CN101010106A - 抗体和Duocarmycin衍生物的缀合物作为抗肿瘤剂 - Google Patents
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Abstract
提供了用抗体-细胞毒素缀合物分子治疗瘤性疾病的方法、合成抗体-细胞毒素缀合物分子的方法。还提供了可用作抗体-细胞毒素缀合物分子或者用于合成这些分子的化合物。
Description
本申请是基于2004年6月30日提交的美国临时申请号60/584,226,将其内容引入本文作为参考。
本工作得到Skaggs Institute for Chemical Biology、NIH(授权NAID-AI47127、NCI-CA41986和RO1-HL63651)、California CancerResearch Program(授权00-00757V-20012)、California Breast CancerResearch Program(授权4JB-001)和Louis R.Jabinson Fellowship(LouisR.Jabinson Investigatorship Fund for Graduate Education)的支持。政府拥有本发明中的某些权利。
领域
本发明一般涉及用抗体-细胞毒素缀合物分子治疗肿瘤性疾病的方法,合成抗体-细胞毒素缀合物分子的方法,和用作抗体-细胞毒素缀合物分子或者用于这些分子的合成中的化合物。
背景
在过去二十年里肿瘤的定向治疗已经取得巨大发展,主要是由于单克隆抗体(mAb)技术的建立。Kohler等人,Nature,256:495-497,1975。早期的基本应用是开发放射性标记的mAb,它们的一些已经在临床上用于成像和癌症治疗。Kousparou等人,JInt Soc Tumor Target,1:55-69,2000;Buchsbaum等人Antibody Immunoconjugate Radiopharm,4:245-272,1991。重要的是,mAb-药物缀合物是另一潜在类别的抗癌剂,它们已经被广泛研究。Safavy等人,In Drug Targeting in Cancer Therapy,M.Page,ed.,257-275,2002;Stan等人,Cancer Res,59:115-121,1999;Florent等人,J Med Chem,41:3572-3581,1998。然而,尽管已经报导了单独的成功的例子,但是需要巨大的进步以处理癌症治疗中的复杂问题。
一个中心目标是寻找当结合到过表达的细胞表面受体或者配体时被肿瘤细胞特异内化的人mAb或者肽。Nielsen等人,Pharm.Sci.Technol.Today,3:282-291,2000;Trail等人,Cancer Immunol Immunother,52:328-337,2003;Gao等人,J Immunol Methods,21 A:185-197,2003;Gao等人,Bioorg Med Chem,10:4057-4065,2002。该研究路线对使用蛋白质载体递送药物战斗部提供了机会,所述药物战斗部增加了癌症化学治疗功效并且减小了副作用。这种策略的临床潜力的一个证明引起了将内化缀合到加利车霉素的抗-CD33抗体P67.6的细胞用于抗急性髓细胞白血病,其已经导致FDA批准的药物MylotargTM。Hamann等人,Bioconjug Chem,13:40-46,2002。
整联蛋白α3β1,也称作VLA-3膜受体,由胎儿和成人组织表达,介导与细胞外基质的粘附、迁移和侵入性细胞相互作用。Elices等人,J Cell Biol,112:169-181,1991。α3β1的升高的表达已经在一些类型的转移性癌症类型中观察到并且已经与增加的迁移和侵入有关。值得注意的是,该整联蛋白的表达在恶性黑素瘤中被上调并且与迁移和皮肤侵入的程度良好相关。Melchiori等人,Exp Cell Res,219:233-242,1995;Laidler等人,ActaBiochim Pol 47:1159-1170,2000;Elshaw等人,Br J Ophthalmol,85:732-738,2001;Yoshinaga等人,Melanoma Res,3:435-441,1993。α3β1整联蛋白也被人PC-3前列腺癌细胞的侵入性克隆表达,但是不被非侵入性亲代细胞群体表达。Dedhar等人,Clin Exp Metastasis,11:391-400,1993;Romanov等人,Prostate,39:108-118,1999。类似地,不同鳞状细胞癌的侵入性性质与包括α3β1的一些整联蛋白的过表达相关。Dyce等人,Laryngoscope,112:2025-2032,2002;Ghosh等人,Cancer,95:2524-2533,2002。还表明恶性胶质瘤细胞中α3β1的功能性抑制可以阻断它们的侵入能力。Fukushima等人,Int J Cancer,76:63-72,1998。α3β1还与哺乳动物癌细胞转移、侵入和胶原降解活性有关。Morini等人,Int J Cancer,87:336-342,2000。最后,鼠肝细胞癌(HCC)中α3β1的表达与肝内转移的发生有关,认为肝内转移是复发的主要形式。Tsuchiya等人,Int J Oncol,20:319-324,2002。考虑到恶性癌细胞和正常细胞之间α3β1的通常不同的表达水平,可以认为α3β1是基于特异抗体的抗肿瘤治疗的可行的靶标,设计所述抗肿瘤治疗来杀死癌细胞和控制转移扩散。
已经证明使用RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)假肽,通过靶定α3β1选择性控制转移可以成功地治疗肝细胞癌(HCC)的肝内转移。Tsuchiya等人,Int J Oncol,20:319-324,2002。而且,经由α3β1整联蛋白靶定的腺病毒载体,通过选择性基因递送已经治疗了头和颈的鳞状细胞癌。Kasono等人,Clin Cancer Res,5:2571-2579,1999。已知一些鼠mAb靶定α3β1的α3或者β1亚基,然而,没有一种已知被肿瘤细胞内化,它们也从来没有用作抗癌治疗剂。Morimoto等人,J Immunol,134:3762-3769,1985;Wayner等人,J Cell Biol,105:1873-1884,1987;Bartolazzi等人,Anticancer Res,13:1-11,1993。重要的是,多数mAb的典型的鼠来源对于人类临床应用是有害的。Tjandra等人,Immunol Cell Biol,68:367-376,1990;Schroff等人,Cancer Res,45:879-885,1985;Goldman-Leikin等人,Exp Hematol,16:861-864,1988;Herlyn等人,J Immunol Methods,85:27-38,1985。此外,另一个屏障可以是mAb作为完整免疫球蛋白G(IgG)的有效利用,通常规因于高分子量,其阻止实体瘤的有效渗透。例如,研究已经指出1%以下的经输注的放射性标记的IgG可以达到它的靶肿瘤块。Jain,CancerRes,50:814s-819s,1990;Pimm等人,In Monoclonal Antibodies forCancer Detection and Therapy,V.S.Byers,ed.,97-128,1985。克服该问题的一种方法是使用scFv形式的mAb。与完整IgG和片段Fab和F(ab’)2相比,已经表明scFv更快和更深地渗透到肿瘤中,还表明具有非常快的血浆和身体清除(<30分钟)。Chester等人,Trends Biotechnol,13:294-300,1995;Hand等人,Cancer,73:1105-1113,1994;Yokota等人,Cancer Res,52:3402-3408,1992;Milenic等人,Cancer Res,51:6363-6371,1991;Colcher等人,J Natl Cancer Inst,82:1191-1197,1990。因此,在许多情况中,优选的治疗策略可以是使用缀合抗癌剂的人scFv。
CC-1065和duocarmycin是两种抗癌抗生素,它们具有序列选择性DNA烷化性质。Chidester等人,J Am Chem Soc,103:7629-7635,1981;Takahashi等人,J Antibiot(Tokyo),41:1915-1917,1988;Ichimura等人,JAntibiot(Tokyo),43:1037-1038,1990;Yasuzawa等人,Chem Pharm Bull(Tokyo),43:378-391,1995;Boger等人,Angew Chem,Int Ed Engl,35:1439-1474,1996。用于单一治疗剂治疗的这些抗癌分子的开发由于延迟的毒性而没有继续,所述延迟的毒性限制了治疗的治疗剂量范围。例如,尽管CC-1065具有高效力和广谱抗肿瘤活性,但是CC-1065存在问题,因为已经表明它在实验动物中导致延迟的死亡。Chidester等人,J Am ChemSoc,103:7629-7635,1981。然而,这些药物可以非常适于抗体靶向的化学疗法,其中受限的抗原表达使得细胞毒性剂的效能是关键的并且靶向可以避免一些毒性作用。Liu等人,Exp Opin Invest Drugs,6:169-172,1997;Chari等人,Cancer Res,55:4079-4084,1995。已经进行了很大努力来将高毒性的这些化合物靶向肿瘤块,而不伤害正常的健康细胞。研究包括TAP(肿瘤活化的前体药物)和ADEPT(抗体导向的酶前体药物治疗)方法。Zhao等人,Abstr Pap Am Chem Soc,224:147-MEDI Part 142,2002;Suzawa等人,Bioorg Med Chem,8:2175-2184,2000;Wang等人,BMCChem Biol,1:4,2001;Tietze等人,Chembiochem,2:758-765,2001;Tietze等人,Bioorg Med Chem 9:1929-1939,2001。两种方法都意在减小CC-1065或者duocarmycin类似物的细胞毒性,通过将这些分子缀合到肿瘤部位的酶的底物实现所述毒性的减小。在第一个研究中,所靶定的酶天然存在于肿瘤环境中,而在第二个研究中,当酶缀合到肿瘤特异的抗体时,该酶被带到肿瘤部位。尽管这些方法很优雅,但是它们的主要缺点是前体药物的残留细胞毒性和肿瘤细胞外面游离药物的释放。迄今为止,没有尝试通过将duocarmycin类似物缀合到抗体片段以将duocarmycin类似物特异递送到肿瘤细胞的报导。Duocarmycin,J.Antibiotics,43:1037,1990。
因此,虽然本领域中存在这些发展,但是仍然需要开发改进的治疗剂,例如,用于治疗肿瘤性疾病,例如,尤其哺乳动物和人类中的癌症和肿瘤。更特别地,治疗剂可以是可以缀合抗体的细胞毒素和相关的前体药物,它们相对于具有相似结构的已知化合物显示出作用的高度特异性、减小的毒性,和在血液中提高的稳定性。
概述
本发明一般涉及用抗体细胞毒素缀合分子治疗肿瘤性疾病的方法、合成抗体-细胞毒素缀合物分子的方法,和用作抗体-细胞毒素缀合物分子或者用于合成这些分子的化合物。使用抗体-药物缀合物可以得到本发明的益处来更有选择性地递送化学治疗剂到肿瘤细胞,通常通过细胞表面表位的识别来实现所述选择性递送。本发明提供了可行的基于抗体的治疗方法来获得人抗体,与正常细胞相比,所述抗体靶定并且可能内化肿瘤细胞上被上调的受体或者配体。一种此类受体是在一些恶性癌细胞上过表达的整联蛋白α3β1。已经鉴定了称作Pan 10的对整联蛋白ocsPi特异的人单链Fv抗体(scFv),其被人胰腺癌细胞内化。本发明的方法利用抗体将有效的细胞毒性药物以高度选择性方式定向到肿瘤,从而减小不加区别的细胞破坏。这些方法将潜在增强化学治疗剂的功效,并且还减小经常与化学治疗剂相关的副作用。
本发明提供了Pan 10上反应性硫羟基的化学引入,经修饰的scFv与有效的细胞毒性剂duocarmycin SA的马来酰亚胺衍生的类似物的特异缀合,和所得缀合物的性质。这些发现提供了证据证明Pan 10-药物缀合物保持亲本scFv的内化能力并且在体外纳摩尔浓度下显示出细胞毒性活性。Pan 10-药物缀合物可以是恶性疾病(包括黑素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤和其他涉及整联蛋白的过表达的赘生物的定向化学疗法的有希望的候选物。
在一个实施方案中,治疗哺乳动物中瘤性疾病的方法包括提供抗体-细胞毒素缀合物,该缀合物在抗体和细胞毒素之间具有酸稳定的共价键,并对所述哺乳动物施用抗体-细胞毒素缀合物,并在哺乳动物细胞内内化抗体-细胞毒素缀合物以治疗哺乳动物细胞内的瘤性疾病。
在详述的实施方案中,细胞毒素是抗肿瘤抗生素、duocarmycin、duocarmycin A、duocarmycin SA,或者其类似物。在详述的实施方案中,酸稳定的键是酰胺键。在另一详述的实施方案中,酰胺键是N-取代的酰胺键。在详述的实施方案中,抗体特异结合激活的整联蛋白受体。在另一详述的实施方案中,激活的整联蛋白受体在转移态的细胞上与相似的非转移细胞相比差别地产生。在另一详述的实施方案中,激活的整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者αvβ3整联蛋白受体。在另一详述的实施方案中,抗体是单链Fv抗体。
在另一实施方案中,瘤性疾病选自实体瘤、血液学恶性、白血病、结肠直肠癌、良性或者恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合征、子宫内膜息肉、鳞状细胞癌、头和颈的鳞状细胞癌、肝细胞癌、肝细胞癌的肝内转移、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫内膜异位、腺癌、胰腺腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或者成星形细胞瘤。
在另一实施方案中,用于治疗哺乳动物中瘤性疾病的方法包括提供抗体-细胞毒素缀合物,该缀合物在抗体和细胞毒素之间具有酸不稳定的共价键,对哺乳动物施用所述抗体-细胞毒素缀合物,并在哺乳动物的细胞内内化所述抗体-细胞毒素缀合物以治疗哺乳动物细胞内的瘤性疾病。在详述的实施方案中,细胞毒素是抗肿瘤抗生素、duocarmycin、duocarmycin A、duocarmycin SA或者其类似物。在详述的实施方案中,所述酸不稳定的共价键是腙键。在详述的实施方案中,所述抗体特异结合激活的整联蛋白受体。在另一详述的实施方案中,激活的整联蛋白受体在转移态的细胞上与相似的非转移细胞相比差别地产生。在另一详述的实施方案中,激活的整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者α3β1整联蛋白受体。在另一详述的实施方案中,抗体是单链Fv抗体。
在另一实施方案中,用于治疗哺乳动物中瘤性疾病的方法包括通过切割酸不稳定的腙键在哺乳动物细胞内内化抗体-抗肿瘤抗生素缀合物。
在另一实施方案中,合成抗体-细胞毒素缀合物分子的方法包括向一个容器中导入抗体、硫醇化试剂,和马来酰亚胺衍生的细胞毒素,并将抗体与硫醇化试剂接触形成硫醇化的抗体,并将硫醇化抗体与马来酰亚胺衍生的细胞毒素接触以形成抗体-细胞毒素缀合物分子。在详述的方面,马来酰亚胺衍生的细胞毒素包含马来酰亚胺和细胞毒素之间的酸不稳定的腙键。在另一详述的方面,马来酰亚胺衍生的细胞毒素包含马来酰亚胺和细胞毒素之间的酰胺键。在另一详述的方面,细胞毒素是抗肿瘤抗生素、duocarmycin、duocarmycin A、duocarmycin SA或者其类似物。在另一详述的实施方案中,抗肿瘤抗生素是duocarmycin SA的羰基取代的CBI-吲哚类似物。在另一详述的方面,抗肿瘤抗生素是duocarmycin SA的酰胺取代的CBI-吲哚类似物。在另一详述的方面,硫醇化试剂是2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)。在另一详述的方面,抗体是单链Fv抗体。
在另一详述的实施方案中,马来酰亚胺衍生的细胞毒素是1-[3-(N’-{1-[2-(1-氯代甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羰基)-1H-吲哚-5-基]-亚乙基}-肼基)-3-氧代-1-丙基]马来酰亚胺。在另一详述的实施方案中,马来酰亚胺衍生的细胞毒素是3-[5-[1-{3-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]丙基}吲哚-2-羰基]氨基吲哚-2-羰基]-(1-氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
在另一实施方案中,公开了式I的化合物:
其中
Q为:
每个A独立地为NR1、O或者S,条件是至少一个A是NR1;
每个B独立地为C或者N;
R1独立地为H或者-(CH2)n-N(H)R4,条件是一个R1是H并且另一个是-(CH2)n-N(H)R5;
R2是烷基;
R3是卤素;
R4是H或者-C(=O)-(CH2)m-N-马来酰亚胺;
m是2、3、4、5或者6;
n是2、3、4、5或者6;
或者其立体异构体、前体药物、可药用盐、水合物、溶剂合物、酸式盐水合物、N-氧化物或者同形结晶形式。
在详述的实施方案中,R2是C1到C6烷基。在另一详述的实施方案中,卤素是Cl、Br或者F。
在另一实施方案中,药物组合物包含至少一种可药用载体或者赋形剂和有效量的式I化合物,其中马来酰亚胺部分缀合到单链Fv抗体。在详述的方面,单链Fv抗体是针对整联蛋白受体的抗体。在另一详述的方面,整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者αvβ3整联蛋白受体。在另一详述的实施方案中,方法包括对哺乳动物施用式I的组合物。
在另一详述的实施方案中,减轻认为对用缀合duocarmycin SA的酰胺取代的CBI-吲哚类似物的抗体治疗响应的哺乳动物中疾病状态的方法包括对该哺乳动物施用治疗量的式I的组合物。在另一详述的实施方案中,疾病状态是瘤性疾病。
在另一实施方案中,化合物是3-[5-(1-(3-氨基丙基)吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
在另一实施方案中,化合物是3-[5-(1-(3-氨基丙基)吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
在另一实施方案中,化合物是3-[5-[1-{3-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]丙基}吲哚-2-羰基]氨基吲哚-2-羰基]-(1-氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
在另一实施方案中,公开了式II的化合物:
其中
Q是:
A是NH、O或者S;
Ra是H或者烷基;
Rb是H、烷基或者-C(=O)-(CH2)r-N-马来酰亚胺;
Rc是烷基;
Rd是卤素;
r是2、3、4、5或者6;
或者其立体异构体、前体药物、可药用盐、水合物、溶剂合物、酸式盐水合物、N-氧化物或者同形结晶形式。
在另一实施方案中,化合物是1-[3-(N’-{1-[2-(1-氯代甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羰基)-1H-吲哚-5-基]-亚乙基}-肼基)-3-氧代-1-丙基]马来酰亚胺。
在另一实施方案中,药物组合物包含至少一种可药用载体或者赋形剂和有效量的式II化合物,其中马来酰亚胺部分缀合到单链Fv抗体。在详述的方面,单链Fv抗体是针对整联蛋白受体的抗体。在另一详述的方面,整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者αvβ3整联蛋白受体。
在另一详述的实施方案中,方法包括对哺乳动物施用式II的组合物。
在另一详述的实施方案中,减轻对为对用缀合duocarmycin SA的羰基取代的CBI-吲哚类似物的抗体治疗响应的哺乳动物的疾病状态的方法包括对该哺乳动物施用治疗量的式II的组合物。在另一详述的方面,疾病状态是瘤性疾病。
附图简述
图1:Duocarmycin SA、CBI吲哚类似物和马来酰亚胺衍生物。
图2A-2B:纯化的Pan10和Pan10缀合物的SDS-PAGE。泳道1:Invitrogen预染色的标记;泳道2:单独的硫醇化和缀合后的Pan10;泳道3:单点硫醇化和缀合后的Pan10;泳道4:未修饰的Pan10。
带密度分析(AlphaEaseFC StandAlone Software)。带阴影的方框含有相对于对应于每个泳道中单体scFv的带的数据。
图3:共焦显微术,覆盖着用Pan 10-FM处理的SW 1990和HdFa细胞的488nm和568nm图像。(A)2小时温育后的SW 1990细胞,(B)2小时后的HdFa细胞,(C)3h后的SW 1990细胞和(D)3小时后的HdFa细胞。
图4:SW 1990的倒置显微镜图像。(A)未处理的细胞,(B)用Pan 10-FM处理的细胞,(C)用Pan10-4处理的细胞,(D)用Pan10-3处理的细胞。用scFv-药物缀合物处理的两个细胞的放大图像显示了广泛的空泡形成。
图5:Boc-保护的1的合成示意图。
发明详述
本发明一般涉及用抗体-细胞毒素缀合物分子治疗瘤性疾病的方法,合成抗体-细胞毒素缀合物分子的方法,和用作抗体-细胞毒素缀合物分子或者用于合成这些分子的化合物。含有游离硫醇的化学修饰的抗-整联蛋白α3β1 scFv Pan10可以缀合到有效的细胞毒性剂duocarmycin SA的马来酰亚胺衍生的类似物。抗体Pan10缀合物保留穿透表达整联蛋白α3β1的细胞的能力。具体地,Pan10-药物缀合物显示出在体外对胰腺癌细胞的极好的细胞毒性作用。考虑到与本文描述的游离药物相比,scFv缀合物的独特优点,该第一步是重要的,所述游离药物非常有效但是不是临床上可行的抗癌剂。缀合物可以将这些药物分子更特异地递送到表达整联蛋白α3β1的癌细胞内部并且抗体药物缀合物的有效递送将允许减小治疗性药物暴露和增强功效。使用这种策略,实验将进一步完善癌症治疗中scFv-药物设计的潜力。
已经描述了基于SW 1990人胰腺腺癌细胞系的内化的选择需要对人scFv噬菌体展示文库的生物淘选。Gao等人,J Immunol Methods,274:185-197,2003。已经产生了称作Pan10的单链Fv抗体(scFv),其当进行免疫沉淀、质谱分析和数据库检索时,发现靶定膜受体整联蛋白α3β1。因为Pan10与α3β1的特异相互作用和内化能力,Pan10 scFv可以作为载体以缀合有效的duocarmycin-SA类似物3-(5-乙酰基吲哚-2-羰基)-1-(S)-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(化合物1,图1)和3-[5-(1-(3-氨基丙基)吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(化合物2,图1)以促进过表达整联蛋白α3β1的恶性肿瘤细胞的破坏。Parrish等人,Bioorg Med Chem,11:3815-3838,2003。马来酰亚胺衍生的细胞毒素包括,但不限于,1-[3-(N’-{1-[2-(1-氯代甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羰基)-1H-吲哚-5-基]-亚乙基}-肼基)-3-氧代-1-丙基]马来酰亚胺(化合物3,图1),或者3-[5-[1-{3-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]丙基}吲哚-2-羰基]氨基吲哚-2-羰基]-(1-氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(化合物4,图1)。因此,工作着眼于下面的任务,包括:(a)将抗肿瘤药物缀合到scFv Pan10而不损害靶亲和性和内化性质,(b)设计促进药物有效附着到scFv而不损害药物的细胞毒性活性的接头,(c)寻找可靠的基于细胞的测定法以评估Pan10-药物缀合物的生物活性。本发明的化合物和方法提供了抗癌化合物的scFv-介导的、肿瘤定向递送的治疗应用。
将理解本发明不限于具体方法、试剂、化合物组分或者生物系统,它们当然可以改变。还将理解本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的,并且不意在限定。本说明书和所述权利要求中所用的单数形式“一个”和“这个”包括复数参考,除非内容明确指出。从而,例如,对“一个细胞”的参考包括两个或者更多细胞等的组合。
除非另有定义,本文所用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常,本文所用的名称和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学中的实验步骤和下面描述的杂交是本领域公知和常用的。标准技术用于核酸和肽合成。通常,根据生产商的说明书进行酶反应和纯化步骤。通常根据本领域的常规方法和多种一般性参考文献进行所述技术和步骤(一般见,Sambrook等人MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,将其引入本文作为参考),它们在该文献全文提供。本文使用的名称和下面描述的分析化学和有机合成中的实验步骤是本领域公知和常用的。标准技术或者其改进技术用于化学合成和化学分析。术语“治疗剂”意在表示一种化合物,其当以治疗有效量存在时,对哺乳动物产生所希望的治疗效果。对于治疗癌症,希望治疗剂还能够进入靶细胞。除非另外定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的相似或者等同的任何方法和材料可以用于实践本发明的测试,但是在本文描述优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明中,将使用下面的术语。
“赘生细胞”和“瘤形成”指显示出相对的自主生长的细胞,从而,它们显示出异常的生长表型,其特征是细胞增殖的明显失控。赘生细胞包括可以活跃复制或者处于暂时非复制静止状态(G1或者G0)的细胞;类似地,赘生细胞可以包括具有分化良好的表型、分化不良的表型的细胞,或者两种类型细胞的混合物。从而,并不是所有赘生细胞都一定是在给定时间点复制的细胞。定义为赘生细胞的集合由良性赘生物中的细胞和恶性(或者坦白)赘生物中的细胞组成。坦白的赘生细胞通常称作癌(上文讨论),如果来自内胚层或者外胚层组织来源,那么通常称作癌,如果来自中胚层的细胞类型,那么称作肉瘤。
已经在几种类型的转移性瘤形成疾病中观察到整联蛋白α3β1的升高的表达,所述瘤形成疾病为例如恶性黑素瘤、膀胱癌、眼睛黑素细胞和色素膜黑素瘤,和前列腺癌。已经在例如恶性乳腺癌的瘤形成疾病中观察到整联蛋白αvβ3的升高的表达。可以通过本发明的组合物治疗的瘤形成疾病的其他实例包括,但不限于,实体瘤、血液恶性、白血病、结肠直肠癌、良性或者恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合征、子宫内膜息肉、鳞状细胞癌、头和颈的鳞状细胞癌、肝细胞癌、肝细胞癌的肝内转移、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫内膜异位、腺癌、胰腺腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或者成星形细胞瘤。
术语“细胞毒素”意在指具有所希望的对癌细胞的细胞毒性效果的治疗剂。示例性细胞毒素包括,例如但不限于,考布他汀、duocarmycins、CC-1065抗肿瘤抗生素、蒽环类、和相关化合物。其他细胞毒素包括真菌毒素、蓖麻毒蛋白和其类似物,刺孢霉素、阿霉素(doxirubicin)和美登木素生物碱。
“酸稳定的共价键”指抗体和细胞毒素之间的共价键,当抗体-细胞毒素缀合物进入细胞时,例如,通过受体介导的内吞作用进入细胞时,所述共价键在细胞内环境中稳定。当抗体-细胞毒素缀合物进入细胞时,所述酸稳定的共价键通常不被切割。抗体和细胞毒素之间的酰胺键是酸稳定的共价键的实例。
“酸不稳定的共价键”指抗体和细胞毒素之间的可断裂的共价键,当抗体-细胞毒素缀合物进入细胞时,例如,通过受体介导的内吞作用进入细胞时,所述共价键在细胞内环境中不稳定。抗体和细胞毒素之间的腙键是酸不稳定的共价键的实例。
术语“标记”意在指用于表征肿瘤或者其他医学条件,例如,肿瘤的诊断、进展,和测定肿瘤细胞分泌的因子的化合物。认为标记是“诊断剂”的子集。
转移细胞上激活的整联蛋白受体的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”用于分别指使用整联蛋白受体结合或信号传递的体外和体内测定法鉴定的抑制、激活或调节分子,例如,配体、激动剂、拮抗剂,和它们的同系物和模拟物。
术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂是例如,结合、部分或者完全阻断刺激、减小、阻止、延迟激活、失活、脱敏或者下调激活的整联蛋白受体的活性的试剂,例如,拮抗剂。激活剂是例如,结合、刺激、增加、打开、活化、促进、增强激活、敏化或者上调激活的整联蛋白受体活性的试剂,例如,激动剂。调节剂包括例如,改变激活的整联蛋白受体与:结合激活剂或抑制剂、受体的蛋白质相互作用的试剂,包括蛋白质、肽、脂类、糖类、多糖或者上面的组合,例如,脂蛋白、糖蛋白,等等。调节剂包括天然发生的激活的整联蛋白受体配体的遗传修饰的形式,例如具有改变的活性,以及天然发生的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等等。
此类抑制剂和激活剂的测定法包括,例如,对表达激活的整联蛋白受体的细胞应用推定的调节剂化合物,然后测定对整联蛋白受体信号传递的功能效应,如本文所述。将用潜在激活剂、抑制剂或者调节剂处理的包含激活的整联蛋白受体的样品或者测定与没有抑制剂、激活剂或者调节剂的对照样品比较,以检查抑制程度。对照样品(未处理的抑制剂)可以分配100%的相对整联蛋白受体活性值。当相对于对照的整联蛋白受体活性值为约80%,任选50%或者25-0%时,实现激活的整联蛋白受体的抑制。当相对于对照的整联蛋白受体活性值为110%,任选150%,任选200-500%,或者1000-3000%或更高时,实现整联蛋白受体的激活。
术语“靶定基团”意在指(1)能够将其附着的实体(例如,治疗剂或者标记)定向到靶细胞,例如,特定类型的肿瘤细胞,或者(2)在靶组织,例如在肿瘤优先活化的部分。靶定基团可以是小分子,其意在包括非肽和肽。靶定基团还可以是大分子,其包括糖类、凝集素、受体、受体的配体、蛋白质,如BSA、抗体等等。
术语“可切割的基团”或者“可切割的键”意在指在体内不稳定的部分。优选地,“可切割的基团”或者“可切割的键”允许通过从缀合物的剩余部分切割标记或者治疗剂来活化所述标记或者治疗剂。可操作地定义地,接头优选在体内通过生物环境切割。切割可以来自没有限制的任何过程,例如,酶的、还原的、pH,等等。优选地,选择切割基团使得在所希望的作用部位发生活化,所述作为部位可以是靶细胞(例如,癌细胞)或者组织中或者附近的部位,如治疗作用或者标记活性的部位。此类切割是酶的和示例性可以酶促切割的基团,包括天然氨基酸或者以天然氨基酸结束的肽序列,并且在它们的羧基末端附着到接头。尽管切割速率增强的程度对于本发明不是关键的,但是可切割接头的优选实例是这样的接头,其中在施用24小时内血流中至少约10%,更优选至少约35%的可切割基团被切割。优选的可切割基团是肽键、酯键,和二硫键。
除非另外说明,术语“烷基”自身或者作为另一取代基的部分表示垂直或者分枝链,或者环状烃基,或者其组合,它们可以是完全饱和的、单不饱和或者多不饱和的,并且可以包括二价和多价原子团,具有所指定数目的碳原子(即,C1-C10指1到10个碳)。饱和烃基的实例包括,但不限于,诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体的基团。不饱和的烷基是具有一个或多个双键或者三键的基团。不饱和烷基的实例包括,但不限于,乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基,和更高级的同系物和异构体。除非另外指出,术语“烷基”也意在包括在下面更详细定义的烷基的那些衍生物,如“杂烷基”。局限于烃基的烷基称作“同烷基”(homoalkyl)。
术语“亚烷基”自身或者作为另一取代基的部分表示从烷衍生的二价基团,例如但不限于CH2CH2CH2CH2,并且还包括下文描述为“杂亚烷基”的那些基团。通常,烷基(或者亚烷基)将具有1到24个碳原子,在本发明中优选具有10个或者更少碳原子的那些基团。“低级烷基”或者“低级亚烷基”是较短链的烷基或者亚烷基,通常具有8个或者更少的碳原子。
除非另外说明,术语“杂烷基”自身或者与另一术语组合表示由所述数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或者支链,或者环状烃基,或者其组合,其中所述氮、碳和硫原子可以任选被氧化并且氮杂原子可以任选被季铵化。杂原子O、N和S和Si可以置于杂烷基的任何内部位置或者烷基附着到分子的剩余部分的位置。实例包括,但不限于,CH2CH2OCH3、CH2CH2NHCH3、CH2CH2N(CH3)CH3、-CH2SCH2-CH3、CH2CH2、S(O)CH3、CH2CH2S(O)2CH3、CH=CHOCH3、Si(CH3)3、-CH2CH=NOCH3和CH=CHN(CH3)CH3。多达两个杂原子可以是连续的,例如CH2NHOCH3和CH2OSi(CH3)3。类似地,术语“杂亚烷基”自身或者作为另一取代基的部分指从杂烷基衍生的二价基团,例如但不限于,CH2CH2SCH2CH2和CH2SCH2CH2NHCH2。对于杂亚烷基基团,杂原子还可以占据链末端之一或者两个(例如,亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基,等等)。术语“杂烷基”和“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)和其衍生物(见,例如,Shearwater Polymers Catalog,2001)。此外,对于亚烷基和杂亚烷基连接基团,连接基团的化学式书写的方向没有暗示连接基团的方向。例如,化学式C(O)2R’代表C(O)2R’和R’C(O)2。
术语“低级”与术语“烷基”或者“杂烷基”组合指具有1到6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或者硫代烷氧基)以它们的常规意义使用,并且指分别通过氧原子、氨基或者硫原子附着到分子的剩余部分的那些烷基。
通常,“酰基取代基”也选自上述基团。本文所用的术语“酰基取代基”指连接到羰基碳并且实现羰基碳的化合价的基团,所述羰基碳直接或者间接连接到本发明化合物的多环核。
除非另外指出,术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或者与其他术语组合分别表示取代或者未取代的“烷基”和取代或未取代的“杂烷基”的环状形式。此外,对于杂环烷基,杂原子可以占据杂环附着到分子的剩余部分的位置。环烷基的实例包括,但不限于,环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基,等等。杂环烷基的实例包括,但不限于,1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基,等等。环状结构的杂原子和碳原子被任选氧化。
除非另外指出,术语“卤”或者“卤素”自身或者作为另一取代基的部分指氟、氯、溴或者碘原子。此外,术语如“卤代烷基”意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如,术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于,三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基,等等。
除非另外指出,术语“芳基”指取代或未取代的多不饱和芳族烃取代基,其可以是单环或者多环(优选1到3个环),它们稠合在一起或者共价连接。术语“杂芳基”指含有选自N、O和S的1到4个杂原子的芳基(或者环),其中氮、碳和硫原子任选氧化,并且氮原子任选季铵化。杂芳基基团可以通过杂原子附着到分子的剩余部分。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、1-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基,和6-喹啉基。上面提到的芳基和杂芳基环系统的每一种的取代基选自下文描述的可接受的取代基。“芳基”和“杂芳基”还包括其中一个或多个非芳香环系统稠合或者结合到芳基或者杂芳基系统的环系统。
为了简短起见,术语“芳基”当与其他术语(例如,芳氧基、芳硫氧基、和芳基烷基)组合使用时包括如上文定义的芳基和杂芳基环。从而,术语“芳基烷基”意在包括其中芳基附着到烷基的那些原子团(例如,苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等),包括其中碳原子(例如,亚甲基)已经被例如氧原子置换的那些原子团(例如,苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等等)。
上面的术语(例如,“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)的每一种包括上面指出的基团的取代和未取代的形式。每种类型基团的优选的取代基在下文提供。
烷基和杂烷基原子团(包括通常称作亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)的取代基通常分别称作“烷基取代基”和‘杂烷基取代基“,并且它们可以是选自但不限于如下的多种基团的一种或多种:OR’、=O、=NR’、=NOR’、NR’R”、SR’、-卤素、SiR’R”R、OC(O)R’、C(O)R’、CO2R’、-CONR’R”、OC(O)NR’R”、NR”C(O)R’、NR’-C(O)NR”R、NR”C(O)2R’、NR-C(NR’R”R)=NR””、NRC(NR’R”)=NR、S(O)R’、S(O)2R’、S(O)2NR’R”、NRSO2R’、CN和NO2,所述取代基的数目为0到(2m’+1),其中m’是这种原子团中碳原子的总数。R’、R”、R和R””每一个优选地独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基,例如,用1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或者硫代烷氧基,或者芳基烷基基团。当本发明的化合物包括一个以上的R基团时,例如当存在一个以上的这些基团时,每个R基团如每个R’、R”、R和R””一样独立地选择。当R’和R”附着到相同的氮原子时,它们可以与氮原子组合形成5-、6-、或者7-元环。例如,-NR’R”意在包括但不限于,1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上面对取代基的讨论,本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括包含结合到氢以外的基团的碳原子的基团,如卤代烷基(例如,CF3和CH2CF3)和酰基(例如,C(O)CH3、C(O)CF3、C(O)CH2OCH3,等等)。
类似于关于烷基描述的取代基,芳基取代基和杂芳基取代基通常分别称作“芳基取代基”和“杂芳基取代基”并且不同和选择例如:卤素、OR’、=O、=NR’、=NOR’、NR’R”、SR’、-卤素、SiR’R”R、OC(O)R’、C(O)R’、-CO2R’、CONR’R”、OC(O)NR’R”、NR”C(O)R’、NR’C(O)NR”R、NR”C(O)2R’、NR-C(NR’R”)=NR、S(O)R’、S(O)2R’、S(O)2NR’R”、NRSO2R’、CN和NO2、R’、N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基、和氟代(C1-C4)烷基,所述取代基的数目为0到芳香环系统上开放化合价的总数;并且其中R’、R”、R和R””优选独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基,和(未取代的芳基)-氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括一个以上的R基团时,例如,例如当存在一个以上的这些基团时,每个R基团如每个R’、R”、R和R””一样独立地选择。
芳基或者杂芳基环的相邻原子上两个芳基取代基可以任选用式T-C(O)(CRR’)qU的取代基替代,其中T和U独立地为NR、O、CRR’或者单键,q为0到3的整数。备选地,芳基或者杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选用式-A-(CH2)rB的取代基替代,其中A和B独立地为CRR’、O、NR、S、S(O)、S(O)2、S(O)2NR’或者单键,并且r为1到4的整数。这样形成的新环的单键之一可以任选用双键替代。备选地,芳基或者杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选用式(CRR’)sX(CR”R)d的取代基替代,其中s和d独立地为0到3的整数,X为O、NR’、S、S(O)、S(O)2或S(O)2NR’。取代基R、R’、R”和R优选独立地选自氢或者取代或未取代的(C1-C6)烷基。
本文所用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
化合物的中性形式优选通过将盐与碱或者酸接触并以常规方式分离亲本化合物来再生。化合物的亲本形式与多种盐在一些生理性质(如极性溶剂中的溶解度)不同,但是对于本发明的目的,所述盐与化合物的亲本形式等同。
除了盐形式,本发明还提供了前体药物形式的化合物。本文描述的化合物的前体药物为在生理条件下容易经历化学改变以提供本发明化合物的那些化合物。此外,通过化学或者生物化学方法,前体药物可以在离体(exvivo)环境转化为本发明的化合物。例如,前体药物当置于经皮贴剂贮库时,可以用合适的酶或者化学试剂缓慢转化成本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式,包括水化形式存在。通常,溶剂化形式等同于非溶剂化形式并且包括在本发明的范围内。本发明的一些化合物可以以多种结晶或者无定形形式存在。通常,所有物理形式对于本发明预期的用途是等同的并且预期包括在本发明的范围内。本发明的化合物还可以含有在组成此类化合物的一个或多个原子上非天然比例的原子同位素。例如,化合物可以周放射性同位素,如氚(3H)、碘-125(125I)或者碳-14(14C)进行放射性标记。本发明化合物的所有同位素变化不管是放射性还是非放射性的,都预期包括在本发明的范围内。
术语“附着部分”或者“用于附着到靶定基团的部分”指允许靶定基团附着到接头的部分。作为阐明并且不作为限定,典型的附着基团包括烷基、氨基烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、羟基烷基、烷基-马来酰亚胺、烷基-N-羟基琥珀酰亚胺、聚(乙二醇)-马来酰亚胺和聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺,它们都可以被进一步取代。接头还可以具有实际上附着到靶定基团的附着部分。
本文所用的术语“离去基团”指底物的一部分,其在反应中从底物切除。
本文所用的“固相支持体”指在所选的溶剂系统中基本上不溶或者可与溶解它的所选溶剂系统容易地分离(例如,通过沉淀)的材料。用于实践本发明的固相支持体可以包括被活化或者能够活化以允许所选的种类结合到固相支持体的基团。固相支持体还可以是基质,例如,芯片、薄片或者孔,其上结合一种或者一种以上的本发明化合物。
本文所用的“反应性官能团”指包括但不限于如下的基团:烯烃、乙炔、醇、酚类、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸盐、异氰酸盐、异硫氰酸盐、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮化、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酐、硫酸盐、次磺酸、异腈、脒、二酰亚胺、亚氨酸盐(imidate)、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化物,和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些官能团,例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等等(见例如,Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic press,SanDiego,1996)。制备这些官能团每一种的方法是本领域公知的并且它们的应用或者为了特定目的进行的修改也是本领域技术人员能力范围之内的(见,例如,Sandler和Kara,编辑,ORGANIC FUNCTIONAL GROUPPREPARATIONS,Academic Press,San Diego,1989)。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或者双键;外消旋物、非对映体、几何异构体和个别异构体包括在本发明的范围内。将本发明的化合物制备为一种异构体(例如,对映异构体、顺反异构体、位置异构体、非对映体)或者异构体的混合物。在优选实施方案中,将化合物制备为基本上一种异构体。制备基本上异构纯的化合物的方法是本领域已知的。例如,通过使用对映异构纯的合成中间体结合在手性中心立体化学保持不改变的反应或者导致它的完全反转的反应可以制备对映异构富集的混合和纯的对映异构化合物。备选地,沿着合成途径的最终产物或者中间产物可以拆分成一种立体异构体。用于反转特定手性中心或者使该手性中心不变的技术和用于拆分立体异构体混合物的技术是本领域公知的并且选择用于特定情况的合适方法在本领域技术人员能力范围之内。一般见,Fumiss等人(编著),VOGEL′S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANICCHEMISTRY第五版,Longman Scientific and Technical Ltd.,Essex,1991,pp.809-816;和Heller,Ace.Chem.Res.23:128(1990)。
免疫毒素
本发明涉及合成抗体-细胞毒素缀合物分子的方法,和用作抗体-细胞毒素缀合物分子或者免疫毒素或者用于合成这些分子的化合物。本发明还涉及抗体,如免疫毒素的免疫化学衍生物。携带合适的效应子功能,如具有它们的恒定结构域的抗体也用于诱导通过天然补体过程的裂解,和与通常存在的依赖抗体的细胞毒性细胞的相互作用。例如,纯化的、无菌过滤的抗体任选缀合到细胞毒素,如duocarmycin,以用于癌症治疗。本发明的方法例如适于得到人源化抗体以用作用于癌症治疗的免疫毒素。
本发明的方法提供了抗体-细胞毒素缀合物分子,其利用抗体将有效的细胞毒素药物以高度选择性的方式定向到肿瘤,从而,减小不加区别的细胞破坏。这些方法将潜在地增强通常与化学治疗剂有关的副作用的功效和减小该副作用。
免疫毒素的细胞毒性部分可以是细胞毒性药物或者细菌、真菌、植物或者动物来源的酶活性毒素,或者这种毒素的酶活性片段。酶活性毒素和其片段包括,但不限于,duocarmycin和其类似物。酶活性毒素和其片段还包括,但不限于,白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风素毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和tricothecens。
当抗体缀合到小分子抗癌药物,如顺铂或者5-氟尿嘧啶时,形成“抗体-细胞毒素缀合物”。使用多种双功能蛋白质偶联剂可以制备单克隆抗体和此类细胞毒素部分的缀合物。此类试剂的实例为SPDP、IT、亚氨酸酯的双功能衍生物,如己二亚氨二盐酸二甲酯(dimethyl adipimidate HCl)、活性酯,如辛二酸二琥珀酰亚胺酯、醛,如戊二醛、二-叠氮化合物,如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺、二-重氮衍生物,如二-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺、二异氰酸酯,如2,6-二异氰酸根合甲苯、和生物活性氟化合物,如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。毒素的裂解部分可以连接到抗体的Fab片段。
可以用如本文讨论的多种方法制备免疫毒素。通常已知的交联试剂可以用于产生稳定的缀合物。
有利地,特异结合暴露在受感染的细胞表面的抗原的结构域的单克隆抗缀合到蓖麻毒蛋白A链。最有利地,蓖麻毒蛋白A链是去糖基化的并且通过重组方法产生。制备蓖麻毒蛋白免疫毒素的有利的方法在Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中描述。
当用于在体外杀死人细胞用于诊断用途时,缀合物将通常以至少约10nM的浓度加入细胞培养基。用于体外使用的制剂和施用方式不是关键的。将通常使用与培养基或者灌流介质相容的水性制剂。可以通过常规技术读出细胞毒性。
用于治疗受感染的细胞的细胞毒性放射性药物可以通过将放射性同位素(例如,I、Y、Pr)缀合到抗体产生。有利地,使用发射α粒子的同位素。本文使用的术语“细胞毒性部分”意在包括此类同位素。
在另一实施方案中,用Fab或者F(ab’)2片段制备毒素-缀合物。因为它们相对较小的尺寸,这些片段可以更好地穿透组织以到达受感染的细胞。
在另一实施方案中,将融合脂质体填充细胞毒性药物并且将脂质体用特异结合特定抗原的抗体包被。
抗体和它们的用途
“抗体”指多肽,其包含来自免疫球蛋白基因的构架区或者其特异结合和识别抗原的片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及无数的免疫球蛋白可变区基因。将轻链分类成κ或λ。将重链分类成γ、μ、α、δ或ε,其又分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常,抗体的抗原结合区将是结合的特异性和亲和性中最关键的。
本发明还涉及特异结合本发明的多肽的抗体和T-细胞抗原受体(TCR)。本发明的抗体包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或者IgM和IgY。本文所用的术语“抗体”(Ab)意在包括完整抗体,包括单链完整抗体,和其抗原结合片段。最优选地,抗体是本发明的人抗原结合抗体片段并且包括但不限于,Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或者VH结构域的片段。抗体可以来自任一动物来源,包括鸟类和哺乳动物。优选地,抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或者鸡的。
抗原-结合抗体片段,包括单链抗体,可以包含仅可变区或者组合下面的全部或者部分:铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任一组合。本发明还包括特异结合本发明的多肽的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和人单克隆抗体和人多克隆抗体。本发明还包括为本发明抗体的抗独特型的抗体。
本发明的抗体可以是单特异的、双特异的、三特异的或者更高的多特异性。多特异性抗体可以对本发明的多肽的不同表位特异或者可以对本发明的多肽以及异源组合物,如异源多肽或者固相支持体材料特异。见,例如,WO 93/17715;WO 92/08802;WO 91/00360;WO 92/05793;Tutt等人,J.Immunol.147:60-69,1991;美国专利号5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648,将它们完整地并且为了所有目的引入本文作为参考;Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553,1992。
完整“抗体”包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或者VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域:CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或者VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成高变区,称作互补性决定区(CDR),其散布着更保守的称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或者因子的结合,所述因子包括免疫系统的多种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一种组分(CIq)。术语抗体包括完整抗体的抗原结合部分,其保留结合激活的整联蛋白受体的能力。结合的实例包括(i)Fab片段,其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。
“分离的”抗体是已经鉴定并从其天然环境的组分分离和回收的抗体。它的天然环境的污染性组分是将干扰抗体的诊断或者治疗用途的物质,并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或者非蛋白质性溶质。在优选实施方案中,抗体将被纯化(1)到如通过Lowry方法测定的按抗体重量计大于95%,最优选按重量计大于99%,(2)到通过使用转杯式测序仪足够得到N-末端或者内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,或者(3)到通过SDS-PAGE在还原条件或者非还原条件下使用考马斯蓝或者优选地使用银染得到同质性。分离的抗体包括重组的15个细胞内原位抗体,因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而,通常,通常将通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
“单链抗体”或者“单链Fv(scFv)”指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。尽管Fv片段两个结构域VL和VH不同的基因编码,但是它们可以用重组方法通过合成的接头结合,所述接头使得它们成为一条蛋白质链,其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv);见例如,Bird等人,Science 242:423-426,1988;和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,85:5879-5883,1988)。此类单链抗体由术语“抗体”片段包括并且可以通过重组技术或者完整抗体的酶促或者化学断裂来制备。
“人序列抗体”包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(如果存在)的抗体。本发明的人序列抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或者位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变导入的突变)。此类抗体可以在非人转基因动物中产生,如PCT公布号WO 01/14424和WO 00/37504中描述。然而,本文所用的术语“人序列抗体”不意在包括这样的抗体,其中来自另一哺乳动物物种,如小鼠的种系的CDR序列已经移植到人构架序列(例如,人源化抗体)。
而且,可以产生重组免疫球蛋白。见,完整地并且为了所有目的引入本文作为参考的Cabilly,美国专利号4,816,567;和Queen等人,Proc.NatlAcad.Sci USA 86:10029-10033,1989。
“单克隆抗体”指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组分显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此,术语“人单克隆抗体”指显示出单一结合特异性的抗体,其具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(如果存在)。在一个实施方案中,通过杂交瘤产生人单克隆抗体,所述杂交瘤包括来自转基因非人动物,例如转基因小鼠的B细胞,具有包含融合到永生化细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来自单个克隆(包括任何真核、原核或者噬菌体克隆)的抗体,而不是产生它的方法。可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体,包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。
“多克隆抗体”指针对细胞表面受体,例如,人激活的整联蛋白受体的一种以上(两种或多种)不同抗体的制备物。此类制备物包括结合一系列不同表位的抗体。
“嵌合抗体”为使用重组DNA技术将来自一个物种(通常为小鼠)的单克隆抗体的Fc恒定区用来自另一物种(通常为人)的抗体的Fc区置换的抗体。例如,将编码鼠单克隆抗体的cDNA用所选的限制性酶消化以特异除去编码Fc恒定区的序列,并用编码人Fc恒定区的cDNA的等同部分替代(见Robinson等人,PCT/US86/02269;Akira等人,欧洲专利申请184,187;Taniguchi,欧洲专利申请171,496;Morrison等人,欧洲专利申请173,494;Neuberger等人,WO 86/01533;Cabilly等人.美国专利号4,816,567;Cabilly等人,欧洲专利申请125,023;Better等人(1988)Science 240:1041-1043;Liu等人(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84:3439-3443;Liu等人(1987)JImmunol 139:3521-3526;Sun等人(1987)Proc Natl Acad Sci USA84:214-218;Nishimura等人(1987)Cancer Res 47:999-1005;Wood等人(1985)Nature 314:446-449;和Shaw等人(1988)J Natl Cancer Inst80:1553-1559)。
CDR-移植的抗体是这样的抗体,其中所称作的“受体”抗体的至少一个CDR被具有所希望的抗原特异性的所称作的“供体”抗体的CDR“移植物”置换。通常,供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体;通常,受体抗体是人抗体(以使得它在人中的抗原性最小),在该情况中,所得的CDR移植的抗体称作“人源化”抗体。移植物可以是受体抗体的单个VH或者VL内的单个CDR(或者甚至单个CDR的部分),或者可以是VH和VL之一或者两者内的多个CDR(或者其部分)。通常,受体抗体的所有可变结构域中的所有三个CDR将被对应的供体CDR置换,尽管仅需要置换必要的CDR以允许所得CDR移植的抗体与MetAp3的充分结合。产生CDR移植的和人源化抗体的方法由Queen等人US 5,585,089、US 5,693,761和US5,693,762;和Winter US 5,225,539教导,将它们的内容都引入本文作为参考。
该方法通常不改变移植的CDR侧翼的受体抗体的FR。然而,有时可以提高所得CDR移植的抗体的抗原结合亲和力,这可通过置换给定FR的某些残基以使得FR与供体抗体的对应的FR更相似的来完成。优选的替换位置包括与CDR相邻的氨基酸残基,或者能够与CDR相互作用的氨基酸残基(见,例如,US 5,585,089,特别是12-16栏)。或者可以以供体FR开始并将其修饰以与受体FR或者人共有FR更相似。产生这些修饰的技术是本领域已知的。具体地,如果所得FR对于该位置满足人共有FR,或者与这种共有FR有至少90%或者更高同一性,那么与具有完整人FR的相同抗体相比,这样做不能显著增加所得修饰的抗体的抗原性。本文所用的术语“共有序列”指在相关序列家族中从最频繁发生的氨基酸(或者核苷酸)形成的序列(见,例如,Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。在蛋白质家族中,共有序列中的每个位置被在该家族中该位置最通常发生的氨基酸占据。如果两个氨基酸以相同频繁发生,那么任一个都可以包括在共有序列中。“共有FR”指共有免疫球蛋白序列中的FR。
针对激活的整联蛋白受体的抗体可以结合人激活的整联蛋白受体上的表位,以便抑制激活的整联蛋白受体与反受体或者共同受体的相互作用。适于用于本发明的这些和其他抗体可以根据本领域公知的方法制备和/或在本文引用的参考文献中描述。在优选实施方案中,用于本发明的抗激活的整联蛋白受体的抗体是“人抗体”,例如,从人分离的抗体-或者它们是“人序列抗体”(上文定义)。
本发明的抗体可以按照本发明多肽的表位或者部分来描述或者说明,所述表位或者部分被抗体识别或者特异结合。表位或者多肽部分可以如本文描述的说明,例如,通过N-末端和C-末端位置,通过连续氨基酸残基的大小来说明。还可以排除特异结合本发明的任一表位或者多肽的抗体。因此,本发明包括特异结合本发明的多肽的抗体,并且允许排除所述抗体。
“表位”指能够特异结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子(如氨基酸或者糖侧链)的化学活性表面定组组成并且通常具有特定的三维结构特征,以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下,对构象表位的结合丧失,但是对非构象表位的结合不丧失。
α3β1的优选表位位于折叠蛋白质的表面上,例如,亲水区,以及具有高抗原性的区域。例如,人α3β1序列的Emini表面概率分析可以用于指出定位于蛋白质表面的具有尤其高概率从而可能组成用于靶定抗体生产的表位的区域。
本发明的抗体还可以按照它们的交叉反应性描述或者说明。包括不结合本发明多肽的任何其他类似物、直向同源物或者同源物的抗体。本发明还包括不结合与本发明的多肽具有小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%、小于50%同一性(如使用本领域已知和本文描述的方法计算)的多肽的抗体。本发明还包括仅结合这样的多核苷酸编码的多肽的抗体,所述多核苷酸在严格杂交条件(如本文所述)下与本发明的多核苷酸杂交。本发明的抗体还可以按照它们的结合亲和性描述或者说明。优选的结合亲和性包括解离常数或者Kd小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、和10-15M的结合亲和性。
针对本发明的激活的整联蛋白受体的抗体的用途包括,但不限于,本领域已知的用于纯化、检测和靶定本发明的多肽的方法,包括体外和体内诊断和治疗方法。例如,抗体可以用于定性和定量测量生物样品中本发明的多肽的免疫测定。见,例如,Harlow&Lane,上文,将其为了所有目的完整引入本文作为参考。
本发明的抗体可以单独或者与其他组合物组合使用。抗体还可以与异源多肽在N-或者C-末端重组融合或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)多肽或者其他组分。例如,本发明的抗体可以重组融合或者缀合到用作检测测定中的标记的分子和效应分子,如异源多肽、药物或者毒素。见,例如,WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、美国专利号5,314,995和EP 0396 387,将它们为了所有目的完整引入本文作为参考。
本发明还包括组合物,其包含与不同于可变区的抗体结构域融合或者缀合的本发明的多肽。例如,本发明的多肽可以融合或者缀合抗体Fc区,或者其部分。与本发明的多肽融合的抗体部分可以包含铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域或者完整结构域或者其部分的任一组合。使用本文已知的方法,本发明的多肽可以融合或者缀合到上面的抗体部分以增加多肽的体内半寿期或者用于免疫测定法。多肽还可以融合或者缀合到上面的抗体部分以形成多聚体。例如,融合本发明多肽的Fc部分可以通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。通过多肽与IgA和IgM的部分的融合可以得到更高的多聚体形式。将本发明的多肽融合或者缀合到抗体部分的方法是本领域已知的。见,例如,美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,112,946、EP 0 307 434、EP 0 367 166、WO 96/04388、WO 91/06570,将它们为了所有目的完整引入本文作为参考;Ashkenazi等人,PNAS,88:10535-10539,1991;Zheng等人,J.Immunol.,154:5590-5600,1995;和Vil等人,PNAS,89:11337-11341,1992。
本发明还涉及作为本发明多肽的激动剂或者拮抗剂的抗体。例如,本发明包括部分或者完全破坏受体/配体与本发明的多肽相互作用的抗体。包括受体特异性抗体和配体特异性抗体。包括不阻止配体结合但是阻止受体活化的受体特异性抗体。可以通过本文描述的或者本领域已知的技术测定受体活化(即,信号传递)。还包括阻止配体结合和受体活化的受体特异性抗体。
同样包括中和抗体,其结合配体并阻止配体与受体的结合,以及结合配体从而阻止受体活化但是不阻止配体结合受体的抗体。“中和抗体”指能够消除或者显著降低它结合的靶抗原的效应功能的抗体分子。因此,“中和”抗靶标抗体能够消除或者显著降低效应功能如酶活性、配体结合或者细胞内信号传递。
还包括活化受体的抗体。这些抗体可以作为通过配体介导的受体活化实现的全部或者少于全部生物活性的激动剂。抗体可以描述为生物活性的激动剂或者拮抗剂,所述生物活性包括本文公开的特定活性。上面的抗体激动剂可以使用本文已知的方法制备。见,例如,WO 96/40281、美国专利号5,811,097,将其为了所有目的完整引入本文作为参考;Deng等人,Blood 92:1981-1988,1998;Chen等人,Cancer Res.,58:3668-3678,1998;Harrop等人,J.Immunol.161:1786-1794,1998;Zhu等人,Cancer Res.,58:3209-3214,1998;Yoon等人,J.Immunol.,160:3170-3179,1998;Prat等人,J.Cell.Sci.,111:237-247,1998;Pitard等人,J.Immunol.Methods,205:177-190,1997;Liautard等人,Cytokinem,9:233-241,1997;Carlson等人,J.Biol.Chem.,272:11295-11301,1997;Taryman等人,Neuron,14:755-762,1995;Muller等人,Structure,6:1153-1167,1998;Bartunek等人,Cytokines,8:14-20,1996。如上文讨论,使用本领域技术人员公知的方法,针对转移细胞上的激活的整联蛋白受体的抗体又可以用于产生抗独特型抗体,其“模拟”本发明的多肽。(见例如,Greenspan等人,FASEB J.7:437-444,1989和Nissinoff,J.Immuno1.147:2429-2438,1991)。例如,结合并且竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明的多肽与配体结合的抗体可以用于产生抗独特型,其“模拟”多肽多聚化和/或结合结构域并且,因此,结合并中和多肽和/或其配体。此类中和抗独特型或者此类抗独特型的Fab片段可以用于治疗方案以中和多肽配体。例如,此类抗独特型抗体可以用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体,从而阻断其生物活性。
抗体制备和产生
本发明的产生抗体或者抗体片段的方法通常包括用纯化的α3β1或者用表达α3β1的细胞免疫受试者(通常非人受试者,如小鼠或者兔)。该多肽的任何免疫原性部分可以用作免疫原。
通常,免疫原将长为至少为8个氨酰基残基,优选至少10个氨酰基残基。给定表位的多聚体有时比单体更有效。如果需要,通过融合或者缀合到半抗原如匙孔血蓝蛋白(KLH)可以增加多肽的免疫原性。许多此类半抗原是本领域已知的。备选地或者额外地,可以组合多肽与常规佐剂,如弗氏完全或不完全佐剂,以增强受试者对该多肽的免疫反应。这些技术是本领域中标准的。
合适的免疫后,可以从受试者的血清制备结合α3β1的多克隆抗体,或者可以用常规方法从受试者的脾脏制备表达单克隆抗体的杂交瘤。见,例如,Milstein等人(Galfre和Milstein,Methods Enzymol(1981)73:3-46)。用标准方法筛选杂交瘤将产生不同特异性(例如,对不同的表位)和亲和性的单克隆抗体。具有所希望的性质的所选单克隆抗体可以以杂交瘤表达的抗体使用,它可以结合到诸如聚乙二醇(PEG)的分子以改变其性质,或者可以分离编码它的cDNA,测序并以多种方法操作。此类操作的实例在CDR移植和FR修饰的上下文中讨论。其他操作包括替代或者缺失在保存或者施用于患者后造成抗体的不稳定性的特定氨酰基残基,和用于提高抗体对MetAp3的亲和力的亲和性成熟技术。
还可以使用本领域已知的重组技术产生单克隆抗体。例如,可以分离编码抗体的区域的核酸群体。利用来自编码抗体的保守区的序列的引物,用PCR扩增编码来自所述群体的抗体的部分,然后从扩增的序列重建编码抗体或者其片段(如可变结构域)的DNA。此类扩增的序列还可以融合到编码其他蛋白质(例如噬菌体外壳,或者细菌细胞表面蛋白)的DNA,以表达和在噬菌体或者细菌上展示融合多肽。然后可以表达扩增的序列并基于例如所表达的抗体或者其片段对抗原或者表位的亲和性进一步选择或分离。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员公知的。
杂交瘤技术包括本领域已知的和在Harlow&Lane,上文;Hammerling等人,Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas,563-681,1981中教导的技术,所述参考文献完整引入本文作为参考。可以通过蛋白水解切割,使用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或者胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)来产生Fab和F(ab’)2片段。
备选地,通过应用重组DNA和噬菌体展示技术或者合成化学,使用本领域已知的方法产生针对激活的整联蛋白受体的抗体。例如,用本领域已知的多种噬菌体展示方法可以制备本发明的抗体。在噬菌体展示方法中,功能抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。通过用抗原直接选择,通常用结合或者捕获到固体表面或者小珠的抗原选择,从所有组成成分或者组合抗体文库(例如,人或者鼠)选择具有所希望的结合性质的噬菌体。用于这些方法的噬菌体通常是丝状噬菌体,包括fd和M13,其具有重组融合到噬菌体基因III或者基因VIII蛋白质的Fab、Fv或者二硫键稳定的Fv抗体结构域。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman等人,J.Immunol.Methods 182:41-50,1995;Ames等人,J.Immunol.Methods 184:177-186,1995;Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958,1994;Persic等人,Gene187:9-18,1997;Burton等人,Advances in Immunology 57:191-280,1994;PCT/GB91/01134;WO 90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO92/18619;WO 93/11236;WO 95/15982;WO 95/20401;和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743中公开的方法,将它们为了所有目的完整引入本文作为参考。
如在上面参考文献中描述的,噬菌体选择后,可以从噬菌体分离抗体编码区并用于产生完整抗体,包括人抗体,或者任何其他希望的抗原结合片段,并在任何希望的宿主中表达,所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母,和细菌。例如,使用本领域已知的方法,如WO 92/22324;Mullinax等人,BioTechniques 12:864-869,1992;和Sawai等人,AJRI 34:26-34,1995;和Better等人,Science 240:1041-1043,1988中公开的方法,还可以使用重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2的技术。
可以用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括美国专利号4,946,778和5,258,498中描述的技术,将它们为了所有目的完整引入本文作为参考;Huston等人,Methods in Enzymology,203:46-88,1991;Shu,L等人,PNAS 90:7995-7999,1993;和Skerra等人,Science 240:1038-1040,1988。对于所述用途,包括人体中抗体的体内应用和体外检测测定法,可以优选使用嵌合的、人源化的或者人抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。见例如,Morrison,Science 229:1202,1985;Oi等人,BioTechniques4:214,1986;Gillies等人,J.Immunol.Methods,125:191-202,1989;和美国专利号5,807,715。可以用多种技术人源化抗体,所述技术包括CDR移植(EP 0 239 400;WO 91/09967;美国专利号5,530,101;和5,585,089),贴面(veneering)或者表面重建(EP 0 592 106;EP 0 519 596;Padlan E.A.,Molecular Immunology,28:489-498,1991;Studnicka等人,ProteinEngineering 7:805-814,1994;Roguska等人,PNAS 91:969-973,1994)和链改组(美国专利号5,565,332)。通过本领域已知的多种方法,包括上述噬菌体展示方法,可以制备人抗体。也见美国专利号4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318;和WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741,为了所有目的将它们完整引入本文作为参考。
本发明还包括重组融合或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)本发明多肽的抗体。抗体可以对不同于本发明的多肽的抗原特异。例如,通过将本发明的多肽融合或者缀合到对特定细胞表面受体特异的抗体,抗体可以用于在体外或体内将本发明的多肽靶向特定细胞类型。使用本领域已知的方法,融合或者缀合本发明多肽的抗体还可以用于体外免疫测定法和纯化方法。见例如,Harbor等人,上文和WO 93/21232;EP 0 439 095;Naramura等人,Immunol.Lett.39:91-99,1994;美国专利号5,474,981,将其为了所有目的完整引入作为参考;Gillies等人,PNAS 89:1428-1432,1992;Fell等人,J.Immunol.146:2446-2452,1991。
scFV噬菌体文库
用于噬菌体展示文库的一种方法是鉴定抗体组分,其用作用于治疗瘤性疾病的抗体-细胞毒素缀合分子,其特异结合转移细胞上的细胞表面受体,例如,激活的整联蛋白受体。已经使用了scFv噬菌体文库(见,例如,Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883,1988;Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,87:1066-1070,1990)。已经描述了在噬菌体外壳蛋白质上展示了scFv文库的多种实施方案。噬菌体文库方法的完善也是已知的,例如,如WO96/06213和WO92/01047(Medical ResearchCouncil等人)和WO97/08320(Morphosys)所述,将其引入本文作为参考。Fab文库的展示也是已知的,如WO92/01047(CAT/MRC)和WO91/17271(Affymax)中所述。
克隆到展示载体的杂种抗体或者杂种抗体片段可以对与转移细胞结合的合适的抗原选择,例如,对转移的肿瘤细胞上细胞表面受体或者活化的细胞表面受体选择,以便鉴定保持良好结合活性的变体,因为抗体或者抗体片段将存在于噬菌体或者噬菌粒颗粒的表面上。见例如,Barbas III等人,Phage Display,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001,将其内容引入本文作为参考。例如,对于Fab片段的情况,轻链和重链Fd产物处于lac启动子的控制下,并且每条链具有与它融合的前导信号以便导向细菌宿主的周质空间。在该空间中,抗体片段将能够正确地装配。重链片段表达为与噬菌体外壳蛋白结构域的融合,其允许装配的抗体片段掺入到新产生的噬菌体或者噬菌粒颗粒的外壳中。新噬菌体颗粒的产生需要加入含有所有必要噬菌体基因的辅助噬菌体。一旦在噬菌体或者噬菌粒表面呈递抗体片段的文库,接着进行称作淘选的方法。该方法中,1)在噬菌体或者噬菌粒颗粒的表面上展示的抗体结合所希望的抗原;ii)洗除非结合者;iii)从抗原洗脱结合的颗粒;和iv)将洗脱的颗粒暴露于新的细菌宿主以便扩增富集的库用于额外一轮选择。通常,在筛选抗体克隆的特定结合之前,进行三或者四轮淘选。以这种方法,噬菌体/噬菌粒颗粒允许结合表型(抗体)与基因型(DNA)的关联,使得利用抗体展示技术非常成功。然而,其他载体形式可以用于该人源化方法,如将抗体片段文库克隆到裂解噬菌体载体(修饰的T7或者Lambda Zap系统)用于选择和/或筛选。
选择所希望的杂种抗体和/或杂种抗体片段后,预期它们可以通过本领域已知的技术,例如,原核或真核细胞表达等等以大体积产生。例如,可以使用常规技术产生杂种抗体或者片段以构建表达载体,其编码抗体重链,其中CDR和如果必要,保持最初物种抗体结合特异性所需的可变区构架的最小部分(如根据本文描述的技术工程化)来自最初的物种抗体并且抗体的剩余部分来自目标物种免疫球蛋白,其可以如本文描述的进行操作,从而产生用于表达杂种抗体重链的载体。
在详述的实施方案中,可以从5、10、15、或者20或者更多患有不同癌症疾病的患者的外周血淋巴细胞制备单链Fv(scFv)抗体文库。然后通过使用合成的唾液酸基Lewisx和LewisxBSA缀合物选择完全人高亲和性scFv抗体。在一个实施方案中,如通过ELISA、BIAcore和流式细胞术所证明,这些人scFv抗体对唾液酸基Lewisx和Lewisx特异,结合胰腺腺癌细胞的细胞表面。核苷酸测序揭示得到至少四种独特的scFv基因。Kd值为1.1到6.2×10-7M,与来自再次免疫应答的mAb的亲和力相当。这些抗体可以是探测糖类抗原的结构和功能和在人类瘤性疾病的治疗中有价值的试剂。Mao等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.96:6953-6958,1999。
在进一步详述的实施方案中,噬菌体展示的组合抗体文库可以用于产生和选择针对与转移细胞结合的合适的抗原的抗体,所述抗原为例如转移的肿瘤细胞上细胞表面受体或者活化的细胞表面受体。噬菌体外壳蛋白pVII和pIX可以用于展示抗体Fv区的异源二聚体结构。该技术的方面已经延伸到构建在丝状噬菌体的pIX上展示的4.5×109个成员的大的人单链Fv(scFv)文库。此外,通过针对六种不同的蛋白质抗原选择scFv克隆,阐明了文库的多样性、质量和效用。值得注意的,90%以上的所选克隆在少至三轮的淘选后显示出对它们的各自抗原的阳性结合。还发现所分析的scFvs具有高亲和性。例如,动力学分析(BIAcore)揭示针对葡萄球菌肠毒素B和霍乱毒素B亚基的scFvs分别具有纳摩尔和亚纳摩尔解离常数,提供了与从免疫得到的mAb相当或者超过所述mAb的亲和力。还在非常不同的蛋白质之间,而且对于更密切相关的蛋白质(例如,蓖麻(“蓖麻毒蛋白”)凝集素(RCA60和RCA120),尽管两者之间具有大于80%的序列同源性)之间得到了高特异性。结果提示pIX展示文库的性能可能超过pIII-展示形式的性能,并且使得它理想地适于淘选多种靶抗原。Gao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12612-12616,2001。
抗体或者其他结合剂和抗原之间的特异结合指至少10-6M的结合亲和性。优选的结合剂以至少约10-7M,更优选10-8M到10-9M、10-10M、10-11M或者10-12M的亲和性结合。
免疫应答
“免疫细胞应答”指免疫系统细胞对外部或者内部刺激(例如,抗原、细胞表面受体、激活的整联蛋白受体、细胞因子、趋化因子和其他细胞)应答,在免疫细胞中产生生物化学改变,导致免疫细胞迁移、靶细胞杀死、吞噬作用、抗体、免疫应答的其他可溶性效应子的产生,等等。
“免疫应答”指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上面的细胞或者肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的协调作用,其导致对癌性细胞、转移性肿瘤细胞、恶性黑素瘤、侵入病原体、受病原体感染的细胞或者组织的选择性损害、破坏,或者清除,或者对于自身免疫或者病理性炎症,对正常人细胞或者组织的选择性损害、破坏,或者清除。
本文所用的“淋巴细胞”具有本领域的通常的含义,并且指在血液、淋巴和淋巴样组织中发现的任何单核细胞、非吞噬淋巴细胞,例如,B和T淋巴细胞。
“T淋巴细胞应答”和“T淋巴细胞活性”在本文可互换使用,指依赖于T淋巴细胞的免疫应答的组分(例如,T淋巴细胞增殖和/或分化成辅助细胞、细胞毒性杀伤细胞,或者抑制性T淋巴细胞,辅助T淋巴细胞为B淋巴细胞提供导致或者阻止抗体产生的信号,细胞毒性T淋巴细胞对特定靶细胞的杀伤,和调节其他免疫细胞功能的的可溶性因子,如细胞因子的释放)。
可以通过本领域技术人员公知的多种方法在体外检测免疫应答的组分。例如,(1)可以将细胞毒性T淋巴细胞与放射性标记的靶细胞温育并通过放射性的释放检测这些靶细胞的裂解,(2)可以将辅助T淋巴细胞与抗原和抗原呈递细胞温育并通过标准方法(Windhagen A;等人,Immunity,2:373-80,1995)测量细胞因子的合成和分泌,(3)可以将抗原呈递细胞与完整蛋白质抗原温育并通过T淋巴细胞活化测定法或者生物物理方法(Harding等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:4230-4,1989)检测MHC上抗原的呈递,(4)可以将肥大细胞与交联它们的Fc-ε受体的试剂温育并通过酶免疫测定法测量组胺释放(Siraganian等人,TIPS,4:432-437,1983)。
类似地,还可以通过本领域技术人员公知的多种方法检测模式生物(例如,小鼠)或者人类患者中免疫应答的产物。例如,(1)通过临床实验室中当前使用的标准方法,如ELISA,可以容易地检测应答接种的抗体产生;(2)可以通过皮肤表面的划痕并放置无菌容器来捕获划痕部位上的迁移细胞来检测免疫细胞向炎症部位的迁移(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988);(3)应答促分裂素或者混合的淋巴细胞反应中外周血单核细胞的增殖可以用3H-胸苷测量;(4)通过将PBMC与标记的颗粒一起放置在孔中可以测量PBMC中粒细胞、巨噬细胞和其他巨噬细胞的吞噬能力(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988);和(5)通过用针对CD分子(如CD4和CD4)的抗体标记PBMC并测量表达这些标记的PBMC的级分来测量免疫系统细胞的分化。
为了方便起见,免疫应答通常在本文中描述为“初次”或者“再次”免疫应答。初次免疫应答也描述为“保护性”免疫应答,指由于某种最初暴露(例如,最初“免疫”)于特定抗原,例如,细胞表面受体,或者激活的整联蛋白受体,在个体中产生的免疫应答。此类免疫接种可以例如由于某种自然暴露于抗原(例如,显示或者呈递该抗原的某种病原体的最初感染)或者个体中某种肿瘤的癌细胞(例如,恶性黑素瘤)呈递的抗原而发生。备选地,可以由于用含有抗原的疫苗接种个体而发生免疫接种。例如,疫苗可以是包含来自癌细胞,例如,恶性黑素瘤的一种或多种抗原的癌症疫苗。
初次免疫应答可以随时间变得减弱或者衰减并且可以甚至消失或者至少变得如此减弱以致不能检测到。因此,本发明还涉及“再次”免疫应答,其也在本文描述为“记忆免疫应答”。术语再次免疫应答指在已经产生了初次免疫应答后在个体中引起的免疫应答。从而可以引起再次免疫应答例如,以增强现有的变得减弱或衰减的免疫应答,或者恢复以前的已经消失或者不再检测到的免疫应答。可以施用以引起再次免疫应答的活性剂在以后称作“加强剂量”,因为可以说所述活性剂“加强”初次免疫应答。
作为实例,并且不作为限制,可以通过向个体中再次引入引起初次免疫应答的抗原(例如,通过再次施用疫苗)引起再次免疫应答。然而,通过使用可以不含有实际抗原的其他活性剂也可以引起对抗原的再次免疫应答。例如,本发明提供了通过对个体施用针对激活的整联蛋白受体的抗体以强化再次免疫应答的方法。在此类方法中,实际抗原不必与针对激活的整联蛋白受体一起施用并且含有所速抗体的组合物不必含有所述抗原。再次或者记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或者细胞应答。当刺激在第一次呈递抗原时产生的记忆B细胞时,发生再次或者记忆体液应答。迟发型超敏反应(DTH)是一种类型的细胞再次或者记忆免疫应答,其由CD4+细胞介导。首次暴露于抗原引发了免疫系统并且额外暴露导致DTH。
“免疫交叉反应的”或者“免疫反应的”指一种抗原,其与使用相同(“免疫反应的”)或者不同(“免疫交叉反应的”)抗原产生的抗体特异反应。通常,抗原是激活的整联蛋白受体,更典型的是α3β1整联蛋白受体或者其子序列。
“免疫反应条件”指这样的条件,其允许针对抗原的特定表位产生的抗体可检测地结合该表位,结合的程度大于该抗体结合基本上所有其他表位的程度,通常高于背景结合至少两倍,优选高于背景至少5倍。免疫反应条件依赖于抗体结合反应的形式并且通常是用于免疫测定方案的免疫反应条件。关于免疫测定形式和条件的描述,见Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York,1988(Harlow&Lane)。
“细胞表面受体”指能够接收信号并且跨细胞质膜传递这种信号的分子或者分子的复合体。本发明的“细胞表面受体”的一个实例是激活的整联蛋白受体,例如,转移细胞上的激活的α3β1整联蛋白受体。
“非特异T细胞活化”指独立于T细胞的抗原特异性刺激T细胞。
“效应细胞”指与免疫应答的识别和活化期相反,参与免疫应答的效应期的免疫细胞。示例性免疫细胞包括骨髓或者淋巴来源的细胞,例如,淋巴细胞(例如,B细胞和T细胞,包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞、和嗜碱性粒细胞。效应细胞表达特定Fe受体并且进行特定免疫功能。效应细胞可以诱导依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC),例如,嗜中性粒细胞能够诱导ADCC。例如,单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和表达FcαR的淋巴细胞参与靶细胞的特异杀伤和将抗原呈递到免疫系统的其他组分,或者结合到呈递抗原的细胞。效应细胞还可以吞噬靶抗原、靶细胞、转移性癌细胞或者微生物。
“靶细胞”指受试者(例如,人或者动物)中任何不希望的细胞,其可以通过本发明的Ab或者Ab组合物靶定。靶细胞可以是表达或者过表达人激活的整联蛋白受体的细胞。表达人激活的整联蛋白受体的细胞可以包括肿瘤细胞,例如,恶性黑素瘤。
抗体组合物对转移性癌细胞,例如恶性黑素瘤的目的靶标包括但不限于,细胞表面受体、生长因子受体,抗体,包括癌症(如转移性癌症和恶性黑素瘤)中存在的抗独特型抗体和自身抗体。其他靶标是黏着蛋白,如整联蛋白、选择蛋白,和免疫球蛋白超家族成员。Springer,Nature,346:425-433,1990;Osborn,Cell,62:3,1990;Hynes,Cell,69:11,1992。其他目的靶标是生长因子受体(例如,FGFR、PDGFR、EGF、her/neu、NGFR、和VEGF)和它们的配体。其他靶标是G-蛋白受体并且包括物质K受体、血管紧张肽受体、α-和β-肾上腺素能受体、5-羟色胺受体、PAF受体。见,例如,Gilman,Ann.Rev.Biochem.56:625-649,1987。其他靶标包括离子通道(例如,钙、钠、钾通道、介导多种药物抗性的通道蛋白质)、毒蕈碱性受体、乙酰胆碱受体、γ-氨基丁酸受体、谷氨酸受体,和多巴胺受体(见Harpold,美国专利号5,401,629和美国专利号5,436,128)。其他靶标是细胞因子,如白介素IL-1到IL-13、肿瘤坏死因子α和β、α、β和γ干扰素、肿瘤生长因子β(TGF-β)、集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。见Human Cytokines:Handbook for Basic&Clinical Research(Aggrawal等人编著,Blackwell Scientific,Boston,Mass.,1991)。其他靶标是激素、酶和细胞内和细胞间信使,如腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶,和磷脂酶C。药物也是目的靶标。靶分子可以是人、哺乳动物或者细菌的。其他靶标是抗原,如来自微生物病原体(病毒和细菌的)和肿瘤的蛋白质、糖蛋白和糖类。其他靶标在美国专利号4,366,241中描述,将其为了所有目的完整引入本文作为参考。通过靶标筛选的一些活性剂仅仅结合靶标。其他活性剂激动或者拮抗靶标。
癌症和癌症治疗
“癌症”或者“恶性肿瘤”以同义术语使用并且指特征是细胞的不受控制的异常增殖、受影响的细胞能够局部或者通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部分(即,转移),以及任意多种特征性结构和/或分子特征的多种疾病的任一种。“癌性的”或者“恶性细胞”理解为具有特定结构性质、缺少分化和能够侵入和转移的细胞。癌症的实例是乳腺癌、肺癌、脑癌、骨癌、肝癌、肾癌、结肠癌,和前列腺癌(见DeVita,V.等人(编者),2001,CancerPrinciples and Practice of Oncology,第六版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA;该参考文献为了所有目的引入本文作为参考)。
“癌症相关的”指核酸和其表达或者其缺乏、或者蛋白质和其水平或活性或者其缺少与受试细胞中恶性肿瘤的发生的关系。例如,癌症可以与特定基因的表达相关,所述基因在正常健康细胞中不表达或者以低水平表达。相反地,癌症相关的基因可以是不在恶性细胞中(或者经历转化的细胞中)表达,或者在恶性细胞中以低于正常健康细胞中表达水平的水平表达的基因。
在癌症的上下文中,术语“转化”指正常细胞变得恶性时经历的改变。在真核生物中,术语“转化”可以用于描述细胞培养物中正常细胞转变成恶性细胞。
“增殖细胞”是活跃地经历细胞分裂并且指数生长的细胞。“失去细胞增殖控制”指细胞已经失去了通常确保细胞分裂的合适限制的细胞周期控制的性质。没有刺激信号的情况下,已经失去此类控制的细胞比正常速率更快地增殖,并且不应答抑制信号。
“晚期癌症“指不再局限于原发肿瘤部位的癌症,或者根据美国癌期划分联合委员会(AJCC)处于III或者IV期的癌症。
“良好耐受的”指不存在由于治疗引起的并且将影响治疗决定而发生的健康状况的不利改变。
“转移的”或者“转移状态”指肿瘤细胞,例如,人黑素瘤细胞,其能够在肺、肝脏、骨或者脑中建立继发肿瘤病变-例如,当向免疫缺陷小鼠的乳房脂肪垫和/或循环系统中注射时,在免疫缺陷小鼠中建立继发肿瘤病变。
“非转移的”或者“非转移状态”指肿瘤细胞,例如,人黑素瘤细胞,其不能在肺、肝脏、骨或者脑或黑素瘤转移的其他靶器官中建立继发肿瘤病变-例如,当向乳房脂肪垫和/或循环系统中注射时在免疫缺陷小鼠中不能建立继发肿瘤病变。本文使用的和在本文中说明为非转移的人肿瘤细胞当注射到免疫缺陷小鼠的乳房脂肪垫时能够建立原发肿瘤,但是它们不能从那些原发肿瘤扩散。
“差别产生的”指细胞产生的化合物,例如,整联蛋白受体,与非转移的细胞相比,所述化合物在转移细胞中以改变的水平产生。当将转移的与非转移的细胞比较时,所述改变的水平可以更低或者更高。改变的水平可以是可检测的并且可以是哺乳动物受试者中瘤性疾病的治疗性治疗的基础。
“差别产生的”指在基因或者蛋白质的暂时或者组织表达模式中定量以及定性差异。例如,在正常的状况与疾病状况相比,差别产生的基因可以使其表达活化或者被完全失活。此类定性调节的基因可以在给定的组织或者细胞类型中显示出一种表达模式,该表达模式在对照或者疾病状况中可以检测到,但是不能同时在两种状况中检测到。差别产生的基因可以代表“概况基因”或者“靶基因”等等。
类似地,在正常对比疾病状况中,差别产生的蛋白质的表达可以活化或者完全失活。此类定性调节的蛋白质可以在给定的组织或者细胞类型中显示出一种表达模式,该表达模式在对照或者疾病状况中可以检测到,但是不能同时在两种状况中检测到。而且,差别产生的蛋白质可以代表“概况蛋白质”或者“靶蛋白质”等等。
治疗癌性疾病的方法提供了用本发明的抗体-细胞毒素缀合物分子进行治疗。通过抗体组合物阻断激活的整联蛋白受体可以增强对患者中癌性细胞的记忆或者再次免疫反应,从而方便癌症治疗。针对抗体-细胞毒素缀合物分子内的激活的整联蛋白受体的抗体可以与免疫原性剂组合或者单独使用以刺激免疫,所述免疫原性剂为诸如癌性细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和糖类分子)、细胞,和用编码免疫刺激细胞因子和细胞表面抗原的基因转染的细胞。
当按照免疫接种方案时,针对激活的整联蛋白受体的抗体当与抗体-细胞毒素缀合物分子组合时是有效的。已经设计了针对肿瘤接种疫苗的许多实验策略(见Rosenberg,S.,ASCO Educational Book Spring:60-62,2000;Logothetis,C,ASCO Educational Book Spring:300-302,2000;Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428,2000;Foon,K.,ASCOEducational Book Spring:730-738,2000;也见Restifo,N.等人,Cancer:Principles and Practice of Oncology,61:3023-3043,1997。在这些策略之一中,用自体或者同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已经证明当转导肿瘤细胞以表达GM-CSF时,这些细胞疫苗是最有效的。已经表明GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效激活剂。Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,90:3539-43,1993。
针对激活的整联蛋白受体的抗体可以加强GM-CSF修饰的肿瘤细胞疫苗,并且在许多实验肿瘤模型如哺乳动物癌(Hurwitz等人,1998,上文)、原发性前列腺癌(Hurwitz等人,Cancer Research,60:2444-8,2000)和黑素瘤(van Elsas等人,J.Exp.Med.,190:355-66,1999)中具有提高的疫苗功效。在这些实例中,已经使得非免疫原性肿瘤,如B 16黑素瘤对免疫系统的破坏敏感。还可以修饰肿瘤细胞疫苗以表达其他免疫激活剂,如IL2,和共刺激分子,等等。
对多种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究已经导致定义了所称作的“肿瘤特异抗原”(Rosenberg,Immunity,10:281-7,1999)。在许多情况中,这些肿瘤特异抗原是在肿瘤和产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原,如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原、Trp-2。更重要地,已经表明这些抗原的许多是在宿主中发现的肿瘤特异T细胞的靶标。针对激活的整联蛋白受体的抗体可以与基于发现在肿瘤中表达的蛋白质和/或肽的重组形式的疫苗结合用作强化剂以便加强对这些蛋白质的再次或者记忆免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视作自身抗原并且因此对它们耐受。肿瘤抗原还可以包括蛋白质端粒酶,其是染色体的端粒合成所需并且在85%以上的人类癌症中表达并且仅在有限数目的体细胞组织中表达(Kim等人,Science,266:2011-2013,1994)。这些体细胞组织可以通过多种方式保护免受免疫攻击。肿瘤抗原还可以由于体细胞突变或者来自B细胞肿瘤的独特型而是在癌细胞中表达的“新抗原”,所述体细胞突变改变蛋白质序列或者产生两个不相关序列之间的融合蛋白(例如,费城染色体中的bcr-abl)。其他肿瘤疫苗可以包括来自与人类癌症有关的病毒的蛋白质,所述病毒如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与针对激活的整联蛋白受体的抗体结合使用的肿瘤特异抗体的另一种形式是从肿瘤组织自身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质的片段并且这些HSP在递送到抗原呈递细胞以引起肿瘤免疫性中非常有效(Suot等人,Science,269:1585-1588,1995;Tamura等人,Science,278:117-120,1997)。
树突细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞,其可以用于引发针对转移的肿瘤细胞上的激活的整联蛋白受体的抗原特异性应答。DC可以离体(ex vivo)产生并且装载多种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人,Nature Medicine,4:328-332,1998)。DC还可以通过遗传方法转导以表达这些肿瘤抗原。还已经将DC直接融合到肿瘤细胞用于免疫接种目的(Kugler等人,Nature Medicine,6:332-336,2000)。作为免疫接种的方法,可以用针对激活的整联蛋白受体的抗体有效加强DC免疫接种以激活更有效的抗肿瘤应答。
可以与针对激活的整联蛋白受体的抗体组合的另一类型的抗肿瘤疫苗是从黑素瘤细胞系裂解物制备的与免疫学佐剂组合的疫苗,如MELACINETM疫苗,其是来自两种人黑素瘤细胞系的裂解物加上DETOXTM免疫学佐剂的混合物。可以用抗激活的整联蛋白受体抗体加强疫苗治疗,使用或者不用额外的化学治疗性治疗。
包含针对激活的整联蛋白受体的抗体的抗体-细胞毒素缀合物还可以用于加强通过标准癌症治疗诱导的免疫性。在这些情况中,可以减小所施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr等人,Cancer Research,58:5301-5304,1998)。组合使用针对激活的整联蛋白受体的抗体和化学治疗之后的科学原理是细胞死亡(多数化学治疗性化合物的细胞毒性的结果)应该导致抗原呈递途径中升高水平的肿瘤抗原。从而,针对激活的整联蛋白受体的抗体可以加强肿瘤细胞的化学治疗释放引发的免疫应答。与用针对激活的整联蛋白受体的抗体进行治疗组合的化学治疗剂的实例可以包括但不限于,放线菌属或者链霉菌属抗生素、duocarmycin、阿地白介素、六甲密胺、阿米斯丁、天冬酰胺酶、博来霉素、卡培他滨、卡铂、卡氮芥、克拉屈滨、西沙比利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、多西他赛、阿霉素、屈大麻酚、duocarmycin、细胞生成素、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、α干扰素、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、亚叶酸、甲地孕酮、美司钠、氨甲喋呤、甲氧氯普安、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇(TaxolTM))、毛果云香碱、甲哌氯丙嗪、利妥希玛、saproin、他莫昔芬、紫杉酚、盐酸拓扑替康、司徒曼布、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。对于前列腺癌治疗,抗激活的整联蛋白受体可以组合的优选的化学治疗剂是紫杉醇(TaxolTM)。对于黑素瘤癌症治疗,抗激活的整联蛋白受体可以组合的优选的化学治疗剂是达卡巴嗪(DTIC)。
可以通过细胞死亡导致免疫系统引发的其他组合疗法为放射、手术或者激素剥夺(Kwon等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,96:15074-9,1999)。这些方案的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。例如,在手术时任何肿瘤操作都可以极大地增加血液中癌细胞数目(Schwartz等人,Principlesof Surgery 1984.第四版p.338)。
血管生成抑制剂也可以与针对激活的整联蛋白受体的抗体组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡,其可以将肿瘤抗原喂饲到宿主抗原呈递途径。所有这些都导致肿瘤释放和针对激活的整联蛋白受体的抗体可以加强的可能的免疫系统引发。
“治疗”包括施用本发明的抗体组合物、抗体-细胞毒素缀合物分子化合物或者活性剂以防止或者延迟疾病的症状、并发症或者生化标记的出现、减轻疾病、状况或者病症(例如,癌症或者转移性癌症)的症状或者阻止或者抑制其进一步发展。使用本发明的方法对癌症或者转移性癌症的“治疗”指在癌症的治疗或减轻或预防中任何成功标志,包括任何客观或者主观参数,如症状的减轻、缓和、减小或者使得疾病状况对患者更耐受;延缓退化或者衰退的速率;或者使得退化的终点使人的虚弱程度较低。症状的治疗或者改善可以基于客观或者主观参数;包括由医生检查的结果。因此,术语“治疗”包括施用本发明的化合物或者活性剂以预防或者延迟、减轻或者阻止或者抑制与瘤性疾病相关的症状或者状况的发展。术语“治疗效果”指减轻、消除或者防止受试者中疾病、疾病的症状或者疾病的副作用。
“与...组合”、“组合治疗”和“组合产品”在一些实施方案中指对患者同时施用第一种治疗剂和如本文使用的化合物。当组合施用时,每种组分可以同时施用或者在不同时间点以任何顺序相继施用。从而,每种组分可以单独但是以足够接近的时间施用以便提供所希望的治疗效果。
“剂量单位”指适于作为待治疗的特定个体的单一剂量的物理上离散的单位。每个单位可以含有预定量的活性化合物,其经计算与所需要的药物载体结合产生所希望的治疗效果。剂量单位形式的规格可以由:(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果,和(b)本领域中配制此类化合物的内在限制决定。
抗体治疗剂
当用于体内治疗时,将主题发明的抗体以治疗有效量(即,具有所希望的治疗效果的量)施用于患者。它们将通常肠胃外施用。剂量和给药方案将取决于感染的程度、所用的具体抗体和免疫毒素的特征,例如,它的治疗指数、患者,和患者的病史。有利地,将抗体或者免疫毒素在1-2周内静脉内连续施用以治疗脉管系统中的细胞和皮下和腹膜内施用以治疗局部淋巴结。任选地,在辅助治疗,如放射、化学治疗的组合周期或者施用肿瘤坏死因子、干扰素或者其他细胞保护或者免疫调节剂期间进行施用。
对于肠胃外施用,抗体将以单位剂量注射形式(溶液剂、混悬剂、乳剂)结合可药用肠胃外载体配制。此类载体是内在无毒的并且非治疗性的。此类载体的实例为水、盐水、林格液、葡萄糖溶液,和5%人血清白蛋白。也可以使用非水性载体,如不挥发油和油酸乙酯。脂质体也可以用作载体。载体可以含有小量添加剂,如增强等渗性和化学稳定性的物质,如缓冲剂和防腐剂。抗体将通常在此类载体中以约1mg/ml到10mg/ml的浓度配制。
IgM抗体的使用优选用于某些应用,然而,IgG分子由于更小而比IgM更能够定位到某些类型的受感染的细胞。
有证据表明体内补体激活导致多种生物学效应,包括诱导炎症反应和激活巨噬细胞(Unanue和Benecerraf,Textbook of Immunology,第二版,Williams&Wilkins,p.218(1984))。伴随炎症的增加的血管舒张可以增加多种活性剂定位在受感染的细胞中的能力。因此,本发明指定类型的抗原-抗体组合可以以多种方式治疗性使用。此外,与此类抗原有关的纯化的抗原(Hakomori,Ann.Rev.Immunol.2:103,1984)或抗独特型抗体(Nepom等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:2864,1985;Koprowski等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA 81:216,1984)可以用于在人类患者中诱导有效免疫应答。此类应答包括形成能够激活人补体和介导ADCC并且通过此类机制导致受感染的细胞破坏的抗体。
任选地,本发明的抗体用作抗体-细胞毒素缀合分子,如通过施用以治疗瘤性疾病所例证。
用于治疗的抗体组合物以与优良医疗实践(good medical practice)相一致的方式配制和确定剂量,考虑所治疗的疾病、个体患者的状况、组合物的递送部位、施用方法和开业医生已知的其他因素。制备抗体组合物用于根据制备用于施用的多肽的描述(上文)来施用。
如本领域中熟知的,生物特异性捕获试剂包括抗体、抗体的结合片段,其结合转移分子上的激活的整联蛋白受体(例如,单链抗体、Fab’片段、F(ab)’2片段、和scFv蛋白质和affibodies(Affibody,Teknikringen 30,floor6,Box 700 04,Stockholm SE-10044,Sweden;见美国专利号5,831,012,为了所有目的将其引入本文作为参考))。取决于预期的用途,它们还可以包括特异结合另一生物分子的受体和其他蛋白质。
杂合抗体和杂合抗体片段包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子,或者其任何片段,如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、scFv、抗体轻链和抗体重链。具有如本文描述的可变区和来自多种物种的恒定区的嵌合抗体也是合适的。见例如,美国申请号20030022244。
最初,选择可以针对其产生抗体的预定的靶标。用于产生针对靶标的单克隆抗体的技术是本领域技术人员已知的。此类技术的实例包括,但不限于,涉及展示文库、xeno或者humab小鼠、杂交瘤等等的技术。靶标包括能够显示出抗原性并且通常是蛋白质或者蛋白质多糖的任何物质。实例包括受体、酶、激素、生长因子、肽等等。将理解不仅天然发生的抗体适于根据本发明的公开使用,而且针对预定目标的工程化抗体和抗体片段也是合适的。
可以进行本文给出的技术处理的抗体(Ab)包括单克隆和多克隆抗体,和抗体片段,如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、scFv、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或来自噬菌体或者噬菌粒展示技术的抗体片段。首先,从最初的物种得到最初抗体。更具体地,需要对靶抗原具有特异性的最初物种抗体的轻链、重链或者两者的可变部分的核酸或者氨基酸序列。最初物种是用于产生抗体或者抗体文库的任何物种,例如,大鼠、小鼠、兔、鸡、猴、人等等。用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员公知的。得到所希望的抗体后,使用CDR的任何可能的定义(例如,仅Kabat、仅Chothia、Kabat和Chothia组合,和本领域技术人员已知的任何其他定义)将可变区(VH和VL)分成组分部分(即构架(FR)和CDR)。一旦得到组分部分后,需要选择合适的靶标物种构架。一个实施方案涉及将来自最初物种抗体序列的每个个体构架区与来自靶标物种的可变氨基酸序列或者基因序列比对。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小抗体片段,所述片段包含连接到相同多肽链(VH VL)的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头,强行结构域与另一链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。双抗体在例如,EP 404,097;WO 93/11161;和30 Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更详细描述。
从相同的家族和/或相同的家族成员选择合适的候选构架区后,通过将来自最初物种的CDR移植到杂合构架区中产生重和轻链可变区任一个或两个。对于上面两方面的任一方面具有杂合可变链区域的杂合抗体或者杂合抗体片段的装配可以使用本领域技术人员已知的常规方法完成。例如,可以通过寡核苷酸合成和/或PCR产生编码本文描述的杂合可变结构域(即,基于靶标物种的构架区和来自最初物种的CDR)的DNA序列。还还可以使用合适的限制酶从最初物种抗体分离编码CDR区的核酸并通过用合适的连接酶连接将所述核酸连接到靶标物种构架。备选地,可以通过位点定向诱变改变最初物种抗体的可变链的构架区。
自从从对应于每个构架区的多个候选者中选择构建杂种后,存在许多序列组合可以服从根据本文描述的原理的构建。因此,可以装配杂种文库,其包括具有个体构架区的不同组合的成员。此类文库可以是序列的电子数据库集合或者杂种的物理集合。
优选使用合成的寡核苷酸完成物理抗体或者抗体片段文库的装配。在一个实例中,设计寡核苷酸具有重叠区从而它们可以退火并且被聚合酶填充,如使用聚合酶链式反应(PCR)。进行多个步骤的重叠延伸以便产生VL和VH基因插入片段。设计那些片段与人恒定结构域具有重叠区从而它们可以通过重叠延伸融合以产生全长轻链和Fd重链片段。轻和重Fd链区可以通过重叠延伸连接以产生将克隆到展示载体的一条Fab文库插入片段。还可以使用装配人源化文库基因的备选方法。例如,可以使用连接酶链式反应(LCR)方法从重叠的寡核苷酸装配文库。Chalmers等人,Biotechniques,30-2:249-252,2001。
可以产生多种形式的抗体片段并将其克隆到合适的载体以产生杂合抗体文库或者杂合抗体片段文库。例如,可变基因可以克隆到在框内含有必要的恒定结构域的剩余部分的载体中。可以克隆的额外片段的实例包括完整轻链、重链的Fd部分,或者含有轻链和重链Fd编码序列的片段。备选地,用于人源化的抗体片段可以是单链抗体(scFv)。
任何选择展示系统可以与根据本公开的文库结合使用。用于分离大文库的所希望的成员的选择方案是本领域已知的,如以噬菌体展示技术为代表。此类系统(其中不同的肽序列展示在丝状噬菌体的表面上)已经证明可以用于产生抗体片段(和编码它们的核酸序列)文库,用于体外选择和扩增结合靶抗原的特定抗体片段。Scott等人,Science,249:386,1990。编码VH和VL区的核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段,所述前导信号将它们导向大肠杆菌的周质空间,并且结果所得的抗体片段(通常作为与噬菌体外壳蛋白的融合(如pIII或者pVIII))展示在噬菌体的表面上。备选地,抗体片段展示在λ噬菌体或者T7壳体(phagebodies)外面。基于噬菌体展示系统的一个优点是,因为它们是生物系统,所以可以通过在细菌细胞中生长含有所选文库成员的噬菌体来简单地扩增所选的文库成员。此外,因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或者噬菌粒载体上,所以测序、表达和随后的遗传操作都相对直接。构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域公知的。McCafferty等人,Nature,348:552,1990;Kang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:4363,1991。
核酸和多肽
在两种或多种核酸或者多肽序列的背景中,术语“同一的”或者百分数“同一性”指两种或多种序列或者子序列相同或者当在比较窗口或者特定区域内为了最大的对应进行比较和比对时,在特定区域(例如,编码本文描述的抗体的核苷酸序列或者本文描述的抗体的氨基酸序列)内具有相同氨基酸残基或者核苷酸的特定百分数(即,约60%同一性,优选65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高同一性,如使用BLAST或者BLAST 2.0序列比较算法以下文描述的默认参数或者通过手工比对和视觉检查测定(见,例如,NCBI网站)。此类序列是“基本上同一的”。该术语还指或者可以应用于测试序列的互补序列。还术语还包括具有缺失和/或添加的序列,以及具有替代的序列。如下文所述,优选的算法可以解决缺口等等。优选地,在长为至少约25个氨基酸或者核苷酸,或者更优选在长为50-100个氨基酸或者核苷酸的区域内存在同一性。
对于序列比较,通常一个序列作为参考序列,测试序列与其比较。当使用序列比较算法时,测试和参考序列进入计算机,如果必要,指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。优选地,可以使用默认的程序参数,或者可以指定备选的参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。
本文所用的“比较窗口”包括对选自20到600,通常约50到约200,更通常约100到约150个连续位置的任意数目的区段的参考,其中两个序列最佳比对后,可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列比较。用于比较的序列的比对方法是本领域公知的。可以进行用于比较的序列的最佳比对,例如,通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.,1981,2:482的局部同源性算法,通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.,1970,48:443的同源性比对算法,通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1988,85:2444的相似性检索算法,通过这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics Software Package(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA),或者手工比对和目视检测(见,例如,Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人,编者1995增补))来进行。
用于比对检索的程序是本领域公知的,例如,BLAST等等。例如,如果目标物种是人,那么可以在任何合适的参考数据库中找到此类氨基酸序列或者基因序列(种系或者重排的抗体序列)或者其翻译产物的来源,所述数据库为例如 Genbank、NCBI蛋白质数据库(
http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、VBASE、人抗体基因的数据库(
http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc)和免疫球蛋白的Kabat数据库(
http://www.immuno.bme.nwu.edu)。如果基于核苷酸序列进行比对,那么可以分析所选的基因以确定该子集中的哪些基因与最初物种抗体具有最近的氨基酸同源性。预期与数据库中其他序列相比接近较高程度的同源性的氨基酸序列或者基因序列可以根据本文描述的步骤进行利用和操作。此外,当根据本文描述的步骤进行操作和选择时,具有较低同源性的氨基酸序列或者基因对预定靶抗原显示出特异性时,可以利用所述氨基酸序列或者基因。在一些实施方案中,同源性的可接受的范围大于约50%。将理解靶标物种可以不同于人。
适于确定百分数序列同一性和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法,其分别在Altschul等人,Nuc.Acids Res.,1977,25:3389-3402和Altschul等人,J.Mol.Biol.,1990,215:403-410中描述。使用BLAST和BLAST 2.0,用本文描述的参数,确定本发明的核酸和蛋白质的百分数序列同一性。用于进行BLAST分析的软件可以通过NationalCenter for Biotechnology Information(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及通过鉴定查询序列中长度W的短字首先鉴定高得分序列对,所述短字当与数据库序列中相同长度的字比对时,匹配或者满足一定的正值阈值得分T。T指邻近字得分阈值。这些初始邻近字采样数作为启动搜索以发现含有它们的更长的HSP的种子。字采样数沿着每条序列的两个方向延伸,只要累积比对得分增加。对于核苷酸序列,使用参数M(一对匹配残基的赏分;总是>0)和N(错配残基的罚分;总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列,使用得分矩阵计算累积得分。当发生如下情况时停止每个方向上字采样数的延伸:累积比对得分从其实现的最大值下降量X;由于一个或多个负得分残基比对的积累,累积得分达到0或者以下;或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)利用字长(W)11、期望(E)10、M=5、N=-4作为默认值,并比较两条链。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用字长3、期望(E)10,BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci USA 1989,89:10915)使用比对(B)50、期望(E)10、M=5、N=-4,并比较两条链。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用,指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于氨基酸聚合物,其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然发生的氨基酸的人工化学模拟物,以及天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然发生的和合成的氨基酸,以及以与天然发生的氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸,以及后来修饰的那些氨基酸,例如,羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物,即结合氢、羧基、氨基和R基团的α碳,如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如,正亮氨酸)或者修饰的肽主链,但是保留与天然发生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同,但是以与天然发生的氨基酸相似的方式发挥功能的化合物。
氨基酸可以通过它们的通常已知的三字母符号或者通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样,核苷酸可以通过它们通常接受的单字母密码表示。
“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列,保守修饰的变体指编码相同或者基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或者当所述核酸不编码氨基酸序列时,指基本上同一的序列。因为遗传密码简并性,许多功能上相同的核酸编码给定蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。从而,在其中丙氨酸通过密码子指定的位置,可以将该密码子改变成任一描述的对应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”,其是保守修饰的变异的一种。此处编码多肽的每种核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG,其通常是甲硫氨酸的唯一密码子,和TGG,其通常是色氨酸的唯一密码子)可以经修饰以产生功能上相同的分子。因此,编码多肽的核酸的每个沉默变异关于表达产物但是不关于实际的探针序列在每个描述的序列中暗示。
关于氨基酸序列,技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或者蛋白质序列的个别替代、缺失或者加入在编码的序列中改变、添加或者缺失了一个氨基酸或者小百分比的氨基酸,所述序列是“保守修饰的变体”,其中所述改变导致将氨基酸用化学上相似的氨基酸替代。本领域公知提供功能上相似的氨基酸的保守替代表。此类保守修饰的变体加入到并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物,和等位基因。
下面的八组每组含有相互为保守替代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见例如,Creighton,Proteins(1984))。
可以按照不同的组织水平描述大分子结构,如多肽结构。关于该组织的一般描述,见,例如,Alberts等人,Molecular Biology of the Cell(第三版1994)和Cantor和Schimmel,Biophysical Chemistry Part I:TheConformation of Biological Macromolecules(1980)。“一级结构”指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常称作结构域,例如,酶结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域,和胞质尾结构域。结构域是多肽的部分,其形成多肽的紧密单位并且通常长15到350个氨基酸。示例性结构域包括具有酶活性的结构域,例如,激酶结构域。典型的结构域由次要组织的片组成,如β片层和α螺旋。“三级结构”指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”指通过独立三级单位的非共价结合形成的三维结构。各向异性术语也称作能量术语。
特定核酸序列也暗含“剪接变体”。类似地,核酸编码的特定蛋白质暗含该核酸的剪接变体编码的蛋白质。“剪接变体”如其名称所提示的,是基因的可变剪接产物。转录后,最初核酸转录物可以被剪接使得不同的(备选)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制可以不同,但是包括外显子的可变剪接。该定义还包括通过连读转录从相同的核酸得到的备选多肽。该定义包括剪接反应的任何产物,包括剪接产物的重组形式。
术语“重组的”当参考例如细胞或者核酸、蛋白质或者载体使用时,指已经通过引入异源核酸或者蛋白质或者天然核酸或者蛋白质的改变修饰的细胞、核酸、蛋白质或者载体或者该细胞来自如此修饰的细胞。从而,例如,重组细胞表达在天然(非重组的)形式的细胞中没有发现的基因或者表达天然基因,该基因否则异常表达、表达不足或者根本不表达。
短语“严格杂交条件”指这样的条件,在该条件下探针将与其靶序列(通常在核酸的复杂混合物中)杂交,但是不与其他序列杂交。严格条件是依赖于序列的并且将在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异杂交。关于核酸杂交的详细教导可以见Tijssen,Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)。通常,选择严格条件使得比在确定的离子强度、pH下对特定序列的热解链点(Tm)低约5-10℃。Tm是平衡时,50%的与靶序列互补的探针与靶序列杂交(由于靶序列以过量存在,在Tm下,平衡时50%的探针被占据)时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。对于选择性或者特异杂交,阳性信号为至少两倍背景,优选10倍背景杂交。示例性严格杂交调节可以如下:50%甲酰胺,5xSSC,和1%SDS,在42℃温育,或者5x SSC,1%SDS,在65℃温育,用0.2xSSC和0.1%SDS在65℃洗涤。
在严格条件下不相互杂交的核酸如果其编码的多肽是基本上同一的,那么所述核酸仍然是基本上同一的。例如,当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生一拷贝核酸时,发生这种情况。在此类情况中,核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性“中等严格杂交条件”包括在40%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲液中在37℃杂交,并在1XSSC中45℃下洗涤。阳性杂交是至少两倍背景。技术人员将通常认识到备选杂交和洗涤条件可以用于提供相似严格性的调节。用于确定杂交参数的额外指导在许多参考文献如Ausubel等人(上文)中提供。
对于PCR,约36℃的温度是低严格扩增典型的,尽管取决于引物长度,退火温度可以在32℃到48℃之间变动。对于高严格PCR扩增,约62℃的温度是典型的,尽管高严格退火温度可以在约50℃到约65℃的范围内,这取决于引物长度和特异性。高和低严格性扩增的通常的循环条件包括90℃-95℃下30秒-2分钟的变性期,持续30秒-2分钟的退火期,和约72℃下1-2分钟的延伸期。低和高严格性扩增反应的方案和指导在例如Innis等人PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.(1990)中提供。
融合蛋白
针对激活的整联蛋白受体的抗体可以用于产生融合蛋白。例如,本发明的抗体当与另一蛋白质融合时,可以用作抗原性标记。针对激活的整联蛋白受体产生的抗体可以用于通过结合多肽间接检测第二种。此外,因为分泌的蛋白质靶定基于运输信号的细胞位置,所以整联蛋白受体一旦与其他蛋白质融合就可以用作靶定分子。
可以与多肽融合的结构域的实例不仅包括异源信号序列,还包括其他异源功能区。融合不必是直接的,而是可以通过接头序列发生。
此外,融合蛋白可以工程化以改进该多肽的特征。例如,额外的氨基酸,尤其带电的氨基酸的区域可以加入到多肽的N-末端以在从宿主细胞纯化或者随后的操作和保存期间提高稳定性和持久性。而且,肽部分可以加入多肽以方便纯化。此类区域可以在多肽的最终制备前除去。加入肽部分以方便多肽的处理是本领域中熟悉和常规的技术。
此外,抗体组合物或者细胞表面受体,或者整联蛋白受体,包括片段和特异表位可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定结构域的部分组合,得到嵌合多肽。这些融合蛋白方便纯化并且显示出体内增加的半寿期。一个报导的实例描述了由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或者轻链的恒定区的多个结构域组成。EP A 394,827;Traunecker等人,Nature,331:84-86,1988。具有二硫键连接的嵌合结构(由于IgG)的融合蛋白还可以在结合和中和其他分子中比仅单体分泌的蛋白质或者蛋白质片段更有效。Fountoulakis等人,J.Biochem.270:3958-3964,1995。
类似地,EP-A-O 464 533(加拿大同族专利2045869)公开了包含免疫球蛋白分子的恒定区的多个部分以及另一种人蛋白质或者其部分的融合蛋白。在许多情况中,融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中有益,从而可以导致例如提高的药物代谢动力学性质。(EP-A 0232 262.)备选地,已经表达、检测和纯化融合蛋白后,将希望除去Fc部分。例如,如果融合蛋白用作免疫接种的抗原,那么Fc部分可以妨碍治疗和诊断。在药物发现中,例如,人蛋白质,如hIL-5,已经与Fc部分融合以便进行高通量筛选测定来鉴定hIL-5的拮抗剂。Bennett等人,J.Molecular Recognition 8:52-58,1995;K.Johanson等人,J.Biol.Chem.,270:9459-94711995。
此外,多肽可以与标记序列(如方便融合多肽的纯化的肽)融合。在优选实施方案中,标记氨基酸序列是六-组氨酸肽,如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供的标记,等等,它们的许多可以通过商业途径获得。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824,1989中描述的,六-组氨酸提供了融合蛋白的方便的纯化。用于纯化的另一种肽标记-“HA”标记对应于来自流感血凝素蛋白质的表位。Wilson等人,Cell 37:767,1984。
从而,可以使用本发明的多核苷酸或者多肽工程化这些上面的融合物的任一种。
重组抗体的表达
通常通过重组表达产生针对转移细胞上的细胞表面受体,例如,激活的整联蛋白受体的嵌合的、人源化的和人抗体。重组多核苷酸构建体通常包括与抗体链的编码序列有效连接的表达控制序列,包括天然结合的或者异源启动子序列。优选地,表达控制序列是载体中的真核启动子系统,其能够转化或者转染真核宿主细胞。一旦载体已经掺入合适的宿主,就将宿主在适于高水平表达核苷酸序列的条件下保持,并收集和纯化交叉反应抗体。见美国申请号20020199213,将其为了所有目的完整引入本文作为参考。
这些表达载体通常可以在宿主生物中作为附加体或者作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常,表达载体含有选择标记,例如,氨苄青霉素抗性或者潮霉素抗性,以允许检测用所希望的DNA序列转化的那些细胞。
大肠杆菌是尤其用于克隆本发明的DNA序列的原核宿主。诸如酵母的微生物也用于表达。酵母属是优选的酵母宿主,合适的载体具有所希望的表达控制序列、复制起点、终止序列等等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素(isocytochrome)C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等等。
哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白或者其片段的核苷酸区段的优选宿主。见Winnacker,From Genes To Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。本领域已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系,并且包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。优选地,细胞是非人的。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列,如复制起点、载体、增强子,和必要的加工信息位点,如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点,和转录终止序列。Queen等人,Immunol.Rev.89:49,1986。优选的表达控制序列是来自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等等的启动子。Co等人,J Immunol.148:1149,1992。
备选地,抗体编码序列可以掺入转基因中用于导入转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的奶中表达。见,例如,美国专利号5,741,957、5,304,489和5,849,992,将它们为了所有目的完整引入本文作为参考。合适的转基因包括与来自乳腺特异基因如酪蛋白或者β乳球蛋白的启动子和增强子有效连接的轻链和/或重链的编码序列。
取决于细胞宿主的类型,含有目的DNA区段的载体可以通过公知的方法转移到宿主细胞。例如,氯化钙转染通常用于原核细胞,而磷酸钙处理、电穿孔、脂转染、生物射弹方法或者基于病毒的转染可以用于其他细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合、脂质体、电穿孔和微注射(一般见Sambrook等人,Molecular Cloning)。为了产生转基因动物,可以将转基因微注射到受精的卵母细胞,或者可以掺入胚胎干细胞的基因组中,并且将此类细胞的细胞核转移到去核的卵母细胞。
一旦表达,从培养基和宿主细胞纯化不同的抗体。可以根据本领域的标准方法纯化抗体,所述方法包括HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳等等。通常,抗体链与信号序列一起表达并且从而释放到培养基。然而,如果抗体链不被宿主细胞天然分泌,那么可以用温和去污剂处理释放抗体链。然后通过常规方法纯化抗体链,所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和层析到固定化的靶标、柱层析、凝胶电泳等等(一般见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982))。
上面的方法得到编码对所选靶标具有特异亲和性的抗体链的核酸序列的文库。核酸文库通常具有至少5、10、20、50、100、1000、104、105、106、107、108、或109个不同的成员。通常,单个成员不组成文库中总序列的25或者50%以上。通常,至少25、50%、75、90、95、99或99.9%的文库成员编码对靶分子具有特异亲和性的抗体链。对于双链抗体文库的情况,分别编码重链和轻链的一对核酸区段认为是一个文库成员。核酸文库可以以游离形式存在,作为任何载体的组分或者作为载体的组分转染到宿主细胞中。
核酸文库可以表达以产生对靶标具有特异亲和性的抗体的多克隆文库。从核苷酸文库的组成确定此类文库的组成。从而,此类文库通常具有至少5、10、20、50、100、1000、104、105、106、107、108、或109个具有不同氨基酸组成的成员。通常,单个成员不组成文库中总体多肽的25或者50%以上。抗体链文库中对靶标具有特异亲和性的抗体链的百分数通常低于编码抗体链的对应核酸的百分数。该差异是由于并不是所有的多肽都折叠成适合结合的结构这一事实,尽管它们具有合适的一级氨基酸序列来支持适当的折叠。在一些文库中,至少25、50、75、90、95、99或99.9%的抗体链对靶分子具有特异亲和性。再次,在多链抗体文库中,认为每种抗体(如Fab或者完整抗体)是文库成员。不同的抗体链在对靶标的结合特异性和亲和性方面相互不同。一些此类文库包含结合相同抗原上不同表位的成员。一些此类文库包含结合相同抗原但是不相互竞争的至少两个成员。
上面方法得到的人抗体的多克隆文库与人抗体的天然群体的差别在于本文库中高亲和结合分子的高百分比,以及本文库通常不显示出与天然群体中存在的抗体的相同多样性。本文库中降低的多样性是由于非人转基因动物,其提供不包括所有人免疫球蛋白基因的来源物质。例如,一些多克隆抗体文库没有具有λ轻链的抗体。本发明的一些多克隆抗体文库具有少于10、20、30或者40种VH基因编码的抗体重链。本发明的一些多克隆抗体文库具有少于10、20、30或者40种VL基因编码的抗体轻链。
经修饰的抗体
本发明还包括针对转移细胞上细胞表面受体,如激活的整联蛋白受体的经修饰的抗体。
“经修饰的抗体”指已经通过例如缺失、加入或者替代抗体的部分修饰的抗体,如单克隆抗体、嵌合抗体,和人源化抗体。例如,通过缺失恒定区并将其用意在增加抗体的半寿期,例如血清半寿期、稳定性或者亲和性的恒定区替换。
本发明的抗体缀合物可以用于修饰给定生物学应答或者产生生物学应答(例如,募集效应细胞)。药物部分不理解为局限于常规的化学治疗剂。例如,药物部分可以是具有所希望的生物活性的蛋白质或者多肽。此类蛋白质可以包括例如,酶促活性毒素,或者其活性片段,如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素,或者白喉毒素;蛋白质,如肿瘤坏死因子或者α干扰素;或者生物应答调节物,如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”),或者其他生长因子。
在本发明的一些优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物例如可以偶联或者缀合到一种或多种治疗性或者细胞毒性部分。如本文所用的,“细胞毒性部分”简单地指当接近或者被细胞吸附时抑制细胞生长或者促进细胞死亡的部分。在这方面合适的细胞毒性部分包括放射性试剂或者同位素(放射性核素)、化学毒性剂,如分化诱导剂、抑制剂、小化学毒性药物、毒素蛋白质和其衍生物,以及核苷酸序列(或者它们的反义序列)。因此,作为非限制性实例,细胞毒性部分可以是化学治疗剂、光活化毒素或者放射性试剂。
通常,例如,通过合适的技术可以将治疗剂缀合到本发明的抗体和抗体组合物,适当考虑药物代谢动力学稳定性和对患者的减小的总体毒性的需要。治疗剂可以直接或者间接(例如,通过接头基团)偶联到合适的抗体部分。试剂和抗体当每种都具有能够与对方反应的官能团时,它们之间可能进行直接反应。例如,亲和基团,如氨基或者巯基能够与含有羰基的基团,如酸酐或者酰基卤或者与含有好的离去基团(例如,卤化物)的烷基反应。备选地,可以使用合适的化学接头基团。接头基团可以作为间隔臂使得抗体与试剂远离以避免干扰结合能力。接头基团还可以用于增加部分或者抗体上的取代基的化学反应性,从而增加偶联效率。化学反应性的增加还可以方便部分或者部分上官能团的使用,所述部分或者官能团否则将不可能使用。
合适的连接化学包括马来酰亚胺基接头和烷基卤接头(其与抗体部分上的巯基反应)和琥珀酰亚胺基接头(其与抗体部分上的伯胺反应)。一些伯胺和巯基存在于免疫球蛋白上,并且可以在重组免疫球蛋白分子中设计额外的基团。本领域技术人员显而易见的是,多种双官能或者多官能均官能和杂官能的试剂(如Pierce Chemical Co.,Rockford,III的目录中描述的那些)可以用作接头基团。例如,通过氨基、羧基、巯基或者氧化的糖类残基可以实现偶联(见例如,美国专利号4,671,958)。
作为备选偶联方法,细胞毒性剂可以偶联到本发明的抗体和抗体组合物,例如,通过糖基化位点上氧化的糖类基团来进行偶联,如美国专利号5,057,313和5,156,840中所述。将抗体和抗体组合物偶联到细胞毒性或者成像部分的再一个备选方法是通过使用非共价结合对,如链霉抗生物素蛋白/生物素,或者亲和素/生物素。在这些实施方案中,所述对的一个成员共价偶联到抗体部分并且结合对的另一成员共价偶联到细胞毒性或者成像部分。
当细胞毒性部分没有本发明的免疫缀合物的抗体部分时更有效时,可以希望使用接头基团,其在内化到细胞期间或者之时可以切割,或者在细胞外环境中随时间逐渐可切割。已经描述了许多不同的可切割的接头基团。细胞内细胞毒性部分物质从这些接头基团的释放的机制包括通过还原二硫键切割(例如,美国专利号4,489,710)、通过光不稳定键的照射(例如,美国专利号4,625,014)切割、通过衍生化的氨基酸侧链的水解切割(例如,美国专利号4,638,045)、通过血清补体介导的水解切割(例如,美国专利号4,671,958),和通过酸催化的水解切割(例如,美国专利号4,569,789)。
可以希望将一种以上的治疗、细胞毒性和/或成像部分偶联到本发明的抗体或抗体组合物。通过本发明抗体的多衍生,可以同时实现一些细胞毒性策略,抗体可以用作一些显影技术的造影剂,或者治疗性抗体可以经标记用于通过显影技术示踪。在一个实施方案中,将细胞毒性部分的多个分子偶联到一个抗体分子。在另一实施方案中,一种以上类型的部分可以偶联到一个抗体。例如,治疗部分,如多核苷酸或者反义序列可以与化学毒性或者放射毒性部分一起缀合到抗体,以增加化学-或者放射毒性疗法的有效性,以及降低得到所希望的治疗效果必须的所需剂量。不管具体实施方案,具有一个以上部分的免疫缀合物可以以多种方法制备。例如,一个以上的部分可以直接偶联到抗体分子,或者可以使用提供用于附着的多个位点的接头(例如,树状聚体)。备选地,可以使用能够容纳一个以上的细胞毒性部分的载体。
如上面解释的,载体可以以多种方式携带试剂,包括直接或者通过接头基团共价键合,和非共价结合。合适的共价键载体包括蛋白质,如白蛋白(例如,美国专利号4,507,234)、肽和多糖,如氨基葡聚糖(例如,美国专利号4,699,784),它们的每一个都具有用于附着部分的多个位点。载体还可以通过非共价结合(如非共价键合)或者通过例如密封在脂质体小泡(例如,美国专利号4,429,008和4,873,088)内携带试剂。密封载体尤其可用于化学毒性治疗方案中,因为它们可以允许治疗组合物随时间逐渐释放化学毒性部分而将其浓缩在靶细胞附近。
用作细胞毒性部分的优选的放射性核素是适于药理学施用的放射性核素。此类放射性核素包括123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb和212Bi。碘和砹同位素是用于本发明的治疗性组合物中的更优选的放射性核素,因为关于它们的使用已经积累了很多文献。131I尤其优选,如其他β放射性核素一样,其具有几毫米的有效射程。利用一些已知的缀合试剂的任一种,可以将123I、125I、131I或者211At缀合到用于组合物和方法中的抗体部分,所述缀合试剂包括非水溶性碘化试剂(Iodogen)、3-[211At]砹代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、3-[131I]碘代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIB)、和5-[131I]碘代-3-吡啶甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIPC)。任何碘同位素可以用于所述碘代试剂中。通过核医学领域中技术人员公知的合适的螯合剂可以将其他放射性核酸缀合到本发明的抗体或者抗体组合物。
优选的化学毒性剂包括小分子药物,如氨甲蝶呤和嘧啶和嘌呤类似物。优选的化学毒素分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。化学毒性部分可以通过化学接头直接缀合到本发明的抗体或者抗体组合物,或者可以密封在载体中,载体又可以偶联到本发明的抗体或者抗体组合物。
用作细胞毒性部分的优选的毒素蛋白质包括放线菌或者链霉菌抗生素,如duocarmycin。用作细胞毒性部分的优选的毒素蛋白质还包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素、多花白树毒蛋白、假单胞菌外毒素、志贺氏菌毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、和医学生物化学领域已知的其他毒素蛋白质。由于这些毒素试剂可以在患者中(特别如果静脉内注射时)引起不希望的免疫应答,所以优选它们密封在载体中用于偶联到本发明的抗体和抗体组合物。
免疫毒素的细胞毒性部分可以是细胞毒性药物或者细菌或者植物来源的酶促活性毒素或者此类毒素的酶促活性片段(“A链”)。使用的酶促活性毒素和其片段是白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂;多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素。在另一实施方案中,将抗体缀合到小分子抗癌药物。使用多种双官能蛋白质偶联剂制备单克隆抗体和此类细胞毒性部分的缀合物。此类试剂的实例是SPDP、IT、亚氨酸酯的双官能衍生物,如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐、活性酯,如辛二酸二琥珀酰亚胺酯、醛,如戊二醛、二-叠氮化合物,如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺、二-重氮衍生物,如二-(对-二重氮苯甲酰基)-乙二胺、二异氰酸酯,如2,6-二异氰酰基甲苯,和二-活性氟化合物,如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。毒素的裂解部分可以结合到抗体的Fab片段。
有利地,特异结合靶受体(例如,活化的α3β1整联蛋白受体)的外部结构域的本发明的抗体和抗体组合物可以缀合到蓖麻毒蛋白A链。更有利地,将蓖麻毒蛋白A链去糖基化并且通过重组方式产生。制备蓖麻毒蛋白免疫毒素的有利的方法在Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中描述,将其完整引入作为参考。
术语“接触的”当应用于细胞时,在本文中用于描述抗体、抗体组合物、细胞毒性剂或者部分、基因、蛋白质和/或反义序列借以递送到靶细胞或者与靶细胞直接接近放置的方法。该递送可以是体外或体内的并且可以涉及使用重组载体系统。
另一方面,本发明描述了缀合到治疗部分,如细胞毒素、药物(例如,免疫抑制剂)或者放射性毒素的本发明的抗体或抗体组合物,或者其片段。此类缀合物在本文称作“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性剂包括对细胞有害(例如,杀死)的任何物质。实例包括放线菌或者链霉素抗生素、duocarmycin、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基anthracindidne、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和其类似物或者同系物。
用于形成本发明的免疫缀合物的合适的治疗剂包括,但不限于,抗代谢物(例如,氨甲蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(例如,氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)(顺铂)、蒽环类(例如,柔红霉素(以前称作道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如,更生霉素(以前称作放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)),和抗有丝分裂剂(例如,长春新碱和长春碱)。在优选实施方案中,治疗剂是细胞毒性剂或者放射毒性剂。在另一实施方案中,治疗剂是免疫抑制剂。在再一个实施方案中,治疗剂是GM-CSF。在优选实施方案中,治疗剂是阿霉素(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲或者蓖麻毒蛋白A。
本发明的抗体和抗体组合物还可以缀合到放射性毒素,例如,放射性碘,以产生用于治疗例如癌症的细胞毒性放射性药物。
用于将此类治疗部分缀合到抗体的技术是本领域公知的,例如,Arnon等人,″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In CancerTherapy″,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom等人,″AntibodiesFor Drug Delivery″,in Controlled Drug Delivery(第二版),Robinson等人(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,″Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review″,in MonoclonalAntibodies′84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(eds.),pp.475-506(1985);″Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″,inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985),and Thorpe等人,″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
多肽或者抗体组合物的用途
可以以多种方式使用本文鉴定的每种多肽或者抗体组合物,例如,针对细胞表面受体的抗体、抗体细胞毒素缀合物,细胞表面受体,如转移细胞上的激活的整联蛋白受体。将认为下面的描述是示例性的并且使用已知的技术。
本发明的多肽或者抗体组合物可以用于使用基于抗体的技术测定生物样品中的蛋白质水平。例如,可以用常规免疫组织学方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.101:976-985,1985;Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096,1987。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定法,如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记,如葡萄糖氧化酶,和放射性同位素或者其他放射性试剂,如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc),和荧光标记,如荧光素和罗丹明,和生物素。
除了测定生物样品中分泌的蛋白质水平,蛋白质或者抗体组合物还可以用于通过成像进行体内检测。用于蛋白质的体内成像的抗体标记或者标记物包括通过X-射线照相术、NMR或者ESR可以检测的那些。对于X-射线照相术,合适的标记包括放射性同位素,如钡或者铯,其发出可检测的放射但是对受试者没有明显伤害。NMR和ESR的合适的标记物包括具有可检测的特征自旋的那些标记物,如氘,其可以通过标记相关scFv克隆的营养物而掺入到抗体中。
向哺乳动物中导入(例如,肠胃外、皮下或者腹膜内)已经用合适的可检测的成像部分,如放射性同位素(例如,131I、112In、99mTc)、放射不透物质,或者可以通过核磁共振检测的物质标记的蛋白质特异性抗体或者抗体片段。本领域中将理解所用的受试者的大小和成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。对于放射性同位素部分的情况,对于人类受试者,注射的放射性的量将通常为约5到20毫居里99mTc。经标记的抗体或者抗体片段将然后优先积累在含有特定蛋白质的细胞的位置处。体内肿瘤成像在S.W.Burchiel等人,Tumor Imaging:The Radiochemical Detection ofCancer 13,1982中描述。
从而,本发明提供了疾病的诊断方法,其包括(a)通过测量个体的细胞或者体液中本发明的抗体组合物的结合来测定多肽的表达;(b)比较基因表达水平与标准基因表达水平,其中与标准表达水平相比,所测定的多肽基因表达水平的提高或者降低指示疾病。
分子结合激活的整联蛋白受体的能力可以例如,通过推定的配体结合测定板上包被的激活的整联蛋白受体免疫粘附素的能力来确定。通过比较对非激活的整联蛋白受体的结合来确定结合的特异性。
在一个实施方案中,抗体与激活的整联蛋白受体的结合可以通过固定所述配体或者受体来测定。例如,测定法可以包括将融合His标记的激活的整联蛋白受体固定在Ni-活化的NTA树脂珠上。抗体可以加入合适的缓冲液中并且在给定温度下将珠子温育一段时间。洗涤除去未结合的物质后,可以用例如,SDS、具有高pH的缓冲液等等释放结合的蛋白质并分析。
此外,本发明的多肽或者抗体组合物可以用于治疗疾病。例如,可以对患者施用本发明的多肽或者抗体组合物以期替换不存在或者降低水平的多肽(例如,胰岛素)、补充不存在或者降低水平的不同多肽(例如,血红蛋白B替代血红蛋白S)、抑制多肽(例如,癌基因)的活性、激活多肽(例如,通过结合到受体)的活性、或者通过竞争游离的配体(例如,用于减轻炎症的可溶性TNF受体)来降低膜结合的受体的活性,或者引起所希望的应答(例如,血管生长)。
类似地,本发明的抗体组合物还可以用于治疗疾病。例如,针对本发明的多肽的抗体的施用可以结合和减少多肽的过量产生。类似地,抗体的施用可以激活多肽,例如,通过结合到结合膜受体的多肽而激活该多肽。
诊断用途
优选使用上述诊断方法产生本发明的人抗体和抗体组合物,所述抗体和抗体组合物用于诊断方法中来鉴定转移肿瘤细胞,例如,恶性黑素瘤。所述方法导致对任何希望的抗原具有任意表位结合特异性和极高结合亲和性的几乎无限数目的本发明的抗体和抗体组合物。通常,抗体对其靶标的结合亲和性越高,可以在免疫测定法中进行越严格的洗涤条件来除去非特异结合的物质而不除去靶抗原。因此,用于上面测定法的本发明的抗体和抗体组合物通常具有至少108、109、1010、1011或1012M-1的结合亲和力。比外,希望用作诊断试剂的抗体具有足够的结合率(on-rate)以在标准条件下在至少12小时内,优选至少5小时内,更优选至少1小时内达到平衡。
用于所要求保护的方法中的本发明的抗体和抗体组合物优选具有高免疫反应性,即,正确折叠的抗体分子的百分数,从而它们可以特异结合它们的靶抗原。这可以通过在如上述的大肠杆菌中表达编码抗体的序列来实现。此类表达通常导致至少80%、90%、95%或者99%的免疫反应性。
本发明的一些方法使用本发明的抗体和抗体组合物的多克隆制剂作为诊断试剂,其他方法使用单克隆分离物。多克隆混合物的使用相比一种单克隆抗体制备的组合物具有许多优点。通过结合到靶标上的多个位点,多克隆抗体或者其他多肽可以比结合单个位点的单克隆抗体产生更强的信号(用于诊断)。此外,多克隆制备物可以结合原型靶序列的许多变体(例如,等位基因变体、物种变体、菌株变体、药物诱导的逃避变体),而单克隆抗体仅可以结合原型序列或者其较窄范围的变体。然而,单克隆抗体对于存在或者可能存在密切相关的抗体时检测一种抗原是有利的。
在使用根据上述方法制备的多克隆人抗体的方法中,制备物通常含有具有对预期的靶抗原具不同表位特异性的多种抗体。在使用单克隆抗体的一些方法中,希望有具有不同表位结合特异性的两种抗体。通过竞争测定法可以确定表位结合特异性中的差异。
尽管人抗体可以用作任何种类样品的诊断试剂,但是它们最有用的是作为人样品的诊断试剂。可以从患者的任一组织或者体液得到样品。优选的样品来源包括全血、血浆、精液、唾液、泪液、尿、排泄物、汗、颊的样品、皮肤和毛发。样品还可以从内部器官或者癌的活组织检查得到。样品可以从用于诊断或研究的临床患者得到或者可以从未患病个体得到,作为对照或者用于基础研究。
方法可以用于检测任何类型的靶抗原。示例性靶抗原包括导致人类疾病的细菌、真菌和病毒病原体,如HIV、肝炎(A、B和C)、流感、疱疹、贾弟虫(Giardia)、疟疾、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。其他靶抗原是人蛋白质,其表达水平或者组成已经与人类疾病或者其他表型相关。此类抗原的实例包括黏着蛋白、激素、生长因子、细胞受体、自身抗原、自身抗体,和淀粉状蛋白沉积物。其他目的靶标包括肿瘤细胞抗原,如癌胚抗原。其他目的抗原是I类和II类MHC抗原。
人抗体可以用于以多种标准测定法形式检测给定靶标。此类形式包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定,和免疫测量测定法。见Harlow&Lane,上文;美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,879,262、4,034,074,3,791,932、3,817,837、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、和4,098,876,为了所有目的将它们每个完整引入本文作为参考。
免疫测量和夹层测定法是优选的形式。见美国专利号4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375,为了所有目的将它们每个完整引入本文作为参考。此类测定法使用固定化到固相的一种抗体或者抗体群体,和溶液中的另一种抗体或抗体群体。通常,将溶液抗体或者抗体群体标记。如果使用抗体群体,那么该群体通常含有结合靶抗原内不同的表位的抗体。因此,相同的群体可以用于固相和溶液抗体。如果使用单克隆抗体,那么具有不同结合特异性的第一种和第二种单克隆抗体用于固相和溶液相。固相和溶液抗体可以以任一顺序或者同时接触靶抗原。如果固相抗体首先接触,那么测定法称作正向测定法。相反地,如果溶液抗体首先接触,那么测定法称作反向测定法。如果靶标同时接触两种抗体,那么该测定法称作同时测定法。靶标与抗体接触后,将抗体温育一段时间,该时间通常为约10分钟到约24小时,通常约1小时。然后进行洗涤步骤以除去样品中不特异结合用作诊断试剂的抗体的组分。当固相和溶液抗体在分开的步骤中结合时,可以在两个结合步骤之一步或者两步之后进行洗涤。洗涤后,定量结合,通常通过检测通过经标记的溶液抗体的结合连接到固相的标记来定量。通常对于给定的对的抗体或者抗体群体和给定反应条件,从含有已知浓度的靶抗原的样品制备校准曲线。然后通过从校准曲线插值读出被测试的样品中抗原的浓度。可以从平衡时结合的经标记溶液抗体的量或者通过达到平衡前在一系列时间点处进行所结合的经标记溶液抗体的动力学测量来测量分析物。这种曲线的斜率是样品中靶标的浓度的度量。
用于上面方法中的合适的支持体包括例如,硝酸纤维素膜、尼龙膜,和衍生化的尼龙膜,以及颗粒,如琼脂糖、基于葡聚糖的凝胶、浸渍片、微粒、微球体、磁性颗粒、试管、微量滴定孔、SEPHADEXTM(AmershamPharmacia Biotech,Piscataway NJ.),等等。通过吸附或者通过共价附着可以进行固定化。任选地,抗体可以结合到接头分子(如生物素)以附着到表面结合的接头,如抗生物素蛋白。
标记
用于测定法中的特定标记或者可检测的基团不是本发明的关键方面,只要它不显著干扰用于测定法中的抗体的特异结合。可检测的基团可以是具有可检测的物理或者化学性质的任何物质。此类可检测的标记已经在免疫测定领域中充分发展并且通常,多数任何用于此类方法的标记都可以应用于本发明。从而,标记是通过光谱法、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或者化学手段可以检测的任一组分。用于本发明的标记包括磁珠(例如,DynabeadsTM)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等等)、放射性标记(例如,3H、14C、35S、125I、121I、112In、99mTc)、其他成像试剂,如微泡(用于超声成像)、18F、11C、15O(用于正电子成像术)、99mTc、111In(用于单光子成像术)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和常用于ELISA的其他酶),和量热标记,如胶体金或者有色玻璃或者塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等等)珠。描述此类标记的用途的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241,将它们为了所有目的完整引入本文作为参考。还见Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第六版,Molecular Probes,Inc.,Eugene OR.)。
根据本领域公知的方法,标记可以直接或者间接偶联到测定的所希望的组分。如上面指出的,可以使用多种标记,标记的选择取决于所要求的灵敏性、缀合化合物的容易度、稳定性要求、可用的仪器,和处理条件。
通常通过间接方式附着非放射性标记。通常,配体分子(例如,生物素)共价结合到分子。配体然后结合到抗-配体(例如,链霉抗生物素蛋白)分子,其是内在的可检测的或者共价结合到信号系统,如可检测的酶、荧光化合物或者化学发光化合物。可以使用许多配体和抗配体。当配体具有天然抗配体(例如,生物素、甲状腺素和皮质醇)时,它可以与经标记的、天然发生的抗配体结合使用。备选地,任何半抗原或者抗原性化合物可以与抗体组合使用。
分子还可以直接缀合到产生信号的化合物,例如,通过缀合酶或者荧光团。作为标记的目的酶将主要是水解酶,尤其磷酸酶、酯酶和糖苷酶,或者氧化还原酶,尤其过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹酰、伞形酮等等。化学发光化合物包括萤光素,和2,3-二氢酞嗪二酮,例如,鲁米诺。关于可以使用的多种标记或者信号产生系统的综述,见美国专利号4,391,904,将其为了所有目的完整引入本文作为参考。
检测标记的方法是本领域技术人员公知的。从而,例如,当标记是放射性标记时,检测方法包括闪烁计数器或者如放射自显影中的照相胶片。当标记是荧光标记时,可以通过用合适波长的光激发荧光染料并检测所得荧光来检测标记。通过目测、通过照相胶片、通过使用电子检测器,如电荷耦合器件(CCD)或者光电倍增管等等检测荧光。类似地,通过提供酶的合适的底物并检测所得反应产生来检测酶标记。最后,通过观察与标记有关的颜色简单地检测简单的量热标记。从而,在多种浸渍片测定中,缀合的金通常看起来为粉红色,而多种缀合的小珠看起来为该小珠的颜色。
一些测定法形式不要求使用标记的组分。例如,凝集反应测定法可以用于检测靶抗体的存在。在该情况中,通过包含靶抗体的样品凝集抗原包被的颗粒。在该形式中,没有一种组分需要标记,并且通过简单的目检来检测靶抗体的存在。
通常,激活的整联蛋白受体或者α3β1整联蛋白受体蛋白质和针对激活的整联蛋白受体的抗体将通过共价或者非共价结合到提供可检测信号的物质来标记。
治疗方案
本发明提供了药物组合物,其包含一种抗体或者抗体的组合,例如,针对激活的整联蛋白受体的抗体(单克隆的、多克隆的或者单链Fv、完整的或者其结合片段)或者与可药用载体一起配制的抗体细胞毒素缀合物。一些组合物包括多种(例如,两种或多种)本发明的单克隆抗体或者其抗原结合部分的组合。在一些组合物中,组合物的每种抗体或者其抗原结合片段是单克隆抗体或者人序列抗体,其结合抗原的不同的、预先选择的表位。
在预防应用中,将抗体细胞毒素缀合物的药物组合物或者药物施用于对疾病或者状况(例如免疫疾病)敏感或者处于所述疾病或者状况危险中的患者,其用量足以消除或者降低所述疾病的风险、减轻严重性或者延迟疾病发作,包括该疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和在该疾病的发展期间呈现的中间病理表型。在治疗应用中,将组合物或者药物施用于怀疑或者已经患有这种疾病的患者,用量足以治疗或者至少部分阻止该疾病的症状(生物化学的、组织学的和/或行为的),包括其并发症和该疾病的发展中的中间病理表型。足够完成治疗或者预防治疗的量定义为治疗-或者预防有效的剂量。在预防和治疗方案中,通常将活性剂以几个剂量施用,直到已经实现了足够的免疫应答。通常,监视免疫应答并且如果免疫应答开始减弱则给予重复剂量。
用于本发明组合物和方法中的特异结合转移肿瘤细胞上激活的整联蛋白受体的抗体组合物、抗体细胞毒素缀合物、其配体模拟物、衍生物或者类似物可以以其立体异构体、前体药物、可药用盐、水合物、溶剂合物、酸式盐水合物、N-氧化物或者同形结晶形式,或者以药物组合物(其中化合物与合适的载体或者赋形剂混合)的形式以(例如,癌症或者转移性癌症的)治疗有效量施用于人类患者本身。
通过施用的具体组合物以及通过用于施用组合物的具体方法部分决定可药用载体。因此,存在用于施用抗体组合物的多种合适剂型的药物组合物(见,例如,Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA第18版,1990,将其引入作为参考)。药物组合物通常包含适于施用于患者的形式的差别表达的蛋白质、激动剂或者拮抗剂。药物组合物通常配制为无菌的、基本上等渗的和完全依照美国食品和药物管理局的优质生产规范(GMP)规程配制。
术语“可药用的”、“生理学上耐受的”和其语法变型,当它们指组合物、载体、稀释剂和试剂时,可互换使用并且表示物质能够施用于人而不产生不希望的生理效果至将阻止组合物的施用的程度。
例如,“药学上可接受的赋形剂”指用于制备通常安全、无毒并且所希望的药物组合物的赋形剂,并且包括兽医上使用可接受以及用于人类药物用途的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体或者对于气雾剂组合物的情况,为气体的。
“可药用盐和酯”指药学上可接受的并且具有所希望的药学性质的盐和酯。此类盐包括当化合物中存在的酸性质子能够与无机或者有机碱反应时可以形成的盐。合适的无机盐包括用碱金属(例如,钠和钾、镁、钙和铝)形成的那些盐。合适的有机盐包括与有机碱如胺碱,例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等等形成的盐。此类盐还包括与无机酸(例如,氢氯酸和氢溴酸)和有机酸(例如,乙酸、柠檬酸、马来酸,和烷-和芳烃-磺酸,如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。可药用酯包括从化合物中存在的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基(phosphonoxy)基团形成的酯,例如,C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时,可药用盐或者酯可以是单-酸-单-盐或者酯或者二盐或酯;类似地,当存在两个以上的酸性基团时,这些基团的一些或者全部可以成盐或者酯化。本发明中命名的化合物可以以未成盐或者未酯化形式、或者成盐和/或酯化的形式存在,并且此类化合物的命名意在包括最初的(未成盐的和未酯化的)化合物和其可药用盐和酯。而且,本发明中命名的某些化合物可以以一种以上的立体异构形式存在,并且此类化合物的命名意在包括所有单一立体异构体和此类立体异构体的所有混合物(外消旋的或非外消旋的)。
“治疗有效量”指当施用于受试者用于治疗疾病时,足以实现该疾病的治疗的量。
除了提到时,术语“受试者”、“患者”或者“哺乳动物”可以互换使用并且指哺乳动物,如人类患者和非人灵长类,以及实验动物,如兔、大鼠、和小鼠,和其他动物。动物包括所有脊椎动物,例如,哺乳动物和非哺乳动物,如绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物,和爬行动物。因此,本文使用的术语“受试者”或者“患者”指本发明的组合物可以施用的任何哺乳动物患者或者受试者。在本发明的一些实施方案中,患者将患有导致对疾病的降低的抗性的疾病,例如艾滋病。在本发明的示例性实施方案中,为了鉴定用包含根据本发明方法的一种或多种抗体-细胞毒素缀合物分子的药物组合物治疗的受试患者,用可接受的筛选方法确定受试者中现有疾病或者状况的状态或者与靶定的或者怀疑的疾病或者状况有关的危险因素。这些筛选方法包括例如,筛选检查以确定受试者是否患有瘤性疾病。这些和其他途径方法允许临床医生选择需要治疗的受试者。
已知癌症治疗药物与本发明的药物组合物的“相伴施用”指在这样的时间施用抗体-细胞毒素缀合物分子组合物使得已知的药物和本发明的组合物都具有治疗效果。此类相伴施用可以包括关于本发明化合物的施用同时(即,在相同时间)、之前和随后施用抗微生物药物。本领域技术人员将无困难地确定具体药物和本发明的组合物的施用的合适的定时、顺序和剂量。
有效剂量
用于治疗本文描述的免疫相关状况和疾病(例如,转移性癌症)的本发明的抗体组合物(例如,针对激活的整联蛋白受体或者抗体细胞毒素缀合物)的有效剂量取决于许多因素而变,所述因素包括施用方式、靶标部位、患者的生理状态(不管患者是人还是动物)、施用的其他药疗法,和治疗是预防性的还是治疗性的。通常,患者是人,但是也可以治疗非人哺乳动物,包括转基因哺乳动物。治疗剂量需要逐步增加以优化安全性和功效。
对于用抗体施用,剂量范围为约0.0001到100mg/kg,更优选0.01到5mg/kg宿主体重。例如,剂量可以为1mg/kg体重或者10mg/kg体重或者在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每两周施用一次或者每月一次或者每3-6周一次。在一些方案中,具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体同时施用,在该情况中,施用的每种抗体的剂量落入所指出的范围内。抗体通常在多个场合施用。单次剂量之间的间隔可以为每周、每月或者每年的。间隔还可以是不规则的,如通过测量患者中抗体的血液水平所指出的。在一些方法中,调节剂量来实现1-1000μg/ml的血浆抗体浓度,在一些方法中,为25-300μg/ml。备选地,抗体可以作为缓释制剂施用,在该情况中需要较低频率的施用。剂量和频率取决于患者中抗体的半寿期而变。通常,人抗体显示出最长的半寿期,接着是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以取决于治疗是预防性还是治疗性的而变。在预防性应用中,相对低的剂量以相对不频繁的间隔在长时期内施用。一些患者在他们生命的剩余时间内持续接受治疗。在治疗性应用中,有时需要以相对短的时间间隔内施用相对高剂量,直到疾病的发展减慢或者终止,并且优选直到患者显示出该疾病的症状的部分或者完全减轻。之后,可以对患者施用预防方案。
编码免疫原的核酸的剂量可以为每名患者约10ng到1g、100ng到100mg、1μg到10mg,或者30-300μgDNA。感染性病毒载体的剂量可以为每剂10-100或者更多的病毒体。
施用途径
用于诱导免疫应答以治疗免疫相关状况或者疾病(例如,转移性癌症)的的抗体组合物,例如,针对激活的整联蛋白受体的抗体或者抗体细胞毒素缀合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或者肌内途径施用,作为靶定脑病变的抗体制剂的吸入剂用于预防性,和/或治疗性治疗。免疫原性剂的最常用的施用途径是皮下的,尽管其他途径同样有效。第二最常用的途径是肌内注射。该类型的注射在通常在臂或者腿肌肉中进行。在一些方法中,将治疗剂直接注射到已经积累了沉积物的特定组织,例如,颅内注射。对于抗体施用,肌内注射比静脉内灌注优选。在一些方法中,将特定治疗抗体直接注射到颅。在一些方法中,抗体作为缓释组合物或者装置,如MedipadTM装置施用。
本发明的活性剂可以任选与其他治疗剂组合施用,所述其他治疗剂在治疗包括多种免疫相关的疾病的疾病中至少部分有效。对于向脑的肿瘤转移,本发明的治疗剂还可以与增加本发明的治疗剂穿过血脑屏障(BBB)的其他治疗剂一起施用。
制剂
用于诱导免疫应答以治疗免疫相关状况和疾病(例如,转移性癌症)的抗体组合物,例如,针对激活的整联蛋白受体的抗体或者抗体细胞毒素缀合物通常作为药物组合物施用,药物组合物包含活性治疗剂,例如,和多种其他可药用的组分。见Remington′s Pharmaceutical Science,1990上文。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。取决于希望的制剂,组合物还可以包括可药用的、无毒性载体或者稀释剂,其可以定义为常用于配制用于动物或者人类施用的药物组合物的载体。选择稀释剂使得不影响组合的生物学活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液。此外,药物组合物或者制剂还可以包括其他载体、佐剂或者无毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂等等。
药物组合物还可以包括大的缓慢代谢的大分子,如蛋白质,多糖,如壳多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(如乳胶官能化的SepharoseTM、琼脂糖、纤维素等等)、聚氨基酸、氨基酸共聚物,和脂类团聚体(如油滴或者脂质体)。此外,这些载体可以作为免疫刺激剂(例如,佐剂)。
对于肠胃外施用,本发明的组合物可以作为生理上可接受的稀释剂与药物载体中的物质的溶液或者悬浮液可注射的剂量施用,所述药物载体可以是无菌液体,如水、油、盐水、甘油或者乙醇。此外,组合物中可以存在辅助物质,如增湿剂或者乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等等。药物组合物的其他组分是石油、动物、植物或者合成来源的,如花生油、大豆油、和矿物油。通常,二元醇如丙二醇或者聚乙二醇是优选的脂类载体,尤其对于注射液。抗体可以以贮库注射或者植入制剂的形式施用,所述贮库注射或者植入制剂可以以这样的方式配制以便允许活性成分的持续释放。示例性组合物包含在水性缓冲液中配制的5mg/mL的单克隆抗体,所述缓冲液由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成,用HCl调节到pH6.0。
通常将组合物制备成可注射的,作为液体溶液剂或者混悬剂;也可以制备适于注射前溶解或者悬浮在液态载体中的固体形式。制剂还可以乳化或者密封在脂质体或者微粒,如聚交酯、聚乙醇酸交酯或者共聚物中用来增强佐剂效果,如上面讨论。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的制剂可以以贮库注射或者植入制剂的形式施用,所述贮库注射或者植入制剂可以以这样的方式配制以便允许活性成分的持续或脉冲式释放。
适于其他施用方式的其他制剂包括经口的、鼻内和经肺制剂、栓剂和经皮应用。
对于栓剂,粘合剂和载体包括例如,聚(亚烷基)二醇或者甘油三酯;并且此类栓剂可以从含有0.5%到10%,优选1%到2%的活性成分的混合物形成。经口制剂包括赋形剂,如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或者粉剂的形式并且含有10%-95%、优选25%-70%的活性成分。
局部应用可以导致经皮或者皮内递送。通过共同施用活性剂与霍乱毒素或者其脱毒的衍生物或者亚基或者其他相似的细菌毒素可以促进局部施用。Glenn等人,Nature 391:851,1998。使用将组分用作混合物或者作为通过化学交联得到的连接的分子或者表达为融合蛋白,可以实现共同施用。
备选地,使用皮肤贴剂或者使用transferosomes可以实现经皮递送。Paul等人,Eur.J.Immunol.25:3521-24,1995;Cevc等人,Biochem.Biophys.Acta 1368:201-15,1998。
药物组合物通常配制为无菌的、几乎等渗的并且完全按照美国食品和药物管理局的优质生产规范(GMP)规定配制。
细胞毒性
优选地,本文描述的抗体组合物或者抗体细胞毒素缀合物的治疗有效剂量将提供治疗益处而不导致实质毒性。
通过细胞培养或者实验动物中的标准药学方法,例如,通过确定LD50(群体的50%致死剂量)或者LD100(群体的100%致死剂量)来确定本文描述的蛋白质的毒性。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定法和动物研究得到的数据可以用于配制用于人体无毒的剂量范围。本文描述的蛋白质的剂量优选位于循环浓度范围内,所述循环浓度范围包括有很小毒性或者没有毒性的有效剂量。取决于使用的剂型和利用的施用途径,剂量可以在该范围内变动。可以由医生考虑患者的状况选择确切的制剂、施用途径和剂量。(见例如,Fingl等人,1975,ThePharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1)。
药盒
本发明的范围内还包括药盒,其包含本发明的组合物(例如,抗体细胞毒素缀合物、单克隆抗体、人序列抗体、人抗体、多特异性和双特异性分子)和使用说明书。药盒可以还含有至少一种额外试剂,或者本发明的一种或多种额外的人抗体(例如,具有互补活性的人抗体,其结合抗原中与第一种人抗体结合的不同的表位)。药盒通常包括指出药盒的内容物的预期用途的标签。术语标签包括药盒上或内或者随药盒提供的任何书面的或者记录的材料。
示例性实施方案
本文描述的实验还可以见Lilo等人,Chemistry&Biology 11:897,2004,将其内容引入本文作为参考。
实施例1
Pan10的表达和纯化。选择大肠杆菌B834(DE3)(Novagen,Madison,WI)作为用质粒pETflag-Pan 10转化的表达宿主。Mao等人,Proc NatlAcad Sci USA,96:6953-6958,1999。大肠杆菌B834(DE3)/pETflag-Pan 10在37℃下生长在补加100μM羧苄青霉素(RPI Corp.,Mount Prospect,IL)的SB培养基(30%蛋白胨,20%酵母提取物,10%MOPS)中至对数中期(OD600 0.65)。通过加入0.5mM IPTG(RPI Corp.)诱导蛋白质表达。培养物在37℃培育额外的1小时并在26℃培育15小时。通过离心收获IPTG-诱导的大肠杆菌B834/pETflag-Pan10的4L培养物。使用BugBusterProtein Extraction Reagent(Novagen)根据销售商的说明书裂解所得细胞沉淀,而将上清液浓缩到~200mL(EasyLoad,Masterflex from Millipore,Bedford,MA)。当通过0.2μM滤器(Nalgene,Rochester,NY)过滤时,将无细胞裂解物(~100mL)或者浓缩的上清液以1ml/分钟的流速加到事先用PBS(磷酸缓冲盐水)平衡的Anti-Flag M2亲和柱(1.7×5cm,来自Sigma,St.Louis,MO)上。用100mL PBS洗涤后,将flag-标记的Pan10用~20mL甘氨酸缓冲液(0.1M甘氨酸,pH2.5)以约3mL/分钟的流速从柱子洗脱。洗脱液用~1mL 1M Tris Base中和。通过SDS-PAGE(10%Bis-Tris,来自Bio-Rad,Hercules,CA)评估纯度水平。IPTG-诱导的大肠杆菌B834(DE3)/pETflag-Pan 10的4L培养物通常提供3.5-5mg纯化的蛋白质,其60%来自细胞沉淀。
细胞系。将人胰腺腺癌细胞系SW1990(ATCC,Manassas,VA)生长在补加10%FCS(胎牛血清)的Leibovitz的L-15培养基中。在补加低血清生长补充物的培养基106中生长来自成人皮肤的正常人皮肤成纤维细胞(HdFa)(Cascade Biologies,Portland,OR)。
通过全细胞ELISA进行SW1990结合测定。将SW1990细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮在PBS中至106个细胞/mL的浓度。将150μL等分试样倒入96孔ELISA板(Corning Incorporated,Canton,NY的组织培养物处理的平底板)并在37℃温育以完成蒸发(注意仅两行孔含有培养基)。用PBS中的0.025%Tween 20(Sigma,St.Louis,MO)洗涤平板4次,用PBS中的1%BSA(来自Sigma的牛血清白蛋白)封闭,用去离子水洗涤一次并pat干燥。向平板加入1%BSA/PBS中的顺序稀释的Pan 10(0.1-0mg/mL,游离或者缀合的)的100μL等分试样。一个无细胞行与Pan10温育而其他的缺少Pan10。然后将平板在37℃温育1小时并随后用蒸馏水洗涤10次。向所有孔中加入1%BSA/PBS中的30μL M2抗-fag/HRP(1.1μg/mL,Sigma)等分试样并将平板在37℃温育1小时。最后,用蒸馏水充分洗涤后,在TMB和H2O2(Pierce,Rockford,IL)存在下对平板显影并在450nM用Spectra Max 250平板读出器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)读数。
Pan10突变。使用标准PCR技术,通过对模板pETflag-Pan10进行位点定向诱变产生突变体Pan10S73C和Pan10S131C。用于引入突变的PCR条件如下:在95℃变性10分钟;30个循环的扩增;72℃延伸2分钟;95℃变性30秒;60℃退火1分钟并在72℃补齐7分钟。在第二个阶段中,突变基因的两半重叠(温度程序:95℃变性10分钟;20个循环的扩增;72℃延伸2分钟;95℃变性30秒;50℃1退火1分钟并72℃补齐7分钟)。最后,在第三个阶段,使用两个末端引物扩增重叠PCR的产物(温度程序:95℃变性10分钟;30个循环的扩增;72℃延伸2分钟;95℃变性30秒;55℃1退火1分钟并72℃补齐7分钟)。用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化扩增的产物,用SfiI(New England BioLabs,Beverly,MA)消化,纯化并连接(T4 DNA连接酶,New England BioLabs)到SfiI消化并纯化的pETflag。通过使用末端引物进行全长DNA测序(The Protein and Nucleic Acids CoreFacility at The Scripps Research Institute,La JoIIa,CA)证实Pan10突变体的序列。
Pan10硫醇化。在10倍化学计量过量的Traut′s试剂(Pierce)存在下将Pan 10(4mg/mL)在50mM三乙醇胺、1mM EDTA和150mM NaCl(pH8.7)中4℃恒定搅拌下温育5小时。所得混合物用PD-10柱(Pharmacia,Peapack,NJ)脱盐,用50mM Hepes pH8洗脱并通过离心超滤(YM 10,000滤器,Millipore)浓缩。脱盐的scFv溶液中游离硫醇的浓度通过Ellman测定法测定。
Ellman测定法。将~30μM硫醇化的scFv或者标准二硫苏糖醇(DTT,ICN,Costa Mesa,CA)和600mM 5,5’-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)(Ellman试剂,Sigma)的75%甲醇溶液以13000转/分钟(rpm)离心5分钟。将上清液转移到96-孔ELISA平板(Fisher,Ottawa,Ontario)并在Spectra Max 25平板读出器(Molecular Devices)中读出Abs412。通过从已知浓度的DTT对对应的Abs412作图得到的标准曲线外推游离硫醇的浓度。
Duocarmycin SA类似物的合成(见图5(括号内出现的所有数字参考图5))。使用的所有化学品都从Aldrich(St.Louis,MO)购买。以前已经报导了3-(5-乙酰基吲哚-2-羰基)-1-(S)-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(1)的合成。Parrish等人,Bioorg Med Chem,11:3815-3838,2003。Boc-保护的3-[5-(1-(3-氨基丙基)吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(10)的合成如下:
1-(3-苯二甲酰亚氨基丙基)吲哚-2-甲酸甲酯(5)。用氢化钠(矿物油中60%悬浮液,167mg,4.18mmol)处理0℃下二甲基甲酰胺(31mL)中吲哚-2-甲酸甲酯(550mg,3.14mmol)的溶液,并允许在25℃保温30分钟。将反应混合物冷却到0℃并用N-(3-溴代丙基)苯邻二甲酰亚胺(1.26g,4.71mmol)处理。允许混合物在25℃保温30分钟并在55℃保温30分钟,之后冷却并加入水(30mL)淬灭。将反应混合物用乙酸乙酯(2×40mL)萃取并用水(40mL)洗涤合并的有机层,干燥(Na2SO4),并真空浓缩。急骤层析(硅胶,0-50%乙酸乙酯/己烷)提供5,产率为62%。
1-[3-(叔-丁氧基羰基)氨基丙基]吲哚-2-甲酸甲酯(6)。将乙醇(14mL)中的5(500mg,1.39mmol)的悬浮液在0℃用肼(200μL,4.14mmol)处理。反应混合物在0℃搅拌1小时,然后允许3小时内升温到25℃,之后真空浓缩。溶解在氯仿(10mL)中的残渣用叔丁氧基羰基酐(602mg,2.76mmol)和饱和的碳酸钠水溶液(10mL)处理。反应混合物在25℃搅拌12小时,之后用氯仿(3×100mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机层,并真空浓缩。急骤层析(硅胶,10-30%乙酸乙酯/己烷)提供6,产率为91%。
5-(1-{3-[N-(叔-丁氧基羰基)氨基]丙基}吲哚-2-羰基)-氨基吲哚-2-甲酸乙酯(8)。将6(332mg,1.0mmol)在10mL二烷/H2O(4∶1)中的溶液用4NLiOH(1mL)处理并在25℃搅拌15小时。加入1N HCl水溶液(10ml),并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取混合物。干燥(Na2SO4)合并的有机层,并真空浓缩,得到7,产率为92%。
将7(63.6mg,0.2mmol)和5-氨基吲哚-2-甲酸乙酯(61.3mg,0.3mmol)在二甲基甲酰胺(4mL)中的溶液用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(115mg,0.6mmol)处理。反应混合物在25℃搅拌18小时并加入15%柠檬酸水溶液(10mL)淬灭。用乙酸乙酯(75mL和2×25mL)萃取反应混合物,合并的有机层用饱和NaCl水溶液(3×10mL)洗涤,干燥(Na2SO4),并真空浓缩。急骤层析(硅胶,33%乙酸乙酯/己烷)提供8,产率为52%。
5-(1-{3-[N-(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}吲哚-2-羰基)吲哚-2-甲酸(9)。将8(50.5mg,0.1mmol)在2mL二烷/H2O(4∶1)中的溶液用4N LiOH(200μL)处理并在25℃搅拌混合物18小时。加入0.5N HCl水溶液(5ml),并用乙酸乙酯萃取混合物(2×30mL)。干燥(Na2SO4)合并的有机层,并真空浓缩。从四氢呋喃/己烷结晶得到9,产率为92%。
3-[5-(1-{3-[N-(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e1吲哚(10)。将(-)-seco-N-Boc-CBI(25mg,75μmol,天然对映异构体)在10mL 4N HCl(乙酸乙酯)中的溶液在25℃搅拌1小时,之后在N2流下除去溶剂。Boger等人,J Org Chem,55:5823-5832,1990。高真空下干燥残渣3小时并加入9(39.5mg,83μmol)。加入二甲基甲酰胺(2mL)中的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(43mg,225μmol)并在25℃下搅拌反应混合物14小时,之后真空浓缩反应混合物。急骤层析(硅胶,20%四氢呋喃/己烷)提供10,产率为44%。
3的合成。将1(3.0mg,7.2μmol)、马来酰亚胺基丙酸酰肼四氢呋喃盐(6mg,20μmol)、四氢呋喃(1μL)和粉碎的3分子筛在0.2mL二甲基甲基甲酰胺的混合物过夜搅拌。溶剂蒸发时,残渣溶解在二氯甲烷中并且通过硅胶薄层层析纯化。得到3,产率为47%。
4的合成。将化合物10(5mg,7.2μmol)用二氯甲烷中的50%三氟乙酸处理30分钟。当三氟乙酸蒸发时,粗品游离胺溶解在0.1mL二甲基甲酰胺中并加入含有马来酰亚胺基丙酸(2.0mg,12μmol)、O-苯并三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟-磷酸盐(4.2mg,11mmol)和N-甲基吗啉(3.2μL,29μmol)的二甲基甲酰胺溶液。搅拌混合物2小时并蒸发溶剂。通过硅胶薄层层析纯化残渣。得到4,产率为57%。
硫醇化的Pan10的缀合。向50μL Pan10(50mM Hepes中~4mg/mL)中以2分钟的间隔加入DMSO中的20mM荧光素马来酰亚胺(MolecularProbes,Eugene,OR)、3或者4的3×1μL等分试样。在摇床上4℃下温育所得反应混合物10h。通过大小排阻层析(PD-10柱,Pharmacia)从缀合的Pan10和游离Pan10分离游离染料或者游离药物。通过将脱盐混合物的Abs492nm和Abs280nm(Ultrospec 2000,Pharmacia)拟合到等式1计算缀合荧光素的Pan10的百分比产率:
(Abs492/59880ax100)/((Abs280-(0.2xAbs492)/1.35b)/scFv-FM MW)
等式1
a:为荧光素-马来酰亚胺实验确定的ε492
b:通常IgG采用的ε280
通过计算药物缀合步骤后残留的游离scFv的量来间接确定3或者4与scFv的比率。Pan10-药物缀合物和游离Pan10的混合物与荧光素-马来酰亚胺反应并认为荧光素-Pan10(如上述确定)的量对应于不结合药物的Pan10的全部量。通过将scFv-药物+游离scFv缀合到荧光素的马来酰亚胺衍生物后得到的脱盐混合物的Abs492nm和Abs280nm拟合到等式2计算Pan10与3或者4缀合的百分比产率:
100-((Abs492/59880ax100)/((Abs280-(0.2xAbs492)/1.35b)/scFv-FM MW))
等式2
质谱法。在Voyager DE Biospectrometry Workstation (PerSeptiveBiosystems,Framingham,MA)上以线性方式使用氮激光(337nm)和芥子酸(Sigma)作为基质进行基质-辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI-MS)。在乙腈和0.1%三氟乙酸水溶液的1∶1混合物中新鲜制备基质溶液作为饱和溶液。通过用基质稀释脱盐的蛋白质溶液1∶10并将0.7μL所得悬浮液直接沉积在不锈钢MALDI靶孔上制备用于MALDI-MS分析的样品。用马细胞色素C和兔肌肉醛缩酶(Sigma)进行两点外部校准来校准所得质量。以正离子方式用140-ns延迟提取收集所有光谱并对约50个激光照射(shot)进行总计。
一锅(one-pot)抗体缀合。在恒定搅拌下,10倍化学计量过量的Traut试剂(Pierce)和等过量的荧光素马来酰亚胺(Molecular Probes)、3或者4的存在下,将50mM三乙醇胺、1mM EDTA和150mM NaCl(pH 8.7)中的Pan10(4mg/mL)在4℃温育8小时。用PD-10柱对所得混合物脱盐,用PBS稀释并通过离心超滤(YM 10,000滤器,Millipore)浓缩到~4mg/mL。
共焦显微术。将SW 1990或HdFa细胞用胰蛋白酶消化,重悬浮在PBS中并计数。将104-105个细胞接种到腔式载玻片(Nunc,Naperville,IL)的孔中并允许在37℃贴壁24小时。当更换培养基(500μL/孔)时,加入10μL~3mg/mL浓缩的Pan10-荧光素或者92H2-荧光素(阴性对照)并将细胞在37℃温育30分钟、1、2或3小时。然后将细胞用它们各自的培养基洗涤10次并用PBS洗涤1次,然后将它们固定并用95%乙醇透化5分钟,用PBS洗涤一次,用碘化丙锭(Sigma,PBS中1∶50稀释)染色1分钟,用PBS洗涤5次并加入抗褪色溶液(Slow Fade,Molecular Probes)后用盖玻片密封。用激光扫描共焦显微镜(MRC1024,Bio-Rad)观察载玻片。
FACS分析。将SW1990或HdFa细胞用胰蛋白酶消化,用冷PBS洗涤并等分试样(~5×105个细胞/管)。然后加入一级抗体(W6/32,NovusBiologicals,Littleton,CO;P1B5,Chemicon,Temecula,CA;或者P5D2,Chemicon)(终浓度10μg/mL)并在冰上进行温育45分钟。然后用冷PBS洗涤细胞并在FITC标记的山羊抗小鼠Ab(Pierce,Rockford,IL)存在下在冰上温育45分钟。用冷PBS进行最后洗涤后,接着PI复染并分析(FACScan,Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。
倒置显微术。将SW1990细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮在PBS中并计数。将500μL生长培养基中的104-105个细胞接种到腔式载玻片(Nunc)的孔中并允许在37℃贴壁24小时。通过含有400nM Pan 10-3、Pan10-4、Pan10-FM或wt-Pan10的培养基替换旧培养基。每天用倒置显微镜(ZeissImm,Thomwood,NY)观察细胞,为期7天。
细胞增殖测定。通过使用Vybrant MTT细胞增殖测定试剂盒(Molecular Probes)定量scFv-药物或者游离药物的细胞毒性。用含有300μL的无苯酚生长培养基中的2×104个SW1990(HdFa)细胞/孔的48孔微量滴定板进行测定。允许细胞贴孔12小时。为了测定IC50,将细胞在37℃与不同浓度的Pan-10药物缀合物、马来酰亚胺衍生物或者游离药物温育3或者12小时。然后在无缀合物/药物的培养基中继续温育并在第7天结束时进行MTT测定。用含有1.2mM MTT的新鲜培养基100μL更换培养基并继续培育3小时。然后通过加入100μL含有SDS(100mg/mL)的HCl的10mM溶液裂解细胞。允许细胞裂解继续进行8小时,结束时将平板以3000rpm离心3分钟并将上清液转移到96孔板并在570nM读数。每个测定包括用游离Pan10处理的阴性对照和缺少细胞的阳性对照。所有测定进行至少两次。用不同浓度的细胞毒性剂得到一组8个数据点。为了得到IC50值,用Grafit5(Leatherbarrow R.J.2003.Grafit版本5.08,Erithieus SoftwareLtd,Staines,England)对来自每个组的数据点拟合通过等式3定义的S形剂量反应曲线。
ya=min y+[(max y-min y)/(1+(IC50/xb)斜率)] (等式3)
ay=%活细胞
bx=药物的浓度(药物-scF)
丢弃极端值的数据点(通常每个实验1-2个)。
实施例2
Pan10表达、纯化和位点定向诱变。为了使用Pan10作为将duocarmycin类似物递送到恶性癌细胞的工具,将无噬菌体的Pan10表达为27,868kDa的scFv(表1)并纯化至均匀(图2,泳道4)。因为典型的VL和VH结构域每个都具有埋藏的单个二硫键,但是没有没有半胱氨酸,所以,我们研究了一些策略意在使得可以在Pan10的表面上得到自由硫醇基和将修饰的scFv缀合到马来酰亚胺衍生的药物。Padlan,Molecular BiologyIntelligence Unit:Antibody-Antigen complexes(Austin,TX,Landes,R.G.),17-30,1994。
表1:质谱分析的结果
分析物 | 计算的MW(g/mol) | 实验质量(m/z) | 分子比率a(Pan10∶Fm/药物 |
-马来酰亚胺) | |||
Pan10 | 27610 | 27868 | - |
Pan10-FM | 28216 | 28388 | 0.997 |
Pan10-3 | 28297 | 28634 | 1.003 |
Pan10-4 | 28456 | 28545 | 0.994 |
a从MR测量的=MW缀合物-MWPan10/MWFM/药物-马来酰亚胺,使用MALDI测量的MW |
最初的方法针对使用通过位点定向诱变掺入到野生型Pan10序列的半胱氨酸进行的单个位点特异缀合。在试图保存scFv结合亲和性中,首先将半胱氨酸残基导入Pan10的接头区。此外,通过商业途径可获得的马来酰亚胺衍生的荧光素(FM)用作灵敏试剂来优化和定量缀合方案。当接头残基S131、G130、G128或G127的任一个突变成半胱氨酸时,用FM缀合突变体的效率仅与野生型Pan10的相似,其可能是由于接头区和半胱氨酸残基被隔离在Pan10结构内。根据Pan10的WAM(Web Antibody Modelingc/o University of Bath At Swindon,Oakfield Campus,Marlowe Avenue,Walcot Swindon Wilts,LJK)理论结构,选择似乎表面暴露的一些其他残基。为了保留Pan10的肿瘤细胞结合和内化能力,仅考虑构架残基。
当更多暴露的残基S73或者S197被突变时实现了提高的FM缀合,该提高可能是由于接头残基的可及性。实现的缀合效率最高为68%。
scFv Pan10的化学修饰。通过位点定向诱变插入自由半胱氨酸存在一些缺点:如果突变的残基不是溶剂可及的,那么它将可能经历氧化或者诱导二聚化,需要额外的还原-纯化步骤,其随后的反应必须在惰性气体中进行。Yang等人,Protein Eng,16,761-770,2003。从而改为研究在Pan10上硫醇基的化学加入。
最初,在两个单独的步骤进行对马来酰亚胺衍生的分子的硫醇化和缀合:通过将Pan10与2-亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(Traut′s试剂)反应导入自由硫醇基,2-亚氨基硫杂环戊烷是与赖氨酸残基反应的胺清除剂。Pan10序列中12个赖氨酸的存在具有导致大量和潜在有害的修饰的潜力;然而,因为10个赖氨酸存在于构架区,因此它们的修饰将不可能影响Pan10对整联蛋白α3β1的结合。全细胞ELISA(酶联免疫吸附测定)揭示野生型Pan10和硫醇化Pan10的结合几乎不可区分。硫醇化Pan10的非还原SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析(图2)揭示二聚体和更高的聚合物的依赖于时间的形成(图2A,泳道2),其导致用于药物缀合的自由硫醇基的数目不断减少。为了避免该问题,在硫醇化后立即进行随后的药物缀合步骤,从而提高偶联效率和减少二聚化。进一步改进是使用一步程序得到的,其中在一锅中发生硫醇化和缀合。使用该方法对修饰的Pan10的SDS-PAGE分析揭示二聚体的仅仅可忽略的形成(图2A,泳道3)。其他scFv可以利用该程序。
马来酰亚胺衍生的药物。马来酰亚胺部分通过酸不稳定的腙键附着到duocarmycin SA类似物1,得到马来酰亚胺衍生物3(图1)。腙键方法广泛用于抗体-药物缀合物作为细胞毒性药物内化到溶酶体时的控释途径,在溶酶体中pH值比胞质溶胶中稍低(pH=5.0-5.5)。Kaneko等人,BioconjugChem,2:133-141,1991。该策略已经证明在许多情况下在临床上有效,如在Bristol-Myers Squibb对BR96-DOX的开发和Wyeth对Mylotarg的设计中。作为比较,我们通过pH不敏感的酰胺基衍生duocarmycin类似物2,产生马来酰亚胺衍生物4(图1)。
Pan10缀合到马来酰亚胺衍生的分子。如上述,硫醇化的Pan10最初缀合到FM得到Pan10-FM以便测试并直接显示被胰腺癌细胞的内化。随后,将硫醇化的Pan10缀合到马来酰亚胺衍生物3和4,分别得到缀合物Pan10-3和Pan10-4。使用我们的两步偶联方法,发现荧光素(通过UV/Vis光谱和基质辅助的激光解吸/电离质谱法(MALDI-MS)测量缀合效率)、3或者4(通过MALDI-MS测量缀合效率)与Pan10的比率接近1∶1(表1)。当在一步中进行缀合和硫醇化时,荧光素与Pan10的比率为2∶1(仅仅通过UV/Vis光谱测量缀合效率)。缀合效率的差异可能是由于不存在硫醇淬灭小分子时硫醇化的Pan10的聚合所致。实际上,通过对两个单独步骤中所得Pan10-药物缀合物的SDS-PAGE(图2)和大小排阻层析检测到一些额外的更高的分子量种类。
已经对其他scFv(αvβ3特异抗体Bc-12和Bc-15[Felding-Habermann等人,递交待发表的手册]和可卡因特异性抗体92H2)测试了一锅scFv缀合方法,提供了荧光素∶蛋白质的3∶1的最大比率而不损失抗原结合活性(数据未显示)。Redwan等人,Biotechnol Bioeng,82:612-618,2003。这种缀合方法可以应用于多种scFv。
Pan10缀合物的生物学活性。一些方法用于研究我们的Pan10缀合物的生物学活性。用共焦显微术分析研究Pan10-FM与SW1990细胞的相互作用相比与正常人皮肤成纤维细胞细胞系(HdFa)的特异性。我们的结果表明Pan10-FM被SW1990细胞以依赖于时间的方式内化(图3)。此外,第二小时的温育后,这些癌性细胞的内化比非癌性HdFa中更明显。这些发现证实Pan10-FM缀合物保持Pan10的野生型活性并且提供了证据证明在胰腺癌细胞中,整联蛋白α3β1的过表达相比用作非癌细胞类型模型的HdFa允许一定的选择性。
通过倒置显微术检查用Pan10、Pan10-FM、Pan10-3或Pan10-4处理的SW1990细胞以定性确定药物缀合物对细胞存活力的影响。培养几天后,用Pan10或Pan10-FM处理的细胞扩大成健康菌落,而用Pan10-药物缀合物处理的细胞已经死亡或者显示出过度空泡形成,表明晚期凋亡(图4)。与游离药物的毒性相比,Pan10-药物缀合物的毒性效果然后通过MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)细胞增殖测定法定量。Liu等人,J Neurochem,69:581-593,1997;Berridge等人,ArchBiochem Biophys,303:474-482,1993;Vistica等人,Cancer Res,51:2515-2520,1991。接种SW1990胰腺腺癌细胞并允许在生长培养基中过夜贴壁。然后用递增浓度的游离药物或者Pan10-药物缀合物处理培养物3或者12小时。
7天后,活细胞数目表明Pan10-药物缀合物的明显的细胞生长抑制/细胞毒性效果,特别在12小时的药物暴露时间后(表12)。对游离药物测量的IC50(抑制浓度50%)值比以前得到的值高2到3个数量级(2=30pM;1=2pM[对2得到])。Parrish等人,Bioorg Med Chem,11:3815-3838,2003。该不一致可能是由于所用的细胞系、药物暴露的持续时间和所选细胞毒性测定法的差异。在本研究中,游离药物比对应的Pan10-药物缀合物具有更有效的细胞毒性效果,特别是短时间暴露后。该效果可能是由于当游离药物通过原生质和核膜扩散时,细胞核中游离药物的更立即的可用性,其中细胞核中DNA是作用部位。进一步的证据来自如下观察:当延长温育时间时,游离药物和Pan10-药物缀合物之间功效差异显著减小。12小时的温育时间后,Pan10-4缀合物与游离化合物2一样有效。
表2:对SW1990细胞进行的MTT测定的结果
细胞毒性剂 | IC50(nM) | IC50(nM)d |
1 | 1.4±0.2b | 0.43±0.17 |
Pan10-3(1∶1)a | 94.3±3.6c | 2.7±0.3 |
Pan10-3(1∶2)a | 251.3±75.8b | 22.6±3.8 |
2 | 32.1±13.1b | 4.3±0.2 |
Pan10-4(1∶1)a | 97.9±38.6c | 4.4±0.7 |
Pan10-4(1∶2)a | 1528±369.4b | 180.8±30.6 |
ascFv与药物的比率b四个实验的平均值。用药物温育3小时c两个实验的平均值。用药物温育3小时d两个实验的平均值。用药物温育12小时 |
Pan10-3(scFv∶药物=1∶1)显示出与Pan10-4(scFv∶药物=1∶1)相似的细胞毒性。该结果与对每个scFv分子携带两个药物分子的缀合物观察到的较低细胞毒性一起提示,通过腙键衍生药物没有优点。该结果还暗示Pan10缀合物的内吞机制不能涉及向低pH环境的转移并且当细胞内化时,药物保持连接到完整的Pan10或者连接到从Pan10的细胞内蛋白酶解得到的肽。此类假定的复合体的残留活性并不奇怪,因为在scFv和药物之间使用的连接物可能足够长以允许与DNA靶标的相互作用并且保留细胞毒性。实际上,其中细胞毒性作用不需要药物从scFv/scFv衍生的肽释放的缀合物可以是有利的,尤其在细胞内化机制的背景中。以这种方式,与游离药物相比,scFv/肽-药物可能通过减小的被动(扩散)和主动流出过程更有效地被捕获在细胞内。总之,该机制将导致高细胞内浓度的药物的依赖于时间的积累,提供有效的癌细胞杀死的潜力、优秀的治疗指数和获得药物抗性的可能性降低。
最后,在对正常HdFa细胞进行的Pan10-3和Pan10-4的测试中,观察到细胞毒性的IC50比对SW1990癌细胞的细胞毒性的IC50分别高~3到5倍,而游离的1对于两种细胞系具有基本上相同的IC50值。该结果和通过FACS(荧光激活细胞分选)的测量之间存在相关性,FACS测量表明与HdFa细胞相比,在SW1990细胞上α3整联蛋白表达高5倍。
实施例3
含有自由硫醇的化学修饰的抗整联蛋白α3β1scFc Pan10可以缀合到有效的细胞毒性剂duocarmycin SA的马来酰亚胺衍生的类似物。抗体Pan10缀合物保留穿透表达整联蛋白α3β1的细胞的能力。具体地,Pan10-药物缀合物在体外对胰腺癌细胞显示出极好的细胞毒性作用。考虑到与本文描述的游离药物相比,scFv缀合物的独特优点,该第一步是重要的,所述游离药物非常有效但是不是临床上可行的抗癌剂。缀合物可以将这些药物分子更特异地递送到表达整联蛋白α3β1的癌细胞内,并且抗体药物缀合物的有效递送将允许减小治疗药物暴露和增强功效。使用这种策略,实验将进一步完善scFv-药物设计在癌症治疗中的潜力。
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尽管为了清楚地理解,通过阐明和实施例详细描述了本发明,但是本领域技术人员根据本发明的教导将显而易见的是,可以对其作出某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神或者范围。
Claims (51)
1.治疗哺乳动物中瘤性疾病的方法,其包括:
提供抗体-细胞毒素缀合物,该缀合物在抗体和细胞毒素之间具有酸稳定的共价键,并
对所述哺乳动物施用所述抗体-细胞毒素缀合物,从而所述缀合物在哺乳动物细胞内内化以治疗所述瘤性疾病。
2.权利要求1的方法,其中所述细胞毒素是抗肿瘤抗生素、duocarmycin、duocarmycin A、duocarmycin SA,或者其类似物。
3.权利要求1的方法,其中所述酸稳定的键是酰胺键。
4.权利要求3的方法,其中所述酰胺键是N-取代的酰胺键。
5.权利要求1的方法,其中所述缀合物的抗体部分特异结合激活的整联蛋白受体。
6.权利要求5的方法,其中所述激活的整联蛋白受体在转移态的细胞上与相似的非转移细胞相比差别地产生。
7.权利要求6的方法,其中所述激活的整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者αvβ3整联蛋白受体。
8.权利要求1的方法,其中所述缀合物的抗体部分是单链Fv抗体。
9.权利要求1的方法,其中所述瘤性疾病选自实体瘤、血液学恶性、白血病、结肠直肠癌、良性或者恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合征、子宫内膜息肉、鳞状细胞癌、头和颈的鳞状细胞癌、肝细胞癌、肝细胞癌的肝内转移、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫内膜异位、腺癌、胰腺腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或者成星形细胞瘤。
10.用于治疗哺乳动物中瘤性疾病的方法,其包括提供抗体-细胞毒素缀合物,该缀合物在抗体和细胞毒素之间具有酸不稳定的共价键,
对所述哺乳动物施用所述抗体-细胞毒素缀合物,从而所述缀合物在哺乳动物的细胞内内化以治疗所述瘤性疾病。
11.权利要求10的方法,其中所述细胞毒素是抗肿瘤抗生素、duocarmycin、duocarmycin A、duocarmycin SA,或者其类似物。
12.权利要求10的方法,其中所述酸不稳定的共价键是腙键。
13.权利要求12的方法,其还包括施用所述抗体-抗肿瘤抗生素缀合物从而通过切割酸不稳定的腙键在哺乳动物细胞内内化所述缀合物。
14.权利要求10的方法,其中所述抗体特异结合激活的整联蛋白受体。
15.权利要求14的方法,其中所述激活的整联蛋白受体在转移态的细胞上与相似的非转移细胞相比差别地产生。
16.权利要求15的方法,其中所述激活的整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者αvβ3整联蛋白受体。
17.权利要求10的方法,其中所述缀合物的抗体部分是单链Fv抗体。
18.权利要求10的方法,其中所述瘤性疾病选自实体瘤、血液学恶性、白血病、结肠直肠癌、良性或者恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合征、子宫内膜息肉、鳞状细胞癌、头和颈的鳞状细胞癌、肝细胞癌、肝细胞癌的肝内转移、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫内膜异位、腺癌、胰腺腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或者成星形细胞瘤。
19.合成抗体-细胞毒素缀合物分子的方法,其包括:向一个容器中导入抗体、硫醇化试剂,和马来酰亚胺衍生的细胞毒素;
将所述抗体与所述硫醇化试剂接触形成硫醇化的抗体,并
将所述硫醇化抗体与所述马来酰亚胺衍生的细胞毒素接触以形成抗体-细胞毒素缀合物分子。
20.权利要求19的方法,其中所述马来酰亚胺衍生的细胞毒素包含马来酰亚胺和细胞毒素之间的酸不稳定的腙键。
21.权利要求19的方法,其中所述马来酰亚胺衍生的细胞毒素包含马来酰亚胺和细胞毒素之间的酰胺键。
22.权利要求19的方法,其中所述细胞毒素是抗肿瘤抗生素、duocarmycin、duocarmycin A、duocarmycin SA或者其类似物。
23.权利要求22的方法,其中所述抗肿瘤抗生素是duocarmycin SA的羰基取代的CBI-吲哚类似物。
24.权利要求22的方法,其中所述抗肿瘤抗生素是duocarmycin SA的酰胺取代的CBI-吲哚类似物。
25.权利要求23的方法,其中所述马来酰亚胺衍生的细胞毒素是1-[3-(N’-{1-[2-(1-氯代甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羰基)-1H-吲哚-5-基]-亚乙基}-肼基)-3-氧代-1-丙基]马来酰亚胺。
26.权利要求24的方法,其中所述马来酰亚胺衍生的细胞毒素是3-[5-[1-{3-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]丙基}吲哚-2-羰基]氨基吲哚-2-羰基]-(1-氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
27.权利要求19的方法,其中所述硫醇化试剂是2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)。
28.权利要求19的方法,其中所述抗体是单链Fv抗体。
29.化合物3-[5-(1-(3-氨基丙基)吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
31.权利要求30的化合物,其中R2是C1到C6烷基。
32.权利要求30的化合物,其中卤素是Cl、Br或者F。
33.化合物3-[5-(1-(3-氨基丙基)吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
34.化合物3-[5-[1-{3-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]丙基}吲哚-2-羰基]氨基吲哚-2-羰基]-(1-氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
35.药物组合物,其包含至少一种可药用载体或者赋形剂和有效量的权利要求30的化合物,其中马来酰亚胺部分缀合到单链Fv抗体。
36.权利要求35的组合物,其中所述单链Fv抗体能够结合整联蛋白受体。
37.权利要求36的组合物,其中所述整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者αvβ3整联蛋白受体。
38.方法,其包括对哺乳动物施用权利要求36的组合物。
39.减轻认为对用缀合duocarmycin SA的酰胺取代的CBI-吲哚类似物的抗体治疗响应的哺乳动物中疾病状态的方法,其包括对该哺乳动物施用治疗量的权利要求36的组合物。
40.权利要求36的方法,其中所述化合物是化合物是3-[5-(1-(3-氨基丙基)吲哚-2-羰基)氨基吲哚-2-羰基]-1-(氯代甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚。
41.权利要求39的方法,其中所述疾病状态是瘤性疾病。
42.权利要求40的方法,其中所述瘤性疾病选自实体瘤、血液学恶性、白血病、结肠直肠癌、良性或者恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合征、子宫内膜息肉、鳞状细胞癌、头和颈的鳞状细胞癌、肝细胞癌、肝细胞癌的肝内转移、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫内膜异位、腺癌、胰腺腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或者成星形细胞瘤。
44.化合物1-[3-(N’-{1-[2-(1-氯代甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羰基)-1H-吲哚-5-基]-亚乙基}-肼基)-3-氧代-1-丙基]马来酰亚胺。
45.药物组合物,其包含至少一种可药用载体或者赋形剂和有效量的权利要求43的化合物,其中所述马来酰亚胺部分缀合到单链Fv抗体。
46.权利要求45的组合物,其中所述单链Fv抗体是针对整联蛋白受体的抗体。
47.权利要求46的组合物,其中所述整联蛋白受体是α3β1整联蛋白受体或者αvβ3整联蛋白受体。
48.方法,其包括对哺乳动物施用权利要求46的组合物。
49.减轻认为对用缀合duocarmycin SA的羰基取代的CBI-吲哚类似物的抗体治疗响应的哺乳动物中疾病状态的方法,其包括对该哺乳动物施用治疗量的权利要求46的组合物。
50.权利要求49的方法,其中所述疾病状态是瘤性疾病。
51.权利要求50的方法,其中所述瘤性疾病选自实体瘤、血液学恶性、白血病、结肠直肠癌、良性或者恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合征、子宫内膜息肉、鳞状细胞癌、头和颈的鳞状细胞癌、肝细胞癌、肝细胞癌的肝内转移、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫内膜异位、腺癌、胰腺腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或者成星形细胞瘤。
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