JP2001218581A - モノクローナル抗体の作製法 - Google Patents
モノクローナル抗体の作製法Info
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- JP2001218581A JP2001218581A JP2000354387A JP2000354387A JP2001218581A JP 2001218581 A JP2001218581 A JP 2001218581A JP 2000354387 A JP2000354387 A JP 2000354387A JP 2000354387 A JP2000354387 A JP 2000354387A JP 2001218581 A JP2001218581 A JP 2001218581A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、疎水性が高く、本来の構造を
保ったまま高純度に精製することが困難な蛋白質に対す
る抗血清、及びモノクローナル抗体を作製することにあ
る。 【解決手段】該蛋白質を昆虫細胞に発現させて、哺乳類
動物に細胞ごと免疫し、該蛋白質を発現させた哺乳類細
胞に対する反応性によりスクリーニングすることで、本
来の構造を保ったまま高純度に精製することが困難な蛋
白質に対する抗血清、及びモノクローナル抗体を作製す
ること可能となった。
保ったまま高純度に精製することが困難な蛋白質に対す
る抗血清、及びモノクローナル抗体を作製することにあ
る。 【解決手段】該蛋白質を昆虫細胞に発現させて、哺乳類
動物に細胞ごと免疫し、該蛋白質を発現させた哺乳類細
胞に対する反応性によりスクリーニングすることで、本
来の構造を保ったまま高純度に精製することが困難な蛋
白質に対する抗血清、及びモノクローナル抗体を作製す
ること可能となった。
Description
【発明の属する技術的な分野】本発明は、遺伝子組換え
技術を用いて産生させた哺乳類蛋白質に対する、モノク
ローナル抗体産生株の作製法に関する。
技術を用いて産生させた哺乳類蛋白質に対する、モノク
ローナル抗体産生株の作製法に関する。
【従来の技術】目的の蛋白質に対する抗血清やモノクロ
ーナル抗体を作製するためには、ほとんどの場合、精製
された蛋白質あるいは化学合成されたペプチドを抗原と
して使用する。目的の蛋白質の水溶性が比較的高い細胞
質内蛋白質・分泌型蛋白質・１回膜貫通型蛋白質の場合
は、該蛋白質を強制発現させた（あるいは内在性に発現
している）大腸菌・酵母・昆虫細胞・哺乳類細胞から活
性を保持したまま精製することは比較的容易であり、非
変性蛋白質に対する抗体が得られる可能性が高い。これ
に対し、目的の蛋白質の水溶性が低い多回膜貫通型蛋白
質、例えばG蛋白質共役７回膜貫通型受容体やイオンチ
ャンネル等の場合は、精製が困難でかつ精製中に失活す
る場合が多く、非変性蛋白質に対する抗体が得られる可
能性が低い。また目的の蛋白質を、断片としてあるいは
ペプチドとして免疫した場合は、いかなる蛋白質に対し
ても適応可能であるが、一次構造から立体構造を推定で
きないため、非変性蛋白質に対する抗体が得られる可能
性を予見することはできない。
ーナル抗体を作製するためには、ほとんどの場合、精製
された蛋白質あるいは化学合成されたペプチドを抗原と
して使用する。目的の蛋白質の水溶性が比較的高い細胞
質内蛋白質・分泌型蛋白質・１回膜貫通型蛋白質の場合
は、該蛋白質を強制発現させた（あるいは内在性に発現
している）大腸菌・酵母・昆虫細胞・哺乳類細胞から活
性を保持したまま精製することは比較的容易であり、非
変性蛋白質に対する抗体が得られる可能性が高い。これ
に対し、目的の蛋白質の水溶性が低い多回膜貫通型蛋白
質、例えばG蛋白質共役７回膜貫通型受容体やイオンチ
ャンネル等の場合は、精製が困難でかつ精製中に失活す
る場合が多く、非変性蛋白質に対する抗体が得られる可
能性が低い。また目的の蛋白質を、断片としてあるいは
ペプチドとして免疫した場合は、いかなる蛋白質に対し
ても適応可能であるが、一次構造から立体構造を推定で
きないため、非変性蛋白質に対する抗体が得られる可能
性を予見することはできない。
【０００１】この様な現状の下、非変性の多回貫通型膜
蛋白質に対する抗体を作製する方法としては、目的の蛋
白質を哺乳類細胞株に強制発現させ、該蛋白質を精製す
ることなく、細胞ごと免疫する手法が最も可能性の高い
方法である。しかしこの場合、抗原を精製することなく
免疫するため、目的の蛋白質以外に対する抗体が産生さ
れる頻度が高く、目的の蛋白質に対する抗体を産生する
細胞株を選択することは容易ではない。同種の抗原に対
しては抗体を産生しにくいことから、強制発現させた細
胞株と系統が同一の細胞種に免疫して、目的とする蛋白
質以外に対する抗体の産生を少なくする方法も試みられ
ている。しかし、細胞株が元来発現していた抗原、例え
ば異所性に発現する抗原（胎児性抗原等）に対する抗体
が無視できず、目的の蛋白質を強制発現させた細胞株
と、発現させない細胞株で抗体の反応性を比較するディ
ファレンシャルスクリーニングが必要であった。
蛋白質に対する抗体を作製する方法としては、目的の蛋
白質を哺乳類細胞株に強制発現させ、該蛋白質を精製す
ることなく、細胞ごと免疫する手法が最も可能性の高い
方法である。しかしこの場合、抗原を精製することなく
免疫するため、目的の蛋白質以外に対する抗体が産生さ
れる頻度が高く、目的の蛋白質に対する抗体を産生する
細胞株を選択することは容易ではない。同種の抗原に対
しては抗体を産生しにくいことから、強制発現させた細
胞株と系統が同一の細胞種に免疫して、目的とする蛋白
質以外に対する抗体の産生を少なくする方法も試みられ
ている。しかし、細胞株が元来発現していた抗原、例え
ば異所性に発現する抗原（胎児性抗原等）に対する抗体
が無視できず、目的の蛋白質を強制発現させた細胞株
と、発現させない細胞株で抗体の反応性を比較するディ
ファレンシャルスクリーニングが必要であった。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、本来
の構造を保ったまま高度に精製することが困難な蛋白質
を、精製することなく、あるいは簡単な濃縮を行った後
に免疫することにより、非変性の蛋白質に対するモノク
ローナル抗体を効率よく作製することにある。
の構造を保ったまま高度に精製することが困難な蛋白質
を、精製することなく、あるいは簡単な濃縮を行った後
に免疫することにより、非変性の蛋白質に対するモノク
ローナル抗体を効率よく作製することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者は、本来の構造
を保ったまま高度に精製することが困難な蛋白質を、精
製することなく細胞ごと免役し、作製したモノクローナ
ル抗体のスクリーニングを、交叉反応が少ないであろう
と考えられる、種の遠く離れた細胞で行うモノクローナ
ル抗体の作製法を検討した。汎用できる細胞の中で最も
種が離れている組合せの一つ、昆虫細胞と哺乳類細胞の
組合せを用い、昆虫細胞で発現させた蛋白質を、精製す
ることなく細胞ごと免疫して、モノクローナル抗体を作
製し、そのスクリーニングを該蛋白質を発現した哺乳類
細胞で行う方法について検討を行った。精製することが
比較的容易なヒトB細胞膜表面上のCD40、B7蛋白質を、
昆虫細胞で発現させて免疫し、ヒトリンパ球でスクリー
ニングするという同様の試みが報告されているが（Mark
de Bore et. al., J. Immunol. Methods, 152:15-23 1
992）、これに対し本発明は、本来の構造を保ったまま
高度に精製することが困難な蛋白質に対する抗体を作製
するという目的で本方法を応用し、更に発現の低い蛋白
質に対しても応用可能なように、該蛋白質をコードする
遺伝子を導入した哺乳類細胞によってスクリーニングを
行うことで、この目的が達成されることを見出したもの
である。本発明者は、昆虫細胞を細胞ごと免疫すること
により、昆虫細胞に対する抗体がかなりの確率で産生さ
れるものの、それらの抗体は哺乳類細胞にはほとんど反
応せず、目的とする蛋白質に対する抗体を産生するクロ
ーンを容易に選び出すことができることが明らかとな
り、本発明を完成するに到った。
を保ったまま高度に精製することが困難な蛋白質を、精
製することなく細胞ごと免役し、作製したモノクローナ
ル抗体のスクリーニングを、交叉反応が少ないであろう
と考えられる、種の遠く離れた細胞で行うモノクローナ
ル抗体の作製法を検討した。汎用できる細胞の中で最も
種が離れている組合せの一つ、昆虫細胞と哺乳類細胞の
組合せを用い、昆虫細胞で発現させた蛋白質を、精製す
ることなく細胞ごと免疫して、モノクローナル抗体を作
製し、そのスクリーニングを該蛋白質を発現した哺乳類
細胞で行う方法について検討を行った。精製することが
比較的容易なヒトB細胞膜表面上のCD40、B7蛋白質を、
昆虫細胞で発現させて免疫し、ヒトリンパ球でスクリー
ニングするという同様の試みが報告されているが（Mark
de Bore et. al., J. Immunol. Methods, 152:15-23 1
992）、これに対し本発明は、本来の構造を保ったまま
高度に精製することが困難な蛋白質に対する抗体を作製
するという目的で本方法を応用し、更に発現の低い蛋白
質に対しても応用可能なように、該蛋白質をコードする
遺伝子を導入した哺乳類細胞によってスクリーニングを
行うことで、この目的が達成されることを見出したもの
である。本発明者は、昆虫細胞を細胞ごと免疫すること
により、昆虫細胞に対する抗体がかなりの確率で産生さ
れるものの、それらの抗体は哺乳類細胞にはほとんど反
応せず、目的とする蛋白質に対する抗体を産生するクロ
ーンを容易に選び出すことができることが明らかとな
り、本発明を完成するに到った。
【０００４】すなわち本発明は、多回膜貫通型哺乳類膜
蛋白質を昆虫細胞に発現させて細胞ごと、あるいは簡単
な濃縮を行った後に免疫して得られる抗血清、免疫した
哺乳類動物から抗体産生細胞を取り出してハイブリドー
マを作製し、そのスクリーニングを該蛋白質を発現させ
た哺乳類細胞で行う方法、その方法で作製されたモノク
ローナル抗体に関する。具体的には、 (1).以下に記載の方法から成る、多回膜貫通型の哺乳類
膜蛋白質に対するモノクローナル抗体産生細胞株を作製
する方法、 1).該蛋白質を発現させた昆虫細胞を、哺乳類動物に免
疫し、 2).免疫した哺乳類動物より抗体産生細胞を取り出し
て、ミエローマ細胞と細胞融合した後、 3).融合した細胞株の産生する抗体を、該蛋白質をコー
ドする遺伝子を導入した哺乳類細胞と反応させて、該蛋
白質に対する抗体を産生する融合細胞株を選択する方
法、 (2).以下に記載の方法から成る、多回膜貫通型の哺乳類
膜蛋白質に対するモノクローナル抗体産生細胞株を作製
する方法、 1).該蛋白質を発現させた昆虫細胞より、膜画分を調整
する、あるいは該蛋白質に付加したアフィニティータグ
を用いて該蛋白質を吸着することにより、濃縮した該蛋
白質を、哺乳類動物に免疫し、 2).免疫した哺乳類動物より抗体産生細胞を取り出し
て、ミエローマ細胞と細胞融合した後、 3).融合した細胞株の産生する抗体を、該蛋白質をコー
ドする遺伝子を導入した哺乳類細胞と反応させて、該蛋
白質に対する抗体を産生する融合細胞株を選択する方
法、 (3).多回膜貫通型の哺乳類膜蛋白質を発現させた昆虫細
胞を、哺乳類動物に免疫し、該蛋白質に対する抗血清を
作製する方法、 (4).多回膜貫通型の哺乳類膜蛋白質を発現させた昆虫細
胞より、膜画分を調整する、あるいは該蛋白質に付加し
たアフィニティータグを用いて該蛋白質を吸着すること
により、濃縮した該蛋白質を、哺乳類動物に免疫し、該
蛋白質に対する抗血清を作製する方法、 (5).(1)ないし(2)に記載の方法により得られたモノクロ
ーナル抗体産生細胞株、 (6).(5)に記載のモノクローナル抗体産生細胞株より産
生されたモノクローナル抗体、 (7).免疫する哺乳類動物が齧歯類である、(1)ないし(2)
に記載の方法、 (8).該蛋白質を発現させた哺乳類細胞が齧歯類細胞であ
る、(1)ないし(2)に記載の方法、 (9).ケモカイン受容体ヒトCX3CR1に対するモノクローナ
ル抗体、に関する。
蛋白質を昆虫細胞に発現させて細胞ごと、あるいは簡単
な濃縮を行った後に免疫して得られる抗血清、免疫した
哺乳類動物から抗体産生細胞を取り出してハイブリドー
マを作製し、そのスクリーニングを該蛋白質を発現させ
た哺乳類細胞で行う方法、その方法で作製されたモノク
ローナル抗体に関する。具体的には、 (1).以下に記載の方法から成る、多回膜貫通型の哺乳類
膜蛋白質に対するモノクローナル抗体産生細胞株を作製
する方法、 1).該蛋白質を発現させた昆虫細胞を、哺乳類動物に免
疫し、 2).免疫した哺乳類動物より抗体産生細胞を取り出し
て、ミエローマ細胞と細胞融合した後、 3).融合した細胞株の産生する抗体を、該蛋白質をコー
ドする遺伝子を導入した哺乳類細胞と反応させて、該蛋
白質に対する抗体を産生する融合細胞株を選択する方
法、 (2).以下に記載の方法から成る、多回膜貫通型の哺乳類
膜蛋白質に対するモノクローナル抗体産生細胞株を作製
する方法、 1).該蛋白質を発現させた昆虫細胞より、膜画分を調整
する、あるいは該蛋白質に付加したアフィニティータグ
を用いて該蛋白質を吸着することにより、濃縮した該蛋
白質を、哺乳類動物に免疫し、 2).免疫した哺乳類動物より抗体産生細胞を取り出し
て、ミエローマ細胞と細胞融合した後、 3).融合した細胞株の産生する抗体を、該蛋白質をコー
ドする遺伝子を導入した哺乳類細胞と反応させて、該蛋
白質に対する抗体を産生する融合細胞株を選択する方
法、 (3).多回膜貫通型の哺乳類膜蛋白質を発現させた昆虫細
胞を、哺乳類動物に免疫し、該蛋白質に対する抗血清を
作製する方法、 (4).多回膜貫通型の哺乳類膜蛋白質を発現させた昆虫細
胞より、膜画分を調整する、あるいは該蛋白質に付加し
たアフィニティータグを用いて該蛋白質を吸着すること
により、濃縮した該蛋白質を、哺乳類動物に免疫し、該
蛋白質に対する抗血清を作製する方法、 (5).(1)ないし(2)に記載の方法により得られたモノクロ
ーナル抗体産生細胞株、 (6).(5)に記載のモノクローナル抗体産生細胞株より産
生されたモノクローナル抗体、 (7).免疫する哺乳類動物が齧歯類である、(1)ないし(2)
に記載の方法、 (8).該蛋白質を発現させた哺乳類細胞が齧歯類細胞であ
る、(1)ないし(2)に記載の方法、 (9).ケモカイン受容体ヒトCX3CR1に対するモノクローナ
ル抗体、に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態につい
て、１．哺乳類蛋白質を昆虫細胞に発現させる方法、
２．該蛋白質を哺乳類細胞に発現させる方法、３．哺乳
類動物に免疫する方法、４．ハイブリドーマ作製の方
法、５．ハイブリドーマのスクリーニングの方法、の順
に詳細に説明する。 １．哺乳類蛋白質を昆虫細胞に発現させる方法 ここで哺乳類蛋白質は、哺乳類細胞で発現する蛋白質を
意味し、哺乳類細胞の遺伝子にコードされた蛋白質、及
び哺乳類細胞に感染したウイルスの遺伝子にコードされ
た遺伝子の両方を意味する。また昆虫細胞とは、in vit
roで培養できる株化された細胞で、遺伝子導入による蛋
白質発現に適した細胞であれば、如何なる細胞でも許さ
れる。好ましくはSf9細胞株あるいはHigh Fiveであるこ
とが望ましい。遺伝子を導入して蛋白質を発現させる方
法としては、組換えウイルスを感染させる方法、リポフ
ェクション法、エレクトロポレーション法等があるが、
効率よく遺伝子を導入できれば如何なる方法でも良く、
好ましくは組換えウイルスを感染させる方法、更に好ま
しくは組換えバキュウロウイルスを感染させる方法が望
ましい。これらのDNAの組換え及び細胞へのベクターの
導入は、例えば文献（Sambruck,J., Fritsch, E. F., a
nd Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labora
tory, Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY）に記載の方法により行うことがで
きる。一例として、昆虫細胞Sf9に組換えバキュウロウ
イルスを産生させ、High Five細胞株に感染させる方法
について具体的に説明する。
て、１．哺乳類蛋白質を昆虫細胞に発現させる方法、
２．該蛋白質を哺乳類細胞に発現させる方法、３．哺乳
類動物に免疫する方法、４．ハイブリドーマ作製の方
法、５．ハイブリドーマのスクリーニングの方法、の順
に詳細に説明する。 １．哺乳類蛋白質を昆虫細胞に発現させる方法 ここで哺乳類蛋白質は、哺乳類細胞で発現する蛋白質を
意味し、哺乳類細胞の遺伝子にコードされた蛋白質、及
び哺乳類細胞に感染したウイルスの遺伝子にコードされ
た遺伝子の両方を意味する。また昆虫細胞とは、in vit
roで培養できる株化された細胞で、遺伝子導入による蛋
白質発現に適した細胞であれば、如何なる細胞でも許さ
れる。好ましくはSf9細胞株あるいはHigh Fiveであるこ
とが望ましい。遺伝子を導入して蛋白質を発現させる方
法としては、組換えウイルスを感染させる方法、リポフ
ェクション法、エレクトロポレーション法等があるが、
効率よく遺伝子を導入できれば如何なる方法でも良く、
好ましくは組換えウイルスを感染させる方法、更に好ま
しくは組換えバキュウロウイルスを感染させる方法が望
ましい。これらのDNAの組換え及び細胞へのベクターの
導入は、例えば文献（Sambruck,J., Fritsch, E. F., a
nd Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labora
tory, Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY）に記載の方法により行うことがで
きる。一例として、昆虫細胞Sf9に組換えバキュウロウ
イルスを産生させ、High Five細胞株に感染させる方法
について具体的に説明する。
【０００６】発現させたい蛋白質をコードする遺伝子断
片を、RT-PCR、cDNAライブラリーからのPCR、cDNAライ
ブラリーからのクローニング等の手段によりベクターに
挿入する。必要であれば複数のクローンをつなぎ合わせ
て、必要な領域を含む遺伝子断片を得ても良い。また該
蛋白質の発現細胞を識別するために、該蛋白質と標識蛋
白質、例えばGreen Fruorescence Proteinの変異体（EG
FP）等との融合蛋白質として発現させるように、遺伝子
断片を構築することも許される。得られた遺伝子断片
を、バキュウロウイルス発現用ドナーベクター、例えば
pFAST BAC1（Lifetech社製）のポリヘドリンプロモータ
ーの下流の適当な制限酵素サイトに挿入して、ドナーベ
クターを構築し、このドナーベクターを組換えBacmid作
製用コンピテント大腸菌DH10 Bac（Lifetech社製）に導
入する。DH10 Bac大腸菌内で、ドナーベクターのTn7の
レフトアームとライトアームの間に挟まれたゲンタマイ
シン耐性遺伝子、ポリヘドリンプロモーター、その下流
に挿入された該蛋白質遺伝子断片、SV40ポリAシグナル
を含むmini-Tn7発現カセットが、DH10 Bacに保持されて
いるカナマイシン耐性遺伝子、バキュウロウイルスゲノ
ム、N末端にmini-attTn7 attachment siteを持つLacZ a
lpha遺伝子を含むバキュウロウイルスシャトルベクター
（bMON14272）のmini-attTn7 attachmentsiteに、ヘル
パープラスミド（pMON7124）によって供給されるTn7ト
ランスポジション機能によって部位特異的に挿入され
る。組換えBacmidを含む大腸菌はカナマイシン、ゲンタ
マイシン、テトラサイクリン、X-gal、IPTGを含むLB寒
天培地上で、白色のコロニーとして増殖することで選択
する。組換えBacmidを、例えばアルカリ溶解法等で調整
し、適当な方法、例えばCellFectin試薬（Lifetech社
製）で昆虫細胞Sf9に遺伝子導入して、組換えバキュウ
ロウイルスを培養上清中に産生させる。好ましくは、得
られた組換えウイルスをもう一度Sf9細胞に感染させ
て、ウイルス力価を高める。作製した組換えバキュウロ
ウイルスを昆虫細胞、例えばHigh Five昆虫細胞に感染
させ、適当な培地、例えばExCell400無血清培地（JRH社
製）で培養して、挿入した遺伝子断片を昆虫細胞で一過
性に発現させる。
片を、RT-PCR、cDNAライブラリーからのPCR、cDNAライ
ブラリーからのクローニング等の手段によりベクターに
挿入する。必要であれば複数のクローンをつなぎ合わせ
て、必要な領域を含む遺伝子断片を得ても良い。また該
蛋白質の発現細胞を識別するために、該蛋白質と標識蛋
白質、例えばGreen Fruorescence Proteinの変異体（EG
FP）等との融合蛋白質として発現させるように、遺伝子
断片を構築することも許される。得られた遺伝子断片
を、バキュウロウイルス発現用ドナーベクター、例えば
pFAST BAC1（Lifetech社製）のポリヘドリンプロモータ
ーの下流の適当な制限酵素サイトに挿入して、ドナーベ
クターを構築し、このドナーベクターを組換えBacmid作
製用コンピテント大腸菌DH10 Bac（Lifetech社製）に導
入する。DH10 Bac大腸菌内で、ドナーベクターのTn7の
レフトアームとライトアームの間に挟まれたゲンタマイ
シン耐性遺伝子、ポリヘドリンプロモーター、その下流
に挿入された該蛋白質遺伝子断片、SV40ポリAシグナル
を含むmini-Tn7発現カセットが、DH10 Bacに保持されて
いるカナマイシン耐性遺伝子、バキュウロウイルスゲノ
ム、N末端にmini-attTn7 attachment siteを持つLacZ a
lpha遺伝子を含むバキュウロウイルスシャトルベクター
（bMON14272）のmini-attTn7 attachmentsiteに、ヘル
パープラスミド（pMON7124）によって供給されるTn7ト
ランスポジション機能によって部位特異的に挿入され
る。組換えBacmidを含む大腸菌はカナマイシン、ゲンタ
マイシン、テトラサイクリン、X-gal、IPTGを含むLB寒
天培地上で、白色のコロニーとして増殖することで選択
する。組換えBacmidを、例えばアルカリ溶解法等で調整
し、適当な方法、例えばCellFectin試薬（Lifetech社
製）で昆虫細胞Sf9に遺伝子導入して、組換えバキュウ
ロウイルスを培養上清中に産生させる。好ましくは、得
られた組換えウイルスをもう一度Sf9細胞に感染させ
て、ウイルス力価を高める。作製した組換えバキュウロ
ウイルスを昆虫細胞、例えばHigh Five昆虫細胞に感染
させ、適当な培地、例えばExCell400無血清培地（JRH社
製）で培養して、挿入した遺伝子断片を昆虫細胞で一過
性に発現させる。
【０００７】２．該蛋白質を哺乳類細胞に発現させる方
法 １で得られた、該蛋白質をコードする遺伝子断片を挿入
したベクターより、適当な制限酵素を用いて該遺伝子断
片を切り出し、哺乳類細胞で発現させる適当な発現ベク
ター、例えばpSV2、pSRα、pCMV、pMX等に挿入する。該
蛋白質をコードする遺伝子断片を挿入した発現ベクター
を、適当な方法、例えばリポフェクション法、エレクト
ロポレーション法、組換えレトロウイルスを用いる方法
等の方法で哺乳類細胞に導入する。遺伝子導入の方法
は、該蛋白質に反応する抗体を、哺乳類細胞に反応する
抗体から区別してスクリーニングするために、導入効率
の高い方法でなくてはならないが、この目的を達成でき
る方法であれば如何なる方法であっても許される。場合
によっては、発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝
子、例えばNeor遺伝子等、に対応した選択薬剤（Neorで
あればNeomycin）存在下で培養して、該蛋白質を高発現
する細胞株を選択しても良い。これらのDNAの組換え及
び細胞へのベクターの導入は、例えば文献（Sambruck,
J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecu
lar Cloning: A Laboratory, Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）に記載の方
法により行うことができる。以下に導入効率の高い組換
えレトロウイルスを使った方法について、詳しく説明す
るが、本発明はこれに限られるものではない。該蛋白質
をを哺乳類用発現ベクター、例えばpMX に挿入する。こ
のベクターを、例えばパッケージング細胞（BOSC23）に
リポフェクション法で導入し、組換えレトロウイルスを
培養上清中に産生させる。この組換えレトロウイルスを
Polybrene存在下に、例えばマウスpre-B細胞株（L1.2）
に感染させる。該蛋白質をEGFPとの融合蛋白質として発
現させた場合であれば、例えばFACS Caliber（Becton D
ickinson社製）等を用いて、EGFPを発現している細胞を
分別分収し、該蛋白質を高発現している細胞集団を集め
ても良い。
法 １で得られた、該蛋白質をコードする遺伝子断片を挿入
したベクターより、適当な制限酵素を用いて該遺伝子断
片を切り出し、哺乳類細胞で発現させる適当な発現ベク
ター、例えばpSV2、pSRα、pCMV、pMX等に挿入する。該
蛋白質をコードする遺伝子断片を挿入した発現ベクター
を、適当な方法、例えばリポフェクション法、エレクト
ロポレーション法、組換えレトロウイルスを用いる方法
等の方法で哺乳類細胞に導入する。遺伝子導入の方法
は、該蛋白質に反応する抗体を、哺乳類細胞に反応する
抗体から区別してスクリーニングするために、導入効率
の高い方法でなくてはならないが、この目的を達成でき
る方法であれば如何なる方法であっても許される。場合
によっては、発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝
子、例えばNeor遺伝子等、に対応した選択薬剤（Neorで
あればNeomycin）存在下で培養して、該蛋白質を高発現
する細胞株を選択しても良い。これらのDNAの組換え及
び細胞へのベクターの導入は、例えば文献（Sambruck,
J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecu
lar Cloning: A Laboratory, Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）に記載の方
法により行うことができる。以下に導入効率の高い組換
えレトロウイルスを使った方法について、詳しく説明す
るが、本発明はこれに限られるものではない。該蛋白質
をを哺乳類用発現ベクター、例えばpMX に挿入する。こ
のベクターを、例えばパッケージング細胞（BOSC23）に
リポフェクション法で導入し、組換えレトロウイルスを
培養上清中に産生させる。この組換えレトロウイルスを
Polybrene存在下に、例えばマウスpre-B細胞株（L1.2）
に感染させる。該蛋白質をEGFPとの融合蛋白質として発
現させた場合であれば、例えばFACS Caliber（Becton D
ickinson社製）等を用いて、EGFPを発現している細胞を
分別分収し、該蛋白質を高発現している細胞集団を集め
ても良い。
【０００８】３．哺乳類動物に免疫する方法 ここで哺乳類動物とは、非ヒト哺乳類動物であり、免疫
に適したヤギ、ウサギ、齧歯類等が好ましい。更には抗
血清を得た後に、モノクローナル抗体の作製にも使用で
きる齧歯類が好ましい。該蛋白質を発現した昆虫細胞
に、必要に応じて免疫原性を高める適当な処理、例えば
フロイントコンプリートアジュバンドと共にエマルジョ
ンを作る等の処理を施した後、哺乳類動物の皮下、腹
腔、フットパット等に投与して免疫する。また必要であ
れば、昆虫細胞を破砕し、超遠心等の手段により膜画分
を調整した後、免疫することも許される。更にアフィニ
ティーカラムを利用できる場合、例えば該蛋白質をHis
タグ・GST等の融合蛋白として発現させた場合は、該蛋
白質をアフィニティーで濃縮した後、免疫しても良い。
必要であれば、適当な間隔をあけて複数回免疫を繰り返
す。免疫した動物から適当な方法で採血し、その血液か
ら該蛋白質に対する抗血清を得る。得られた抗血清は、
２で作製した該蛋白質を発現している哺乳類細胞、及び
発現していない哺乳類細胞との反応性の差から、該蛋白
質に対する抗体を含む抗血清を選択することができる。
に適したヤギ、ウサギ、齧歯類等が好ましい。更には抗
血清を得た後に、モノクローナル抗体の作製にも使用で
きる齧歯類が好ましい。該蛋白質を発現した昆虫細胞
に、必要に応じて免疫原性を高める適当な処理、例えば
フロイントコンプリートアジュバンドと共にエマルジョ
ンを作る等の処理を施した後、哺乳類動物の皮下、腹
腔、フットパット等に投与して免疫する。また必要であ
れば、昆虫細胞を破砕し、超遠心等の手段により膜画分
を調整した後、免疫することも許される。更にアフィニ
ティーカラムを利用できる場合、例えば該蛋白質をHis
タグ・GST等の融合蛋白として発現させた場合は、該蛋
白質をアフィニティーで濃縮した後、免疫しても良い。
必要であれば、適当な間隔をあけて複数回免疫を繰り返
す。免疫した動物から適当な方法で採血し、その血液か
ら該蛋白質に対する抗血清を得る。得られた抗血清は、
２で作製した該蛋白質を発現している哺乳類細胞、及び
発現していない哺乳類細胞との反応性の差から、該蛋白
質に対する抗体を含む抗血清を選択することができる。
【０００９】４．ハイブリドーマ作製の方法 免疫した哺乳動物から、脾臓、リンパ節等の抗体産生細
胞を含む臓器を取り出し、そこからリンパ球を分離す
る。哺乳動物としてラットを用いた場合について具体的
に説明する。ラットをエーテル麻酔下に放血により屠殺
し、免疫箇所の所属リンパ節、例えばフットパットに免
疫した場合は腸骨リンパ節と両足のリンパ節を摘出し
て、RPMI-1640培地で５回洗浄した後に、鋏でリンパ節
を切開し、70μmのメッシュを通してリンパ球を分離す
る。分離したリンパ球とミエローマ細胞、例えばP3細胞
の細胞融合を以下の方法で行うが、細胞融合の方法はこ
れに限られるものではない。リンパ球とP3細胞を２回RP
MI-1640培地で洗浄し、5:1の割合で混合してRPMI-1640
培地に懸濁し、1500 rpmで５分間遠心する。細胞塊をほ
ぐした後、37℃で暖めておいた50%PEG溶液（ベーリンガ
ー社製）1 mlを２分間かけて徐々に加え、続けて37℃に
暖めておいたRPMI-1640培地20 mlを３分間かけて徐々に
加える。1000rpmで５分間遠心した後、５分間放置す
る。上清を除いた後、リンパ球細胞が1x 106/mlになる
ように10% FCS/10% ORIGEN HCF（ICGS社製）/RPMI-1640
培地に懸濁し、１ウェルあたり100μlずつ96ウェルプレ
ートに分注する。翌日に10% FCS/10% ORIGEN HCF/2x HA
T（Lifetech社製）/RPMI-1640培地を１ウェルあたり100
μlずつ加えハイブリドーマのHAT選択を行って、融合細
胞を選択する。
胞を含む臓器を取り出し、そこからリンパ球を分離す
る。哺乳動物としてラットを用いた場合について具体的
に説明する。ラットをエーテル麻酔下に放血により屠殺
し、免疫箇所の所属リンパ節、例えばフットパットに免
疫した場合は腸骨リンパ節と両足のリンパ節を摘出し
て、RPMI-1640培地で５回洗浄した後に、鋏でリンパ節
を切開し、70μmのメッシュを通してリンパ球を分離す
る。分離したリンパ球とミエローマ細胞、例えばP3細胞
の細胞融合を以下の方法で行うが、細胞融合の方法はこ
れに限られるものではない。リンパ球とP3細胞を２回RP
MI-1640培地で洗浄し、5:1の割合で混合してRPMI-1640
培地に懸濁し、1500 rpmで５分間遠心する。細胞塊をほ
ぐした後、37℃で暖めておいた50%PEG溶液（ベーリンガ
ー社製）1 mlを２分間かけて徐々に加え、続けて37℃に
暖めておいたRPMI-1640培地20 mlを３分間かけて徐々に
加える。1000rpmで５分間遠心した後、５分間放置す
る。上清を除いた後、リンパ球細胞が1x 106/mlになる
ように10% FCS/10% ORIGEN HCF（ICGS社製）/RPMI-1640
培地に懸濁し、１ウェルあたり100μlずつ96ウェルプレ
ートに分注する。翌日に10% FCS/10% ORIGEN HCF/2x HA
T（Lifetech社製）/RPMI-1640培地を１ウェルあたり100
μlずつ加えハイブリドーマのHAT選択を行って、融合細
胞を選択する。
【００１０】５．ハイブリドーマのスクリーニングの方
法 ４でHAT選択されたハイブリドーマの培養上清中に含ま
れる抗体を、２で作製した該蛋白質を発現する細胞、及
び発現しない細胞と反応させ、該蛋白質を発現する細胞
には反応するが、発現しない細胞とは反応しないハイブ
リドーマのクローンを選択する。場合によっては、例え
ばlimiting dilution等の方法で、クローニングを繰り
返し、該蛋白質に対する抗体を産生しているハイブリド
ーマをクローニングする。ハイブリドーマの培養上清中
に含まれる抗体と、該蛋白質を発現する、あるいは発現
しない細胞との反応性を調べる方法としては、蛍光抗体
法、酵素抗体法、FACSを使った方法等があるが、一例と
してFACSを使った方法について以下に説明する。ハイブ
リドーマ培養上清を２で作製した該蛋白質を発現してい
る細胞に加え、４℃で30分間放置する。FACS溶液（PBS/
1% FCS/0.02% NaN3）で１回洗浄した後、PE標識抗IgG抗
体を加え、４℃に30分間放置する。FACS溶液で１回洗浄
した後、FACS Caliber（Becton Dickinson社製）を用い
て、各細胞上のPE標識抗体が発する蛍光強度を測定し、
ハイブリドーマ培養上清中の抗体と該蛋白質を発現して
いる細胞との反応性を測定する。コントロールとして該
蛋白質を発現していない細胞についても、同様に反応性
を測定し、該蛋白質を発現する細胞には反応するが、発
現しない細胞とは反応しないハイブリドーマを選択す
る。別法として、該蛋白質をEGFPとの融合蛋白として発
現させた場合は、EGFP及びPEに対応した２つの波長で蛍
光測定を行い、EGFPの蛍光が観察される細胞で、同時に
PEの蛍光が観察されるハイブリドーマを選択しても良
い。以上に述べた、哺乳類動物の免疫、抗血清の取得、
ハイブリドーマの作製、蛍光抗体法、酵素抗体法は文
献、例えばEd Harlow, David Lane, Antibodies A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (198
8)に記載の方法により行うことができる。
法 ４でHAT選択されたハイブリドーマの培養上清中に含ま
れる抗体を、２で作製した該蛋白質を発現する細胞、及
び発現しない細胞と反応させ、該蛋白質を発現する細胞
には反応するが、発現しない細胞とは反応しないハイブ
リドーマのクローンを選択する。場合によっては、例え
ばlimiting dilution等の方法で、クローニングを繰り
返し、該蛋白質に対する抗体を産生しているハイブリド
ーマをクローニングする。ハイブリドーマの培養上清中
に含まれる抗体と、該蛋白質を発現する、あるいは発現
しない細胞との反応性を調べる方法としては、蛍光抗体
法、酵素抗体法、FACSを使った方法等があるが、一例と
してFACSを使った方法について以下に説明する。ハイブ
リドーマ培養上清を２で作製した該蛋白質を発現してい
る細胞に加え、４℃で30分間放置する。FACS溶液（PBS/
1% FCS/0.02% NaN3）で１回洗浄した後、PE標識抗IgG抗
体を加え、４℃に30分間放置する。FACS溶液で１回洗浄
した後、FACS Caliber（Becton Dickinson社製）を用い
て、各細胞上のPE標識抗体が発する蛍光強度を測定し、
ハイブリドーマ培養上清中の抗体と該蛋白質を発現して
いる細胞との反応性を測定する。コントロールとして該
蛋白質を発現していない細胞についても、同様に反応性
を測定し、該蛋白質を発現する細胞には反応するが、発
現しない細胞とは反応しないハイブリドーマを選択す
る。別法として、該蛋白質をEGFPとの融合蛋白として発
現させた場合は、EGFP及びPEに対応した２つの波長で蛍
光測定を行い、EGFPの蛍光が観察される細胞で、同時に
PEの蛍光が観察されるハイブリドーマを選択しても良
い。以上に述べた、哺乳類動物の免疫、抗血清の取得、
ハイブリドーマの作製、蛍光抗体法、酵素抗体法は文
献、例えばEd Harlow, David Lane, Antibodies A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (198
8)に記載の方法により行うことができる。
【００１１】
【発明の効果】本発明により、本来の構造を保ったまま
高純度に精製することが困難な疎水性の高い蛋白質に対
しても、モノクローナル抗体を作製することが可能とな
った。
高純度に精製することが困難な疎水性の高い蛋白質に対
しても、モノクローナル抗体を作製することが可能とな
った。
【００１２】
【実施例】以下に、具体的な例をもって本発明を示す
が、本発明はこれに限られるものではない。 ［実施例１］ヒト７回膜貫通型CX3CR1受容体とEGFPの融
合蛋白を発現するマウス細胞の作製 ヒトCX3CR1cDNA（Imai, T. et al., Cell）からPCR法を
用いてコード領域の全長から終止コドンを取り除いた遺
伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片を制限酵素Sa
l IとXba Iで消化し、EGFP融合蛋白発現用ベクターpEGF
P-N1（Clontech社製）の上流のSal I/Xba Iサイトに挿
入し、CX3CR1-EGFPの融合蛋白をコードする遺伝子断片
を作製した。作製した遺伝子断片をSal IとNot Iで消化
して切り出し、哺乳類用発現ベクター（pMX V28-EGFP）
を構築した。このベクターをパッケージング細胞（BOSC
23）にリポフェクション法で導入し、組換えレトロウイ
ルスを培養上清中に産生させた。この組換えレトロウイ
ルスをPolybrene存在下にマウスpre-B細胞株（L1.2）に
感染させた。CX3CR1-EGFP発現細胞はFACS Caliber（Bec
ton Dickinson社製）を用いて分別分収した。その結
果、90%程度の細胞がCXCR1-EGFPを発現しているL1.2細
胞集団が得られた。
が、本発明はこれに限られるものではない。 ［実施例１］ヒト７回膜貫通型CX3CR1受容体とEGFPの融
合蛋白を発現するマウス細胞の作製 ヒトCX3CR1cDNA（Imai, T. et al., Cell）からPCR法を
用いてコード領域の全長から終止コドンを取り除いた遺
伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片を制限酵素Sa
l IとXba Iで消化し、EGFP融合蛋白発現用ベクターpEGF
P-N1（Clontech社製）の上流のSal I/Xba Iサイトに挿
入し、CX3CR1-EGFPの融合蛋白をコードする遺伝子断片
を作製した。作製した遺伝子断片をSal IとNot Iで消化
して切り出し、哺乳類用発現ベクター（pMX V28-EGFP）
を構築した。このベクターをパッケージング細胞（BOSC
23）にリポフェクション法で導入し、組換えレトロウイ
ルスを培養上清中に産生させた。この組換えレトロウイ
ルスをPolybrene存在下にマウスpre-B細胞株（L1.2）に
感染させた。CX3CR1-EGFP発現細胞はFACS Caliber（Bec
ton Dickinson社製）を用いて分別分収した。その結
果、90%程度の細胞がCXCR1-EGFPを発現しているL1.2細
胞集団が得られた。
【００１３】［実施例２］ヒト７回膜貫通型CX3CR1受容
体とEGFPの融合蛋白を発現する昆虫細胞の作製 実施例１で作製したCX3CR1-EGFPの融合蛋白質をコード
する遺伝子断片をバキュウロウイルス発現用ドナーベク
ターpFAST BAC1（Lifetech社製）のポリヘドリンプロモ
ーターの下流のSal I/Not Iサイトに挿入し、ドナーベ
クター（pFAST BAC1 V28-EGFP）を構築した。このベク
ターを組換えBacmid作製用コンピテント大腸菌DH10 Bac
（Lifetech社製）に導入した。DH10 Bac大腸菌内で、ド
ナーベクターのTn7の間に挟まれたCX3CR1-EGFP遺伝子を
含むmini-Tn7発現カセットが、DH10 Bacに保持されてい
るバキュウロウイルスシャトルベクター（bMON14272）
のmini-attTn7 attachment siteに、部位特異的に挿入
される。組換えBacmidを含む大腸菌をカナマイシン、ゲ
ンタマイシン、テトラサイクリン、X-gal、IPTGを含むL
B寒天培地上の、白色のコロニーとして選択した。組換
えBacmidはアルカリ溶解法で調整し、CellFectin試薬
（Lifetech社製）で昆虫細胞Sf9に導入して、組換えバ
キュウロウイルスを培養上清中に産生させた。得られた
組換えウイルスはもう一度Sf9細胞に感染させて、ウイ
ルス力価を高めた後に、以下の実験に使用した。作製し
た組換えバキュウロウイルスを昆虫細胞High Fiveに感
染させ、ExCell400無血清培地（JRH社製）で３から６日
間培養して、CX3CR1-EGFPを昆虫細胞で一過性に発現さ
せた。CX3CR1-EGFPの発現はFACS Caliber（Becton Dick
inson社製）を用いて解析した。その結果、CX3CR1-EGFP
がHigh Five昆虫細胞において発現しており、その発現
はL1.2マウス細胞のものより10倍程度強いことが示され
た。
体とEGFPの融合蛋白を発現する昆虫細胞の作製 実施例１で作製したCX3CR1-EGFPの融合蛋白質をコード
する遺伝子断片をバキュウロウイルス発現用ドナーベク
ターpFAST BAC1（Lifetech社製）のポリヘドリンプロモ
ーターの下流のSal I/Not Iサイトに挿入し、ドナーベ
クター（pFAST BAC1 V28-EGFP）を構築した。このベク
ターを組換えBacmid作製用コンピテント大腸菌DH10 Bac
（Lifetech社製）に導入した。DH10 Bac大腸菌内で、ド
ナーベクターのTn7の間に挟まれたCX3CR1-EGFP遺伝子を
含むmini-Tn7発現カセットが、DH10 Bacに保持されてい
るバキュウロウイルスシャトルベクター（bMON14272）
のmini-attTn7 attachment siteに、部位特異的に挿入
される。組換えBacmidを含む大腸菌をカナマイシン、ゲ
ンタマイシン、テトラサイクリン、X-gal、IPTGを含むL
B寒天培地上の、白色のコロニーとして選択した。組換
えBacmidはアルカリ溶解法で調整し、CellFectin試薬
（Lifetech社製）で昆虫細胞Sf9に導入して、組換えバ
キュウロウイルスを培養上清中に産生させた。得られた
組換えウイルスはもう一度Sf9細胞に感染させて、ウイ
ルス力価を高めた後に、以下の実験に使用した。作製し
た組換えバキュウロウイルスを昆虫細胞High Fiveに感
染させ、ExCell400無血清培地（JRH社製）で３から６日
間培養して、CX3CR1-EGFPを昆虫細胞で一過性に発現さ
せた。CX3CR1-EGFPの発現はFACS Caliber（Becton Dick
inson社製）を用いて解析した。その結果、CX3CR1-EGFP
がHigh Five昆虫細胞において発現しており、その発現
はL1.2マウス細胞のものより10倍程度強いことが示され
た。
【００１４】［実施例３］ポリクローナル抗体の作製 組換えバキュウロウイルスを感染させ、３から５日後に
感染High Five細胞をフラスコから回収し、PBSで一回洗
浄して、1.0から2.0 x 107 cells/mlになるようにPBSに
懸濁した。これに等量のフロイントコンプリートアジュ
バンドを加え、エマルジョンを作製した。これをエーテ
ル麻酔下にWKY/NCrjラットの両足のフットパットに100
μlずつ投与した。追加免疫には感染細胞を上記の様に
0.5から2.0 x 107 cells/mlになるようにPBSに懸濁した
溶液を、エーテル麻酔下にWKY/NCrjラットの両足のフッ
トパットに100μlずつ投与した。この追加免疫は３から
５日おきに行った。初回免疫から14日後に２匹のラット
の尾静脈を剃刀で切断し、末梢血を回収した。血液は37
℃に30分間放置した後、４℃で一晩放置した。3000 rpm
で５分間遠心し血清を得た。この血清をFACS溶液（PBS/
1% FCS/0.02% NaN3）で100倍に希釈し、希釈液50μlを
実施例１で作製したCX3CR1-EGFPを発現しているL1.2細
胞に加え、４℃で30分間放置した。FACS溶液で１回洗浄
した後、PE標識抗ラットIgG抗体（Caltag社製）を50倍
希釈した溶液を50μl加え、４℃に30分間放置した。FAC
S溶液で１回洗浄した後、FACS CaliberでCX3CR1-EGFPの
発現及び抗体の反応を同時に測定した。その結果、２匹
中１匹においてCX3CR1-EGFPと選択的に反応する血清が
得られた。更に追加免疫を続けた結果、初回免疫から28
日後には２匹中２匹のラットで特異的な抗血清が得られ
た。これら血清はCX3CR1-EGFPを発現している細胞とは
反応するものの、発現していない細胞とは反応せず、昆
虫細胞に対して誘起された抗体が、哺乳類細胞であるマ
ウスL1.2細胞とはほとんど交叉反応を示さないことが明
らかとなった。この結果により、昆虫細胞等の非哺乳類
細胞に哺乳類の遺伝子を発現させて、発現させた細胞を
抗原としてラット等に免疫する手法は、特に本来の構造
を保ったまま高純度に精製することが困難な、多回膜貫
通型蛋白質（例えばG蛋白質共役型７回膜貫通型受容
体、イオンチャンネルなど）の抗血清を得るのに有用な
方法であることが示された。
感染High Five細胞をフラスコから回収し、PBSで一回洗
浄して、1.0から2.0 x 107 cells/mlになるようにPBSに
懸濁した。これに等量のフロイントコンプリートアジュ
バンドを加え、エマルジョンを作製した。これをエーテ
ル麻酔下にWKY/NCrjラットの両足のフットパットに100
μlずつ投与した。追加免疫には感染細胞を上記の様に
0.5から2.0 x 107 cells/mlになるようにPBSに懸濁した
溶液を、エーテル麻酔下にWKY/NCrjラットの両足のフッ
トパットに100μlずつ投与した。この追加免疫は３から
５日おきに行った。初回免疫から14日後に２匹のラット
の尾静脈を剃刀で切断し、末梢血を回収した。血液は37
℃に30分間放置した後、４℃で一晩放置した。3000 rpm
で５分間遠心し血清を得た。この血清をFACS溶液（PBS/
1% FCS/0.02% NaN3）で100倍に希釈し、希釈液50μlを
実施例１で作製したCX3CR1-EGFPを発現しているL1.2細
胞に加え、４℃で30分間放置した。FACS溶液で１回洗浄
した後、PE標識抗ラットIgG抗体（Caltag社製）を50倍
希釈した溶液を50μl加え、４℃に30分間放置した。FAC
S溶液で１回洗浄した後、FACS CaliberでCX3CR1-EGFPの
発現及び抗体の反応を同時に測定した。その結果、２匹
中１匹においてCX3CR1-EGFPと選択的に反応する血清が
得られた。更に追加免疫を続けた結果、初回免疫から28
日後には２匹中２匹のラットで特異的な抗血清が得られ
た。これら血清はCX3CR1-EGFPを発現している細胞とは
反応するものの、発現していない細胞とは反応せず、昆
虫細胞に対して誘起された抗体が、哺乳類細胞であるマ
ウスL1.2細胞とはほとんど交叉反応を示さないことが明
らかとなった。この結果により、昆虫細胞等の非哺乳類
細胞に哺乳類の遺伝子を発現させて、発現させた細胞を
抗原としてラット等に免疫する手法は、特に本来の構造
を保ったまま高純度に精製することが困難な、多回膜貫
通型蛋白質（例えばG蛋白質共役型７回膜貫通型受容
体、イオンチャンネルなど）の抗血清を得るのに有用な
方法であることが示された。
【００１５】［実施例４］モノクローナル抗体の作製 実施例３で免疫した初回免疫から30日後のラット１匹を
用いて、モノクローナル抗体の作製を試みた。エーテル
麻酔下にラットを右腋静脈からの放血により屠殺し、腸
骨リンパ節と両足のリンパ節を得た。RPMI-1640培地で
５回洗浄した後に、鋏でリンパ節を切開し、70μmのメ
ッシュを通して2 x 108個のリンパ球を分離した。分離
したリンパ球とミエローマP3細胞を２回RPMI-1640培地
で洗浄し、5:1の割合で混合してRPMI-1640培地に懸濁
し、1500 rpmで５分間遠心した。細胞塊をほぐした後、
37℃で暖めておいた50%PEG溶液（ベーリンガー社製）1
mlを２分間かけて徐々に加えた。続けて37℃に暖めてお
いたRPMI-1640培地20 mlを３分間かけて徐々に加えた。
1000 rpmで５分間遠心した後、５分間放置して細胞融合
を行った。上清を除いた後、リンパ球細胞が1 x 106/ml
になるように10% FCS/10% ORIGEN HCF（ICGS社製）/RPM
I-1640培地に懸濁し、１ウェルあたり100μlずつ96ウェ
ルプレート20枚に分注した。翌日に10% FCS/10% ORIGEN
HCF/2x HAT（Lifetech社製）/RPMI-1640培地を１ウェ
ルあたり100μlずつ加えハイブリドーマの選択を開始し
た。６日後に、抗CX3CR1抗体を産生するハイブリドーマ
を、実施例１で作製したCX3CR1-EGFPを発現しているL1.
2細胞を用いて、実施例３と同様の方法でスクリーニン
グした。その結果、2000ウェル中19ウェルがCX3CR1-EGF
Pを発現しているL1.2細胞と選択的に反応した。これに
対し、CX3CR1-EGFPを発現している細胞にも発現してい
ない細胞にも、非選択的に反応するウェルは３ウェルの
みであった。従って、昆虫細胞に対して誘起された抗体
は、哺乳類細胞であるマウスL1.2細胞とは、ほとんど交
叉反応を示さないことが明らかとなった。この結果によ
り、昆虫細胞等の非哺乳類細胞に哺乳類の遺伝子を発現
させて、発現させた細胞を抗原としてラット等に免疫す
る手法は、特に本来の構造を保ったまま高純度に精製す
ることが困難な、多回膜貫通型蛋白質（例えばG蛋白質
共役型７回膜貫通型受容体、イオンチャンネルなど）の
モノクローナル抗体を得るのに有用な方法であることが
示された。
用いて、モノクローナル抗体の作製を試みた。エーテル
麻酔下にラットを右腋静脈からの放血により屠殺し、腸
骨リンパ節と両足のリンパ節を得た。RPMI-1640培地で
５回洗浄した後に、鋏でリンパ節を切開し、70μmのメ
ッシュを通して2 x 108個のリンパ球を分離した。分離
したリンパ球とミエローマP3細胞を２回RPMI-1640培地
で洗浄し、5:1の割合で混合してRPMI-1640培地に懸濁
し、1500 rpmで５分間遠心した。細胞塊をほぐした後、
37℃で暖めておいた50%PEG溶液（ベーリンガー社製）1
mlを２分間かけて徐々に加えた。続けて37℃に暖めてお
いたRPMI-1640培地20 mlを３分間かけて徐々に加えた。
1000 rpmで５分間遠心した後、５分間放置して細胞融合
を行った。上清を除いた後、リンパ球細胞が1 x 106/ml
になるように10% FCS/10% ORIGEN HCF（ICGS社製）/RPM
I-1640培地に懸濁し、１ウェルあたり100μlずつ96ウェ
ルプレート20枚に分注した。翌日に10% FCS/10% ORIGEN
HCF/2x HAT（Lifetech社製）/RPMI-1640培地を１ウェ
ルあたり100μlずつ加えハイブリドーマの選択を開始し
た。６日後に、抗CX3CR1抗体を産生するハイブリドーマ
を、実施例１で作製したCX3CR1-EGFPを発現しているL1.
2細胞を用いて、実施例３と同様の方法でスクリーニン
グした。その結果、2000ウェル中19ウェルがCX3CR1-EGF
Pを発現しているL1.2細胞と選択的に反応した。これに
対し、CX3CR1-EGFPを発現している細胞にも発現してい
ない細胞にも、非選択的に反応するウェルは３ウェルの
みであった。従って、昆虫細胞に対して誘起された抗体
は、哺乳類細胞であるマウスL1.2細胞とは、ほとんど交
叉反応を示さないことが明らかとなった。この結果によ
り、昆虫細胞等の非哺乳類細胞に哺乳類の遺伝子を発現
させて、発現させた細胞を抗原としてラット等に免疫す
る手法は、特に本来の構造を保ったまま高純度に精製す
ることが困難な、多回膜貫通型蛋白質（例えばG蛋白質
共役型７回膜貫通型受容体、イオンチャンネルなど）の
モノクローナル抗体を得るのに有用な方法であることが
示された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 19/00 // Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ１２Ｒ 1:91） 14/705 (Ｃ１２Ｐ 21/08 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA63 BA80 CA04 DA02 EA02 FA10 GA05 HA15 4B064 AG26 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA92X AA93Y AB05 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 CA42 DA51 DA75 DA76 EA50 EA61 FA72 FA74
Claims (9)
- 【請求項１】以下に記載の方法から成る、多回膜貫通型
の哺乳類膜蛋白質に対するモノクローナル抗体産生細胞
株を作製する方法。 1).該蛋白質を発現させた昆虫細胞を、哺乳類動物に免
疫し、 2).免疫した哺乳類動物より抗体産生細胞を取り出し
て、ミエローマ細胞と細胞融合した後、 3).融合した細胞株の産生する抗体を、該蛋白質をコー
ドする遺伝子を導入した哺乳類細胞と反応させて、該蛋
白質に対する抗体を産生する融合細胞株を選択する方
法。 - 【請求項２】以下に記載の方法から成る、多回膜貫通型
の哺乳類膜蛋白質に対するモノクローナル抗体産生細胞
株を作製する方法。 1).該蛋白質を発現させた昆虫細胞より、膜画分を調整
する、あるいは該蛋白質に付加したアフィニティータグ
を用いて該蛋白質を吸着することにより、濃縮した該蛋
白質を、哺乳類動物に免疫し、 2).免疫した哺乳類動物より抗体産生細胞を取り出し
て、ミエローマ細胞と細胞融合した後、 3).融合した細胞株の産生する抗体を、該蛋白質をコー
ドする遺伝子を導入した哺乳類細胞と反応させて、該蛋
白質に対する抗体を産生する融合細胞株を選択する方
法。 - 【請求項３】多回膜貫通型の哺乳類膜蛋白質を発現させ
た昆虫細胞を、哺乳類動物に免疫し、該蛋白質に対する
抗血清を作製する方法。 - 【請求項４】多回膜貫通型の哺乳類膜蛋白質を発現させ
た昆虫細胞より、膜画分を調整する、あるいは該蛋白質
に付加したアフィニティータグを用いて該蛋白質を吸着
することにより、濃縮した該蛋白質を、哺乳類動物に免
疫し、該蛋白質に対する抗血清を作製する方法。 - 【請求項５】請求項１ないし請求項２に記載の方法によ
り得られたモノクローナル抗体産生細胞株。 - 【請求項６】請求項５に記載のモノクローナル抗体産生
細胞株より産生されたモノクローナル抗体。 - 【請求項７】免疫する哺乳類動物が齧歯類である、請求
項１ないし請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】該蛋白質を発現させた哺乳類細胞が齧歯類
細胞である、請求項１ないし請求項２に記載の方法。 - 【請求項９】ケモカイン受容体ヒトCX3CR1に対するモノ
クローナル抗体。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000354387A JP2001218581A (ja) | 1999-11-30 | 2000-11-21 | モノクローナル抗体の作製法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33957099 | 1999-11-30 | ||
| JP11-339570 | 1999-11-30 | ||
| JP2000354387A JP2001218581A (ja) | 1999-11-30 | 2000-11-21 | モノクローナル抗体の作製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001218581A true JP2001218581A (ja) | 2001-08-14 |
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ID=26576453
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000354387A Pending JP2001218581A (ja) | 1999-11-30 | 2000-11-21 | モノクローナル抗体の作製法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001218581A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7390490B1 (en) | 2001-03-19 | 2008-06-24 | Eisai Co., Ltd. | Uses of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine |
| US8518401B1 (en) | 2004-10-29 | 2013-08-27 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Treating inflammatory diseases with antibodies that inhibit fractalkine-CXCR1 interaction |
| US8932592B2 (en) | 2009-10-30 | 2015-01-13 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
-
2000
- 2000-11-21 JP JP2000354387A patent/JP2001218581A/ja active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6009038608, 社団法人 日本生化学会 編，新生化学実験講座１２ 分子免疫学ＩＩＩ−抗原・抗体・補体−，東京化学同人 * |
| JPN6009038610, Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． １９９１， Ｖｏｌ．２， Ｎｏ．２−３， ｐ．９５−１０７ * |
| JPN6009038612, Ｃｅｌｌ． １９９７， Ｖｏｌ．９１， Ｎｏ．４， ｐ．５２１−５３０ * |
| JPN6009038613, Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９９ Ｆｅｂ， Ｖｏｌ．６４， Ｎｏ．１１， ｐ．９１３−９２１ * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7390490B1 (en) | 2001-03-19 | 2008-06-24 | Eisai Co., Ltd. | Uses of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine |
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| US8932592B2 (en) | 2009-10-30 | 2015-01-13 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
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