JP2012041359A - 誘導型no合成酵素産生抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体を含有することを特徴とする、誘導型NO合成酵素産生抑制剤。
【選択図】 なし
Description
と期待されている。しかしながらフラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害することにより発揮される、これら病態改善作用の詳細なメカニズムは未だ不明であるのが現状である。
文献23、非特許文献24、非特許文献25)、移植拒絶反応(非特許文献22)などにおいて病態の改善が報告されている。
(1)フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストを含有することを特徴とする、炎症性疾患治療剤。
(2)抗体が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする、(1)記載の剤。
(3)抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、(2)記載の剤。
(4)受託番号 FERM BP-10372のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体5H8-4、または受託番号 FERM BP-10371のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体#126であることを特徴とする、(3)記載の剤。
(5)炎症性疾患が炎症性腸疾患である(1)〜(4)のいずれか一項に記載の剤。
(6)炎症性疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である(5)記載の剤。
(7)炎症性疾患が乾癬である(1)〜(4)のいずれか一項に記載の剤。
(8)炎症性疾患がアトピー性皮膚炎である(1)〜(4)のいずれか一項に記載の剤。(9)炎症性疾患が喘息である(1)〜(4)のいずれか一項に記載の剤。
(10)炎症性疾患が動脈硬化症である(1)〜(4)のいずれか一項に記載の剤。
(11)炎症性疾患が虚血再灌流における組織障害である(1)〜(4)いずれか一項に記載の剤。
(12)炎症性疾患が急性呼吸促迫症候群である(1)〜(4)のいずれか一項に記載の剤。
(13)受託番号 FERM BP-10371のハイブリドーマHam @mFKN#126.1.1。
(14)(13)記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体#126。
また、治療上有効量の、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストを炎症性疾患の治療が必要な患者に投与することを含む、炎症性疾
患の治療方法、及び、炎症性疾患治療剤の製造における、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストの使用を提供する。
ハイブリドーマHam @mFKN5H8-4は、2004(平成16年)年9月29日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番1中央第6)に寄託され(受託番号:FERM P-20236)、その寄託は、ブタペスト条約に基づく国際寄託に移管された(受託番号:FERM BP-10372)。
フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体は、以下のようにして作製することができる。
マニュアル(Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Mannual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory)に準じて行うことができる。更に、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983)、EBV-ハイブリドーマ法(Cole et al., Monoclonal Antibody inCancer Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96)、コンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング(Huse et al., Science, 246: 1275, 1989)等他の方法により作製しても良い。
本発明は、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体が、フラクタルカイン-CX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であって、iNOS活性または炎症性細胞による過剰なNOの産生が原因となる炎症性疾患の治療に有用であることを見出したことにより完成したものである。したがって、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害し、CX3CR1の機能を阻害する化合物、CX3CR1アンタゴニストも本発明に使用することができる。前記作用を有する化合物であれば特に限定されず、公知な化合物であってもよく、新規な化合物であってもよい。さらに、後述するスクリーニング方法によって得られる化合物であってもよい。
CX3CR1とフラクタルカインの相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストは、フラクタルカイン又は膜結合型フラクタルカインを発現する細胞に対し、CX3CR1陽性細胞が遊走するか否かによりスクリーニングできる。以下にCX3CR1陽性細胞が遊走するか否かによりスクリーニングする具体的な方法について記載するが、本発明はこれに限定されるものではない。
ばECV304細胞を培養し、カルチャーインサート上面に単層の細胞層を形成させる。フラクタルカインを、適当な濃度好ましくは10 nMの濃度になるように、遊走溶液(例えばRPMI-1640: M199 = 1 : 1, 0.5% BSA, 20 mM HEPES, pH7.4)で希釈し、24穴のウェルプレートに加える。ECV304細胞を培養したトランスウェルカルチャーインサートを24穴のトランスウェルに取りつけ、遊走溶液に懸濁した適当な個数、好ましくは106個の末梢血単核球細胞をトランスウェルカルチャーインサートに加える。適当な条件好ましくは37℃で4時間培養した後、ECV304細胞を通過して、ウェルプレートに遊走してきた細胞を回収し、細胞表面マーカーや細胞内抗原により同定する。好ましくは蛍光標識した該細胞表面マーカーや細胞内抗原に対する抗体で蛍光染色した後、FACScaliburを用いて定量する。
本明細書において「iNOSの産生抑制」、「iNOSの産生が抑制され」とは、iNOSのmRNA発現量が抑制されること、もしくはiNOSタンパク質の産生量が抑制されることを意味する。iNOSの産生抑制は、リアルタイムPCR法、ウェスタンブロッティング法、ELISA法(固相酵素免疫測定法)、iNOS酵素活性測定法、いずれかを用いて測定することができる。例えば、リアルタイムPCRは具体的には、以下の様に行う。トータルRNAを組織及び細胞から常法により精製し、逆転写酵素と適当なプライマーを用いてcDNAを作製する。作製したcDNAをもとに、各分子に特異的なプライマーとDNAポリメラーゼを用いることで各分子を特異的に増幅させることができる。各分子は、増幅させる際に適当な蛍光色素を取り込ませることで、特定の機器(PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems社製)など)を用いて増幅曲線をモニターすることができる。内部標準遺伝子(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子など)により各分子の補正を行うことで、各分子の組織及び細胞におけるmRNA発現量を定量的に測定することができる。
本発明は、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストを含有する炎症性疾患治療剤を提供するものである。前記治療剤においては、前記抗体はフラクタルカインと結合するものであることが好ましい。抗体を含有する本発明の治療剤をヒトに適用する場合には、以下の態様が好ましい。
USA, 81: 6851, 1985、Takeda et al., Nature, 314: 452, 1985)、また抗原結合領域としてヒト由来のフレームワーク領域とマウスモノクローナル抗体由来の超可変領域を組み合わせて使ったキメラ抗体(Teng et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308-12,
1983、 Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 7279, 1983)が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
きる。
(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを防止すること;
(b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止すること;
(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退を引き起こすこと。
(1)抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)の調製
抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)は、以下の方法により調製した(特開2002-345454号公報)。抗原にはマウスフラクタルカイン(R&D社製)を用いた。抗原はTiterMaxアジュバンドと混合した後、アルメニアハムスターに免疫し、以降抗原のみで追加免疫を行った。血清中の抗体価はELISAを用いて測定した。抗体価が上昇したアルメニアハムスターからリンパ球を分離し、リンパ球:P3ミエローマ細胞の比率が5:1になるように混合し、PEG(ベーリンガー社製)を用いて細胞融合を行った。ハイブリドーマは、RPMI-1640/10% FCS/HAT/10% Origen HCF (ISGN社製)を用いて、96-ウェルプレートで1週間培養した。そして、培養上清を用いて、ELISAを実施し、陽性ウェルを同定した。抗マウスフラクタルカイン抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈を2回行い、クローニングを行った。モノクローナル抗体は、不完全フロイントアジュバントを投与したSCIDマウスにハイブリドーマを接種して作製した腹水から、プロテインAカラムを用いて精製した。中和活性は、CX3CR1発現細胞のマウスフラクタルカインに対する遊走を抑制することを指標にして測定し、中和抗体(5H8-4)を得た。この中和抗体を産生するハイブリドーマをHam @mFKN5H8-4と名づけた。
CD4陽性CD45RB強陽性(CD4+CD45RBhigh)Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルの作製についてはPowrie et al. , Int. Immunol., 5, 1461-1471, 1993を参考にした。雌性、8〜10週齢のBalb/cマウス(日本チャールズ・リバー)の脾臓を摘出し、孔径100μmのセルストレーナー(ファーミンジェン社製)上で組織をすり潰し脾臓細胞を分離した。分離した脾臓細胞は、脾臓一個あたり5mlの塩化アンモニウム溶液(0.75%塩化アンモニウム、16mMトリス緩衝液、pH7.4)を加え15分室温に放置し赤血球を溶解した。脾臓細胞溶液にPBSを2倍容量加え、1500rpmで5分遠心して沈殿を回収した。分離した脾臓細胞からCD4 T cell Isolation kit(ミルテニー社製)によりCD4 Tリンパ球を精製した。CD4陽性CD45RB強陽性Tリンパ球を分離するために、精製したCD4 Tリンパ球に対して、フィコエリスリン(PE)標識抗CD4抗体(eBioscience社製)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗CD45RB抗体(eBioscience社製)を用い二重染色を行った。二重染色の後、FACSAria(ベクトンディッキンソン社製)を用いCD4陽性CD45RB強陽性細胞をソーティングし目的の細胞を回収した。回収された細胞はPBSで洗浄後、2x106/mlの細胞濃度にPBSにて懸濁した。雌性、8〜10週齢のSCIDマウス(日本クレア)の腹腔に、上記で調製したCD4陽性CD45RB強陽性細胞を200μlずつ、すなわち4x105/mouseで移入を行った。各群7匹のCD4陽性CD45RB強陽性細胞を移入したSCIDマウスに、500μgのコントロール抗体(ハムスターIgG)、500μgの抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)(抗体はPBS溶液)を、細胞移入後2週間目より、3日に1回投与した。なお投与は尾静脈から行った。また陰性対照群として、CD4 T cell Isolation kit(ミルテニー社製)により精製し、CD45RBの発現強度による分離をして
いないマウスCD4 Tリンパ球(トータルCD4)を1.2x106/mouseで移入したSCIDマウス4匹を用いた。各抗体投与後2週間後に剖検を行い体重減少、大腸内便性状をスコア化したもの、大腸肥厚、iNOS mRNA発現解析、病理学的観察により評価を行った。便性状のスコアは表1に示すようにデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎で用いられている便性状のスコア(Cooper et al., Lab. Invest., 69, 238-249, 1993)を使用した。
コントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与群は、体重減少が抑制された(図1)。またコントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与群は、大腸内便性状スコアおよび大腸肥厚において改善を示した(図2)。大腸部位の形態的観察においても、コントロール抗体投与群では結腸から直腸部位において肥厚が観察され、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与により改善が認められた(図3)。組織切片染色においてコントロール抗体群では大腸粘膜層に非常に多くの白血球(Tリンパ球、単球、マクロファージなど)が浸潤し、粘液を産生する杯細胞の消失や大腸上皮組織の損傷、過形成が認められるのに対し、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与群では、白血球の浸潤が抑制され大腸上皮細胞の損傷も僅かであった(図4)。一方mRNA発現に関してもコントロール抗体投与群ではiNOSの発現が上昇し、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)によりその発現が顕著に抑制された。また、パーフォリン、Fas、FasLなどの細胞障害性因子、IFNγ、TNFαなどのサイトカインのmRNAに関してもコントロール抗体投与群では発現が上昇し、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与群では発現の抑制が認められた(図5)。以上の結果から、フラクタルカイン-CX3CR1経路がCD4陽性CD45RB強陽性(CD4+CD45RBhigh)Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおいて重要な役割を果たすことが明らかとなった。その作用はiNOS産生を抑制することで過剰なNOの産生を抑制し
、組織障害を軽減しているものと推察された。つまりフラクタルカイン-CX3CR1の相互作用阻害に基づくiNOS産生抑制は、炎症性腸疾患に有用な治療体系であることが示唆された。
(1)方法
マウスオキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルについてはIijima et al. , J. Exp. Med.
, 199, 471-482, 2004を参考にした。雄性8〜10週齢Balb/cマウス(日本チャールズ・リバー)の腹部を約2cm四方剃毛した。3% 4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-オン(以下オキサゾロン、シグマ社製)を含む100%エタノール溶液を150μlずつ各マウスに塗布した。オキサゾロン感作してから4日目に絶食し、5日目にジエチルエーテル麻酔下のマウスの肛門から約3cmの部位に、0.5%オキサゾロンを含む50%エタノール生理食塩水溶液を100μlずつマウスに腸注した。なお陰性対照群として正常Balb/cマウスに50%エタノール生理食塩水溶液を100μlずつ腸注したマウス5匹を設定した。各群7匹のオキサゾロン腸注したマウスに、500μgのコントロール抗体(ハムスターIgG)、500μgの抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)(抗体はPBS溶液)を投与した。なお抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与は感作5日目(オキサゾロン腸注直前)に行った。なお抗体投与は尾静脈から行った。評価項目は疾患活動指数[Disease Activity Index](以下DAI;便の硬度、血の含有度合い、そして体重増減をスコア化してDAI値として算出)、大腸の短縮化、大腸肥厚および病理学的観察により評価を行った。なおDAIは表3に示すようにデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎で用いられているDAI(Cooper et al., Lab. Invest., 69, 238-249, 1993)を使用した。
コントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与群は、DAIにおいてオキサゾロン腸注2日目より改善を示した(図6)。また大腸の肥厚および短縮化もコントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与群は改善を示した(図7)。大腸部位の形態的観察において、コントロール抗体投与群では結腸から直腸部位において肥厚が観察され、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与により改善が認められた(図8)。組織切片染色においてコントロール抗体群では大腸粘膜層に非常に多くの白血球(Tリンパ球、単球、マクロファージなど)が浸潤し、粘液を産生する杯細胞の消失や大腸上皮組織の損傷、過形成が認められるのに対し、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)投与群では、白血球の浸潤が抑制され大腸上皮細胞の損傷も僅かであった(図9)。以上の結果からフラクタルカイン-CX3CR1細胞浸潤系がオキサゾロン誘発大腸炎モデルにおいても重要な役割を果たしていることが予想され、フラクタルカイン-CX3CR1細
胞浸潤系が炎症性腸疾患において有用な治療体系であることが示唆された。
(1)抗フラクタルカイン抗体(#126)の調製
マウスフラクタルカイン(Genzyme社製)とTiterMaxTMGoldアジュバンドを混合した後、アルメニアハムスターに複数回免疫し、さらに最終免疫をマウスフラクタルカインのみで行った。血清中の抗体価を固相化したフラクタルカインを用いたELISAで測定し、抗体価が上昇したアルメニアハムスターからリンパ球を分離し、リンパ球:P3ミエローマ細胞の比率が5:1になるように混合し、PEG(Rosh社製)を用いて細胞融合を行った。ハイブリドーマは、RPMI-1640/10% FCS/HAT/10% Origen HCF (ISGN社製)を用いて、プレートで1週間培養した。そして、培養上清を用いて固相化したフラクタルカインを用いたELISAを実施し、陽性ウェルを同定した。抗フラクタルカイン抗体を産生するハイブリドーマは、2回の限界希釈によりクローニングを行った。モノクローナル抗体は、プリスタンを投与したSCIDおよびヌードマウスにハイブリドーマを接種して作製した腹水から、プロテインAカラムを用いて精製した。得られた抗体の中和活性は、CX3CR1発現細胞のマウスフラクタルカインに対する遊走を抑制することを指標にして測定し、中和活性を有する#126抗体を得た。この中和抗体を産生するハイブリドーマをHam @mFKN#126.1.1と名づけた。
実施例2と同様の方法を用い検討を行った。評価項目は大腸短縮および大腸肥厚とした。各群7匹のオキサゾロンを腸注したマウスに、500μgのコントロール抗体(ハムスターIgG)、500μgの抗フラクタルカイン抗体(#126)(抗体はPBS溶液)を投与した。
抗フラクタルカイン抗体(#126)は抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)と同様に、コントロール抗体投与群に比較し、大腸短縮および大腸肥厚を改善した(図10)。以上の結果から、異なる2種類の抗フラクタルカイン抗体がオキサゾロン誘発大腸炎モデルにおいて効果を示したことは、フラクタルカイン-CX3CR1細胞浸潤系の阻害が炎症性腸疾患治療に有用であることが強く示唆された。
(1)方法
1群4匹のC57BL/6マウスに、500μgのコントロール抗体(ハムスターIgG)、500μgの抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)(抗体はPBS溶液)を静脈内投与し、直後にコンカナバリンA(ConA、シグマアルドリッチ社製)を12 mg/kgで静脈内投与した。その2時間後に肝臓を摘出し、RNA抽出を行った。なお陰性対照群としてC57BL/6マウスにPBS(リン酸バッファー)を静脈内投与したマウス4匹を設定した。iNOSのmRNA発現は、実施例1と同様の方法にてRNAを回収し、cDNAを合成し、リアルタイム PCRにて測定した。また、コントロール抗体あるいは抗フラクタルカイン抗体とConA、陰性対照群としてPBSを静脈内投与して12時間後の肝臓を摘出し、凍結組織切片を作製した。抗iNOS抗体と抗CX3CR1抗体で免疫組織染色を行い、iNOS、CX3CR1の陽性細胞の数を測定した。
ConAの投与により上昇したiNOS mRNA発現は抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に減少した。また、グランザイムB、Fasなどの細胞障害性因子、IFNγ、TNFα、IL-4などのサイトカインのmRNAに関しても、ConAの投与により発現が上昇し、抗フラクタルカイン
抗体(5H8-4)の投与により発現の減少が認められた(図11)。また、免疫組織染色の結果から、iNOS陽性の炎症性細胞はConAの投与により増加し、抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に減少していた(図12)。また、CX3CR1陽性の炎症性細胞もConAの投与により増加し、抗フラクタルカイン抗体(5H8-4)の投与により顕著に減少していた(図12)。以上の結果からフラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害することで、ConA肝炎での肝臓におけるiNOS mRNAの発現抑制と、炎症性細胞でのiNOS産生が抑制されることが明らかとなり、炎症性細胞による過剰なNOの産生が阻害されることで、肝臓の組織障害が軽減されることが示唆された。
免疫組織染色の結果を詳細に解析した。CX3CR1陽性細胞は主に丸く小型で、核は馬蹄形で細胞質は少なく、門脈(portal vein)や中心静脈(central vein)、類洞(sinusoid)に隣接しており、一部は壊死部(necrotic region)の辺縁部でも認められた。iNOS陽性細胞は、主に大きく進展しており、核は馬蹄形で細胞質は大きく、類洞に隣接しており、壊死部の辺縁部に加え壊死部の中でも見られたが、門脈や中心静脈近傍では見られなかった。このように、CX3CR1陽性細胞とiNOS陽性細胞の形態や局在には異なる点が見られたので、CX3CR1およびiNOS陽性細胞の特徴を詳細に解析した。
実施例4と同様にConA静脈内投与12時間後の肝臓(ConA肝炎肝組織)を用い、凍結組織切片を作製した。抗CX3CR1抗体あるいは抗iNOS抗体(BD Bioscience社製)と抗BM8抗体(BMA社製)、抗CD11b抗体(eBioscience社製)、あるいは抗MCP-1抗体(Gengyme Techne社製)で蛍光二重染色を行い、CX3CR1陽性細胞およびiNOS陽性細胞におけるBM8、CD11b、MCP-1の陽性率を測定した。
代表的な染色像を図13に示す。図中、写真の左および上の文字は、蛍光染色に用いた抗体が認識するマーカーを示す。また、バーの長さは20μmである。また、各マーカーの陽性率の測定結果を図14に示す。図中、BM8+はBM8陽性、CD11b+はCD11b陽性、MCP1+は、MCP-1陽性を意味する。
が53.4±2.0% (n=3)であった。一方、iNOS陽性細胞は、大型で進展したBM8陽性が81.6±1.8% (n=3)、CD11b陽性が12.6±3.0% (n=3)であった。したがって、CX3CR1陽性細胞はiNOS陽性細胞と必ずしも同じ細胞ではなく、一部は別の細胞集団で発現していることが明らかとなった。最近、iNOS産生細胞の浸潤には、CCR2が関与することが細菌感染モデルマウスにおいて報告されている(非特許文献13)。そこで、CCR2のリガンドであるMCP-1の発現を解析した。MCP-1陽性細胞は、CX3CR1と同様に丸く小型であった。CX3CR1陽性細胞の72.5±3.7% (n=3)がMCP-1を発現しており、逆にMCP-1陽性細胞のほとんどがCX3CR1陽性であった。したがって、ConA肝炎では、CX3CR1陽性細胞は、MCP-1を発現する主な細胞であることが明らかとなった。一方、MCP-1陽性細胞とiNOS陽性細胞は、形態が異なることから予想されるように、iNOS陽性細胞の14.6±2.2% (n=3)しかMCP-1を発現しておらず、ほとんど一致しなかった。したがって、iNOS陽性細胞の多くは、CX3CR1/MCP-1陽性細胞と異なることが明らかとなった。興味深いことに、肝臓の類洞血管(sinusoidal vessel)や壊死部では、iNOS陽性細胞とMCP-1陽性細胞は高頻度で隣接して存在していた。
(1)方法
実施例4で作製したConAを静脈内投与2時間後の肝臓由来cDNAを用い、実施例1と同様の方法にて、ケモカインのmRNA発現をリアルタイムPCRにて測定した。使用したプライマーのセットは以下のとおりであった。コントロール遺伝子として、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)遺伝子を用いた。
結果を図17に示す。図中、「normal」は陰性対照、「control」はコントロール抗体投与群、「anti-FKN」は抗フラクタルカイン投与群を意味する。
ConAの投与により2時間後に肝臓でのMCP-1、KC、MIP-2、IP-10、MIP-1α、MIP-1βのmRNAの発現が上昇した。これらのケモカインの mRNA発現は抗フラクタルカイン抗体の投与により減少した。以上の結果から、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害することで、多種類のケモカインの産生が抑制され、炎症の初期誘導反応である炎症性細胞浸潤と活性化の増幅回路が広範囲に作動しなくなることが示唆された。
(1)方法
実施例1で作製した大腸由来cDNAを用い、実施例1と同様の方法にて、さらに詳細に白血球マーカー、サイトカイン、ケモカイン、細胞活性化および組織破壊に関与する分子のmRNA発現をTaqMan PCRにて測定した。使用したプライマーのセットは以下のとおりである。
コントロール抗体投与群ではCD4、T-bet、F4/80、M-CSF receptor (M-CSF R)、Ly-6G、CD11cなどの各種白血球マーカーのmRNA発現が亢進していた(図18)。これらの結果から、実施例1の組織切片染色における、コントロール抗体投与群でのおびただしい数の浸潤した白血球はCD4 + T細胞(特にTh1タイプCD4+ T細胞)や単球/マクロファージ、好中球、樹状細胞など多種類の白血球から構成されている可能性が示唆された。また各々のケモカイン-ケモカイン受容体、KC、MIP-2、CXCR2、MCP-1、MCP-3、CCR2、MIP-1α、MIP-1β、CCR5、IP-10、I-TAC、CXCR3、TARC、MDC、CCR4のmRNA発現亢進がコントロール抗体投与群において認められたことから、浸潤した白血球はこれらケモカイン−ケモカイン受容体機構を介して浸潤したものと推察された(図19、図20)。さらに一連の炎症性サイトカイン、IL-1β、IL-6、IL-12α、Il-12β、Il-23α、Il-17、RANKL や組織破壊に関与するプロテアーゼMMP-2、MMP-9、MMP-14さらに炎症部位での血管新生に関与するbFGFやVEGF Receptor 2のmRNA発現もコントロール抗体投与群において顕著な亢進が認められた(
図21、図22)。また樹状細胞などの活性化受容体であるCD40やTLR2、活性化T細胞で発現し、樹状細胞などを活性化する分子CD40L、樹状細胞の活性化により発現が増強するCD80、CD86などのT細胞活性化補助シグナル分子群およびMHC Class IIの発現亢進が認められたことから、T細胞および樹状細胞などの抗原提示細胞が病変部位において活性化され、抗原特異的な獲得免疫系が作動している可能性が示唆された(図23)。これら一連の白血球マーカー、ケモカイン−ケモカイン受容体、サイトカイン、組織破壊分子、血管新生関連分子、T細胞・樹状細胞活性化分子のmRNA発現は、抗フラクタルカイン抗体投与により顕著に抑制されていた(図18〜図23)。以上の結果から、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害することで、炎症性サイトカインやケモカインの産生が抑制され、炎症性細胞浸潤と活性化の増幅回路が広範囲に作動しなくなり、炎症性腸疾患の病態進展が抑制される可能性が示唆された。
(1)方法
実施例2と同様の方法により炎症性腸疾患モデルを作製した。コントロール抗体、坑フラクタルカイン抗体(5H8-4)を実施例2の方法に従い投与した。オキサゾロン腸注後24時間および3日目に剖検を行い、大腸を摘出後、大腸組織より実施例1と同様の方法を用いRNAを抽出した。陰性対照群には50%エタノール生理食塩水を腸注した。RNAを抽出後、実施例1と同様の方法を用いcDNAを合成しサイトカイン、ケモカインのmRNA発現をTaqMan PCRにて測定した。使用したプライマーのセットは以下のとおりである。
オキサゾロン腸注24時間後において、コントロール抗体投与群ではIL-1β、IL-6などの炎症性サイトカイン、KC、MIP-2、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-1βなどのケモカイン、ケモカイン受容体CXCR2のmRNA発現の亢進が認められ、この発現亢進は抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に抑制された(図24)。オキサゾロン腸注3日後においては、IL-1β、IL-6、KC、MIP-2、MCP-1、MCP-3、CXCR2に加え、好中球のマーカーであるLy-6GのmRNA発現の亢進が認められ、この発現亢進は抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に抑制された(図25)。以上の結果から、坑フラクタルカイン抗体のオキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける病態改善効果の一部は、IL-1βやIL-6の炎症性サイトカインやケモカインの産生が抑制されること、好中球の浸潤が抑制されることで発揮されることが示唆された。
Claims (5)
- フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体を含有することを特徴とする、誘導型NO合成酵素産生抑制剤。
- 抗体が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする、請求項1記載の剤。
- 抗フラクタルカイン抗体が、受託番号 FERM BP-10372のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体5H8-4、または受託番号 FERM BP-10371のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体#126が認識するエピトープを認識するものであることを特徴とする、請求項2記載の剤。
- 抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項2または3記載の剤。
- 抗フラクタルカイン抗体が、受託番号 FERM BP-10372のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体5H8-4、または受託番号 FERM BP-10371のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体#126であることを特徴とする、請求項4記載の剤。
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