CN108473575A - 抗-bcma多肽和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

公开了能够特异性结合并免疫识别B‑细胞成熟抗原(BCMA)的多肽和蛋白质。还公开了与所述多肽和蛋白质有关的嵌合抗原受体(CAR)、抗‑BCMA结合部分、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、药物组合物和缀合物。还公开了检测癌症存在的方法以及治疗或预防癌症的方法。

Description

抗-BCMA多肽和蛋白质
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2015年11月13日提交的美国临时专利申请第62/255,255号和2015年11月19日提交的美国临时专利申请第62/257,493号的权益，将其各自通过引用整体并入本文。
以电子方式提交的材料的通过引用并入
通过引用整体并入本文的是与本文同时提交并标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：一个日期为2016年10月7日的名为“726736_ST25.txt”的7,149字节ASCII(文本)文件。
发明背景
癌症是公共健康问题。尽管诸如化疗的治疗取得了进展，但许多癌症(包括多发性骨髓瘤)的预后可能较差。因此，存在对于癌症，特别是多发性骨髓瘤的另外治疗的未满足的需求。
发明简述
本发明的一个实施方案提供了包含抗体BM24或BM306的互补决定区(CDR)序列的多肽。
本发明的另一个实施方案提供了包含(a)SEQ ID NO:1-6或(b)SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列的多肽。
本发明的其它实施方案提供了与本发明的多肽和蛋白质相关的相关抗-BCMA结合部分、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、缀合物和药物组合物。
本发明的另外实施方案提供了检测哺乳动物中癌症的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法。
附图中几个视图的简述
图1A是显示了在向小鼠注射肿瘤细胞后的各个时间点(天数)用PBS(菱形)或LMB-38(正方形)处理的小鼠中的肿瘤体积(mm3)的图。箭头指示向小鼠施用免疫毒素的日期。
图1B是显示了在向小鼠注射肿瘤细胞后的各个时间点(天数)用PBS(菱形)或LMB-70(正方形)处理的小鼠中的肿瘤体积(mm3)的图。箭头指示向小鼠施用免疫毒素的日期。
图2是显示了在向小鼠注射肿瘤细胞后的各个时间点(天数)用对照(媒介物)(菱形)、仅LMB70(实心正方形)、仅阿普拉克西纳(abraxane)(圆圈)或者阿普拉克西纳和LMB70的组合(空心正方形)处理的小鼠中的肿瘤体积(mm3)的图。在第15、16、18、20、23和25天向小鼠施用免疫毒素。
图3A是显示在暴露于对照(正方形)、2ng/ml LMB70(菱形)、10ng/ml LMB70100ng/ml LMB70(▲)或CHX(圆圈)2小时后各个时间点(天数)的存活细胞数/ml的图。
图3B是显示在暴露于对照(正方形)、2ng/ml LMB70(菱形)、10ng/ml LMB70100ng/ml LMB70(▲)或CHX(圆圈)2小时后各个时间点(天数)的存活细胞百分比的图。
图3C是显示在暴露于对照(正方形)、2ng/ml LMB70(菱形)、10ng/ml LMB70100ng/ml LMB70(▲)或CHX(圆圈)6小时后各个时间点(天数)的存活细胞数/ml的图。
图3D是显示在暴露于对照(正方形)、2ng/ml LMB70(菱形)、10ng/ml LMB70100ng/ml LMB70(▲)或CHX(圆圈)6小时后各个时间点(天数)的存活细胞百分比的图。
图4A是显示在暴露于单独的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nM BTX(菱形)、3nMBTX或6nM BTX(无毒素)(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞数/ml的图。
图4B是显示在暴露于单独的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nM BTX(菱形)、3nMBTX或6nM BTX(无毒素)(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞百分比的图。
图4C是显示在暴露于与2ng/ml LMB70组合的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nMBTX(菱形)、3nM BTX或6nM BTX(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞数/ml的图。
图4D是显示在暴露于与2ng/ml LMB70组合的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nMBTX(菱形)、3nM BTX或6nM BTX(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞百分比的图。
图5A是显示在暴露于与6ng/ml LMB70组合的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nMBTX(菱形)、3nM BTX或6nM BTX(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞数/ml的图。
图5B是显示在暴露于与6ng/ml LMB70组合的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nMBTX(菱形)、3nM BTX或6nM BTX(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞百分比的图。
图5C是显示在暴露于与10ng/ml LMB70组合的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nMBTX(菱形)、3nM BTX或6nM BTX(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞数/ml的图。
图5D是显示在暴露于与10ng/ml LMB70组合的0nM硼替佐米(BTX)(正方形)、1nMBTX(菱形)、3nM BTX或6nM BTX(▲)4小时后各个时间点(天数)的存活细胞百分比的图。
发明详述
本发明的一个实施方案提供了包含抗-B-细胞成熟抗原(BCMA)抗体的抗原结合结构域的多肽和蛋白质。多肽和蛋白质有利地特异性识别和以高亲和力结合BCMA(也被称为CD269)。BCMA是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。BCMA结合B-细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。在非恶性细胞中，据报道BCMA主要在浆细胞和成熟B细胞亚群中表达。已经在多发性骨髓瘤细胞中检测到BCMA RNA，并且已经在来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面上检测到BCMA蛋白质。
BCMA被各种人类癌症表达或过表达。表达或过表达BCMA的癌症的实例包括但不限于伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和多发性骨髓瘤。不受限于特定的理论或机制，据信通过特异性识别并结合BCMA，本发明的多肽和蛋白质可以有利地靶向表达BCMA的癌细胞。在本发明的一个实施方案中，本发明的多肽和蛋白质可以引发针对BCMA的抗原-特异性应答。因此，不受限于特定的理论或机制，据信通过特异性识别并结合BCMA，本发明的蛋白质和多肽可提供以下一种或多种：检测表达BCMA的癌细胞，靶向并破坏表达BCMA的癌细胞，减少或消除癌细胞，促进免疫细胞和/或效应分子浸润到一个或多个肿瘤位点，以及增强/延长抗癌应答。
本文所用的术语“多肽”包括寡肽并且是指通过一个或多个肽键连接的氨基酸的单链。多肽可以包含抗-BCMA抗体的抗原结合结构域的一个或多个可变区(如，两个可变区)，每个可变区包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3。在本发明的一个实施方案中，多肽包含抗体BM24或BM306的CDR序列。CDR结合序列可以通过本领域已知的方法确定，诸如例如国际免疫遗传学信息系统(IMGT)或Kabat(Wu和Kabat J.Exp.Med.,132:211-250(1970)的方法。
优选地，第一可变区包含含有SEQ ID NO:1或7的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、包含含有SEQ ID NO:2或8的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和包含含有SEQ ID NO:3或9的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，并且第二可变区包含含有SEQID NO:4或10的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、包含含有SEQ ID NO:5或11的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和包含含有SEQ ID NO:6或12的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，本发明的多肽可包含SEQ ID NO:(a)1-3、(b)SEQ ID NO:4-6、(c)SEQ ID NO:7-9、(d)SEQ ID NO:10-12、(e)SEQ ID NO:1-6或(f)SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列。优选地，本发明的一个实施方案提供了包含(i)SEQ ID NO:1-6或(ii)SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多肽各自包含抗-BCMA抗体的抗原结合结构域的一个或多个可变区(如，第一和第二可变区)，所述可变区各自包含如上所述的CDR。例如，多肽可包含抗体BM24或BM306的重链可变区和轻链可变区。第一可变区可包含SEQ ID NO:13或15的氨基酸序列。第二可变区可包含SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列。因此，在本发明的一个实施方案中，多肽包含(a)SEQ ID NO:13、(b)SEQ ID NO:14、(c)SEQ ID NO:15、(d)SEQ ID NO:16、(e)SEQ ID NO:13和14或(f)SEQ ID NO:15和16的氨基酸序列。优选地，多肽包含(i)SEQ IDNO:13和14或(ii)SEQ ID NO:15和16的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，第一可变区是抗-BCMA抗体的重链且第二可变区是抗-BCMA抗体的轻链。
在本发明的一个实施方案中，多肽的可变区可通过接头连接。接头可包含任何适合的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，接头是约1至约100个、约3至约20个、约5至约30个、约5至约18个或约3至约8个氨基酸长的Gly/Ser接头，并且由甘氨酸和/或丝氨酸残基依次组成。因此，Gly/Ser接头可由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，Gly/Ser接头是下式的肽：(Xaa1)n，其中每个氨基酸残基Xaa1独立地选自甘氨酸和丝氨酸并且n是3至15的整数。优选地，Gly/Ser接头包含SEQ ID NO:17或18的氨基酸序列。
本发明还提供了包含本文所述的至少一种多肽的蛋白质。"蛋白质"意指包含一条或多条多肽链的分子。
本发明的蛋白质可包含含有(i)SEQ ID NO:1-3或(ii)SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列的第一多肽链和含有(i)SEQ ID NO:4-6、(ii)SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列的第二多肽链。在这方面，蛋白质可包含含有(i)SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列的第二多肽链，或(ii)包含含有SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列的第一多肽链和含SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列的第二多肽链。本发明的蛋白质可例如包含含有SEQ ID NO:13或15的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列的第二多肽链。在这方面，蛋白质可包含含有(i)SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第二多肽链，或(ii)包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二多肽链。
该蛋白质还可包含如本文关于本发明的其它方面所述的接头。
本发明的蛋白质可以是例如，融合蛋白。如果例如蛋白质包含含含有(i)SEQ IDNO:13或15和(ii)SEQ ID NO:14或16的单条多肽链，或者如果蛋白质的一条或多条第一和/或第二多肽链还包含其它氨基酸序列，如编码免疫球蛋白或其一部分的氨基酸序列，则本发明的蛋白质可以是融合蛋白。在这方面，本发明还提供了这样的融合蛋白，其包含本文所述的至少一种本发明的多肽以及至少一种其它多肽。其它多肽可以作为融合蛋白的单独的多肽存在，或者可以作为这样的多肽存在，其与本文所述的本发明的多肽之一框内(串联)表达。其它多肽可以编码任何肽分子或蛋白质分子，或其一部分，包括但不限于免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子，如CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等。
融合蛋白可以包含一个或多个拷贝的本发明的多肽和/或一个或多个拷贝的其它多肽。例如，融合蛋白可以包含1、2、3、4、5或更多个拷贝的本发明的多肽和/或其它多肽。制备融合蛋白的适合方法是本领域已知的，并且包括，例如重组方法。
考虑到本发明的多肽和蛋白质可用作抗-BCMA结合部分。在这方面，本发明的一个实施方案提供了包含本文所述的多肽或蛋白质中的任一种的抗-BCMA结合部分。在本发明的一个实施方案中，抗-BCMA结合部分包含本文所述的多肽或蛋白质中的任一种的抗原结合部分。抗原结合部分可为具有至少一个抗原结合位点的任何部分。在一个实施方案中，抗-BCMA结合部分是抗体、Fab片段(Fab)、F(ab’)2片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体、单链可变区片段(scFv)或二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)。优选地，抗-BCMA结合部分是Fab片段或dsFv。
在一个实施方案中，抗-BCMA结合部分是抗体。抗体可以是仅对BCMA具有抗原特异性的单特异性抗体，或对BCMA和BCMA以外的第二抗原具有抗原特异性的双特异性抗体。抗体可以是，例如，包含本文所述的本发明的多肽中的至少一种的重组抗体。如本文所用，“重组抗体”是指包含本发明的多肽或蛋白质中的至少一种以及抗体或其一部分的一条或多条多肽链的重组(如，遗传工程化)蛋白质。抗体或其一部分的多肽可以是例如重链或轻链的恒定区，或抗体的Fc片段等。抗体或其一部分的多肽链可以作为重组抗体的单独的多肽存在。可选地，抗体或其一部分的多肽链可以作为这样的多肽存在，其与本发明的多肽或蛋白质框内(串联)表达。抗体或其一部分的多肽可以是任何抗体或任何抗体片段的多肽。
本发明的抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗-BCMA结合部分可以是任何同种型的抗体，如IgA、IgD、IgE、IgG(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM等。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是天然存在的抗体，如从哺乳动物(如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人类等)分离和/或纯化的抗体。可选地，抗体可以是经遗传工程化的抗体，如人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以是单体或聚合物形式。此外，抗体可对BCMA具有任何水平的亲和力或亲合力。
测试抗体结合BCMA的能力的方法在本领域中是已知的，并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定。
制备抗体的适合方法是本领域已知的，并且包括例如标准杂交瘤方法、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)-杂交瘤方法和噬菌体载体表达系统。抗体可以在非人类动物中产生。
在一个优选的实施方案中，抗-BCMA结合部分是单链可变区片段(scFv)。可以使用常规的重组DNA工艺技术产生单链可变区片段(scFv)抗体片段，其是截短的Fab片段，包括经由合成肽与抗体轻链的V结构域连接的抗体重链的可变(V)结构域。类似地，可以通过重组DNA技术制备二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)。然而，本发明的抗-BCMA结合部分不限于这些示例性类型的抗体片段。
此外，抗-BCMA结合部分可被修饰以包含可检测标记，诸如例如放射性同位素、荧光团(如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(如金颗粒)。
本发明的另一个实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)抗原结合结构域，其包含本文所述的多肽、蛋白质或抗-BCMA结合部分中的任一种；(b)跨膜(TM)结构域和(c)细胞内T细胞信号传导结构域。
嵌合抗原受体(CAR)是一种人工构建的杂合蛋白质或多肽，其含有与T细胞信号传导结构域连接的抗体的抗原结合结构域(如，单链可变片段(scFv))。CAR的特征包括它们能够利用单克隆抗体的抗原结合性质以非MHC限制性方式重定向T细胞对所选靶标的特异性和反应性。非-MHC限制性抗原识别使得表达CAR的细胞能够不依赖于抗原加工而识别抗原，从而绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。
如本文所用的短语“具有抗原特异性”和“引发抗原-特异性应答”意指CAR能够特异性结合并免疫识别抗原，使得CAR与抗原的结合引发免疫应答。
本发明的CAR对BCMA具有抗原特异性。不受限于特定的理论或机制，据信通过引发针对BCMA的抗原-特异性应答，本发明的CAR提供以下一种或多种：靶向和破坏表达BCMA的癌细胞，减少或消除癌细胞，促进免疫细胞浸润到一个或多个肿瘤位点，以及增强/延长抗癌应答。
本发明的一个实施方案提供了包含抗-BCMA抗体的抗原结合结构域的CAR。抗-BCMA抗体的抗原结合结构域能够特异性结合BCMA。CAR的抗原结合结构域可包含本文所述的多肽、蛋白质或抗-BCMA结合部分中的任一种。在本发明的一个实施方案中，CAR包含抗-BCMA单链可变片段(scFv)。在这方面，本发明的一个优选的实施方案提供了包含含有单链可变片段(scFv)的抗原结合结构域的CAR，所述抗原结合结构域包含本文所述的多肽或蛋白质中的任一种。
在本发明的一个优选的实施方案中，CAR包含重链和轻链，其各自包含含有互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的可变区。优选地，重链包含含有SEQ ID NO:1或7的氨基酸序列的CDR1(重链的CDR1)、含有SEQ ID NO:2或8的氨基酸序列的CDR2(重链的CDR2)和含有SEQ IDNO:3或9的氨基酸序列的CDR3(重链的CDR3)，并且轻链包含含有SEQ ID NO:4或10的氨基酸序列的CDR1(轻链的CDR1)、含有SEQ ID NO:5或11的氨基酸序列的CDR2(轻链的CDR2)和含有SEQ ID NO:6或12的氨基酸序列的CDR3(轻链的CDR3)。在这方面，本发明的CAR可包含(a)SEQ ID NO:1-3、(b)SEQ ID NO:4-6、(c)SEQ ID NO:1-6、(d)SEQ ID NO:7-9、(e)SEQ IDNO:10-12或(f)SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列。优选地，CAR包含SEQ ID NO:1-6或SEQ IDNO:7-12的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，CAR的抗原结合结构域各自包含轻链和重链。轻链可包含SEQ ID NO:14或16。重链可包含SEQ ID NO:13或15。因此，在本发明的一个实施方案中，抗原结合结构域包含(a)SEQ ID NO:13、(b)SEQ ID NO:14、(c)SEQ ID NO:15、(d)SEQID NO:16、(e)SEQ ID NO:13和14或(f)SEQ ID NO:15和16的氨基酸序列。优选地，CAR包含(i)SEQ ID NO:13-14或(ii)SEQ ID NO:15-16的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含前导序列。在本发明的一个实施方案中，虽然前导序列可以促进CAR在细胞表面上的表达，但是为了CAR发挥作用，经表达的CAR中前导序列的存在不是必需的。在本发明的一个实施方案中，当CAR在细胞表面上表达后，前导序列可以从CAR上裂解下来。因此，在本发明的一个实施方案中，CAR缺乏前导序列。
在一个实施方案中，CAR包含免疫球蛋白恒定结构域。优选地，免疫球蛋白结构域是人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域包含免疫球蛋白CH2和CH3免疫球蛋白G(IgG1)结构域序列(CH2CH3)。不受限于特定的理论，据信CH2CH3结构域将scFv的结合基序延伸离开表达CAR的细胞的膜，并且可以更精确地模拟天然TCR的大小和结构域结构。在一些实施方案中，CAR可缺乏免疫球蛋白恒定结构域。
在本发明的一个实施方案中，CAR包含TM结构域。在本发明的一个实施方案中，TM结构域包含CD8或CD28的TM结构域。在一个优选的实施方案中，CD8和CD28是人类的。
在本发明的一个实施方案中，CAR包含细胞内T细胞信号传导结构域，所述细胞内T细胞信号传导结构域包括i)CD28、ii)CD137和iii)CD3ζ中的一种或多种的细胞内T细胞信号传导结构域。在一个优选的实施方案中，CD28、CD137和CD3泽塔是人类的。CD28是T细胞共刺激中重要的T细胞标志物。CD137，也被称为4-1BB，向T细胞传递有效的共刺激信号，从而促进T淋巴细胞的分化并增强其长期存活。CD3ζ与TCR缔合以产生信号并含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
在本发明的一个实施方案中，CAR包含TM结构域(包括CD28的TM结构域)和细胞内T细胞信号传导结构域(包括CD28和CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域)。
在本发明的一个实施方案中，CAR包含TM结构域(包括CD8的TM结构域)和细胞内T细胞信号传导结构域(包括CD28、CD137和CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域)。
在本发明的一个实施方案中，CAR包含TM结构域(包括CD8的TM结构域)和细胞内T细胞信号传导结构域(包括CD137和CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域)。
包括在本发明范围内的是本文所述的本发明的多肽、蛋白质和CAR的功能部分。当用于提及多肽、蛋白质或CAR时，术语“功能部分”是指本发明的多肽、蛋白质或CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留所述部分或片段来源的多肽、蛋白质或CAR(亲本多肽、蛋白质或CAR)的生物学活性。功能部分涵盖，例如，保留与亲本多肽、蛋白质或CAR类似程度、相同程度或更高程度地识别靶细胞或者检测、治疗或预防癌症的能力的多肽、蛋白质或CAR的那些部分。就亲本多肽、蛋白质或CAR而言，功能部分可以包括例如亲本多肽、蛋白质或CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
功能部分可以在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本多肽、蛋白质或CAR的氨基酸序列中不存在。期望地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本多肽、蛋白质或CAR的生物学活性相比，另外的氨基酸增强生物学活性。
包括在本发明的范围内的是本文所述的本发明的多肽、蛋白质或CAR的功能变体。本文所用的术语“功能变体”是指与亲本多肽、蛋白质或CAR具有大量或显著的序列同一性或相似性的多肽、蛋白质或CAR，所述功能变体保留该变体所来源的多肽、蛋白质或CAR的生物学活性。功能变体涵盖例如本文所述的多肽、蛋白质或CAR(亲本多肽、蛋白质或CAR)的那些变体，其保留与亲本多肽、蛋白质或CAR类似程度、相同程度或更高程度地识别靶细胞的能力。就亲本多肽、蛋白质或CAR而言，功能变体可以与亲本多肽、蛋白质或CAR在氨基酸序列中具有例如至少约30％、约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多同一性。
功能变体可以例如包含具有至少一个保守性氨基酸取代的亲本多肽、蛋白质或CAR的氨基酸序列。可选地或另外地，功能变体可以包含具有至少一个非保守性氨基酸取代的亲本多肽、蛋白质或CAR的氨基酸序列。在这种情况下，非保守性氨基酸取代优选不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守性氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，使得与亲本多肽、蛋白质或CAR相比，功能变体的生物活性增加。
本发明的多肽、蛋白质或CAR的氨基酸取代优选为保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代是本领域已知的，并且包括其中具有一定物理和/或化学性质的一种氨基酸被交换为另一具有相同或相似化学或物理性质的氨基酸的氨基酸取代。例如，保守性氨基酸取代可以是将酸性/带负电荷的极性氨基酸取代为另一酸性/带负电荷的极性氨基酸(如，Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸取代为另一具有非极性侧链的氨基酸(如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)，碱性/带正电荷的极性氨基酸取代为另一碱性/带正电荷的极性氨基酸(如Lys、His、Arg等)，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸取代为另一具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)，具有β-分支侧链的氨基酸取代为另一具有β-分支侧链的氨基酸(如，Ile、Thr和Val)，具有芳香族侧链的氨基酸取代为另一具有芳香族侧链的氨基酸(如，His、Phe、Trp和Tyr)等。
多肽、蛋白质或CAR可以基本上由本文所述的特定氨基酸序列或序列组成，使得其它组分如其它氨基酸不实质上改变多肽、蛋白质、CAR、功能部分或功能变体的生物学活性。
本发明的实施方案的多肽、蛋白质或CAR(包括功能部分和功能变体)可以具有任何长度，即可以包含任何数量的氨基酸，条件是多肽、蛋白质或CAR(或其功能部分或功能变体)保留其生物活性，如能够特异性结合至抗原、检测哺乳动物中的患病细胞、或者治疗或预防哺乳动物中的疾病等。例如，多肽、蛋白质或CAR可以是约50至约5000个氨基酸长，诸如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸长。
本发明的实施方案的多肽、蛋白质或CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可以包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的实施方案的多肽、蛋白质或CAR(包括其功能部分和功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由如二硫桥环化，或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合。
可以通过本领域已知的方法获得本发明的实施方案的多肽、蛋白质或CAR(包括其功能部分和功能变体)。可以通过任何适合的制备多肽或蛋白质的方法制备多肽、蛋白质或CAR。本领域已知从头合成多肽和蛋白质的适合方法。此外，可使用核酸和标准重组方法重组产生多肽和蛋白质。此外，本发明的一些多肽、蛋白质或CAR(包括其功能部分和功能变体)可以从诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物(如大鼠、人)等的来源分离和/或纯化。分离和纯化的方法是在本领域中众所周知的。可选地，本文所述的多肽、蛋白质或CAR(包括其功能部分和功能变体)可由诸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)和Multiple Peptide Systems(San Diego,CA)的公司商业合成。在这方面，本发明的多肽、蛋白质或CAR可为合成的、重组的、经分离的和/或经纯化的。
包括在本发明范围内的是缀合物，如生物缀合物，其包含本发明的多肽、蛋白质、CAR、抗-BCMA结合部分或其功能部分或功能变体中的任一种。在这方面，本发明的一个实施方案提供了缀合物，其包含与(b)效应分子缀合或融合的(a)本文所述的多肽、蛋白质、CAR或抗-BCMA结合部分中的任一种。效应分子可以是任何治疗性分子或促进缀合物检测的分子。效应分子不受限制，并且可以是任何适合的效应分子。例如，效应分子可以是药物、毒素、标记物(如，本文所述的可检测标记中的任一种)、小分子或另一种抗体中的任一种或多种。例如，毒素可以是(i)假单胞菌外毒素A(“PE”)，(ii)PE的细胞毒性片段(如，PE的结构域III)或者(iii)(i)或(ii)的细胞毒性变体，诸如如，如在例如美国专利第4,892,827号；第5,512,658号；第5,602,095号；第5,608,039号；第5,821,238号；第5,854,044号；第8,871,906号；第8,907,060号；第8,936,792号；第9,346,859号；第9,206,240号；和第9,388,222号(将其各自通过引用并入本文)中所述的PE-LR、PE-LO10R456A、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE24、PE25、PE38QQR、PE38KDEL和PE35中的任一种。在本发明的缀合物中可能适合的药物的实例包括但不限于吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、微管蛋白-结合剂诸如例如多拉司他汀10、单甲基多拉司他汀10、奥利斯他汀E、单甲基奥利斯他汀E(MMAE)、奥利斯他汀F、单甲基奥利斯他汀F、HTI-286、微管蛋白裂解素M、美登素类AP-3(maytansinoid AP-3)、念珠藻素、Boc-Val-Dil-Dap-OH、微管蛋白裂解素IM-1、Boc-Val-Dil-Dap-Phe-OMe、微管蛋白裂解素IM-2、Boc-Nme-Val-Val-Dil-Dap-OH、微管蛋白裂解素IM-3和秋水仙碱DA；DNA-烷化剂(alkylator)(倍癌霉素类似物)诸如，例如倍癌霉素(duocarmycin)SA、倍癌霉素CN、倍癌霉素DMG、倍癌霉素DMA、倍癌霉素MA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素GA；茅屋霉素DM(tomaymycin DM)；SJG-136；隐杯伞素S；伊洛福芬；阿帕齐醌(apaziquone)；雷公藤甲素；星形孢菌素；喜树碱；甲氨蝶呤；和其它抗癌药物，诸如，例如激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。
本文所述的多肽、蛋白质、CAR或抗-BCMA结合部分可以直接或如经由接头间接地缀合或融合至(b)效应分子。接头可以是本领域已知的任何适合的接头。在一个实施方案中，接头是在将缀合物施用至哺乳动物后可以被裂解的可裂解接头。可适用于本发明的缀合物的接头的实例包括但不限于本文关于本发明的其它方面所述的任何接头。
本发明的一个实施方案还提供了核酸，其包含编码多肽、蛋白质、CAR、抗-BCMA结合部分、缀合物或其功能部分或功能变体中的任一种的核苷酸序列。本发明的核酸可以包含编码本文所述的接头、抗原结构结构域、免疫球蛋白结构域、TM结构域和/或细胞内T细胞信号传导结构域中的任一种的核苷酸序列。
本发明的一个实施方案提供了核酸，其包含编码本文所述的多肽、蛋白质或抗-BCMA结合部分中的任一种的核苷酸序列。在该方面，核酸包含分别编码(i)第一和第二可变区SEQ ID NO:13和14，或(ii)第一和第二可变区SEQ ID NO:15和16的核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了包含编码本文所述的CDR区中的任一种的核苷酸序列的核酸。在这方面，核酸包含编码SEQ ID NO:(a)1-3、(b)SEQ ID NO:4-6、(c)SEQ ID NO:7-9、(d)SEQID NO:10-12、(e)SEQ ID NO:1-6或(f)SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了包含编码本文所述的CDR中的任一种的核苷酸序列的核酸。
如本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或从天然来源获得的(如，分离和/或纯化的)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间连键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，代替在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或取代。然而，如本文所论述的，在一些情况下，可能适合的是核酸可以包含一个或多个插入、缺失、倒置和/或取代。在一些实施方案中，核酸可以编码不影响多肽、蛋白质或CAR功能并且在宿主细胞表达核酸后可以翻译或不翻译的另外氨基酸序列(如，AAA)。在本发明的一个实施方案中，核酸是互补DNA(cDNA)。在本发明的一个实施方案中，核酸包含密码子优化的核苷酸序列。
本发明的一个实施方案的核酸可以是重组体。如本文所用，术语“重组体”是指(i)通过将天然或合成的核酸区段连接至可在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)由如上面(i)所述那些的复制产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
核酸可以基本上由本文所述的指定核苷酸序列或序列组成，使得其它组分如其它核苷酸不会实质上改变编码的CAR、多肽、蛋白质、抗BCMA-结合部分、功能部分或功能变体的生物学活性。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个另外分离的序列区段而制备的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成或更常见地通过人工操纵分离的核酸区段来完成，例如通过遗传工程技术，诸如Green和Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第4版(2012)中所述的那些遗传工程技术。可以使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应构建核酸。参见，例如，Green等人，同上。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸(如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸，所述各种经修饰的核苷酸被设计用于增加分子的生物稳定性或增加杂交时形成的双链体的物理稳定性。可用于产生核酸的经修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。可选地，本发明的一种或多种核酸可以从诸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen(Houston,TX)的公司购买。
核酸可以包含编码多肽、蛋白质、CAR、抗-BCMA结合部分、缀合物或其功能部分或功能变体中的任一种的任何分离或纯化的核苷酸序列。可选地，核苷酸序列可以包含简并成任何序列或简并序列组合的核苷酸序列。
本发明的一个实施方案还提供了分离或纯化的核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或者在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。“高严格条件”意指核苷酸序列以可检测地强于非特异性杂交的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸或仅含有一些分散错配的多核苷酸与恰好具有匹配该核苷酸序列的一些小区域(如，3-10个碱基)的随机序列分开的条件。这种小的互补性区域比14-17个或更多个碱基的全长互补体更容易熔解，而高严格杂交使其易于区分。相对高的严格条件将包括，例如低盐和/或高温条件，诸如由约0.02-0.1M NaCl或等效物在约50-70℃的温度下所提供的条件。此类高严格条件容许核苷酸序列与模板或靶链之间很少的(如果存在的话)错配，并且特别适用于检测本发明的多肽、蛋白质、CAR、抗-BCMA结合部分、缀合物或其功能部分或功能变体的表达。通常认识到，通过加入增加量的甲酰胺可以使条件变得更加严格。
本发明还提供了包含与本文所述的核酸中任一种具有至少约70％或更多，如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，可以将本发明的核酸掺入重组表达载体中。在这方面，本发明的一个实施方案提供了包含本发明的任何核酸的重组表达载体。为了本文的目的，术语“重组表达载体”意指经遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，其允许当构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列且使载体与细胞在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下接触时，由宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本发明的载体整体上不是天然存在的。然而，部分载体可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链或双链的、合成的或部分从天然来源获得的并且可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在或非天然存在的核苷酸间连键或这两种类型的连键。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连键不妨碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何适合的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何适合的宿主细胞。适合的载体包括那些被设计用于繁殖和扩增或表达或两者的载体，诸如质粒和病毒。载体可以选自：pUC系列(Fermentas LifeSciences,Glen Burnie,MD)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可以使用噬菌体载体，诸如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，如逆转录病毒载体。
本领域通常已知多种转染技术。转染方法包括磷酸钙共沉淀、直接微注射入培养的细胞、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转导和使用高速微弹轰击的核酸递送。
在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以使用例如Green，同上所述的标准的重组DNA技术来制备。可以是环状或线性的表达载体的构建体可以制备成含有在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统。例如，复制系统可以来源于ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
重组表达载体可以包含调控序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子，视情况而定并考虑载体是基于DNA的还是基于RNA的，其对待引入载体的宿主细胞的类型(如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性。重组表达载体可以包含限制性位点以促进克隆。
重组表达载体可以包含一个或多个标志物基因，其允许选择转化或转染的宿主细胞。标志物基因包括杀生物剂抗性，如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型等。适用于本发明的表达载体的标志物基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可包含天然或非天然启动子，所述天然或非天然启动子与编码多肽、蛋白质、CAR、抗-BCMA结合部分、缀合物或其功能部分或功能变体的核苷酸序列可操作地连接或者与编码本发明的多肽、蛋白质、CAR、抗-BCMA结合部分、缀合物或其功能部分或功能变体的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作地连接。启动子的选择，如强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性的，在本领域技术人员的普通技术范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的普通技术范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复中存在的启动子。
本发明的重组表达载体可经设计用于瞬时表达、稳定表达或两者。此外，重组表达载体可经制备用于组成型表达或用于诱导型表达。
此外，可以将重组表达载体制备为包含自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予基因在其中表达的细胞对药剂如药物的敏感性并且当细胞与药剂接触或暴露于药剂时导致细胞死亡的基因。自杀基因在本领域中是已知的，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
本发明的一个实施方案还提供了包含本文所述的重组表达载体中的任一种的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，如植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从有机体如人分离的。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。适合的宿主细胞是本领域已知的，并且包括例如DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，如DH5α细胞。为了产生重组多肽、蛋白质、CAR、抗-BCMA结合部分、缀合物或其功能部分或功能变体的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人类细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型的，可以来源于任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段的，但宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。宿主细胞可以是B细胞或T细胞。
为了本文的目的，T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，如原代T细胞；或来自培养的T细胞系的T细胞，如Jurkat、SupT1等；或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，T细胞可以从多种来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T细胞也可以被富集或纯化。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以是任何发育阶段的，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞，如Th1和Th2细胞、CD8+T细胞(如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
本发明的一个实施方案还提供了包含本文所述的至少一种宿主细胞的细胞群体。细胞群体可以是异源群体，除了不包含重组表达载体中的任一种的至少一种其它细胞，如宿主细胞(如T细胞))或除T细胞以外的细胞如B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等，所述异源群体还包含含有所述的任何重组表达载体的宿主细胞。可选地，细胞群体可以是基本上同源的群体，其中群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(如，基本由其组成)。该群体也可以是克隆细胞群体，其中群体的所有细胞都是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得该群体的所有细胞都包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群体是包含含有本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
多肽、蛋白质、CAR(包括其功能部分和变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)、抗-BCMA结合部分和缀合物，所有这些在下文中统称为“本发明的抗-BCMA材料”，可以经分离和/或纯化。本文所用的术语“经分离”意指已从其自然环境中移出。术语“经纯化”或“经分离”不需要绝对的纯度或分离；相反，它意在作为相对术语。因此，例如，经纯化(或经分离)的宿主细胞制备物是其中宿主细胞比其体内的天然环境中的细胞更纯的制备物。此类宿主细胞可以通过例如标准纯化技术来产生。在一些实施方案中，纯化宿主细胞的制备物，使得宿主细胞占制备物总细胞含量的至少约50％、例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％、可以大于约60％、约70％或约80％，或可以是约100％。
本发明的抗-BCMA材料可以配制成组合物，诸如药物组合物。在这方面，本发明的一个实施方案提供了药物组合物，其包含本文所述的本发明的抗-BCMA材料中的任一种和药学上可接受的载体。含有本发明的抗-BCMA材料中的任一种的本发明的药物组合物可以包含多于一种本发明的抗-BCMA材料，如缀合物和核酸，或者两种或更多种不同的缀合物。可选地，药物组合物可以包含与其它药学活性剂或药物组合的本发明的抗-BCMA材料，所述其它药学活性剂或药物，诸如化疗剂如天冬酰胺酶、硼替佐米(如，VELCADE硼替佐米)、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、地塞米松、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、来那度胺、美法仑、甲氨蝶呤、紫杉醇(如，ABRAXANE紫杉醇)、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的缀合物。优选地，其它药学活性剂或药物是美法仑、硼替佐米、来那度胺、地塞米松或紫杉醇。
本发明的抗-BCMA材料可以以盐的形式提供，如药学上可接受的盐。适合的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸)以及有机酸(诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些酸加成盐。
关于药物组合物，药学上可接受的载体可以是常规使用的那些中的任一种，并且仅受到化学-物理考虑因素，诸如溶解度和对一种或多种活性剂缺乏反应性以及施用途径的限制。本文所述的药学上可接受的载体，例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂对于本领域技术人员来说是熟知的，并且容易为公众获得。优选的是药学上可接受的载体为对一种或多种活性剂具有化学惰性的载体和在使用条件下不具有有害副作用或毒性的载体。
载体的选择将部分由特定的本发明的抗-BCMA材料以及用于施用本发明的抗-BCMA材料的具体方法确定。因此，本发明的药物组合物有多种适合的制剂。可以使用防腐剂。适合的防腐剂可以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。任选地可以使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。
适合的缓冲剂可以包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。任选地可以使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。
本发明的抗-BCMA材料在药物制剂中的浓度可以例如从小于约1重量％、通常为或至少约10重量％，变化至多达例如约20重量％至约50重量％或更多，并且可以根据所选的特定施用模式主要通过流体体积和粘度来选择。
用于制备可施用(如，可肠胃外施用的)组合物的方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的，并且更详细地描述于，例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Pharmaceutical Press；第22版(2012)。
用于口服、气雾剂、肠胃外(如，皮下、静脉内、动脉内、肌内、皮内、腹膜内和鞘内)和局部施用的下列制剂仅仅是示例性的，而绝不是限制性的。可以使用一种以上的途径来施用本发明的抗-BCMA材料，并且在某些情况下，特定途径可以提供比另一途径更快速且更有效的应答。
适合于口服施用的制剂可以包含以下或由以下组成：(a)液体溶液，诸如溶于稀释剂诸如水、盐水或橙汁中的有效量的本发明的抗-BCMA材料；(b)胶囊、药囊、片剂、锭剂和糖锭，各自含有固体或颗粒状的预定量的活性成分；(c)粉末；(d)于适当的液体中的混悬液；和(e)适合的乳液。液体制剂可以包含加入或未加入药学上可接受的表面活性剂的稀释剂，诸如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇。胶囊形式可以是普通的硬壳或软壳的明胶类型，其含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和其它药理学相容的赋形剂中的一种或多种。除了本领域内已知的这些赋形剂之外，锭剂形式可在调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含本发明的抗-BCMA材料，而糖锭在惰性基质(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶、乳剂、凝胶等)中包含本发明的抗-BCMA材料。。
适用于肠胃外施用的制剂包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质的水性和非水性等渗无菌注射液，以及可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬液。在加入或未加入药学上可接受的诸如皂或去污剂的表面活性剂，诸如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素的悬浮剂，或乳化剂和其它药物佐剂时，本发明的抗-BCMA材料可以生理上可接受的稀释剂于药物载体中施用，所述药物载体如无菌液体或液体的混合物包括水、盐水、含水葡萄糖和相关的糖溶液、醇如乙醇或十六烷醇、乙二醇如丙二醇或聚乙二醇、二甲基亚砜、甘油、缩酮如2,2-二甲基-l,3-二噁茂烷-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化的脂肪酸甘油酯。
可用于肠胃外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。用于肠胃外制剂的适合的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合的脂肪酸酯的实例。
在肠胃外制剂中使用的适合的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，而适合的去污剂包括(a)阳离子去污剂如，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子去污剂如，例如烷基、芳基和烯烃基磺酸酯，烷基、烯烃基、醚基和单甘油硫酸酯和磺基琥珀酸酯，(c)非离子去污剂如，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚环氧乙烷聚丙烯(polyoxyethylenepolypropylene)共聚物，(d)两性去污剂如，例如烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐，以及(e)其混合物。
肠胃外制剂将通常于溶液中含有例如约0.5重量％至约25重量％的本发明的抗-BCMA材料。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位处的刺激，此类组合物可含有一种或多种具有例如约12至约17的亲水-亲油平衡值(HLB)的非离子表面活性剂。此类制剂中的表面活性剂的量通常范围为例如约5重量％至约15重量％。适合的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯以及环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合而形成的疏水性基质的高分子量加合物。肠胃外制剂可以在单位剂量或多剂量密封的容器诸如安瓿和小瓶中提供，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前即刻添加用于注射的无菌液体赋形剂(例如水)。临时注射溶液和混悬液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
可注射制剂与本发明的一个实施方案一致。对于可注射组合物的有效药物载体的要求是本领域普通技术人员所熟知的(参见，如，A Practical Guide to ContemporaryPharmacy Practice,第3版,Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA,Thompson and Davidow,编辑，(2009),and Handbook on Injectable Drugs,Trissel,第16版,(2010))。
局部制剂，包括可用于透皮药物释放的制剂，是本领域技术人员所熟知的，并且在本发明的实施方案的上下文中适用于施加至皮肤。本发明的抗-BCMA材料可单独或与其它适合的组分组合制备成待经由吸入施用的气雾剂制剂。这些气雾剂制剂可以被置于可接受的加压推进剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。它们也可以被配制成用于非加压制备诸如在喷雾器或雾化器中的药物。此类喷雾制剂也可用于对粘膜喷雾。
“有效量”或“有效治疗的量”是指足以预防或治疗个体中的癌症的剂量。对于治疗性或预防性用途有效的量将取决于例如所治疗的疾病或病症的阶段和严重性，患者的年龄、体重和一般健康状态以及处方医师的判断。剂量的大小还将选择的活性物质，施用方法，施用的时间和频率，可能伴随施用特定活性物质的任何不良副作用的存在、性质和程度以及所需的生理效应决定。本领域技术人员将理解，各种疾病或病症可能需要涉及多次施用的延长治疗，可能在每轮或各轮施用中使用本发明的抗-BCMA材料。作为举例而非意在限制本发明，本发明的抗-BCMA材料的剂量可为约0.001至约1000mg/kg经治疗的受试者体重/天，0.01至约10mg/kg体重/天，约0.01mg至约1mg/kg体重/天。
为了本发明的目的，施用的本发明的抗-BCMA材料的量或剂量应该足以在合理的时间范围内在受试者或动物中实现治疗性或预防性应答。例如，本发明的抗-BCMA材料的剂量应该在从施用时间起约2小时或更长，如约12至约24小时或更多个小时的时间内足以结合抗原或检测、治疗或预防疾病。在某些实施方案中，时间段可能甚至更长。剂量将由特定的本发明的抗-BCMA材料的功效和动物(如人)的情况以及待治疗的动物(如人)的体重来确定。
为了本发明的目的，测定可用于确定待施用给哺乳动物的起始剂量，所述测定包括例如在一组其中各自给予不同剂量的本发明的抗-BCMA材料的哺乳动物中比较施用给定剂量的本发明的抗-BCMA材料给哺乳动物后杀死靶细胞的程度。施用一定剂量后杀死靶细胞的程度可通过本领域已知的方法测定。
除了上述药物组合物之外，本发明的抗-BCMA材料还可以被配制成包合配合物，诸如环糊精包合配合物或脂质体。脂质体可用于将本发明的抗-BCMA材料靶向至特定组织。脂质体也可用于增加本发明的抗-BCMA材料的半衰期期。许多方法可用于制备脂质体。
在本发明的实施方案的上下文中有用的递送系统可以包括定时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得本发明的组合物的递送发生在待治疗的部位发生敏化之前，并且具有充足的时间引起待治疗的部位发生敏化。本发明的组合物可以与其它治疗剂或疗法联合使用。此类系统可以避免重复施用本发明的组合物，从而增加受试者和医师的便利性，并且可能特别适合于本发明的实施方案的某些组合物。
许多类型的释放递送系统是可用的并且是本领域普通技术人员已知的。它们包括聚合物基质系统诸如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。递送系统还包括非聚合物系统，其为脂质，包括甾醇诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪诸如单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶(sylastic)系统；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合植入物；等。特定实例包括但不限于：(a)活性组合物以一定形式包含在基质内的侵蚀系统和(b)其中活性组分以受控速率从聚合物渗透的扩散系统。另外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中的一些适用于植入。
本领域的普通技术人员将容易理解，本发明的抗-BCMA材料可以以任何数量的方式进行修饰，使得本发明的抗-BCMA材料的治疗性或预防性功效通过修饰而增加。例如，本发明的抗-BCMA材料可以被修饰成储库形式，使得本发明的抗-BCMA材料被释放到施用其的体内的方式相对于体内的时间和位置受到控制。本发明的抗-BCMA材料的储库形式可以是例如包含本发明的抗-BCMA材料和多孔或无孔材料(诸如聚合物)的可植入组合物，其中本发明的抗-BCMA材料被材料封装或扩散通过材料和/或无孔材料的降解。然后将储库植入体内的所需位置中，并以预定速率从植入物释放本发明的抗-BCMA材料。
当本发明的抗-BCMA材料与一种或多种另外的治疗剂一起施用时，一种或多种另外的治疗剂可以共同施用给哺乳动物。“共同施用”意指以足够接近的时间施用一种或多种另外的治疗剂和本发明的抗-BCMA材料，使得本发明的抗-BCMA材料可以增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。在这方面，本发明的抗-BCMA材料可以首先施用，并且一种或多种另外的治疗剂可以其次施用，反之亦然。可选地，可以同时施用本发明的抗-BCMA材料和一种或多种另外的治疗剂。可以与抗-BCMA材料共同施用的示例性治疗剂包括本文关于本发明的其它方面描述的化疗剂。为了本发明的方法的目的，其中将宿主细胞或细胞群体施用给哺乳动物，细胞可以是哺乳动物的同种异体细胞或自体细胞。
考虑到本发明的抗-BCMA材料和药物组合物可用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法。不受限于特定的理论或机制，本发明的抗-BCMA材料具有生物活性，如识别抗原(如BCMA)的能力，使得抗-BCMA材料可将效应分子引导至靶细胞或靶组织。在这方面，本发明的一个实施方案提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量向哺乳动物施用本发明的多肽、蛋白质、CAR、功能部分、功能变体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗-BCMA结合部分、缀合物和/或药物组合物中的任一种。
本发明的一个实施方案还包括在施用一种或多种本发明的抗-BCMA材料之前对哺乳动物进行淋巴清除。淋巴清除的实例包括但可不限于非清髓性淋巴清除化疗、清髓性淋巴清除化疗、全身辐照等。
为了本发明的方法(其中施用宿主细胞或细胞群体)的目的，细胞可以是哺乳动物的同种异体细胞或自体细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。
本文提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，以及兔形目的哺乳动物，诸如兔。哺乳动物可以来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)，或者来自奇蹄目，包括马科动物(马)。哺乳动物可以来自灵长目、猿(Ceboid)目或猴(Simoids)目(猴)，或者来自类人猿目(人类和类人猿)。优选地，哺乳动物是人类。
关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下中的任一种：急性淋巴细胞性癌症、急性骨髓性白血病、横纹肌肉瘤、膀胱癌症(如膀胱癌)、骨癌、脑癌(如髓母细胞瘤、神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、DLBCL淋巴瘤、尤因氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌瘤、头颈癌(如，头颈鳞状细胞癌)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。优选地，癌症是伯基特氏淋巴瘤、DLBCL淋巴瘤、ALL淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤或多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，癌症的特征在于BCMA的表达或过表达。
本文所用的术语“治疗”和“预防”以及源自其的词语不一定意味着100％或完全的治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明的方法可以对哺乳动物中的癌症提供任何量的任何水平的治疗或预防。此外，由本发明方法提供的治疗或预防可包括被治疗或预防的疾病(如癌症)的一种或多种病况或症状的治疗或预防。此外，为了本文的目的，“预防”可以涵盖延迟癌症或其症状或病况的发作，或者延迟或预防癌症的复发。
本发明的另一个实施方案提供了本发明的多肽、蛋白质、CAR、功能部分、功能变体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗-BCMA结合部分、缀合物或药物组合物中的任一种用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的用途。
本发明的另一个实施方案提供了检测哺乳动物中的癌症的存在的方法，其包括：(a)使包含来自哺乳动物的一种或多种细胞的样品与本发明的多肽、蛋白质、CAR、功能部分、功能变体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗-BCMA结合部分或缀合物中的任一种接触，从而形成复合物，(b)和检测复合物，其中检测到复合物表明哺乳动物中存在癌症。
样品可以通过任何适合的方法获得，如活检或尸检。活检是从个体中移出组织和/或细胞。此类移出可以是从个体中收集组织和/或细胞，以便对移出的组织和/或细胞进行实验。这种实验可包括确定个体是否患有和/或罹患某种病况或疾病状态的实验。该病况或疾病可以是，如癌症。
关于检测哺乳动物中癌症的存在的本发明方法的实施方案，包含哺乳动物细胞的样品可以是包含全细胞、其裂解物或全细胞裂解物的一部分(如核部分或细胞质部分、全蛋白质部分或核酸部分)的样品。如果样品包含全细胞，则细胞可以是哺乳动物的任何细胞，如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。
为了本发明的检测方法的目的，接触可在相对于哺乳动物的体外或体内发生。优选地，接触是在体外的。
此外，复合物的检测可以通过本领域已知的任何数量的方式进行。例如，本文所述的本发明的CAR、多肽、蛋白质、功能部分、功能变体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗-BCMA结合部分或缀合物可以用可检测标记诸如例如放射性同位素、荧光团(如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(如，金颗粒)标记。
以下实施例进一步说明了本发明，但是，当然不应将其解释为以任何方式限制其范围。
实施例
在实施例1-11中描述的实验中采用以下材料和方法。
质粒
将BCMA(TNFRSF17)cDNA克隆并构建一对表达载体。一个载体编码全长人BCMA，且另一个载体编码与兔IgG重链的Fc区(CH2和CH3结构域)和铰链区融合的人BCMA的胞外结构域(残基1-54)。首先，将人BCMA的全长cDNA克隆到pcDNA6(Invitrogen,Carlsbad,CA)(一种在巨细胞病毒启动子的控制下的哺乳动物表达载体)中，从而产生pcDNA6/BCMA。对于Fc-融合蛋白，通过PCR扩增编码人BCMA的胞外结构域的DNA片段，通过EcoRI和BglII消化并克隆到pFUSE-rFc1表达载体(InvivoGen,San Diego,CA)中，从而产生pFUSE/BCMA-rFc。
细胞
使293T细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中生长。使用P3U1骨髓瘤细胞作为杂交瘤形成的融合伴侣，并维持在含有15％胎牛血清(FBS)的伊思考夫改良达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM,Invitrogen)中。
重组BCMA-rFc融合蛋白的产生
为了建立表达BCMA-rFc融合蛋白的稳定细胞系，根据制造商的说明书，通过LIPOFECTAMINE LTX和PLUS试剂(LIPOFECTAMINE LTX with PLUS reagent,Invitrogen)用pFUSE/BCMA-rFc转染293T细胞。通过几轮有限稀释在含有200mg/ml ZEOCIN抗生素(Invitrogen)的培养基中选择转染的细胞。具有最高BCMA-rFc表达的稳定细胞系用于在促进高细胞密度的CELLINE AD 1000(Wheaton,Millville,NJ)两隔室生物反应器中大规模生产。用蛋白质G-SEPAHROSE柱(GE healthcare,Pittsburgh,PA)纯化BCMA-rFc融合蛋白。
免疫
用TITERMAX Gold Adjuvant液体(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)中的25μg重组BCMA-rFc融合蛋白对雌性BALB/c小鼠(6周龄)腹膜内免疫用于第一免疫，随后用无佐剂的BCMA-rFc免疫5次。在细胞融合前测试来自小鼠血清的抗体的滴度。为了加强BCMA-免疫的小鼠，将100μg具有佐剂的BCMA-rFc腹膜内注射到小鼠中。在用于细胞融合的最终增强后72小时(h)收获脾脏。将所有动物均根据机构指南进行维持。
细胞融合和杂交瘤培养
用无血清的IMDM分别洗涤脾细胞和P3U1细胞三次和两次。对脾细胞计数并以4:1的比率将其与P3U1混合。将混合的细胞离心并将细胞沉淀重悬于1ml的40％聚乙二醇(PEG4000,EMD Millipore,Billerica,MA)中，将其在1分钟的时间内在旋转下逐滴地添加。再旋转1分钟后，将混悬液用预热(37C)的IMDM缓慢稀释。将得到的混悬液离心并将细胞沉淀以2.5x106/ml重悬于补充有20％FBS、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-巯基乙醇、10μg/ml庆大霉素、8μg/ml牛胰岛素、1μg/ml牛转铁蛋白、1U/ml的人IL-6的IMDM中。将细胞混悬液以2.5x105个细胞/孔接种在96孔板中并在CO2孵育箱中培养。在融合后次日，加入100μl新鲜的HAT培养基。在第4天和第7天，用新鲜的HAT培养基代替一半用过的培养基(spentmedium)。如下所述通过荧光激活细胞分选仪(FACS)筛选在第10或11天测定培养物上清液中的抗体产生。
FACS筛选
对于转染实验，将293T细胞接种在100mm皿(BD Biosciences,Bedford,MA)中并在近汇合密度下生长。根据制造商的说明书，通过LIPOFECTAMINE LX和PLUS试剂，每皿转染pcDNA6/BCMA、pcDNA/TACI或pcDNA6/BAFFR(6μg)。24小时后，收获瞬时转染的细胞并将其用于FACS筛选。将细胞(1-5x 105)与杂交瘤上清液在FACS缓冲液(含有5％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS)中的连续稀释液一起在冰上孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤两次后，将细胞与1:200稀释的R-藻红蛋白(PE)-标记的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2(Jackson Immuno ResearchLaboratories,West Grove,PA)孵育30分钟。洗涤两次后，将细胞重悬于含有10nM TO-PRO-3染色剂(Invitrogen)的180μl FACS缓冲液中，并且使用BD ACCURI C6流式细胞仪(BDBiosciences)测量与活细胞相关的荧光。将阳性杂交瘤克隆转移至24孔板中。为了排除第一筛选中的假阳性，在转移后2天重新测定24孔培养物上清液。通过几轮有限稀释克隆特异性杂交瘤并使其在CELLINE烧瓶中生长以收获培养物上清液中的MAb。通过小鼠MAb同种分型试剂(isotyping reagent)(Sigma-Aldrich)确定建立的单克隆抗体(MAb)的同种型。通过夹心ELISA测定培养物上清液中的免疫球蛋白浓度。
ELISA
在4℃下用于PBS中的100ng/孔的山羊抗-兔IgG(Jackson Immuno ResearchLaboratories)包被MAXISORP 96孔ELISA板(Nalge Nunc,Rochester,NY)过夜。封闭后，向板中加入5ng/孔的BCMA-rFc、TACI-rFC或BAFFR-rFc，并在室温下孵育2小时。洗涤后，将4μg/ml杂交瘤上清液加入板中，并在室温下孵育2小时。洗涤后，通过与碱性磷酸酶(ALP)-标记的山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research Laboratories)，随后磷酸对硝基苯酯(pNPP,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)孵育1小时检测结合的MAb。
亲和力测定
使用BLITZ(ForteBio,Menlo Park,CA)仪器通过生物层干涉测量法测量MAb与BCMA的结合动力学。根据制造商的说明书，在用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化传感器表面后，通过胺偶联将BCMA-rFc固定在胺-反应性第二代生物传感器上。使在PBS(pH 7.4)中的5个不同浓度的MAb的连续稀释液运行穿过传感器表面。使用内置的BLITZ软件来确定缔合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和亲和力常数(KD)，从而使传感图数据组全局拟合。
实施例1
本实施例说明了分泌抗-BCMA mAb的杂交瘤的产生。
用于佐剂中的BCMA-rFc融合蛋白腹膜内免疫小鼠以用于第一免疫，且随后用无佐剂的BCMA-rFc免疫5次。在用BCMA-rFc免疫的小鼠的血清中检测到针对表达BCMA的293T细胞的高抗体滴度(1:10,000)。通过腹膜内注射具有佐剂的BCMA-rFc，给予具有高滴度的小鼠最后一次加强，并且3天后将脾脏与P3U1骨髓瘤融合。通过FACS分析筛选杂交瘤的培养物上清液的特异性mAb的产生。FACS筛选后，选择了11个阳性克隆。在这11个克隆中，BM303显示出对BCMA的天然构象的最高亲和力。同型分型测试揭示出所有选择的mAb都是具有κ轻链的IgG1。
实施例2
本实施例说明了BM24和BM306抗体能够特异性结合BCMA。
为了检查抗-BCMA mAb与其它TNFR超家族成员的交叉反应性，通过FACS测试饱和浓度(4μg/ml)的每种mAb与通过转染的293T细胞表达的天然TNFR(BCMA、TACI或BAFFR)的反应性。通过ELISA测试每种mAb与TNFR-rFc融合蛋白的反应性。这些结果表明，5种mAb(BM101、BM226、BM303、BM309和BM313)与TACI表现出不同程度的交叉反应性，而BM14、BM24、BM201、BM219、BM222和BM306中的每一种的结合在两个测定中都对BCMA是特异性的。
实施例3
本实施例说明了BM24和BM306的结合动力学。
BM24和BM306以高亲和力和特异性选择性结合细胞表面上的BCMA抗原。通过生物层干涉测量法测量这两种抗-BCMA mAb针对BCMA-rFc蛋白质的结合动力学。将抗-BCMA MAb的连续稀释液(20、10、5、2.5、1.25μg/ml)施加到BCMA-rFc固定的传感器上并检测。用BLITZ软件进行实时生物分子相互作用分析。结果显示在表1中。与BM24相比，BM306显示出高缔合速率常数(Ka)。两种mAb的解离常数(KD)都小于1x10-12(超出检测限)。
表1
样品 KD(M) ka(1/Ms) kd(1/s)
BM24 <1x10-12 2.97x105 <1x10-7
BM306 <1x10-12 4.15x105 <1x10-7
实施例4
本实施例说明了来自BM24和BM306杂交瘤的Fv片段的克隆。
BM24和BM306mAb两者都是IgG1同种型。使用IgG1同种型-特异性寡聚物引物从表达BM24和BM306的杂交瘤克隆重链和轻链。表2中显示了氨基酸序列的SEQ ID NO。
表2
BM24 VH SEQ ID NO:13
BM24 VL SEQ ID NO:14
BM306 VH SEQ ID NO:15
BM306 VL SEQ ID NO:16
实施例5
本实施例说明了使用来自BM24和BM306的Fv开发了基于PE的免疫毒素。
制备免疫毒素，其中Fab或dsFv片段与PE的结构域III的变体连接。下面列出了所得的抗-BCMA免疫毒素：
LMB34：BM24-Fab-LO10R456A；
LMB38：BM24-Fab-LR-GGS；
LMB63：BM24-Fab-LR-GGS-T20；
LMB64：BM24-Fab-LR-GGS-T20-KDEL；
LMB70：BM306-Fab-LR-GGS；
LMB75：BM306-dsFv-LR-GGS；
LMB92：BM306-Fab-LO10R456A；
LMB94：BM306-dsFv-GGSx4-PE24(无弗林蛋白酶位点)；
LMB103：BM306-Fab-LR-GGS-T20；和
LMB107：BM306-dsFv-PE38。
实施例6
本实施例说明了抗-BCMA免疫毒素(IT)针对细胞系的活性。
通过WST测定来测试抗-BCMA免疫毒素针对表达BCMA的细胞系和来自四名多发性骨髓瘤患者的细胞的活性。每种免疫毒素的IC50值总结在表3中。具有野生型PE24-GGS的LMB38和LMB70是针对表达BCMA的H929细胞系的最有活性的IT，其IC50为1.0-1.5ng/ml。
实施例7
本实施例说明了抗-BCMA免疫毒素在固定剂量下的细胞毒性。
为了测试LMB38和LMB70实际上是否杀死细胞而不是仅抑制生长，将BCMA-阳性H929细胞与无毒素(对照(Ctrl))或100ng/ml的LMB38或LMB70一起孵育2小时、4小时、6小时或24小时，随后在新鲜培养基上洗涤并孵育。通过暴露于免疫毒素后各个时间点(天数)取得的细胞的台盼蓝染色测量细胞杀死活性。如表4A和4B所示，甚至在暴露于100ng/ml的LMB38 2小时后，细胞全部死亡(台盼蓝阳性)。21天后细胞没有复苏，表明细胞在暴露于100ng/ml的LMB38后全部死亡。
表4A
表4B
将BCMA-阳性H929、U266和RPMI细胞系以3ml体积以106/ml接种。在第0天(D-0)，以100ng/ml添加LMB38(BM24-Fab-LRggs)。在不同的日期取出细胞(10μl)并在台盼蓝染色后计数。D-3后，将细胞洗涤并接种于不含毒素的培养基中。对于6小时的组，将细胞在6小时后洗涤并接种于不含毒素的常规培养基中。环己酰胺(Chxm)和205用作阳性对照；靶向间皮素的SS1-Fab-免疫毒素用作阴性对照(Ctrl)。
如表5所示，所有三种细胞系均被高剂量的LMB38杀死。
表5
NT＝未测试。
实施例8
本实施例说明了LMB38在具有H929异种移植肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性。
为了测试LMB38和LMB70的体内功效，使用最敏感的细胞系H929使肿瘤在SCID小鼠中生长。基于先前的毒性数据，对每组5只小鼠使用1.5mg/kg QODX5剂量。如图1A和1B所示，与对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)-处理的小鼠相比，免疫毒素-处理组中的肿瘤生长延迟。然而，一旦处理结束，肿瘤就会重新长出。
实施例9
本实施例说明了LMB70和阿普拉克西纳的组合在具有H929异种移植肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性。
体外测量H929和U266B细胞对阿普拉克西纳和bortezumib(BTZ)的敏感性。结果示于表6中。
表6
阿普拉克西纳IC50 BTZ IC50
H929 0.5ng/ml 4nM
U266B 1.0ng/ml NT
NT＝未测试
使用细胞系H929使肿瘤在小鼠中生长。当肿瘤达到约100mm3的体积时，向小鼠施用对照(媒介物)、仅LMB70、仅阿普拉克西纳或阿普拉克西纳(Abrx)和LMB70的组合。剂量为：LMB70(BM306-Fab-LR-ggs)：1mg/kg QODX5；Abrx:40mg/kg X1。
测量肿瘤体积。结果示于图2中。如图2所示，用阿普拉克西纳和LMB70的组合处理的小鼠中肿瘤生长受到抑制。
实施例10
本实施例说明了杀死H929细胞所需的暴露于LMB70的持续时间。本实施例还说明了H929细胞暴露于LMB70后有多快死亡。
用AF647标记LMB70以测量体内摄取。使用AF647标记试剂盒(Life Technologies)将LMB70用AF647标记两次。通过WST-8测定和亲和力测量来测量标记功效和活性。在第一标记后的WST-8分析揭示未标记的LMB70的IC50为1.532且标记的LMB70的IC50为6.082。第二标记后的WST-8分析揭示未标记的LMB70的IC50为2.758且标记的LMB70的IC50为10.69。在第一标记后的亲和力测量揭示未标记的LMB70的Bmax为2220且标记的LMB70的Bmax为1131，并且未标记的LMB70的Kd为4078且标记的LMB70的Kd为3673。已确定标记的毒素的活性比未标记的毒素低约4倍。
为了定量H929细胞表面上的BCMA分子，将H929细胞与各种浓度的标记的LMB70在FLOW缓冲液中在冰上一起孵育1小时。洗涤细胞并将其通过流式细胞术与AF647定量珠一起分析。结果显示，第一标记后，Bmax为150,000个分子/细胞且Kd为710ng/ml(9.5nM)。第二标记后，Bmax为230,000个分子/细胞且Kd为1600ng/ml(21nM)。
将H929细胞暴露于LMB70持续不同的持续时间。3天后通过流式细胞术(膜联蛋白V/7AAD染色)分析细胞活力。结果显示，使用高剂量的LMB70(100ng/ml)，非常短的暴露时间(如短至10分钟)足以杀死细胞。
将H929细胞暴露于100ng/ml LMB70持续20分钟。用台盼蓝染色分析细胞活力。结果显示，H929细胞在暴露后24小时开始死亡，并且所有细胞在3天后死亡。
将H929细胞暴露于2ng/ml LMB70，持续10分钟至长达72小时的不同时间长度。3天后通过流式细胞术(膜联蛋白V/7AAD染色)分析细胞活力。结果显示，使用2ng/ml LMB70，细胞即使在暴露24小时后也不会死亡。
实施例11
本实施例说明了不同浓度的LMB70对H929细胞活力和生长的影响。
将H929细胞暴露于2、10和100ng/ml LMB70持续2小时或6小时。分析细胞活力和细胞密度。结果显示在图3A-3D中。结果显示2ng/ml LMB70仅提供轻微的生长抑制，但没有细胞杀死。10ng/ml LMB70不足以杀死所有细胞；存活的细胞在一段时间后生长出来。
将H929细胞暴露于与0、1、3或6nM硼替佐米组合的0、2、6或10ng/ml LMB704小时。用台盼蓝染色分析细胞活力和细胞密度。结果显示在图4A-4D和5A-5D中。
本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)通过引用并入本文，其程度如同每个参考文献被单独且具体地指出通过引用并入并且在此全部阐述一样。
术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和“所述(the)”以及类似的指代物在描述本发明的上下文中(特别是在下述权利要求的上下文中)的使用被解释为既涵盖单数又涵盖复数，除非本文另外指明或者上下文明显矛盾。术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”以及“含有(containing)”被解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)除非另外标注。本文数值范围的叙述仅意图作为单独指落入范围内的各独立数值的速记法，除非本文另外指明，并且各独立的数值并入说明书如同本文单独对其进行叙述一样。可以以任何合适的顺序实施本文所述的所有方法，除非本文另外指明或者在其它方面与上下文明显矛盾。本文提供的任何或所有实施例或者示例性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制，除非另外声明。说明书中的语言均不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必要的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。经阅读前述描述，那些优选实施方案的改变对于本领域普通技术人员而言可以变得显而易见。发明人期望本领域技术人员视情况应用此类改变，并且发明人意图以与本文具体所述的不同的方式实践本发明。因此，如适用的法律所允许的，本发明包括在此所附的权利要求中所述的主题的所有修饰和等同物。此外，本发明涵盖以上所述元素的所有可能的改变的任何组合，除非本文另外指明或者在其它方面与上下文明显矛盾。
序列表
<110> 美国卫生和人力服务部(THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTEDBY THE
SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES)
桑福德研究院(SANFORD RESEARCH)
<120> 抗-BCMA多肽和蛋白质
<130> 726736
<150> US 62/257,493
<151> 2015-11-19
<150> US 62/255,255
<151> 2015-11-13
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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1 5 10

Claims (25)

1.多肽，其包含抗体BM24或BM306的互补决定区(CDR)序列。
2.多肽，其包含(a)SEQ ID NO:1-6或(b)SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的多肽，其包含(a)SEQ ID NO:13-14或(b)SEQ ID NO:15-16的氨基酸序列。
4.蛋白质，其包含：
(a)含有SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列的第二多肽；或
(b)含有SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列的第二多肽。
5.如权利要求4所述的蛋白质，其包含：
(a)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第二多肽；或
(b)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二多肽。
6.抗-B细胞成熟抗原(BCMA)结合部分，其包含权利要求1-3中任一项所述的多肽或者权利要求4或5所述的蛋白质。
7.如权利要求6所述的结合部分，其中所述抗-BCMA结合部分是抗体、Fab片段(Fab)、F(ab’)2片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体、单链可变区片段(scFv)或二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)。
8.如权利要求7所述的结合部分，其中所述抗体是双特异性抗体。
9.嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4或5所述的蛋白质或权利要求6-8中任一项所述的结合部分。
10.缀合物，其包含与(b)效应分子缀合或融合的(a)权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4或5所述的蛋白质、权利要求6-8中任一项所述的抗-BCMA结合部分或者权利要求9所述的CAR。
11.如权利要求10所述的缀合物，其中所述效应分子是药物、毒素、标记物、小分子或抗体。
12.如权利要求10或11所述的缀合物，其中所述效应分子是(i)假单胞菌外毒素A(PE)、(ii)PE的细胞毒性片段或者(iii)(i)或(ii)的细胞毒性变体。
13.如权利要求10-12中任一项所述的缀合物，其中所述效应分子选自：PE-LR、PE-LO10R456A、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE 24、PE25、PE38QQR、PE38KDEL和PE35。
14.如权利要求10-13中任一项所述的缀合物，其中所述效应分子经由接头缀合或融合至所述多肽、蛋白质或抗-BCMA结合部分。
15.如权利要求14所述的缀合物，其中所述接头包含SEQ ID NO:17或18的氨基酸序列。
16.核酸，其编码权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4或5所述的蛋白质、权利要求6-8中任一项所述的抗-BCMA结合部分、权利要求9所述的CAR或者权利要求10-15中任一项所述的缀合物。
17.重组表达载体，其包含权利要求16所述的核酸。
18.宿主细胞，其包含如权利要求17所述的重组表达载体。
19.宿主细胞群体，其包含至少两种权利要求18所述的宿主细胞。
20.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4或5所述的蛋白质、权利要求6-8中任一项所述的抗-BCMA结合部分、权利要求9所述的CAR、权利要求10-15中任一项所述的缀合物、权利要求16所述的核酸、权利要求17所述的重组表达载体、权利要求18所述的宿主细胞或者权利要求19所述的宿主细胞群体以及药学上可接受的载体。
21.检测哺乳动物中癌症的存在的方法，所述方法包括：
(a)使包含来自所述哺乳动物的一种或多种细胞的样品与权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4或5所述的蛋白质、权利要求6-8中任一项所述的抗-BCMA结合部分、权利要求9所述的CAR、权利要求10-15中任一项所述的缀合物、权利要求16所述的核酸、权利要求17所述的重组表达载体、权利要求18所述的宿主细胞、权利要求19所述的宿主细胞群体或者权利要求20所述的药物组合物接触，从而形成复合物，和
(b)检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示所述哺乳动物中存在癌症。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述癌症是伯基特氏淋巴瘤、DLBCL淋巴瘤、ALL淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
23.权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4或5所述的蛋白质、权利要求6-8中任一项所述的抗-BCMA结合部分、权利要求9所述的CAR、权利要求10-15中任一项所述的缀合物、权利要求16所述的核酸、权利要求17所述的重组表达载体、权利要求18所述的宿主细胞、权利要求19所述的宿主细胞群体或者权利要求20所述的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的用途。
24.用于权利要求23所述用途的多肽、蛋白质、抗-BCMA结合部分、缀合物、核酸、重组表达载体、分离的宿主细胞、细胞群体或药物组合物，其中所述癌症是伯基特氏淋巴瘤、DLBCL淋巴瘤、ALL淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
25.(A)权利要求23或24所述的多肽、蛋白质、抗-BCMA结合部分、缀合物、核酸、重组表达载体、分离的宿主细胞、细胞群体或药物组合物和(B)第二治疗剂，
其用于权利要求23或24所述的用途。
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