CN106999444A - 完整的细菌衍生的囊泡对小分子化合物的增强装载 - Google Patents
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Abstract
将小分子化合物增强装载到完整的细菌衍生的囊泡中提供操作及治疗优势。
Description
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背景
该申请要求2014年10月3日提交的美国临时专利申请号62/059,466的优先权。该申请的内容以其全部通过引用被并入本文。
封入生物活性剂的无生命但完整的细菌囊泡已用于治疗目的。在例如国际专利申请W02003/033519中,本发明人描述含有治疗性核酸分子的细菌衍生完整微细胞的制备及用途。通过W02005/079854,本发明人也表明,小分子药物(无论亲水性或疏水性)可封装至微细胞中,所述微细胞在被靶哺乳动物细胞摄取时可将药物释放至靶细胞的细胞质中。同样地,美国专利第8,591,862号列出本发明人且表明封装有治疗剂的完整杀死的细菌细胞的制备及用途。
根据定义,杀死的细菌细胞为无生命的,微细胞亦如此。任一种类型的完整细菌囊泡均不能复制或主动侵入宿主细胞。
本发明人已报导,杀死的细菌细胞及微细胞(尽管其尺寸相对较大)在与细胞接触时可被靶哺乳动物细胞摄取,且随后在晚期内体/溶酶体中降解,将其药物有效负载释放至靶细胞中。当杀死的细菌细胞或微细胞附着至靶向哺乳动物细胞的配体时,摄取改良。W02005/056749中说明性描述的此类配体为双特异性抗体,其具有(i)对微细胞表面结构具有特异性的第一臂及(ii)对非吞噬性哺乳动物细胞表面受体具有特异性的第二臂。
本发明人也发现,在静脉内施用到带有肿瘤的哺乳动物宿主后,微细胞通过与包括某些脑瘤的多种实体肿瘤相关的渗漏脉管快速外渗(W02013/088250),且微细胞在肿瘤微环境中积聚。微细胞被限制于肿瘤微环境中且不会穿透至正常组织中被认为归因于直径约400nm±50nm的微细胞不能从包围正常(非肿瘤)组织的正常脉管逸出。
另外,本发明人描述用于将药物有效负载装载至此类细菌囊泡中的方法。例如,核酸在浓度梯度下与囊泡一起温育时可被封装至完整无生命细菌囊泡中,在此期间,核酸沿梯度向下移动至囊泡中。参见例如美国专利第8,669,101号。可选地,可将编码核酸的质粒转导至活细菌中且复制或转录以产生核酸。随后可杀死封装核酸的活细菌,得到如上文所描述的杀死的细菌细胞,或其可产生自身装载有核酸的完整微细胞。参见例如W02003/033519。
不同于核酸,小分子药物典型地无法由质粒产生。然而,如所述,本发明人发现,可直接将此类药物装载至囊泡中。他们的装载小分子药物的方法被阐明在MacDiarmid等人,Cancer Cell 11:431-45(2007)所报导的实验中。
对于2007公开内容中报导的实验,用1至2毫升(ml)磷酸缓冲盐水(“PBS缓冲液”)中所含有的微细胞实现药物装载,所述缓冲液具有以下组成:137mM NaCl、2.7mM KC1、10mMNa2PO4、2mM KH2PO4(调节至pH 7.4)。参见P.Gerhardt等人,MANUAL OF METHODS FORGENERAL BACTERIOLOGY,第2版,American Society for Microbiology(Washington,D.C.),1981。在此1ml至2ml规模(下文,“小规模”)上,与给定药物共同温育微细胞之后进行自微细胞移除过量药物的工作。此工作需要离心,从而将封装药物的微细胞形成球粒(pellet),且随后丢弃认为任何过量药物存在于其中的上清液。随后使微细胞再悬浮于新鲜PBS(同样1至2ml)中,且对于给定制剂,重复离心及上清液丢弃步骤五次至六次。在本公开中,此常规方法称为“小规模方案”,其需要共同温育(装载)步骤及通过再悬浮、离心及上清液丢弃的洗涤的多个步骤,均在1至2ml规模上进行。
作为执行小规模方案的后续,MacDiarmid等人提取与微细胞相关的药物,参见第433页上及以下的最后一个完整句子,之后使用HPLC分析来测定药物浓度。对于若干抗癌药物,MacDiarmid等人报导就例如多柔比星的“每个微细胞约1000万个......分子......”而言,小规模方法的所估计的装载效率。同上,第435页的第一个完整句子。
发明概述
通过进一步研究,本发明人已发现,当与初始不含有给定荧光化合物的无生命完整细菌囊泡一起温育时,荧光化合物可出人意料地比其他类似但非荧光化合物更迅速地沿所得浓度梯度向下移动(高外部至低内部)至囊泡的细胞质中,且荧光化合物也可实现出人意料地较高囊泡内浓度。沿着这些线索,本发明人观测到,例如将非荧光化合物与荧光部分连接大大提高至无生命完整细菌囊泡中的装载、用非荧光化合物自身获得的相对结果,然而此类修饰典型地实现分子量提高,其被认为将妨碍药物装载。
尤其就荧光化合物的装载而言,本发明人也已确定,当在已添加有诸如碱金属卤化物盐(例如氯化钾、氯化钠及溴化钾)的二元离子化合物的培养基中实现荧光化合物的装载时,效率的增强甚至更大。依照本发明,装载培养基中浓度低至约200mM数量级的此类化合物的存在使荧光化合物的装载效率提高两倍或更多,其中装载在仅约十五分钟之后有效地完成。
更一般而言,本发明人发现,可除去上文所讨论的小规模方案中涉及的离心,且对于荧光及非荧光化合物两者,小规模方案自身替换为共同温育(装载)继而经由交叉流过滤的洗涤的多个步骤的方法。一般而言,参见CROSS FLOW FILTRATION METHOD HANDBOOK(29-0850-76AB),GE Healthcare,访问www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1392028292867/litdoc29085076_20140313045908.pdf。也参见MEMBRANE PROCESSES IN BIOTECHNOLOGY AND PHARMACEUTICS,Catherine Charcosset编,Elsevier(2012)及STERILE FILTRATION:A PRACTICAL APPROACH,Maik W.Jornitz及Theodore H.Meltzer编,Taylor&Francis(2000)。根据本发明,用可购自除其它供货商外的Sartorius Stedim Systems,GE Healthcare和Pall Corporation的医药级过滤器进行交叉流过滤。基于由供货商提供的使用者手册中的描述,视过滤器的尺寸、制备规模等而定,选择适合的过滤器在熟悉过滤领域的那些人的权限内。另外,过滤器的孔径为标准的,例如0.45μm或0.2μm,视过滤目的而定。在过滤期间所施加的压力在各步骤间不同且根据需要进行调节。
在此情形下,当在缓冲液中洗涤封装药物的囊泡的规模在所采用的缓冲液体积方面提高约四与五个之间的数量级(即,相比于小规模方案的毫升规模,在升规模(下文,“大规模”)),例如通过每次重复在约20升新鲜缓冲液中重复洗涤装载药物的囊泡三至五次时,发现涉及出人意料的优势。依照此方法(下文,“大规模方法”),因此,可例如在针对给定批次的装载药物的囊泡的洗涤步骤中采用约100升数量级的缓冲液。
因此,本发明方法不仅使得游离内毒素水平下降,且也使得常规小规模方案截留(trapped)于囊泡外表面上的有效负载化合物的迄今未辨识部分减少。借助于说明,小规模方案使得每个完整微细胞装载许多多柔比星分子,上述MacDiarmid等人(2007)估计为约1000万。在本发明的大规模方法的情况下,此数值为每个微细胞约100万个以下的分子(参见以下实施例6)。因此,小规模方案与使900万个多柔比星分子中的一些截留至封装微细胞外层相关,与本发明方法形成显著对比(参见实施例14)。
因此,根据本发明方法,有效负载化合物截留至封装囊泡外部被减到最少,且当移除浓度梯度时,装载化合物保持在囊泡内部。因此,本发明提供制备以每109个微细胞数百纳克化合物的数量级的量封入装载化合物的完整无生命细菌囊泡的高效方法。
因此,在一个方面中,本发明提供包含封入荧光小分子药物的完整且无生命的细菌囊泡的组合物,该荧光小分子药物不是多柔比星、伊立替康、比山群、托泊替康、表柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、Oregon488结合的紫杉醇或FL结合的长春碱。囊泡为完整细菌衍生的微细胞或杀死的细菌细胞。在一些实施方式中,微细胞封入小分子药物的至少500,000个分子。优选,小分子药物为生物活性的。在一些实施方式中,小分子药物的分子量为约900道尔顿或更小。在其它实施方式中,小分子药物为细胞毒性的。示例性小分子药物包括但不限于吗啉基蒽环类衍生物,诸如PNU-159682。在某些实施方式中,小分子药物为体内活化的。
在另一方面中,本公开提供包含封入式D-L-F化合物或其盐的完整且无生命的细菌囊泡的组合物,其中:D为小分子药物的残基,L为连接体,且F为荧光部分。适用于本发明的连接体的半衰期在6小时与24小时之间,或在酸性pH条件下,诸如在哺乳动物细胞的内体中降解。下文详述说明性小分子药物、荧光部分及连接体及其结构。
在又一方面中,提供包含封入化合物的细菌衍生的完整细菌囊泡的组合物,该化合物包括活性剂,通过连接体结合至能量转移部分,其中活性剂不为Oregon488结合的紫杉醇和FL结合的长春碱。在一些实施方式中,能量转移部分为发光部分,包含共轭pi系统,或包含吖啶基部分、呫吨基部分或苯并咪唑基部分。
在相关方面中,本发明涉及不通过离心使多个微细胞装载所需化合物的方法。该方法包括以下步骤:(A)在一定体积的所需化合物于缓冲液体中的温育溶液中温育该多个微细胞,其中体积为约100ml或更大的数量级,及随后(B)使该多个微细胞经多个洗涤步骤,各包括用数量级为升的一定体积的缓冲液体交叉流过滤微细胞,其中洗涤步骤中无一者采用离心微细胞。在一些实施方式中,使与待装载在微细胞内的所需化合物不同的二元离子化合物溶解于温育溶液中,达到约200mM或更大数量级的浓度。优选,步骤(B)包括三至五个洗涤步骤。在一些实施方式中,所需化合物为荧光的。在一些实施方式中,步骤(A)的温育持续约4小时的时期。在一些实施方式中,所需化合物为生物活性的。所需化合物可为分子量为约900道尔顿或更小的小分子药物。优选,小分子药物为细胞毒性的。小分子药物可为体内活化的。在其它实施方式中,所需化合物具有式D-L-F或为其盐,其中D为小分子药物的残基,L为连接体,且F为荧光部分。优选,连接体的半衰期在6小时与24小时之间或在哺乳动物细胞的内体中降解。
在又一方面中,描述涉及在需要其的患者中治疗癌症。治疗包括向患者施用有效量的本发明所涵盖的组合物。在一些实施方式中,组合物包含细胞毒性化合物。
附图简述
图1显示封装有长春碱FL的微细胞的荧光图像。微细胞在黑色背景上发出亮红色荧光,指示长春碱FL存在于微细胞中且不存在于外部空间中。
图2显示封装有FLUTAX-1的微细胞的荧光影像。微细胞在黑色背景上发出亮绿色荧光。因此,FLUTAX-1被封装至微细胞中且未保留在外部空间中。
图3显示来自1×109个封装FLUTAX-1的微细胞的提取物的HPLC分离的示例性层析图。在保留时间(rt)=4.72分钟时发现对应于FLUTAX-1的峰值。此峰面积用于通过与已知量的FLUTAX-1的标准曲线进行比较来计算封装至微细胞中的FLUTAX-1的量。
图4显示封装有与Green-488结合的紫杉醇的微细胞的荧光影像。微细胞在黑色背景上发出亮绿色荧光显示结合物封装至微细胞中。
图5显示封装有FCP的微细胞的荧光影像。微细胞在黑色背景上发出亮绿色荧光,指示FCP封装至微细胞中。
图6显示来自装载FCP的微细胞(1×109)的提取物的HPLC分离的示例性层析图。在保留时间(rt)=3.64分钟时发现对应于FCP的峰值。此峰值的区域用于通过与已知量的FCP的标准曲线进行比较来计算封装至微细胞中的FCP的量。
图7显示封装有BacLightTM Green的微细胞的荧光影像。微细胞在黑色背景上发出亮绿色荧光。因此,BacLightTM Green显示与微细胞相关且不与外部空间相关。
图8显示由空的及封装BacLightTM Green的微细胞的流式细胞术分析产生的直方图。x轴表示FL-1通道中的荧光,且y轴=计数。封装BacLightTM Green的微细胞呈现相异的群体,其相比于空的微细胞移位至右侧,指示该群体的微细胞为荧光的。
图9显示封装有多柔比星的微细胞的荧光影像。微细胞在黑色背景上发出亮红色荧光,指示多柔比星存在于微细胞内而非外部空间中。
图10显示来自1×109个封装多柔比星的微细胞的提取物的HPLC分离的示例性层析图。在保留时间(rt)=5.5分钟时发现对应于多柔比星的峰值。此峰值的区域用于通过与已知多柔比星量的标准曲线进行比较来计算封装至微细胞中的多柔比星的量。
图11显示封装有核酸染料SYTO 9的微细胞的荧光影像。微细胞在黑色背景上发出亮绿色荧光,指示SYTO 9与微细胞而非外部空间相关。
图12显示由空的及封装SYTO 9的微细胞的流式细胞术分析产生的直方图。x轴表示FL-1通道中的荧光;y轴=计数。封装SYTO 9的微细胞呈现相异的群体,其相比于空的微细胞移位至右侧;因此,封装微细胞为荧光的。
图13显示封装有9-氨吖啶盐酸盐水合物的微细胞的荧光影像。微细胞在黑色背景上发出蓝色荧光,指示9-氨吖啶盐酸盐水合物与微细胞而非外部空间相关。
图14显示来自1×109个封装紫杉醇的微细胞的提取物的HPLC分离的示例性层析图。在保留时间(rt)=4.48分钟时发现对应于紫杉醇的峰值。此峰值的区域用于通过与已知量的标准曲线进行比较来计算封装至微细胞中的紫杉醇的量。
图15显示来自1×109个封装TF.Pac的微细胞的提取物的HPLC分离的示例性层析图。在保留时间(rt)=4.57分钟时发现对应于TF.Pac的峰值。此峰值的区域用于通过与已知TF.Pac量的标准曲线进行比较来测定封装至微细胞中的TF.Pac的量。
图16显示在两种不同波长处,具有不同浓度的叶酸的装载多柔比星的溶液的荧光读数。
图17显示游离多柔比星的标准曲线的产生。
图18显示荧光淬灭剂叶酸对多柔比星装载量的影响。
图19显示根据UV(250nm)读数的多柔比星装载至微细胞中的HPLC定量。
图20显示根据相对荧光(RF)读数的多柔比星装载量的HPLC定量。
图21显示在来自各种离子盐的解离的离子存在下装载至微细胞中的FLUTAX-1的过程及量。
图22描绘针对表示将FLUTAX-1装载至微细胞中15分钟的时间点,图21中所显示的数据。
图23显示共同温育温度对通过离子增强荧光介导的化合物跨膜移动至微细胞中的影响。
图24说明人类受体酪氨酸激酶的20个亚家族及58个成员(摘录自Lemmon andSchlessinger,Cell 141:1117-134(2010))。
详细描述
本公开提供用于将化合物装载至完整的细菌衍生的无生命囊泡(包括微细胞及杀死的细菌细胞的类别)中的方法,以及含有装载此类化合物的囊泡的组合物(优选医药级)。
(A)定义
除非另外定义,否则本说明书中所用的所有技术及科学术语具有与相关技术领域技术人员通常所理解相同的含义。
为方便起见,下文提供本说明书、实施例及所附权利要求中所采用的某些术语及词组的含义。在整个说明书中定义其它术语及词组。
除非上下文另外明确指示,否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个指示物。
如本文所使用,术语“约”将为一般本领域普通技术人员理解且将在一定程度上视使用其的上下文而变化。若使用本领域普通技术人员并不清楚的术语(给定使用该术语的上下文),则“约”将意谓特定术语至多加或减10%。
如本文所使用,除当上下文另外需要时外,术语“包含(包括,comprise)”及该术语的变化形式,诸如“包含(包括,comprising)”、“包含(包括,comprises)”及“包含(包括,comprised)”并不意欲排除其它添加物、组分、整数或步骤。
词组“生物活性的(biologically active)”和“生物活性(biologicalactivity)”用于描述或指示(视具体情况)化合物或组合物对活的物质的影响。因此,若材料与人类或动物体中的任何细胞组织具有相互作用或对其有影响,例如通过与细胞中的蛋白质、核酸或其它分子反应,则材料为生物活性的或具有生物活性。
本文中可互换使用的“癌症”、“赘瘤”、“肿瘤”、“恶性肿瘤”及“癌”指展现特征为明显失去细胞增殖控制的异常生长表型的细胞或组织。本公开的方法及组合物尤其适用于恶性、转移前、转移性及非转移性细胞。
“药物”指在动物,尤其哺乳动物及人类中产生局部或全身性影响的任何生理学上或药理学上活性的物质。
在本说明书中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”及“患者”指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物个体。个体、受试者、宿主或患者可为人类或非人类动物。因此,适合的受试者可包括但不限于非人类灵长类动物、牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠及小鼠。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”及其类似者指在肿瘤患者中获得所需药理学及/或生理作用。在完全或部分预防肿瘤生长或其症状方面,该作用可为预防性的,和/或在部分或完全稳定或治愈肿瘤方面和/或针对可归因于肿瘤的不良作用方面,该作用可为治疗性的。治疗涵盖在哺乳动物,尤其人类中的肿瘤的任何治疗。期望的治疗效果可为肿瘤反应,其可测量为肿瘤块(质量,mass)减少或抑制肿瘤块增加。可选地或另外地,期望的治疗效果可为总患者存活、无进展存活、肿瘤复发时间的增加,或不良作用的减少。
“烷基”指具有1至20,或1至10,或1至6,或1至4个碳原子的单价饱和直链或支链线性烃基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基或辛基。C1-C4直链或支链烷基也称为“低级烷基”。
“亚烷基”指具有1至20,或1至10,或1至6,或1至4个碳原子,或1或2个碳原子的二价饱和直链或支链线性烃基。亚烷基的实例包括-(CH2)y-,其中y为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
“环烷基”指具有3至10,或3至8个碳原子的环烃基。环烷基的实例包括例如金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基及环己烯基。“Cu-v环烷基”指具有u至v个碳原子作为环成员的环烷基。
“杂环”或“杂环的”或“杂环基(heterocyclo)”或“杂环烷基”或“杂环基(heterocyclyl)”指具有总计3至18个环原子、1至14个碳原子及1至6个选自氮、硫或氧的杂原子的饱和或部分饱和环状基团,且包括单环及多环系统,包括稠合、桥连及螺环系统。对于具有芳族和/或非芳族环的多环系统,当存在至少一个环杂原子且连接点在非芳族环的原子处(例如1,2,3,4-四氢喹啉-3-基、5,6,7,8-四氢喹啉-6-基及十氢喹啉-6-基)时,应用术语“杂环的”或“杂环”或“杂环基(heterocyclo)”或“杂环烷基”或“杂环基(heterocyclyl)”。在一个实施方式中,杂环基的氮和/或硫原子(一个或多个)任选地被氧化以提供N-氧化物、亚磺酰基或磺酰基部分。更确切而言,杂环基包括但不限于四氢吡喃基、哌啶基、N-甲基哌啶-3-基、哌嗪基、N-甲基吡咯啶-3-基、3-吡咯烷基、2-吡咯烷酮酰-1-基(2-pyrrolidon-1-yl)、吗啉基及吡咯烷基。指示碳原子数目的前缀(例如C3-C10)指杂环基部分中除杂原子数目以外的碳原子总数。
取代的烷基、亚烷基、环烷基或杂环指分别具有1至5或1至3个并未实质上干扰化合物的抗癌活性的取代基的烷基、亚烷基、环烷基或杂环。烷基上取代基的实例包括-OH、-NH2、-NO2、-CN、-COOH、卤基(halo)、卤烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、烷氧基、卤代烷氧基、-ORa、氧代(=O)、-O-CORa、-CORa、-SO3H、-NHRa、-NRaRb、-COORa、-CHO、-CONH2、-CONHRa、-CONRaRb、-NHCORa、-NRcCORa、-NHCONH2、-NHCONRaH、-NHCONRaRb、-NRcCONH2、-NRcCONRaH、-NRcCONRaRb、-C(=NH)-NH2、-C(=NH)-NHRa、-C(=NH)-NRaRb、-C(=NRc)-NH2、-C(=NRc)-NHRa、-C(=NRc)-NRaRb、-NH-C(=NH)-NH2、-NH-C(=NH)-NHRa、-NH-C(=NH)-NRaRb、-NH-C(=NRc)-NH2、-NH-C(=NRc)-NHRa、-NH-C(=NRc)-NRaRb、-NRd-C(=NH)-NH2、-NRd-C(=NH)-NHRa、-NRd-C(=NH)-NRaRb、-NRd-C(=NRc)-NH2、-NRd-C(=NRc)-NHRa、-NRd-C(=NRc)-NRaRb、-NHNH2、-NHNHRa、-NHNRaRb、-SO2NH2、-SO2NHRa、-SO2NRaRb、-CH=CHRa、-CH=CRaRb、-CRc=CRaRb、-CRc=CHRa、-CRc=CRaRb、-CCRa、-SH、-SRa、-S(O)Ra、-S(O)2Ra及-CO-烷基,其中Ra、Rb、Rc及Rd独立地为烷基、卤烷基、环烷基、苯基或苄基。在一些实施方式中,取代基(一个或多个)选自-OH、卤基、苯基、苄基、吡啶基及C1-C8烷氧基。在一些实施方式中,取代基(一个或多个)选自-OH、卤基及C1-C4烷氧基。亚烷基、环烷基或杂环基团上取代基的实例包括-OH、-NH2、-NO2、-CN、-COOH、卤基、卤烷基、烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代(=O)、-ORa、-O-CORa、-CORa、-SO3H、-NHRa、-NRaRb、-COORa、-CHO、-CONH2、-CONHRa、-CONRaRb、-NHCORa、-NRcCORa、-NHCONH2、-NHCONRaH、-NHCONRaRb、-NRcCONH2、-NRcCONRaH、-NRcCONRaRb、-C(=NH)-NH2、-C(=NH)-NHRa、-C(=NH)-NRaRb、-C(=NRc)-NH2、-C(=NRc)-NHRa、-C(=NRc)-NRaRb、-NH-C(=NH)-NH2、-NH-C(=NH)-NHRa、-NH-C(=NH)-NRaRb、-NH-C(=NRc)-NH2、-NH-C(=NRc)-NHRa、-NH-C(=NRc)-NRaRb、-NRd-C(=NH)-NH2、-NRd-C(=NH)-NHRa、-NRd-C(=NH)-NRaRb、-NRd-C(=NRc)-NH2、-NRd-C(=NRc)-NHRa、-NRd-C(=NRc)-NRaRb、-NHNH2、-NHNHRa、-NHRaRb、-SO2NH2、-SO2NHRa、-SO2NRaRb、-CH=CHRa、-CH=CRaRb、-CRc=CRaRb、-CRc=CHRa、-CRc=CRaRb、-CCRa、-SH、-SRa、-S(O)Ra、-S(O)2Ra及-CO-烷基,其中Ra、Rb、Rc及Rd独立地为烷基、卤烷基、环烷基、苯基或苄基。在一些实施方式中,取代基(一个或多个)选自-OH、卤基、C1-C4烷基、苯基、苄基、吡啶基及C1-C8烷氧基。在一些实施方式中,取代基(一个或多个)选自-OH、C1-C4烷基、卤基及C1-C4烷氧基。
“芳基”指具有6至14个碳原子且无环杂原子且具有单个环(例如苯基)或多个缩合(稠合)环(例如萘基或蒽基)的芳族基。对于多环系统,包括具有不含环杂原子的芳族及非芳族环的稠合、桥连及螺环系统,当连接点在芳族碳原子处时,应用术语“芳基”或“Ar”。例如,5,6,7,8四氢萘-2-基为芳基,其连接点在芳族苯环的2-位置处。
“取代的芳基”指用1至8,或在一些实施方式中1至5,1至3或1至2个选自以下的取代基取代的芳基:-OH、氧代(=O)、-NH2、-NO2、-CN、-COOH、卤基、卤烷基、烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、烷氧基、卤代烷氧基、-ORa、-O-CORa、-CORa、-COOH、-SO3H、-NHRa、-NRaRb、-COORa、-CHO、-CONH2、-CONHRa、-CONRaRb、-NHCORa、-NRcCORa、-NHCONH2、-NHCONRaH、-NHCONRaRb、-NRcCONH2、-NRcCONRaH、-NRcCONRaRb、-C(=NH)-NH2、-C(=NH)-NHRa、-C(=NH)-NRaRb、-C(=NRc)-NH2、-C(=NRc)-NHRa、-C(=NRc)-NRaRb、-NH-C(=NH)-NH2、-NH-C(=NH)-NHRa、-NH-C(=NH)-NRaRb、-NH-C(=NRc)-NH2、-NH-C(=NRc)-NHRa、-NH-C(=NRc)-NRaRb、-NRd-C(=NH)-NH2、-NRd-C(=NH)-NHRa、-NRd-C(=NH)-NRaRb、-NRd-C(=NRc)-NH2、-NRd-C(=NRc)-NHRa、-NRd_C(=NRc)-NRaRb、-NHNH2、-NHNHRa、-NHRaRb、-SO2NH2、-SO2NHRa、-SO2NRaRb、-CH=CHRa、-CH=CRaRb、-CRc=CRaRb、-CRc=CHRa、-CRc=CRaRb、-CCRa、-SH、-SRa、-S(O)Ra、-S(O)2Ra及-CO-烷基,其中Ra、Rb、Rc及Rd独立地为烷基、环烷基、苯基或苄基。在一些实施方式中,取代基(一个或多个)选自-OH、卤基、C1-C4烷基、苯基、苄基、吡啶基及C1-C8烷氧基。在一些实施方式中,取代基(一个或多个)选自-OH、C1-C4烷基、卤基及C1-C4烷氧基。
“卤烷基”指用1至5或1至3个卤基取代的烷基。
“烷氧基”指基团-O-烷基,其中烷基如本文所定义。“取代的烷氧基”指-O-(取代的烷基)。
“卤代烷氧基”指基团-O-卤烷基,其中卤烷基如本文所定义。
“卤基”指-F、-Cl、-Br或-I。
“杂芳基”指示具有1至14个碳原子及1至6个选自氧、氮及硫的杂原子的芳族基,且包括5至18元环或环系统——包括单个环(例如咪唑基)或多个环(例如苯并咪唑-2-基及苯并咪唑-6-基)。对于多环系统,包括具有芳族及非芳族环的稠合、桥连及螺环系统,若存在至少一个环杂原子且连接点在芳环的原子处(例如1,2,3,4-四氢喹啉-6-基及5,6,7,8-四氢喹啉-3-基),则应用术语“杂芳基”。在一个实施方式中,杂芳基的氮和/或硫环原子(一个或多个)任选地被氧化以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。在一些实施方式中,杂芳基包含总共5、6或7个环原子,且分别称为5元、6元或7元杂芳基。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、咪唑基、异唑基、吡咯基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、苯并呋喃基、四氢苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并唑基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、苯并咪唑基、苯并异唑基或苯并噻吩基。
“小规模方案”指示例在MacDiarmid等人(2007)中的程序,其中细菌衍生的囊泡,诸如微细胞装载有缓冲液体(典型地PBS缓冲液)中的治疗有效负载,该缓冲液体积数量级为毫升,例如1至2ml,其后装载的微细胞经多个洗涤步骤,涉及离心、上清液丢弃及微细胞再悬浮,同样在毫升体积的缓冲液体中进行。
相比之下,“大规模方法”指本发明的方法,其中装载的微细胞经多个(例如3至5个)洗涤步骤,其中利用每步骤体积数量级为几十升(例如约20升)的适用于细胞生物学研究的PBS缓冲液或其它缓冲液体,诸如HEPES缓冲盐水、硼酸盐缓冲盐水及Tris缓冲盐水,进行交叉流过滤(无离心)。另外,对于大规模方法,使微细胞装载有治疗有效负载(诸如小分子药物)的步骤在一定体积的缓冲液体(其优选约100毫升或更大数量级)中进行,其中缓冲液体,诸如PBS缓冲液任选地具有约200mM或更大数量级的二元离子化合物(诸如KCl)的浓度。
词组“医药级”指示不具有亲代细胞污染、细胞碎片、游离内毒素及其它热原,足以符合人类静脉内施用的管理要求。参见例如美国食品药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)的“工业热原及内毒素测试指南(Guidance for Industry-Pyrogen andEndotoxinsTesting)”(2012年6月)。
“化合物的残基”指示通过从化合物移除原子或部分,诸如氢原子、。OH或-CO-CH3基团获得的部分。因此,在一些实施方式中,化合物的残基为通过从化合物移除氢原子获得的部分。
“取代的杂芳基”指用1至8或在一些实施方式中1至5、或1至3、或1至2个选自针对取代的芳基所定义的取代基的取代基取代的杂芳基。
“立体异构体”指示不同之处在于一或多个立体中心的手性的化合物(一个或多个)。立体异构体包括对映异构体及非对映异构体。若本发明化合物具有一或多个不对称中心或具有不对称取代的双键,则其可以立体异构形式存在,且因此,可作为个别立体异构体或混合物产生。除非另外指明,否则该描述意欲包括个别立体异构体以及混合物。用于立体异构体的立体化学测定及分离的方法是熟知的,如MARCH′S ADVANCED ORGANICCHEMISTRY,第7版(Wiley,2013)的第4章中的讨论所证明。
“互变异构体”指质子位置不同的化合物的替代形式,诸如烯醇-酮基及亚胺-烯胺互变异构体,或含有连接至环-NH-部分与环=N-部分的环原子的杂芳基的互变异构形式,诸如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑及四唑。同理,本文中提及“化合物”同样包括其互变异构体。
“药学上可接受的盐”指衍生自本领域中熟知的多种有机及无机反离子的药学上可接受的盐,且包括例如钠、钾、钙、镁、铵及四烷基铵。当分子含有碱性官能性时,有机或无机酸的酸加成盐,诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其类似;或用诸如以下的有机酸形成:乙酸、丙酸、己酸、环戊丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、草酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、甲磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸及其类似者。盐也可当母体化合物中所存在的酸性质子被金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子置换;或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺及其类似者配位时形成。药学上可接受的盐适用于在患者体内施用且具有合乎需要的药理学特性。适合的盐进一步包括HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS:PROPERTIES,SELECTION,AND USE,第2版(Wiley,2011)中所描述的那些盐。
在本说明书中“有效负载”识别或限定待装载或已装载至微细胞中以用于递送至靶宿主细胞的生物活性材料。
(B)本发明人的发现及其惊人本质
如所述,本发明人发现,荧光本身大大增加小分子化合物至完整无生命细菌囊泡中的装载效率。例如,以下实例表明可将未经修饰的紫杉醇封装至微细胞中以达到每个微细胞2,115个拷贝(分子)的浓度(实施例9),且同时紫杉醇的水可溶衍生物TF.Pac可达到每个微细胞50,000个拷贝(实施例10),均通过与微细胞一起共同温育。相比之下,可将紫杉醇、FLUTAX-1及FITC结合的紫杉醇(FCP)的两种荧光衍生物均装载至微细胞中以达到每个微细胞270,000个拷贝(实施例2)及230,000个拷贝(实施例4)的高浓度。相对于通过未经修饰(未衍生化)的非荧光化合物达到的浓度,这些浓度分别高127倍及109倍。
预期较大分子通常将比较小分子更难装载至囊泡中,因为据认为装载方法需要运送通过膜通道,其中尺寸将影响移动。然而,尽管FCP(分子量:1455.6道尔顿)远大于紫杉醇(分子量:853.9道尔顿),但是荧光衍生物可达到比紫杉醇自身高109倍的囊泡内浓度。出于此原因,本发明人在此方面的发现也是非常惊人的。
可能归因于除其(自发)荧光特性外的小尺寸优势,多柔比星及米托蒽醌分别达到每个微细胞约800,000个拷贝(实施例6)及759,000个拷贝(实施例12)。荧光化合物BacLightTM Green染料(实施例5)、SYTO 9(实施例7)及9-AAHH(实施例8)也展现高装载效率。
紫杉醇、紫杉醇Oregon的又一个荧光结合物同样达到如此高的浓度(实施例3)。同样地以高效率将长春碱的荧光衍生物FL装载至微细胞中,如实施例1所表明。利用未经修饰的长春碱进行此类装载是不可能的,该事实从上述MacDiarmid等人(2007)的使用FL结合的长春碱以及Oregon488结合的紫杉醇以通过荧光显微镜检查证明用药物装载微细胞的公开内容是不明显的。参见MacDiarmid等人(2007)第432页(图例)的图1(E)及(F)。
本发明的另一惊人的方面为荧光化合物的高装载效率似乎与给定化合物的亲水性或疏水性无关。例如,紫杉醇为疏水性的,而TF.Pac及FCP均为水溶性的,但是FCP的装载效率又比TF.Pac的装载效率大5倍。
化合物上荧光部分的结合点似乎不影响通过本发明实现的装载效率。因此,FCP及FLUTAX-1具有相同荧光素荧光团,但对于FCP,其连接在C2’位置处,而非如FLUTAX-1中的C7位置处。又在最终微细胞内化合物浓度方面,两种衍生物实现类似装载效率。
此外,实施例11说明,通过叶酸淬灭多柔比星荧光以剂量依赖性方式降低多柔比星至微细胞中的装载效率。依照本发明,此现象进一步突显了荧光本身在增强化合物装载至微细胞中方面的作用。
据本发明人所知,还没有通过荧光因而对化学化合物的运输或移动,尤其跨越细胞膜的移动产生影响的报导。此类影响,如本发明人所证明,可归因于荧光化合物与跨膜通道中或沿跨膜通道排列的某些分子之间的能量转移,其增强化合物移动通过通道。相比于非荧光化合物,荧光化合物含有例如通过电磁辐射更易于激发的电子。据认为,此类激发有助于荧光化合物与一些微细胞跨膜通道结构(一个或多个)之间的能量转移,使得化合物在通道中更快速移动,以及所装载的化合物的量增加。
根据本发明的装载方法需要浓度梯度,即,细胞外高于细胞内的化合物浓度。然而,如所述,荧光化合物的参与导致装载速率及囊泡内浓度大于可常规地在单独浓度梯度方面解释的浓度。因此,当至微细胞中的装载针对荧光化合物进行时,化合物的细胞内浓度提高且随后超越细胞外浓度,且化合物持续移动至微细胞中直至达到实际饱和度。培养基中离子的存使荧光介导的完整的细菌衍生的囊泡的装载增强成为可能,如实施例13所说明,同样地不是浓度梯度的明显功能。
另外,未告知关于制备含有医药级微细胞及杀死的细菌细胞的组合物的常规思想,且确实未考虑在MacDiarmid等人(2007)所说明的小规模方案的情况下发生的装载化合物在囊泡表面上的截留。本发明人关于截留问题的发现揭露迄今未认识到的变量——表面截留化合物的沥滤(参见实施例14),其可能影响通过施用含有微细胞或杀死的细菌细胞的组合物递送的有效负载化合物的有效剂量,根据以下部分(I)。也在实施例14中说明的本发明的大规模方法允许通过缓解或甚至消除截留问题来控制此变量。
上文所描述的这些发现及其它发现涉及完整的细菌衍生的微细胞,但其易于外推至杀死的细菌细胞。这是因为此两种类型的无生命细菌囊泡的不同之处主要在于尺寸及存在或不存在细菌染色体。两种区别均被认为与化合物的装载效率无关,化合物的装载效率主要为细菌膜的功能(两种类型细菌囊泡共有的特征)。
在这方面,本发明人的出人意料的发现不仅强调在此所描述的针对将小分子化合物装载至完整无生命细菌囊泡中的方法的惊人本质而且也强调根据本发明使用其的相关组合物及方法的惊人本质。
(C)将荧光化合物装载至完整的细菌衍生的囊泡中
因此,提供包括完整无生命细菌囊泡的组合物,该囊泡封入呈现荧光的化合物。荧光为(A)固有的(自发荧光)或(B)非固有的,即,借助于如下文所定义的预先化学引入的能量转移部分的荧光。
自发荧光化合物的子类别(A)原则上涵盖如下文所定义的在曝露于某一波长的电磁辐射后固有地呈现荧光,但典型地不一定在视觉光谱中的任何小分子化合物。根据其方法学方面,涉及子类别(A)的本发明涵盖借助于如上文所定义的大规模方法将任何自发荧光化合物装载至完整的细菌衍生的囊泡(包括微细胞或杀死的细菌细胞)中。根据其组成方面,涉及子类别(A)的本发明涵盖包含完整的细菌衍生的囊泡的组合物,所述囊泡含有自发荧光化合物,其不包括以下化合物(先前公开,而未提及或暗示目前描述的荧光对囊泡装载的影响)中的任一或多个或所有的子类别(A):多柔比星(激发480nm,发射580nm);伊立替康——喜树碱的半合成类似物,激发最大值为约360nm且发射最大值为约440nm;比山群(激发,410nm;发射,517nm);托泊替康(激发,382nm;发射,523nm);表柔比星(激发,474nm;发射,551nm);柔红霉素(激发,488nm;发射,575nm);及米托蒽醌(激发,610及660nm;发射,684nm)。
包含在本发明的组成方面下的其余自发荧光小分子化合物的说明性实例为:达内霉素A,天然环状烯二炔以及达内霉素A的荧光类似物(参见美国专利第5,281,710号,其内容在此以引用的方式并入);吖啶橙,激发最大值为502nm且发射最大值为525nm(绿色);和喜树碱,天然生物碱,激发最大值为360nm且发射最大值为440nm。同样地,说明性实例为在国际专利申请WO1998/002446中所描述的吗啉基蒽环类衍生物类别中的固有荧光化合物。在此类衍生物中有奈莫柔比星(nemombicin)(3′-脱氨基-3’-[2(S)-甲氧基-4-吗啉基]多柔比星)、a/k/a MMDX及其主要代谢物PNU-159682(3′-脱氨基-3″-4′-脱水-[2″(S)-甲氧基-3”(R)-羟基-4″-吗啉基]多柔比星),其结构式下面示出;以及内容在此以引用的方式并入的美国专利第8,470,984号中所描述的这四种其它此类衍生物:3′-脱氨基-3″-4’-脱水-[2″(S)-甲氧基-3”(R)-羟基-4″-吗啉基]伊达比星;3′-脱氨基-3″-4’-脱水-[2”(S)-甲氧基-3″(R)-羟基-4”-吗啉基]柔红霉素;3′-脱氨基-3″-4’-脱水-[2”(S)-甲氧基-3″(R)-羟基-4″-吗啉基-洋红霉素(caminomycin);及3’-脱氨基-3″-4’-脱水-[2”(S)-乙氧基-3”(R)-羟基-4”-吗啉基]多柔比星。
依照本发明,前述衍生物中的任一者的药学上可接受的酸加成盐也是此群组自发荧光吗啉基蒽环类衍生物的成员。
非固有荧光化合物的子类别(B)涵盖下文所定义的尤其包含(i)活性成分或部分及(ii)能量转移部分的任何化合物。活性成分可为药物或药物的活性部分,通过衍生化反应向其添加能量转移部分。结果可为结合物,其中衍生化反应的产物因而在具有或不具有连接体的情况下将接合的药物或其活性部分并入至能量转移部分;或它可为结构类似物,其中反应产物表现与药物或其活性部分的结构类似性,但不同之处在于药物或活性部分中一个或多个原子、官能基或子结构用结构类似物中的其它原子、基团或子结构置换。
根据其方法学方面,涉及子类别(B)的本发明考虑借助于大规模方法将任何非固有荧光化合物装载至完整的细菌衍生的囊泡(包括微细胞或杀死的细菌细胞)中。根据其组成方面,涉及子类别(B)的本发明涵盖包含完整的细菌衍生的囊泡的组合物,所述囊泡含有选自子类别(B)的非固有荧光化合物,其不包括其中成分微细胞由含有Oregon488结合的紫杉醇或FL结合的长春碱的那些组成的含有微细胞的组合物。此类排除的含有微细胞的组合物由上述MacDiarmid等人(2007)公开,而未提及或暗示目前描述的荧光对化合物跨膜移动至此类囊泡中的影响。
上文所提及的结构类似物的说明性实例为多卡米星的荧光开环类似物——细胞毒性抗生素,如Tietze等人,Chemistry&Diversity 9∶2559-70(2012)所描述。通过涉及某些香豆素羧酸的反应流程,药物的三甲氧基吲哚部分及(二甲氨基)乙氧基吲哚部分由荧光分子(其如同置换部分,与DNA相互作用)置换。同样地,在本说明书内的结构类似物的示例为药物依地福新的荧光类似物(1-O-十八烷基-2-O-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱),其如Mollinedo等人,Cell Death&Dis.2:e158(2011)中所描述,保存药物的促凋亡活性。也参见Gajate等人,Oncogene31:2627-39(2012)。
在其中采用荧光结合物的实施方式中,连接体可具有一定半衰期以使得当将化合物装载至囊泡中时或当一定时期已过去或在其后时间范围内时(参见下文),连接体降解,以释放非固有荧光结合物的活性成分。可选地,连接体基团在靶细胞内可为不稳定的。即,连接体可经历热、pH依赖性、化学(例如水解)或酶裂解,于是在摄取后将活性成分释放至细胞中。例如,在抗体-药物结合物的情形下已发展此类不稳定连接体且其易于调适用于本发明中。参见Ducry and Stump,Bioconjugate Chem.21:5-13(2010),加上下文其它论述。
上文所提及的“能量转移部分”为在通过适当波长电磁辐射激发后将能量转移至附近能量受体的基团。“适当的”波长为激发能量转移部分中的电子以使得其进入能阶的电磁辐射的任何波长,其中在弛豫后,电子自能量转移部分释放或使得电磁辐射自能量转移部分释放。
说明性能量转移部分为具有共轭pi电子系统的基团。共轭pi系统包括例如多个双键的配位、多个芳族基团的配位、双键与芳族基团的配位、杂环芳族基团的配位及其类似物。说明性能量转移部分为吖啶基、呫吨基、蒽基、苯并咪唑基、菲基(phenanthrenylgroup)、吡啶基、喹啉基及卟啉基(porphorinyl group)。
与本发明一致,据认为能量转移达到的能量受体与无生命细菌囊泡的一或多个跨膜结构相关联。根据此观点,当由能量转移部分实现能量转移时,随后跨膜结构(一个或多个)接收所传递的能量,无论通过电子或光的发射。
下文论述适用于装载至根据本发明的完整无生命细菌囊泡中的不同类型的化合物(只要其为自发荧光或非固有荧光的)。这些化合物包括但不限于生物活性化合物的类别及化学治疗化合物,尤其小分子化学治疗化合物的子类别。
多种生物活性化合物并不是荧光的。本发明涉及用于提供给定化合物(其是荧光的)的修饰的(衍生的)形式的途径,其用于将此类化合物装载至完整无生命细菌囊泡中,且通过此类囊泡,随后将其引入靶哺乳动物细胞中。尽管大多数分子尺寸将小于约900道尔顿,但连接荧光分子或改变药物的结构以增强药物至微细胞中的装载可能将其分子量提高至约1500道尔顿。
在一个方面中,本发明考虑将生物活性但非荧光化合物与荧光部分结合以形成具有下式的“修饰的化合物”:
D-L-F,
或其盐,其中:
D为化合物或其活性成分,
L为连接体,和
F为荧光部分。
依照本发明,此类荧光修饰的化合物可在允许修饰的化合物进入囊泡的条件下与完整无生命细菌囊泡一起温育。
连接体L可为在一定时期之后或在某些条件下使得化合物或活性成分D自荧光部分F释放。例如,如上文所指出,连接体在囊泡中可具有一定半衰期以使得连接体在装载修饰的化合物之后某时降解以在囊泡内释放D。可选地,连接体L在囊泡内部可以是稳定的但在哺乳动物细胞的内体或溶酶体中为不稳定的。即,在被靶哺乳动物细胞摄取且曝露于内体或溶酶体区室内的环境后,连接体在环境因素,诸如pH或酶作用的影响下降解,以在内体或溶酶体中释放活性成分。此类连接体的实例提供在以下部分G中。
根据相关方面,修饰的化合物不具有未经修饰的化合物的生物活性且在囊泡内部保持那种“非活性”状态。连接体在内体或溶酶体中的降解使得活性形式或种类,即,活性成分D释放。
更一般而言,荧光部分可在部分或完全抑制生物活性化合物的活性的位置处连接至生物活性化合物。生物活性化合物典型地具有对于生物活性而言重要的一或多个外部反应性基团。这些反应性基团的化学修饰或衍生化可能降低或甚至消除化合物的生物活性。此通过以下实例中所论述的某些修饰的化合物说明,其并未具有与对应未经修饰的化合物相关的生物活性。
在本发明技术的情况下,如下文部分(E)下所定义的小分子化合物的分子重量连续光谱上的甚至较高分子量化合物可有效地装载至完整的细菌衍生的囊泡中。因此,修饰的化合物的分子量可为至少约1000道尔顿,或可选地至少约1100、1200、1300、1400或1500道尔顿。
在上文所描述的方法及组合物中的任一者的情形下,化合物或修饰的化合物可为疏水性的,而在另一方面中为亲水性的。在又一方面中,化合物或修饰的化合物为水可溶的。
沿着类似线索,本发明在一个方面中提供包含呈微细胞和/或杀死的细菌细胞形式的完整的细菌衍生的囊泡及式D-L-F化合物或其盐的组合物,其中D为诸如药物的非荧光小分子化合物的残基,L为连接体,且F为荧光部分。该组合物为有用的,尤其因为以下事实:通过未经修饰的小分子化合物的实例促进化合物装载至囊泡中。
根据一个方面,本说明书的细菌囊泡为完整的细菌衍生的微细胞。考虑到本发明装载方法的高效率,各此类囊泡(即,微细胞)可封装有化合物的至少约100,000个拷贝。更特定而言,各微细胞可封装有化合物的至少约200,000个拷贝,可选地至少约300,000、约400,000、约500,000、约600,000、约700,000、约800,000、约900,000或约100万个拷贝。
在一个方面中,微细胞封入每109个微细胞至少约200ng,或至少300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng或1,000ng的给定荧光化合物或荧光化合物的组合。相比之下,每109个微细胞所装载的可比非荧光化合物的量典型地为较小的数量级,即,数量级为几十纳克。
根据本发明的另一方面,完整无生命囊泡为杀死的细菌细胞。与上文描述一致,给定杀死的细菌细胞的容量比微细胞的容量大约3-4倍。因此,杀死的细菌细胞可封装修饰的化合物的至少约400,000个拷贝。更特定而言,各杀死的细菌细胞可封装有化合物的至少约800,000个拷贝,或可选地至少约1,200,000、约1,600,000、约2,000,000、约2,400,000、约2,800,000、约3,200,000、约3,600,000或约400万个拷贝。
此类杀死的细菌细胞可每109个杀死的细胞封入至少约800ng,或至少1,200ng、1,600ng、2,000ng、2,400ng、2,800ng、3,200ng、3,600ng或4,000ng的化合物。
(D)完整的细菌衍生的囊泡
词组“完整的细菌衍生的囊泡”及“完整的无生命细菌囊泡”同义地指细菌细胞的囊泡衍生物,包括杀死的细菌细胞及细菌微细胞,其无法再生且其不能主动地启动进入哺乳动物细胞中。在此情形下,“完整”意谓细胞包膜,即,质膜及周围细胞壁(其包括围绕单层细胞壁的多个层(对于源自革兰氏阳性细菌细胞的囊泡)或双层外部膜(对于源自革兰氏阴性细菌细胞的囊泡))的规则连续性及结构完整性。参见BERGEY′S MANUAL OF SYSTEMATICBIOLOGY,第2版(Springer,2012)。
因此,词组“完整的杀死的细菌细胞”指示细菌、蓝细菌、真细菌或古细菌的完整无生命原核细胞,其具有完整细胞包膜且含有细菌物种内源的遗传物质(核酸)。同上。对于医药用途,将杀死的细菌细胞的组合物尽可能彻底地与免疫原性组分及其它有毒污染物分离。用于纯化杀死的完整细菌细胞的方法描述于美国专利第8,591,862号中,其相关内容在此以引用的方式并入。简言之,可通过抗生素杀死活细菌细胞,继而移除细胞碎片及游离内毒素。
“微细胞”指细菌细胞的衍生物,其缺乏染色体(“无染色体”)且是由二分裂期间细胞分裂与DNA分离的协调失调所产生。微细胞不同于其它小囊泡,诸如所谓“膜泡”(尺寸约为0.2μm或以下),其在某些情形下自发地产生及释放,但其并不归因于特异基因重排或游离基因表达。同样地,完整微细胞不同于细菌鬼影(ghosts),其并不因特异基因重排或游离基因表达而产生。
本发明中所采用的细菌衍生的微细胞为完全完整的,如上文所讨论,且因此区别于以外膜或界定膜破碎或降解、甚至移除为特征的其它无染色体形式的细菌细胞衍生物。参见美国专利第7,183,105号第111栏第54行及以下。表征本发明微细胞的完整膜允许治疗有效负载在微细胞内保留直至摄取后在肿瘤细胞内释放该有效负载。
根据本发明所采用的微细胞可由诸如大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞制备。原核染色体复制与正常二分裂相联,其涉及细胞中隔(mid-cell septum)形成。在大肠杆菌中,例如min基因(诸如minCD)的突变可移除细胞分裂期间在细胞极对隔膜形成的抑制,导致正常子细胞及少染色体微细胞产生。参见Boer等人,J.Bacteriol.174:63-70(1992);Raskin and de Boer,J.Bacteriol.181:6419-24(1999);Hu and Lutkenhaus,Mol.Microbiol.34:82-90(1999);和Harry,Mol.Microbiol.40:795-803(2001)。
除min操纵子突变以外,少染色体微细胞在影响隔膜形成的一系列其它基因重排或突变后产生,例如在枯草杆菌中的divIVB1中。参见Reeve and Cornett,J.Virol.15:1308-16(1975)。微细胞也可在参与细胞分裂/染色体分离的蛋白质的基因表达水平扰动后形成。例如,minE的过度表达导致极性分裂且微细胞产生。类似地,少染色体微细胞可由染色体分离缺陷产生,例如枯草杆菌中的smc突变(Britton等人,Genes Dev.12∶1254-59(1998))、枯草杆菌中的spoOJ缺失(Ireton等人,J.Bacteriol.176:5320-29(1994))、大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga等人,J.Bacteriol.171:1496-1505(1989))及大肠杆菌中的parC突变(Stewart and D’Ari,J.Bacteriol.174:4513-51(1992))。此外,CafA可增强细胞分裂速率和/或抑制复制后的染色体分配(Okada等人,J.Bacteriol.176:917-22(1994)),导致链状细胞及少染色体微细胞形成。
Min系统存在于大多数细菌物种中,参见Barak,Frontiers in Microbiology 4:Art.378(2013),而在其它细菌,诸如新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)中,已进化出另一机制以控制分裂隔膜的放置,可操控该机制以通过不等分裂产生微细胞。因此,针对本发明,可由革兰氏阳性或革兰氏阴性来源的任何细菌细胞制备微细胞。此外,用于本发明中的微细胞应具有完整细胞壁(即,为“完整微细胞”),如上文所指出,且应区别于其它小囊泡(诸如膜泡)且与其分离,其并不由特异基因重排或游离基因表达引起。
在给定实施方式中,微细胞的亲本(源)细菌可为革兰氏阳性或其可为革兰氏阴性的,如所提及的。因此,亲本细菌可选自例如以下分类群中的任何一或多者:地杆菌属(Terrabacteria)(BV1),其包括革兰氏阳性门(放线菌门(Actinobacteria)及硬壁菌门(Firmicutes))等;变形菌门(Proteobacteria)(BV2),其为所有成员均为革兰氏阴性的一门;及类别BV4,其包括螺旋体门(Spirochaetes)、鞘脂杆菌门(Sphingobacteria)及浮游细菌门(Planctobacteda)以及其它革兰氏阴性细菌,诸如酸杆菌门(Acidobacteria)。
因此,依照一个方面,制备杀死的细菌细胞或微细胞的细菌选自以下分类群中的一或多者:硬壁菌门(BV3),诸如杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)及无壁菌门(Tenericutes)/柔膜菌纲(Mollicutes);及放线菌门(BV5),诸如放线菌目(Actinomycetales)及双歧杆菌目(Bifidobacteriales)。在另一方面中,亲本细菌选自以下中的任何一或多者:原细菌(Eobacteria)(绿弯菌门(Chloroflexi)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus))、蓝细菌(Cyanobacteria)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、嗜热菌(thermophiles)(产水菌门(Aquificae)、热袍菌门(Thermotogae))、α、β、γ(肠杆菌科(Enterobacteriaceae))、δ或ε变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、绿菌门(Chlorobi)/拟杆菌门(Bacteroidetes)、衣原体门(Chlamydiae)/疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、产金菌门(Chrysiogenetes)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、互养菌门(Synergistetes)、网团菌门(Dictyoglomi)、黏胶球形菌门芽孢杆菌目(Lentisphaerae Bacillales)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、李斯特菌科(Listeriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、乳杆菌目(Lactobacillales)、肠球菌科(Enterococcaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、梭菌目(Clostridiales)、盐厌氧菌目(Halanaerobiales)、嗜热厌氧菌目(Thermoanaerobacterales)、支原体目(Mycoplasmatales)、虫原体目(Entomoplasmatales)、厌氧奖菌目(Anaeroplasmatales)、无胆甾原体目(Acholeplasmatales)、Haloplasmatales、放线菌亚目(Actinomycineae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、棒杆菌亚目(Corynebacterineae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、弗兰克氏菌亚目(Frankineae)、弗兰克氏菌科(Frankiaceae)、微球菌亚目(Micrococcineae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)及双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)。
对于医药用途,本发明的组合物应包含尽可能彻底地与免疫原性组分及其它有毒污染物分离的杀死的细菌细胞或微细胞。用于纯化细菌衍生的微细胞以移除游离内毒素及亲本细菌细胞的方法描述于WO2004/113507中,其在此以全文引用的方式并入。简言之,纯化方法实现移除以下各者:(a)小囊泡,诸如膜泡,其尺寸通常为小于0.2μm;(b)自细胞膜释放的游离内毒素;及(c)亲本细菌,无论活的或死的,及其碎片,其同样为游离内毒素的来源。此类移除可尤其利用以下执行:0.2μm过滤器,以移除小囊泡及细胞碎片,0.45μm过滤器,以在诱导亲本细胞形成长丝后移除亲本细胞、杀死活细菌细胞的抗生素及抗游离内毒素的抗体。
在纯化程序下,本发明人发现,尽管其细菌来源差异,所有完整微细胞的尺寸均为大致400nm,即,大于膜泡及其它小囊泡且仍小于亲本细菌。可通过使用固态(诸如电子显微镜检查)或通过基于液体的技术(例如动态光散射)来实现微细胞的尺寸测定。通过各类此技术产生的尺寸值可具有误差范围,且不同技术之间所述值可能略微不同。因此,在干燥状态中的微细胞的尺寸可经由电子显微镜检查测量为大致400nm±50nm。另一方面,动态光散射可测量相同微细胞的尺寸为大致500nm±50nm。此外,同样可使用动态光散射测量封装药物、靶向配体的微细胞为大致600nm±50nm。
实际上易于调节此尺寸值的分散,例如出于将微细胞与如上文所描述的免疫原性组分及其它有毒污染物分离的目的。即,细菌衍生的完整微细胞的特征在于通过刚性膜包围的细胞质,该刚性膜为微细胞提供刚性球形结构。此结构在透射电子显微图中显而易见,其中跨越微细胞,在刚性膜的外部界限之间测量微细胞直径。此测量提供上文所提及的400nm±50nm的尺寸值。
源自革兰氏阴性细菌的微细胞的另一结构元素为脂多醣(LPS)的O-多醣组分,其通过脂质A锚定物嵌入在外部膜中。该组分为重复碳水化合物-残基单元的链,其中每链多达70至100个四至五个糖的重复单元。因为这些链在液体环境中并不如体内一般为刚性的,所以其可采用提供珊瑚海洋环境中的海藻的一般外观的波状可挠性结构;即,所述链随液体移动,同时其余部分锚定于微细胞膜上。
受O-多醣组分影响,动态光散射可为微细胞尺寸提供约500nm至约600nm的值,如上文所指出。然而,来自革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌的微细胞以同样的方式容易地通过0.45μm过滤器,其证实了400nm±50nm的有效微细胞尺寸。本发明涵盖上文所提及的尺寸分散且尤其通过词组“尺寸为大致400nm”及其类似者中的限定词“大致”表示。
关于有毒污染物,本发明的组合物可含有小于约350EU的游离内毒素。在此方面的说明性实例为分别约250EU、约200EU、约150EU、约100EU、约90EU、约80EU、约70EU、约60EU、约50EU、约40EU、约30EU、约20EU、约15EU、约10EU、约9EU、约8EU、约7EU、约6EU、约5EU、约4EU、约3EU、约2EU、约1EU、约0.9EU、约0.8EU、约0.7EU、约0.6EU、约0.5EU、约0.4EU、约0.3EU、约0.2EU、约0.1EU、约0.05EU及约0.01EU的游离内毒素水平。
本公开的组合物也可含有至少约108个囊泡,例如至少约5×108个。可选地,组合物可含有数量级为109或1010个囊泡,例如5×109、1×1010或5×1010个囊泡。此外,在任何此数量微细胞中,本公开的组合物可含有少于约10个污染活的/亲本细菌细胞,例如少于约9、8、7、6、5、4、3、2或1个活的/亲本细菌细胞。
(E)小分子化合物
如所述,本发明提供用于将荧光的小分子化合物装载至完整无生命细菌囊泡中的方法。小分子化合物可为固有荧光(自发荧光)的或其可为非固有荧光的,即,借助于将荧光部分添加至非荧光化合物中的荧光,之后将修饰的化合物装载至完整无生命细菌囊泡中。
根据本发明,小分子化合物可为“小分子药物”,其意谓其在施用本发明组合物时为生物活性的,或其在施用后在体内转化成生物活性形式(“活化的”)。与上述定义一致,“生物活性”指小分子药物与细胞中的蛋白质、核酸或其它分子反应而导致细胞中的功能改变的能力。在一个方面中,改变为治疗学上合乎需要的。生物活性可为细胞毒性的,例如其中小分子化合物为化学治疗剂,即,其为小分子“化疗药物”。因此,可互换地采用“化疗药物”、“化疗剂”及“化学疗法”以意谓具有杀死或破坏赘生性细胞的能力的小分子药物。
“小分子药物”子类别涵盖特征在于(i)对生物过程具有作用及(ii)相比于蛋白质或聚合大分子具有相对低分子量的化合物。小分子药物典型地为约900道尔顿或更小,下限值为约150道尔顿,如约194道尔顿的(替莫唑胺(temozolomide))所说明,其用于治疗多形性胶质母细胞瘤及其它类型的脑癌。然而,尽管大多数分子的尺寸将小于约900道尔顿,但连接荧光分子或改变药物的结构以增强药物至微细胞中的装载可能将其分子量提高至高达约1500道尔顿。在此情形下,“约”指示合格的分子重量值易有测量精度方面的变化及数量级为若干道尔顿或几十道尔顿的实验误差。因此,小分子药物(未经修饰、修饰的或连接至荧光分子)的分子量可为约1500道尔顿或更小,约1400道尔顿或更小,约1300道尔顿或更小,约1200道尔顿或更小,约1100道尔顿或更小,约1000道尔顿或更小,约900道尔顿或下,约800道尔顿或更小,约700道尔顿或更小,约600道尔顿或更小,约500道尔顿或更小,或约400道尔顿或更小,例如在约150至约400道尔顿范围内。更确切而言,小分子药物(未经修饰、修饰的或连接至荧光分子)的分子量可为约400道尔顿或更大,约450道尔顿或更大,约500道尔顿或更大,约550道尔顿或更大,约600道尔顿或更大,约650道尔顿或更大,约700道尔顿或更大,约750道尔顿或更大,约800道尔顿或更大,约850道尔顿或更大,约900道尔顿或更大,约950道尔顿或更大,约1000道尔顿或更大,约1050道尔顿或更大,约1100道尔顿或更大,约1150道尔顿或更大,约1200道尔顿或更大,约1250道尔顿或更大,约1300道尔顿或更大,约1350道尔顿或更大,约1400道尔顿或更大,约1450道尔顿或更大,或约1500道尔顿或更大。在另一实施方式中,封装至微细胞中的小分子药物(未经修饰、修饰的或连接至荧光分子)的分子量在约400道尔顿与约1300道尔顿之间,在约400道尔顿与约1100道尔顿之间,在约400道尔顿与约1000道尔顿之间,在约450道尔顿与约900道尔顿之间,在约450道尔顿与约850道尔顿之间,在约450道尔顿与约800道尔顿之间,在约500道尔顿与约800道尔顿之间,或在约550道尔顿与约750道尔顿之间。
受制于分别根据本发明的方法学及组成方面在上面所列的限制性条件,适合的小分子化疗药物尤其包括但不限于氮芥、亚硝基脲、乙撑亚胺、烷烃磺酸盐、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环、紫杉烷、长春花生物碱及拓扑异构酶抑制剂。因此,用于本发明中的小分子化疗药物可尤其选自以下中的任一者:烯二炔,诸如达内霉素A、尤尼卡拉霉素(unicalamycin)、卡奇霉素γ1及卡奇霉素θ1;米阿亚霉素(meayamicin),其为FR901464的合成类似物;苯并环庚烯衍生物,如例如Tanpure等人,Bioorg.Med.Chem.21:8019-32(2013)所描述;奥瑞他汀(audstatins),诸如奥瑞他汀E、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)及奥瑞他汀F(其为多拉司他汀的合成类似物);多卡米星类,诸如多卡米星SA及CC-1065;美登素(maytansine)及其衍生物(类美登素(maytansinoids)),诸如DM1及DM4;伊立替康及其它拓扑异构酶抑制剂,诸如托泊替康、依托泊苷、米托蒽醌及替尼泊苷;及谷田霉素(yatakemycin),Okano等人,J.Am.Chem.Soc.128:7136-37(2006)详述其合成。
更特定而言,此段落中详述的特异性小分子化疗药物的任一或多者或所有为适用于根据上述部分(C)中所陈述的限制性条件的那些的说明性实例:放射菌素-D、爱克兰、ara-C、阿那曲唑、BiCNU、比卡鲁胺、博莱霉素、白消安、卡培他滨卡铂、碳铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、右雷佐生、多西紫杉醇、DTIC、乙撑亚胺、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉宾、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、六甲铵、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、链脲菌素、STI-571、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊甙、四嗪、硫鸟嘌呤、噻替派、雷替曲塞(tomudex)、托泊替康、曲奥舒凡(treosulphan)、三甲曲沙、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨及VP-16。依照本发明,这些小分子化学治疗药物中的任一种或多种或所有可衍生有荧光团,或视具体情况可针对固有荧光采用。
如上述部分(C)中所详述,本发明内的组合物分别相对于固有荧光药物(子类别(A))及非固有荧光活性剂(子类别(B))进行排除。对于子类别(A),排除由多柔比星、伊立替康、比山群、表柔比星、托泊替康、表柔比星、柔红霉素及米托蒽醌组成。对于子类别(B),排除由Oregon488结合的紫杉醇及FL结合的长春碱组成。
在一些实施方式中,式D-L-F中的D具有以下式D-I或D-II
或为其立体异构体或化合物或立体异构体的药学上可接受的盐,
其中:
R1为H、-OH、C1-4烷氧基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、取代的C1-4烷氧基、-O-C(O)-(取代的C1-4烷基)、-O-CH2-O-P(O)(OH)2、-O-CH2-O-(C1-4烷基)、-O-CH2-S-(C1-4烷基),或与R3一起形成-CH2-,或与R4一起为双键、ORe、或Re;
R2为H、-OH、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基、取代的C1-4烷氧基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-O-C(O)-(取代的C1-4烷基)、-O-CH2-O-(C1-4烷基)、-S-CH2-O-(C1-4烷基)、-O-C(O)-Re或-Re;
R3为H、C1-4烷基,或与R1一起形成-CH2-;
R4为H或卤基,或与R1一起为双键;
R5为H、C1-4酰基、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基甲基、(C1-4烷基)硫基甲基、-C(O)-(C1-4烷基)、-C(O)-(取代的C1-4烷基)、-C(O)-O(C1-4烷基)、-C(O)-O(取代的C1-4烷基)、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-NH(取代的C1-4烷基)或Re;
R6为苯基或取代的苯基;
R7为H、-OH、-CO-(C1-4烷基)、-CO-(取代的C1-4烷基)、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、(C1-4烷氧基)甲基或(C1-4烷基)硫基甲基,或与R8及与R7和R8结合的碳原子一起为五元或六元非芳族杂环;
R8为H、-CH3,或与R7及R7和R8结合的碳原子一起为五元或六元非芳族杂环;
R9为H、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、-CO-(C1-4烷基)、-CO-(取代的C1-4烷基)或Re;
R10为C1-4烷基、取代的C1-4烷基、芳基或取代的芳基;
R11为C1-4烷基、取代的C1-4烷基、苯基、取代的苯基、-SR12、-NHR12或-OR12;及
R12为C1-4烷基、取代的C1-4烷基、苯基或取代的苯基;
条件为R1、R2、R5及R9中的至少一个为Re,且Re为L的连接点。
在一些实施方式中:
R1为H、OH、-CH2SCH3、-CH2-O-P(O)(OH)2、ORe或Re;
R2为H、-OH、-OCO-CH3、-CO-CH3或-(CH2)2-N-吗啉代;
R3为甲基,或R3与R4一起为亚烷基,诸如-CH2-;
R4为H或-F;
R5为-CO-CH3;
R6为苯基;
R7为H或OH,
R8为H;
或R7与R8一起为-O-CO-O-;
R9为H、-C(O)-CHBr-(CH2)13-CH3、-C(O)-(CH2)2-NH2;-C(O)-(CH2)14-CH3;-C(O)-CH2-CH(OH)-COOH、-C(O)-CH2-O-C(O)-CH2CH(NH2)-CONH2、-C(O)-CH2-O-CH2CH2OCH3、-C(O)-O-C(O)-CH2CH3或-Re;
R10为苯基、(CH3)2CHCH2-、-2-呋喃基、环丙基或对甲苯酰基;及
R11为苯基、叔丁氧基、-S-CH2-CH-(CH3)2、-S-CH(CH3)3、-S-(CH2)3CH3、-O-CH(CH3)3、-NH-CH(CH3)3、-CH=C(CH3)2或对氯苯基;
条件为R1及R9中的至少一个为Re。
在一些实施例中,式D-L-F中的D具有式
或为其立体异构体,或化合物或立体异构体的药学上可接受的盐,
其中表示与L的连接点。
在一些实施方式中,式D-L-F中的D为选自以下的化合物的残基:
或其立体异构体,或化合物或立体异构体的药学上可接受的盐。
在一些实施方式中,式D-L-F中的D为紫杉醇的残基。
在一些实施方式中,式D-L-F中的D为多西紫杉醇的残基。
在一些实施方式中,式D-L-F中的D为长春碱或其类似物的残基。
(F)荧光部分
荧光部分为本领域中所熟知。在一些方面中,荧光部分的最大激发波长为760nm和/或最大发射波长为770nm。在一些方面中,荧光部分的最大激发波长为600nm和/或最大发射波长为600nm。在一些方面中,荧光部分的最大激发波长为500nm和/或最大发射波长为550nm。在一些实施方式中,荧光部分的激发波长选自380-450nm、450-495nm、495-570nm、570-590nm、590-620nm、620-650nm、650-700nm或700-760nm。在一些实施方式中,荧光部分的发射波长选自380-450nm、450-495nm、495-570nm、570-590nm、590-620nm、620-650nm、650-700nm或700-770nm。
在一些方面中,荧光部分的分子量为约100道尔顿至约1000道尔顿或此两个值中间的任何量,或约100道尔顿至约650道尔顿或此两个值中间的任何量。在其它实施方式中,荧光部分的分子量为约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900道尔顿或这些值中间的任何量。在又其它实施方式中,荧光部分的分子量为约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650道尔顿或这些值中间的任何量。
在一个方面中,荧光部分(F)为选自以下的化合物的残基:氧杂蒽衍生物,诸如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红及德克萨斯红;花青衍生物,诸如花青、吲哚羰花青、氧羰花青、硫羰花青(thiacarbocyanine)及部花青;萘衍生物,诸如丹酰基及氟硅酸钠衍生物;香豆素衍生物;二唑衍生物,诸如吡啶唑、硝基苯并二唑(nitrobenzoxadiazole)及苯并二唑;蒽衍生物,诸如蒽醌,例如DRAQ5、DRAQ7及CyTRAK Orange;芘衍生物,诸如级联蓝(cascade blue);嗪衍生物,诸如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫及嗪170;吖啶衍生物,诸如原黄素、吖啶橙及吖啶黄;芳基次甲基衍生物,诸如金胺、结晶紫及孔雀绿;及四吡咯衍生物,诸如卟吩、酞菁及胆红素。
在一个方面中,荧光部分(F)为
其中
X为O或NR20;
R20为H或C1-4烷基;
R21为H、C1-4烷基、卤基、-OH、-COOH、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、C1-4烷氧基、卤基、-NO2、-SO2Cl、-SO3 -或Rf;
R22为H、卤基、-OH、-COOH、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基、取代的C1-4烷氧基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-O-C(O)-(取代的C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(取代的C1-4烷基)、-O-CH2-O-(C1-4烷基)、-S-CH2-O-(C1-4烷基)、-NO2、-SO2Cl、-SO3 -或Rf;
各R23、R24、R25、R26、R27、R28及R29独立地为H、卤基、-OH、-NO2、-CH3或Rf,
或R23及R24接合在一起形成5元、6元或7元环,和/或R24及R25接合在一起形成5元、6元或7元环,和/或R27及X接合在一起形成5元、6元或7元环,和/或R28及X接合在一起形成5元、6元或7元环;
条件为R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28及R29中的至少一个且不超过两个为Rf;其中Rf为L的连接点。
在一个方面中,荧光部分(F)为
其中R21为L的连接点。
在一个方面中,荧光部分(F)为选自以下的化合物的残基:
其中各R30独立地为氢、C1-4烷基或取代的C1-4烷基,A1及A2独立地为任选取代的含有氮杂芳基,n为选自1至10的整数。在一些实施方式中,杂芳基为吡咯、咪唑、噻唑、吡啶、喹啉、吲哚、苯并唑或苯并噻唑。
在一个方面中,荧光部分(F)为
其中R40中的一者为R30,且另一者为Rf、L40-Rf、L40-ORf、L40-NHRf,L40为(CH2)m,其中一个或两个CH2基团任选地被O、S、SO、SO2、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、NHC(O)、
NH或任选取代的苯基置换,且Rf为L的连接点。
在一个方面中,荧光部分(F)为
其中
R31及R32独立地为H、-OH、C1-4烷基、C1-4卤烷基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、C1-4烷氧基、卤基或Rf;
R34及R35独立地为H、卤基、-OH、-COOH、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、-O-CH2-O-(C1-4烷基)、-S-CH2-O-(C1-4烷基)或Rf;
各R33及R36独立地为H、卤基、-OH、-CH3或Rf;
各R37、R38及R39独立地为卤基、-OH、-CH3或Rf;
各m、n及p独立地为0、1、2、3或4;
条件为R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37、R38及R39中的至少一个且不超过两个为Rf;其中Rf为L的连接点。
在一个方面中,荧光部分(F)为
其中R32为L的连接点。
(G)连接体
本公开的连接体(L)将荧光部分或荧光团连接至小分子化合物。在特定的方面,连接体为一键,即,荧光部分直接连接至小分子化合物。
在一些实施方式中,连接荧光部分不会明显降低药物(D)的活性,从而修饰的化合物为生物活性和/或医药有效的。在一些实施方式中,连接荧光部分降低或消除药物(D)的活性,从而修饰的化合物具有降低的生物和/或医药活性或者为生物非活性和/或医药无效的。
适用于此目的的其它连接体包括出于结合两个分子的目的熟知的连接体。
在一些方面中,连接体(L)为稳定的且不在施用后降解,且荧光部分及药物的结合物为生物和/或医药活性的。示例性稳定连接体包括但不限于乙酰基丙氨酸(参见实施例2)及β-丙氨酸(参见实施例3)。在其它方面中,连接体在生理条件(例如在非冻干状态中)下的半衰期比微细胞装载时间长,以使得在将修饰的化合物装载至微细胞中之后荧光部分/荧光团及小分子化合物在连接体分解后变得分离。一般而言,装载微细胞需要约4小时。因此,连接体的半衰期可为至少4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时。优选,连接体的半衰期在6-24小时或8-24小时内。例如,当用作连接体时,2’-(3-氨基丙酰基)部分的半衰期为约8小时。
在其它方面中,连接体在细菌囊泡内为稳定的,但可为pH敏感性的,且因此,在低于中性的pH下较不稳定。因为内体/溶酶体中的pH明显低于正常细胞环境中的pH,所以此类pH敏感性连接体仅在靶哺乳动物细胞的内体/溶酶体中可降解。在此类酸性条件下,连接体可水解。例如,酯可水解成醇残基及羧酸,或酰胺可水解成胺及羧酸。
已知pH敏感性连接体例如由Nie等人在POLYMERIC BIOMATERIALS:MEDICINAL ANDPHARMACEUTICAL APPLICATIONS,第16章,第413-32页(Dumitriu编,2013)中说明,其描述用于药物递送的酸不稳定连接体。国际专利申请WO2006/108052也描述酸不稳定连接体,其在溶酶体中可见的条件下可降解。Duncan,Nature Reviews Cancer 6:688-701(2006)描述在曝露于溶酶体酶后可降解的连接体,例如组织蛋白酶B)裂解Gly-Phe-Leu-Gly及聚谷氨酸(PGA)或以降低pH,例如腙连接体在内体及溶酶体(pH 6.5至pH<4.0)中降解。美国专利第5,306,809号描述适用于免疫治疗剂的酸不稳定连接体。
例如,美国专利第6,521,431号描述乙醇酸或乳酸;羟基酯,诸如3-羟基丁酸、2-羟基丙酸及5-羟基羊油酸;氨基酸;原酯;酸酐;膦嗪;磷酸酯作为连接体的用途。
公开申请US2013/0071482描述具有一或多个诸如以下的部分的连接体
其中X5为O或NH,且针对R的结构详述在‘482公开申请中。
公开申请US2013/0261094描述诸如以下的连接体:-OQ-(CnH2n)-S(R’)(R”)-(CmH2m)-CH2-A或-R9N-Q-(CnH2n)-S(R’)(R”)-(CmH2m)-CH2-A,其中n及m为0至20,且优选地1至10的整数;R’及R”独立地为电子孤对、氧部分(诸如=O)或氮部分诸如(=N-Rx),其中Rx为原子的同源组或异源组;A为结合部分;且Q为直接键、C=O、C=NH或C=NRP基团,其中RP为C1-C3烷基,且R9可为氢原子或C1-C3烷基。
公开申请US2012/0121615描述连接体,诸如
公开申请US2005/0112065描述pH敏感性连接体,诸如柠康酰基或酰肼连接体;或酶敏感性连接体。申请详述的此类连接体的实例包括:
其中x、y、z独立地为0、1、2、3、4或5,条件为x、y及z中的至少一个不为0。在一些实施方式中,x、y及z独立地为1、2、3、4或5。
Nicoletti等人,Int’l J.Antimicrob.Agents 33:441-48(2009)描述作为连接体的多肽GlyPheLeuGly。
上文所提及的出版物的各个内容在此以全文引用的方式并入。一些出版物在描述连接体时使用给定化合物的名称。在任何情况下,当充当连接体时,任何给定化合物呈现二价自由基,以使得其可连接药物及荧光部分以提供根据本发明的修饰的(荧光)化合物。
在一个方面中,连接体(L)选自:键、-C(O)-O-、-C(O)NH-、-OC(O)-(CHR50)qNR51C(O)-、和-OC(O)-(CHR50)qC(O)NR51-(CHR52)u-NH-C(S)-NH-,其中R50、R51及R52独立地为H或C1-4烷基,且q及u独立地为1、2、3、4、5、6或7。
在另一方面中,L选自:-O-C(O)-CH(CH3)-NHC(O)-、-O-C(O)-(CH2)2-NH-CO-、和-O-C(O)-(CH2)3C(O)NH-(CH2)6-NH-C(S)-NH-。
在一些方面中,连接体为-(CHR52)p-,其中-(CHR52)-中的至少一个被来自以下基团的一者置换:-O-、-((CHR52)-O)q-、-S-、-S-S-、-C(O)NH-、-C(O)O-和-CR52=NNH,其中R52为H或C1-4烷基;且其中p为选自2-10的整数,且q为选自1-7的整数。在一些实施方式中,p为2至10(包括端点)的整数,且q为1至7(包括端点)的整数。
(H)治疗方法及组合物
依照本发明的另一方面,通过配体将如上文所描述的组合物的装载化合物的完整且无生命的细菌囊泡导入靶哺乳动物肿瘤细胞中。在一些实施方式中,配体为“双特异性的”。即,配体对微细胞及哺乳动物(肿瘤)细胞组分两者呈现特异性,其从而使得给定囊泡结合至靶细胞,其中后者吞噬前者。双特异性配体使微细胞靶向肿瘤细胞的用途进一步描述于WO 05/056749及WO 05/079854中,且双特异性配体使杀死的细菌细胞靶向肿瘤细胞的用途进一步描述于美国专利第8,591,862号中,其各自内容在此以全文引用的方式并入。在此类配体连接至囊泡后,配体的未占用特异性(“单一特异性”)适用直至其与靶(肿瘤)哺乳动物细胞相互作用。
配体可借助于配体与细胞膜上的组分(诸如多醣、糖蛋白或多肽)之间的相互作用连接至囊泡的细胞膜。表达的配体锚定于囊泡的表面上以使得配体的表面组分结合部分曝露,从而使得该部分可在囊泡与哺乳动物细胞接触时结合靶哺乳动物细胞表面组分。
可选地,可通过细菌衍生的囊泡的活的对应物,例如通过微细胞的亲本细胞或通过在其变成杀死的细胞之前的细菌细胞表达并呈现配体。在此情况下,配体不需要对囊泡的特异性且仅呈现对哺乳动物细胞所特有的组分的特异性。即,此类组分无需对肿瘤细胞本身或甚至对在治疗下的特定种类肿瘤细胞而言为独特的,只要肿瘤细胞在其表面上呈现该组分即可。
在静脉内施用后,囊泡在肿瘤微环境中快速积聚。作为上文所描述的渗漏的肿瘤脉管的函数而出现的此积聚实现将封装囊泡的治疗有效负载递送至肿瘤细胞,其随后内化封装囊泡。
本发明人已发现,此递送途径适用于哺乳动物肿瘤细胞的范围,包括通常抗拒微细胞的特异性粘附及胞吞作用的细胞。例如,包含引导在抗-HER2受体或抗-EGF受体处的抗体或抗体衍生物(参见下文)的配体可在靶向的非吞噬细胞(诸如肺、卵巢、大脑、乳房、前列腺及皮肤癌细胞)的范围上使微细胞结合至各自受体。
因此,在各类型非吞噬细胞摄取囊泡之前实现结合。即,在本发明的情形下,适合的靶细胞呈现细胞表面组分,通过囊泡上的配体,其结合引发该囊泡的胞吞作用。
更确切而言,本发明人发现,(a)微细胞或杀死的细菌细胞上的配体与(b)哺乳动物细胞表面受体之间的相互作用可活化至靶宿主细胞诸如肿瘤细胞的晚期内体/溶酶体区室中的摄取路径,此处称为“受体介导的胞吞作用”(rME)路径。通过此rME路径,本发明人发现,细菌衍生的囊泡通过早期内体、晚期内体及溶酶体加工,导致将其有效负载释放至哺乳动物宿主细胞的细胞质中。此外,作为核酸的有效负载不仅在晚期内体/溶酶体区室中逃避完全降解,且亦通过宿主细胞表达。
用于此递送途径的配体可为“双特异性的”,如上文所描述,因为其分别结合至携带有效负载的囊泡及靶细胞上的表面组分,且其与后一组分的相互作用导致囊泡被摄取至rME路径中。在任何情况下,依照本发明,若与组分的相互作用实际上接入需要自靶细胞表面的胞溶质内化的细胞内吞路径,则给定靶细胞表面组分可为配体结合的候选物。此类候选物易于通过这样的分析评估在本发明中的适用性,其中将在其表面上呈现候选物组分的细胞类型在体外与携带配体的微细胞共同温育,该配体结合候选物且也接合至经得起检测(例如通过共焦显微镜检查可视)的荧光染料或其它标记。(此种体外分析由MacDiarmid(2007)在第436页图3的图例中描述。)因此,标记的所观测到的内化构成此类分析的阳性指示:所测试的靶细胞表面组分适用于本发明。
候选物靶细胞表面组分的说明性实例为(A)受体酪氨酸激酶或“RKT”(其为以类似于其它整合膜蛋白的速率进行组成型内化(胞吞作用)的跨膜蛋白质家族)的成员。参见Gohand Sorkin,Cold Spring Harb.Perspect.Biol.5:a017459(2013)。RKT的家族由例如Lemmon and Schlessinger,Cell 141:1117-134(2010)描述。下表列出人类蛋白质组中的在二十个亚家族中所有五十八种RTK,可测试其中的任何一种或多种在本发明中的适用性,如上文所描述(也参见图24)。
同样地,说明性实例为以下的成员:(B)膜结合、高亲和力叶酸结合蛋白(叶酸受体)的类别,其结合叶酸且减少叶酸衍生物,且其介导四氢叶酸递送至细胞内,(C)膜结合细胞因子受体的亚群,其在同源细胞因子,诸如IL13的内化方面起作用;(D)表面抗原,诸如CD20、CD33、间皮素及HM1.24,其在某些癌细胞上表达且介导同源单克隆抗体(例如CD20的实例中的利妥昔单抗)的内化;及(E)粘附受体(整合素)、跨膜糖蛋白的家族,其通过内体路径运输且为癌细胞粘附至细胞外基质的主要介体。
根据本发明,配体可为视具体情况展现期望的一种或多种特异性的任何多肽或多醣。优选配体为抗体。在其当前用途中,术语“抗体”涵盖通过免疫原性反应的体外或体内产生获得的免疫球蛋白分子。因此,“抗体”类别包括单克隆抗体及人化抗体以及抗体衍生物,诸如单链抗体片段(scFv)、双特异性抗体等。已知大量不同双特异性蛋白质及基于抗体的配体,如Caravella and Lugovskoy,Curr.Opin.Chem.Biol.14:520-28(2010)的综述文章所证明的,其在此以全文引用的方式并入。根据本发明适用的抗体可同样通过已知重组DNA技术获得。
因此,通过非限制性实例,依照本发明,携带对表面组分(诸如肿瘤抗原)的特异性的抗体可用于使微细胞靶向待治疗的肿瘤中的细胞。在此方面,说明性细胞表面受体包括RTK表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)及胰岛素样生长因子受体(IGFR)中的任一者,其每一个在若干实体肿瘤(包括脑瘤)中高度表达;以及叶酸受体,其在一些垂体腺瘤中过度表达。此类双特异性配体可同样靶向突变体或变体受体,例如IL-13Rα2受体,其在50%至80%的人类多形性胶质母细胞瘤中表达(参见Wykosky等人,Clin Cancer Res.14:199-208(2008);Jarboe等人,CancerRes.67:7983-86(2007);Debinski等人,J.Neurooncol.48:103-11(2000);及Okada等人,J.Bacteriol.176:917-22(1994)),但与其生理对应物IL4R/IL13R不同,其在正常组织中表达。参见Hershey,J.Allergy Clin.Immunol.Ill:677-90(2003)。因此,正常大脑细胞中几乎不存在IL13Rα2。参见Debinski and Gibo,Mol.Med.6:440-49(2000)。另外,转移至大脑中的肿瘤可能过度表达某些受体,其也可为适合的靶标。例如,Da Silva等人,BreastCancer Res.12:R46(1-13)(2010),显示乳腺癌的脑转移表达RTK的HER家族的所有成员。HER2在20%脑转移中扩增且过度表达,EGFR在21%脑转移中过度表达,HER3在60%脑转移中过度表达,且HER4在22%脑转移中过度表达。有趣地,在滞留于大脑中的乳腺癌细胞中HER3表达增加。
(I)制剂及施用途径及时程
本发明的组合物的制剂可以单位剂型呈现,例如在安瓿或小瓶中或在多剂量容器中,具有或不具有所添加的防腐剂。制剂可为油性或水性媒剂中的溶液、悬浮液或乳液,且可含有配制剂(formulatory agents),诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适合的溶液与接受者的血液等渗,且通过盐水、林格氏溶液及右旋糖溶液说明。可选地,制剂可呈冻干粉末形式,以便用适合的媒剂,例如无菌、无热原水或生理盐水复原。制剂也可呈储存制剂形式。此类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。
在一些方面中,提供包括治疗有效量的小分子化合物的含有囊泡的组合物。抗赘生剂的“治疗学上有效”的量为根据本公开所讨论的药剂的剂量。若小分子化合物在囊泡中呈非活性形式,则“治疗学上有效”的量指在靶细胞的内体/溶酶体中释放有效量的活化的化合物的非活性化合物的量。
因此,在本公开的情形下,当施用携带治疗有效负载的微细胞时,可参考在动物模型中或在人类个体中肿瘤或肿瘤症状的预防或改善来衡量治疗有效量,如下文进一步描述。在给定实例中对于特定个体证明为“治疗有效量”的量可能不对针对100%所讨论的肿瘤进行类似治疗的个体有效,但博学的临床医师认为此类剂量为“治疗有效量”。在此方面,适当的剂量也将作为例如肿瘤的类型、阶段及严重程度的函数而变化。在任何情况下,根据本公开,当根据整个说明书考虑时,体外测试(实施例3及4)及体内测试(实施例5、7及8)以及用于定量体内药物分布(实施例9)的方法的本发明说明使得熟知候选药物的临床前及临床测试的人能够通过常规实验测定针对特定指征的活性剂的治疗有效量。同样地,当“治疗学上有效的”用于指药物组合物中的微细胞的数量时,该数量可基于封装至微细胞中的抗赘生剂及该药剂在治疗肿瘤方面的功效来确定。在此方面,可用临床或病理学参数,诸如肿瘤质量来测量治疗效果。因此,肿瘤质量减少或增加减少可用于测量治疗效果。
本公开内的制剂可通过各种途径局部或全身施用且施用至哺乳动物体中的各种部位,以实现所需治疗效果。在一特定方面中,施用途径为静脉内注射。
一般而言,可以以通过常规测试所界定的适当的剂量使用本公开的制剂,以获得最佳生理效果,同时使任何潜在毒性减至最小。可根据多种因素选择给药方案,所述因素包括患者的年龄、重量、性别、医学状况;肿瘤的严重性或阶段;施用途径;及患者的肾及肝功能。
获得产生最大功效而副作用最小的范围内囊泡和治疗剂的浓度的最佳精度可能且典型地将需要基于药剂到达靶部位及靶细胞的动力学的方案。可在测定治疗方案的最佳浓度时考虑囊泡或药剂的分布、平衡及消除。可分别调节囊泡及治疗剂的剂量以实现所需效果。
此外,可使用药物动力学/药效动力学建模系统使制剂的剂量施用最佳化。因此,可选择一个或多个剂量方案且可使用药物动力学/药效动力学模型来测定一个或多个剂量方案的药物动力学/药效动力学概况。基于特定的此类概况,可随后选择达成所需药物动力学/药效动力学反应的施用剂量方案中的一者。例如,参见WO 00/67776。
可向肿瘤患者施用本公开的制剂一周至少一次历经若干周。因此,可施用制剂一周至少一次历经若干周至若干月的时期。
更确切而言,本发明制剂可一日至少一次施用约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天或约31天。可选地,制剂可每天施用约一次或每约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天或约31天或更多天施用约一次。
在本公开的另一实施方式中,制剂可每周施用约一次或每约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周或约20周或更多周施用约一次。可选地,制剂可一周至少一次施用约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周或约20周或更多周。
可选地,制剂可每月施用约一次或每约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月或更多个月施用约一次。
制剂可以单一日剂量形式施用。可选地,总的日剂量可以以每日两次、三次或四次的分开剂量施用。
因此,参考以下实施例将更容易理解通常描述的本发明,所述实施例以说明方式提供且并不意欲限制本发明。本文中所参考的所有公开可获得的文件(包括但不限于专利)尤其以引用的方式并入。
实施例
本发明人观测到,荧光类型(固有相对于非固有)及化合物结构不同的装载化合物的广泛范围中,荧光相关的装载增强的效果。对于非固有荧光化合物,差异分别涉及荧光团及连接体(若存在)的性质。
一般而言,实施例涉及将多种荧光化合物装载至细菌衍生的完整囊泡中。对于所有实施例,起始物质均为源自肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)鼠伤寒血清变型(鼠伤寒沙门杆菌(S.typhimurium))的minCDE-染色体缺失突变体的空的完整微细胞的缓冲组合物,游离内毒素水平不超过每109个微细胞约5EU。参见美国专利第8,449,877号(产生实质上缺乏游离内毒素的微细胞组合物)。
对于装载囊泡(此处为微细胞),实施例1-5、7-10、12及13中的方法与上文所描述且MacDiarmid等人(2007)中所说明的小规模方案基本上一致。例如,在给定实验中,可将PBS缓冲液中的空的微细胞添加至微量离心管中且离心(16,000g,10分钟)。在丢弃所得上清液之后,微细胞球粒将重新悬浮于任选地具有0.01(w/v)所添加的明胶的PBS缓冲液(所谓“BSG缓冲液”)中,且与有效负载化合物(通常每ml微细胞悬浮液约200μg至约1mg)一起温育。将由此获得的装载的微细胞离心(16,000g,10分钟)且丢弃装载上清液。随后将通过使球粒重新悬浮于1ml缓冲液中洗涤装载的微细胞,离心微细胞(16,000g,10分钟),且丢弃上清液洗液。此类洗涤步骤通常重复三次。最后,将使微细胞重新悬浮于PBS或BSG缓冲液中。
当待装载的荧光化合物为水可溶(如许多前述实例的情况一般)时,化合物截留至囊泡外表面明显减少。因此,在较小规模上洗涤为足够的,准许使用小规模方案。然而,在实施例6及11中,装载的化合物为多柔比星,其为两亲性而非亲水性的,且因此截留为显著因素。因此,尽管这些实施例的装载步骤在较小规模上,即,装载在约毫升规模体积的缓冲液体中进行,但洗涤步骤涉及利用升规模体积的缓冲液体的交叉过滤(无离心),因此构成大规模方法。
最后,实施例14将小规模方案与大规模方法进行比较,突显利用后者所实现的改良稠度及纯度。
在所述实施例中,将封装有效负载的微细胞安装至玻璃载片上以便通过荧光显微镜检查,使用Leica型号DM LB光学显微镜,100×放大率(Leica Microsystems,Germany)进行目测。使用Leica DC照相机及Leica IM影像管理软件采集结果,其中采用适当的过滤器以准许目测有效负载荧光。
实施例1.装载长春碱FL
此实施例表明长春碱的荧光结合物至细菌衍生的微细胞的细胞质中的封装。长春碱为常规用于治疗某些类型癌症,包括霍杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌及睾丸癌的抗微管药物。
所采用的化合物长春碱FL为市售的且获自Life Technologies(ThermoFisher Scientific),Molecular品牌。该化合物为通过亚甲基连接体与荧光染料FL的结合物长春碱。在此情形下诸如BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 581/591、BODIPYTR、BODIPY 630/650及BODIPY 650/665的其它BODIPY荧光团可取代FL。参见THE MOLECULARHANDBOOK-A GUIDE TO FLUORESCENT PROBES AND LABELINGTECHNOLOGIES(第11版),部分1.4,“BODIPY Dye Series”,其内容在此以引用的方式并入。
长春碱FL具有定义明确的荧光特征(激发505nm,发射513nm红色荧光)。其结构描绘如下。
在起始组合物含有空的微细胞的情况下,根据小规模方案装载(温育在每ml溶液1mg结合物中温育)长春碱FL且洗涤,其中洗涤步骤重复三次。荧光成像的结果(图1)显示,所有装载的微细胞发出亮红色荧光,指示长春碱FL已转移至微细胞细胞质中。另外,长春碱FL分子保留在微细胞内,尽管在整个洗涤步骤中浓度梯度反转。
实施例2.装载FLUTAX-1
此实施例表明紫杉醇的荧光结合物至完整的细菌衍生的囊泡的细胞质中的封装。紫杉醇为使微管稳定的紫杉烷,且因此在细胞分裂期间干扰微管的正常分解。作为有丝分裂抑制剂,紫杉醇用于化学疗法中以治疗肺癌、卵巢癌及乳腺癌、头颈癌及卡波西肉瘤的晚期形式。
所采用的荧光紫杉烷衍生物FLUTAX-1为紫杉醇与荧光素通过乙酰基丙氨酸连接体的市售结合物。常规地,认为FLUTAX-1为治疗学上无效的;因此,其仅作为研究试剂出售。对于此实例,结合物获自市售来源Tocris Biosciences(Bristol,UK)。
FLUTAX-1(分子量:1283.2)具有定义明确的荧光特征(激发约495nm,发射约520nm;绿色荧光)。衍生物的正式名称为2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-双(乙酰氧基)-9-[(2R,3S)-3-(苯甲酰氨基)-2-羟基-1-氧代-3-苯基丙氧基]-12-(苯甲酰氧基)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-11-羟基-4a,8,13,13-四甲基-5-氧代-7,11-亚甲基-1H-环癸[3,4]苯并[1,2-b]氧杂环丁(oxet)-4-基酯N-[(3′,6′-二羟基-3-氧代螺[异苯并呋喃-1(3H),9′-[9H]呫吨]-5-基)羰基]-L-丙氨酸。其化学结构描绘如下。
将如上文所描述制备的PBS中的微细胞与1ml的200μg/ml FLUTAX-1溶液一起温育,且随后依照小规模方案反复洗涤。
荧光成像(图2)显示,所有微细胞发出亮绿色荧光,表明FLUTAX-1已转移至微细胞细胞质中,且大量FLUTAX-1分子保持被囊封,尽管在整个洗涤步骤中浓度梯度反转。相比于封装FLUTAX-1的微细胞,背景呈现黑色,证明几乎没有(little to no)外部FLUTAX-1。
通过从微细胞提取药物,继而HPLC分析且与已知浓度的FLUTAX-1样品的标准曲线进行比较来测定封装在微细胞内的FLUTAX-1的量。如上述MacDiarmid等人(2007)所描述,针对封装有多柔比星的微细胞进行微细胞提取。针对FLUTAX-1的定量研发出一种HPLC方法。HPLC方法特征包括(i)流动相:乙腈:MilliQ dH2O,50∶50,等度洗脱12分钟,流动速率2毫升/分钟。(ii)固定相:Metalchem 3u Taxsil,100mm×4.6mm加上C18筒。(iii)柱温:40℃。(iv)检测:(a)SPD-MlOAvp二极管阵列检测器-228nm;(b)RF-10AXL荧光检测器(Shimadzu)-激发495nm,发射520nm。(v)注射体积:50μl。(vi)HPLC系统:Shimadzu SCL-10AVP系统,包含SIL-10AVP自动注射器、LC-10Advp泵、DGU-14A脱气器、CTO-l0Avp柱烘箱、RF-10AXL荧光检测器及SPD-M10Avp二极管阵列检测器,利用Class-VP版本7.2.1软件(Shimadzu corporation,Kyoto,Japan)。
通过HPLC测定用这些药物装载条件获得的FLUTAX-1含量为每1×109个微细胞570ng (图3)。通过使用阿伏伽德罗数,这等于每个微细胞封装约270,000个FLUTAX-1分子,其为紫杉醇封装的显著改良,其中每个微细胞FLUTAX-1分子比紫杉醇分子多127倍(参见下文实施例9)。这同样是惊人的,因为TF.Pac(紫杉醇的水可溶衍生物)仅提供每个微细胞多25倍的分子(参见实施例10)。结果指示,荧光素荧光团增强FLUTAX-1进入及保留在微细胞中。
实施例3.装载紫杉醇Oregon
此实施例表明,可将另一荧光紫杉醇结合物紫杉醇Oregona/k/a“FLUTAX-2”封装至完整的细菌衍生的囊泡的细胞质中。对于此衍生物,通过β-丙氨酸连接体将氟化荧光素部分Oregon结合至紫杉醇的C7。氟化荧光素部分赋予衍生物分子荧光(激发约495nm,发射约525nm;绿色荧光)以及改良的水溶性。
所涉及的紫杉醇的衍生化产生生物非活性且因此治疗无效的化学实体,其仅出于研究目的出售。紫杉醇Oregon为市售的,因此,且对于此实施例,其获自LifeTechnologies(Thermo Fisher Scientific)。
衍生物的正式名称为L-丙氨酸、N-[(2′,7′-二氟-3′,6′-二羟基-3-氧代螺[异苯并呋喃-1(3H),9′-[9H]呫吨]-5-基)羰基]-(2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-双(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-9-[(2R,3S)-3-(苯甲酰氨基)-2-羟基-1-氧代-3-苯基丙氧基]-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-11-羟基。其化学结构表示如下。
根据小规模方案制备PBS中的微细胞,将其装载(100μg/ml结合物溶液的外部装载浓度)且洗涤。荧光成像(图4)显示,所有微细胞发出亮绿色荧光,指示紫杉醇Oregon已转移至微细胞细胞质中,且甚至在整个洗涤步骤中浓度梯度反转后,大量结合物分子保留在微细胞中。相比于装载的微细胞,背景呈现黑色证明几乎没有外部紫杉醇Oregon
不得不间接测定封装在微细胞内的紫杉醇Oregon的量,因为在此实例中破坏装载的微细胞同样导致装载的化合物分解,妨碍通过HPLC分析进行的定量。因此,通过荧光显微镜检查,将装载有紫杉醇Green-488的微细胞中的(绿色)荧光强度与针对装载有多柔比星的微细胞(其在提取及定量条件下为稳定的)目测到的(红色)自发荧光进行比较。参见下文实施例6,每109个微细胞封装约800ng多柔比星。关于在多柔比星的情况下观测到的荧光,装载有紫杉醇Oregon的微细胞所观测到的荧光的较高强度指示针对后者的类似浓度,即,每109个微细胞约800ng药物。此值与装载紫杉醇的微细胞观测到的每109个微细胞小于10ng药物的值形成对比(下文实施例9)。
实施例4.装载FITC结合的紫杉醇
此实施例表明紫杉醇的异硫氰酸荧光素(FITC)衍生物(缩写字“FCP”)有效封装至完整的细菌衍生的囊泡的细胞质中。荧光素基团(与FLUTAX-1中所见一致)通过5-氧代-5-((6-硫脲基己基)氨基)戊酸连接体(即,相对长的连接体结构域)结合至紫杉醇分子上的C2’位置而非C7位置(如FLUTAX-1及紫杉醇Oregon中一般)。在此,荧光素基团同样赋予衍生物分子荧光(激发:495nm;发射:519nm),且连接体提高其水溶解度。
FCP不为生物活性的且到目前为止仅出于研究目的使用。对于此实施例,FCP获自IDT Australia Ltd.(Boronia,Victoria)。其化学结构呈现如下。
在如所描述的起始组合物的情况下,根据小规模方案制备PBS中的微细胞,通过与FCP溶液(300μg/ml)一起温育而装载,且洗涤。荧光成像(图5)显示,所有微细胞均发出亮绿色荧光,指示FCP已转移至微细胞细胞质中,且在整个洗涤步骤中浓度梯度的反转留下大量囊封在微细胞中的FCP分子。几乎不存在外部FCP,如相对于封装FCP的囊泡背景的黑色外观所反映。
通过从微细胞提取药物,继而HPLC分析来测定封装在微细胞内的FCP的量。进行微细胞提取,且如上文针对FLUTAX-1的定量所描述采用HPLC方法。
用这些药物装载条件获得的FCP含量定量为每1×109个微细胞550ng(图6)。这等于每个微细胞封装约230,000个FLCP分子。此为紫杉醇封装的显著改良,其中每个微细胞多109倍的分子,尽管FCP为较大分子(分子量1455.6相对于853.9)的事实。
所封装的FCP分子的数量类似于FLUTAX-1的数量(约270,000)。FCP及FLUTAX-1具有相同荧光团。然而,结合不同,C2′(FCP)相对于C7(FLUTAX-1),但紫杉醇Oregon共有与FLUTAX-1相同的C7结合位置。因此,荧光素荧光团的结构且非分子的结合点对于促进药物分子装载至微细胞中而言至关重要。因此,结合点对荧光介导的化合物装载至根据本发明的完整的细菌衍生的囊泡中的增强而言并非至关重要。
实施例5.装载BacLightTM Green
此实施例表明,细菌染色剂BacLightTM Green可容易地封装于细菌衍生的完整囊泡中。绿色荧光染料(吸收/发射分别为约480/516nm及约581/644nm),BacLightTM Green为市售的,且对于此实施例获自Life Technologies(Thermo Fisher Scientific),Molecular品牌。其化学结构描绘如下。
将BacLightTM Green溶液添加至PBS缓冲液中的微细胞达到200nM的最终浓度。依照小规模方案,在室温下温育微细胞30分钟且如上文所描述进行三次重复洗涤步骤。
荧光成像(图7)显示,所有微细胞发出亮绿色荧光,指示BacLightTM Green已装载至微细胞中。相对于如BacLightTM Green染色的微细胞,黑色背景的外观证明几乎没有外部染色剂。
通过流式细胞术(Beckman Coulter FC500)分析封装有BacLightTM Green的微细胞。用抗-LPS alexa荧光647(AF647)抗体标记空的微细胞及封装BacLightTM Green的微细胞。首先,使用FL4通道分析微细胞以检测抗-LPS AF647染色的微细胞。在使用FL4荧光相对于向前散射的位图中目测微细胞群体,且对该群体进行门控以仅选择抗-LPS AF647染色的微细胞,不考虑任何碎片。
在FL1通道上分析门控的群体以检测BacLightTM Green荧光。直方图(图8)表示当相比于空的微细胞(对数标度)时,作为完全相异群体的FL1荧光具有较大偏移的封装BacLightTM Green的微细胞。此指示,由于有效BacLightTM Green并入,大于95%的微细胞为荧光的,且其表示,具有比空的微细胞所呈现大许多的FL1荧光的单一荧光群体。
实施例6.装载多柔比星
此实施例表明,可将两亲性、自发荧光细胞毒素有效地封装至细菌衍生的囊泡的细胞质中。以下显示细胞毒素多柔比星的蒽环结构。多柔比星用于癌症化学疗法中,其通过化学半合成衍生自链霉菌属细菌且为市售的。
依照大规模方法(在小规模上装载加上大规模中的多个洗涤步骤,无离心,利用交叉流过滤),PBS缓冲液中的微细胞装载有多柔比星,且通过荧光显微镜检查(激发480nm,发射580nm;红色荧光)目测装载的微细胞。成像结果(图9)显示,所有微细胞发出亮红色荧光,其中相比于封装多柔比星的微细胞,背景呈现黑色。
通过从微细胞提取药物(如所描述),继而HPLC分析来测定封装在微细胞内的多柔比星的量。HPLC方法特征包括(i)流动相:0.1M甲酸铵(pH 3.0):MilliQ H2O:乙腈。梯度0.2分钟28∶72∶0至28∶42∶30,等度5分钟,变至28∶72∶0,等度15分钟,流动速率1.25ml/分钟。(ii)固定相:Waters XBridge Phenyl,3.5μm×4.6mm×150mm加上C18滤筒。(iii)柱温:40℃。(iv)检测:荧光-激发480nm,发射560nm。(v)注射体积:10μl。(vi)HPLC系统:Shimadzu10AVP系统,包含自动进样器、溶剂脱气器、四元泵、柱加热器及荧光检测器,利用Class-VP版本7.2.1软件(Shimadzu corporation,Kyoto,Japan)。
通过与已知量的多柔比星样品的线性标准曲线进行比较,利用HPLC测定用这些药物装载条件获得的多柔比星的含量为大致每1×109个微细胞770ng(图10)。这等于装载至各微细胞中约800,000个多柔比星分子。
实施例7.装载荧光核酸染色剂
9为绿色荧光的核酸结合细菌染色剂(激发约485/6nm,发射约498/501nm)。对于此实施例,其获自Life Technologies(Thermo Fisher Scientific),Molecular品牌。
将9溶液添加至PBS缓冲液中的微细胞中达到20μM的最终浓度。依照小规模方案,温育微细胞30分钟且如先前所描述进行三次重复洗涤步骤。
使用如上文所描述的荧光显微镜目测封装9Green的微细胞,其中采用适当的过滤器以准许目测9荧光。荧光成像(图11)显示,9已在几乎无外部染色剂的情况下并入微细胞中。
通过流式细胞术(Beckman Coulter FC500)分析封装有SYTO的微细胞。用抗-LPS alexa荧光647(AF647)抗体标记空的微细胞及9染色微细胞。首先,使用FL4通道分析微细胞以检测抗-LPS AF647染色的微细胞。在使用FL4荧光相对于向前散射的点图中目测微细胞群体,且对该群体进行门控以仅选择抗-LPS AF647染色的微细胞,不考虑任何碎片。随后在FL1通道上分析门控群体以检测SYTO 9荧光。
由此获得的直方图(图12)表示当相比于空的微细胞(对数标度)时,作为相异群体的SYTO9染色微细胞具有FL1荧光偏移。此指示,由于SYTO 9并入,微细胞为荧光的,且其表示,具有比空的微细胞所示大许多的FL1荧光的荧光群体。
实施例8.装载9-氨基吖啶化合物
此实施例表明作为盐酸盐水合物化合物的荧光染料9-氨基吖啶可封装至完整的细菌衍生的囊泡的细胞质中。化合物9-氨基吖啶盐酸盐水合物(9-AAHH)可获自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)且具有下文所示的结构。
通过小规模方案制备装载有9-AAHH(温育溶液:500μg/ml)的PBS中的微细胞(2.5×1010,且进行荧光显微目测(激发400nm,发射420nm;蓝色荧光)。荧光成像结果(图13)指示9-氨基吖啶已转移至微细胞细胞质中且保留在那里,尽管在整个洗涤步骤中浓度梯度反转。
实施例9.紫杉醇的低效装载
此实施例表明,将疏水性、非荧光细胞毒性药物紫杉醇(参见以下结构)装载至完整的细菌衍生的囊泡的细胞质中的效率低于紫杉醇的荧光衍生物的效率。
根据小规模方案制备PBS缓冲液中的微细胞。因此,将空的微细胞(游离内毒素水平≤每109个微细胞约2EU)添加至微量离心管中且离心(16,000g,10分钟)。丢弃上清液且使微细胞沉淀物彻底重新悬浮于0.9ml PBS缓冲液中,该缓冲液被调节至pH 3(必需较低pH以使溶液中的高疏水性紫杉醇保持溶解状态持续至少30分钟)。随后向微细胞悬浮液中添加100μl的6mg/ml紫杉醇(于1∶1克列莫佛EL∶EtOH中),得到600μg/ml的外部紫杉醇浓度。微细胞在37℃下旋转温育过夜。通过离心洗涤来洗涤非特异性连接至微细胞表面的过量紫杉醇溶液及分子。即,离心(16,000g,10分钟)温育后微细胞且丢弃紫杉醇装载上清液。通过使球粒彻底地重新悬浮于1ml PBS(pH 7.4)中,离心微细胞(16,000g,10分钟)且丢弃上清液洗液来洗涤装载紫杉醇的微细胞。重复洗涤步骤三次。最后,使装载紫杉醇的微细胞重新悬浮于PBS中(pH 7.4)。
使用HPLC分析如上所述测定封装在微细胞内的紫杉醇的量。针对紫杉醇定量研发出的HPLC方法具有包括以下的特征:(i)流动相:乙腈及MilliQ dH2O,等度0.24分钟37∶63,自37∶63至60∶40梯度洗脱5分钟,随后历经1分钟流动相返回至初始溶剂组成37∶63且维持在此水平直至结束,流动速率2ml/分钟(操作时间8分钟);(ii)固定相:Metalchem 3uTaxsil,100mm×4.6mm加上C18筒;(iii)柱温:40℃;(iv)检测:SPD-M10Avp二极管阵列检测器-228nm;(v)注射体积:50μl:及(vi)HPLC系统:Shimadzu SCL-10AVP系统,包含SIL-10AVP自动注射器、LC-10Advp泵、DGU-14A脱气器、CTO-10Avp柱烘箱、SPD-M10Avp二极管阵列检测器,利用Class-VP版本7.2.1软件(Shimadzu Corp.,Kyoto,Japan)。
通过与已知量的紫杉醇样品的线性标准曲线进行比较,通过HPLC定量用这些药物装载条件获得的紫杉醇含量为每1×109个微细胞3ng(图14)。这等于每个微细胞囊封2115个紫杉醇分子,或大致分别比FCP及FLUTAX-1少110-130倍。采用额外途径以试图使微细胞装载有更大量的紫杉醇。其包括改变溶剂、缓冲剂、pH;使用环糊精/紫杉醇,包括复合物;使用助水溶剂,诸如水杨酸钠及NN-二乙基烟碱酰胺;及使用膜不稳定方法、化学(例如EDTA、CaCl2处理)及物理(诸如音波穿孔)方法。所有测试途径产生类似结果,其中紫杉醇装载效率在每1×109个微细胞0-10ng范围内。
实施例10.装载水可溶紫杉醇类似物
此实施例表明2’-β-丙氨酰基紫杉醇甲酸盐或“TF.Pac”(参见以下结构)(紫杉醇的水可溶类似物)的装载效率仅略微高于紫杉醇自身的装载效率。
由于结合至紫杉醇的C2’的β-丙氨酰基紫杉醇甲酸盐,TF.Pac具有改良的可溶性。非市售,合成TF.Pac以阐明是否仅是水溶解度不佳抑制紫杉醇至完整的细菌衍生的囊泡中的有效装载。紫杉醇可溶于水中直至0.3μg/ml,同时TF.Pac的可溶性为至少2mg/ml。
依照小规模方案使PBS缓冲液中的微细胞装载有TF.Pac(装载溶液:每ml蒸馏水0.1%乙酸1mg化合物)。
因此通过从微细胞提取药物,继而HPLC分析来测定封装在微细胞内的TF.Pac的量。如上文针对封装有多柔比星的微细胞所描述进行微细胞提取。所使用的HPLC方法与针对紫杉醇定量研发出的方法一致。
通过HPLC定量用这些药物装载条件获得的平均TF.Pac含量为每1×109个微细胞78ng(图15),其等于每个微细胞封装约50,000个TF.Pac分子。因此装载效率略微大于紫杉醇,但比FLUTAX-1小约5.4倍。采用诸多缓冲剂以试图使微细胞装载有更大量TF.Pac;然而,利用上文所描述的方法获得的效率未提高。因此,仅提高化合物的水溶解度无法增强至完整的细菌衍生的囊泡中的装载。
实施例11.多柔比星荧光淬灭剂叶酸影响多柔比星至完整微细胞中的装载
此实施例测定荧光化合物在其荧光被淬灭时至完整的细菌衍生的囊泡中的装载效率是否降低。在此情况下,化合物为自发荧光药物多柔比星(Dox),且淬灭剂为叶酸(FA)。参见Husseini,Adv.Sci.Lett.7:726(2012)(FA淬灭Dox荧光)。
材料及方法
将PBS中的多柔比星(100μg/ml)与各种浓度(即,0μg/ml、50μg/ml及400μg/ml)的FA混合。在室温下温育溶液过夜,且随后通过0.1μm过滤器过滤以使溶液灭菌,且移除任何颗粒。
在第二天,用荧光盘读取器测量各溶液的等分试样的荧光(激发波长:485nm,发射波长:590nm及620nm)。同时,用PBS缓冲液洗涤微细胞且随后装载有各Dox+FA溶液中的一者或另一者,所述溶液先前以2.5×1010个微细胞/ml的密度制备,体积在约1ml与2ml之间。在30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时及过夜的时刻自处理组中的每一个取出样品(500μl)。
对于每一时间点,对微细胞进行以下小规模方案:
1.离心微细胞-16,000g持续7分钟。
2.丢弃上清液(SN)且使球粒重新悬浮于1ml PBS缓冲液(pH 7.4)中。
3.离心微细胞-16,000g持续7分钟。
4.丢弃SN且使球粒再悬浮于0.5ml PBS缓冲液中。
5.传送微细胞悬浮液通过0.8μm过滤器。
6.用另外0.5ml PBS洗涤过滤器且与微细胞组合。
7.离心微细胞-16,000g持续7分钟。
8.丢弃SN且使球粒重新悬浮于1ml PBS缓冲液中。
9.离心微细胞-16,000g持续7分钟。
10.丢弃SN且使球粒再悬浮于1ml PBS缓冲液中。
11.离心微细胞-16,000g持续7分钟。
12.丢弃SN且最后使球粒重新悬浮于350μl PBS缓冲液中。
a.对于微细胞定量,针对纳米颗粒示踪分析(Malvem Instruments,UK),使用Nanosight技术等分20μl微细胞。
b.对于提取及HPLC分析,使40μl微细胞成球粒(16,000g,15分钟,丢弃SN,且球粒储存在-20℃下)。
装载多柔比星的微细胞作为离心球粒呈现粉红色。基于通过视觉检查评估的相对颜色强度,显而易见,在时间点中的每一个完成洗涤步骤后,在400μg/ml叶酸存在下装载的微细胞含有明显少于在叶酸不存在下装载的那些微细胞的多柔比星。相比于0μg/ml叶酸,在50μg/ml叶酸样品中同样观测到略微较少的装载量。
表2.多柔比星装载溶液的荧光读数结果
观测到,50μg/ml及400μg/ml叶酸在不同程度上淬灭100μg/ml Dox溶液的荧光(图16)。当在485nm处激发溶液且在590nm或620nm处测量发射时,这是适用的。使用400μg/ml叶酸,多柔比星淬灭更明显,其中多柔比星荧光发射信号损失约40%,而使用较低浓度的50μg/ml叶酸多柔比星发射荧光仅损失6%-7%。
通过比色法定量微细胞DOX样品
除使用HPLC测定微细胞样品中的每一个的Dox含量以外,采用比色分析测量多柔比星含量,因为此测量不依赖于Dox荧光。
多柔比星标准曲线
产生游离多柔比星的标准曲线。通过生物光度计在490nm处一式两份测量各种浓度的PBS中多柔比星的吸光率。
结果
对平均数据进行线性回归,其产生公式y=0.019x,其中y为吸光率(Abs490nm)且x为多柔比星的μg/ml(图17)。因此,对于所测量的微细胞Dox样品,
μg/ml多柔比星=Abs490nm/0.019
微细胞Dox样品的比色法
根据上表,在比色杯中用PBS缓冲液(pH 7.4)将来自各微细胞Dox样品的微细胞补足至200μl。也在比色杯中在200μl PBS(pH 7.4)中补足含有空的微细胞的“空白”样品。在490nm处测量空白微细胞样品及所有微细胞Dox样品的吸光率。
表3.微细胞Dox样品的比色分析结果
结果呈现于以上表3中。大多数样品过于接近0.472的空白吸光率(即,其在0.1的生物光度计误差内)而不为适用的。对于大部分样品而言,此比色分析的灵敏度过低,且因此大多数时间点的测量值波动。参见图18。
HPLC结果
如上述MacDiarmid等人(2007)所描述,微细胞球粒被处理以便通过HPLC进行分析。使用UV250nm检测及相对荧光(RF)检测两者对各样品中的Dox进行定量。
来自UV250nm读数的HPLC定量呈现于图19中,且来自相对荧光(RF)读数的HPLC定量显示于图20中。观测到存在于装载溶液中的叶酸的提高的量不利地影响多柔比星至微细胞中的装载。叶酸的外部浓度愈高,装载至完整微细胞中的多柔比星的浓度愈低。
实施例12.装载米托蒽醌
此实施例说明米托蒽醌二盐酸盐(MTX)(固有荧光细胞毒性药物,也称为“米托蒽醌(Mitozantrone)”)至完整的细菌衍生的囊泡中的增强装载。蒽醌抗赘生剂MTX充当II型拓扑异构酶抑制剂,且已用于治疗癌症,诸如转移性乳腺癌、急性髓性白血病及非霍奇金氏淋巴瘤。
米托蒽醌购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。如上文所描述制备空的完整微细胞(3.2×1010/ml)。柱(0.65μm)获自Millipore(Billerica,MA),无菌PBS(pH 7.4)获自Sigma-Aldrich,且可注射盐水获自Livingstone Int’l(Rosebery,NSW)。
在盐水中制备2mg/ml的MTX储备溶液且通过0.1μm过滤器过滤。(米托蒽醌可溶于水达到大致5-7.5mg/ml。)将所得溶液储存在4℃下且避光。
小规模方案经调适用于此实施例中。因此,在单独试管中以781μl等分试样(2.5×1010最终)提供微细胞。在台式Eppendorf离心机上以13,200rpm旋转试管8分钟。移除上清液;使球粒重新悬浮于1ml PBS缓冲液(pH 7.4)中,且随后再次旋转。使由此获得的球粒重新悬浮于850μl PBS缓冲液中。
将一定体积(150μl)MTX(2mg/ml储备液)添加至各微细胞悬浮液中以得到300μg/ml(外部浓度)的最终装载溶液。伴随在旋转器上混合,在37℃下培肓样品2小时、4小时或过夜(约12小时)。
在温育后,以13,200rpm旋转微细胞8分钟且丢弃上清液。用1ml PBS(pH 7.4)洗涤球粒且如上所述进行离心。丢弃上清液。
使球粒重新悬浮于0.5ml PBS(pH 7.4)中且在室温下旋转温育15分钟。在温育之后,将各样品施加至0.65μm柱上,且以200g旋转1分钟或直至全部样品流过。将流过物收集至新试管中。将新一批次0.5ml PBS(pH 7.4)施加至同一过滤器中,且旋转,且将流过物添加至初始0.5ml样品中。
以13,200rpm将样品离心8分钟,且丢弃上清液。随后使各样品重新悬浮于350μlPBS(pH 7.4)中。
使用NanoSight Ltd(Amesbury,Wiltshire,UK)的产品LM20纳米颗粒分析系统,利用含10μl微细胞的990μl PBS(pH 7.4)进行微细胞样品计数。结果如下:
2小时:6.24×1010/ml
4小时:5.77×1010/ml
过夜:5.93×1010/ml
以13,200rpm旋转各样品批料(20μl)8分钟,且移除上清液,继而进行针对微细胞样品中的MTX含量的HPLC分析。
通过HPLC,各样品中装载至微细胞中的MTX的量测量为251nm处的峰面积(注射体积:50μl)。对于一式两份样品对(1,2:2小时装载;3,4:4小时装载;及5,6:过夜装载),结果如下,包括每个样品的MTX含量及每109个微细胞的MTX的量。
对于样品5及6,在装载过夜的情况下,109个微细胞平均装载有约0.56μg MTX。此意谓各微细胞含有约759,000个MTX分子,基于药物的约444的分子量,根据The MerckIndex Online(2014)。
相比于同MTX一样为固有荧光的多柔比星的浓度,微细胞内部MTX浓度出人意料地高。参见Consoli等人,Leukemia 11:2066-74(1997);及Bell,Biochim Biophys Acta 949:132-37(1988)(MTX的最大激发及发射分别为约610nm及685nm)。也参见Smith等人,CancerRes.52:4000-08(1992)(低红色荧光为514nm)。因此,认为略微小于多柔比星的MTX的高装载效率是其荧光的函数。
实施例13.在离子存在下装载荧光化合物
此实施例显示,离子的存在加强初始实施例所证明的荧光介导的囊泡装载增强。因此,认为囊泡培养基中的来自盐解离的离子与细菌衍生的囊泡(此处为微细胞)的完整膜中的通道相互作用以强化对荧光化合物移动通过跨膜通道、化合物与通道中或沿通道排列的分子之间的能量转移的上文所论述的作用。
与小规模方案一致,用1ml PBS(pH 7.4)洗涤微细胞(每试管2.5×1010)一次,并离心(16,000g,7分钟)且丢弃上清液。在15%乙醇、85%PBS(pH 7.4)中,在具有或不具有200mM KCl(Sigma-Aldrich)的情况下用100μg/ml FLUTAX-1(Tocris Biosciences)装载经洗涤的微细胞。
在37℃下旋转试管。自各处理移出一个试管以便在15分钟、45分钟、2小时及5小时中的每一个时洗涤。各处理洗涤三次以移除试剂且保留微细胞。
通过HPLC以上文所描述的方式测量FLUTAX-1水平。因此,将测量值(UV 228nm)与已知FLUTAX-1量的标准曲线进行比较且外推得到1×109个微细胞内的FLUTAX-1量。
如图21所描绘,结果显示,在装载溶液中包括200mM KCl显著增强FLUTAX-1至完整微细胞中的装载。即,较高盐浓度与超过两倍的装载至微细胞中的荧光药物的量相关。实际上,在短至微细胞/药物共同温育15分钟之后,效果是明显的。
为阐明其它离子盐是否具有此效果,在等摩尔量的不同盐存在下测试FLUTAX-1至微细胞中的装载;且如前所述通过HPLC测量装载量。因此,用1ml PBS(pH 7.4)洗涤微细胞(每试管2.5×1010一次并离心(16,000g,7分钟),且丢弃上清液。在15%乙醇、85%PBS(pH7.4)中,在具有或不具有200mM KCl、NaCl或KBr的情况下用100μg/ml FLUTAX-1装载经洗涤的微细胞。在37℃下旋转试管。从各条件移出一个试管以便在15分钟及1小时中的每一个时洗涤。各处理如上文所描述洗涤三次。
如上文所描述裂解且提取微细胞,且在HPLC条件下操作裂解物以便测量FLUTAX-1水平。将测量值(UV 228nm)与已知FLUTAX-1量的曲线进行比较且外推获得1×109个微细胞中的FLUTAX-1的量。
结果显示在图21中。在200mM下,所测试的盐中的每一种显著增强荧光药物至微细胞中的装载,其中在15分钟及1小时时间点时的改良明显。图22中的条形图表示来自15分钟时间点的组合数据。在各实验(例如无盐相对于200mM KCl)中所进行的相同处理提供高度一致的一式两份数据。
盐KCl、NaCl及KBr中的每一种提高荧光药物至细菌衍生的完整囊泡中的装载效率,此处在15分钟时提高了大致2倍。装载实际上在温育约4小时内完成。这些观测结果强调,通过使囊泡及荧光化合物与添加至外部环境的阳离子和/或阴离子一起共同温育来增强荧光化合物至完整囊泡中的装载。相比之下,离子对另外类似但非荧光化合物的装载无此类影响。
发现此离子效果受共同温育温度影响。例如,当在HEPES盐水缓冲液(pH 6.8)中制备细菌衍生的完整微细胞且通过基本上如上文所描述,分别在室温(约22℃)及约37℃下与多柔比星一起共同温育装载药物时,基于HPLC的不同时间点囊泡内多柔比星水平的定量的结果如下:
表5
这些数据的图形表示(图23)显示,当在约37℃下进行共同温育时装载至微细胞中的荧光化合物的量大于室温下的量超过100%。(膜降解导致比约37℃高得多的任何共同温育温度不可行。)
实施例14.本发明大规模方法优于常规小规模方案的优势
此实施例将上文相对于MacDiarmid等人(2007)所论述的小规模方案与本发明的大规模方法进行比较。如该实施例所表明,本发明方法为含有完整的细菌衍生的囊泡的组合物提供出人意料地更好稠度及纯度。这是因为本发明的大规模方法不仅显著降低内毒素水平,且也减少截留在囊泡外部的有效负载化合物。
小规模方案
基本上根据MacDiarmid等人(2007)的方法制备完整微细胞且装载有多柔比星,除了微细胞不携带任何靶向双特异性配体,且因此将不会被靶宿主细胞摄取。在37℃下与药物(约1ml/mg)-起旋转温育过夜后,装载的微细胞经五次洗涤步骤,其需要离心(13,200rpm,10分钟)及所得球粒于1ml BSG缓冲液(pH 7.4)中的重新悬浮。
随后在补充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺及100U/ml青霉素G及链霉素两者的Gibco RPMI-1640组织培养基(以每孔0.5ml形式)中将经洗涤的装载多柔比星的微细胞(1x108)与雌激素受体阴性的MDA-MB-468人乳腺癌细胞(每孔104个细胞)一起温育。
随后通过共聚焦显微镜检查每24小时监测细胞。在两天内,癌细胞在其核内呈现红色荧光,指示多柔比星进入,但装载的微细胞未被细胞靶向摄取。因此,小规模方案导致额外多柔比星在微细胞表面上的截留,其沥滤至组织培养基中且进入癌细胞中。
大规模方法
独立于封装多柔比星的微细胞制备五个批料且用结合EGFR的双特异性配体靶向(参见MacDiarmid等人(2007)第443页第二段“Experimental Procedures”)。根据大规模方法,装载多柔比星且靶向EGFR的微细胞经五次PBS缓冲液连续洗涤,每次洗涤约20升,通过较大交叉流过滤器。
对于各批次微细胞,如上文所描述测定多柔比星浓度,且通过标准LAL分析测量游离内毒素的水平。参见例如Dawson,LAL Update,第22卷,第3期(2005年10月)。结果列表于下面。
如这些结果所示,大规模方法提供每1×109个微细胞约672ng±58ng的装载微细胞的平均多柔比星浓度。用大规模方法实现的实质上改良的纯度通过每1×109个微细胞2.99EU±1.45EU的平均游离内毒素水平来证明。
虽然已说明且描述某些实施方式,但应理解,可根据本领域普通技术人员在不脱离如以下权利要求中所定义的其较广方面的技术的情况下在其中进行改变及修改。
上文所说明性地描述的实施方式可在不存在未特定公开的任何一或多个要素、一或多个限制的情况下适当地实践。例如,术语“包含”、“包括”、“含有”等应广泛地且无限制地理解。另外,本文中所采用的术语及表述以说明且不受限制的方式使用,且在使用这些术语及表述时不欲排除所显示及所描述特征的任何等效物或其部分,但应认识到可在所要求保护的技术的范围内进行各种修改。另外,词组“主要由......组成”应理解为包括那些特定列举的要素及那些并未实质上影响所请求保护的技术的基本及新颖特征的额外要素。词组“由......组成”不包括任何未规定的要素。
就在本说明书中所描述的特定实施方式而言本发明并非限制性的。如对本领域技术人员将是显而易见的,可在不脱离其精神及范围的情况下进行许多修改及改变。除本文中所列举的那些外,根据前述描述,在本发明的范围内的功能上等效的方法及组合物对本领域技术人员将是显而易见的。此类修改及改变意欲落入所附权利要求的范围内。本发明仅受所附权利要求的术语以及此权利要求所赋予权利的等效物的完整范围限制。应理解,本发明不限于特定方法、试剂、化合物组合物或生物系统,其当然可改变。同样应理解,本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的且不意欲为限制性的。
另外,在根据马库什群组描述本发明的特征或方面时,本领域技术人员应认识到,本发明也从而根据马库什群组成员的任何个别成员或子群组进行描述。
本领域技术人员应理解,出于任何及所有目的,尤其就提供书面说明而言,本文所公开的所有范围也涵盖其任何及所有可能的子范围及子范围组合。任何列出的范围可因足够说明而容易地识别且能够将同一范围分解为至少相同的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例,本文所讨论的各范围可容易地分解为下部三分之一、中间三分之一及上部三分之一等。本领域技术人员也应理解,所有语言,诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”及其类似者均包括所列举的数字且指可随后如上文所讨论分解为子范围的范围。最终,本领域技术人员将理解,范围包括各个别成员。
本说明书中所提及的所有出版物、专利申请、颁发专利及其它文件均以引用的方式并入本文中,该引用程度就如同已特定地且个别地将各个出版物、专利申请、颁发专利或其它文件以全文引用的方式并入本文中一般。在以引用的方式并入的正文中所含的定义若与在本发明中的定义矛盾,则将其排除在外。
其它实施方式阐述于以下权利要求中。
Claims (23)
1.包含封入荧光小分子药物的完整且无生命细菌囊泡的组合物,所述荧光小分子药物不为多柔比星、伊立替康、比山群、托泊替康、表柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、Oregon488结合的紫杉醇、或FL结合的长春碱。
2.权利要求1所述的组合物,其中所述囊泡为完整的细菌衍生的微细胞。
3.权利要求1或2所述的组合物,其中所述微细胞封入至少约500,000个所述小分子药物分子。
4.权利要求1-3中任一项所述的组合物,其中所述囊泡为杀死的细菌细胞。
5.权利要求1-4中任一项所述的组合物,其中所述小分子药物:
(a)是生物学活性的;和/或
(b)是细胞毒性的;和/或
(c)在体内活化。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物,其中所述小分子药物为吗啉基蒽环类衍生物。
7.权利要求6所述的组合物,其中所述小分子药物为PNU-159682。
8.包含封入式D-L-F化合物或其盐的完整且无生命细菌囊泡的组合物,其中D为小分子药物的残基,L为连接体,且F为荧光部分。
9.权利要求8所述的组合物,其中所述连接体的半衰期在约6小时与约24小时之间。
10.权利要求8或9所述的组合物,其中所述连接体在哺乳动物细胞的内体中降解。
11.权利要求8-10中任一项所述的组合物,其中:
(a)所述连接体选自键、-OC(O)-(CHR40)qNR41C(O)-和-OC(O)-(CHR40)qC(O)NR41-(CHR42)u-NH-C(S)-NH-,其中R40、R41及R42独立地为-H或C1-4烷基,且q及u独立地为1、2、3、4、5、6或7;或
(b)所述连接体选自-O-C(O)-(CH2)NHC(O)-和-O-C(O)-(CH2)3C(O)NH-(CH2)6-NH-C(S)-NH-。
12.权利要求8-11中任一项所述的组合物,其中所述荧光部分为:
其中
R21是-H、-OH、-COOH、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、C1-4烷氧基、卤基、或-Rd;
R22为-H、-OH、-COOH、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基、取代的C1-4烷氧基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-O-C(O)-(取代的C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(取代的C1-4烷基)、-O-CH2-O-(C1-4烷基)、-S-CH2-O-(C1-4烷基)、或-Rd;
各R23、R24、R25、R26、R27、R28和R29独立地为-H、卤基、-OH、-CH3或-Rd,
条件为R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28及R29中的至少一个为-Rd;其中Rd为所述连接体的连接点。
13.权利要求8-11中任一项所述的组合物,其中所述荧光部分为:
其中R21为所述连接体的连接点。
14.权利要求8-11中任一项所述的组合物,其中所述荧光部分为:
其中
R31和R32独立地为-H、-OH、C14烷基、C1-4卤烷基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、C1-4烷氧基、卤基、或-Rd;
R34和R35独立地为-H、卤基、-OH、-COOH、C1-4烷基、取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基、-O-C(O)-(C1-4烷基)、-C(O)-O-(C1-4烷基)、-O-CH2-O-(C1-4烷基)、-S-CH2-O-(C1-4烷基)、或-Rd;
各R33和R36独立地为-H、卤基、-OH、-CH3或-Rd;
各R37、R38和R39独立地为卤基、-OH、-CH3或-Rd;
各m、n、和p独立地为0、1、2、3或4;
条件为R31、R32、R34、R34、R35、R36、R37、R38和R39中的至少一个为-Rd;其中Rd为所述连接体的连接点。
15.权利要求14所述的组合物,其中所述荧光部分为:
其中R32为所述连接体的连接点。
16.包含封入化合物的完整的细菌衍生的细菌囊泡的组合物,所述化合物包括活性剂,所述活性剂通过连接体结合至能量转移部分,其中所述活性剂不为Oregon488结合的紫杉醇及FL结合的长春碱。
17.权利要求16所述的组合物,其中所述能量转移部分:
(a)为发光部分;
(b)包含共轭pi系统;和/或
(c)包含吖啶基部分、呫吨基部分或苯并咪唑基部分。
18.不通过离心将所需化合物装载于多个微细胞中的方法,包括
(a)在一定体积的缓冲液体中的所述化合物的温育溶液中温育所述多个微细胞,其中所述体积为约100ml或更多的数量级;及随后
(b)对所述多个微细胞进行多个洗涤步骤,各包含用数量级为升的一定体积缓冲液体交叉流过滤所述微细胞,其中所述洗涤步骤中无一个采用离心所述微细胞。
19.权利要求18的方法,其中使与所述所需化合物不同的二元离子化合物溶解于所述温育溶液中达到约200mM或更多的数量级的浓度。
20.权利要求18或19的方法,其中:
(a)步骤(b)包含三至五个洗涤步骤;和/或
(b)所述所需化合物为荧光的;和/或
(c)所述温育持续约4小时或更长的时期;和/或
(d)所述所需化合物是生物活性的;和/或
(e)所述所需化合物为约1500道尔顿或更小的小分子药物;和/或
(f)所述小分子药物是细胞毒性的;和/或
(g)所述小分子药物在体内活化。
21.权利要求18-20中任一项所述的方法,其中所述所需化合物具有式D-L-F或为其盐,
其中D为小分子药物的残基,L为连接体,且F为荧光部分。
22.权利要求21所述的方法,其中:
(a)所述连接体的半衰期在约6小时与约24小时之间;和/或
(b)所述连接体在哺乳动物细胞的内体中降解。
23.有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的组合物在用于治疗需要其的患者的癌症的药物中的用途,其中所述化合物是细胞毒性的。
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