost evaluată prin testul de concurenţă FACS a CX3CR1 umane prezentată în Exemplul 4. Au fost utilizate celule CHO-huCX3CR1, celule BA/F3-huCX3CR1 sau celule HEK293T transfectate tranzitoriu. Cantitatea de ligand marcat utilizată în diferite setări de concurenţă a fost, de asemenea, modificată. Valorile CI50 pentru VHH-urile care blochează interacţiunea fractalkinei umane cu CX3CR1 umană sunt reprezentate în tab.19.
Capacitatea şi eficacitatea VHH-ului în analiza FACS de concurenţă a liganzilor
Tabel 19
ID-ul VHH-ului Familia Linia de celule CI50 % bloc Repetări 11H11 9 CHO-huCX3CR1 1.7 E-8 100 4 18E06 13 CHO-huCX3CR1 1.8 E-9 33 4 54A12 101 CHO-huCX3CR1 2.1 E-9 104 2 54D08 101 CHO-huCX3CR1 1.5 E-8 101 2 54A07 101 CHO-huCX3CR1 1.1 E-8 78 2 54D05 101 CHO-huCX3CR1 2.7 E-9 102 2 54B03 101 CHO-huCX3CR1 2.5 E-8 108 1 54G03 101 CHO-huCX3CR1 5.6 E-8 107 1 11H11 9 BA/F3-huCX3CR1 8.1 E-9 100 3 18E06 13 BA/F3-huCX3CR1 2.8 E-9 71 3 54A12 101 BA/F3-huCX3CR1 4.0 E-9 100 4 54D08 101 BA/F3-huCX3CR1 3.8 E-8 99 1 54A07 101 BA/F3-huCX3CR1 1.5 E-8 81 4 54D05 101 BA/F3-huCX3CR1 5.5 E-9 99 1 54B03 101 BA/F3-huCX3CR1 3.3 E-8 99 1 54G03 101 BA/F3-huCX3CR1 9.8 E-8 98 1 54A12 101 HEK293-huCX3CR1 6.8 E-9 96 5 54D08 101 HEK293-huCX3CR1 8.4 E-8 95 2 54A07 101 HEK293-huCX3CR1 2.3 E-8 52 2 54D05 101 HEK293-huCX3CR1 5.3 E-9 94 5 54B03 101 HEK293-huCX3CR1 6.7 E-8 92 2 54G03 101 HEK293-huCX3CR1 2.7E-7 89 2 61E02 101 HEK293-huCX3CR1 8.2 E-8 98 2 61B04 101 HEK293-huCX3CR1 5.7 E-8 97 2 61B02 101 HEK293-huCX3CR1 1.0 E-8 94 2 54H01 101 HEK293-huCX3CR1 1.0 E-8 64 2 54A04 101 HEK293-huCX3CR1 4.9 E-8 100 2 61F11 101 HEK293-huCX3CR1 4.6 E-8 96 2 61G03 101 HEK293-huCX3CR1 6.0 E-8 96 2 61G04 101 HEK293-huCX3CR1 4.2 E-8 96 2 66B02 101 HEK293-huCX3CR1 2.5 E-9 102 2 66G01 101 HEK293-huCX3CR1 1.4 E-8 99 2
Inhibarea de către VHH-urile anti-CX3CR1 a chemotaxiei induse de fractalkina umană a celulelor BA/F3 care supraexprimă CX3CR1 umană.
Pentru evaluarea inhibării chemotaxiei induse de fractalkină, s-a efectuat un test de chemotaxie cu ajutorul camerei de unică folosinţă ChemoTx cu dimensiunea porilor de 5 µm (Neuroprobe, Gaithersburg, SUA). Celulele au fost recoltate de la o cultură în creştere activă şi spălate înainte de utilizare în mediul de testare, RPMI (Gibco, Carlsbad, SUA) suplimentat cu BSA de 0,1%. Camera inferioară a fost umplută cu 320 pM de fractalkină umană într-un volum total de 300 µl. După aplicarea membranei, celulele 0.13E6 au fost depuse pe partea superioară a membranei într-un volum total de 70 µl. Chemotaxia a fost lăsată timp de 3 ore la 37°C într-o cameră umidificată cu CO2. După această perioadă de incubare, membrana a fost înlăturată şi celulele din camera inferioară au fost repuse în suspensie. Cantitatea de ATP prezentă în godeuri a fost determinată cu ajutorul kitului CelITiter-Glo (Promega, Madison WI, SUA). Citirea datelor a fost efectuată pe un aparat Envision (Perkin Elmer, Massachusetts, SUA), cu setările standard pentru citirea datelor referitoare la luminiscenţă. Seriile de titrare au fost realizate în trei exemplare şi fiecare placă, de asemenea, conţinea probe de control în trei exemplare. În calitate de martor, a fost inclusă o probă fără VHH, precum şi o probă în care nu s-a adăugat fractalkină umană în camera inferioară. Rezumatul rezultatelor este prezentat în tab. 20.
Capacitatea şi eficacitatea VHH-ului în blocarea chemotaxiei induse de fractalkină
Tabel 20
ID-ul VHH-ului Fam. IC50 % blocării Repetări 11H11 9 2 E-7 89 5 18E06 13 NA 17 4 54A12 101 8 E-8 84 6 54D08 101 NA 33 2 54A07 101 5 E-8 45 4 54D05 101 7 E-8 81 4 54B03 101 1 E-7 73 1 54G03 101 NA 40 1 66B02 101 2 E-8 87 2 66G01 101 4 E-7 54 2
Evaluarea reactivităţii încrucişate a VHH-urilor anti-CX3CR1 împotriva CX3CR1 de cynomolgus.
Iniţial, s-a utilizat o setare a legării bazată pe FACS pentru a evalua reactivitatea încrucişată a cynomolgus. Pentru aceasta, VHH-urile au fost incubate cu celulele respective timp de 30 de minute la 4°C, după care au urmat trei etape de spălare şi ulterior au fost incubate cu reactivi de detectare. Ca detectare, s-a utilizat un anticorp de şoarece anti-cmyc (Serotec, MCA2200), urmat de un anticorp de capră anti-şoarece cuplat la PE (Jackson 115-116-071), fiecare incubare fiind de 30 de minute la 4°C, urmată de trei etape de spălare. Rezultatele testului sunt prezentate în 21.
Valoarea CE50 pentru legarea VHH-ului respectiv pe CX3CR1 umană sau pe CX3CR1 de cynomolgus
Tabel 21
ID-ul VHH-ului Familia CE50 (M) Uman CE50 (M) Cynomolgus Raportul Repetări 11H11 9 8.0 E-10 NA NA 2 18E06 13 1.5 E-9 1.4 E-8 9 2 54A12 101 3.5 E-8 1,1 E-7 3,3 1 54A07 101 5,4 E-7 3.0 E-8 0,1 1 54D05 101 8.4 E-10 5.0 E-8 59,6 1
Pentru VHH-urile identificate mai târziu, a fost realizată analiza FACS de concurenţă a fractalkinei umane cu ajutorul CX3CR1 umane sau de cynomolgus exprimată în celulele HEK293T. Atât receptorul uman, cât şi cel de cynomolgus a fost transfectat tranzitoriu în celulele HEK293T şi transfecţiile au fost ajustate prin legarea ligandului marcat, fractalkinei umane. Concurenţa a fost evaluată cu ajutorul concentraţiei CE30 a fractalkinei şi astfel valorile CI50 obţinute sunt o bună estimare a valorii Ki, o măsură pentru afinitate (22). Experimentul a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 4. Raportul dintre valorile CI50 pe maimuţa cynomolgus şi CX3CR1 umană a fost utilizat pentru a evalua potenţialele diferenţe în afinitate pentru CX3CR1 în ambele specii.
Eficacitatea şi capacitatea VHH-urilor în FACS de concurenţă a liganzilor faţă de CX3CR1 umană şi de cynomolgus
Tabel 22
ID-ul VHH-ului Familia Uman Cynomolgus Raportul Repetări IC50 (M) % blocării IC50 (M) % blocării 54A12 101 6.8 E-9 96 6.7 E-8 94 9,85 5 54D08 101 8.4 E-8 95 7.2 E-8 91 0,85 2 54A07 101 2.3 E-8 52 2,8 E-7 69 12,3 2 54D05 101 5.3 E-9 94 6.4 E-8 91 12,25 5 54B03 101 6.7 E-8 92 4,7 E-7 95 7,05 2 54G03 101 2.7E-7 89 4,7 E-7 89 1,74 2 61E02 101 8.2 E-8 98 4.6 E-8 96 0,55 2 61B04 101 5.7 E-8 97 8.7 E-8 93 1,53 2 61B02 101 1.0 E-8 94 4.5 E-8 92 4,37 2 54H01 101 1.0 E-8 64 6.8 E-8 92 6,48 2 54A04 101 4.9 E-8 100 3.1 E-8 91 0,64 2 61F11 101 4.6 E-8 96 1,6 E-7 95 3,58 2 61G03 101 6.0 E-8 96 3,0 E-7 89 5,02 2 61G04 101 4.2 E-8 96 2,0 E-7 100 4,8 2 66B02 101 2.5 E-9 102 1.9 E-8 97 7,5 2 66G01 101 1.4 E-8 99 1,2 E-7 100 8,29 2
Legarea VHH-urilor ale CX3CR1 anti-umane la CCR2 umană, CCR5 umană sau CX3CR1 de şoarece
Specificitatea pentru receptorul huCX3CR1 a fost evaluată prin efectuarea experimentului de legare FACS pe celulele parentale CHO-K1 sau celulele CHO care exprimă huCCR2, huCCR5 sau msCX3CR1. VHH-urile au fost incubate cu liniile celulare respective timp de 30 de minute la 4°C, după care au urmat trei etape de spălare şi ulterior au fost incubate cu reactivi de detectare. În calitate de detectare s-a utilizat un anticorp de şoarece anti-cmyc (Serotec, MCA2200), urmat de un anticorp de capră anti-şoarece cuplat la PE (Jackson 115-116-071), fiecare incubare fiind de 30 de minute la 4°C, urmată de trei etape de spălare. Pentru fiecare linie celulară a fost inclus un control de calitate cu anticorp specific receptorului. În plus, cea mai înaltă concentraţie a fiecărui VHH a fost, de asemenea, incubată cu celulele CHO care exprimă huCX3CR1 ca martor pozitiv. Nu s-a observat legătură cu msCX3CR1, huCCR2 sau huCCR5.
Determinarea grupului de epitopi
Un experiment de legare competitivă a fost realizat cu scopul de a determina dacă VHH-urile leagă epitopii care se suprapun pe CX3CR1. Pentru aceasta, VHH-ul 66B02 marcat cu alexa647 a fost utilizat într-un FACS de concurenţă pe celulele BA/F3 care exprimă huCX3CR1. VHH-uri reprezentative din cele trei familii funcţionale au fost utilizate în calitate de competitori pentru legarea 66B02 marcat. Valorile CI50 obţinute sunt prezentate în t23.
Sortarea epitopilor pe bază de FACS de concurenţă
Tabel 23
ID-ul VHH-ului Familia CI50 (M) % blocării 11H11 9 4.9E-09 100 18E06 13 2.3E-09 100 66B02 101 1.5E-09 100
Dat fiind că inhibarea completă a legării 66B02 ar putea fi obţinută de toate VHH-urile reprezentative din diverse familii de blocare a liganzilor, se poate concluziona că toate familiile funcţionale se leagă în proximitate suficient de aproape una de cealaltă, astfel încât ele concurează cu legarea 66B02.
Exemplul 6: Formatarea VHH-urilor în bivalenţă
Formarea bivalenţilor
Pentru a spori capacitatea şi/sau eficacitatea dintr-o selecţie a VHH-urilor obţinute, moleculele bivalente au fost formate prin ingineria genetică. Două VHH-uri au fost legate genetic împreună cu un linker 35GS între cele două blocuri de formare şi, ulterior, exprimate în E.coli aşa cum este descris mai sus pentru VHH-urile monovalente. Diferite structuri bivalente au fost executate precum sunt prezentate în 4.
Formate bivalente reprezentative
Tabel 24
ID-ul structurii Identitatea VHH-ului Familia Linkerul Identitatea VHH-ului Familia CX3CR1BII007 CX3CR1BII11H11 9 35GS CX3CR1BII18E6 13 CX3CR1BII009 CX3CR1BII18E6 13 35GS CX3CR1BII11H11 9 CX3CR1BII012 CX3CR1BII54D08 101 35GS CX3CR1BII18E06 101 CX3CR1BII016 CX3CR1BII54A12 101 35GS CX3CR1BII54A12 101 CX3CR1BII017 CX3CR1BII54D5 101 35GS CX3CR1BII54D5 101 CX3CR1BII018 CX3CR1BII66B02 101 35GS CX3CR1BII66B02 101 CX3CR1BII019 CX3CR1BII66G01 101 35GS CX3CR1BII66G01 101 CX3CR1BII020 CX3CR1BII54B5 101 35GS CX3CR1BII54B5 101 CX3CR1BII026 CX3CR1BII11H11 9 35GS CX3CR1BII66B02 101 CX3CR1BII027 CX3CR1BII11H11 9 35GS CX3CR1BII54B5 101
Inhibarea de către VHH-urile anti-CX3CR1 ale legării Fractalkinei umane de CX3CR1 umană exprimată pe celulele BA/F3
Inhibarea legării ligandului de CX3CR1 umană a fost examinată pentru diferite formate aşa cum este descris în Exemplul 4. Pentru această caracterizare a fost utilizată linia celulară BA/F3-huCX3CR1 prezentând expresia stabilă a receptorului CX3CR1 umane. Fractalkina lingandă marcată cu alexa647 a fost utilizată în concentraţia sa CE30 şi astfel valorile CI50 obţinute reflectă valorile Ki. Rezumatul datelor obţinute este prezentat în tab. 25.
Eficacitatea formatelor bivalente în concurenţa liganzilor
Tabel 25
ID-ul structurii Linia celulară CI50 (M) % blocării Repetări CX3CR1BII007 CHO-huCX3CR1 3.8 E-10 100 2 CX3CR1BII009 CHO-huCX3CR1 7.0 E-10 91 2 CX3CR1BII012 CHO-huCX3CR1 8.0 E-10 93 1 CX3CR1BII016 HEK293-huCX3CR1 1.9 E-10 102 2 CX3CR1BII017 HEK293-huCX3CR1 3.1 E-10 99 2 CX3CR1BII018 HEK293-huCX3CR1 3.0 E-10 102 2 CX3CR1BII019 HEK293-huCX3CR1 2.9 E-10 100 2 CX3CR1BII020 HEK293-huCX3CR1 2.2 E-10 102 2 CX3CR1BII026 BA/F3-huCX3CR1 7.0 E-10 100 3 CX3CR1BII027 BA/F3-huCX3CR1 6.7 E-10 100 3
Inhibarea de către VHH-urile anti-CX3CR1 a chemotaxiei induse de fractalkina umană a celulelor BA/F3 care supraexprimă CX3CR1 umană
Similar cu ceea ce a fost descris pentru VHH-urile anti-CX3CR1 monovalente, inhibarea chemotaxiei indusă de fractalkină pe celulele BA/F3-huCX3CR1 a fost evaluată pentru structurile bivalente. S-a utilizat o setare identică a testării precum este descris mai sus şi rezultatele obţinute sunt rezumate în tab.26.
Inhibarea chemotaxiei indusă de fractalkină prin structurile bivalente ale VHH-urilor
Tabel 26
ID-ul structurii Linia celulară CI50 (M) % blocării Repetări CX3CR1BII007 BA/F3-huCX3CR1 4 E-9 101 5 CX3CR1BII009 BA/F3-huCX3CR1 2 E-8 79 5 CX3CR1BII012 BA/F3-huCX3CR1 4 E-9 78 1 CX3CR1BII016 BA/F3-huCX3CR1 2 E-9 88 3 CX3CR1BII017 BA/F3-huCX3CR1 3 E-9 89 3 CX3CR1BII018 BA/F3-huCX3CR1 6 E-10 98 6 CX3CR1BII019 BA/F3-huCX3CR1 2 E-9 85 3 CX3CR1BII020 BA/F3-huCX3CR1 2 E-9 85 3 CX3CR1BII026 BA/F3-huCX3CR1 3 E-10 98 1 CX3CR1BII027 BA/F3-huCX3CR1 9 E-10 98 1
Evaluarea reactivităţii încrucişate a VHH-urilor anti-CX3CR1 împotriva CX3CR1 de cynomolgus
De asemenea, pentru structurile bivalente reactivitatea încrucişată faţă de CX3CR1 de cynomologus a fost evaluată şi comparată cu reactivitatea umană. Aşa cum s-a descris anterior, o setare a legării (tab. 27) sau o setare a concurenţei ligande (tab. 28) au fost aplicate cu ajutorul celulelor HEK293T transfectate tranzitorii. Loturi de celule transfectate tranzitorii au fost potrivite după nivelul lor de expresie a receptorilor.
Legarea structurilor bivalente de CX3CR1 umană sau de cynomolgus
Tabel 27
ID-ul structurii Linia celulară CE50 (M) Fiinţă umană CE50 (M) Cynomolgus Raportul Repetări CX3CR1BII007 HEK293T 3.1 E-10 4.8 E-8 154 2 CX3CR1BII009 HEK293T 2.0 E-9 6.8 E-9 3,3 2 CX3CR1BII012 HEK293T 5.6 E-11 6.3 E-11 1,1 1
Concurenţa liganzilor a structurilor bivalente pe CX3CR1 umană sau de cynomolgus
Tabel 28
ID-ul structurii Linia celulară Fiinţă umană Cynomolgus Raportul Repetări CI50 (M) % blocării CI50 (M) % blocării CX3CR1BII016 HEK293T 1.9 E-10 102 6.9 E-10 98 3,67 2 CX3CR1BII017 HEK293T 3.1 E-10 99 1.6 E-9 95 5,34 2 CX3CR1BII018 HEK293T 3.0 E-11 102 1.0 E-10 97 3,33 2 CX3CR1BII019 HEK293T 2.9 E-10 100 8.2 E-10 96 2,86 2 CX3CR1BII020 HEK293T 2.2 E-10 102 3.2 E-10 97 1,47 2
Exemplul 7: Explorarea lungimii linkerului şi extinderea timpului de înjumătăţire
Evaluarea lungimii linkerului şi poziţionareaVHH-ului alb11
Deoarece lungimea linkerului utilizată într-un format bivalent poate avea un impact drastic asupra eficacităţii obţinute, au fost evaluate lungimi diferite ale linkerilor.
În plus, Alb11, un Nanobody care se leagă de albumina serică umană a fost inclus pentru a spori timpul de înjumătăţire in vivo a moleculelor formatate (WO 06/122787 (A1) 2006.11.23). Diferite formate au fost efectuate, inclusiv variaţii asupra lungimilor linkerilor utilizate, dar şi poziţionarea diverselor VHH-uri de compunere. Rezumatul formatelor explorate este prezentat în tab.29.
Tabelul 29 Explorarea extinderii timpului de înjumătăţire şi a lungimii linkerilor
ID-ul structurii Identitatea VHH-ului Linkerul Identitatea VHH-ului Linkerul Identitatea VHH-ului CX3CR1BII032 CX3CR1BII66B02 9GS CX3CR1BII66B02 9GS Alb11 CX3CR1BII034 CX3CR1BII66B02 35GS CX3CR1BII66B02 9GS Alb11 CX3CR1BII036 CX3CR1BII66B02 9GS Alb11 9GS CX3CR1BII66B02 CX3CR1BII040 CX3CR1BII66B02 9GS CX3CR1BII66B02 35GS Alb11 CX3CR1BII041 CX3CR1BII66B02 35GS CX3CR1BII66B02 35GS Alb11 CX3CR1BII042 CX3CR1BII66B02 35GS Alb11 35GS CX3CR1BII66B02
Secvenţele de codificare pentru VHH-ul formatat au fost clonate într-o plasmidă de producţie proprie care permite expresia în Pichia pastoris şi secreţia în mediul de cultivare. Vectorul de expresie a fost obţinut din pPICZA (Invitrogen) şi conţinea promotorul AOX1 pentru expresia indusă de metanol, reglată strict, o genă de rezistenţă pentru Zeocin™, un sit de multiclonare şi semnalul de secreţie α-factor. După transformare culturile de expresie au fost cultivate şi expresia VHH-ului fost indusă prin adăugarea metanolului şi lăsată să continue timp de 48 de ore la 30°C.
Eficacitatea acestor formate diferite a fost evaluată cu ajutorul testului de concurenţă a liganzilor precum este descris mai sus. Observând că concentraţia liganzilor utilizată este sub valoarea CE50, valorile CI50 obţinute sunt echivalente cu valorile Ki. Valorile Ki obţinute pentru diverse formate sunt rezumate în 30.
Eficacitatea formatelor timpului de înjumătăţire extins în concurenţa liganzilor
Tabel 30
ID-ul structurii Linia celulară CI50 (M) % blocării Repetări CX3CR1BII032 BA/F3-huCX3CR1 5.8 E-10 99 2 CX3CR1BII034 BA/F3-huCX3CR1 5.2 E-10 99 2 CX3CR1BII036 BA/F3-huCX3CR1 5.6 E-10 99 2 CX3CR1BII040 BA/F3-huCX3CR1 5.9 E-10 104 1 CX3CR1BII041 BA/F3-huCX3CR1 6.4 E-10 102 1 CX3CR1BII042 BA/F3-huCX3CR1 8.9 E-10 100 1
Impactul albuminei serice umane asupra eficacităţii
Legarea albuminei serice umane (ASU) la VHH alb11 ar putea avea un impact asupra eficacităţii formatului şi astfel concurenţa liganzilor a fost repetată în prezenţa ASU. Pe scurt, pentru a permite legarea ASU de VHH alb11, structurile evaluate şi fractalkina au fost pre-incubate cu ASU timp de 30 de minute înainte de adăugarea la celule. De asemenea, celulele au fost repuse în suspensie în soluţie tampon FACS suplimentată cu ASU. Concentraţia finală de ASU utilizată era de 50 de ori mai mare faţă de cea mai înaltă concentraţie de VHH utilizată. Ulterior, concurenţa a fost lăsată timp de 2 ore şi prelucrarea ulterioară a fost precum s-a descris în exemplul 4.
ID-ul structurii Linia celulară CI50 (M) % blocării Repetări CX3CR1BII032 BA/F3-huCX3CR1 1.4 E-9 100 2 CX3CR1BII034 BA/F3-huCX3CR1 1.3 E-9 100 2 CX3CR1BII036 BA/F3-huCX3CR1 1.4 E-9 100 2
Potenţiala interferenţă a ASU a fost, de asemenea, evaluată într-o setare adaptată a chemotaxiei, inclusiv ASU în diferite compartimente ale testului. Concentraţia ASU folosită a fost din nou de 50 ori mai mare faţă de cea mai înaltă concentraţie de structuri utilizate şi structurile au fost încărcate cu ASU timp de 30 de minute înainte de începerea testului. Soluţia-tampon de testare a fost suplimentată, de asemenea, cu ASU astfel încât ASU este prezentă pe toată durata experimentului. Aşa cum s-a descris mai sus, s-a folosit camera de unică folosinţă ChemoTX cu dimensiunea porilor de 5 µm (Neuroprobe, Gaithersburg, MD, SUA). Celulele au fost recoltate de la o cultură în creştere activă şi spălate înainte de utilizare în mediu de testare, RPMI (Gibco, Carlsbad, SUA) suplimentat cu 0,1% BSA şi 62.5µm ASU (Sigma, A8763). Camera inferioară a fost umplută cu 320 pM de fractalkină umană într-un volum total de 300 µl. După aplicarea membranei, celulele 0.13E6 au fost depuse pe partea superioară a membranei într-un volum total de 70 µl. Chemotaxia a fost lăsată să decurgă timp de 3 ore la 37°C într-o cameră umidificată cu CO2. După această perioadă de incubare, membrana a fost înlăturată şi celulele din camera inferioară au fost repuse în suspensie. Cantitatea de ATP prezentă în godeu a fost determinată cu ajutorul kitului CelITiter-Glo (Promega, Madison WI, SUA). Înregistrarea datelor a fost efectuată pe un aparat Envision (Perkin Elmer, Massachusetts, SUA), cu setările de fabrică standard pentru înregistrarea luminiscenţei. Seriile de titrare au fost realizate în trei exemplare şi fiecare placă, de asemenea, conţinea probe de control în trei exemplare. În calitate de martor, a fost inclusă o probă fără VHH, precum şi o probă în care nu s-a adăugat fractalkină umană în camera inferioară. Valorile CI50 obţinute sunt prezentate în tab.31.
Chemotaxia indusă de fractalkină în prezenţa ASU
Tabel 31
ID-ul structurii Linia celulară CI50 (M) % blocării Repetări CX3CR1BII032 BA/F3-huCX3CR1 6E-10 98 2 CX3CR1BII034 BA/F3-huCX3CR1 9E-10 100 2 CX3CR1BII036 BA/F3-huCX3CR1 6E-10 102 2
Inhibarea internalizării fractalkinei de către polipeptidele bivalente formatate cu timp de înjumătăţire extins
Au fost realizate teste funcţionale suplimentare pentru a demonstra activitatea antagonistă a polipeptidelor bivalente cu timp de înjumătăţire extins. Polipeptidele au fost evaluate în privinţa capacităţii lor de a inhiba internalizarea fractalkinei A647 în celulele CHO huCX3CR1. Pe scurt, celulele 1E4/godeu au fost plasate pe plăci cu 96 de godeuri negre, cu fundul transparent (BD, Franklin Lakes, New Jersey, SUA) şi cultivate timp de o noapte. Celulele au fost spălate o dată şi apoi echilibrate în soluţie-tampon de testare (HBSS cu calciu şi magneziu (Gibco) suplimentat cu 10 mM HEPES şi 0,1% BSA). Structurile de polipeptide formatate au fost adăugate şi plăcile au fost incubate timp de 15 minute la 37°C. Fractalkina A647 a fost apoi adăugată într-o concentraţie finală de 8 nM şi celulele au fost incubate timp de 60 de minute la 37°C. Mediul a fost îndepărtat şi celulele au fost fixate timp de 10 minute cu soluţie de formaldehidă de 3,7% (Polysciences, Warrington, PA, SUA). Celulele au fost clătite o dată cu PBS şi nucleii au fost marcaţi cu colorant Hoechst (Life Technologies, Grand Island, NY, SUA). Pentru a cuantifica Fractalkina marcată internalizată, celulele au fost reprezentate cu ajutorul sistemului BD Pathway Bioimaging. Segmentarea imaginilor a fost realizată prin identificarea nucleului celulei marcat şi desenarea unui inel de 3 pixeli în jurul cadrului respectiv. Intensitatea medie A647 a fost măsurată în inelul citoplasmatic. Polipeptidele formatate au inhibat puternic internalizarea fractalkinei precum s-a rezumat în tab. 32:
Inhibarea internalizării fractalkinei A647
Tabel 32
ID-ul structurii Linia celulară CI50 (M) Repetări CX3CR1BII032 CHO-huCX3CR1 4.0 E-10 5 CX3CR1BII034 CHO-huCX3CR1 7.4 E-10 3 CX3CR1BII036 CHO-huCX3CR1 4.9 E-10 8 CX3CR1BII040 CHO-huCX3CR1 1.0 E-9 3 CX3CR1BII041 CHO-huCX3CR1 1.1 E-9 2 CX3CR1BII042 CHO-huCX3CR1 8.5 E-10 2
O polipeptidă formatată bivalentă anti-CX3CR1 cu timp de înjumătăţire extins este lipsită de activitate agonistă
Pentru a confirma că o polipeptidă bivalentă anti-CX3CR1 cu timp de înjumătăţire extins nu a avut activitate agonistă, s-a evaluat CX3CR1BII036 pentru inducerea influxului de calciu în celule CHO huCX3CR1. Fractalkina a mediat creşterile nivelurilor de calciu citosolic în aceste celule într-o manieră dependentă de CX3CR1 şi CX3CR1BII036 a inhibat acest răspuns.
Celulele CHO huCX3CR1 au fost plasate la 5E4 celule/godeu pe plăci cu 96 de godeuri negre, cu fundul transparent (BD) şi crescute timp de o noapte. Celulele au fost incubate cu colorant Calcium-4/2 mm probenicid (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA) în HBSS suplimentat cu 20 mM HEPES, timp de 60 min la 37°C. Pentru a demonstra antagonismul polipeptidic, CX3CR1BII036 a fost preincubat cu celule timp de 15 minute înainte de adăugarea Fractalkinei la valoarea sa CE80. Mobilizarea calciului a fost monitorizată cu ajutorul unui sistem FLIPR Tetra (Dispozitive moleculare), conform instrucţiunilor producătorului. Pentru determinarea agonismului, nu a existat preincubarea cu polipeptidă şi în schimb, CX3CR1BII036 a fost folosită în loc de stimularea Fractalkinei. În timp ce CX3CR1BII036 a inhibat influxul de calciu mediat de Fractalkină cu CI50 de 1,3 nM, nu s-a observat o creştere a nivelurilor de calciu citosolic atunci când polipeptida s-a adăugat în concentraţii de până la 1 µM.
Exemplul 8: Explorarea formatelor de extindere a timpului de înjumătăţire cu ajutorul Fc de şoarece
Pentru a investiga modalităţi alternative de extindere a timpului de înjumătăţire, domeniul VHH 66B02 a fost produs ca o proteină de fuziune cu un domeniu lgG2a Fc de şoarece (66B02-MFC). Acidul aspartic la mutaţia alanină (D265 A) a fost încorporat în domeniul CH2 pentru a suprima funcţia potenţială efectoare mediată de Fc în această structură (Baudino, J. Immunol., 181, 2008, p. 6664-6669). 66B02-mFc a fost exprimat în celulele HEK293T sau celulele NS0 şi purificate prin cromatografie de afinitate cu Proteina A urmată de cromatografia de schimb de ioni. Această moleculă a fost testată cu privire la activitate utilizând formatele de testare descrise în exemplul 7. Rezultatele au fost rezumate în tab. 33.
Activitatea 66B02-mFc
Tabel 33
Testul Linia celulară CI50 (M) Repetări Concurenţa liganzilor BA/F3-huCX3CR1 5.7 E-10 2 Chemotaxia BA/F3-huCX3CR1 8.9 E-10 3 Internalizarea liganzilor CHO-huCX3CR1 5.2 E-10 5 Influxul de calciu CHO-huCX3CR1 9.8 E-10 5
În timp ce 66B02-mFc a inhibat puternic activarea CX3CR1 mediată de fractalkină, aceasta nu a expus o activitate agonistă. Nu s-a observat o creştere a concentraţiilor de calciu citosolic cu tratarea cu până la 1 µM a acestei molecule.
Exemplul 9: Inhibarea progresiei plăcilor în polipeptidele bivalente cu timpul de înjumătăţire extins ale unui model de ateroscleroză la şoareci
Generarea CX3CR1 umană introdusă în şoareci Apo E -/-
Având în vedere lipsa reactivităţii încrucişate a VHH-urilor identificate pentru CX3CR1 de şoarece (Exemplul 5), o linie de CX3CR1 umană introdusă în şoareci (hu CX3CR1 KI) a fost generată în TaconicArtemis (Koeln, Germania) pentru a permite testarea acestor molecule în modelele de boală la şoareci. O strategie a fost folosită care a permis expresia receptorului chemokinei umane sub controlul promotorului corespunzător de şoarece, în timp ce s-a perturbat expresia proteinei de şoarece endogene. Pe scurt, un vector direcţionat a fost creat, acolo unde regiunea de codificare a CX3CR1 de şoarece în exonul 2 a fost înlocuită cu cadrul de citire deschis al CX3CR1 complet umane şi flancată de markeri de selecţie şi situsuri loxP. Vectorul direcţionat a fost introdus în celulele ES de şoarece şi clonele care au trecut cu succes prin recombinarea omoloagă au fost utilizate pentru a genera şoareci himerici. Aceşti şoareci au fost crescuţi până la şoareci Flp-Deleter foarte eficienţi pentru a atinge îndepărtarea markerului de selecţie şi transmiterea liniei de germeni. Şoarecii obţinuţi cu hu CX3CR1 KI pe un fundal C57BL/6 au fost apoi încrucişaţi cu şoarecii Apo E -/- (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, SUA) pentru a genera şoareci cu hu CX3CR1 KI Apo E-/-. Modelul de şoareci Apo E-/- oferă o metodă robustă pentru a provoca formarea plăcii aterosclerotice extensive care este extrem de similară cu boala umană în ce priveşte localizarea specifică situsului a formării plăcilor, compoziţiei histologice, şi factorilor de risc cunoscuţi (colesterol, inflamaţie , hipertensiune, etc.).
Evaluarea polipeptidelor bivalente cu timp de înjumătăţire extins anti-CX3CR1 în modelul de ateroscleroză la şoarecii Apo E-/-
Şoarecii-femele hu CX3CR1KI ApoE-/- au fost hrăniţi cu o dietă cu un conţinut bogat de grăsimi/colesterol conţinând 1,5% colesterol timp de 16 săptămâni începând de la vârsta de patru săptămâni. Dupa 10 săptămâni, animalelor li s-a administrat prin purtător de injecţie i.p. (20 mM NaCitrate pH 6.0, 115 mM NaCl), 10 mg/kg 66B02-MFC o dată sau de două ori pe săptămână sau 30 mg/kg CX3CR1BII036 de două ori pe săptămână timp de 6 săptămâni. Animalele au fost anesteziate prin anestezie cu gaz şi li s-a introdus soluţie salină de 0,9%. Aorta descendentă spre bifurcaţia iliacă a fost îndepărtată cu grijă şi fixată în formol. Apoi aceasta a fost deschisă longitudinal, şi colorată cu Sudan IV timp de 15 minute, urmată de metanol de 70% timp de 2 minute. Vasele au fost spălate sub jet de apă şi acoperite cu PBS. Ţesuturile au fost fotografiate cu un aparat de fotografiat digital utilizând software SPOT Advanced (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI, SUA). Procentajul colorării lipidice a fost determinat cu software de analiză a imaginilor (Image-Pro Plus, MediaCybernetics, Rockville, MD, SUA) şi exprimat ca o colorare pozitivă a procentajului vasului. Rezultatele din acest studiu sunt rezumate în tab. 34.
Cuantificarea dimensiunii plăcilor în aorta descendentă în femelele de şoareci hu CX3CR1 KI Apo E -/-
Tabel 34
Grupul Doza # animalelor % suprafeţei plăcilor % reducerii în suprafaţa plăcilor Martor (10 săptămâni) N/A 6 3,4 N/A Martor (16 săptămâni) Purtător 17 14,8 N/A 66B02-mFc 10 mg/kg (1x/ună) 17 13,0 16 66B02-mFc 10 mg/kg (2x/lună) 17 10,3 39 (p<0.05) CX3CR1BII036 30 mg/kg (2x/lună) 17 10,1 41 (p<0.05)
Atât 66B02-mFc, cât şi CX3CR1BII036 au inhibat semnificativ progresia plăcilor la administrarea de două ori pe săptămână. Aceasta a corelat cu acoperirea deoarece concentraţiile plasmatice ale acestor molecule ar putea fi confirmate pentru a fi menţinute pe toată durata studiului. Pentru administrarea o dată pe săptămână a 66B02-MFC, concentraţiile plasmatice detectabile nu au fost menţinute şi aceasta a corelat cu lipsa eficacităţii semnificative observată după 6 săptămâni de tratament. Nicio moleculă nu a afectat semnificativ concentraţiile de colesterol plasmatic sau trigliceride.
Exemplul 10: Optimizarea secvenţelor ale VHH-ului parental
În general, în timpul optimizării secvenţionale a VHH-ului, secvenţele parentale ale VHH-ului de tip sălbatic sunt mutate pentru a obţine secvenţe VHH care sunt mai identice cu secvenţele de consens ale liniilor de germeni ale VH3-JH umane. Aminoacizii specifici în regiunile cadru care diferă între VHH şi consensul liniei de germeni ale VH3-JH umane sunt modificate în omologul uman în aşa fel încât structura proteinelor, activitatea şi stabilitatea sunt păstrate intacte. Pentru a investiga acest lucru, toate variantele de optimizare secvenţională au fost comparate cu VHH-ul parental în trei teste diferite: (i) determinarea temperaturii de topire (Tm) într-un test Thermal Shift Assay (TSA), (ii) analiza potenţei in vitro în FACS de concurenţă a fractalkinei, şi pentru unele structuri (iii) analiza potenţei in vitro în testul chemotaxiei induse de fractalkină.
Mutaţia reziduurilor cadru
Pentru optimizarea secvenţelor, următoarele mutaţii au fost examinate: E1D, S11L, A14P, E16G, R44Q, D46E, A74S, K83R şi Q108L. Mutanţii individuali care au fost generaţi în secvenţa parentală a CX3CR1BII66B02 sunt descrişi în tab. 35.
Mutaţiile examinate în timpul optimizării secvenţelor 66B02
Tabel 35
Numărul clonei Mutaţiile introduse C100CX3CR1BII043 A14P,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII045 E1D,A14P,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII047 S11L,A14P,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII048 A14P,E16G,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII049 A14P,R44Q,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII050 A14P,D46E,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII061 S11L,A14P,E16G,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII056 S11L,A14P,E16G,R44Q,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII057 S11L,A14P,E16G,D46E,A74S,K83R,Q108L C100CX3CR1BII060 S11L,A14P,E16G,R44Q,D46E,A74S,K83R,Q108L
Toate structurile au fost clonate într-un vector de expresie E. coli, şi exprimate în E. coli ca proteine marcate myc/His într-un volum de cultură de 0,25L până la 0.5L mediu TB. Expresia a fost indusă prin adăugarea a 1mM IPTG şi lăsată să continue timp de 4 ore la 37°C şi 250 rpm. Celulele au fost peletate, şi extractele periplasmice au fost preparate prin congelare-decongelare şi repunere în suspensie în dPBS. Aceste extracte au fost utilizate ca materie primă pentru cromatografia de afinitate cu ioni metalici imobilizaţi (IMAC) cu ajutorul coloanelor brute HisTrap FF (GE healthcare). Nanocorpii au fost eluaţi din coloană cu 250mM imidazol şi ulterior desalinizaţi spre dPBS. Puritatea şi integritatea Nanocorpilor a fost verificată prin reducerea SDS-PAGE.
După cum s-a rezumat în tab. 36, mutaţiile A14P, A74S, K83R şi Q108L n-au avut un efect clar asupra eficacităţii determinată prin analiza FACS de concurenţă. În mod similar, mutaţiile suplimentare E1D, S11L şi E16G n-au afectat eficacitatea. Introducerea a R44Q sau D46E, pe de altă parte, a dus la o scădere semnificativă a eficacităţii care a fost şi mai pronunţată, în cazul în care ambele mutaţii au fost introduse.
Eficacitatea structurilor optimizării secvenţelor determinată prin FACS de concurenţă a liganzilor
Tabel 36
Numărul clonei CI50 % blocării Tm la pH7 CX3CR1BII66B02 2.6E-09 101,0 65,66 C100CX3CR1BII043 2.2E-09 101 66,49 C100CX3CR1BII045 2.2E-09 101,2 66,07 C100CX3CR1BII047 2.3E-09 101,2 66,49 C100CX3CR1BII048 1.9E-09 101,2 67,74 C100CX3CR1BII049 1.8E-08 101,2 66,07 C100CX3CR1BII050 1.7E-08 101,1 71,90 C100CX3CR1BII061 1.4E-09 98,9 68,57 C100CX3CR1BII056 1.6E-08 101,1 68,57 C100CX3CR1BII057 1.4E-08 99,4 74,39 C100CX3CR1BII060 1.9E-07 98,4 74,81
De asemenea, a fost evaluată temperatura de topire, predictivă pentru stabilitatea VHH-ului. Majoritatea mutaţiilor individuale s-au limitat la nici un efect, cu excepţia mutaţiei D46E care a crescut temperatura de topire cu aproximativ 6°C. Introducerea mutaţiilor combinate a sporit, de asemenea, stabilitatea termică, cfr 057 şi 060.
Datorită efectelor majore asupra eficacităţii în analiza FACS de concurenţă a liganzilor, mutaţiile R44Q şi D46E nu au fost incluse în secvenţa finală.
Mutaţia reziduurilor CDR
Pe baza analizei in silico a secvenţei parentale, un situs de glicozilare a fost estimat la poziţia 52. Prin urmare, au fost create două bănci; una pentru poziţia 52 şi una pentru poziţia 53, care a fost destinată pentru a include toţi aminoacizii posibili la poziţia respectivă. Băncile au fost examinate ca extracte periplasmice într-un FACS de concurenţă a liganzilor. În primul rând, o serie de diluţii a fost efectuată din material periplasmic din secvenţa parentală şi trei diluţii au fost selectate pentru examinarea ulterioară. Un prim punct de diluţie (dublu) a fost ales pentru a oferi blocare integrală a interacţiunii liganzilor, în timp ce celelalte două puncte de diluţie (de 128 şi 512 de ori) ar trebui să rezulte într-o blocare de 70% şi, respectiv, 40%. După producerea extractelor periplasmice din bancă, toate probele au fost împărţite în două şi una dintre ele a fost supusă unui tratament termic. Atât probele netratate, cât şi cele tratate termic au fost ulterior analizate în FACS de concurenţă a liganzilor la cele trei puncte de diluţie. Impactul mutaţiei poate fi estimat prin compararea blocării obţinute cu cea din secvenţa parentală. Analiza probelor tratate termic oferă o măsură pentru un impact potenţial asupra stabilităţii mutaţiei.
Pe baza rezultatelor iniţiale ale examinării, şapte mutaţii au fost selectate pentru caracterizarea ulterioară. Eficacitatea obţinută în FACS de concurenţă a liganzilor este prezentată în tab.37.
Înlăturarea situsului de glicozilare în poziţia 52
Tabel 37
Structura CI50 (M) % blocării Tm la pH7 C100CX3CR1BII66B02 2.5E-09 98,0 65,66 CX3CR1BII66B02 (N52S, Q108L) 1.7E-09 98,0 66,07 CX3CR1BII66B02 (N52Q, Q108L) 2.1E-09 97,9 59,83 CX3CR1BII66B02 (N52G, Q108L) 1.1E-09 98,0 59,83 CX3CR1BII66B02 (N52T, Q108L) 2.8E-09 98,0 66,07 CX3CR1BII66B02 (S53T, Q108L) 1.3E-09 98,1 66,07 CX3CR1BII66B02 (S53G, Q108L) 1.2E-09 98,3 64,83 CX3CR1BII66B02 (S53P, Q108L) 8.0E-10 98,2 66,91
Din această analiză, alinierea secvenţelor cu secvenţa de referinţă umană şi pe baza unui program de prezicere-recunoaştere a epitopilor celulelor T in silico, s-a decis includerea mutaţiilor N52S şi S53T în secvenţă.
Din motive de stabilitate s-a creat o bancă suplimentară pentru poziţia 32. Examinarea concurenţei liganzilor a fost efectuată într-un mod similar precum s-a descris mai sus. Din nou trei diluţii de extracte periplasmice au fost examinate şi blocarea procentuală obţinută a fost comparată cu cea obţinută pentru secvenţa parentală. În urma analizei diverşilor mutanţi, substituirea N32T a fost aleasă şi inclusă în varianta finală optimizată a secvenţei.
Exemplul 11: Analiza variantelor optimizate
În runda finală de caracterizare, structurile enumerate în 38 au fost caracterizate.
Variantele secvenţelor optimizate ale VHH-ului principal 66B02
Tabel 38
Numărul clonei Mutaţia introdusă SECV ID Nr.: CX3CR1BII00306 CX3CR1BII66B02(E1D,S11L,A14P,E16G,N32T,N52S,A74S,K83R,Q108L) 138 CX3CR1BII00307 CX3CR1BII66B02(E1D,S11L,A14P,E16G,N32T,N52S,S53T,A74S,K83R,Q108L) 139 CX3CR1BII00308 CX3CR1BII66B02(E1D,S11L,A14P,E16G,A74S,K83R,Q108L) 140 CX3CR1BII00312 CX3CR1BII66B02(E1D,S11L,A14P,E16G,N32T,N52S,A74S,K83R,Q108L)-9GS-Alb11-9GS-CX3CR1BII66B02(S11L,A14P,E16G,N32T,N52S,A74S,K83R,Q108L) 225 CX3CR1BII00313 CX3CR1BII66B02(E1D,S11L,A14P,E16G,N32T,N52S,S53T,A74S,K83R,Q108L)-9GS-Alb11-9GS-CX3CR1BII66B02(S11L,A14P,E16G,N32T,N52S,S53T,A74S,K86R,Q113L) 226 CX3CR1BII00314 CX3CR1BII66B02(E1D,S11L,A14P,E16G,A74S,K83R,Q108L)-9GS-Alb11-9GS-CX3CR1BII66B02(S11L,A14P,E16G,A74S,K83R,Q108L) 227
Un experiment al analizei FACS de concurenţă a fost efectuat după cum s-a descris mai sus, precum şi o determinare a temperaturii de topire. Valorile obţinute sunt reprezentate în tab. 39.
FACS de concurenţă şi Tm a variantelor optimizate ale secvenţelor
Tabel 39
Structura CI50 (M) % blocării Tm la pH7 C100CX3CR1BII66B02 2.5E-09 98,0 65,05 CX3CR1BII00306 1.7E-09 97,0 68,54 CX3CR1BII00307 1.9E-09 97,0 68,13 CX3CR1BII00308 1.6E-09 97,0 68,13 CX3CR1BII00312 4.6E-10 100,0 59,37 CX3CR1BII00313 4.0E-10 100,0 58,88 CX3CR1BII00314 6.5E-10 100,0 58,40
Aceste structuri au fost, de asemenea, caracterizate în chemotaxia indusă de fractalkină precum s-a descris mai sus (tab. 40).
Chemotaxia indusă de liganzi cu variante optimizate ale secvenţelor
Tabel 40
Structura CI50 (M) % blocării n C100CX3CR1BII66B02 3.6E-08 91 3 CX3CR1BII00306 6.3E-08 95 2 CX3CR1BII00307 6.3E-08 100 2 CX3CR1BII00308 4.4E-08 89 2 CX3CR1BII00312 2.7E-09 99 3 CX3CR1BII00313 2.7E-09 99 3 CX3CR1BII00314 3.6E-09 100 3
Structurile selectate au fost evaluate pentru inhibarea internalizării induse de A647-Fractalkină în celulele CHO huCX3CR1. Rezultatele au fost rezumate în tab. 41.
Internalizarea indusă de liganzi cu variante optimizate ale secvenţelor
Tabel 41
Structura CI50 (M) n CX3CR1BII00312 5.5 E-10 1 CX3CR1BII00313 3.3E-10 6
O polipeptidă optimizată secvenţial anti-CX3CR1 cu timp de înjumătăţire extins este lipsită de activitate agonistă
Pentru a confirma că polipeptida optimizată secvenţial anti-CX3CR1 cu timp de înjumătăţire extins nu are activitate agonistă, s-a evaluat CX3CR1BII036 pentru inducerea influxului de calciu în celulele CHO huCX3CR1. În timp ce preincubarea cu CX3CR1BII036 a inhibat influxul de calciu mediat de Fractalkină cu CI50 de 1,3 nM, nu s-a observat o creştere a concentraţiilor de calciu citosolic atunci când polipeptida s-a adăugat în concentraţii de până la 1µM.
Exemplul 12: Explorarea formatelor de extindere a timpului de înjumătăţire cu ajutorul Fc uman
Pentru a analiza modalităţi suplimentare de extindere a timpului de înjumătăţire, domeniile VHH cu secvenţe optimizate CX3CR1BII00306 şi CX3CR1BII00307 au fost produse ca proteine de fuziune cu un domeniu uman IgG1 Fc (306D-hFc şi 307D-hFc). Două mutaţii au fost incorporate în domeniul CH2 pentru a suprima funcţia potenţială efectoare mediată de Fc în această structură. 306D-hFc şi 307D-hFc au fost exprimate în celulele HEK293T sau celulele NS0 şi purificate prin cromatografia de afinitate cu Proteina A urmată de cromatografia cu schimb de ioni. Aceste molecule au fost testate cu privire la activitatea funcţională cu ajutorul formatelor de testare descrise în Exemplul 7. Rezultatele au fost rezumate în tab. 42.
Activitatea proteinelor de fuziune hFc
Tabel 42
Testul Linia celulară 306D-hFc CI50 Repetări 306D-hFc 307D-hFc CI50 Repetări 307D-hFc Concurenţa liganzilor BA/F3-huCX3CR1 6.9 E-10 2 7.0 E-10 2 Chemotaxia BA/F3-huCX3CR1 2.9 E-9 2 3.0 E-9 3 Internalizarea liganzilor CHO-huCX3CR1 4.8 E-10 3 3.7 E-10 3 Influxul de calciu CHO-huCX3CR1 1.3 E-9 3 3.2 E-9 3
În timp ce aceste molecule au inhibat puternic activarea CX3CR1 mediată de fractalkină, ele nu au manifestat o activitate agonistă. Nu au fost observate creşteri ale concentraţiilor de calciu citosolic în timpul tratamentului cu până la 1 µM de aceşti Nanocorpi.
Exemplul 13: Inhibarea progresiei plăcilor într-un model de ateroscleroză la şoareci printr-un Nanocorp anti-CX3CR1 cu secvenţe optimizate
Şoarecii femele hu CX3CR1KI ApoE-/- au fost hrăniţi cu o dietă cu un conţinut bogat de grăsimi/colesterol conţinând 1,5% colesterol timp de 16 săptămâni începând de la vârsta de patru săptămâni. Dupa 10 săptămâni, animalelor li s-a administrat prin purtător de injecţie i.p. (20 mM NaCitrate pH 6.0, 115 mM NaCl), 30 mg/kg CX3CR1BII00313 o dată sau de două ori pe săptămână sau 30 mg/kg CX3CR1BII036 de două ori pe săptămână timp de 6 săptămâni. Animalele au fost sacrificate şi procentajul suprafeţei plăcilor în aorta descendentă a fost cuantificat precum s-a descris mai sus. Rezultatele din acest studiu au fost rezumate în tab. 43.
Cuantificarea dimensiunii plăcilor în aorta descendentă în şoarecii femele hu CX3CR1 KI Apo E -/-
Tabel 43
Grupul Doza # animalelor % suprafeţei plăcilor % reducerii în suprafaţa plăcilor Martor (10 săptămâni) N/A 6 2,1 N/A Martor (16 săptămâni) Purtător 18 12,0 neaplicabil CX3CR1BII00313 30 mg/kg (1x/ună) 17 10,7 13 CX3CR1BII00313 30 mg/kg (2x/lună 18 5,9 62 (p<0.01) CX3CR1BII036 30 mg/kg (2x/lună) 17 6,8 52 (p<0.01)
Atât CX3CR1BII00313, cât şi CX3CR1BII036 au inhibat semnificativ progresia plăcilor la administrarea de două ori pe săptămână. Aceasta a corelat cu acoperirea deoarece concentraţiile plasmatice ale acestor molecule ar putea fi confirmate pentru a fi menţinute pe toată durata studiului. Pentru administrarea o dată pe săptămână a CX3CR1BII00313, concentraţiile plasmatice detectabile nu au fost menţinute şi aceasta a corelat cu lipsa eficacităţii semnificative observată după 6 săptămâni de tratament. Nici o moleculă nu a afectat semnificativ concentraţiile plasmatice de colesterol sau trigliceride.
Exemplul 14: Legarea nanocorpilor la celulele primare umane şi de maimuţă cynomolgus CD14+ în sângele integral
FACS de concurenţă cu Nanocorp formatat cu secvenţe optimizate anti-CX3CR1
Pentru a confirma legarea Nanocorpului formatat cu secvenţe optimizate anti-CX3CR1 la celulele primare umane, CX3CR1BII00313 s-a dovedit că concurează pentru legarea CX3CR1BII018 (A647-018) marcată A647 la celulele CD14+ într-un test FACS de concurenţă în sângele integral. Pe scurt, un anticorp de şoarece anti-uman CD14 conjugat cu eFluor 450 (eBioscience, San Diego, CA, SUA) a fost diluat 1:10 în sângele integral tratat cu EDTA de la un donator uman sănătos. S-a adăugat 40 µl/godeu pe o placă cu fund rotund din polistiren cu 96 de godeuri, apoi 10 µl/godeu de CX3CR1BII00313 diluat în soluţie tampon de colorant cu BSA (BD Pharmingen) la o concentraţie finală cuprinsă între 100 nM şi 0,002 pM şi probele au fost incubate timp de 20 minute la temperatura camerei. 10 µl/godeu de A647-018 în soluţie tampon de colorant s-a adăugat apoi pentru a se obţine o concentraţie finală de 1 nM (CE80 a legării A647-018) şi probele au fost incubate timp de încă 20 minute la temperatura camerei. Apoi s-a adăugat 220 µl/godeu de soluţie 1-Step Fix/Lyse (eBioscience). După incubarea la temperatura camerei timp de 10 minute celulele au fost granulate, spălate de două ori în soluţie tampon de colorant şi repuse în suspensie în această soluţie. Probele au fost analizate cu ajutorul unui citometru de flux BD LSR II. Intensitaftea medie a fluorescenţei pentru AlexaFluor 647 a fost cuantificată pentru populaţia de celule pozitive CD14. CX3CR1BII00313 a inhibat puternic legarea A647-018 la celulele pozitive CD14 în sângele uman cu CI50 de 0,35 nM (n=8).
Pentru a confirma legarea Nanocorpului formatat cu secvenţe optimizate anti-CX3CR1 la celulele primare de maimuţă cynomolgus, CX3CR1BII00313 s-a dovedit că concurează pentru legarea CX3CR1BII018 (A647-018) marcată A647 la celulele CD14+ într-un test FACS de concurenţă în sângele integral de maimuţă cynomolgus. Metoda utilizată a fost analoagă cu cea descrisă mai sus, cu excepţia faptului că concentraţia finală a A647-018 a fost de 3 nM (CE80 a legării A647-018) şi soluţia tampon de lizare ACK (Life Technologies) a fost utilizată în loc de soluţia 1-Step Fix/Lyse. Celulele au fost repuse în suspensie în soluţia-tampon de colorant suplimentată cu formaldehidă 1% înainte de analiză. CX3CR1BII00313 a inhibat puternic legarea A647-018 la celulele pozitive CD14 în sângele de maimuţă cynomolgus cu CI50 de 0,43 nM (n=4).
Exemplul 15: Farmacocinetica (PK) în maimuţe cynomolgus
Un studiu farmacocinetic a fost realizat în masculi de maimuţe cynomolgus (Macaca fascicularis), nesupuşi anterior experimentelor, cu vârsta de 2 -5 ani cu masa corporală variind între 2,4 - 3,5 kg. Maimuţele au fost împărţite în patru grupe de tratament. Grupa 1 (n=3) a primit 0,2 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v.; Grupa 2 (n=3) a primit 2 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v.; Grupa 3 (n=3) a primit 2 mg/kg de CX3CR1BII00313 s.c. şi Grupa 4 (n=3) a primit 5 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v. CX3CR1BII00313 a fost administrată ca o soluţie de 2 mg/ml în soluţie-tampon de citrat (20 mM citrat de sodiu/115 mM clorură de sodiu, pH 6.0). Probele de sânge au fost colectate timp de 6 săptămâni dintr-o venă periferică în tuburi separatoare cu ser pentru analiza PK.
Probele de ser au fost analizate cu ajutorul unui format MSD (Meso Scale Discovery). Pe scurt, un anticorp anti-Nanocorp biotinilat a fost legat de o placă standard cu streptavidină MSD (Meso Scale Discovery, Rockville, MD, SUA). Plăcile au fost spălate cu Tween 20 de 0,05% în soluţie salină tamponată cu fosfat şi blocate cu SeraCare BSA (SeraCare Life Sciences, Milford, MA, SUA) de 5% g/v înainte de incubare cu probele de ser. CX3CR1BII00313 a fost detectată cu ajutorul unui Nanocorp anti-Nanocorp marcat cu sulfo şi plăcile au fost analizate cu un Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Concentraţiile variabile ale CX3CR1BII0313 de la 5000 până la 0,5 ng/ml în ser de maimuţă de 5% au fost utilizate ca standarde. Atingerea ţintei a fost evaluată prin nivelurile de monitorizare a CX3CR1 libere pe monocitele dependente CD14+. Acest test a fost analog cu testul de concurenţă FACS rezumat în Exemplul 14, cu excepţia faptului că nu s-a adăugat CX3CR1BII00313 suplimentară. Probele de ser au fost, de asemenea, monitorizate referitor la prezenţa anticorpilor anti-umani ale primatelor (PAHA), deoarece aceştia pot avea un impact asupra evaluării PK şi CX3CR libere.
ForteBio RED96 a fost utilizat pentru detectarea PAHA. Pe scurt, CX3CR1BII0313 biotinilată a fost capturată pe senzori de streptavidină. Apoi s-a utilizat ser de maimuţă amestecat, netratat anterior, în calitate de martor negativ pentru a calcula valoarea-limită (definită ca o valoare dublă peste semnalul mediu de legare a serurilor netratate anterior). Toate probele de ser au fost diluate de 20 de ori în soluţie-tampon şi răspunsul PAHA a fost determinat ca fiind pozitiv în cazul în care semnalul de legare era mai mare decât valoarea-limită.
Datele pentru intervalele de timp după detectarea PAHA au fost excluse din analiza PK/PD. Datele PK sunt rezumate în tab. 44 de mai jos.
Parametrii farmacocinetici ai CX3CR1BII00313
Tabel 44
Doza (mg/kg) CL (ml/zi/kg) T1/2 (zi) MRT (zi) Doza normalizată AUC(0-14d) (nM·d) F% IV 0.2 113 1 1 ** IV 2.0 9 ± 1 9 ± 2 8 ± 2 56530 IV 5.0 ** ** ** 58604 SC 2.0 54
**date insuficiente pentru caracterizarea fazei terminale
Clearance-ul şi timpul de înjumătăţire la 2,0 mg/kg i/v au fost 9,4 ml/d/kg şi, respectiv, 9,6 zile. La 0,2 mg/kg i/v, clearance-ul a fost semnificativ mai înalt (113 ml/d/kg), corespunzător farmacocineticii distribuţiei saturabile mediată de ţintă (TMD). AUC(0-14d) ajustat dozei era comparabil între dozele de 2 şi 5 mg/kg i/v sugerând saturaţia TMD la doza de 2 mg/kg. Expunerea la 2 săptămâni după administrarea intraventriculară sau subcutanată a nanocorpilor a fost > 70 nM şi biodisponibilitatea după administrarea subcutanată era de 54%. Receptorul liber urmărit cu expunere cu acoperirea ţintei mai mare de 90% s-a menţinut la expuneri > 10 nM.
1. David H. McDermott, Julian P.J. Halcox, William H. Schenke, Myron A. Waclawiw, Maya N. Merrell, Neal Epstein, Arshed A. Quyyumi and Philip M. Murphy. Association Between Polymorphism in the Chemokine Receptor CX3CR1 and Coronary Vascular Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis. Circulation Research, 2001, volume 89(5), p. 401-407.
2. McDermott D.H., Fong A.M., Yang Q., Sechler J.M., Cupples L.A., Merrell M.N., Wilson P.W., D'Agostino R.B., O'Donnell C.J., Patel D.D., Murphy P.M. Chemokine receptor mutant CX3CR1-M280 has impaired adhesive function and correlates with protection from cardiovascular disease in humans. J. Clin. Invest. 2003 , 111(8), p. 1241-50.
3. Giorgio Ghilardi, MD; Maria Luisa Biondi, MD; Olivia Turri, PhD; Emma Guagnellini, MD; Roberto Scorza, MD. Internal Carotid Artery Occlusive Disease and Polymorphisms of Fractalkine Receptor CX3CR1 A Genetic Risk Factor. Stroke Journal. 2004, 35, p. 1276-1279.
4. Wong B.W., Wong D., McManus B.M. Characterization of fractalkine (CX3CL1) and CX3CR1 in human coronary arteries with native atherosclerosis, diabetes mellitus, and transplant vascular disease. Cardiovasc. Pathol. 2002, 11, p. 332-338.
5. Lesnik P., Haskell C.A., Charo I.F. Decreased atherosclerosis in CX3CR1-/- mice reveals a role for fractalkine in atherogenesis. J. Clin. Invest., 2003 Feb,111(3), p. 333-340.

Claims (37)

1. Polipeptidă care cuprinde un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 menţionat constă, în principal, din patru regiuni-cadru (FR1, FR2, FR3 şi FR4) şi trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR1, CDR2 şi CDR3) şi unde CDR3 menţionată are secvenţa de aminoacizi Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr (SECV ID nr.: 186) şi unde polipeptida menţionată cuprinde o regiune CDR1, CDR2 şi CDR3, care are secvenţele de aminoacizi prezentate în: - SECV ID Nr.: 213, 221 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 164 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 166 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 167 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 213, 214 şi, respectiv, 186.
2. Polipeptidă conform revendicării 1, unde polipeptida cuprinde o regiune CDR1, CDR2 şi CDR3 care are secvenţele de aminoacizi prezentate în: SECV ID Nr.: 141, 164 şi, respectiv, 186, SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv, 186, SECV ID Nr.: 213, 214 şi, respectiv, 186, sau SECV ID Nr.: 213, 221 şi, respectiv, 186.
3. Polipeptidă conform oricăreia dintre revendicările 1 şi 2, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1 este un domeniu VHH, care cuprinde o secvenţă a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 1, 3-5, 7, 9, 10, 13, 19, 21, 23, 24, 121-130, 138-140 şi 222-224.
4. Polipeptidă conform revendicării 1, unde polipeptida cuprinde suplimentar o porţiune de extindere a timpului de înjumătăţire.
5. Polipeptidă conform revendicării 4, unde porşiunea respectivă de extindere a timpului de înjumătăţire este legată covalent de polipeptida respectivă şi este selectată din grupul ce constă dintr-o porţiune de legare a albuminei, cum ar fi un domeniu imunoglobulinic anti-albumină, o porţiune de legare a transferinei, cum ar fi un domeniu imunoglobulinic anti-transferină, o moleculă de polietilenglicol, o moleculă de polietilenglicol recombinant, albumină serică umană, un fragment de albumină serică umană, o peptidă de legare a albuminei sau un domeniu Fc.
6. Polipeptidă conform revendicării 4 sau 5, unde porţiunea respectivă de extindere a timpului de înjumătăţire constă dintr-un domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-albumină.
7. Polipeptidă conform revendicării 6, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic este selectat dintr-un domeniu VHH, un domeniu VHH umanizat, un domeniu VH camelizat, un anticorp domeniu, un anticorp domeniu unic şi/sau "dAb"s.
8. Polipeptidă conform revendicării 7, unde domeniul variabil unic imunoglobulinic anti-albumină cuprinde o secvenţă selectată dintre oricare din SECV ID Nr.: 230-232.
9. Polipeptidă conform revendicării 1, unde polipeptida respectivă cuprinde suplimentar un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic.
10. Polipeptidă conform revendicării 9, unde cel de-al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat cuprinde un al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic anti-CX3CR1.
11. Polipeptidă conform revendicării 9, unde cel de-al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionat cuprinde CDR1, CDR2 şi CDR3, care are secvenţele de aminoacizi prezentate în: - SECV ID Nr.: 213, 221 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 164 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 166 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 141, 167 şi, respectiv, 186; sau - SECV ID Nr.: 213, 214 şi, respectiv, 186.
12. Polipeptidă conform revendicării 11, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionate cuprind aceleaşi CDR1, CDR2 şi CDR3.
13. Polipeptidă conform revendicării 12, unde primul şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic menţionate cuprind un domeniu VHH, care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 1, 3-5, 7, 9, 10, 13, 19, 21, 23, 24, 121-130, 138-140 sau 222-224.
14. Polipeptidă, care cuprinde un prim domeniu variabil unic imunoglobulinic şi al doilea domeniu variabil unic imunoglobulinic, fiecare cuprinzând CDR1, CDR2 şi CDR3 având secvenţele de aminoacizi prezentate în SECV ID Nr.: 141, 164 şi, respectiv 186, , SECV ID Nr.: 141, 162 şi, respectiv 186, SECV ID Nr.: 213, 214 şi, respectiv 186, sau SECV ID Nr.: 213, 221 şi, respectiv 186.
15. Polipeptidă, care cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SECV ID Nr.: 225-227 sau 257-262.
16. Polipeptidă, conform revendicării 15, care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 225.
17. Polipeptidă, conform revendicării 15, care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 226.
18. Polipeptidă, conform revendicării 15, care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 227.
19. Polipeptidă, conform revendicării 15, care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 258.
20. Polipeptidă, conform revendicării 15, care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.: 261.
21. Moleculă de acid nucleic, care codifică o polipeptidă conform oricăreia dintre revendicările 1-20.
22. Vector de expresie, care cuprinde o moleculă de acid nucleic conform revendicării 21.
23. Celulă-gazdă, care cuprinde o moleculă de acid nucleic ce codifică polipeptida conform oricăreia dintre revendicările 1-20, unde celula gazdă respectivă este capabilă să exprime polipeptida menţionată.
24. Compoziţie farmaceutică pentru tratamentul bolilor, afecţiunilor sau stărilor asociate cu CX3CR1, care cuprinde o polipeptidă conform oricăreia dintre revendicările 1-20 şi un purtător acceptabil farmaceutic, şi opţional un diluant, excipient, adjuvant şi/sau stabilizator.
25. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 24, care cuprinde o polipeptidă conform revendicării 16.
26. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 24, care cuprinde o polipeptidă conform revendicării 17.
27. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 24, care cuprinde o polipeptidă conform revendicării 18.
28. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 24, care cuprinde o polipeptidă conform revendicării 19.
29. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 24, care cuprinde o polipeptidă conform revendicării 20.
30. Compoziţie farmaceutică conform uneia dintre revendicării 24-29, unde compoziţia farmaceutică respectivă este adecvată pentru injectarea intravenoasă sau subcutanată unui om.
31. Procedeu de fabricare a unei polipeptide conform oricăreia dintre revendicările 1-20, care cuprinde etapele de cultivare a unei celule-gazdă în condiţii care permit expresia unei polipeptide conform oricăreia dintre revendicările 1- 20; celula-gazdă respectivă poartă un vector de expresie, care cuprinde o moleculă de acid nucleic, unde molecula dată de acid nucleic cuprinde o regiune care codifică polipeptida conform uneia dintre revendicările 1-20, iar celula-gazdă este o celulă procariotă sau eucariotă.
32. Procedeu, conform revendicării 31, care cuprinde suplimentar etapele de - extragere a polipeptidei menţionate; şi - purificare a polipeptidei menţionate.
33. Polipeptidă conform uneia dintre revendicările 1-20 pentru utilizarea în tratamentul, prevenirea sau atenuarea unei boli, afecţiuni sau stări asociate cu CX3CR1.
34. Polipeptidă pentru utilizare conform revendicării 33, unde boala, afecţiunea sau starea este selectată dintre afecţiunile cardio- şi cerebrovasculare aterosclerotice, boala arterială periferică, restenoză, nefropatie diabetică, glomerulonefrită, glomerulonefrită crescentică umană, nefropatie IgA, nefropatie membranoasă, nefrită lupică, vasculită ce include purpura Henoch-Schonlein şi granulomatoză Wegener, artrită reumatoidă, osteoartrită, rejetul alogrefei, scleroza sistemică, afecţiunile neurodegenerative şi boala demielinizantă, scleroza multiplă (SM), boala Alzheimer, bolile pulmonare, cum ar fi BPOC, astm, durerea neuropatică, durerea inflamatorie, sau cancer.
35. Polipeptidă pentru utilizare conform revendicării 33, unde boala este ateroscleroza.
36. Kit de diagnosticare a bolilor, afecţiunilor sau stărilor asociate cu CX3CR1, care cuprinde o polipeptidă conform oricăreia dintre revendicările 1-20.
37. Kit de diagnosticare conform revendicării 36, pentru diagnosticarea cel puţin a uneia dintre afecţiunile cardio şi cerebrovasculare aterosclerotice, boala arterială periferică, restenoză, nefropatie diabetică, glomerulonefrită, glomerulonefrită crescentică umană, nefropatie IgA, nefropatie membranoasă, nefrită lupică, vasculită ce include purpura Henoch-Schonlein şi granulomatoză Wegener, artrită reumatoidă, osteoartrită, rejetul alogrefei, scleroza sistemică, afecţiunile neurodegenerative şi boala demielinizantă, scleroza multiplă (SM), boala Alzheimer, bolile pulmonare, cum ar fi BPOC, astm, durerea neuropatică, durerea inflamatorie, sau cancer.
MDA20140104A 2012-02-27 2013-02-25 Polipeptide care se leagă de CX3CR1 MD4548C1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261603622P 2012-02-27 2012-02-27
PCT/US2013/027580 WO2013130381A1 (en) 2012-02-27 2013-02-25 Cx3cr1-binding polypeptides

Publications (3)

Publication Number Publication Date
MD20140104A2 MD20140104A2 (ro) 2015-02-28
MD4548B1 MD4548B1 (ro) 2018-01-31
MD4548C1 true MD4548C1 (ro) 2018-08-31

Family

ID=47884535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDA20140104A MD4548C1 (ro) 2012-02-27 2013-02-25 Polipeptide care se leagă de CX3CR1

Country Status (27)

Country Link
US (6) US9035029B2 (ro)
EP (2) EP2820046B1 (ro)
JP (1) JP6101715B2 (ro)
KR (1) KR102008136B1 (ro)
CN (3) CN115925938A (ro)
AP (1) AP2014007791A0 (ro)
AR (1) AR090158A1 (ro)
AU (1) AU2013226340B2 (ro)
CA (1) CA2862182A1 (ro)
CL (1) CL2014002072A1 (ro)
EA (1) EA028183B1 (ro)
EC (1) ECSP14020402A (ro)
GE (1) GEP201706773B (ro)
IL (3) IL311502A (ro)
IN (1) IN2014DN05756A (ro)
MD (1) MD4548C1 (ro)
MX (1) MX349192B (ro)
NZ (1) NZ627260A (ro)
PE (1) PE20141859A1 (ro)
PH (2) PH12014501912B1 (ro)
SG (1) SG11201405283SA (ro)
TN (1) TN2014000360A1 (ro)
TW (1) TWI598361B (ro)
UA (1) UA115781C2 (ro)
UY (1) UY34644A (ro)
WO (1) WO2013130381A1 (ro)
ZA (3) ZA201405021B (ro)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9556273B2 (en) 2010-03-29 2017-01-31 Vib Vzw Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
US9101674B2 (en) 2010-03-29 2015-08-11 Vib Vzw Targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
EA028183B1 (ru) 2012-02-27 2017-10-31 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Cx3cr1-связывающие полипептиды
WO2015026884A1 (en) * 2013-08-21 2015-02-26 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cx3cr1-targeting imaging agents and their use in the diagnosis and treatment of disease
RU2609627C2 (ru) * 2014-09-26 2017-02-02 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Высокоаффинные и агрегационно стабильные антитела на основе вариабельных доменов vl и производного vhh
RU2753439C2 (ru) 2015-07-23 2021-08-16 Инхибркс, Инк. Поливалетные и полиспецифичные gitr-связывающие слитые белки
US20170198051A1 (en) 2016-01-11 2017-07-13 Inhibrx Lp Multivalent and multispecific ox40-binding fusion proteins
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
KR20230041739A (ko) * 2016-03-08 2023-03-24 매버릭 테라퓨틱스, 인크. 유도성 결합 단백질 및 사용 방법
AU2017368518B2 (en) * 2016-11-29 2023-05-18 National Center Of Neurology And Psychiatry Prophylactic agent, onset-suppressing agent or therapeutic agent for progressive immune demyelinating diseases
WO2018134815A2 (en) * 2017-01-17 2018-07-26 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of treating neurodegenerative diseases by inducing disease-associated microglia (dam) cells
KR20240170847A (ko) 2017-09-08 2024-12-04 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 제약된 조건적으로 활성화된 결합 단백질
CN112601761A (zh) 2018-08-13 2021-04-02 印希比股份有限公司 结合ox40的多肽及其用途
CN120484127A (zh) 2019-03-05 2025-08-15 武田药品工业有限公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
CN110675421B (zh) * 2019-08-30 2022-03-15 电子科技大学 基于少量标注框的深度图像协同分割方法
JP2023528462A (ja) * 2020-06-02 2023-07-04 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション ナノボディ（ｖｈｈ）コンジュゲートおよびそれらの使用
US20240109954A1 (en) * 2021-02-01 2024-04-04 The General Hospital Corporation Fc-enhanced antibodies for prevention and treatment of ebola virus infection
TW202246334A (zh) * 2021-02-02 2022-12-01 美商美國禮來大藥廠 Gitr拮抗劑及其使用方法
IL318323A (en) 2022-07-18 2025-03-01 Ablynx Nv CX3CR1 binding compounds, uses thereof and related methods
IL321045A (en) 2022-12-22 2025-07-01 Chiome Bioscience Inc Anti-human CX3CR1 antibody
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69330523D1 (de) 1992-08-21 2001-09-06 Vrije Universiteit Brussel Bru Immunoglobuline ohne leichte ketten
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
WO2001060406A1 (en) * 2000-02-18 2001-08-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods that target fractalkine or cx3cr1
EP2275557A1 (en) 2000-04-12 2011-01-19 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20020192212A1 (en) * 2001-03-19 2002-12-19 Toshio Imai Uses of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine
WO2003002609A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
JP4123856B2 (ja) 2001-07-31 2008-07-23 日油株式会社 生体関連物質の修飾剤およびポリオキシアルキレン誘導体の製造方法
US20050069962A1 (en) 2001-10-12 2005-03-31 Archer Robert M Antibody complexes and methods for immunolabeling
CA2484556A1 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP2005528921A (ja) 2002-06-10 2005-09-29 メタボレックス インコーポレーティッド Ｃｘ３ｃｒ１修飾物質を用いる糖尿病の治療および診断の方法
AU2003286002B2 (en) 2002-11-08 2011-06-16 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
KR101025143B1 (ko) 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
DE602004017726D1 (de) 2003-06-30 2008-12-24 Domantis Ltd Pegylierte Single-domain-antikörper (dAb)
WO2005103684A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with cx3c chemokine receptor 1 (cx3cr1)
JP5113523B2 (ja) 2004-10-13 2013-01-09 アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ アミロイド−βに対するナノ抗体及びアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療のためのナノ抗体ＴＭを含むポリペプチド
ES2641815T3 (es) 2004-10-29 2017-11-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Tratamiento para enfermedades inflamatorias
EP2949668B1 (en) 2005-05-18 2019-08-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies tm against tumor necrosis factor-alpha
CA2615460A1 (en) 2005-08-08 2007-02-15 Onconon, Llc Antibody compositions, methods for treating neoplastic disease and methods for regulating fertility
EP2520588A1 (en) * 2005-08-19 2012-11-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
EP2069402A2 (en) * 2006-09-08 2009-06-17 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US20080267949A1 (en) 2006-12-05 2008-10-30 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
WO2009109635A2 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Ablynx Nv Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making and uses thereof
CN102089325A (zh) 2008-04-17 2011-06-08 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合血清白蛋白的肽，以及包含其的化合物、构建体和多肽
LT2285408T (lt) 2008-06-05 2019-01-25 Ablynx N.V. Aminorūgščių sekos, nukreiptos prieš viruso apvalkalo baltymus, ir tokias sekas turintys polipeptidai, skirti virusinių ligų gydymui
WO2010070394A1 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Universite Pierre Et Marie Curie-Paris Vi Modulators of the cx3cr1 receptor and therapeutic uses thereof
WO2011044377A2 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Cell Point, Llc Chelator-targeting ligand conjugates for cardiovascular imaging
WO2011042398A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
EP2648754A4 (en) * 2010-12-07 2016-02-24 Philadelphia Health & Educatio METHOD OF INHIBITING CANCER METASTASES
EA028183B1 (ru) 2012-02-27 2017-10-31 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Cx3cr1-связывающие полипептиды
WO2015026884A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cx3cr1-targeting imaging agents and their use in the diagnosis and treatment of disease

Also Published As

Publication number Publication date
HK1205154A1 (en) 2015-12-11
US20150239971A1 (en) 2015-08-27
ZA201405021B (en) 2024-09-25
US20240026013A2 (en) 2024-01-25
CA2862182A1 (en) 2013-09-06
UY34644A (es) 2013-09-02
MX349192B (es) 2017-07-18
US20180030141A1 (en) 2018-02-01
US20130224224A1 (en) 2013-08-29
MD20140104A2 (ro) 2015-02-28
US20190322753A1 (en) 2019-10-24
US20160355595A1 (en) 2016-12-08
TN2014000360A1 (en) 2015-12-21
AU2013226340B2 (en) 2017-06-22
EP4050027A3 (en) 2022-11-30
IN2014DN05756A (ro) 2015-04-10
ZA202308845B (en) 2025-03-26
IL291571A (en) 2022-05-01
CN104245735B (zh) 2018-02-23
IL234018B1 (en) 2023-01-01
US20230046772A1 (en) 2023-02-16
IL234018B2 (en) 2023-05-01
EP2820046B1 (en) 2022-06-15
IL311502A (en) 2024-05-01
IL291571B2 (en) 2024-08-01
IL291571B1 (en) 2024-04-01
CN108610421A (zh) 2018-10-02
SG11201405283SA (en) 2014-10-30
EA028183B1 (ru) 2017-10-31
KR20140130685A (ko) 2014-11-11
MD4548B1 (ro) 2018-01-31
ZA202308846B (en) 2025-03-26
UA115781C2 (uk) 2017-12-26
US20240279349A2 (en) 2024-08-22
EA201400964A1 (ru) 2015-02-27
PE20141859A1 (es) 2014-12-17
AR090158A1 (es) 2014-10-22
BR112014021080A2 (pt) 2017-07-04
PH12014501912B1 (en) 2023-01-18
AP2014007791A0 (en) 2014-07-31
CL2014002072A1 (es) 2015-01-23
CN115925938A (zh) 2023-04-07
AU2013226340A1 (en) 2014-07-31
NZ627260A (en) 2015-10-30
US12221487B2 (en) 2025-02-11
KR102008136B1 (ko) 2019-08-08
TW201348256A (zh) 2013-12-01
EP4050027A2 (en) 2022-08-31
WO2013130381A1 (en) 2013-09-06
MX2014009864A (es) 2014-10-24
TWI598361B (zh) 2017-09-11
CN108610421B (zh) 2022-08-19
JP6101715B2 (ja) 2017-03-22
EP2820046A1 (en) 2015-01-07
IL234018A0 (en) 2014-09-30
US11384151B2 (en) 2022-07-12
GEP201706773B (en) 2017-11-27
US9035029B2 (en) 2015-05-19
PH12014501912A1 (en) 2014-11-24
US9783612B2 (en) 2017-10-10
PH12021553014A1 (en) 2022-09-05
US10385134B2 (en) 2019-08-20
US9458235B2 (en) 2016-10-04
CN104245735A (zh) 2014-12-24
JP2015509368A (ja) 2015-03-30
ECSP14020402A (es) 2015-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12221487B2 (en) Nucleic acids encoding CX3CR1-binding polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains
JP6822848B2 (ja) Ｋｖ１．３結合免疫グロブリン
JP2019503167A (ja) Ｃｄ３８に対する抗原結合性ポリペプチド
JP2025537215A (ja) Ｇｉｐｒ結合タンパク質及びその使用
HK40077734A (en) Cx3cr1-binding polypeptides
BR122021000901B1 (pt) Polipeptídeo, seu método de fabricação, célula hospedeira bacteriana, de levedura ou fúngica, composição farmacêutica, kit de diagnóstico, e método de diagnóstico
BR122021000924B1 (pt) Polipeptídeo, seu método de fabricação, célula hospedeira bacteriana, de levedura ou fúngica, composição farmacêutica, kit de diagnóstico, e método de diagnóstico
HK1205154B (en) Cx3cr1-binding polypeptides
BR112014021080B1 (pt) Polipeptídeo, seu método de fabricação, célula hospedeira bacteriana, de levedura ou fúngica, composição farmacêutica, kit de diagnóstico, e método de diagnóstico
OA17072A (en) CX3CR1-binding polypeptides.

Legal Events

Date Code Title Description
FG4A Patent for invention issued
KA4A Patent for invention lapsed due to non-payment of fees (with right of restoration)
MM4A Patent for invention definitely lapsed due to non-payment of fees