【発明の詳細な説明】
ニューロタクチンおよびその使用 発明の背景
本発明は、新規のケモカインであるニューロタクチンと、ニューロタクチンの
調製法および使用法に関する。
ケモカインは、白血球の活性化および走化性に関する。これらは、炎症の重要
な介在因子と考えられている（Baggioliniviら、Immunology Today 15:127，199
4）。
ケモカインは、3種類に分類されている。C-X-Cファミリーのケモカインは、1
個のアミノ酸によって、最初の2個のシステインが隔てられている。このケモカ
インの仲間は、好中球の走化性、細胞形状の変化の誘導、細胞内カルシウムの一
過的な増加、顆粒のエキソサイトーシス、およびレスピラトリーバーストに関与
すると考えられている。インターロイキン-8(IL-8)、好中球活性化蛋白質-2（NA
P-2）、および顆粒球走化性蛋白質（GCP）が、この仲間に入る。既知のC-X-Cケ
モカインはすべて、ヒトの第4染色体とマウスの第5染色体上にマップされている
。
C-Cファミリーにおいては、最初の2つのシステインが互いに結合している。こ
の仲間は、単球に走化性を与えるが、好中球には与えない。最近の研究から、こ
れらが、好塩基球および好酸球を活性化できることが示された。C-Cケモカイン
に属する蛋白質には、単球走化性蛋白質1、2、ならびに3（MCP-1、MCP-2、およ
びMCP-3）、RANTES、およびマクロファージ炎症蛋白質αおよびβ（MIP-α、お
よびMIP−β）。最近になって、MIP-3、MIP-4、およびMIP-1γについても言及さ
れている（WO95/17092）。既知のC-Cケモカインはすべて、ヒトの第17染色体と
マウスの第11染色体上にマップされている。
第三のグループのケモカインの例も同定されている。このグループのケモカイ
ンであるリンパタクチンは、Tリンパ球の前駆細胞から分離された。リンパタク
チンは、リンパ球に対して走化性がある（Kelnerら、Science，266:1395，1994
）。2つのジスルフィド結合が蛋白質を安定化させる、C-Cファミリー、およびC-
X-Cファミリーのケモカインと違って、リンパタクチンには、たった一つのジス
ルフィド結合しかない。リンパタクチンは、ヒトとマウスの第1染色体上にマッ
プされて
いる。
さまざまなタイプの細胞が、さまざまな炎症状態に関与している。例えば、細
菌感染の後に見られる急性の浸潤細胞は、主に好中球であるが、細胞内の病原体
による感染後には、単核細胞が優勢を占める。好塩基球と好酸球は、即時型アレ
ルギー反応と自己免疫疾患において優位を占める。ケモカインによって、これら
のさまざまな細胞型が調節されていることが分かるにつれて、炎症に関連した障
害に対する、より効果的な治療法の開発が容易になる。
脳の炎症については、部分的にしか分かっていない。脳は、免疫学的に特権を
与えられた器官というよりは、それ自体で、免疫反応を調節していると考えられ
る（Trevorら、Immunology Today 15:566，1994）。T細胞の浸潤によって、炎症
性サイトカインの脳内の産生が開始されるが、長期間の炎症は、小膠細胞のよう
な、CNSに常在する細胞に依存している。
発明の概要
本発明は、新規の膜定着ケモカインであるニューロタクチンの同定および特徴
分析に関する。ニューロタクチンの配列解析によって、これが、他のケモカイン
のアミノ末端に類似したアミノ末端ドメインを含む一方で、現在同定されている
全てのケモカインとは異なる全体構造を有することが明らかになる。ニューロタ
クチンの発現パターンは、正常な哺乳動物の脳において高度に発現されるという
点で、ケモカインとしては例外的である。別のケモカインと同じように、ニュー
ロタクチンは、骨髄幹細胞、内皮細胞、および線維芽細胞で、いずれも活性化因
子であるリポ多糖（LPS）およびホルボールミリスチン酸（PMA）によって処理さ
れた細胞において上昇制御を受ける。
本明細書において説明されているニューロタクチンのマウス型は、395個のア
ミノ酸をコードしている（図1）。このマウス型蛋白質（配列番号：2）は、約21
アミノ酸長のシグナル配列で始まり、その後に、約22位のアミノ酸から約339位
のアミノ酸まで続く約318個のアミノ酸を含む明らかな細胞外ドメインと、約340
位のアミノ酸から約360位のアミノ酸まで続く約21個の膜貫通ドメインと、約361
位のアミノ酸から395位のアミノ酸にかけて続く約35個のアミノ酸を含む細胞質
ドメインを有する。
本明細書において説明されているニューロタクチンのヒト型は、397個のアミ
ノ酸をコードしている（図2）。このヒト型蛋白質（配列番号：4）は、約21アミ
ノ酸長のシグナル配列で始まり、その後に、約22位のアミノ酸から約341位のア
ミノ酸まで続く約321個のアミノ酸を含む明らかな細胞外ドメインと、約342位の
アミノ酸から約362位のアミノ酸にかけて続く約22個のアミノ酸を含む細胞膜貫
通ドメインと、約363位のアミノ酸から約397位のアミノ酸にかけて続く約35個の
アミノ酸を含む細胞質ドメインを有する。
本明細書において説明されているマウス型のニューロタクチンと、本明細書に
おいて説明されているヒト型のニューロタクチンの両方の細胞外ドメインに中に
は、約22位のアミノ酸から約92位のアミノ酸にかけて続くケモカイン様ドメイン
がある。
全体としては、本明細書において説明されているヒト型のニューロタクチンは
、本明細書において説明されているマウス型のニューロタクチンと、アミノ酸レ
ベルで67％一致している。細胞膜貫通ドメインと細胞質ドメインとで、二つの型
の間に最も高い相同性が見られ、どちらも重要な機能的役割を持っていることが
示唆された。また、二つの型の間では、ケモカイン様アミノ末端領域に、高い相
同性が見られる。
本発明は、ニューロタクチンポリペプチドをコードする、単離された核酸を特
徴とする。この核酸は、例えば、図1の配列番号：1（マウス）、または図2の配
列番号：3（ヒト）の塩基配列を持っていてもよい。好ましくは、ニューロタク
チンポリペプチドには、図1（配列番号：2）に示されたアミノ酸配列または図2
（配列番号：4）に示されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸が含まれる
。また、厳密な条件下で、例えば、図1の配列番号：1（マウス）または図2の配
列番号：3（ヒト）の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸を単離する
ことも、本発明の範囲内に含まれると考えられる。厳密な条件下で、例えば、配
列番号：1、配列番号：3にハイブリダイズする核酸によってコードされる、実質
的に純粋なポリペプチドも、本発明の特徴である。
好ましいニューロタクチンポリペプチドは、例えば、本明細書において説明さ
れているヒトのニューロタクチンの成熟型など、天然のニューロタクチンポリペ
プチドの配列と実質的に同一の配列をもつ。
「単離された核酸」とは、DNAが、その由来した生物の天然のゲノム中におい
て（一方は5'末端に、一方は3'末端に）直接に隣接している両側のコード配列が
、直接には隣接しなくなっているという意味である。このように、組換え核酸は
、コード配列に直接隣接している5'側非コード（例えば、プロモーター）配列の
全部または一部を含んでいてもよい。したがって、この用語には、例えば、組換
えDNAで、ベクター、自己複製するプラスミドや、レトロウイルスのようなウイ
ルス、または、原核生物や真核生物のゲノムDNAの中に組み込まれたDNA、または
、他の配列とは独立した別個の分子（例えば、cDNA、PCRまたは制限酵素処理に
よって産生されたゲノムDNA断片）として存在しているDNAが含まれる。また、付
加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDN
Aも含まれる。
「成熟したヒトニューロタクチン」とは、図2（配列番号：4）に示されている
、約22位のアミノ酸から397位のアミノ酸までの配列をもつポリペプチドを意味
する。成熟したヒトニューロタクチンに実質的に同一のポリペプチドは、図2（
配列番号：4）のニューロタクチンポリペプチドのアミノ酸配列に、少なくとも8
5％、好ましくは90％、最も好ましくは95％、さらには、99％同一のアミノ酸配
列を持っている。
「実質的に同一の」とは、参照となるアミノ酸配列または塩基配列に、少なく
とも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％、またはそれ以上一致した配列
を有するポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについては、参照と
なるポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも16アミノ酸、好ましくは
、少なくとも20アミノ酸、より好ましくは、少なくとも25アミノ酸、また、最も
好ましくは35アミノ酸である。核酸について、参照となる塩基配列の長さは、少
なくとも50塩基、好ましくは、少なくとも60塩基、より好ましくは、少なくとも
75塩基、また、最も好ましくは110塩基である。
配列の一致率は、配列解析ソフトウエア（例えば、ジェネティクスコンピュー
タグループの配列解析ソフトウエアパッケージ、ウィスコンシン州1710、マディ
ソン、ユニバーシティー通りにあるウィスコンシン大学バイオテクノロジーセン
ター）を用いて、そこで設定されているデフォルトのパラメータによって測定す
る。
参照となる配列に100％よりも低い一致率を示すポリペプチド配列の場合には
、一致しない位置は、好ましくは、参照配列に関して保存的な置換であることが
、必要ではないが、好ましい。保存的な置換としては、典型的には、以下の基内
での置換が含まれる：グリシンとアラニン；バリンとイソロイシンとロイシン；
アスパラギン酸とグルタミン酸；アスパラギンとグルタミン；セリンとスレオニ
ン；リジンとアルギニン；および、フェニルアラニンとチロシン。
特定のポリペプチドが、所定の長さの参照アミノ酸と特定の一致率をもつとい
われるときには、この一致率は、参照ペプチドに対するものである。すなわち、
100アミノ酸長の参照ポリペプチドに50％一致するペプチドというのは、参照ポ
リペプチドの50アミノ酸長の部分に完全に一致する50アミノ酸のポリペプチドか
もしれない。また、参照ポリペプチドの全長にわたって、50％が一致する100ア
ミノ酸長のポリペプチドであるかもしれない。勿論、その他多くのポリペプチド
が、同じ基準に合致すると考えられる。
例えば、細胞外ドメインまたはケモカイン様ドメイン（本明細書において説明
されているニューロタクチンの形態では、約22位のアミノ酸から約92位のアミノ
酸）などのニューロタクチンの一つ以上のドメインに対応するポリペプチドも、
本発明の範囲に含まれる。好ましいポリペプチドとは、正常な生理学的条件下で
可溶性のポリペプチドである。また、融合蛋白質を作出するために、ニューロタ
クチンの全長またはその一部（例えば、一つ以上のドメイン）を、無関係な蛋白
質やポリペプチドに融合させた可溶性の融合蛋白質も本発明の範囲内である。
本発明はまた、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質内ドメイン、ケモカ
イン様ドメイン、およびニューロタクチンのさまざまな機能的ドメインを含むが
、これらに限定はされない、ニューロタクチンの一部をコードする単離された塩
基配列を特徴とする。また、細胞外ドメインまたはケモカイン様ドメインなど、
ニューロタクチンの一つ以上のドメインに対応するポリペプチドをコードする核
酸も、本発明の範囲に含まれる。好ましい核酸は、正常な生理学的条件下で可溶
性のポリペプチドをコードしている。また、融合蛋白質を作出するために、ニュ
ーロタクチンまたはその一部（例えば、一つ以上のドメイン）を、無関係な蛋白
質やポリペプチドに融合した融合蛋白質も本発明の範囲内にある。
配列を改変したり、欠失させたニューロタクチンの形状をコードする塩基配列
も、発明の範囲内に包含される。
本発明の核酸には、成熟したニューロタクチンをコードする核酸だけでなく、
例えば、分泌に関係する配列など、分泌を促すポリペプチドに融合されたニュー
ロタクチンポリペプチドをコードする核酸が含まれる。このような融合蛋白質は
、典型的には、プレ蛋白質と呼ばれている。分泌に関係する配列は、宿主細胞に
よって取り除かれて、成熟蛋白質を形成することができる。また、不活性なプロ
蛋白質を産生するための、ポリペプチド配列に融合した成熟ニューロタクチンを
コードする核酸も、本発明の範囲に含まれる。プロ蛋白質は、不活性化配列を除
去することによって、蛋白質の活性型に転換することができる。
また、本発明は、ニューロタクチンポリペプチドをコードする核酸に、厳密な
条件下でハイブリダイズする核酸も包含する。「厳密な条件」とは、チャーチ緩
衝液（7％ SDS、0.5％ NaHPO4、1mM EDTA、1％BSA）中、50℃でのハイブリダイ
ゼーション、および2×SSC中、50℃での洗浄を意味する。ハイブリダイズする核
酸のハイブリダイズする部分の長さは、好ましくは、20塩基、30塩基、50塩基、
または70塩基の長さである。好ましくは、ハイブリダイズしている核酸のハイブ
リダイズする部分は、ニューロタクチンポリペプチドをコードする核酸の一部の
配列に、95％、または、さらに98％一致している。上述したような型にハイブリ
ダイズする核酸は、クローニング用プローブ、プライマー（例えば、PCRプライ
マー）、または診断用プローブとして用いることができる。ハイブリダイズする
核酸で好ましい核酸は、天然のニューロタクチンがもつ生物学的活性の全部また
は一部をもつポリペプチドをコードするものである。ハイブリダイズする核酸は
、本明細書において説明されているニューロタクチン遺伝子の一つがコードする
スプライスバリアントの可能性もある。すなわち、それらは、本明細書において
説明されているニューロタクチンのさまざまな形態よりも短かったり、長かった
りする蛋白質をコードしている。また、ハイブリダイズする核酸は、ニューロタ
クチンに関係する蛋白質（例えば、本明細書において説明されているニューロタ
ク
チン遺伝子に相対的に高い一致率をもつ部位を含む遺伝子がコードする蛋白質）
をコードしているかもしれない。
また、本発明は、実質的に純粋なニューロタクチンポリペプチドを特徴とする
。本発明に包含されるポリペプチドには、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細
胞質内ドメイン、および、本明細書において説明されているマウスニューロタク
チンの形態では、約22位のアミノ酸から約92位のアミノ酸にわたるドメインに相
当し、また、本明細書において説明されているヒトニューロタクチンの形態では
、約22位のアミノ酸から約92位のアミノ酸にわたるドメインに相当するケモカイ
ン様ドメインを含む、ニューロタクチンのさまざまな機能的ドメインに対応する
ポリペプチドである。
本発明はまた、その配列が、本明細書において説明されている形態のニューロ
タクチンの配列に実質的に同一なポリペプチドと核酸を包含する。
「蛋白質」および「ポリペプチド」とは、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコ
シル化、またはリン酸化）とは関係なく、あらゆるアミノ酸の鎖を意味する。
「実質的に純粋」とは、少なくとも重量（乾物重）で60％が、目的とする化合
物、すなわち、ニューロタクチンポリペプチドである調製物を意味する。この調
製物は、重量で、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、
最も好ましくは少なくとも99％が、目的の化合物である。精製度は、例えば、カ
ラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析な
どの適当な標準的方法によって測定することができる。
「核酸」という用語は、RNA、ならびに、cDNA、ゲノムDNA、および合成（例え
ば、化学的に合成された）DNAなどのDNAを包含する。この核酸は、二本鎖でも一
本鎖でもよい。一本鎖の場合には、この核酸は、センス鎖でもアンチセンス鎖で
もよい。
本発明のポリペプチドには、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、およ
び合成ポリペプチド、また、プレ蛋白質、またはプロ蛋白質であるポリペプチド
が含まれるが、これらに限定はされない。
本発明のポリペプチドは、例えば、マーカーポリペプチドなどの別のポリペプ
チド、すなわち融合パートナーと融合させて発現させることができる。例えば、
ポリペプチドを、ヘキサヒスチジンタグに融合させて、バクテリアが発現する蛋
白質の精製を容易にすることができ、あるいは、ヘマグルチニンタグに融合させ
て、真核生物の細胞が発現する蛋白質の精製を容易にすることができる。
本発明は、本発明に包含される核酸を有する形質転換された細胞を特徴とする
。また、本発明は、発現に適当な位置に置かれた本発明の核酸を含むベクターを
特徴とする。例えば、このベクターは、発現ベクターでもよく、1個以上の調節
因子を含んでいてもよい。組織特異的な発現を指向する調節因子など、ベクター
に挿入された核酸の発現に影響を与える調節因子は、当業者に周知である。調節
因子の例としては、サイトメガロウイルスhCMVの極初期遺伝子、SV40アデノウイ
ルスの初期プロモーター、SV4Oアデノウイルスの後期プロモーター、lacシステ
ム、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、ラムダファージの主要オペレー
ターおよびプロモーター領域、fdコート蛋白質の調節領域、3-ホスホグリセリン
酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母の
α-接合因子のプロモーターなどがある。ベクターは、プラスミド、またはレト
ロウイルスなどのウイルスでもよい。
「形質転換細胞」とは、組換えDNA技術の方法によって、（本明細書において
用いられる場合は）ニューロタクチンポリペプチドをコードしているDNA分子を
、その中（または、その祖先細胞の中）に導入している細胞を意味する。
「発現のために置かれた」とは、配列要素が、選択されたDNAの転写および/ま
たは翻訳を調節することができるように（すなわち、選択されたDNAが、操作で
きるように配列要素に結合している）、配列の転写および/または翻訳を指向す
る、1個以上の配列要素に隣接した位置に、選択したDNA分子を置くことを意味す
る。このように操作できるように結合された要素を用いて、ニューロタクチンポ
リペプチドの産生を促すことができる。
また、本発明は、ニューロタクチン蛋白質またはニューロタクチンポリペプチ
ドに特異的に結合する精製された抗体も特徴とする。
「精製された抗体」とは、抗体が、自然な状態で結合している蛋白質、および
天然の有機分子から、乾物重で少なくとも60％分離されていることを意味する。
好ましくは、この調製物は、乾物重で、少なくとも75％が、より好ましくは少な
くとも90％が、また、最も好ましくは少なくとも99％が抗体である。
「特異的に結合する」とは、特定の抗原、例えば、ニューロタクチンポリペプ
チドなどを認識して結合するが、例えば、生物学的サンプルなどで、自然にニュ
ーロタクチンを含んでいるサンプル中の他の分子を認識して結合することのない
抗体を意味する。
本発明はまた、ニューロタクチンの作用剤および拮抗剤を特徴とする。拮抗剤
は、ニューロタクチンの機能を一つ以上阻害することができる。適当な拮抗剤に
は、高分子もしくは低分子、ニューロタクチンに対する抗体、および、天然型の
ニューロタクチンと競合するニューロタクチンポリペプチドが含まれる。ニュー
ロタクチンの作用剤は、ニューロタクチンの機能を一つ以上亢進ないし促進させ
る。適当な作用剤には、例えば、高分子もしくは低分子、およびニューロタクチ
ンに対する抗体が含まれうる。
また、ニューロタクチンの発現を妨害するために用いることができる核酸分子
、例えば、アンチセンス分子およびリボザイムも本発明に含まれる。
本発明は、実質的に純粋なニューロタクチンポリペプチドを特徴とする。さま
ざまな好ましい態様において、このポリペプチドは、可溶性であり、ニューロタ
クチンのケモカイン様ドメインを含み、ニューロタクチンの細胞外ドメインを含
み、配列番号：4における22位のアミノ酸から92位のアミノ酸までのアミノ酸配
列に少なくとも80％同一であり、配列番号：4における22位のアミノ酸から92位
のアミノ酸までのアミノ酸配列に少なくとも90％同一であり、配列番号：4にお
ける22位のアミノ酸から92位のアミノ酸までのアミノ酸配列と同一であり、配列
番号：4における22位のアミノ酸から397位のアミノ酸までのアミノ酸配列に少な
くとも80％同一であり、配列番号：4における22位のアミノ酸から397位のアミノ
酸までのアミノ酸配列に少なくとも90％同一であり、また、配列番号：4におけ
る22位のアミノ酸から397位のアミノ酸までのアミノ酸配列に同一である。
本発明はまた、第一の部位と第二の部位とを含む、実質的に純粋なポリペプチ
ドを特徴とするが、ここで、第一の部位はニューロタクチンポリペプチドを含み
、第二の部位は、免疫グロブリンの定常領域を含んでいる。
本発明はまた、第一の部位と第二の部位とを含む、実質的に純粋なポリペプチ
ドを特徴とするが、ここで、第一の部位はニューロタクチンポリペプチドを含み
、第二の部位は検出可能なマーカーを含んでいる。検出可能なマーカーの例とし
ては、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（C
AT）、アデノシンデアミナーゼ（ADA）、アミノグリコシドホスホトランスフェ
ラーゼ（neor、G418r）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、ハイグロマイシ
ン-B-ホスホトランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）、β-ガラク
トシダーゼ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XG
PRT）などがある。
別の局面において、本発明は、ニューロタクチンをコードする組換え核酸を特
徴とする。さまざまな好ましい態様において、この核酸は、可溶性のニューロタ
クチンポリペプチドをコードしており、ニューロタクチンのケモカイン様ドメイ
ンをコードしており、また、ニューロタクチンの細胞外ドメインをコードしてい
る。
本発明はまた、ハイブリッドポリペプチドをコードする核酸を特徴とする。こ
のハイブリッドポリペプチドは、第一の部位と第二の部位とを含むが、ここで、
第一の部位はニューロタクチンポリペプチドを含み、第二の部位は免疫グロブリ
ンの定常領域を含んでいる。
本発明はまた、ニューロタクチンポリペプチドをコードする組換え核酸、すな
わち、ニューロタクチンポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む細
胞を特徴とする。
別の局面において、本発明は、選択的にニューロタクチンポリペプチドに結合
する抗体を特徴とする。好ましい態様において、この抗体は、モノクローナル抗
体である。
また、本発明は、ニューロタクチンポリペプチドを含む薬学的組成物を特徴と
する。
本発明は、炎症を検出するための方法を特徴とする。この方法には、（a）生
物学的サンプルを得る段階；（b）このサンプルに、ニューロタクチンポリペプ
チドに選択的に結合する抗体を接触させる段階；そして、（c）炎症の測定値と
して、該生物学的サンプルに選択的に結合した抗体の量を測定する段階が含まれ
る。
別の局面において、本発明は、患者の炎症を治療するための方法で、ニューロ
タクチンの阻害剤を患者に投与する段階を含む方法を特徴とする。好ましくは、
阻害剤は、ニューロタクチンに選択的に結合する抗体である。
本発明は、また、患者において前駆細胞が増殖することを阻害するための方法
を特徴とする。この方法には、前駆細胞の増殖を阻害することができる実質的に
純粋なニューロタクチンポリペプチドを患者に投与することが含まれる。また、
本発明には、活発に分裂している骨髄細胞の増殖を抑制する方法が含まれる。こ
の方法には、細胞を、有効量の骨髄細胞の増殖を阻害することができるニューロ
タクチンポリペプチドと接触させることが含まれる。
本発明はまた、患者の化学療法または放射線療法とともに用いるための補助的
な方法も特徴とする。この方法には、有効量のニューロタクチンポリペプチドを
患者に投与する段階、ニューロタクチンポリペプチドの投与とともに、患者に化
学療法または放射線療法を施す段階が含まれる。「補助的な方法」とは、化学療
法または放射線療法の前後または最中に投与することを意味する。
本発明は、また、骨髄細胞過増殖症の患者を治療するための方法を特徴とする
。この方法には、有効量のニューロタクチンポリペプチドを患者に投与する段階
が含まれる。好ましい態様において、この病気は、慢性骨髄性白血病、真性多血
症および超巨核球細胞形成性障害（hypermagakaryocytopoietic disorder）であ
る。
本発明は、ニューロタクチンと機能的に相互作用する実質的に純粋な蛋白質お
よびニューロタクチンと機能的に相互作用する蛋白質をコードする核酸を特徴と
する。
別途定義されないかぎり、本明細書において用いられる技術的および科学的な
用語はすべて、本発明の属する技術分野において通常の技術をもつ当業者に広く
理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書において説明されているもの
に類似または等価の方法および材料を用いて、本発明を実施または試験すること
ができるが、好ましい方法および材料は、本明細書において説明されている。矛
盾する場合には、本明細書が、定義を含めて、統制する。さらに、材料、方法、
および実施例は、単なる例示であって、これらに制限されるものではない。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から
明らかになると思われる。
図面の簡単な説明
図1は、マウス型のニューロタクチンの塩基配列（配列番号：1）とアミノ酸配
列（配列番号：2）の、シグナル配列と推定される配列を含む配列を示している
。C32とC36との間のユニークな配列に下線が施されている。酵素切断部位の可能
性があるR337とR338と、膜内ドメインの可能性があるA340とY360との間にも下線
が施されている。
図2は、ヒト型のニューロタクチンの塩基配列（配列番号：3）とアミノ酸配列
（配列番号：4）の、シグナル配列と推定される配列を含む配列を示している。C
32とC36との間のユニークな配列に下線が施されている。酵素切断部位の可能性
のある、保存されているR339とR340、および、膜内ドメインの可能性があるA342
とY362との間にも下線が施されている。
図3は、ヒトおよびマウスのニューロタクチンの全長配列のアラインメントを
示している。この図において、二本の並んだ配列の間の垂直な線は、完全に一致
するものを示し、二本の並んだ配列の間の1個の点は、保存的な置換を示し、2個
の点は非常によく保存された置換を示し、配列の中の点線は、最適なアラインメ
ントを出すときに組み込まれたギャップを示している。図4は、既知のケモカイ
ンサブファミリーの一次構造と、ニューロタクチンの一次構造を比較したもので
ある。
図5は、好中球の走化性アッセイ法の結果をグラフに図示したものである。
詳細な説明
本明細書において初めて説明されているニューロタクチンは、炎症、特に、脳
の炎症に関与する新規のケモカインである。
ニューロタクチンは、特異的な細胞型の走化性に介在し、炎症伝達物質の放出
を誘導する可能性が高い。この結果、ニューロタクチンは、内皮細胞壁を通して
、白血球の浸潤を促進し、小膠細胞に影響を与えるようである。ニューロタクチ
ンは、別の蛋白質と同じように、機能的には膜結合型だけでなく、機能的に分泌
型のものもあるようである。
ニューロタクチンがケモカインであることが明らかになったが、ニューロタク
チンが、ケモカインの新規の分類例であることも明らかになった。
第一に、CCケモカインとCXCケモカインとのそれぞれが、スペーサーアミノ酸
を全く持たないか、1個しか持たないのに対して、ニューロタクチンは、最初の2
個のシステインの間に3個のスペーサーアミノ酸（CXXXC）を持っている。
第二に、ニューロタクチンは、普通とは違う発現パターンをもつ。他のケモカ
インと同じように、LPSまたはPMAで処理されると、ニューロタクチンは、骨髄幹
細胞、内皮細胞、および線維芽細胞の中で上昇制御される。しかし、他のケモカ
インとは異なって、ニューロタクチンは、正常な脳の中で高度に発現され、脳の
機能に関与していることが示唆されている。
第三に、予想されるニューロタクチン蛋白質の長さが、本明細書において説明
されているマウス型で395アミノ酸、本明細書において説明されているヒト型で3
97アミノ酸というのは、既知のケモカインの大部分よりも、かなり長い。さらに
、マウスおよびヒトのニューロタクチンの、成熟蛋白質の最初の92アミノ酸の後
ろの部位は、現在までに知られている、配列決定された蛋白質のいずれにも有意
な類似性を持っていない。本明細書において説明されているマウス型およびヒト
型のニューロタクチンの両方の最初の92アミノ酸は、それぞれ、マウスのMCP-1
、およびヒトのMCP-1に40％を越えるの同一性がある。
第四に、ニューロタクチン遺伝子は、既知の3つのマウスケモカインの染色体
上の位置とは異なった位置にマップされており、ヒトの第16染色体と、マウスの
第8染色体上にある。マウスのCC、CXC、およびリンパタクチンケモカインは、そ
れぞれ、第11、第5および第1染色体上にマップされている。
以上をまとめると、これらの事実は、ニューロタクチンが、本明細書において
δクラスと名付けられた新規の分類に属するケモカインの代表であることを示し
ている。
図4は、マウス型およびヒト型のニューロタクチンの一次構造と、ヒトのIL-8
、MCP-1、およびリンパタクチンの一次構造を示している。また、この図には、
これらの蛋白質の比較が示されている。この図からも分かるように、5つの蛋白
質すべての最初の92アミノ酸の一次構造は同じであるが、2つの型のニューロタ
クチンに
は、他のケモカインには見られない細胞外リンカードメイン、膜貫通ドメイン、
および細胞質ドメインが含まれている。細胞外リンカードメインは、ケモカイン
様ドメインと膜貫通ドメインとの間にあるドメインである。細胞外ドメインは、
本明細書において説明されているヒト型のニューロタクチンの約93位のアミノ酸
から約341位のアミノ酸にかけて続いており、本明細書において説明されている
マウス型のニューロタクチンの約93位のアミノ酸から約339位のアミノ酸にかけ
て続いている。
膜貫通領域に隣接した2個の隣り合うアルギニン（ヒト型では、339位と340位
のアミノ酸；ヒト型では、337位と338位のアミノ酸）により、これらの蛋白質を
細胞膜から切り離すために、蛋白質分解酵素によって、これらの蛋白質がプロセ
シングを受ける可能性が示されている。ニューロタクチン蛋白質とポリペプチド
ニューロタクチン蛋白質ならびにポリペプチド、およびニュー一ロタクチンの
融合蛋白質を調製して、抗体を精製したり、診断アッセイ法のための試薬を調製
したり、炎症（特に、脳の炎症）に関係する、その他の分子を同定したり、炎症
性モジュレーターのスクリーニングアッセイ法に用いるための試薬を調製したり
、また、炎症に関連した障害を治療するための治療薬を調製したりするなどの、
しかしこれらに限定されない広い範囲で使用することができる。
図1は、マウス型のニューロタクチンのアミノ酸配列（配列番号：2）を示して
いる。1位のアミノ酸から約21位のアミノ酸までのドメイン（イタリック体で示
してある）が、シグナル配列と推定される配列を形成する。この推定シグナル配
列の後には、約22位のアミノ酸から約339位のアミノ酸まで続く約318アミノ酸を
含む細胞外ドメインと考えられるドメイン、約340位のアミノ酸から約360位のア
ミノ酸まで続く約21アミノ酸を含む膜貫通ドメイン、および、約361位のアミノ
酸から約395位のアミノ酸まで続く約35アミノ酸を含む細胞質ドメインが続いて
いる。
図2は、ヒト型のニューロタクチンのアミノ酸配列（配列番号：4）を示してい
る。1位のアミノ酸から約21位のアミノ酸までのドメイン（イタリック体で示し
てある）が、シグナル配列と推定される配列を形成する。この推定シグナル配列
の後には、約22位のアミノ酸から約341位のアミノ酸まで続く約321アミノ酸を含
む
細胞外ドメインと考えられるドメイン、約342位のアミノ酸から約362位のアミノ
酸まで続く約22アミノ酸を含む膜貫通ドメイン、および、約363位のアミノ酸か
ら約397位のアミノ酸まで続く約35アミノ酸を含む細胞質ドメインが続いている
。
本発明は、図1の塩基配列（マウス、配列番号：1）または図2の塩基配列（ヒ
ト、配列番号：3）によってコードされているニューロタクチンに機能的に関係
しているニューロタクチン蛋白質およびポリペプチドを含むが、これらに限定は
されない。機能的に関連する蛋白質およびポリペプチドには、例えば、増殖、分
化、生存、アポトーシスに影響を与える能力、または、その増殖、分化、生存、
アポトーシスがニューロタクチンによって影響される細胞型の活性化に影響を与
える能力など、ニューロタクチンの特徴に共通する機能的特徴をもつ蛋白質また
はポリペプチドが含まれる。このような機能的に関連するニューロタクチンポリ
ペプチドには、本明細書において説明されているニューロタクチンの配列によっ
てコードされているアミノ酸配列の中のアミノ酸残基の付加または置換で、表面
的には変化のない変化をもたらし、そのため機能的には同等の遺伝子産物の産生
をもたらす付加または置換が含まれるが、これらに限定はされない。アミノ酸置
換は、関係する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および/または両
親媒性における類似に基づいて行われよう。
例えば、非極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニン
が含まれ、極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイ
ン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、陽性の電荷をもった
（塩基性の）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、
また、陰性の電荷をもった（酸性の）アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミ
ン酸が含まれる。
ニューロタクチンDNAにランダムな突然変異を起こすことができ（ランダム突
然変異誘発技術は、当業者において周知である）、その結果できた変異ニューロ
タクチン蛋白質の活性を調べることができるが、例えば、細胞増殖をより強く刺
激するなど、増強された機能をもつ変異ニューロタクチン、または、細胞増殖を
より弱く刺激するなど、低下した機能をもつ変異ニューロタクチンを作出するた
め
には、ニューロタクチンをコードする配列に部位特異的な突然変異誘発を工夫す
ることができる（部位特異的突然変異誘発技術は、当業者において周知である）
。
機能的に関連し、機能的に多様なニューロタクチンポリペプチドを設計するた
めには、保存された位置と可変的な位置を区別することが有用である。図4は、
保存された位置と可変的な位置にあるアミノ酸を決定するために用いることので
きる、ヒトのニューロタクチンとマウスのニューロタクチンのアミノ酸配列間の
アラインメントを示している。
ニューロタクチンの機能を保存するためには、保存された残基を変更しないこ
とが好ましい。さらに、非保存残基を変更するときには、保存的な変更、例えば
、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置き換えることが好ましい。別の機能
をもつ変異体を産生するためには、可変的および/または保存的位置に非保存的
変更を行うことが好ましい。また、可変的位置、および保存的位置における欠失
を用いて、異なった機能をもつ変異体を作出することができる。
選択した宿主細胞の中で発現させたり、発現量を上げたりするのにより適した
ニューロタクチン作出するために、ニューロタクチンをコードする配列に別の突
然変異を加えることができる。例えば、N-結合によるグリコシル化部位を変更な
いし削除して、例えば、N-結合した部位を過グルコシル化することが知られてい
る酵母宿主から、より容易に回収、精製される均一な産物の発現を行なわせるこ
とができる。この目的のために、（N-X-S、またはN-X-Tという形で）存在する一
つ以上のグルコシル化認識配列の1位か3位のアミノ酸の両方、または一方におけ
る、さまざまなアミノ酸置換、および/または、このような一つ以上の認識配列
の2位の位置におけるアミノ酸欠失によって、改変されたトリペプチド配列のグ
ルコシル化が防止される（例えば、Miyajimaら、EMBO J．，5:1193，1986を参照
のこと）。
好ましいニューロタクチンポリペプチドは、好中球の走化性を刺激するような
ニューロタクチンペプチド、または、その変異体である。特定のニューロタクチ
ンポリペプチド、または、その変異体が、好中球の走化性を刺激するか否かを判
定するにあたっては、標準的な好中球走化性アッセイ法のいずれを用いてもよい
。好ましいアッセイ法の一つは、本明細書において説明されている走化性アッセ
イ法である。好ましいニューロタクチンポリペプチドと変異体は、本明細書にお
いて説明されている、成熟した全長のヒト型のニューロタクチンの活性の20％、
40％、50％、75％、80％、または、さらに90％の活性をもっている。このような
比較は、一般的に、比較する分子の濃度が等しいことに基づいている。また、こ
のような比較は、得ることのできる最大限の刺激の50％に達するのに必要な蛋白
質量、またはポリペプチド量に基づいていてもよい。
また、例えば、細胞外ドメイン、およびケモカイン様ドメインなど、ニューロ
タクチンの一つ以上のドメインに相当するポリペプチドも、本発明の範囲内に含
まれている。好ましいポリペプチドは、正常な生理学的条件下で可溶なポリペプ
チドである。ニューロタクチンの一部が（例えば、一つ以上のドメインが）、融
合蛋白質を作出するために、無関係の蛋白質またはポリペプチド（すなわち、融
合パートナー）に融合している融合蛋白質も、本発明の範囲内に含まれる。融合
パートナーは、精製、検出、または可溶化を容易にするために選択された部位で
もよいし、または、何か別の機能を提供するために選択された部位でもよい。融
合蛋白質は、一般的に、ニューロタクチンの全部または一部をコードする塩基配
列を、読み枠を合わせて、融合パートナーに結合させたハイブリッド遺伝子を発
現させて産生される。融合パートナーには、免疫グロブリンの定常領域（IgFc）
が含まれるが、これらに限定はされない。ニューロタクチンポリペプチドが、Ig
Fcに融合されている融合蛋白質は、より安定的で、体内における半減期が、ニュ
ーロタクチンポリペプチドそれ自体よりも長い可能性がある。
ニューロタクチンのさまざまな可溶型も、本発明の範囲内に含まれる。例えば
、ニューロタクチンの全細胞外ドメイン、または、その一部を、それ自体で、ま
たは、例えば、免疫グロブリンなどの可溶化パートナーに融合させて発現させる
ことができる。
本発明は、また、前駆細胞の増殖を阻害することのできるニューロタクチンポ
リペプチドを特徴とする。このようなポリペプチドを用いて、化学療法および/
または放射線療法の影響から前駆細胞を守ることができる。都合の良いインビト
ロまたはインビボのアッセイ法を用いて、選択したニューロタクチンポリペプチ
ド
、またはその変異体が、前駆細胞の増殖を阻害することによって、適当な化学防
御剤となる可能性が高いか否かを判定することができる。適当なインビトロアッ
セイ法には、ジェンティーレ（Gentile）らによって説明されているアッセイ法
（米国特許第5,149,544号と第5,294,544号）が含まれる。さらに、インビボアッ
セイ法を用いて、前駆細胞の増殖阻害を調べることができる。前駆細胞の増殖を
評価するための適当なマウスモデルが、クーパー（Cooper）らによって説明され
ている（Exp．Hematol．22:186，1994）。このインビボモデルの結果を、インビ
トロアッセイ法の結果と合わせると、例えば、人間などの患者を治療するときの
、調べられた分子の効能を予測することができる。
一般的に、本発明によるニューロタクチン蛋白質は、適当な発現ベクターに入
った、ニューロタクチンをコードするDNA断片（例えば、本明細書において説明
されているcDNA）の全部、または一部で、宿主細胞を形質転換（トランスフェク
ション、形質導入、または感染）することによって産生させることができる。適
当な発現ベクターには、プラスミド、ウイルス粒子、およびファージが含まれる
。昆虫細胞のときには、バキュロウイルス発現ベクターが適当である。発現ベク
ターの全部、または、その一部を、宿主細胞のゲノムの中に組み込むことができ
る。状況によっては、例えば、商標登録LACSWITCHTM誘導発現システム（ストラ
タジーン（Stratagene）社、カリフォルニア州ラホヤ）のような誘導的な発現ベ
クターを用いることが望ましい。
分子生物学の分野における当業者には、広範囲の多様な発現システムを用いて
、組換え蛋白質を提供できることは明らかである。用いられる宿主細胞が正確に
何であるかは、本発明において重要ではない。ニューロタクチン蛋白質は、原核
生物宿主（例えば、大腸菌、または枯草菌）、または、真核生物宿主（例えば、
サッカロマイセス属（Saccharomyces）、またはピキア属（Pichia）；哺乳動物
細胞では、例えば、COS、NIH 3T3、CHO、BHK、293、またはHeLa細胞；または、
昆虫細胞）の中で産生させることができる。
蛋白質とポリペプチドは、植物細胞によっても産生させることができる。植物
細胞にとっては、ウイルスの発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイ
ルス、およびタバコモザイクウイルス）、およびプラスミド発現ベクター（例え
ば、Tiプラスミド）が適当である。このような細胞は、広範な供給源から入手す
ることが可能である（例えば、米国基準培養株コレクション、メリーランド州ロ
ックランド；また、例えば、Ausubelら、分子生物学の最新プロトコール（Curre
nt Protocol in Molecular Biology）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（
John Wiley & Sons）、ニューヨーク、1994を参照のこと）。形質転換およびト
ランスフェクションの方法と、発現ベクターの選択は、選択した宿主細胞システ
ムによって変わる。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えば、ア
ウスウベル（Ausubel）ら、（分子生物学の最新プロトコール（Current Protoco
l in Molecular Biology）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley
& Sons）、ニューヨーク、1994）によって説明されており、発現ベクターは、
例えば、クローニングベクター：実験マニュアル（Cloning Vectors:A Laborato
ry Manual）（P.H．Pouwels et al.,1985，Supp．1987）で提供されているもの
から選択される。
発現ベクターを含んでいる宿主細胞は、選択される遺伝子を活性化したり、抑
制したり、形質転換体を選抜したり、選択される遺伝子を増幅させたりする必要
に合うよう調整された従来からある栄養培地で培養することができる。
好ましい発現システムの一つは、pMAMneo発現ベクター（クローンテック社（C
lontech）、カリフォルニア州パロアルト）によってトランスフェクトされた、
マウス3T3線維芽細胞の宿主細胞である。pMAMneoは、デキサメタゾンで誘導され
るMMTV-LTRプロモーターに結合したRAV-LTRエンハンサー、哺乳動物システムの
中での複製を可能にするSV40の複製開始点、選抜用のネオマイシン遺伝子、およ
びSV40のスプライス部位とポリアデニル化部位を備えている。pMAMneoベクター
の中に、ニューロタクチンをコードしているDNAを、発現されるように設計され
た方向に挿入してもよい。組換えニューロタクチン蛋白質は、下記で説明するよ
うにして分離されよう。pMAMneo発現ベクターとともに用いることのできる、こ
の他の好ましい宿主細胞には、COS細胞とCHO細胞（それぞれ、ATCC寄託番号：CR
L1650とCCL61）が含まれる。
ニューロタクチンポリペプチドは、融合蛋白質としても産生することができる
。例えば、発現ベクターpUR278（Rutherら、EMBO J．2:1791，1983）を用いて、
lacZ融合蛋白質を作出することができる。pGEXベクターは、外来のポリペプチド
を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白質をして発現させ
るために用いることができる。一般的に、このような融合蛋白質は可溶性で、溶
解した細胞をグルタチオンアガロースビーズに吸着させて、その後、遊離のグル
タチオン存在下で溶出を行なうことによって簡単に精製することができる。pGEX
ベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物が、GST部分から遊離できるよ
うにするために、トロンビンまたは第Xa因子のプロテアーゼ切断部位を含んでい
る。
昆虫細胞の発現系においては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera fru
giperda）の細胞の中で増殖するアウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa
californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）が、外来遺伝子を発現させるための
ベクターとして用いられる。ニューロタクチンをコードする配列を、一つずつ、
ウイルスの必須でない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングして
、例えば、ポリヘドリンプロモーターのような、AcNPVのプロモーターの制御下
に置くことができる。ニューロタクチンポリペプチドまたは蛋白質をコードする
遺伝子をうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化されて、閉塞されて
いない組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子にコードされている蛋白
質の外被をもたないウイルス）の産生がもたらされる。そして、これらの組換え
ウイルスを用いて、挿入された遺伝子を発現するスポドプテラ・フルギペルダ（
Spodoptera frugiperda）の細胞に感染させる（例えば、Smithら、J．Virol．46
:584、Smith、米国特許第4,215,051号を参照のこと）。
哺乳動物の細胞の中では、ウイルスに基づいた多数の発現系を利用することが
できる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ニューロタ
クチンの塩基配列を、例えば、晩期プロモーターと3つの部分を含む先導配列な
どの、アデノウイルスの転写/翻訳調節複合体に連結させることができる。そし
て、このキメラ遺伝子を、インビトロ、またはインビボの組換えによって、アデ
ノウイルスのゲノムの中に挿入することができる。ウイルスゲノムの必須でない
領域（例えば、E1またはE3領域）の中への挿入によって、生存力があり、感染し
た宿主の中でニューロタクチン遺伝子産物を発現することのできる組換えウイル
スがもたらされる（例えば、Logan、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3655，198
4を参
照のこと）。
また、挿入された塩基配列が効率的に翻訳されるためには、特異的な開始シグ
ナルも必要とされよう。これらのシグナルには、ATG開始コドンと隣接配列が含
まれる。ATG開始コドンと隣接配列を含む、天然のニューロタクチン遺伝子全体
またはcDNAが適正な発現ベクターの中に挿入されているときには、別の翻訳調節
シグナルは必要とはされないであろう。別の場合には、おそらく、ATG開始コド
ンを含む外来の翻訳調節シグナルを備えていなければならない。さらに、全挿入
配列の翻訳を確実にするためには、開始コドンが、所期のコーディング配列の読
み枠に合っていなければならない。これらの外来の翻訳調節シグナルと開始コド
ンは、さまざまな由来をもち、天然のものでも合成のものでもよい。発現効率は
、適当な転写促進要素である転写終結因子を含ませることによって上昇させるこ
とができる（Bittnerら、Methods in Enzymol.153:516，1987）。
さらに、宿主細胞は、挿入配列の発現を調節するもの、または、遺伝子産物を
特異的な、望ましい方式で修飾、加工するものを選択することができる。蛋白質
産物のこのような修飾（例えば、グルコシル化）とプロセッシング（例えば、切
断）は、蛋白質の機能にとって重要であろう。別の宿主細胞は、蛋白質、および
遺伝子産物の翻訳後のプロセッシングおよび修飾のために関する特徴と特異的な
メカニズムをもっている。発現された外来蛋白質の適正な修飾とプロセッシング
を確実にするために、適切な細胞系、または宿主系を選択することができる。こ
のために、一次転写産物を適正にプロセッシングし、遺伝子産物をグルコシル化
し、またリン酸化するための細胞装置をもつ真核生物の宿主細胞を用いることが
できる。このような哺乳動物の宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDC
K、293、3T3、WI38、および、特に、脈絡叢細胞系が含まれるが、これらに限定
はされない。
または、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞系によって、ニューロ
タクチン蛋白質を産生させることができる。哺乳動物細胞を安定的にトランスフ
ェクトするのに適当な、数多くのベクターが、一般的に入手可能であり、例えば
、Pouwelsら（前記）を参照のこと；また、このような細胞系を構築するための
方法も、例えば、アウスウベル（Ausubel）ら（前記）にあるように、一般的に
利用
可能である。実施例の一つにおいて、ニューロタクチンタンパク質をコードする
cDNAが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターの中にク
ローニングされる。プラスミドと、したがって、ニューロタクチンタンパク質を
コードする遺伝子とが、宿主細胞の染色体に組み込まれたものが、0.01から300
μMのメトトレキセートを細胞培養培地に入れることによって選択される（アウ
スウベル（Ausubel）ら（前記））。この優性選抜は、ほとんどの細胞型で行な
うことができる。
トランスフェクトされた遺伝子の、DHFRが介在する増幅によって、組換え蛋白
質の発現を上昇させることができる。遺伝子増幅された細胞系を選抜する方法は
、アウスウベル（Ausubel）ら（前記）において説明されているが、このような
方法は、一般的に、メトトレキセートのレベルが次第に増加する培地の中で、培
養時間を延長することを含む。この目的のために広く用いられている、DHFRを含
む発現ベクターには、pCVSEII-DHFRとpAdD26SV(A)が含まれる（アウスウベル（A
usubel）ら（前記）において説明されている）。上記で説明されている宿主細胞
のいずれか、または、好ましくは、DHFRを欠失したCHO細胞系（例えば、CHO DHF
R-細胞、ATCC寄託番号：CRL9096）が、安定的にトランスフェクトされた細胞系
、またはDHFRが介在する遺伝子増幅をDHFR選抜するのに好ましい宿主細胞に含ま
れている。
別の選抜システムを数多く用いることができ、tk、hgprt、またはaprt細胞に
おいて、それぞれ、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン
-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ遺伝子を用いることができるシステムなどがあるが、これら
に限定はされない。さらに、マイコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt
（Mulliganら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072，1981）；アミノグリコシ
ドG-418に対する抵抗性を付与するneo（Colberre-Garapinら、J．Mol．Biol．Sc
i．150:1，1981）；および、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するhygro
（Santerreら、Gene 30:147，1981）を用いることもできる。
または、発現される融合蛋白質に対して特異的な抗体を利用することによって
、融合蛋白質を容易に精製することができる。例えば、ジャンクネヒト（Jankne
cht）ら、Proc．Natl．Acad.Sci．USA 88:8972(1981)において説明されているシ
ステムによって、ヒト細胞系で発現されている非変性融合蛋白質の迅速な精製が
可能である。このシステムにおいて、目的の遺伝子を、遺伝子の読み枠が、6個
のヒスチジン残基を含むアミノ末端タグと翻訳によって融合されるようにワクシ
ニアの組換えプラスミドにサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスに
感染させた細胞からの抽出物を、Ni2+ニトリロ酢酸アガロースカラムにかけて、
イミダゾールを含む緩衝液によって、ヒスチジンタグが付いた蛋白質を選択的に
溶出する。
または、ニューロタクチン、またはその一部を、免疫グロブリンのFcドメイン
に融合させることができる。このような融合蛋白質は、プロテインAカラムを用
いて、容易に精製することができる。さらに、このような融合蛋白質によって、
インビボで、安定性が高まったニューロタクチンポリペプチドの二量体型の産生
が可能になる。
また、ニューロタクチン蛋白質とポリペプチドを遺伝子導入動物の中で発現さ
せることができる。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤ
ギ、および、例えば、ヒヒ、サル、ならびにチンパンジーなどのヒト以外の霊長
類を含むがこれらに限定はされない、いずれかの種の動物を用いて、ニューロタ
クチン発現遺伝子導入動物を作出することができる。
当技術分野において既知の技術を用いて、遺伝子導入動物の創始系統を産生す
るために、ニューロタクチン導入遺伝子を動物に導入することができる。このよ
うな技術には、生殖核のマイクロインジェクション（米国特許第4,873,191号）
；レトロウイルス介在による、生殖系列への遺伝子導入（Van der Puttenら、Pr
oc．Natl．Acad.Sci．USA 82:6148，1985）；胚幹細胞への遺伝子ターゲッティ
ング（Thompsonら、Cell 56:313，1989）；および、胚のエレクトロポレーショ
ン（Lo、Mol．Cell．Biol.3:1803，1983）が含まれるが、これらに限定はされな
い。
本発明は、その細胞のすべてにニューロタクチン導入遺伝子をもつ遺伝子導入
動物と、その細胞の全部ではなく、一部に導入遺伝子をもつ動物、すなわち、モ
ザイク動物を提供する。この導入遺伝子は、単一の導入遺伝子、または、例えば
、ヘッド・ツー・ヘッドに一列になった、またはヘッド・ツー・テールで一列に
なったコンカタマーとして組み込むことができる。また、この導入遺伝子を、特
定の細胞型に選択的に導入して、その中で活性化することができる（Laskoら、P
roc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6232，1992）。このような細胞型特異的な活性
化に必要とされる調節配列は、目的となる特定の細胞型に依存しており、当業者
には明らかである。
内生的なニューロタクチン遺伝子の染色体の部位に、ニューロタクチン導入遺
伝子を組み込むのが望ましいときには、遺伝子ターゲッティングが好ましい。要
約すると、このような技術が用いられるとき、内生的なニューロタクチン遺伝子
に相同な塩基配列を含むベクターは、染色体配列との相同的組換えによって内生
的な遺伝子の塩基配列の中に組み込まれ、その機能を破壊するように設計されて
いる。また、導入遺伝子を特定の細胞型に選択的に導入し、それによって、その
細胞型の中だけで、内生的なニューロタクチン遺伝子を不活性化させることがで
きる（Guら、Science 265:103,1984）。このような細胞型特異的な不活性化に必
要とされる調節配列は、目的となる特定の細胞型に依存しており、当業者には明
らかである。
遺伝子導入動物が作出されると、標準的な技術を利用して、組換えニューロタ
クチン遺伝子の発現を測定することができる。最初のスクリーニングは、導入遺
伝子の組み込みが起きたか否かを測定するために、動物の組織を解析するサザン
ブロット解析、またはPCR技術によって行なわれる。また、動物から得た組織サ
ンプルのノザンブロット解析、インサイチューハイブリダイゼーション解析、お
よびRT-PCRを含むが、これらに限定されない技術を用いて、遺伝子導入動物の組
織における導入遺伝子のmRNAの発現のレベルを測定することもできる。また、ニ
ューロタクチン導入遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて、ニューロタクチ
ン遺伝子発現組織のサンプルを、免疫細胞化学的に評価することもできる。
組換えニューロタクチン蛋白質が発現されると、それを単離する。分泌型は、
培養培地から単離することができるが、非分泌型は、宿主細胞から単離しなけれ
ばならない。蛋白質は、アフィニティークロマトグラフィーによって単離するこ
とができる。一つの実施例において、抗-ニューロタクチン蛋白質抗体（例えば
、本明細書において説明されているようにして産生されたもの）をカラムに付着
さ
せて、ニューロタクチン蛋白質を単離するために用いる。アフィニティークロマ
トグラフィーの前に、標準的な方法（例えば、アウスウベル（Ausubel）ら（前
記）を参照のこと）によって、ニューロタクチン蛋白質を含む細胞の溶解と分画
を行なうことができる。または、例えば、ニューロタクチンーマルトース結合蛋
白質、ニューロタクチン-β-ガラクトシダーゼ、またはニューロタクチン-trpE
融合蛋白質などのニューロタクチン融合蛋白質を構築して、ニューロタクチン蛋
白質を単離するために用いることができる（例えば、アウスウベル（Ausubel）
ら（前記）；ニューイングランドバイオラブ社（New England Biolab）、マサチ
ューセッツ州ビバリーを参照のこと）。
単離されたら、もし望ましければ、例えば、標準的な技術を用いた高速液体ク
ロマトグラフィーによって、組換え蛋白質をさらに精製することができる（例え
ば、WorkとBurden編、Fisher、生化学と分子生物学における実験技術（Laborato
ry Techiques In Biochemistry And Molecular Biology）エルゼビア社（Elsevi
er）、1980を参照のこと）。
本発明のポリペプチドである、特に、短いニューロタクチン断片は、化学合成
によっても産生することができる（例えば、固相ペプチド合成（Solid Phase Pe
ptide Synthesis）第2版、1984、ピアス・ケミカル社（The Pierce Chemical Co
.）イリノイ州ロックフォードにおいて説明されている方法）。
また、ポリペプチド発現と精製の、これらの一般的な技術を用いて、有用なニ
ューロタクチンの断片、または類似化合物（本明細書において説明されている）
を作出し、単離することができる。
本発明は、また、ニューロタクチンと相互作用し、ニューロタクチンの機能に
関係する蛋白質を特徴とする。また、これらの相互作用する蛋白質をコードする
遺伝子も、本発明に含まれる。相互作用する蛋白質は、当業者に既知の方法を用
いて同定することができる。適当な方法の一つは、「ツーハイブリッドシステム
」で、インビボでの蛋白質の相互作用を検出する（Chienら、Proc．Natl．Acad
．Sci．USA 88:9578，1991）。この方法を実施するためのキットは、クローンテ
ック（Clontech）社（カリフォルニア州パロアルト）から購入可能である。
抗-ニューロタクチン抗体
ヒトのニューロタクチン蛋白質およびポリペプチド（または、免疫原性断片、
もしくは類似化合物）を用いて、本発明において有用な抗体を作製することがで
きるが、このようなポリペプチドは、組換え、またはペプチド合成技術によって
作製されたポリペプチドでもよい（例えば、例えば、固相ペプチド合成（Solid
Phase Peptide Synthesis）、前記；アウスウベル（Ausubel）ら、前記を参照の
こと）。一般的に、アウスウベル（Ausubel）ら、前記において説明されている
ようにして、KLHのような担体蛋白質にペプチドを結合させることができ、アジ
ュバントと混合し、宿主哺乳動物に注入することができる。ペプチド抗原アフィ
ニティークロマトグラフィーによって、抗体を精製することができる。
特に、ニューロタクチン蛋白質またはポリペプチドを注射することによって、
さまざまな宿主動物を免疫することができる。宿主動物には、ウサギ、マウス、
モルモット、およびラットが含まれる。宿主の種に応じて、フロイントのアジュ
バント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレ
シチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオル（pluronic polyol）、ポリ
アニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペット（keyhole limpet、巻き
貝の一種）のヘモシアニン、ジニトロフェノール、および、BCG（カルメット-ゲ
ラン杆菌（bacille Calmette-Guerin））ならびにコリネバクテリウム・パルバ
ム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトのアジュバントを含む
が、これらに限定はされない、さまざまなアジュバントを用いて、免疫応答を高
めることができる。ポリクローナル抗体は、免疫された動物の血清に由来する抗
体分子の不均一な集団である。
本発明に含まれる抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト
に適合させた、またはキメラの抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、および
、Fab発現ライブラリーを用いて産生される分子などがある。
上記のニューロタクチン蛋白質、および標準的なハイブリドーマ技術（例えば
、Kohlerら、Nature 256:495，1975;Kohlerら、Eur．J．IEunol．6:511，1976;K
ohlerら、Eur．J．Immunol．6:292，1976;Hammerlingら、モノクローナル抗体と
T細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridoma）、Elsev
ier、ニューヨーク、1981;アウスウベル（Ausubel）ら、前記）を用いて、
特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体を調製することが
できる。
特に、Kohlerら、Nature 256:495，1975、および米国特許第4,376,110号で説
明されているような、培養中の連続的な細胞系統、ヒトのB細胞ハイブリドーマ
技術（Kosborら、Immunology Today 4:72，1983;Coleら、Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA 80:2026，1983）、および、EBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、モノクロ
ーナル抗体とガン治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）Alan R．
Liss，Inc.，pp．77-96，1983）によって、抗体分子の産生を提供するいずれか
の技術によって、モノクローナル抗体を得ることができる。このような抗体は、
IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、および、それらのサブクラスを含む、免疫グロブリ
ンのいずれかのクラスであってもよい。本発明の、mAbを産生するハイブリドー
マは、インビトロで培養しても、インビボで培養してもよい。インビボで高力価
のmAbを産生する能力によって、これが、現在好ましい産生方法になっている。
一旦産生されたら、例えば、アウスウベル（Ausubel）ら、前記によって説明
されているような標準的な方法によるウエスタンブロットまたは免疫沈殿解析に
よって、特異的なニューロタクチンの認識に関する試験を行なう。ニューロタク
チンを特異的に認識し、結合する抗体が、本発明においては有用である。例えば
、このような抗体を免疫アッセイ法で用いて、哺乳動物によって産生されるニュ
ーロタクチンのレベルをモニターする（例えば、ニューロタクチンの量や、細胞
の中での局在を判定する）ことができる。
好ましくは、本発明の抗体は、ニューロタクチン蛋白質の断片で、高度に保存
された領域の外側の位置にあり、高頻度の荷電残基のような基準によって抗原性
となる可能性が高いと思われるものを用いて産生される。特異的な実施例の一つ
において、このような断片は、PCRの標準的な技術によって作製してから、pGEX
発現ベクターの中にクローニングする（アウスウベル（Ausubel）ら、前記）。
融合蛋白質は、大腸菌で発現され、アウスウベル（Ausubel）ら、前記で説明さ
れているように、グルタチオンアガロースアフィニティー基質を用いて精製され
る。
場合によっては、抗血清の親和性または特異性が低いという問題が起こる可能
性を最小限にすることが望ましい。このようなときには、各蛋白質について2つ
か
ら3つの融合蛋白質を作製し、各融合蛋白質を、少なくとも2匹のウサギに注射す
ることができる。好ましくは、少なくとも3回の追加免疫を含む、連続した注射
によって、抗血清を作製することができる。
また、組換えニューロタクチン蛋白質、または、グルココルチコイドレセプタ
ー、CAT、またはルシフェラーゼなどの対照蛋白質を免疫沈殿させることができ
るかについて、抗血清をチェックすることもできる。
抗体は、例えば、診断アッセイ法の一部として、生物サンプルの中にあるニュ
ーロタクチンを検出するときに用いることができる。また、ニューロタクチンの
発現または局在に対する候補化合物の効果を測定するためのスクリーニングアッ
セイ法において、抗体を用いることもできる。さらに、例えば、正常な、および
/または工作したニューロタクチン発現細胞を患者に導入する前に、これらを評
価するために、遺伝子治療技術とともに、このような抗体を用いることもできる
。さらに、異常なニューロタクチン活性を阻害するための方法において、このよ
うな抗体を用いることができる。
さらに、適当な生物学的活性をもつヒトの抗体分子の遺伝子とともに、適当な
抗原特異性をもつマウスの抗体分子の遺伝子を切り出して「キメラ抗体」（Morr
isonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6851，1984；Neubergerら、Nature 31
2:604，1984;Takedaら、Nature 314:452，1984）を産生するために開発された技
術を用いることができる。キメラ抗体は、マウスのmAbに由来する可変領域とヒ
トの免疫グロブリンの定常領域をもつなど、異なった部位が異なった動物種に由
来する分子である。
または、単鎖抗体を産生するために説明されている技術（米国特許第4,946,77
8号；および米国特許第4,946,778号と第4,704,692号）を改変して、ニューロタ
クチン蛋白質またはポリペプチドに対する単鎖抗体を産生することができる。単
鎖抗体は、Fv領域の重鎖と軽鎖断片を、アミノ酸架橋によって結合することによ
って形成され、単鎖のポリペプチドができる。
既知の技術によって、特異的なエピトープを認識して結合する抗体断片を作製
することができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン分解によ
って産生されるF(ab')2断片、および、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元す
る
ことによって作出することができるFab断片が含まれるが、これらに限定はされ
ない。または、Fab発現ライブラリーを構築して（Huseら、Science 246:1275，1
989）、望ましい特異性をもつモノクローナルのFab断片を、迅速かつ容易に同定
することができる。
次に、当業者に周知の技術を用いて、ニューロタクチンの一部に類似した抗イ
ディオタイプ抗体を作製するために、ニューロタクチンに対する抗体を用いるこ
とができる（例えば、Greenspanら、FASEB J．7:437，1993;Nissinoff，J．Immu
nol．147:2429，1991）。例えば、ニューロタクチンに結合して、ニューロタク
チンのリガンドが結合するのを競合的に阻害する抗体を用いて、ニューロタクチ
ンのリガンド結合ドメインに類似して、そのために、ニューロタクチンのリガン
ドに結合して、それを中和する抗イディオタイプ抗体を作製することができる。
このような中和抗イディオタイプ抗体、または、このような抗イディオタイプ抗
体のFab断片は、治療的な養生法で用いることができる。
ニューロタクチン発現の低下
別の態様において、例えば、ニューロタクチンmRNA転写産物が翻訳されるのを
阻害または防止するために、アンチセンスまたはリボザイム法を用いて、ニュー
ロタクチン遺伝子の転写を阻害するために三本鎖法を用いて、または、ニューロ
タクチン遺伝子、もしくはその本来のプロモーターを不活性化、もしくは「ノッ
クアウト」するために、標的をもつ相同的組換えを用いて、内生的なニューロタ
クチン遺伝子の発現レベルが低下するように、抗炎症療法を設計することができ
る。ニューロタクチン遺伝子は、脈絡叢、および弓状核など、脳の中で発現され
るため、デリバリー技術は血液脳関門を通過できるように設計されていることが
好ましい（例えば、PCT国際公開公報第89/10134号）。または、本明細書におい
て説明されているアンチセンス、リボザイム、またはDNA構築物は、例えば、脳
、心臓、腎臓、肺、子宮、内皮細胞、線維芽細胞、および骨髄幹細胞などの標的
細胞を含む部位に直接投与することができるかもしれない。
アンチセンス核酸
アンチセンス法は、ニューロタクチンmRNAに相補的なオリゴヌクレオチド（DN
AかRNAのいずれか）を設計することに関係する。アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、相補的なニューロタクチンmRNA転写産物に結合し、翻訳を妨げる。完全に
相補的であることが好ましいが、必要ではない。RNAの一部に「相補的な」配列
とは、本明細書において言及されるときには、RNAにハイブリダイズすることが
でき、安定した二本鎖を形成するのに充分な相補性をもつ配列を意味し、二本鎖
アンチセンス核酸の場合には、二本鎖DNAの一方の鎖を調べれるか、または三本
鎖の形成を測定してもよい。ハイブリダイズできる能力は、相補性の程度と、ア
ンチセンス核酸の長さとに依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長く
なるにつれて、より多くの、RNAとの塩基のミスマッチを含むようになるが、そ
れでも、安定した二本鎖（場合によっては三本鎖）を形成するようになる。当業
者は、ハイブリダイズした複合体の融解点を判定するための標準的な手順を用い
ることによって、許容できるミスマッチの程度を確認することができる。
例えば、ATG開始コドンまでの、およびこれを含む5'側非翻訳配列などのmRNA
の5'末端側に相補的なオリゴヌクレオチドが、最も効率的に、翻訳の阻害に作用
する。しかし、最近になって、mRNAの3'側非翻訳配列に相補的な配列も、同様に
、mRNAの翻訳を阻害するのに効果的であることが示されている（Wagner、Nature
372:333，1984）。したがって、例えば、図2に示されているヒトの遺伝子など
のニューロタクチン遺伝子の5'側または3'側の非翻訳、非コーディング領域のど
ちらかに相補的なオリゴヌクレオチドを、アンチセンス法で用いて、内生的なニ
ューロタクチンmRNAの翻訳を阻害することができよう。mRNAの5'側非翻訳領域に
相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンに相補配列を持っていなければ
ならない。
mRNAのコーディング領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率
的な翻訳阻害因子ではないが、本発明によって使用することができよう。ニュー
ロタクチンmRNAの5'側、3'側、またはコーディング領域のいずれにハイブリダイ
ズするように設計されていても、アンチセンス核酸は、少なくとも6個のヌクレ
オチド長でなければならず、また、長さ6から50ヌクレオチドの範囲内にあるの
が、好ましいオリゴヌクレオチドである。特異的な局面において、オリゴヌクレ
オチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも
25ヌクレオチド、または、少なくとも50ヌクレオチドである。
標的配列の選択とは関係なく、遺伝子発現を阻害するためのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの能力を定量するために、まず最初に、インビトロの実験を行な
うことが好ましい。これらの実験では、アンチセンス遺伝子による阻害と、オリ
ゴヌクレオチドの非特異的な生物学的作用とを区別するような対照を利用するこ
とが好ましい。また、これらの実験では、標的RNAまたは蛋白質のレベルを、内
部対照用RNAまたは蛋白質と比較することが好ましい。さらに、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、対照用オリゴヌクレオチドを用いて
得られた結果と比較することが考えられる。対照用オリゴヌクレオチドは、試験
用のオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドの塩基配列
が、標的配列との特異的なハイブリダイゼーションを防ぐのに必要なだけアンチ
センスの配列とは異なっているというのが好ましい。
オリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNA、またはキメラ混合物、または、それ
らの誘導体もしくは改変したもので、一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレ
オチドは、例えば、分子の安定性やハイブリダイゼーションなどを向上させるた
めに、塩基部分や、塘部分、またはリン酸バックボーンを改変することができる
。オリゴヌクレオチドには、ペプチドなど（例えば、インビボで宿主細胞のレセ
プターを標的とするための）の別の付加的な基、または、細胞膜を通過する輸送
を促進する因子（例えば、Letsingerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:6553
，1989;Lemaitreら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:648，1987;PCT国際公開公
報第88/09810号において説明されているもの）、もしくは血液脳関門を通過する
輸送を促進する因子（例えば、PCT国際公開公報第88/10134号を参照のこと）、
または、ハイブリダイゼーションによって起こる切断剤（例えば、Krolら、BioT
ichniques 6:958，1988を参照のこと）、またはインターカレーション剤（例え
ば、Zon，Pharm．Res．5:539，1988を参照のこと）が含まれていてもよい。この
ために、オリゴヌクレオチドに別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼー
ションの開始による架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーションの開始によ
る切断剤などを結合させることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル
、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセ
チルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチル
アミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジ
ヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペン
テニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン
、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン
、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキ
シアミノ-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカ
ルボキシメチルウラシル、5'-メトキシウラシル、2-ウラシル-5-オキシ酢酸（V
）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-
メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル
、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(V)、5-メチ
ル-2-チオウラシル、2-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)
ｗ、および2,6-ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない群より選択され
る、少なくとも一つの修飾塩基部分を含んでいてもよい。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、2-フルオロアラビ
ノース、キシルロース、およびヘキソースからなるが、これらに限定されない群
より選択される、少なくとも一つの修飾された塘部分を含んでいよう。
さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
酸、ホスホロジチオ酸、ホスホラミドチオ酸、ホスホラミド酸、ホスホジアミド
酸、メチルホスホン酸、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール
、またはこれらのバックボーンの類似体からなる群より選択される、少なくとも
一つの修飾されたホスフェート骨格を含む。
さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α-アノマー
オリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のベータ-
ユニットとは対照的に、互いに平行な方向にある相補的なRNAと、特異的な二本
鎖ハイブリッドを形成する（Gautierら、Nucl．Acids．Res．15:6625，1987）。
このオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチドである（Inoueら、Nu
cl．Acids．Res．15:6131，1987）か、または、キメラRNA-DNA類似体（Inoueら
、FEBS Lett．215:327，1987）である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成機（バイ
オサーチ（Biosearch）社、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems
）社などから購入可能なものなど）を使用するなど、当技術分野において既知の
標準的な技術によって合成することができる。実施例としては、スタイン（Stei
n）ら、の方法（Nucl．Acids．Res．16:3209，1988）によって、ホスホロチオ酸
オリゴヌクレオチドを合成することができ、また、制御された多孔ガラスポリマ
ー支持体（Sarinら、Proc.Natl．Acad．Sci．USA 85:7448，1988）を使用するこ
とによって、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドを調製することができる。
ニューロタクチンのコーディング領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチ
ドを用いるときには、転写される非翻訳領域に相補的なヌクレオチドが最も好ま
しい。
ヒトのニューロタクチン遺伝子に対する、15塩基のアンチセンス配列の例の一
つは、5’-TATCGGAGCCATGGC-3’（配列番号：5）であるが、ここで、下線を施し
た配列は、開始コドンのメチオニンの相補配列を示している。
アンチセンス分子は、例えば、脳、心臓、腎臓、肺、子宮、内皮細胞、線維芽
細胞、および骨髄幹細胞など、インビボでニューロタクチンを発現させている細
胞に輸送されなければならない。数多くの方法が、アンチセンスDNAまたはRNAを
細胞に輸送するために開発されてきており、例えば、アンチセンス分子を直接、
組織部位に注射することができ、または、修飾されたアンチセンス分子で、所期
の細胞を標的とするように設計されたもの（例えば、標的細胞の表面で発現され
ているレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合した
アンチセンス）を全身に投与することができる。
しかし、内生するmRNAの翻訳を抑制するのに充分な、アンチセンス分子の細胞
内濃度に到達させるのは、しばしば困難である。このため、好ましい方法におい
ては、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なpol IIIプロモーター、またはp
ol Iプロモーターの制御下に置いた組換えDNA構築物が用いられる。患者の中の
標的細胞をトランスフェクトさせるために、このような構築物を使用することに
よって、内生的なニューロタクチン転写産物と相補的な対合を形成して、ニュー
ロタクチンmRNAの翻訳を妨げるのに十分な量の単鎖RNAの転写が起こる。例えば
、細
胞に取り込まれて、アンチセンスRNAの転写を指令するために、インビボでベク
ターを導入することができる。このようなベクターは、望ましいアンチセンスRN
Aを産生するために転写されうるかぎり、染色体外に留まっていても、染色体に
組み込まれてもよい。
当技術分野においては標準的な組換えDNA技術法によって、このようなベクタ
ーを構築することができる。ベクターは、プラスミドでも、ウイルスでも、また
は、その他、哺乳動物細胞の中での複製と発現に用いられる、当技術分野におい
て既知のものでもよい。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、当技術分
野において、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の中で作用することが知られてい
るプロモーターによって行なうことができる。このようなプロモーターは、誘導
的なものでもよいし、構成的なものでもよい。このようなプロモーターには、SV
40の早期プロモーター領域（Bernoistら、Nature 290:304，1981）、ラウス肉腫
ウイルスの3'側の長い繰り返し配列に含まれているプロモーター（Yamamotoら、
Cell 22:787-797，1988）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら
、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1441，1981）、または、メタロチオネイン遺
伝子の調節配列（Brinsterら、Nature 296:39，1988）が含まれるが、これらに
限定はされない。
いかなるタイプのプラスミド、コスミド、YAC、またはウイルスベクターを用
いても、例えば、脳、心臓、腎臓、肺、子宮、内皮細胞、線維芽細胞、および骨
髄幹細胞などの組織部位に直接導入することのできる組換えDNA構築物を調製す
ることができる。または、所期の組織（例えば、脳には、ヘルペスウイルスベク
ターが用いられよう）に選択的に感染するウイルスベクターを用いることができ
るが、この場合には、別の経路によって（例えば、全身的に）、投与することが
できる。
リボザイム
ニューロタクチンのmRNA転写産物を触媒的に切断するように設計されたリボザ
イムを用いて、ニューロタクチンmRNAの翻訳、およびニューロタクチンの発現を
防止することもできる（例えば、PCT国際公開公報第90/11364号；Saraverら、Sc
ience 247:1222，1990を参照のこと）。部位特異的な認識配列のところでmRNAを
切断するさまざまなリボザイムが、ニューロタクチンmRNAを破壊するために用い
ることができるが、ハンマーヘッド型リボザイムを用いるのが好ましい。ハンマ
ーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接した領域とし
て示される位置で、mRNAを開裂する。標的mRNAが次の2塩基の配列：5’-UG-3’
を持つことが必要とされるだけである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築と作
製は、当技術分野において周知されている（Haseloffら、Nature 334:585，1988
）。ヒトのニューロタクチンcDNAの塩基配列（図2）の中には、ハンマーヘッド
型リボザイムの切断部位となりうる例が多数ある。好ましくは、リボザイムは、
切断認識部位が、ニューロタクチンmRNAの5'側末端近くに位置するように、すな
わち、効率を上げ、非機能的なmRNA転写産物の細胞内での蓄積を最小限にするよ
うに工夫されていることが好ましい。
ヒトニューロタクチンにおいて、リボザイム部位となりうる例には、開始メチ
オニンコドンに対応する5'-UG-3'部位（87位〜88位のヌクレオチド）、および、
ケモカイン様ドメインの各システイン残基に当たるコドンに対応する5'-UG-3'部
位（例えば、179〜180位、191〜192位、257〜258位、および305〜306位のヌクレ
オチド）が含まれる。
また、本発明のリボザイムには、テトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena
Thermophila）の中に自然に存在しており（IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られ
ている）、チェックと彼の共同研究者によって広範に説明されている（Zaugら、
Science 224:574，1984;Zaugら、Science 231:470，1986;Zugら、Nature 324:42
9，1986;PCT出願国際公開公報第88/04300号；および、Beenら、Cell 47:207，19
86）RNAエンドリボヌクレアーゼ（本明細書においては以後「チェック（Cech）
型リボザイム」という）も含まれる。チェック型リボザイムは、標的となるRNA
配列にハイブリダイズする8塩基対配列をもち、その後ろで、標的RNAの切断が起
こる。本発明には、ニューロタクチン中に存在する8塩基対の活性部位を標的と
するようなチェック型リボザイムが包含される。
アンチセンス法と同じように、リボザイムも、（例えば、安定性を向上させ、
標的とするためなどに）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成されることがで
き、例えば、脳、心臓、腎臓、肺、子宮、内皮細胞、線維芽細胞、および骨髄幹
細胞など、インビボで、ニューロタクチンを発現させる細胞に輸送されなければ
ならない。好ましい輸送方法には、トランスフェクトされた細胞に、内生的なニ
ューロタクチンmRNAを破壊して、翻訳を妨げるのに十分な量のリボザイムを産生
させるために、強力な構成的pol IIIプロモーター、またはpol IIプロモーター
の制御下でリボザイムを「コードする」DNA構築物を用いることが含まれる。ア
ンチセンス分子とは違って、リボザイムは触媒的であるため、有効性のために必
要とされる細胞内濃度は低い。
ニューロタクチンの発現を低下させる、その他の方法
内生的なニューロタクチン遺伝子の発現は、標的相同的組換え（例えば、米国
特許第5,464,764号を参照のこと）を用いて、ニューロタクチン遺伝子、または
そのプロモーターを不活性化、または「ノックアウト」することによって低下さ
せることもできる。例えば、突然変異体である、内生的なニューロタクチン遺伝
子（ニューロタクチン遺伝子のコーディング領域、または、調節領域）に相同な
DNＡが隣接した非機能的なニューロタクチン（または、全く無関係なDNA配列）
を用いて、選抜用マーカー、および/または負の選抜用マーカーとともに、また
は、それらなしに、インビボでニューロタクチンを発現させる細胞をトランスフ
ェクトすることもできる。標的相同的組換えによるDNA構築物の挿入によって、
ニューロタクチン遺伝子の不活性化がもたらされる。このような方法は、ES（胚
幹）細胞に対する改変により、不活性なニューロタクチンをもつ動物の子孫が作
製されるような農業的分野での使用に特に適している。しかし、例えば、弓状核
または脈絡叢などの脳組織に輸送するために、例えば、ヘルペスウイルスベクタ
ーのような適当なウイルスベクターを用いて、組換えDNA構築物が、インビボで
、必要な部位に直接に投与され、またはそこに向かわせたりすれば、この方法を
ヒトでの使用に適合させることもできる。
または、身体の中の標的細胞中のニューロタクチン遺伝子の転写を妨げる三本
鎖構造を形成させるために、ニューロタクチン遺伝子の調節領域（すなわち、ニ
ューロタクチンプロモーター、および/またはエンハンサー）に相補的なデオキ
シリボヌクレオチド配列を標的とすることによって、内生的なニューロタクチン
遺伝子の発現を低下させることができる（Helene、Anticancer Dreg Des．6:569
，
1981;Heleneら、Ann．N．Y．Accad．Sci．660:27，1992;およびMaher、Bioassay
s 14:807，1992）。ニューロタクチンと相互作用する蛋白質の同定
また、本発明は、ニューロタクチンと相互作用する蛋白質を特徴とする。ニュ
ーロタクチンと相互作用する膜貫通蛋白質、細胞内蛋白質、または細胞外蛋白質
を同定するために、蛋白質-蛋白質の相互作用を検出するのに適した方法を用い
ることができる。用いることのできる従来からの方法の中には、免疫共沈殿、ク
ロスリンキング、および、細胞溶解物、または、細胞溶解物から得られた蛋白質
の勾配、またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製で、ニューロタクチン
と相互作用する、溶解物中の蛋白質を同定するために、ニューロタクチンを使用
するものがある。これらのアッセイ法では、ニューロタクチンポリペプチドは、
全長のニューロタクチンでもよく、ニューロタクチンの可溶性の細胞外ドメイン
でもよく、また、その他いくつかの適当なニューロタクチンポリペプチドでもよ
い。単離されたら、このように相互作用する蛋白質を同定して、クローニングし
、その後、それと相互作用する蛋白質を同定するために、標準的な技術とともに
用いることができる。例えば、エドマン分解法によるなどの、当業者に周知の方
法を用いて、ニューロタクチンと相互作用する蛋白質のアミノ酸配列の少なくと
も一部を確認することができる。得られたアミノ酸配列は、相互作用する蛋白質
をコードする遺伝子配列をスクリーニングするために用いることのできるオリゴ
ヌクレオチド混合液を作製するために用いることができる。スクリーニングは、
例えば、標準的なハイブリダイゼーション、またはPCR技術によって行なうこと
ができる。オリゴヌクレオチド混合液を作製するための技術と、スクリーニング
法は、よく知られている（アウスウベル（Ausubel）ら、前記；および、PCRプロ
トコール：方法と応用への手引き、1990、Innisら編、Academic Press，Inc.、
ニューヨーク）。
さらに、ニューロタクチンと相互作用する蛋白質をコードする遺伝子の同定を
、直接にもたらす方法を用いることができる。これらの方法には、例えば、λgt
11ライブラリーを抗体によって検索する技術で、よく知られているものと同じよ
うな方式で、標識されたニューロタクチンポリペプチド、または、例えば、酵素
、蛍光色素、発光蛋白質などのマーカー、もしくは、IgFcドメインに融合したニ
ューロタクチンポリペプチドもしくは、そのドメインなどのニューロタクチン融
合蛋白質を用いて、発現ライブラリーのスクリーニングをすることが含まれる。
関連する局面において、本発明は、ニューロタクチンの発現または活性を調節
する化合物を同定する方法を特徴としている。この方法は、調節化合物であるか
もしれないものの存在下と非存在下で、ニューロタクチンの発現または活性を評
価することによって実施される。
蛋白質の相互作用を検出するために用いることのできる方法は、当業者にとっ
ては既知である。例えば、インビボでの蛋白質相互作用を検出する方法の一つに
、ツーハイブリッドシステムがある（Chienら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88
:9578，1991）。この方法を実施するためのキットは、クローンテック（Clontec
h）社（カリフォルニア州パロアルト）から購入可能である。
簡単に言うと、このシステムを利用して、二つの雑種蛋白質をコードするプラ
スミドが構築される。一つのプラスミドには、ニューロタクチン、ニューロタク
チンポリペプチド、もしくはニューロタクチン融合蛋白質をコードする塩基配列
に融合した、転写活性化蛋白質のDNA結合ドメインをコードする塩基配列が含ま
れており、もう一つのプラスミドには、cDNAライブラリーの一部として、このプ
ラスミドに組み込まれた未知の蛋白質をコードするcDNAに融合させた、転写活性
化蛋白質の活性化ドメインをコードする塩基配列が含まれている。DNA結合ドメ
インを融合したプラスミドとcDNAライブラリーを、その調節領域が、転写活性化
因子結合部位をもっているレポーター遺伝子（例えば、HBSまたはlacZ）を含む
、酵母サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のある菌
株で形質転換させる。どちらかの雑種蛋白質だけでは、レポーター遺伝子の転写
を活性化することができない。すなわち、DNA結合ドメインの雑種は、活性化機
能を提供できないためにできず、また、活性化合ドメインの雑種は、活性化因子
結合部位を置いていないためにできない。二つの雑種蛋白質の相互作用によって
、機能的な活性化蛋白質が再構成され、レポーター遺伝子の発現をもたらされ、
レポーター遺伝子産物を測定するためのアッセイによって検出される。
ツーハイブリッドシステム、またはそれに関連した方法を用いて、活性化ドメ
インライブラリーをスクリーニングして、「おとり」となる遺伝子産物と相互作
用する蛋白質を探すことができる。限定的なものではなく、例示としては、ニュ
ーロタクチンをおとりの遺伝子産物として用いることができる。全ゲノム配列、
またはcDNA配列を、活性化ドメインをコードするDNAに融合させる。このライブ
ラリーと、DNA結合ドメインと、おとりのニューロタクチン遺伝子産物とが融合
した雑種蛋白質をコードするプラスミドとを、酵母のレポーター菌株の中に同時
形質転換させ、その結果できた形質転換体をスクリーニングして、レポーター遺
伝子を発現するものを探す。例えば、ニューロタクチン、または、ニューロタク
チンの一ドメインなどの、おとりとなるニューロタクチン遺伝子の配列を、それ
が、GAL4蛋白質のDNA結合ドメインをコードするDNAに融合して翻訳されるように
、ベクターの中にクローニングすることができる。これらのコロニーを精製して
、レポーター遺伝子の発現をもたらす、ライブラリー中のプラスミドを単離する
。そして、DNA配列決定法を用いて、ライブラリー中のプラスミドによってコー
ドされている蛋白質を同定する。当技術分野において日常的に実施されている方
法によって、おとりとなるニューロタクチンの遺伝子産物と相互作用する蛋白質
が検出されるはずの細胞系のcDNAライブラリーを作製することができる。本明細
書において説明されている特定のシステムによれば、例えば、cDNA断片を、それ
らが翻訳されるよう、GAL4の転写活性化ドメインに融合して翻訳されるように挿
入することができる。このライブラリーを、おとりとなるニューロタクチン遺伝
子とGAL4の融合プラスミドとともに、GAL4活性化配列を含むプロモーターによっ
て操作されているlacZ遺伝子を含む酵母菌株に同時形質転換させる。GAL4の転写
活性化ドメインに融合した、cDNAにコードされている蛋白質で、おとりとなるニ
ューロタクチン遺伝子産物と相互作用するものが、活性のあるGAL4蛋白質を再構
成し、それによって、HIS3遺伝子の発現が促される。そして、これらの菌株から
、HIS3を発現させるコロニーを精製し、当技術分野において日常的に行われてい
る技術を用いて、おとりとなるニューロタクチン遺伝子と相互作用する蛋白質を
産生し、単離することができる。
ニューロタクチンと、炎症の治療
ニューロタクチンは、脳の中で高度に発現され、内皮細胞（例えば、血管系に
並ぶ細胞）における炎症刺激（例えば、LPSとPMA）に対する応答において上昇制
御を受け、また、好中球に対する走化性がある（詳細は下述）ため、ニューロタ
クチンは脳の炎症において重要な役割を担っていると思われる。組織の中での好
中球の蓄積が、炎症の目印である。したがって、ウイルス性脳炎、多発性硬化症
、ウイルス性または細菌性髄膜炎、重度の頭部外傷、脳卒中、神経変性病（例え
ば、アルツハイマー病とルーゲーリック病）、HIV脳症、原発性脳腫瘍（例えば
、神経膠芽腫）、狼蒼関連脳炎、および発作後の脳外傷など、脳における望まし
くない炎症を、ニューロタクチンの発現または機能を妨げる化合物を投与するこ
とによって軽減することができる。
ニューロタクチンの発現または機能を妨げる化合物は、例えば、アテローム性
動脈硬化症や呼吸器系の感染症など、その他の望ましくない炎症過程の治療のた
めにも用いることができる。
勿論、例えば、一次的な感染を消散させたり、または抗腫瘍応答に介在する免
疫細胞を調達するためなどの場合、上記の症状の多くでも、一定の病期など、状
況によっては、ニューロタクチンの機能または発現を促進することが望ましいこ
ともあろう。
化学防御剤としてのニューロタクチン
本発明は、また、活発に分裂している細胞を殺傷する薬剤、または治療法から
、例えば、骨髄前駆細胞、および骨髄幹細胞などの骨髄細胞を保護するために、
ニューロタクチンポリペプチドを使用することに関する。この方法で、骨髄前駆
細胞と幹細胞を保護する薬剤は、化学防御剤といわれる。このような薬剤は、骨
髄前駆細胞（例えば、幹細胞）を保護された、緩やかな細胞周期状態に置いくこ
とによって、そうしないと、シトシンアラビノシド、5-フルオロウラシル、また
はヒドロキシウレアなどの、細胞周期活性化学治療薬によって惹き起こされるで
あろう細胞の傷害または破壊を阻害ないし軽減させる。化学防御剤の使用によっ
て、患者の成熟した機能的な血液細胞を生成する能力を危険に曝すことなく、よ
り高い用量の化学治療薬（または放射線）を投与することが可能になる。
化学療法または放射線療法を受けている多くの患者は、実質的に多数の数幹細
胞、および、その他活発に分裂している骨髄前駆細胞を失う。この喪失によって
、患者を、感染症や貧血症に対して感受性にさせることになる。好中球減少症を
予防するための方法の一つは、細胞周期を阻害する分子の用量を低くして細胞の
増殖を阻害することであり、それによって、化学療法、および/または放射線療
法の影響から前駆細胞を保護することができる。化学療法が終了した後、この防
御的な治療も停止され、前駆細胞に正常な増殖を再開させる。
便利なインビトロおよびインビボのアッセイ法を用いて、前駆細胞の増殖を阻
害するため、化学防御剤として適当である可能性が高い、好ましいニューロタク
チンポリペプチド、または、その変異体を同定することができる。
適当なインビトロアッセイ法には、ジェンティーレらによって説明されている
もの（米国特許第5,149,544号、および第5,294,544号）などがある。これらのア
ッセイ法において、インビトロ系で、例えば、CSFによって、骨髄細胞、または
脾臓細胞を刺激する。候補分子（例えば、ニューロタクチン）の阻害活性は、そ
れが、どの程度、CSFに刺激されたコロニーとクラスター形成を減少させたかを
判定して評価される。
例えば、ニューロタクチンポリペプチド、または、その変異体を、次のように
試験することができる。CFU-GMを測定するために、LD細胞を、密度が5×105細胞
になるように、10％FBS（ハイクローン（Hyclone）社、ユタ州ローガン）入りの
0.3％の寒天培地上に塗布した。ヒトrSLF（50ng/ml）と組み合わせたrGM-CSF（1
00U/ml）によって、CFU-GMコロニー（＞40細胞/グループ）を刺激する。異なっ
た濃度のニューロタクチンポリペプチド（または、その変異体）を入れた場合と
入れない場合とについて、全てのコロニーを調べて、増殖阻害の程度を判定する
。
ESPEC N2-O2-CO2インキュベーターBNP-210(タオイESPEC社（Taoi ESPEC Corp.
）、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）の中で、加湿環境下、O2の
圧力を下げ（5％）、5％CO2で、14日間インキュベートした後、コロニーの測定
値を調査する。各判定ごとに3枚のプレートを測定する。
適当な分子は、少なくとも200ng/ml、好ましくは100ng/ml、より好ましくは50
ng/ml、または、さらに10ng/mlの濃度で、ヒトの骨髄GM前駆細胞によるコロニー
形成を有意に阻害する効果のあるものである。多数のニューロタクチンポリ
ペプチドをアッセイすることによって、増殖を有意に阻害する原因となる、ニュ
ーロタクチンのドメインを同定することが可能になる。
さらに、インビボアッセイ法を用いて、前駆細胞の増殖阻害を試験することが
できる。前駆細胞の増殖を評価するのに適当なマウスモデルについては、クーパ
ー（Cooper）らによって説明されている（Exp．Hematol．22:186，1994）。この
インビボモデルの結果を、インビトロアッセイの結果と合わせて考えると、例え
ば、人間などの患者の治療における、試験した分子の効力を予測できる。
適当なインビボの試験において、分子をマウスの骨髄造血に与える効果につい
て評価することにより、エンドポイントが、骨髄、脾臓、および抹消血では有核
細胞性と特異的な形態をもち、骨髄と脾臓では骨髄前駆細胞の絶対数と周期状態
をもつことが示される。各試験において、C3H/HeJマウスのグループに、特定の
試験用サンプルを与える。C3H/HeJマウスは、エンドトキシンの影響に対する感
受性が比較的低いため、好ましい。したがって、試験用サンプルにエンドトキシ
ンの汚染があったとしても、インビボの結果には影響を及ぼさないことになる。
別のアッセイ法も有用であるが、次のようにして、ニューロタクチンポリペプ
チドを試験することができる。ジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から
C3H/HeJマウスを入手して、従来からの動物施設に入れる。発熱物質を含まない
滅菌食塩水を一匹当り0.2ml、または、マンテル（Mantel）らによって説明され
ている（Proc.Natl．Acad．Sci．USA 90:2232，1993）、選ばれたニューロタク
チン、または、その変異体の一定量を、マウスに静脈注射する。24時間後にこの
マウスを殺す。
造血前駆細胞の周期状態、すなわち、DNA合成における前駆細胞の比率（細胞
周期のS期）を、メイズ（Maze）ら（J．Immunol．149:1004，1992）、およびク
ーパー（Cooper）ら（Exp．Hematol．22:186，1994）において説明されているよ
うにして評価する。高い特異的活性（20Ci/mM）-トリチウム化チミジン（50μCi
/mL）（New England Nuclear，マサチューセッツ州ボストン）による殺傷技術を
用い、これは、マッコイ（McCoy's）の培地、または放射活性のない同量の「コ
ールドな」チミジンなどの対照と比較した、「ホットな」トリチウム化チミジン
に20分間細胞を曝した後に形成されるコロニー数の減少をインビトロで計算した
ものを
基にする。
殺したマウスの大腿部から骨髄を切り出し、高い特異的活性をもるトリチウム
化チミジンで処理し、10％容量/容量のポークウィードマイトジェン・マウス脾
臓細胞培養培地の存在下、10％FBS入りの0.3％の寒天培地上に塗布する。インキ
ュベートして7日後に、コロニー（>40細胞/集塊）とクラスター（3〜40細胞）を
調査する。
統計的な解析を行なうために、各サンプル毎に、3枚のプレートを調査する。3
匹のマウスからなるグループで、別々に各マウスの評価を行なう。
好ましいニューロタクチンポリペプチドと変異体は、200μg/マウス、100μg/
マウス、50μg/マウス、さらに10μg/マウスか、それ以下でも有効である。有効
量は、少なくとも25％、少なくとも50％、さらにそれ以上、前駆細胞の細胞周期
を低減させる。
化学防御的なニューロタクチンポリペプチドは、補助的な薬剤として、化学療
法または放射線療法の前、および/または、その最中に、化学治療薬、または放
射線の細胞傷害的な影響から前駆細胞を保護するために患者に投与することがで
きる。化学防御的なニューロタクチンポリペプチドは、骨髄細胞を防御された、
緩やかな細胞周期状態に置くことによって、そうしないと、シトシンアラビノシ
ド、5-フルオロウラシル、またはヒドロキシウレアなどの、細胞周期活性のある
化学治療薬によってもたらされる細胞の傷害を阻害ないし軽減させる。化学防御
剤の使用によって、患者の成熟した機能的な血液細胞を生成する能力を危険に曝
すことなく、より高い用量の化学治療薬を投与することが可能になる。
化学防御的なニューロタクチンポリペプチドは、例えば、薬学的に許容される
担体に入れて、静脈または皮下から注射するなど、一般的には、ケモカインと同
じようにして患者に投与する。
化学療法においては、特異的なプロトコールはさまざまであり、腫瘍の大きさ
、増殖速度、および腫瘍の位置など、全ての要素が、治療コースに影響を与える
。化学防御薬だけでなく、化学治療薬の投与にも、病気の程度や、その前の治療
コースの毒性の強さ、および、化学治療薬の予想される毒性の程度など、必要な
知識を得ることが必要となる。実施例
実施例1では、マウスのニューロタクチン遺伝子とヒトのニューロタクチン遺
伝子の同定と配列決定について説明する。実施例2では、発現パターンと、好中
球に対する化学誘引剤として作用する能力を含む、ニューロタクチンのキャラク
タリゼーションが説明される。実施例3では、ニューロタクチン遺伝子の染色体
上へのマッピングについて説明する。
実施例1：ニューロタクチン遺伝子のクローニング
マウスのニューロタクチンの遺伝子が、マウスの脈絡叢cDNAライブラリーの中
に同定された。このマウスニューロタクチン遺伝子を用いて、ヒトのニューロタ
クチン遺伝子が同定された。この2つの遺伝子の同定と配列決定について、最初
の実施例で説明する。
脈絡叢mRNAの単離：マウス脈絡叢mRNAライブラリーを作出するために用いられ
たマウスmRNAは、次のようにして調製された。分子生物学の最新プロトコール（
Current Protocols for Molecular Biology）（前記）で説明されているように
、Chirgwinら（Biochemistry 18:5294，1979）のグアニジウムイソチオシアネー
ト/CsCl法を用いて、マウスの脈絡叢組織から全RNAを単離した。このRNAを定量
して、1mg/mlになるよう水で希釈してから、等量のDNase溶液（TE中、20mM MgCl2
，2mM DTT，0.1ユニットのDNase，0.6ユニットのRNaseインヒビター）とともに
、37℃で30分間インキュベートして、混入しているDNAを除去した。そして、こ
のRNAをフェノール-クロロフォルム-イソアミルアルコールで抽出し、エタノー
ルで沈殿させた。260nmで定量した後、RNAが完全かをチェックするために等量液
を電気泳動した。次に、Quiagen社（カリフォルニア州チャットワース）のオリ
ゴテックス-dTキット（Oligotex-dT kit）を、製造業者により説明されていると
おりに用いて、ポリA+RNAを単離した。定量した後、mRNAをエタノールで沈殿さ
せて、1mg/mlになるよう水に再懸濁した。
cDNA ライブラリー構築：単離された、上記の脈絡叢mRNAを用いて、次のように
して、cDNAを調製した。
脈絡叢mRNAを鋳型として用いて、Gublerらの方法（Gene 25:263，1983）に従
い、スーパースクリプトプラスミドcDNA合成キット（Superscript Plasmidc DNA
s
ynthsis kit）（Life Technologies;メリーランド州ゲティスバーグ）を用いて
、cDNA調製を行なった。得られたcDNAを、哺乳動物の発現ベクターであり、pME1
8Sの改変版で、以前に説明されている（Takebe，Mol．Cell．Bio．8:466，1988
）ように、SRaプロモーターを利用するpMET7のNotI/SalI部位にライゲーション
した。ライゲーションしたcDNAを、標準的な手順で調製したか、ライフテクノロ
ジーズ（Life Technologies）社から購入した電気的な受容能のある大腸菌DH10B
に形質転換した。
DNA 調製と配列解析：目的の配列を同定するために、マウスの脈絡叢ライブラ
リー中の多数のcDNAクローンの配列を決定した。そして、同定された配列を用い
て、完全長のマウスニューロタクチン遺伝子を同定し、配列決定した。同定と解
析は、以下のようにして行なった。
まず、96穴プレートの1mlのLB-ampに、脈絡叢ライブラリーの各形質転換体を
接種した。これらの接種は、cDNA形質転換体を希釈して行なわれた。この結果で
きた培養液を、エアレーションを行ないながら、３７℃で15時間から16時間増殖
させた。DNA調製する前に、細胞懸濁液を100μl取って、100μlの50％グリセロ
ールを加えて、混ぜ、-80℃で保存した（グルセロール凍結プレート）。そして
、商標登録ウィザード（WizardTM）ミニプレップシステム（Promega；ウィスコ
ンシン州マディソン）を用い、96穴方式を修正したものを用いて、DNAを調製し
た。
多数のクローンの挿入cDNAを、ダイ-プライマー化学法（アプライドバイオシ
ステムズ（Applied Biosystems，Inc.）社、カリフォルニア州フォスターシティ
ー）を用いた、標準的な自動蛍光ジデオキシヌクレオチド配列決定法によって、
アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社の373と377シークエンサ
ーで配列決定した。このシークエンシングで用いられたプライマーは、ベクター
のSRaプロモーターに隣接しているため、クローンの5'末端に対する選択性があ
るが、同じ選択性をもつ別のプライマーを用いることもできる。この方法で得ら
れた短いcDNA配列を次のようにしてスクリーニングした。
まず、各配列をチェックして、それが、バクテリアやリボソームやミトコンド
リアの混入物でないかを判定した。このような配列は、以後の解析からは排除し
た。次に、ベクター、または反復要素などの人為的な配列は、各配列から隠すか
、および/または除去した。第三に、残った配列を、BLASTNプログラム（BLASTN
1.3 MP:Altshulら、J．Mol．Bio．215:403，1990）を用いて、GenBankの塩基配
列データベースのコピーに対して検索を行なった。第四に、BLASTXプログラム（
BLASTX 1.3 MP:Altshulら、前記）を用いて、重複のない蛋白質データベースに
対する配列の解析を行なった。この蛋白質データベースは、Swiss-Prot、PIR、
およびNCBI GenPept蛋白質データベースを組み合わせたものである。BLASTXプロ
グラムは、フィルターパラメータ：「Xnu+seg」をもつ、デフォルトのBLOSUM-62
置換マトリクスを用いて実行させた。カットオフ値は、75を利用した。
シークエンチャープログラム（Gene Codes Corp.;Ann Arbor，MI）を用いて、
重複するクローンのコンティグへの組み立てを行なった。GCGパッケージ（Genet
ic Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison
，WI53711）中のプログラムを用いて、まとめられたコンティグを解析した。
上記の解析によって、395アミノ酸を含む読み枠をもつクローン（クローン番
号:jfmjd006h11）が同定された（図1）。このクローンによってコードされてい
る蛋白質をニューロタクチンと名付けた。フォン ハイン（Von Heijne）の方法
（J．Membrane Biol．115:195,1990）を用いて、読み枠の最初の、約21個のアミ
ノ酸が、シグナル配列であると推定された。マウスニューロタクチンのアミノ末
端部分は、既知のケモカインC-Cファミリーに有意な相同性をもっている。この
部分は、23位から92位までの残基の一次的な配列アラインメントによると、マウ
スの単球MCP-1に40％一致している。
BLASTNプログラムを用いて、DBEST発現配列タグ（EST）データベースを検索す
るために、マウスニューロタクチン遺伝子の配列を用いた。選んだESTに対応す
るクローンをゲノムシステムズ社（Genome Systems Inc.）から入手して、全長
の配列を決定した（図2）。このクローンの配列は、最初に同定したESTの配列と
、319位の位置で異なっていた。このクローンの配列と比較してみると、ESTの配
列には1塩基の欠失があり、そのために読み枠が変化していた。この欠失がある
ため、このクローンの推定アミノ酸配列は、ESTに対応する推定アミノ酸配列と
は異なっている。
ヒトのMCP-1（Swiss Prot #13500）と、ヒトニューロタクチンの23位から92位
までの残基との一次的な配列アラインメントに基づくと、このヒト型ニューロタ
クチンは、ヒトのMCP-1に42％一致している。ヒトニューロタクチン全体では、3
97アミノ酸をもち、本明細書において説明されているマウスのニューロタクチン
と67％一致している（図4）。N末端側のケモカイン様ドメインで、平均よりも高
い相同性が見られる。より高い相同性をもつこの領域は、膜貫通ドメインと細胞
質ドメインである。
実施例2：ニューロタクチンのキャラクタリゼーション
ニューロタクチンの発現パターンを、下記に説明するようにして調べた。組換
え型の可溶性マウスニューロタクチンの発現、および、ニューロタクチンが好中
球の走化性を刺激することを示す実験についても、下記で説明されている。
ニューロタクチンの発現解析：ノザン解析を用いて、次のようにして、ニュー
ロタクチンの発現を調べた。まず、RNAsolによって、細胞が80％集密になったと
きに、次の細胞型から全RNAを抽出した。すなわち、WEH-1-3、およびPu5-1.8（
骨髄単球）、P388D1とIC-21（マクロファージ）、AKR.G.2（胸腺腫）、BaF3（プ
ロB細胞）、EL-4（リンパ腫）、NFS-1.0（B細胞リンパ腫）、BCL（B細胞白血病
）、STO（胚線維芽細胞）、EOMA（内皮）、およびBMS-12（骨髄幹）。EOMA細胞
とBMS-12細胞以外のこれらの細胞はすべて、米国基準培養株コレクション（メリ
ーランド州ベセスダ）によって説明されている手続きにしたがって、維持されて
いた。EOMA細胞は、10％FCS入りのDMEM中で維持されており、BMS-12細胞は、10
％ウマ血清入りのDMEM中で維持されていた。活性化因子のニューロタクチンに対
する効果を判定するために、RNA抽出の前に100ng/mlのLPS、または30ng/mlのPMA
で4時間処理するか、処理しないままにしておいた。
標準的な技術（Chirgwinら、Biochemistry 18:5294，1979）を用い、全長ニュ
ーロタクチンをコードする、32P標識したDNA断片を用いて、全RNA20μgを含むノ
ザンブロットを検索した。
このノザン解析によって、3.5kbのニューロタクチンmRNAが、内皮細胞（EOMA
）と胚線維芽細胞（STO）の中で構成的に発現されていることが明らかになった
。3.5kbのニューロタクチンmRNAは、LPSおよびPMAによる刺激を受けると、これ
らの細胞の中で上昇制御を受ける。また、このmRNAは、LPSおよびPMAで処理する
と
骨髄幹細胞（BMS-12）の中でも上昇制御される。刺激を受けていないBMS-12細胞
の中では発現されない。この発現パターンは、炎症のモジュレーターに特徴的な
ものである。
LPSおよびPMAで刺激してもしなくても、造血細胞由来のいくつかの細胞系では
、ニューロタクチンmRNAが検出されなかった。調べられた細胞系は、WEH-1-3、
およびPu5-1.8（骨髄単球）、P388D1とIC-21（単球/マクロファージ）、AKR.G.2
（胸腺腫）、BaF3（プロB細胞）、EL-4（リンパ腫）、NFS-1.0（B細胞リンパ腫
）、およびBCL（B細胞白血病）であった。
この同じノザン解析によって、次のおおよその大きさをもつmRNAの存在が明ら
かになった。すなわち、1.5kb、4.4kb、および5.5kb。これらのメッセージは、
ニューロタクチンの選択的なスプライシングを受けた型か、または、関連する遺
伝子の転写産物を表している可能性が高い。
ヒトの組織のノザンブロットは、ヒトのニューロタクチンが、脳と心臓で高度
に発現されていることを明らかした。さらに、脳組織のノザンブロット（Clonte
ch社）へのハイブリダイゼーションによって、このmRNAは、脳のすべての部分で
発現していることが分かった。
また、インサイチューハイブリダイゼーションを用いて、ニューロタクチンの
発現を調べた。これらのハイブリダイゼーションを行なうための組織は、以下の
ようにして調製した。4週齢から6週齢のC57BL/6マウスに麻酔をかけて、PBSを灌
流させた後、4％パラホルムアルデヒド（PFA/PBS）を灌流させた。そして、脳を
取り出して、10％緩衝ホルマリン中に保存した。10μｍの脳の冠状凍結切片を、
4％PFA/PBSで15分間固定した。PBSで洗浄した後、切片を2μg/mlのプロテナーゼ
Kによって、37℃で15分間分解し、その後、4％PFA/PBSで10分間インキュベート
した。そして、切片をPBSで洗浄して、0.2N HClで10分間インキュベートし、PBS
で洗浄して、0.25％無水酢酸/1Mトリエタノールアミンで10分間インキュベート
し、PBSで洗浄して、70％エタノールと100％エタノールで脱水した。
マウスのニューロタクチン遺伝子（クローン6h11）のコーディング領域の1.9k
bの分節をコードする、35S放射性標識した（5×107cpm/ml）アンチセンスcRNAプ
ローブを用いて、50％ホルムアミド、10％デキストラン硫酸、1×デンハルト溶
液
、600mM NaCl、10mM DTT、0.25％SDS、および100μg/ml tRNAが存在する中で、5
5℃で18時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションを行
なった後、スライドを55℃で、5×SSCを用いて洗浄し、55℃で、50％ホルムアミ
ド/2×SSCを用いて30分間洗浄し、10mM Tris-HCl(pH7.6)/500mM NaCl/1mM EDTA
（TNE）を用いて37℃で10分間洗浄し、TNE中、10μg/mlのRNase Aに入れて37℃
で30分間インキュベートし、TNE中で37℃で10分間洗浄し、50℃で30分間、2×SS
C中で一度インキュベートし、50℃で30分間、0.2×SSC中で2回インキュベートし
てから、70％エタノールと100％エタノールで脱水した。スライドをコダックNBT
-2（Kodak NBT-2）フォトエマルジョンに浸し、4℃で4日間感光させて、mRNA転
写産物の局在を検出した。インサイチューハイブリダイゼーション実験のための
対照には、バックグランド以上のシグナルを示さないセンス鎖プローブが含まれ
ていた。
マウスニューロタクチンプローブによる、これらのインサイチューハイブリダ
イゼーションによって、ニューロタクチンが、弓状核で発現していることが明ら
かになった。皮質と脈絡叢でも発現が検出された。
ニューロタクチンの細胞膜との結合を判定するために、全長のニューロタクチ
ンコーディング領域を含む構築物を、哺乳動物の発現ベクターであるpN83中に作
製した。哺乳動物のシステムの中で発現させるために、次のプライマーを用いた
PCRによって、全長のマウスニューロタクチンcDNAを改変した。
および
番号：13）。FLAGエピトープタグ（DYKDDDDK（配列番号：14））をコードしてい
るヌクレオチドで、M2抗FLAG抗体によって検出できるヌクレオチドは、3'「逆側
」プライマーに組み込まれた。キアゲン商標登録マキシプレップキット（Quiage
n MaxiprepTMkit）（Quiagen，Chatsworthy，CA）によって、構築物DNAを調製し
、商標登録リポフェクタミン（lipofectamineTM）（ギブコ社（Gibco）、Gaithe
rsburg，MD）によって、8穴のチャンバースライド中で培養された293 EBNA細胞
の中に形質転換された。形質転換して48時間後、50％メタノールと50％アセトン
によ
り、室温で1分間、細胞を固定して、2.5mlのTBSで4回洗浄し、10μg/mlのM2抗FL
AGモノクローナル抗体（Eastman KodakCo.，New Haven，CT）とともにインキュ
ベートしてから、FITC結合ヤギ抗マウス抗体（Jackson Immuno Research，West
Grove，PA）と、１：1000の希釈率でインキュベートした。細胞を、それぞれ1時
間ずつ、一次抗体と二次抗体に接触させた。免疫蛍光染色を、拡大率200倍の下
で可視化した。強い染色が、形質転換された293 EBNA細胞の表面上で検出され、
完全長のニューロタクチンが、実際に膜に定着していることを示唆した。インキ
ュベート液中に、FLAGペプチドを過剰量加えると、観察されたシグナルを競合に
より消してしまうことができた。
可溶性ニューロタクチンの調製：pGEX発現システムを用いて、バクテリアの中
で、組換えマウスニューロタクチンの可溶性型（22〜105位の残基）を産生させ
た。グルタチオンアガロース上で、pGEX-ニューロタクチンを精製し、トロンビ
ン分解によって、ニューロタクチン部分を遊離させた。エンドトキシンBXカラム
（Cape Cod Associates:Falmouth，MA）でエンドトキシンを除去した後、カブト
ガニの遊走細胞溶解物（LAL）アッセイ法（Cape Cod Associates）によって、低
レベルのエンドトキシン（<0.01FU/ml）が含まれていないかを判定した。
組換えた、可溶性のニューロタクチンを、以下のようにして作出した。まず、
マウスニューロタクチンのコーディング領域を、ケモカイン様ドメインをコード
する配列の5'末端にある配列に相当するプライマー（5'プライマー）によって増
幅した。この5'プライマー、5'-GGGAAAGAATTCCTGCCGGGTCAGCACCTCGGCATG-3’（
配列番号：6）は、EcoRI制限酵素切断部位をもち、その後ろに、マウスニューロ
タクチンのケモカイン様ドメインの始めの部分をコードする24個のヌクレオチド
が続く。用いられた3'プライマーは、5'-GGGAAACTCGAGTCATTCTCAAACTTGCCACCATT
TTTA-3’（配列番号：7）であった。このプライマーは、99位から105位のアミノ
酸をコードする配列に相補的な配列で、その先に、終止コドンとXhoI部位をもつ
。
これらのプライマーの組みを、次の条件を用いて行なうPCR増幅に用いた。す
なわち、94℃で30秒間、55℃で30秒間、また72℃で90秒間を30サイクルで行なう
。この結果できたPCR産物を、GST融合蛋白質ベクターpGEX-4Tにクローニングし
た（ファルマシア（Pharmacia）社、Piscataway，NJ）。この融合蛋白質は、大
腸菌の
中で産生され、製造業者が配布しているプロトコールにしたがって、精製を行な
った。ニューロタクチン構築物は、トロンビンでGSTを切断すると、ほぼ10,000k
Daの蛋白質を産生した。
好中球の化学誘引剤としてのニューロタクチンのアッセイ法 上記の可溶性型
の組換えニューロタクチンの能力を、好中球の化学誘引剤として作用することが
できるかについて試験した。
これらの実験で用いられたヒトの好中球は、50mlのポリプロピレン製のポリプ
ロピレン製のコニカルチューブの中で、10mlのFICOLL 1119と10mlのFICOLL 1077
（シグマ社；St Louis，MO）の上に20mlのヒトの血液を層状に重ね、室温で1800
rpmで15分間遠心分離して単離した。遠心分離後、好中球の層を滅菌して氷冷し
た、カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（ギブコ社、Bethes
da，MD）で洗浄し、混入した赤血球細胞を溶解するために、45mlの滅菌して氷冷
したH2Oと、5mlの滅菌した10×リン酸緩衝食塩水（PBS）で、好中球のペレット
を再懸濁した。4℃、1800rpmで5分間遠心分離して、細胞を沈殿させた。沈殿し
た好中球を、10mlの滅菌したPBSに再懸濁して、定量し、インビトロアッセイで
必要となるまで、氷上に保存しておいた。
ニューロタクチンが、好中球の走化性を誘引できるを、フォーク（Falk）ら（
J．Immunol．Meth．33:39，1980）によって説明されているインビトロアッセイ
法で試験した。5μｍ孔径フィルターをもつ、48穴の微量走化性チャンバーの各
ウエルに、およそ50,000個の好中球を加えた。ニューロタクチン、またはヒトイ
ンターロイキン-8（Biosource International，Camarillo，CA）を、さまざまな
濃度で、適当な各ウエルの下側のチャンバーに加えた。そして、37℃、5％CO2で
30分間、細胞をインキュベートした。上側のチャンバーを取り除き、上側のチャ
ンバーのフィルター上の細胞を掻き取った。このフィルターを100％エタノール
で固定し、3.7％ホルムアルデヒド中0.5％トルイジンブルー溶液で染色した。過
剰に染色した部分は、蒸留水で除去した。ウエル当り3箇所の高拡大領域（400×
倍率）を計測して、移動した細胞を定量した。対照とした緩衝液に移行した細胞
数をバックグランドとして引き算した。このアッセイ法における化合物の活性か
ら、インビボで、好中球の走化性を誘引できる化合物の能力を予測できる。
このアッセイ法の結果が、図5に示されている。この図は、ヒトのインターロ
イキン-8とニューロタクチンが、好中球の走化性を誘引できる能力を比較を示し
ている。図からも分かるように、ニューロタクチンは、おおよその最終濃度（最
大の刺激レベルの50％をもたらす濃度）が1ng/mlで、ヒトの好中球に走化性をも
たらした。この最終濃度は、既知の好中球誘引因子である、ヒトのインターロイ
キン-8の最終濃度に勝るとも劣らない。
ケモカイン様ドメイン（22から105位の残基）に相当する、マウスニューロタ
クチンの可溶性型も、ヒトのTリンパ球に走化性をもたらす。さらに試験すると
、このケモカイン様ドメインも、細胞外ドメイン全体も、ヒトの単球、ヒトの骨
髄単球THP1細胞、またはマウスP388D1単球細胞に対しては走化性効果をもたらさ
ないことが分かった。
また、2つのマウスニューロタクチンの可溶性型（ケモカイン様ドメイン（22
から105位の残基）と細胞外ドメイン全体（22から337位の残基）に相当する）を
、C57BL/6Jマウスに腹腔内注射して、インビボでの走化性効果を判定した。これ
らの可溶性型ニューロタクチンと同じ方法で、グルタチオンS-トランスフェラー
ゼのみを含む細菌溶解液を精製して、インビボアッセイ法における対照として用
いた。ニューロタクチンと対照用蛋白質は、両方とも、0.5μg/400μl PBS/マウ
スとなる用量で投与された。さらに、400μl PBSだけを注入したマウスもあった
。注射してから2時間後、腹膜からの滲出液を集めて、体液中から回収された白
血球の数とサブタイプを、4箇所の高拡大領域（40×倍率；全面積で0.5mm2）の
細胞をタイピングおよび計測して判定した。ライト-ギムザで染色したところ、
好中球と好酸球が同定されため、Thy 1.2（53-2.1）とIgM（II/41）免疫染色に
よってリンパ球を評価した。
ケモカイン様ドメイン（22から105位の残基）は、（インビトロ実験から予想
されたとおり）好中球とリンパ球に走化性をもたらし、また、単球にも走化性を
もたらした。しかし、単球に対するケモカイン様ドメインの活性は、インビボで
の2次的効果によるものであって、ニューロタクチンの走化性の特異性を反映し
たものではないようである。ニューロタクチンのケモカイン様ドメインは、好酸
球に走化性をもたらさなかった。細胞外ドメイン全体（22から337位の残基）は
、イン
ビボでは、単球およびリンパ球に対する化学誘引剤として作用しなかったが、好
酸球には走化性をもたらした。
正常なマウスの脳、ならびにLPS処理したマウスの脳、および、重度の実験的
自己免疫性脳脊髄炎（EAE）に罹ったマウスの脳切片におけるニューロタクチン
の発現を、免疫組織学法によって判定した。EAEは、慢性炎症疾患のモデルとし
て用いられる、免疫不全のα-ミエリン塩基性蛋白質T細胞レセプター遺伝子組換
えマウスにおいて自然に発生する。
ニューロタクチンのアミノ末端側に位置するペプチド（LPGQHLGMTKCEIM配列番
号：15；Rsearch Genetics，Huntsville，AL）に対するポリクローナル抗ニュー
ロタクチン抗体を、ウサギの中で作製した。12週間飼育したものから、抗体をア
フィニティー精製した。LPS処理するために、8週齢のCD1マウスに、40μgのLPS
を静脈から注射し、2時間後に頚部脱臼させて殺した。これらの脳を取り出し、
横断的に2つに切断し、商標登録ティシューテックOCT（Tissue TekTMOCT）化合
物（Cryoform）で被覆した。そして、OCTで被覆した組織を、イソペンタンとド
ライアイスの混合液の中で直ちに凍結し、-70℃で保存した。切片（3μｍの厚さ
）を切り出して顕微鏡用スライドの上に載せ、風乾させて、2％パラホルムアル
デヒド（4℃で5分間）とメタノール（-20℃で10分間）で固定した。EAEモデルで
のニューロタクチンの発現を実験するために、オスのα-ミエリン塩基性蛋白質T
細胞レセプター（MBR TCR）遺伝子組換えマウス（約4月齢のもの）から脳を採集
し、10％中性緩衝ホルマリンで固定して、パラフィンに包埋した。染色する前に
、5分間ずつ2回、0.01Mクエン酸ナトリウムの中で、切片（4μｍ）を電子レンジ
にかけた。
アビジン/ビオチン染色法を用いて、固定した切片を抗体で染色した。インキ
ュベーションはすべて、加湿した状態で行なわれ、各ステップの間に5分間ずつ2
回、0.2％ゼラチンを添加した、0.1Mリン酸緩衝液（PBSG）でスライドを洗浄し
た。この切片を、20％ウシ胎児血清入りのPBSに15分間浸した後、抗ニューロタ
クチンポリクローナル抗体、または正常なウサギ血清（どちらも、0.1％ウシ血
清アルブミンを添加したPBSで、1：200に希釈した）と一緒に、4℃で一晩インキ
ュベートした。0.3％過酸化水素を含むメタノール中で20分間インキュベートし
て、内生
するパーオキシダーゼを遮断した。20分間ずつ、アビジン溶液でインキュベート
した後、ビオチン溶液でインキュベートして、内生するアビジンまたはビオチン
との交差反応による非特異的な染色を遮断した。結合したモノクローナル抗体は
、どちらも10％正常マウス血清入りのPBSで希釈した、ビオチニル化したブタ抗
ウサギ免疫グロブリン（ダコー社（Dako）、カリフォルニア州）と、次にストレ
プトアビジンパーオキシダーゼ複合化合物と1時間インキュベートして可視化し
た。そして、このスライドを、パーオキシダーゼ基質溶液（0.01％過酸化水素を
含む、10mlのPBS中、400μgのジアミノベンジジン）に10分間浸した。この切片
をヘマトキシリンで対比染色した。対照用切片は、モノクローナル抗体、ビオチ
ニル化した抗ラット免疫グロブリン、またはストレプトアビジン複合体を選択的
に省いて作成した。さらに、組織切片とインキュベートする前に、抗体をペプチ
ド（25μg/ml）と、37℃で45分間プレインキュベートして、抗体の競合的阻害を
行なった。
正常なマウスの脳では、染色は、毛細管と常住の小膠細胞に局在していた。LP
S処理後2時間で、同じ細胞型上で、標識強度の増加が見られた。さらに、抗ニュ
ーロタクチン抗体に対して陽性に染色される活性化小膠細胞の数が増加した。正
常な脳とLPS処理された脳の両方において、太い脈管の染色は、内皮の先端領域
に限られていた。常住の小膠細胞に加えて、この他に2つのサブタイプの小膠細
胞、脈管周囲小膠細胞と脈管近傍小膠細胞がCNSの血液脳関門のところに存在し
ていることが知られている。微細脈管に関連した抗ニューロタクチン抗体染色は
、このような小膠細胞の染色と一致していた。また、EAEマウスの脳の中の活性
化小膠細胞において、ニューロタクチンの発現が上昇制御されていた。
実施例3：ニューロタクチン遺伝子のマッピング
本実施例で説明されているのは、ニューロタクチンの染色体マッピングである
。また、ニューロタクチンとバルデー-ビードル症候群とが関係する可能性につ
いても、下記で説明されている。
マウスの染色体マッピング：以下のPCRプライマーを用いて、マウスのゲノムD
NAを増幅した。
PCR反応は、種内戻し交配マウスのパネルからのゲノムDNAについて行なった。
増幅プロフィールは以下のようであった。すなわち、94℃（30秒）、55℃（30秒
）、および72℃（45秒）を30サイクルで行なった。サンプルは、20Wと4℃で、2.
5時間、非変性の10％ポリアクリルアミドSSCPゲル上で泳動した。
マウスニューロタクチンは、C57B1/6Jとムス・スプレタス（Mus spretus）の
戻し交配後代のパネルを用いて、マウスの第8染色体の長腕部のD8MIT35とD8MIT7
4の間にマップされた。この領域は、ヒトの第16染色体と同じ配列順序をもって
いる。
ヒトの染色体マッピング：ヒトのニューロタクチンが、放射線雑種のパネルを
用いて、ヒトの染色体16q上のWI7078とWI6174の間にマップされた。
以下のPCRプライマーを用いて、放射線雑種のパネル（ジーンブリッジ4（Gene
bridge 4）、リサーチジェネティクス社（Research Genetics）、アラバマ州ハ
ンツビル）からのヒトのゲノムDNAを増幅した。
増幅プロフィールは以下のようであった。すなわち、94℃で30秒、55℃で30秒
、また72℃で45秒を30サイクル行なった。サンプルは、1％アガロースTAEゲルで
分離した。
発表された論文（クゥイテック-ブラック（Kwitek-Black）ら、Nature Geneti
cs 5:392，1993）と第16染色体の統合遺伝子マップ（ゲノムデイレクトリ、Natu
re 377:335，1995）によると、ニューロタクチン遺伝子がマップされた領域は、
バルデー-ビードル症候群（BBS）で重要な遺伝子の遺伝子座と重複する。
BBSは、肥満、精神遅滞、多指症、色素性網膜炎、および生殖機能不全という
特徴をもつ異種性常染色体劣性障害である。この症候群に罹った患者は、腎臓と
心臓血管の異常を高い頻度で起こしている。ニューロタクチンが、BBSで影響を
受ける組織と器官において発現されるという事実は、ニューロタクチンがBBSに
関与していることを示唆している。例えば、BBSは、肥満、および精神遅滞とい
う特徴をもち、また、ニューロタクチンは脳の、弓状核、体重の調節に関与する
と考えら
れている脳領域、および、その他の部分で発現されている。また、BBSは、腎臓
と心臓血管の病徴を伴っており、ニューロタクチンは、腎臓と心臓で発現されて
いる。さらに、BBSは、生殖機能不全を伴うが、ニューロタクチンは子宮で発現
されている。
治療への応用
本明細書において説明されているニューロタクチン蛋白質とポリペプチドは、
好中球の走化性を刺激するため、炎症に介在している可能性が高い。したがって
、ニューロタクチンの発現または機能を妨げる化合物（例えば、抗体）を投与す
ることによって、ウイルス性脳炎、多発性硬化症、ウイルス性または細菌性髄膜
炎、重度頭部外傷、脳卒中、神経変性病（例えば、アルツハイマー病とルーゲー
リック病）、HIV脳症、原発性脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）、狼蒼関連脳炎、
および発作後の脳外傷など、脳における望ましくない炎症を軽減することができ
る。また、ニューロタクチンの発現または機能を妨げる化合物を用いて、その他
の望ましくない炎症、例えば、アテローム性動脈硬化症、または呼吸器系の感染
症などを治療することができる。
ニューロタクチンは、他のケモカイント同じように（ロード（Lord）ら、Bloo
d 85:3412，1995;ラテルビーア（Laterveer）ら、Blood 85:2269，1995）、造血
幹細胞と前駆細胞を、骨髄から抹消血に移行させるために用いることができる。
幹細胞と前駆細胞は、骨髄よりも抹消血から、より容易に回収することができる
ため、ニューロタクチンは、幹細胞回復治療で使用するために、これらの細胞を
分離する上で有用である。このような治療は、骨髄切除的、および/または骨髄
抑制的な癌治療を受けたことのある患者にとって役に立つ。
ニューロタクチンは、造血細胞の調節に関係する可能性が高い。特に、ニュー
ロタクチンは、他のケモカイント同じように(グラハム（Graham）ら、Nature 34
4:442,1994;ブロクシマイアー（Broxmeyer）ら、J．Immunol．150:3448，1993)
、造血幹細胞と前駆細胞の増殖を阻害することができるようである。このような
阻害によって、化学療法による損傷から細胞を保護することができる。このよう
に、ニューロタクチンを用いて、化学療法による損傷、例えば、癌に対する化学
療法中の損傷から、造血幹細胞と前駆細胞を保護することができる。
前駆細胞の増殖を阻害するニューロタクチンポリペプチドを用いて、慢性骨髄
性白血病、一次性赤血球増加症、および超巨大核細胞形成障害（hypermagakaryo
cytopoietic disorder）などの病気による過増殖性骨髄細胞を阻害することがで
きる。このような病気における過増殖状態は、前駆細胞が細胞増殖と複製を消極
的に調節できなくなるために起こる。適当なニューロタクチンポリペプチドの投
与によって、細胞の複製を阻害し、異常な細胞増殖の阻害をもたらすことが期待
される。過増殖性骨髄細胞による病気を治療するためのニューロタクチンポリペ
プチドの投薬量は、上記の化学療法の補助薬として、この蛋白質を使用するため
の投薬量と同じであろう。
さらに、ニューロタクチンポリペプチドを用いて、化学治療薬を投与した結果
、骨髄前駆細胞が白血病になることを防止することができる。ニューロタクチン
ポリペプチドは、上記した方法と同じ方法で投与される。
組換えニューロタクチンによって、ニューロタクチンの機能を薬学的に修飾す
る因子の産生が容易になるかもしれない。本発明に係る、このような治療薬的な
ポリペプチドは、ニューロタクチンの機能を調節するのに有効な用量で、例えば
、静脈内など、適当な経路によって投与することができる。病状を緩和させるの
に必要なだけ、治療を繰り返すことができる。
診断的への応用
本発明の核酸、ポリペプチド、および抗体は、ニューロタクチンの機能にとっ
て重要な蛋白質を含む、哺乳動物の細胞の区画を同定するために有用である。ニ
ューロタクチンに特異的な抗体を、上記のようにして産生することができる。そ
して、蛋白質の通常の細胞内の局在を、インサイチュー、または、標準的な免疫
学的な、または免疫組織学的な方法（例えば、アウスウベル（Ausubel）ら、前
記；バンクロフトとスティーブンス（Bancroft and Stevens）、組織学的技術の
理論と実際（Theory and Practice of Histological Techniques）、チャーチル
・リビングストン社（Churchill Livingstone）、1982）によって分画された細
胞を用いて判定する。
ニューロタクチンに特異的な抗体は、また、ニューロタクチン関連疾患の検出
または監視において、診断的に使用することができる。標準的な技術によって、
サンプル中のニューロタクチン蛋白質のレベルを測定することができる。例えば
、本明細書において説明されている抗体を用いた、標準的な免疫学的、または免
疫組織学的方法（例えば、上記の方法）によって、ニューロタクチン蛋白質の発
現をモニターすることができる。または、ニューロタクチンの発現を、標準的な
ノザンブロット解析で測定するか、PCRで補助することができる（例えば、アウ
スウベル（Ausubel）ら、前記；PCR技術：DNA増幅への原理と応用（PCR Technol
ogy］Principles and Applications for DNA Amplification）、エイチ・エイ・
エールリヒ（H．A．Ehrlich）編、ストックトンプレス（Stockton Press）、ニ
ューヨーク）。必要か望ましければ、ニューロタクチンの配列中の点突然変異の
検出するために、（例えば、よく知られている、核酸のミスマッチ検出技術を用
いて）解析を行なうことができる。上記の技術はすべて、本明細書において説明
されているニューロタクチン配列によって可能である。
したがって、ニューロタクチンの異常な発現に関連した障害をもつ患者である
か否かを判定するための方法において、本発明の核酸、ポリペプチド、および抗
体を用いることができる。患者から得た生物学的サンプルにおけるニューロタク
チン発現レベルを定量することによって、この方法を行なうことができる。対照
として、健康な患者から得られた生物学的サンプルを用いて、定量を行なうこと
ができる。
生物学的サンプルにおける、ニューロタクチンmRNAの発現レベルを定量するこ
とによって、または、発現されているニューロタクチン蛋白質のレベルを定量す
ることによって、ニューロタクチンの発現を、遺伝子発現のレベルで評価するこ
とができる。当業者が実施することのできる範囲に十分に含まれる、上記の技術
を用いて定量を行なうことができる。
ある患者が、ニューロタクチンの異常な発現または活性に関係した障害をもっ
ていると判定されたならば、その発現または活性を調節する化合物を与えること
ができる。例えば、低分子、アンチセンス核酸、またはリボザイムなど、ニュー
ロタクチンの発現を阻害する化合物を受けることができる。また、患者はニュー
ロタクチンの活性を阻害する化合物を受けることもできる。ニューロタクチンに
特異的に結合する抗体を、この目的のために用いることができる。
または、患者は、ニューロタクチンの発現または活性を促進する化合物を受け
ることができる。ニューロタクチンの発現または活性を、阻害または促進する化
合物には、合成分子も含まれうる。これらの治療方法を用いて、上記で、より完
全に説明されている、炎症性障害、および細胞増殖に関連する障害を治療するこ
とができる。
その他の態様
本発明は、また、上記のニューロタクチンポリペプチドの断片、変異体、類似
体、および誘導体で、好中球の走化性など、ニューロタクチンの生物学的活性の
一つ以上を保持しているものを特徴とする。
本発明には、天然、および非天然の対立遺伝子的変異体が含まれる。ニューロ
タクチンをコードする、最も一般的な天然の塩基配列と比較すると、対立遺伝子
的変異体をコードする塩基配列は、1個以上の置換、欠失、または付加をもって
いるかもしれない。好ましい対立遺伝子的変異体は、天然のニューロタクチンと
機能的には同じである。
本発明は、その詳細な説明とともに説明されているが、前記の説明は、例示の
ためのものであり、添付の請求の範囲によって明らかにされている発明の範囲を
制約するものではないと理解されるべきである。この他の局面、利点、および修
正は、次の請求の範囲に含まれる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00
45/00 Ａ６１Ｐ 7/00
48/00 35/00
Ａ６１Ｐ 7/00 35/02
35/00 43/00 １０５
35/02 Ｃ０７Ｋ 14/52
43/00 １０５ 16/24
Ｃ０７Ｋ 14/52 19/00
16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15
19/00 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｐ 21/08
1/21 Ｇ０１Ｎ 33/566
5/10 33/68
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｇ０１Ｎ 33/566 5/00 Ａ
33/68 Ｂ
Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ