ES2641815T3 - Tratamiento para enfermedades inflamatorias - Google Patents

Abstract

Un agente terapéutico que comprende un anticuerpo o un antagonista de CX3CR1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino, en el que dicho anticuerpo o dicho antagonista de CX3CR1 inhibe una interacción de fractalcina y CX3CR1.

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento para enfermedades inflamatorias Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un agente terapeutico para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino.

Antecedentes tecnicos

Las quimiocinas son factores principales de migracion celular en los organismos vivos y regulan la infiltracion de linfocitos en tejidos mediante el aumento de la motilidad celular y la activacion de moleculas de adhesion celular. Las quimiocinas se clasifican en cuatro subfamilias de CC, CXC, C y CXXXC basandose en los tipos de secuencia de los dos primeros restos de cistema. Los miembros de las subfamilias de quimiocinas CC, CXC y C son protemas secretoras que consisten en aproximadamente 70 aminoacidos, y aunque no tienen actividad como moleculas de adhesion por sf mismas, pueden inducir la adhesion celular. Una quimiocina secretada se une a un receptor de siete dominios transmembrana sobre la superficie de una celula diana y activa la integrina mediante la protema G trimerica para inducir la adhesion o la migracion celular.

Recientemente, se identifico un novedoso mecanismo simple de infiltracion de linfocitos ademas del mecanismo conocido de migracion celular. Este mecanismo esta mediado por la fractalcina expresada en celulas endoteliales activadas y un receptor de siete dominios transmembrana, CX3CR1, expresado en monocitos, celulas NK y una parte de los linfocitos T en el flujo sangumeo. La fractalcina es el unico miembro de la subfamilia de quimiocinas CXXXC y tiene caractensticas distintas en la estructura y en las funciones de la misma que no se encuentran en otras quimiocinas. La fractalcina se expresa sobre una superficie celular como una protema unida a membrana que tiene un dominio de quimiocina, un dominio de mucina, un dominio transmembrana y un dominio intracitoplasmatico. La fractalcina unida a membrana por sf misma puede mediar la fuerte adhesion por union a CX3CR1 incluso en presencia de un caudal de sangre fisiologico sin mediacion de selectina o de integrina. Es decir, en una reaccion de una fase, el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 media una funcion similar a la del mecanismo de infiltracion celular de multiples fases mediante selectina o integrina. Ademas, la fractalcina secretora secretada de fractalcina unida a membrana por desprendimiento se une a CX3CR1 e induce la activacion de integrina y la migracion celular como las quimiocinas conocidas.

Ademas, la expresion de fractalcina se induce cuando se tratan celulas del endotelio vascular con citocinas inflamatorias tales como TNF e IL-1. Por otro lado, CX3CR1 se expresa en monocitos, en la mayona de las celulas NK y en una parte de los linfocitos T, pero no en neutrofilos. Por lo tanto, el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 parece ser un mecanismo muy eficaz para movilizar ciertos tipos de inmunocitos en celulas endoteliales de tejidos danados o en los tejidos. Como la fractalcina se induce en celulas del endotelio vascular tras la inflamacion, y CX3CR1 existe en muchos tipos de leucocitos como se describe anteriormente, se sugiere fuertemente que el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 esta implicado en el desarrollo y la progresion de afecciones patologicas en enfermedades inflamatorias. De hecho, muchos se han hecho muchos informes sobre la implicacion del sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 en enfermedades inflamatorias, y dichos informes se han hecho sobre muchas enfermedades tales como artritis reumatoide (documento que no es patente 1), enfermedades inflamatorias del intestino cuyos ejemplos tfpicos son colitis ulcerante y enfermedad de Crohn (documento que no es patente 2), psoriasis y dermatitis (documentos que no son patente 3 y 4), asma (documento que no es patente 5), arteriosclerosis (documento que no es patente 6), smdrome de dificultad respiratoria aguda (documento que no es patente 7). Ademas, puede esperarse que se proporcionen efectos de la prevencion de la progresion de las afecciones patologicas y mejora de las afecciones por inhibicion del sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 en enfermedades inflamatorias basandose en los analisis que usan ratones CX3CR1 knockout (arteriosclerosis [documento que no es patente 8], dano tisular causado por reperfusion isquemica [documento que no es patente 9]), analisis de modelos animales patologicos de enfermedades inflamatorias usando anticuerpos monoclonales anti-fractalcina (artritis inducida por colageno de tipo II de raton, encefalomeningitis autoinmunitaria experimental (documento de patente 1), hepatopatfa inducida por concanavalina A (documento de patente 1), analisis de modelos animales patologicos usando antisuero anti- CX3CR1 (nefritis semilunar de rata WKY [documento que no es patente 10], rechazo de aloinjerto cardiaco [documento no de patente 11]) o analisis de modelos animales patologicos de enfermedades inflamatorias usando mutante inhibido con fractalcina (nefritis por lupus MRL/lpr [abril de 2004, Japan College of Rheumatology]) y, por tanto, se espera la construccion de un novedoso sistema de tratamiento para enfermedades inflamatorias. Sin embargo, los detalles del mecanismo de estas acciones para mejorar las afecciones patologicas mostradas por la inhibicion de la interaccion de fractalcina-CX3CR1 siguen siendo desconocidos en las presentes circunstancias.

En cuanto a la clasificacion de los leucocitos, linfocitos, monocitos y granulocitos, se han clasificado en pequenos grupos basandose en muchos marcadores de superficie celular hasta ahora. Recientemente, se han clasificado adicionalmente en grupos mas pequenos de acuerdo con la distribucion de los receptores de quimiocinas, y un grupo que se consideraba un unico grupo se ha descubierto que es un conjunto de varios subgrupos. Se ha

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informado a partir de analisis de ratones que CX3CR1 se expresa en monocitos, en celulas NK y en una parte de los linfocitos T como se describe anteriormente, y se esta dilucidando que hay dos grupos de monocitos entre ellos, un grupo de ellos que expresa fuertemente CX3CR1, pero que no expresa CCR2 (CX3CR1highCCR2-) y un grupo de ellos que expresa debilmente CX3CR1 y expresa fuertemente CCR2 (CX3CR1lowCCR2+). Los analisis de ratones CX3CR1 knockout y ratones CCR2 knockout han sugerido que los monocitos CX3CR1lowCCR2+ se inducen en sitios de inflamacion tras la inflamacion y contribuyen al dano tisular produciendo citocinas inflamatorias tales como TNFa y oxido de nitrogeno sintetasa inducible (iNOS) como una potente sintetasa de oxido de nitrogeno (NO) (documentos que no son patente 12 y 13). Sin embargo, las funciones y la importancia de los monocitos CX3CR1highCCR2- tras la inflamacion no se ha mencionado, y en su lugar se ha dicho que son necesarios para el suministro de macrofagos tisulares cuando no hay inflamacion, y es indeseable inhibir las funciones de estas celulas.

Ademas, los monocitos en sangre periferica humana tambien se clasifican de forma precisa basandose en los marcadores de superficie celular (tales como CD16, CD62L) y la expresion de CX3CR1. Se informa que, en uno de los grupos, los monocitos CD16+CD62L-, aumentan en sangre periferica en enfermedades inflamatorias, y la implicacion de los mismos en la provision de las afecciones patologicas esta fuertemente sugerida. Como se ha informado de que los monocitos CD16+CD62L- expresan de forma elevada CX3CR1, se preve que los monocitos CD16+CD62L- tienen propiedades sustancialmente similares a las de los monocitos CX3CR1highCCR2- de raton mencionados anteriormente (documento que no es patente 14). Ademas, como ya se ha informado de que los monocitos CD16+CD62L- producen fuertemente TNFa e iNOS, se considera que estan fuertemente asociados con la progresion de afecciones patologicas, junto con su aumento en la sangre periferica en enfermedades inflamatorias. Sin embargo, no se ha informado espedficamente a cerca de si la produccion de TNFa e iNOS por estas celulas se inhibe por la inhibicion de las funciones de CX3CR1.

iNOS, que tiene la mayor capacidad de smtesis de NO, no se expresa constantemente a diferencia de NOS endotelial (eNOS) y NOS neural (nNOS), y se induce por factores estimuladores (por ejemplo, citocinas inflamatorias y/o por polisacaridos), se produce de forma transitoria en una gran cantidad y esta implicada en reacciones biofilacticas tales como eliminacion de bacterias, virus, hongos o parasitos. Sin embargo, como la produccion excesiva de NO da lugar a danos tisulares, se considera que la produccion excesiva de iNOS en lesiones puede ser un factor principal de la progresion de afecciones patologicas. Los ejemplos de enfermedades en las que esta realmente implicado el NO en el desarrollo o en la progresion de las afecciones patologicas incluyen enfermedades inflamatorias (por ejemplo, inflamacion reumatica, artritis reumatoide, artrosis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante, psoriasis, arteriosclerosis, enfermedades autoinmunitarias, inflacion aguda), enfermedades de alergia (asma, dermatitis atopica), enfermedades isquemicas (por ejemplo, diversos trastornos cardiacos y trastornos cerebrales causados por infarto o por isquemia, trastorno de reperfusion despues de isquemica), choque (por ejemplo, choque endotoxico, choque hemorragico, choque cardiogenico), hipotension patologica (por ejemplo, hipotension en tratamientos contra el cancer usando citocinas, hipotension causada por septicemia, choque hemorragico o cirrosis), rechazo de trasplantes, trastornos del sistema nervioso (enfermedad de Alzheimer, epilepsia, migrana), tumores y diabetes insulinodependientes.

Ademas, basandose en los analisis de inhibicion de la actividad de iNOS en modelos patologicos o en ratones iNOS knockout, se ha informado de una mejora de las afecciones patologicas en la artritis reumatoide (documento que no es patente 15), artrosis (documento que no es patente 16), enfermedades inflamatorias del intestino cuyos ejemplos tfpicos son colitis ulcerante y enfermedad de Crohn (documentos que no son patente 17 y 18), hepatopatfa inducida por concanavalina A (documento que no es patente 19), asma (documento que no es patente 20), lesion pulmonar aguda inducida por endotoxina (documento que no es patente 21), arteriosclerosis (documento que no es patente 22), enfermedades isquemicas (documentos que no son patente 23, 24 y 25) y rechazo de trasplantes (documento que no es patente 22).

De hecho, se ha informado de la mejora de las afecciones patologicas por la inhibicion de la actividad de iNOS en muchos animales modelo patologicos o en ratones iNOS knockout como se describe anteriormente. Sin embargo, no se ha lanzado ningun farmaco prometedor que inhiba la actividad de iNOS.

Ademas, aunque la inhibicion de la produccion excesiva de NO por inhibidores de actividad enzimatica de iNOS mejora la hipotension habitualmente observada en choque septico, la destruccion tisular tal como en vasoparalisis y trastornos organicos, se ha sugerido un riesgo de bloqueo de las funciones fisiologicas fundamentales de NO tal como la regulacion de la presion sangumea y del flujo de sangre (documento que no es patente 26). En particular, en el analisis de las funciones del musculo cardiaco en septicemia usando ratones iNOS knockout, se ha apuntado a diferencias en la funcion de iNOS dependiendo del tipo de celulas que lo producen. La iNOS expresada en celulas de musculo cardiaco es esencial para la reaccion util para acortar las celulas de musculo cardiaco por estfmulos adrenergicos en el caso de septicemia, mientras que la iNOS que se expresa en celulas inflamatorias infiltradas en las cercamas de las celulas del musculo cardiaco esta implicada en una reaccion perjudicial de dano a las celulas del musculo cardiaco (documento que no es patente 27).

Por lo tanto, se ha deseado proporcionar un farmaco basandose en una estrategia novedosa, es decir, la inhibicion de la actividad de iNOS selectiva para la especie celular, por ejemplo, no la inhibicion general de la reaccion enzimatica de iNOS, sino inhibicion de la reaccion enzimatica de iNOS o inhibicion de la produccion de iNOS en

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celulas inflamatorias.

Documento que no es patente 1: Arthritis Rheum., 2002 Nov., 46(11): 2878-83

Documento que no es patente 2: Am. J. Pathol., 2001 Mar., 158(3): 855-66

Documento que no es patente 3: J. Allergy Clin. Immunol., 2004 May, 113 (5) : 940-8

Documento que no es patente 4: J. Clin. Invest., 2001 May. 107(9): 1173-81

Documento que no es patente 5: J. Allergy Clin. Immunol., 2003 Dic, 112 (6) : 1139-46

Documento que no es patente 6: J. Clin. Invest.. 2003 Abr., 111(8): 1241-50

Documento que no es patente 7: Clin. Exp. Immunol., 1999 Nov., 118 (2) : 298-303

Documento que no es patente 8: Circulation, 2003 Feb. 25, 107(7): 1009-16

Documento que no es patente 9: J. Neuroimmunol., 2002 Abr., 125(1-2): 59-65

Documento de patente 1: patente japonesa abierta a inspeccion publica (Kokai) n.° 2002-345454

Documento que no es patente 10: Kidney Int., 1999 Ago., 56(2): 612-20

Documento que no es patente 11: J. Clin. Invest., 2001 Sep., 108 (5) : 679-88

Documento que no es patente 12: Immunity, 2003 Jul., 19(1): 71-82

Documento que no es patente 13: Immunity, 2003 Jul., 19(1): 59-70

Documento que no es patente 14: J. Exp. Med., 2003 Jun. 16, 197(12): 1701-7

Documento que no es patente 15: Eur. J. Pharmacol., 2002 Oct. 18, 453(1): 119-29

Documento que no es patente 16: Arthritis Rheum., 1998 Jul., 41(7): 1275-86

Documento que no es patente 17: J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001 Sep., 298(3) : 1128-32

Documento que no es patente 18: Eur. J. Pharmacol., 2001 Ene. 19, 412(1): 91-9

Documento que no es patente 19: J. Clin. Invest., 2001 Feb., 107 (4) : 439-47

Documento que no es patente 20: J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003 Mar., 304 (3) : 1285-91

Documento que no es patente 21: Anesth. Analg., 2003 Dic., 97(6): 1751-5

Documento que no es patente 22: Eur. J. Pharmacol., 2000 Mar. 10, 391 (1-2) : 31-8

Documento que no es patente 23: Br. J. Pharmacol., 1999 May, 127 (2) : 546-52

Documento que no es patente 24: Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2002 Jun., 282(6): H1996-2003

Documento que no es patente 25: Nitric Oxide, 2004 May, 10(3): 170-7

Documento que no es patente 26: Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy, 2002 Mar., 1(1): 89-108 Documento que no es patente 27: Circulation, 2003 Sep. 2, 108(9): 1107-12

Divulgacion de la invencion

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un agente terapeutico para enfermedades inflamatorias, espedficamente, enfermedades inflamatorias del intestino (en particular, colitis ulcerante, enfermedad de Crohn), basandose en un concepto novedoso.

Basandose en los hallazgos previos, los inventores de la presente invencion pusieron atencion al hecho de que no habfa informes sobre la inhibicion de la produccion de iNOS y mejora de las afecciones patologicas de eso modo por la inhibicion de la funcion de CX3CR1, por tanto construyeron una hipotesis de que un agente terapeutico para una enfermedad inflamatoria basado en un concepto novedoso podna crearse dilucidando la funcion y realizaron diversas investigaciones.

Es decir, se realizo investigacion usando anticuerpos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 y la funcion de CX3CR1 en diversos modelos animales descritos en los ejemplos mencionados posteriormente, y como resultado, se descubrio por primera vez que inhibfan la produccion de iNOS y mejoraban las afecciones patologicas. Ademas, aunque se habfa informado de que los anticuerpos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 y la funcion de CX3CR1 son eficaces para la hepatitis inducida por ConA, se descubrio por primera vez que inhibfan la expresion del ARNm iNOS en el Idgado en hepatitis inducida por ConA y la produccion de iNOS en celulas inflamatorias. Basandose en estos hallazgos, demostraron que un anticuerpo que inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1 y la funcion de CX3CR1 o un compuesto que inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1 y la funcion de CX3CR1 (por tanto, tambien mencionado como "antagonista de CX3CR1") era util para el tratamiento de enfermedades inflamatorias asociadas con el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 y causaba produccion excesiva de NO por la actividad de iNOS o celulas inflamatorias (enfermedades inflamatorias del intestino [en particular, colitis ulcerante y enfermedad de Crohn] y, por tanto, consegrna la presente invencion).

Es decir, la presente invencion proporciona lo siguiente.

(1) Un agente terapeutico que comprende un anticuerpo o un antagonista de CX3CR1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino, donde dicho anticuerpo o dicho antagonista de CX3CR1 inhibe una interaccion de fractalcina y CX3CR1.

(2) El agente para su uso de acuerdo con (1), donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-fractalcina.

(3) El agente para su uso de acuerdo con (2), donde el anticuerpo anti-fractalcina es un anticuerpo monoclonal.

(4) El agente para su uso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3), donde la enfermedad inflamatoria del intestino es colitis ulcerante o enfermedad de Crohn.

Breve descripcion de los dibujos

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[Fig. 1] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar la perdida de peso corporal en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 2] Muestra los valores de consistencia de las deposiciones en el intestino grueso y el efecto del anticuerpo anti- fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar la hipertrofia del intestino grueso en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 3] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar los cambios morfologicos en el intestino grueso en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos (fotograffas de la morfologfa del organo).

[Fig. 4] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar los danos tisulares del intestino grueso en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos (fotomicrograffas).

[Fig. 5] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para diversos factores en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 6] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar DAI en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxafolona en raton.

[Fig. 7] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar la hipertrofia del intestino grueso y el acortamiento del intestino grueso en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxafolona en raton.

[Fig. 8] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar los cambios morfologicos en el intestino grueso en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxafolona en raton (fotograffa de la morfologfa del organo).

[Fig. 9] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar los danos tisulares del intestino grueso en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxafolona en raton (fotomicrograffas).

[Fig. 10] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (n.° 126) para mejorar la hipertrofia del intestino grueso y el acortamiento del intestino grueso en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxafolona en raton.

[Fig. 11] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de diversos factores en tejido hepatico en hepatitis inducida por ConA.

[Fig. 12] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar los aumentos en iNOS y celulas inflamatorias CX3CR1 positivas en el parenquima hepatico en hepatitis inducida por ConA (fotomicrograffas).

[Fig. 13] Muestra los resultados de la tincion de doble fluorescencia de tejidos hepaticos en hepatitis inducida por ConA (fotomicrograffas).

[Fig. 14] Muestra las proporciones de celulas positivas al marcador entre celulas CX3CR1 positivas y celulas iNOS positivas en tejidos hepaticos en hepatitis inducida por ConA.

[Fig. 15] Muestra los resultados de citometffa de flujo de celulas CX3CR1 positivas.

[Fig. 16] Muestra los resultados de la tincion histologica de tejidos hepaticos en hepatitis inducida por ConA (microfoiograffas).

[Fig. 17] Muestra las expresiones de quimiocinas en hepatitis inducida por ConA y el efecto del anticuerpo anti- fractalcina (5H8-4) sobre las expresiones de quimiocinas.

[Fig. 18] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para marcadores de leucocitos en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos. "Normal" indica un control negativo, "cIgG" indica el grupo de administracion de anticuerpo de control y "@FKN" denota indica el grupo de administracion de anticuerpo anti-fractalcina (lo mismo se aplicara a las Fig. 19 a 25).

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[Fig. 19] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para quimiocinas y receptores de quimiocinas en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 20] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para quimiocinas y receptores de quimiocinas en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 21] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para citocinas en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 22] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para moleculas de neovascularizacion y proteasas de destruccion tisular en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 23] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para moleculas que activan las celulas dendnticas y los linfocitos T en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos.

[Fig. 24] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para citocinas, quimiocinas y receptores de quimiocinas 24 horas despues de la inyeccion intestinal de oxazolona en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxazolona en raton.

[Fig. 25] Muestra el efecto del anticuerpo anti-fractalcina de raton (5H8-4) para mejorar las expresiones de los ARNm para marcadores de neutrofilos, citocinas, quimiocinas y receptores de quimiocinas tres dfas despues de la inyeccion intestinal de oxazolona en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxazolona en raton.

Mejor modo para realizar la invencion

1. Deposito de microorganismos

El hibridoma Ham @mFKN5H8-4 se deposito en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon) el 29 de septiembre de 2004 (N.° de acceso: FERM P-20236), y despues el deposito se convirtio en un deposito internacional segun las provisiones del tratado de Budapest (N.° de acceso: FERM BP-10372).

El hibridoma Ham @mFKN#126.1.1 se deposito en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon) el 29 de septiembre de 2004 (N.° de acceso: FERM P-20235), y despues el deposito se convirtio en un deposito internacional segun las provisiones del tratado de Budapest (N.° de acceso: FERM BP-10371).

2. Anticuerpo que inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1

Los anticuerpos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 pueden prepararse del siguiente modo.

Un mairnfero (por ejemplo, raton, hamster o conejo) puede inmunizarse con CX3CR1 o fractalcina en forma de un inmunogeno que causa respuestas inmunitarias en el marnffero o un fragmento proteico de la misma (por ejemplo, fragmento peptfdico).

Se expresa un vector de expresion que incorpora el gen de CX3CR1 o fractalcina (por ejemplo, vease GenBank NM_001337 o NM_002996) en las celulas hospedadoras, por ejemplo, celulas bacterianas, de mamffero o de insecto, y puede purificarse CX3CR1 o fractalcina de un medio de cultivo o de celulas bacterianas o de otras celulas de acuerdo con un metodo convencional. Ademas, puede expresarse CX3CR1 o fractalcina como una protema de fusion con, por ejemplo, GST o similares, y puede purificarse usando una columna con glutation en el caso de una protema de fusion con GST.

Tambien puede sintetizarse un peptido de CX3CR1 o fractalcina basandose en la secuencia de aminoacidos de CX3CR1 o fractalcina por un metodo conocido (por ejemplo, smtesis qmmica de F-moc o de T-boc) y puede potenciarse la inmunogenicidad del peptido sintetizado uniendolo a un vehmulo adecuado, por ejemplo, KLH.

Despues de la inmunizacion con CX3CR1 o fractalcina purificada o un fragmento peptfdico de la misma y un adyuvante, puede obtenerse un antisuero, y pueden aislarse los anticuerpos policlonales del antisuero si se desea. Ademas, para producir anticuerpos monoclonales, se recogen celulas productoras de anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y se fusionan con celulas de mieloma por un metodo convencional de fusion celular para inmortalizar las celulas y de ese modo obtener celulas de hibridoma. Esta tecnica es un metodo establecido en este

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campo tecnico, y puede implementarse de acuerdo con un manual adecuado (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory). Ademas, pueden prepararse anticuerpos monoclonales por otros metodos tales como el metodo de hibridoma de linfocitos B humanos para producir anticuerpos monoclonales humanos (Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983), el metodo de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibody in Cancer Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., 77-96), y cribado de una biblioteca combinatoria de anticuerpos (Huse et al., Science, 246: 1275, 1989).

Ademas, como metodo alternativo, tambien es aceptable un metodo en que se inmuniza un mairnfero con celulas de insecto per se en que se expresa CX3CR1, se preparan hibridomas a partir de linfocitos del marnffero y se realiza cribado de los anticuerpos producidos usando celulas de mamffero en que se expresa CX3CR1 (celulas que muestran baja inmunidad cruzada con las celulas de insecto y no se unen a los anticuerpos dirigidos a las protemas derivadas de las celulas de insecto). Ademas, tambien pueden prepararse por el metodo descrito en la patente japonesa abierta a inspeccion publica n.° 2002-345454.

El cribado de anticuerpos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 puede realizarse por el metodo de cribado descrito posteriormente.

3. Antagonista de CX3CR1

La presente invencion se consiguio basandose en el hallazgo de que los anticuerpos que inhiben la interaccion de la fractalcina y CX3CR1 son utiles para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino asociada con el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 y causaban produccion excesiva de NO por la actividad de iNOS o celulas inflamatorias. Por lo tanto, los compuestos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 y la funcion de CX3CR1, los antagonistas de CX3CR1, tambien pueden usarse en la presente invencion. Los antagonistas de CX3CR1 no estan particularmente limitados siempre que se usen compuestos que tienen la accion mencionada anteriormente, y pueden ser compuestos conocidos o novedosos. Ademas, pueden ser compuestos obtenidos por el metodo de cribado descrito posteriormente.

En la presente memoria descriptiva, los "compuestos" incluyen productos de expresion de una genoteca, biblioteca de compuestos sinteticos de bajo peso molecular, acidos nucleicos (oligo ADN, aligo ARN), biblioteca de peptidos sinteticos, sustancias liberadas de las bacterias, extractos celulares (microorganismos, celulas vegetales, celulas animales), sobrenadante de cultivo celular (microorganismos, celulas vegetales, celulas animales), polipeptidos purificados o parcialmente purificados, extractos derivados de organismos marinos, plantas, animales, el suelo y biblioteca de presentacion de peptidos en fagos aleatorios. Los ejemplos espedficos incluyen los compuestos descritos en las publicaciones de patente internacional WO03/018549, WO00/09511 y WO02/076990. Los compuestos conocidos pueden producirse por un metodo de produccion conocido per se, o cuando son compuestos naturales, pueden obtenerse por un metodo de extraccion conocido per se o un metodo de purificacion conocido per se, o cuando estan disponibles en el mercado, pueden adquirirse. Ademas, pueden obtenerse derivados de compuestos conocidos por modificacion por medios qmmicos, ffsicos y/o bioqmmicos.

4. Metodo de cribado para anticuerpos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1

Los anticuerpos o los antagonistas de CX3CR1 que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 pueden cribarse basandose en si las celulas CX3CR1 positivas migran a celulas que expresan fractalcina o fractalcina unida a membrana. Un metodo espedfico para el cribado basandose en si las celulas CX3CR1 positivas migran se describe a continuacion. Sin embargo, la presente invencion no esta limitada a este metodo.

La migracion a fractalcina puede medirse usando, por ejemplo, un inserto de cultivo Transwell (Coaster).

Las celulas que no expresan fractalcina, por ejemplo, celulas ECV304, se cultivan en un inserto de cultivo Transwell para formar una capa monocelular sobre la superficie del inserto de cultivo. La fractalcina se diluye con una solucion de migracion (por ejemplo, RPMI-1640:M199 = 1:1, BSA al 0,5%, HEPES 20 mM, pH 7,4) hasta una concentracion apropiada, preferiblemente una concentracion de 10 nM, y se anade a una placa de 24 pocillos. El inserto de cultivo Transwell en el que se cultivan las celulas ECV304 se adhiere al 24-Transwell, y se anade una cantidad apropiada, preferiblemente 106, de monocitos de sangre periferica suspendidos en la solucion de migracion al inserto de cultivo Transwell. Las celulas se cultivan en condiciones apropiadas, preferiblemente, 37°C durante 4 horas, despues las celulas que migran a la placa de pocillo a traves de las celulas ECV304 se recogen e identifican basandose en los marcadores de superficie celular o los antfgenos intracelular. Preferiblemente, se tinen con fluorescencia usando anticuerpos marcados con fluorescencia dirigida a un marcador de superficie celular o antfgeno intracelular, y despues se cuantifican usando el FACScalibur.

Si la migracion de los linfocitos citoltticos, preferiblemente celulas que expresan perforina y granzima B o CX3CR1, mas preferiblemente celulas que expresan CX3CR1, se inhibe cuando se anaden anticuerpos que se unen a CX3CR1 o fractalcina a la solucion de migracion, se determina que los anticuerpos inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1.

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Ademas, expresando fractalcina unida a membrana en celulas ECV304 y midiendo los monocitos de sangre periferica que migran a otras quimiocinas tales como MIP-1p, tambien puede determinarse si un anticuerpo inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1.

5. Inhibicion de la produccion de iNOS

En la presente memoria descriptiva, la expresion "inhibicion de la produccion de iNOS" o "se inhibe la produccion de iNOS" significa que el nivel de expresion de ARNm para iNOS esta suprimido, o esta suprimida la cantidad de produccion de protema iNOS. La inhibicion de la produccion de iNOS puede medirse por cualquiera de PCR a tiempo real, transferencia de Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en fase solida) y medicion de la actividad enzimatica iNOS.

Por ejemplo, la PCR a tiempo real se realiza espedficamente del siguiente modo. Se purifica el ARN total de los tejidos o las celulas de una manera convencional, y se prepara el ADNc usando una transcriptasa inversa y cebadores adecuados. A partir del ADNc preparado, cada molecula puede amplificarse espedficamente usando cebadores espedficos para cada molecula y una ADN polimerasa. Puede controlarse una curva de amplificacion para cada molecula incorporando un colorante fluorescente adecuado en la molecula cuando se amplifica y usando un aparato espedfico (tal como el detector de secuencia PRISM 7700 (Applied Biosystems)). El nivel de expresion de ARNm de cada molecula en tejidos y en celulas puede medirse cuantitativamente corrigiendo cada molecula usando un gen de patron interno (tal como gen de la gliceraldeddo-3-fosfato deshidrogenasa).

6. Uso de anticuerpo o de antagonista de CX3CR1 que inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1

La presente invencion proporciona un agente terapeutico que comprende un anticuerpo o un antagonista de CX3CR1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino, donde dicho anticuerpo o dicho antagonista de CX3CR1 inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1. En el agente terapeutico mencionado anteriormente, el anticuerpo mencionado anteriormente es preferiblemente un anticuerpo que se une a fractalcina. Cuando el agente terapeutico de la presente invencion que contiene el anticuerpo se aplica a seres humanos, se prefieren las siguientes realizaciones.

Un anticuerpo monoclonal preparado usando un animal diferente de un ser humano, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de raton preparado usando un raton como animal a inmunizar, a menudo se reconoce como una protema foranea y a menudo causa una respuesta inmunitaria contra un anticuerpo monoclonal, cuando se administra a un ser humano. Un medio para evitar este problema es un anticuerpo quimerico, es decir, un anticuerpo que consiste en una region de union a antfgeno derivada de un anticuerpo monoclonal de raton y las otras regiones derivadas de un anticuerpo humano. Los anticuerpos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 usados en la presente invencion tambien incluyen anticuerpos quimericos. Los ejemplos de anticuerpos quimericos incluyen un anticuerpo quimerico que usa la region variable completa de un anticuerpo monoclonal de raton como la region de union a antfgeno (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature, 314: 452, 1985) y un anticuerpo quimerico que usa una region flanqueante derivada de ser humano y una region hipervariable derivada de un anticuerpo monoclonal de raton en combinacion con la region de union a antfgeno (Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308-12, 1983; Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 7279, 1983). Sin embargo, la presente invencion no esta limitada a estos ejemplos.

Ademas, los anticuerpos que inhiben la interaccion de fractalcina y CX3CR1 mencionados en la presente memoria descriptiva tambien incluyen un fragmento de un anticuerpo que se une espedficamente a CX3CR1 o fractalcina, por ejemplo, fragmento Fab o (Fab')2.

El agente terapeutico de la presente invencion puede administrarse a pacientes que necesitan tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino, que esta asociada con el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 y causada por produccion excesiva de NO por la actividad de iNOS o celulas inflamatorias (en particular, colitis ulcerante, enfermedad de Crohn).

El agente terapeutico de la presente invencion puede administrarse de una manera convencional tal como inyeccion (tal como inyecciones subcutaneas e intravenosas).

La forma del agente terapeutico se selecciona adecuadamente dependiendo del metodo de administracion y puede ser una composicion farmaceutica que usa vehmulos farmaceuticamente aceptables en combinacion. Los ejemplos de la composicion farmaceutica adecuados para inyeccion incluyen solucion acuosa esterilizada (cuando los ingredientes son hidrosolubles), dispersion o un polvo esterilizado usado para preparar inmediatamente una solucion o dispersion de inyeccion esterilizada. Todas las composiciones farmaceuticas adecuadas para inyeccion deben esterilizarse y tienen una fluidez que posibilita la facil operacion de inyeccion. Estas composiciones deben ser estables en condiciones de produccion y de almacenamiento y deben protegerse de las acciones de microorganismos contaminantes tales como bacterias y hongos. Los ejemplos de los vedculos incluyen agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol), disolventes o medios de dispersion que comprenden una mezcla apropiada de estos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un

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recubrimiento de lecitina para mantener un tamano de grano requerido en el caso de dispersiones o usando un tensioactivo. La proteccion de las acciones de microorganismos puede implementarse usando diversos agentes antibacterianos y agentes antifungicos tales como parabeno, clorobutanol, fenol, acido ascorbico y timerosal. En muchos casos, la composicion contiene preferiblemente un agente isotonico, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, cloruro de sodio. La adsorcion sostenida de la composicion para inyeccion puede conseguirse mezclando un agente que retarda la adsorcion tal como monoestearato de aluminio y gelatina en la composicion.

Una solucion para inyeccion puede prepararse mezclando una cantidad requerida del anticuerpo que inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1 y uno o una mezcla de los compuestos mencionados anteriormente en un disolvente adecuado si fuera necesario y despues sometiendo la mezcla a filtracion de esterilizacion. En general, una dispersion se prepara mezclando un compuesto activo en un medio esterilizado que contiene un medio de dispersion basico y otros componentes requeridos seleccionados de los mencionados anteriormente. Los metodos preferidos para preparar el polvo esterilizado usado para la preparacion de una solucion de inyeccion esterilizada son secado al vado y liofilizacion, y los polvos que contienen el ingrediente activo y los componentes adicionales deseados sometidos a filtracion de esterilizacion de antemano pueden obtenerse por estos metodos.

La dosis del agente terapeutico de la presente invencion puede variar dependiendo del anticuerpo seleccionado, la finalidad de la administracion, la edad, el genero y susceptibilidad a farmacos del paciente, metodo de administracion, historial de la enfermedad y puede cambiarse a discrecion del medico. Sin embargo, el intervalo de dosis adecuado es, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 a 30 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg, por kilogramo de peso corporal del paciente. Teniendo en cuenta que la eficacia de las vfas de administracion vana, se espera que la dosis requerida cambie en un amplio intervalo. Por ejemplo, se espera que la administracion oral requiera una dosis mayor que para la administracion por inyeccion intravenosa. Dichos cambios en el nivel de dosis pueden ajustarse usando un procedimiento de optimizacion empmca convencional bien comprendido en este campo.

Ademas, puede prepararse una inmunotoxina que contiene un anticuerpo dirigido contra CX3CR1 y una sustancia citotoxica unida al anticuerpo.

Los ejemplos de la sustancia toxica incluyen saporina, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina difterica y agente quimioterapeuticos. El anticuerpo y la sustancia toxica pueden unirse por un metodo convencional usado para la preparacion de inmunotoxinas. Dicha inmunotoxina inhibe espedficamente el crecimiento de celulas que expresan CX3CR1.

Cuando se aplica un agente terapeutico para enfermedades inflamatorias que contiene el antagonista de CX3CR1 a seres humanos, se prefieren las siguientes realizaciones. El antagonista de CX3CR1 puede formar una sal, y ejemplos de la misma incluyen sales con acidos o bases farmaceuticamente aceptables. Por consiguiente, el antagonista de CX3CR1 o una sal del mismo puede usarse para el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino asociada con el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 y causada por la produccion excesiva de NO por la actividad de iNOS o celulas inflamatorias (en particular, colitis ulcerante y enfermedad de Crohn). Las sustancias obtenidas per se pueden usarse en solitario, o pueden tambien usarse como una composicion farmaceutica mezclandolas con un vedculo farmaceuticamente aceptable. La proporcion del ingrediente activo al vedculo en dicho caso puede cambiarse en el intervalo de un 1 a un 90% en peso. Ademas, el agente terapeutico puede administrarse mediante cualquiera de las vfas de administracion orales o parenterales (por ejemplo, inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, administracion subcutanea, administracion rectal o administracion percutanea).

Por lo tanto, se prepara una composicion farmaceutica que contiene el antagonista de CX3CR1 o una sal del mismo en una forma de dosificacion adecuada dependiendo de la via de administracion, y los ejemplos espedficos de la forma de dosificacion incluyen agentes orales tales como comprimido, capsula, granulo, polvo y jarabe, y agentes parenterales tales como inyeccion, infusion por goteo, liposoma y supositorio. Estas preparaciones pueden producirse de una manera convencional usando excipientes, diluyentes, aglutinantes, agentes humectantes, agentes disgregantes, tensioactivos, lubricantes, agentes de dispersion, tampones, conservantes, auxiliares de disolucion, antisepticos, agentes aromatizantes, agentes calmantes y estabilizantes habitualmente usados. Los ejemplos de aditivos no toxicos utiles mencionados anteriormente incluyen lactosa, fructosa, glucosa, almidon, gelatina, estearato de magnesio, metilcelulosa o sales de la misma, etanol, acido dtrico, cloruro de sodio y fosfato de sodio.

La forma de administracion y el intervalo de dosis requerido de la misma dependen de la seleccion de los compuestos obtenidos, la finalidad de la administracion, la via de administracion, las propiedades de la preparacion y las afecciones del paciente, asf como la discrecion del medico. Sin embargo, el intervalo de dosis adecuado es de aproximadamente 1,0 a 1500 |jg, preferiblemente de aproximadamente 10 a 500 |jg, por kg de peso corporal del paciente. Teniendo en cuenta que la eficacia de la via de administracion vana, se espera que la dosis requerida cambie en un amplio intervalo. Por ejemplo, se espera que la administracion oral requiera una dosis mayor que para administracion por inyeccion intravenosa. Dichos cambios en el nivel de dosis pueden ajustarse usando un procedimiento de optimizacion empmca convencional bien entendido en este campo.

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En la presente memoria descriptiva, "tratamiento" en general significa obtener un efecto farmacologico y/o un efecto fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en vista de la prevencion completa o parcial de una enfermedad y/o de un smtoma, o puede ser terapeutico en vista de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o de un efecto adverso de la enfermedad. En la presente memoria descriptiva, "tratamiento" incluye tratamientos arbitrarios de enfermedades en mamfferos, en particular, seres humanos, por ejemplo, los siguientes tratamientos (a) a (c):

(a) Prevencion de la aparicion de una enfermedad o de un smtoma en un paciente que puede tener una predisposicion de la enfermedad o del smtoma, pero aun no se ha diagnosticado como que la predisposicion;

(b) Inhibicion de un smtoma de una enfermedad, es decir, prevencion de la progresion del smtoma;

(c) Mejora de un smtoma de la enfermedad, es decir, induccion de la regresion de la enfermedad o smtoma.

Como el anticuerpo o el antagonista de CX3CR1 que inhibe la interaccion de fractalcina y CX3CR1 usado en la presente invencion tiene una accion de inhibicion de la produccion de iNOS, tambien se proporciona un inhibidor de la produccion de iNOS que contiene el antagonista de CX3CR1 como ingrediente activo. El inhibidor de la produccion de iNOS puede prepararse como una composicion como el agente terapeutico mencionado anteriormente, y puede administrarse a un paciente que necesita inhibicion de la produccion de iNOS de la misma manera que para el agente terapeutico mencionado anteriormente.

A partir de ahora en este documento, se explicara la presente invencion en mas detalle con referencia a los ejemplos. Las abreviaturas usadas en la siguiente descripcion son de acuerdo con las usadas convencionalmente en este campo.

Ejemplo 1

Efecto de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) en modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y cD45RB fuertemente positivos (CD4+CD45RBhigh)

(1) Preparacion de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4)

El anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) se preparo por el siguiente metodo (patente japonesa abierta a inspeccion publica n.° 2002-345454). Se uso fractalcina de raton (R&D) como antigeno. El antfgeno se mezclo con adyuvante TiterMax, se inmunizaron hamsteres armenios con la mezcla y se realizaron inmunizaciones de refuerzo despues de ello con el antfgeno en solitario. El tttulo del anticuerpo en el suero se midio por ELISA. Se aislaron los linfocitos de los hamsteres armenios en que aumento el tftulo del anticuerpo, se mezclaron los linfocitos y las celulas de mieloma P3 a una relacion de 5:1, y las celulas se fusionaron usando PEG (Boehringer). Los hibridomas se cultivaron en una placa de 96 pocillos durante una semana usando RPMI-1640/FcS al 10% /HAT/Origen HCF al 10% (ISGN). Despues, se realizo ELISA para el sobrenadante de cultivo para identificar los pocillos positivos. Los hibridomas que producen anticuerpos anti-fractalcina de raton se sometieron a dilucion limitante dos veces para la clonacion. Los anticuerpos monoclonales se purificaron usando una columna de protema A del fluido asdtico preparado por inoculacion de los hibridomas en ratones SCID a los que se administro adyuvante incompleto de Freund. La actividad de neutralizacion se determino usando la inhibicion de la migracion de celulas que expresan CX3CR1 a fractalcina de raton como un mdice para obtener un anticuerpo neutralizante (5H8-4). El hibridoma que produce el anticuerpo neutralizante se denomino Ham @mFKN5H8-4.

(2) Metodo

En cuanto a la preparacion de un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos (CD4+CD45RBhigh), se hizo referencia a Powrie et al., Int. Immunol., 5, 1461-1471, 1993. Se retiraron los bazos de ratones Balb/c hembra de 8 a 10 semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc.) y se trituraron los tejidos en un tamiz celular (PharMingen) que tiene un diametro de poro de 100 pm para separar las celulas esplenicas. Las celulas esplenicas separadas, 5 ml de solucion de cloruro de amonio (cloruro de amonio al 0,75%, tampon Tris 16 mM, pH 7,4) se anadieron por cada bazo y la mezcla se dejo a temperatura ambiente durante 15 minutos para lisar los eritrocitos. A la solucion de celulas esplenicas, se le anadio PBS en un volumen de 2 veces y la mezcla se centrifugo a 1500 rpm durante 5 minutos, para recoger los precipitados. Los linfocitos T CD4 se purificaron de las celulas esplenicas separadas usando el kit de aislamiento de linfocitos T CD4 (Milteny). Para separar los linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos, los linfocitos T CD4 purificados se sometieron a doble tincion usando anticuerpo anti-CD4 marcado con ficoeritrina (PE) (eBioscience) y anticuerpo anti-CD45RB marcado con isotiocianato de fluorescema (FITC) (eBioscience). Despues de la doble tincion, clasificaron las celulas CD4 positivas y CD45RB fuertemente positivas usando FACSAria (Becton-Dickinson) para recoger las celulas objetivo. Las celulas recogidas se lavaron con PBS y despues se suspendieron en PBS a una densidad celular de 2 x 106 celulas/ml. Las celulas CD4 positivas y CD45RB fuertemente positivas anteriores se transfundieron en las cavidades peritoneales de ratones SCID hembra de 8 a 10 semanas de edad (Clea Japan, Inc.) en un volumen de 200 pl cada uno, es decir, 4 x 105 celulas/raton. A siete ratones SCID en cada grupo transfundidos con las celulas CD4 positivas y CD45RB fuertemente positivas se les dio

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500 |jg de un anticuerpo de control (IgG de hamster) o 500 jg del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) (anticuerpo en PBS) una vez cada tres desde dos semanas despues de la transfusion de las celulas. La administracion se realizo desde la vena caudal. Ademas, como grupo de control negativo, se usaron cuatro ratones SCID transfundidos con linfocitos T CD4 de raton (CD4 total) que se purificaron usando el kit de aislamiento de linfocitos T CD4 (Milteny) y no se separaron basandose en el nivel de expresion de CD45RB en una cantidad de 1,2 x 106 celulas/raton. Dos semanas despues de la administracion de cada anticuerpo, se realizo la autopsia y se realizo la evaluacion basandose en la perdida de peso corporal, los valores de consistencia de las deposiciones en el intestino grueso, el desarrollo de hipertrofia en el intestino grueso, el analisis de expresion del ARNm de iNOS y la observacion patologica. En cuanto a los valores de consistencia de las deposiciones, se usaron los valores de consistencia de las deposiciones usadas para el analisis de colitis inducida por sulfato de dextrano sodico (Cooper et al., Lab. Invest., 69, 238-249, 1993) mostrados en la tabla 1.

Tabla 1

Tabla 1 Valores de consistencia de deposiciones

Consistencia de las deposiciones

Valor 0

Normal

Valor 1

Deposicion suelta (la forma es sustancialmente normal)

Valor 2

Deposicion suelta (la forma esta mantenida)

Valor 3

Deposicion suelta (la forma es anomala)

Valor 4

Diarrea, se adhieren las deposiciones alrededor del ano

Ademas, para hipertrofia del intestino grueso, se midio un sitio de aproximadamente 1,5 cm desde la regional anal usando un calibre de grosor de cuadrante (Peacock) despues de retirar los contenidos intestinales. Ademas, el intestino grueso se sometio a observacion morfologica y a observacion histopatologica basada en tincion con hematoxilina y eosina de Mayer de secciones tisulares.

Ademas, se analizaron las expresiones de los ARNm para iNOS por PCR a tiempo real usando, como molde, ADNc obtenido purificando el ARN total (500 ng) del intestino grueso usando el RNeasy Mini Kit (QIAGEN) y transcribiendolo de forma inversa usando la transcriptasa inversa AMV (TAKARA) y un hexamero aleatorio (TAKARA). La PCR a tiempo real se realizo para una mezcla de reaccion preparada mezclando diversos cebadores con reactivos del kit de PCR QuantiTect SYBR Green (Qiagen) y uracil-ADN-glucosilasa (Invitrogen) usando el detector de secuencia ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). La PCR se realizo por reacciones a 50°C durante 2 minutos y a 95°C durante 15 minutos y 35 ciclos de reacciones a 95°C durante 15 segundos y a 60°C durante 1 minuto. Los conjuntos de cebadores usados son los siguientes.

Tabla 2

Cebador

miNOS codificante miNOS no codificante mfractalcina (FKN) codificante mfractalcina (FKN) no codificante mIFN-Y codificante mIFN-Y no codificante mTNFa codificante mTNFa no codificante mIL-4 codificante mIL-4 no codificante mPerforina codificante mPerforina no codificante mGranzimaB (GrB) codificante mGranzimaB (GrB) no codificante mFasL codificante

Tabla 2 Secuencia

5'-AGCTGAACTTGAGCGAGGAG-3' 5'- TGCCCCATAGGAAAAGACTG-3' 5'- GGCAAGATGACCTCACGAAT-3' 5'- CTGTGTCGTCTCCAGGACAA-3' 5'- GCTTTAACAGCAGGCCAGAC-3' 5'- GGAAGCACCAGGTGTCAAGT-3' 5'- CCAGTGTGGGAAGCTGTCTT-3' 5'- AAGCAAAAGAGGAGGCAACA-3' 5'- GGCATTTTGAACGAGGTCAC-3' 5'- AAATATGCGAAGCACCTTGG-3' 5'- TGCAAGCAGAAGCACAAGTT-3' 5'- TGTGTGTTCACTGGGAAGGA-3' 5'- CCATCGTCCCTAGAGCTGAG-3' 5'- GCTGGTCCTTGTGAATGGAT-3' 5'- CTGTGGCTACCGGTGGTATT-3'

SEQ ID NO: 1 2

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mFasL no codificante mFas codificante mFas no codificante

(3) Resultados

La perdida de peso corporal se suprimio en el grupo de administracion con anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) en comparacion con el grupo de administracion de anticuerpo de control (Fig. 1). Ademas, los valores de consistencia de las deposiciones en el intestino grueso y la hipertrofia del intestino grueso se mejoraron en el grupo de administracion de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) en comparacion con el grupo de administracion del anticuerpo de control (Fig. 2). En cuanto a la observacion morfologica de los sitios del intestino grueso, se observo hipertrofia en sitios del colon al recto en el grupo de administracion de anticuerpo de control, y se observo mejora por la administracion de los anticuerpos anti-fractalcina (5H8-4) (Fig. 3). En tincion de secciones tisulares, una cantidad muy grande de leucocitos (tales como linfocitos T, monocitos y macrofagos) se infiltraron en la capa mucosa del intestino grueso y se observo desaparicion de las celulas caliciformes que producen moco y dano e hiperplasia de los tejidos epiteliales del intestino grueso en el grupo de anticuerpo de control. En contraste, en el grupo de administracion de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) se inhibio la infiltracion de leucocitos y las celulas epiteliales del intestino grueso estaban escasamente danadas (Fig. 4). Ademas, en cuanto a la expresion del ARNm, la expresion del ARNm de iNOS aumento en el grupo de administracion de anticuerpo de control, pero la expresion se inhibio notablemente por los anticuerpos anti-fractalcina (5H8-4). Ademas, las expresiones de los ARNm para los factores citotoxicos tales como perforina, Fas y FasL y citocinas tales como IFNy y TNFa tambien aumentaron en el grupo de administracion de anticuerpo de control. En contraste, se observo la inhibicion de estas expresiones en el grupo de administracion de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) (Fig. 5). Los resultados anteriores revelaron que la ruta de fractalcina CX3CR1 desempenaba una funcion importante en el modelo de enfermedad inflamatoria del intestino transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos (CD4+CD45RBhigh). Se dedujo que la accion inhibfa la produccion excesiva de NO inhibiendo la produccion de iNOS y mejoraba los danos tisulares. Es decir, se sugirio que la inhibicion de la produccion de iNOS basada en la inhibicion de la interaccion de fractalcina y CX3CR1 era un sistema de tratamiento util para enfermedades inflamatorias del intestino.

Ejemplo 2

Efecto del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) en modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxazolona en raton

(1) Metodo

En cuanto al modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxazolona en raton, se hizo referencia a lijima et al., J. Exp. Med., 199, 471-482, 2004. Se guardaron los abdomenes de ratones Balb/c macho de 8 a 10 semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc.) en una casilla de aproximadamente 2 cm. A cada raton, se le aplicaron 150 pl de solucion de etanol al 100% que contema 4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona al 3% (a partir de ahora en este documento mencionada como oxazolona, Sigma). Los animales se mantuvieron en ayunas en el cuarto dfa despues de la sensibilizacion con oxazolona, y en el quinto dfa, se les administro una inyeccion intestinal de 100 pl cada una de etanol al 50%/solucion salina fisiologica que contema oxazolona al 0,5% en un sitio aproximadamente 3 cm desde el ano con anestesia por eter dietflico. Como grupo de control negativo, a cinco ratones Balb/c normales se les administro una inyeccion intestinal de 100 pl cada una de etanol al 50%/solucion salina fisiologica. A siete ratones en cada grupo a los que se les habfa administrado la inyeccion intestinal de oxazolona, se les administro 500 pg de un anticuerpo de control (IgG de hamster) o 500 pg del anticuerpo anti- fractalcina (5H8-4) (anticuerpo en PBS). El anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) se administro en el quinto dfa despues de la sensibilizacion (inmediatamente antes de la inyeccion intestinal de oxazolona). El anticuerpo se administro desde la vena caudal. La evaluacion se realizo para los puntos de evaluacion de mdice de actividad de enfermedad (a partir ahora en este documento mencionado como DAI, la consistencia de las deposiciones, el contenido de sangre y la ganancia y perdida de peso corporal se representaron por valores, y se calcularon los valores de DAI), acortamiento del intestino grueso, hipertrofia del intestino grueso y observacion patologica. En cuanto a DAI, se uso el DAI usado para la evaluacion de colitis inducida por sulfato de dextrano sodico (Cooper et al., Lab. Invest., 69, 238-249, 1993) mostrado en la tabla 3.

5'-GTTCTGCCAGTTCCTTCTGC-3' 16

5'- GGAGACAGGATGACCCTGAA-3' 17

5'- TTCAGCAATTCTCGGGATGT-3' 18

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Tabla 3

Tabla 3: DAI

Perdida de peso corporal Consistencia en las deposiciones Sangre en las deposiciones

Valor 0

0% Normal Normal

Valor 1

0-5% Deposicion solida (la forma es sustancialmente normal) Rastros de sangre en las deposiciones

Valor 2

5-10% Deposicion suelta (se mantiene la forma) Sangre en las deposiciones (aproximadamente en la mitad de las deposiciones)

Valor 3

10-15% Deposicion suelta (la forma es anomala) Sangre en las deposiciones (en la mayona de la deposicion)

Valor 4

> 20% Diarrea, las deposiciones se adhieren alrededor del ano Hemorragia

Ademas, como se observo diarrea y deposiciones sueltas desde el segundo d^a despues de la inyeccion intestinal de oxazolona, se vigilo el DAI a lo largo del tiempo. El intestino grueso se sometio a observacion morfologica y a observacion histopatologica basada en tincion con hematoxilina y eosina de Mayer de secciones tisulares.

(2) Resultados

En comparacion con el grupo de administracion de anticuerpo de control, el grupo de administracion de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) mostro un DAI mejorado desde el segundo dfa despues de la inyeccion intestinal de oxazolona (Fig. 6). Ademas, la hipertrofia y el acortamiento del intestino grueso tambien se mejoraron en el grupo de administracion de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) en comparacion con el grupo de administracion de anticuerpo de control (Fig. 7). En la observacion morfologica de los sitios del intestino grueso, se observo hipertrofia en sitios desde el colon hasta el recto en el grupo de administracion de anticuerpo de control, pero se observo mejora por la administracion de los anticuerpos anti-fractalcina (5H8-4) (Fig. 8). En la tincion de secciones tisulares, se observo una cantidad muy grande de leucocitos (linfocitos T, monocitos y macrofagos) infiltrados en la capa mucosa del intestino grueso y desaparicion de las celulas caliciformes que producen moco y dano e hipertrofia en los tejidos epiteliales del intestino grueso en el grupo de anticuerpo de control. En contraste, en el grupo de administracion de anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4), se inhibio la infiltracion de leucocitos y las celulas epiteliales del intestino grueso estaban escasamente danadas (Fig. 9). Se esperaba a partir de los resultados anteriores que el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 desempenara una funcion importante tambien en el modelo de colitis inducida por oxazolona, y se sugirio que el sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 fuera un sistema de tratamiento util para enfermedades inflamatorias del intestino.

Ejemplo 3

Efecto del anticuerpo anti-fractalcina (n.° 126) en modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxazolona en raton

(1) Preparacion de anticuerpo anti-fractalcina (n.° 126)

Se mezclo fractalcina de raton (Genzyme) y adyuvante Titer Max™ Gold, y despues se usaron para inmunizar hamsteres armenios dos o mas veces, y se realizo adicionalmente la inmunizacion final con la fractalcina de raton en solitario. El tttulo del anticuerpo en el suero se midio por ELISA usando fractalcina en fase solida, y se aislaron los linfocitos de los hamsteres armenios en que aumento el tftulo de anticuerpo. Los linfocitos y las celulas de mieloma P3 se mezclaron a una relacion de 5:1, y se realizo la fusion celular usando PEG (Rosh). Los hibridomas se cultivaron en una placa durante una semana usando RPMI-1640/FCS al 10% /HAT/Origen HCF al 10% (ISGN). Despues, el sobrenadante de cultivo se ensayo por ELISA usando fractalcina en fase solida para identificar los pocillos positivos. Los hibridomas que producen los anticuerpos anti-fractalcina se clonaron realizando dilucion limitante dos veces. Usando una columna de protema A, se purificaron los anticuerpos monoclonales del fluido ascftico preparado por inoculacion del hibridoma en ratones SCID y atfmicos a los que se habfa administrado pristina. La actividad de neutralizacion de los anticuerpos obtenidos se determino usando inhibicion de la migracion de celulas que expresan CX3CR1 a fractalcina de raton como un mdice, y se obtuvo el anticuerpo n.° 126 que tema actividad de neutralizacion. El hibridoma que produce el anticuerpo neutralizante se denomino Ham @mFKN#126.1.1.

(2) Metodo

Se realizo una investigacion de la misma manera que la usada en el ejemplo 2. Los puntos de evaluacion fueron acortamiento e hipertrofia del intestino grueso. A siete ratones en cada grupo a los que se les habfa administrado la

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inyeccion intestinal de oxazolona, se les administro 500 |jg de un anticuerpo de control (IgG de hamster) o 500 |jg del anticuerpo anti-fractalcina (n°. 126) (anticuerpo en PBS).

(3) Resultados

Como el anticuerpo anti-fractalcina 5H8-4, el anticuerpo anti-fractalcina n.° 126 mejoro el acortamiento y la hipertrofia del intestino grueso en comparacion con el anticuerpo de control (Fig. 10). Estos resultados sugieren fuertemente que la inhibicion del sistema de infiltracion celular de fractalcina-CX3CR1 era util para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino ya que dos tipos diferentes de anticuerpos anti-fractalcina mostraban efectos en el modelo de colitis inducida por oxazolona.

Ejemplo 4 (Referencia)

Expresion de iNOS en hepatitis inducida por ConA y efecto del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) en la produccion de iNOS

(1) Metodo

A cuatro ratones C57BL/6 en cada grupo, se les administro por via intravenosa 500 jg de un anticuerpo de control (IgG de hamster) o 500 jg del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) (anticuerpos en PBS), e inmediatamente despues se les administro por via intravenosa 12 mg/kg de concanavalina A (ConA, Sigma Aldrich). Se retiro el tugado dos horas despues y se extrajo el ARN. Como grupo de control negativo, se proporcionaron cuatro ratones C57BL/6 a los que se les habfa administrado por via intravenosa PBS (tampon fosfato). Se midio la expresion de ARNm para iNOS recogiendo el ARN, sintetizando el ADNc y midiendolo por PCR a tiempo real de la misma manera que la usada en el ejemplo 1. Ademas, 12 horas despues de la administracion intravenosa del anticuerpo de control o del anticuerpo anti-fractalcina y ConA, o PBS para el grupo de control negativo, se retiro el tugado y se prepararon secciones tisulares congeladas. Se realizo tincion inmunohistologica con los anticuerpos anti-iNOS y los anticuerpos anti-CX3CR1 y se contaron las celulas iNOS y CX3CR1 positivas.

(2) Resultados

La expresion del ARNm para iNOS aumentada por la administracion de ConA disminuyo notablemente por la administracion del anticuerpo anti-fractalcina. Ademas, las expresiones de los ARNm para los factores citotoxicos tales como granzima B y Fas y citocinas tales como IFNy, TNFa e IL-4 aumentaron por la administracion de ConA, y estas expresiones disminuyeron por la administracion del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) (Fig. 11). Ademas, los resultados de la tincion inmunohistologica mostraron que las celulas inflamatorias iNOS positivas aumentaban por la administracion de ConA y disminrnan notablemente por la administracion del anticuerpo anti-fractalcina (Fig. 12). Ademas, las celulas inflamatorias CX3CR1 positivas tambien aumentaron por la administracion de ConA y disminuyeron notablemente por la administracion del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) (Fig. 12). Los resultados anteriores revelaron que, inhibiendo la interaccion de fractalcina y CX3CR1, se inhibfa la expresion del ARNm para iNOS en el tugado de hepatitis inducida por ConA, y se inhibfa la produccion de iNOS en celulas inflamatorias y, por tanto, se sugirio que el dano tisular en el tugado se mejoraba por la inhibicion de la produccion excesiva de NO por las celulas inflamatorias.

Ejemplo 5 (Referencia)

Analisis de celulas que expresan CX3CR1 e iNOS en hepatitis inducida por ConA

Los resultados de la tincion inmunohistologica se analizaron en detalle. La mayona de las celulas CX3CR1 positivas eran pequenas y redondas, y teman un nucleo con forma de herradura y una pequena cantidad de citoplasma. Existfan adyacentes a la vena porta, la vena central y la sinusoide, y una parte de ellas se observaron tambien en las periferias de regiones necroticas. La mayona de las celulas iNOS positivas estaban en gran medida agrandadas y teman un nucleo con forma de herradura y una gran cantidad de citoplasma. Existfan adyacentes a la sinusoide y tambien se observaron en regiones necroticas ademas de sus periferias, pero no en las cercamas de la vena porta o de la vena central. Como se observaron diferencias entre las celulas CX3CR1 positivas y las celulas iNOS positivas en su morfologfa y localizacion como se describe anteriormente, se analizaron en detalle las caractensticas de las celulas CX3CR1 positivas y de las celulas iNOS positivas.

(1) Metodo

De la misma manera que la usada en el ejemplo 4, se prepararon secciones tisulares congeladas usando el hfgado obtenido 12 horas despues de la administracion intravenosa de ConA (tejido hepatico con hepatitis inducida por ConA). Se realizo tincion de doble fluorescencia con el anticuerpo anti-CX3CR1 o con el anticuerpo anti-iNOS (BD Bioscience) y el anticuerpo anti-BM8 (BMA), el anticuerpo anti-CD11b (eBioscience) o el anticuerpo anti-MCP-1 (Gengyme Techne), y se midieron las tasas de BM8, CD11b y MCP-1 positivas en las celulas CX3CR1 positivas y en las celulas iNOS positivas.

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El anticuerpo CX3CR1 mencionado anteriormente se prepare en conejos usando un peptido C-terminal CX3CR1 de raton (CSlLSSFTHYTSEGDGSLLL (SEQ ID NO: 31)) como antigeno. Espedficamente, se obtuvieron del siguiente modo. Un peptido sintetico de la SEQ ID NO: 31 se unio a KLH y se uso para inmunizar conejos (JW) en una cantidad de 250 pg/conejo de una vez con un adyuvante. Como adyuvante, se uso el adyuvante completo de Freund solamente para la inmunizacion inicial y se uso el adyuvante incompleto de Freund para las otras inmunizaciones restantes. La inmunizacion se realizo cinco veces en total. Se confirmo el aumento en el tftulo del anticuerpo por ELISA usando un peptido en fase solida, y se recogio el suero. Se realizo purificacion por afinidad usando el peptido que tiene la secuencia mencionada anteriormente unido a tiopropil Sephrose 4B (Amersham Bioscience) para obtener el anticuerpo anti-CX3CR1 del suero recogido.

Ademas, las celulas CX3CR1 positivas en la sangre periferica (PBL) y las celulas de medula osea de ratones C57BL/6 macho de 9 semanas de edad se cultivaron con M-CSF (50 ng/ml) durante cinco dfas, y se analizaron las celulas CX3CR1 positivas entre los macrofagos (BMM$) diferenciados de las celulas de medula osea por citometna de flujo (FACS) para F4/80 espedfico de macrofagos y monocitos y Ly6C, un marcador de superficie de celulas del sistema de la medula osea inmaduras, usando anticuerpo anti-F4/80 (CALTAG) y anticuerpo anti-Ly6C (BMA). Ademas, se realizo la tincion tisular de los tejidos hepaticos con hepatitis inducida por ConA con el anticuerpo anti- Ly6C y la tincion tisular de los tejidos hepaticos con hepatitis inducida por ConA infiltrados con macrofagos marcados con fluorescencia con el anticuerpo anti-MCP-1.

(2) Resultados

Se muestran imagenes de tincion representativas en la Fig. 13. En la figura, las letras a la izquierda y en la parte superior de las fotograffas representan los marcadores reconocidos por los anticuerpos usados en la tincion de fluorescencia. La longitud de la barra es de 20 pm. Los resultados de la medicion para la tasa positiva de cada marcador se muestran en la Fig. 14. En la figura, BM8+ indica BM8 positiva, CD11b+ indica CD11b positiva y MCP1+ indica MCP-1 positiva.

Las celulas CX3CR1 positivas comprendfan 68,9 ± 2,7% (n = 3) de celulas CD11b positivas pequenas y redondas y 53,4 ± 2,0% (n = 3) de celulas BM8 positivas grandes y agrandadas. Por otro lado, las celulas iNOS positivas comprendfan 81,6 ± 1,8% (n = 3) de celulas BM8 positivas grandes y agrandadas y 12,6 ± 3,0% (n = 3) de celulas CD11b positivas. Por lo tanto, se revelo que las celulas CX3CR1 positivas no eran necesariamente celulas iNOS positivas, y una parte de ellas se expresaba en otro grupo de celulas. Se ha informado recientemente de que CCR2 esta implicado en la infiltracion de celulas productoras de iNOS en un modelo de raton de infeccion bacteriana (documento que no es patente 13). Por consiguiente, se analizo la expresion de MCP-1, un ligando de CCR2. Las celulas MCP-1 positivas son pequenas y redondas como las celulas CX3CR1 positivas. MCP-1 se expreso en 72,5 ± 3,7% (n = 3) de las celulas CX3CR1 positivas y la mayona de las celulas MCP-1 positivas eran CX3CR1 positivas. Por lo tanto, se revelo que las celulas CX3CR1 positivas eran celulas principales entre las celulas que expresan MCP-1 en hepatitis inducida por ConA. Ademas, como se esperaba a partir de las diferencias morfologicas entre las celulas MCP-1 positivas y las celulas iNOS positivas, MCP-1 se expresaba en solamente un 14,6 ± 2,2% (n = 3) de las celulas iNOS positivas, y estaban escasamente solapadas entre sf. Por lo tanto, se descubrio que la mayona de las celulas iNOS positivas no eran celulas CX3CR1/MCP-1 positivas. De forma interesante, las celulas iNOS positivas y las celulas MCP-1 positivas existian adyacentes entre sf a una alta frecuencia en los vasos sinusoides y en lesiones necroticas en el hfgado.

Los resultados del analisis de las celulas CX3CR1 positivas basado en FACS se muestran en la Fig. 15. Los resultados de la tincion tisular se muestran en la Fig. 16.

Como resultado del analisis de las celulas CX3CR1 positivas por FACS usando sangre periferica (PBL), CX3CR1 se expresaba en los monocitos F4/80 positivos y el nivel de expresion era elevado en los monocitos maduros Ly6C y bajo en los monocitos inmaduros Ly6C+. Como resultado de la tincion tisular del tngado obtenido 12 horas despues de la administracion de ConA con Ly6C, que es un marcador de superficie de celulas del sistema de la medula osea inmaduras, se sugirio que las celulas iNOS positivas y F4/80 positivas eran Ly6C positivas, y derivaban de monocitos inmaduros. Posteriormente, se cultivaron celulas de medula osea de ratones C57BL/6 macho de 9 semanas de edad con M-CSF (50 ng/ml) durante cinco dfas para obtener macrofagos (BMM$) diferenciados de celulas de medula osea. Los macrofagos de BMM$ adheridos se recogieron con EDTA 1mM/PBS y se analizaron por FACS. Como resultado, eran CX3CR1hi F4/80+ Ly6C-/low como los monocitos maduros de sangre periferica. Entonces, los macrofagos BMM$ se marcaron con fluorescencia usando CFSE 10 pM, se inyectaron por via intravenosa 2,5 x 106 celulas/250 pl a los ratones, se inyecto por via intravenosa adicionalmente ConA (15 mg/kg) diez minutos despues y se recogio el hfgado 12 horas despues para el examen de la infiltracion. La infiltracion de BMM$ al hfgado aumento notablemente por la administracion de ConA. Ademas, las celulas marcadas con fluorescencia infiltradas produdan MCP-1 a causa de la administracion de ConA. No se expresaba iNOS en las celulas marcadas con fluorescencia y obtenidas del hospedador.

Los resultados anteriores sugirieron que los monocitos maduros CX3CR1 positivos infiltrados en los sitios de inflamacion tras la inflamacion expresan MCP-1 e inducen infiltracion de monocitos inmaduros que producen iNOS

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en los sitios de inflamacion, y de ese modo causan afecciones patologicas.

Ejemplo 6 (Referencia)

Expresiones de quimiocinas en hepatitis inducida por ConA y efecto del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) sobre las expresiones de quimiocinas

(1) Metodo

Se midieron las expresiones de los ARNm para quimiocinas por PCR a tiempo real de la misma manera que la usada en el ejemplo 1 usando ADNc derivado del hngado dos horas despues de la administracion intravenosa de ConA preparada en el ejemplo 4. Los conjuntos de cebadores usados fueron los siguientes. Se uso el gen de la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) como gen de control.

Tabla 4

Tabla 4

Cebador

mMCP-1 codificante mMCP-1 no codificante mKC codificante mKC no codificante mMIP-2 codificante mMIP-2 no codificante mIP-10 codificante mIP-10 no codificante mMIP-1a codificante mMIP-1a no codificante mMIP-1j6 codificante mMIP-1^ no codificante

(2) Resultados

Los resultados se muestran en la Fig. 17. En la figura, "normal" indica un control negativo, "control" indica un grupo de administracion de anticuerpo de control y "anti-FKN" indica un grupo de administracion de anti-fractalcina.

Dos horas despues de la administracion de ConA, las expresiones de los ARNm para MCP-1, KC, MIP-2, IP-10, MIP-1a y MIP-1p aumentaron en el hngado. Las expresiones de los ARNm para estas quimiocinas disminuyeron por la administracion del anticuerpo anti-fractalcina. Estos resultados sugirieron que la produccion de muchos tipos de quimiocinas se inhibfa por la inhibicion de la interaccion de fractalcina y CX3CR1 y, por tanto, la amplificacion de la ruta de infiltracion de celulas inflamatorias y la activacion como reacciones de la induccion de inflamacion inicial se vuelve ampliamente no funcional.

Ejemplo 7

Expresiones de los ARNm para marcadores de superficie celular, citocinas, quimiocinas, moleculas de activacion celular y moleculas citotoxicas y efecto del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) sobre las expresiones de los ARNm para marcadores de superficie celular, citocinas, quimiocinas, moleculas de activacion celular y moleculas citotoxicas en modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de raton transfundido con linfocitos T CD4 positivos y CD45RB fuertemente positivos (CD4+CD45RBhigh)

(1) Metodo

Se midieron las expresiones de los ARNm para marcadores de leucocitos, citocinas, quimiocinas y moleculas implicadas en la activacion celular y en la destruccion tisular en mas detalle por PCR TaqMan de la misma manera que la usada en el ejemplo 1 usando ADNc derivado del intestino grueso preparado en el ejemplo 1.

Los conjuntos de cebadores usados fueron los siguientes.

Tabla 5-1

Secuencia SEQ ID NO:

5'-AGGTCCCTGTCATGCTTCTG-3' 19

5'- TCATTGGGATCATCTTGCTG-3' 20

5'- CTTGAAGGTGTTGCCCTCAG-3' 21

5'- TGGGGACACCTTTTAGCATC-3' 22

5'- TCCAGAGCTTGAGTGTGACG-3' 23

5'- GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC-3' 24

5'- TGAATCCGGAATCTAAGACCA-3' 25

5'- GAGGCTCTCTGCTGTCCATC-3' 26

5'- ACCATGACACTCTGCAACCA-3' 27

5'- GATGAATTGGCGTGGAATCT-3' 28

5'- CCCACTTCCTGCTGTTTCTC-3' 29

5'- CTCACTGGGGTTAGCACAGA-3' 30

Cebadores

Tabla 5

Secuencia

CD4 codificante

CD4 no codificante

F4/80 codificante

F4/80 no codificante

T-bet codificante

T-bet no codificante

CD11c codificante

CD11c no codificante

M-CSF receptor codificante

M-CSF receptor no codificante

Ly-6G codificante

Ly-6G no codificante

IL-1p codificante

IL-1p no codificante

IL-6 codificante

IL-6 no codificante

IL-12a codificante

IL-12a no codificante

IL-12p codificante

IL-12p no codificante

IL-23a codificante

IL-23a no codificante

IL-17 codificante

IL-17 no codificante

RANKL codificante

RANKL no codificante

5'- GGGCTGTGGCAGTGTCTACT -3'

5'- CTGGTTCACCCCTCTGGATA -3'

5'- TGCCTCCCTGACTTTCAAAT -3'

5'- TGGCATTGCTGTATCTGCTC -3'

5'- GGGAAGCTAAAGCTCACCAA -3'

5'- CCTCTGGCTCTCCATCATTC -3'

5'- CTTATCGTGGGCAGCTCAGT -3'

5'- CCATTTGCTTCCTCCAACAT -3'

5'- CGACTTCTTCAAGTGACTCCTTC -3' 5'- CTACGTCCCGGTGGATGC -3'

5'- GATGGATTTTGCGTTGCTCT -3'

5'- GTCCAGAGTAGTGGGGCAGA -3'

5'- GCTGAAAGCTCTCCACCTCA -3'

5'- AGGCCACAGGTATTTTGTCG -3'

5'- CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG -3' 5'- GCCACTCCTTCTGTGACTCC -3'

5'- GCCAGGTGTCTTAGCCAGTC -3'

5'- TCTTCAATGTGCTGGTTTGG -3'

5'- ATCCAGCGCAAGAAAGAAAA -3'

5'- AATAGCGATCCTGAGCTTGC -3'

5'- CAACAGCCAGTTCTGCTTGC -3'

5'- GATCCTCTGGCTGGAGGAG -3'

5'- TCCAGAAGGCCCTCAGACTA -3'

5'- TGAGCTTCCCAGATCACAGA -3'

5'- CATTTGCACACCTCACCATC -3'

5'- TCCGTTGCTTAACGTCATGT -3'

Tabla 5-2 5

Cebador

Tabla 5 (continuacion)

Secuencia

KC codificante KC no codificante MIP-2 codificante MIP-2 no codificante MCP-1 codificante MCP-1 no codificante MCP-3 codificante MCP-3 no codificante CXCR2 codificante CXCR2 no codificante CCR2 codificante CCR2 no codificante MIP-1a codificante MIP-1a no codificante

5'- CTTGAAGGTGTTGCCCTCAG -3' 5'- TGGGGACACCTTTTAGCATC -3' 5'- TCCAGAGCTTGAGTGTGACG -3' 5'- GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC -3' 5'- AGGTCCCTGTCATGCTTCTG -3' 5'- TCATTGGGATCATCTTGCTG -3' 5'- CTGCTTTCAGCATCCAAGTG -3' 5'- CCCAGGGACACCGACTACT -3' 5'- GCTCACAAACAGCGTCGTAG -3' 5'- AGGGCATGCCAGAGCTATAA -3' 5'- CTTTGCAACTGCCTCTTTCC -3' 5'- TTCCCAGGAAGAGGTTGAGA -3' 5'- ACCATGACACTCTGCAACCA -3' 5'- GATGAATTGGCGTGGAATCT -3'

SEQ ID NO:

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

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46

47

48

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50

51

52

53

54

55

56

57

SEQ ID NO:

58

59

60 61 62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

5

MIP-1p codificante

5'-

MIP-1p no codificante

5'-

CCR5 codificante

5'-

CCR5 no codificante

5'-

TARC codificante

5'-

TARC no codificante

5'-

MDC codificante

5'-

MDC no codificante

5'-

CCR4 codificante

5'-

CCR4 no codificante

5'-

IP-10 codificante

5'-

IP-10 no codificante

5'-

CCCACTTCCTGCTGTTTCTC -3' CTCACTGGGGTTAGCACAGA -3' GCCAGAGGAGGTGAGACATC -3' GCCAGAGGAGGTGAGACATC -3' TGCTTCTGGGGACTTTTCTG -3' CATCCCTGGAACACTCCACT -3' TTCTTGCTGTGGCAATTCAG -3' GCAGGATTTTGAGGTCCAGA -3' TGTCCTCAGGATCACTTTCAGA -3' AGCAGGAGAAGCCAATGAGA -3' TGAATCCGGAATCTAAGACCA -3' GAGGCTCTCTGCTGTCCATC -3'

Tabla 5-3

Cebador

I-TAC codificante

I-TAC no codificante

CXCR3 codificante

CXCR3 no codificante

CD40 codificante

CD40 no codificante

CD40L codificante

CD40L no codificante

CD80 codificante

CD80 no codificante

CD86 codificante

CD86 no codificante

Clase II codificante

Clase II no codificante

TLR2 codificante

TLR2 no codificante

bFGF codificante

bFGF no codificante

VEGF Receptor 2 codificante

VEGF Receptor 2 no codificante

MMP-2 codificante

MMP-2 no codificante

MMP-9 codificante

MMP-9 no codificante

MMP-14 codificante

MMP-14 no codificante

Tabla 5 (continuacion)

Secuencia

5'- CAAGCAAGCTCGCCTCATA -3'

5'- GCATGTTCCAAGACAGCAGA -3'

5'- GTTCTGCTGGTCTCCAGAGG -3'

5'- TGCCACCACCACTACCACTA -3'

5'- GTCGGCTTCTTCTCCAATCA -3'

5'- GCATCCGGGACTTTAAACC -3'

5'- TGGATCTGTGCTTTTTGCTG -3'

5'- CCTTCTCCTTTGTTGCATCTC -3'

5'- GCTGAACAGACCGTCTTCCT -3'

5'- GTTTGCAGAGCCAGGGTAGT -3'

5'- TTCAGCAAAACCAAATGCAG -3'

5'- TGCACTTCTTATTTCAGGCAAA -3' 5'- TCTACACCTGCGTGGTTCAG -3'

5'- GCCAACACAGAAGATGATGAAG -3' 5'- TAGGGGCTTCACTTCTCTGC -3'

5'- CCAAAGAGCTCGTAGCATCC -3'

5'- CCAACCGGTACCTTGCTATG -3'

5'- GTGCCACATACCAACTGGAG -3'

5'- CCAAGCTCAGCACACAGAAA -3'

5'- TCAGAATCACGCTGAGCATT -3'

5'- CCCCTGATGTCCAGCAAGTA -3'

5'- TGCGATGAGCTTAGGGAAAC -3'

5'- AGACGACATAGACGGCATCC -3'

5'- GTGGTTCAGTTGTGGTGGTG -3'

5'- CTGGGAAGGAATCCCTGAAT -3'

5'- CTGGGAAGGAATCCCTGAAT -3'

72

73

74

75

76

77

78

79

80 81 82 83

SEQ ID NO:

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

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100 101 102

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106

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108 109

(2) Resultados

En el grupo de administracion de anticuerpo de control, aumentaban las expresiones de los ARNm para diversos marcadores de leucocitos tales como CD4, T-bet, F4/80, receptor de M-CSF (M-CSF R), Ly-6G y CD11c (Fig. 18). Estos resultados sugirieron una posibilidad de que los numerosos leucocitos infiltrados en el grupo de administracion

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de anticuerpo de control observados en la tincion de secciones tisulares del ejemplo 1 podnan estar constituidos por muchos tipos de leucocitos tales como linfocitos T CD4+ (en particular, linfocitos T CD4+ de tipo Thl), monocitos/macrofagos, neutrofilos y celulas dendnticas. Ademas, como los aumentos en las expresiones de los ARNm para quimiocinas-receptores de quimiocinas tales como KC, MIP-2, CXCR2, MCP-1, MCP-3, CCR2, MIP-1a, MIP-1p, CcR5, IP-10, I-TAC, CXCR3, TARC, MDC y CCR4 se observaron en el grupo de administracion de anticuerpo de control, se dedujo que los leucocitos infiltrados se infiltraban a traves de estos mecanismos de quimiocina-receptor de quimiocina (Fig. 19 y 20). Ademas, tambien se observaron aumentos notables en las expresiones de los ARNm para una serie de citocinas inflamatorias tales como as IL-1p, IL-6, IL-12a, IL-12p, IL-23a, IL-17 y RANKL, proteasas MMP-2, MMP-9 y MMP-14 implicadas en la destruccion tisular y ademas de bFGF y el receptor 2 de VEGF implicado en neovascularizacion en sitios de inflamacion en el grupo de administracion de anticuerpo de control (Fig. 21 y 22).

Ademas, como se observaron aumentos en las expresiones de CD40 y TLR2, receptores de activacion de celulas dendnticas, CD40L, una molecula que se expresa en linfocitos T activados y activa las celulas dendnticas, moleculas del grupo de moleculas de co-senalizacion de activacion de linfocitos T tales como CD80 y CD86, cuya expresion se potencia por la activacion de celulas dendnticas y MHC de clase II, se sugirio una posibilidad de que las celulas presentadoras de antigeno tales como linfocitos T y celulas dendnticas se activaban en sitios de lesion, y los sistemas de inmunidad adquirida espedficos de antigeno podnan estar funcionando (Fig. 23). Las expresiones de los ARNm para la serie de marcadores de leucocitos, quimiocinas-receptores de quimiocinas, citocinas, moleculas de destruccion tisular, moleculas relacionadas con neovascularizacion y moleculas de activacion de linfocitos T/celulas dendnticas se inhibfan notablemente por la administracion de los anticuerpos anti-fractalcina (Fig. 18 a 23). Los resultados anteriores sugirieron una posibilidad de que mediante la inhibicion de la interaccion de fractalcina y CX3CR1, se inhibiera la produccion de citocinas y quimiocinas inflamatorias, por tanto, la amplificacion de la ruta de infiltracion de celulas inflamatorias y activacion quedaba ampliamente no funcional, y se prevema la progresion de afecciones patologicas en enfermedad inflamatoria del intestino.

Ejemplo 8

Expresiones de los ARNm para marcadores de superficie celular, citocinas, quimiocinas, moleculas de activacion celular y moleculas citotoxicas y efecto del anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) sobre las expresiones de los ARNm para marcadores de superficie celular, citocinas, quimiocinas, moleculas de activacion celular y moleculas citotoxicas en modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por oxazolona en raton

(1) Metodo

Se preparo un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de la misma manera que la usada en el ejemplo 2. El anticuerpo de control y el anticuerpo anti-fractalcina (5H8-4) administraron de acuerdo con el metodo del ejemplo 2. La autopsia se realizo 24 horas y tres dfas despues de la inyeccion intestinal de oxazolona, se retiro el intestino grueso y despues se extrajo el ARN de los tejidos del intestino grueso de la misma manera que la usada en el ejemplo 1. Al grupo de control negativo se le administro una inyeccion intestinal de etanol al 50%/solucion salina fisiologica. Se midieron las expresiones de los ARNm para citocinas y quimiocinas por PCR TaqMan de la misma manera que la usada en el ejemplo 1 extrayendo el ARN y despues sintetizando ADNc. Los conjuntos de cebadores usados son los siguientes.

Tabla 6

Cebador

Tabla 6 Secuencia SEQ ID NO:

IL-1p codificante

5'- GCTGAAAGCTCTCCACCTCA -3' 110

IL-1p no codificante

5'- AGGCCACAGGTATTTTGTCG -3' 111

IL-6 codificante

5'- CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG -3' 112

IL-6 no codificante

5'- GCCACTCCTTCTGTGACTCC -3' 113

Ly-6G codificante

5'- GATGGATTTTGCGTTGCTCT -3' 114

Ly-6G no codificante

5'- GTCCAGAGTAGTGGGGCAGA -3' 115

KC codificante

5'- CTTGAAGGTGTTGCCCTCAG -3' 116

KC no codificante

5'- TGGGGACACCTTTTAGCATC -3' 117

MIP-2 codificante

5'- TCCAGAGCTTGAGTGTGACG -3' 118

MIP-2 no codificante

5'- GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC -3' 119

MCP-1 codificante

5'- GGTCCCTGTCATGCTTCTG -3' 120

MCP-1 no codificante

5'- TCATTGGGATCATCTTGCTG -3' 121

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un agente terapeutico que comprende un anticuerpo o un antagonista de CX3CR1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino, en el que dicho anticuerpo o dicho antagonista de CX3CR1 inhibe una

   5 interaccion de fractalcina y CX3CR1.
2. 2. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-fractalcina.
3. 3. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo anti-fractalcina es un anticuerpo

   10 monoclonal.
4. 4. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enfermedad inflamatoria del intestino es colitis ulcerante o enfermedad de Crohn.